CN110042100A - 一种反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用 - Google Patents

一种反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种反义核酸AMO‑miR‑307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用，所述反义核酸AMO‑miR‑307序列为：5’‑CUCACUCAAGGAGGUUGUGA‑3’。本发明的反义核酸AMO‑miR‑307对于WSSV具有显著抑制效果，通过促进宿主血淋巴细胞凋亡来抑制病毒的增殖，有效抑制了WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖。本发明反义核酸AMO‑miR‑307为白斑综合症病毒的防治提供了一种潜在的药物，能够有效防治白斑综合症病毒的感染和传播，适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的日本囊对虾及拟穴青蟹，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾。本发明反义核酸AMO‑miR‑307绿色环保，不会对养殖过程中的生态平衡产生影响，且不会对人的身体健康造成危害。

Description

一种反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中 的应用
技术领域
本发明涉及水产养殖的病毒性疾病防治领域，尤其涉及一种反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用。
背景技术
拟穴青蟹是一种重要的海洋经济类养殖蟹类，有着极高的经济价值。海洋中蟹类资源丰富，仅在印度洋，太平洋区的蟹类就有2000多种，但可以进行人工养殖的蟹类却十分稀少，其中拟穴青蟹占据了十分重要的地位，在我国主要分布在东南沿海和台湾地区。日本囊对虾，属甲壳纲，因其抗逆性及抗病力较强，经济价值较高的特点为养殖户们所喜爱，在我国东南沿海广泛养殖。克氏原螯虾，俗称小龙虾，为淡水经济养殖虾类，生长速度快，食性杂，适应能力强，分布范围十分广泛。克氏原螯虾因肉质鲜美而被人青睐，养殖范围逐年上升，是我国重要的淡水养殖物种。
近年来，随着水产养殖规模的不断扩大，集约化程度日益提高，各种病毒，细菌引起的疾病愈加常见，严重影响了水产养殖业的可持续发展。白斑综合症病毒(white spotsyndrome virus，WSSV)是水产养殖过程中的常见病原，对宿主具有泛适性，几乎所有的十足甲壳类都会被感染，并且死亡率高，传播速度快，极容易形成爆发之势，难以控制。拟穴青蟹、日本囊对虾和克氏原螯虾均属无脊椎动物，只能依靠先天免疫系统来抵抗外来病原，其病害防治工作难度极大。长期以来抗生素被广泛用于水产养殖中，虽然在一定程度上可以抑制病毒细菌的侵害，但是长久来看，抗生素的滥用会极大地破坏养殖区域的生态环境，其在人体内累积也会对健康产生影响现在已经被禁止使用。目前无脊椎动物免疫病害防治已经有了长足的进步，但仍缺乏快速有效地防治手段，寻求环保高效的WSSV防治手段对于水产养殖业的长期发展有着深远意义。
miRNA是近年发现的一类非编码单链RNA，长度约为18-22个核苷酸，通过与靶基因mRNA配对结合，进而抑制靶基因的表达，发挥着转录后调控的功能。研究表明，miRNA在宿主与病毒的互作过程中发挥着关键的作用，miRNA做为抗病毒治疗的潜在靶点具备良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小RNA反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用，本发明AMO-miR-307可有效抑制WSSV在拟穴青蟹、日本囊对虾和克氏原螯虾体内的增殖，以解决WSSV对海水及淡水养殖虾蟹类感染并致死的现象等问题。
一种水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307，序列为：5’-CUCACUCAAGGAGGUUGUGA-3’。
上述水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用。
进一步的，所述广谱抗白斑综合症病毒制剂包括含反义核酸AMO-miR-307的饲料添加剂、含反义核酸AMO-miR-307的固体或者液体药物。
进一步的，所述广谱抗白斑综合症病毒制剂可用于甲壳类动物。
进一步的，所述甲壳类动物包括海水养殖蟹类、海水养殖虾类和淡水养殖虾类。
进一步的，所述甲壳类动物包括日本对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
一种包含上述水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307的制剂。
本发明通过研究WSSV刺激前后miRNA的变化情况，结合相关功能的研究，发现了miR-307可以促进WSSV在宿主体内的复制，因此，miR-307是潜在的WSSV防治新靶点。随后通过设计合成AMO-miR-307特异性地识别并抑制miR-307的表达，进而抑制WSSV在宿主体内的复制，其作用机制是诱导宿主细胞发生凋亡进而抑制WSSV在宿主体内的复制。此外，为了证明AMO-miR-307作为抗WSSV药物的泛适性，本发明在日本囊对虾及克氏原螯虾中进行了相关功能验证试验，发现AMO-miR-307能够抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内的增殖，显著提高虾血淋巴细胞的活力，增强虾对病毒的抵抗能力。因此AMO-miR-307有望成为一种新的白斑综合症病毒抑制剂，广泛应用于水产养殖过程中WSSV的防治工作。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明适用范围广泛，不仅适用于海水养殖的拟穴青蟹及日本囊对虾，同样也适用于淡水养殖的克氏原螯虾，是一种潜在的广谱抗WSSV的药物。
(2)本发明属于核酸合成物，分子质量小易降解，不会对虾蟹个体本身造成伤害，不会污染水体环境和海洋生态环境，且不会对人体造成危害。
(3)本发明AMO-miR-307见效快，不仅适用于预防，也可适用在已爆发白斑综合症的虾蟹的养殖过程。
(4)本发明的抗白斑综合症病毒制剂可以只包含AMO-miR-307一种物质，相比于目前的大多数混合药物，本发明更易于实际生产。
附图说明
图1为WSSV感染拟穴青蟹后，拟穴青蟹血淋巴细胞中miR-307含量的变化情况。
图2为miR-307模拟物对拟穴青蟹体内miR-307含量的影响；将miR-307模拟物及相关对照注射至拟穴青蟹体内后，利用qPCR检测血淋巴细胞中miR-307的表达量。
图3为miR-307模拟物对WSSV在拟穴青蟹体内增殖的影响；将miR-307模拟物及相关对照混合WSSV后分别注射至拟穴青蟹体内，检测拟穴青蟹体内WSSV的拷贝数。
图4为AMO-miR-307对拟穴青蟹体内miR-307含量的影响；将AMO-miR-307及相关对照注射至拟穴青蟹体内后，利用qPCR检测血淋巴细胞中miR-307的表达量。
图5为AMO-miR-307对WSSV在拟穴青蟹体内增殖的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至拟穴青蟹体内，检测拟穴青蟹体内WSSV的拷贝数。
图6为AMO-miR-307对WSSV感染后拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至拟穴青蟹体内，检测拟穴青蟹体内的血淋巴细胞活力。
图7为AMO-miR-307对WSSV感染后拟穴青蟹体内血淋巴细胞凋亡的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至拟穴青蟹体内，对照组仅注射PBS，检测注射48小时后青蟹血淋巴细胞凋亡。
图8为AMO-miR-307对WSSV在日本囊对虾体内增殖的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至日本囊对虾体内，检测日本囊对虾体内WSSV的拷贝数。
图9为AMO-miR-307对WSSV在克氏原螯虾体内增殖的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至克氏原螯虾体内，检测克氏原螯虾体内WSSV的拷贝数。
图10为AMO-miR-307对WSSV感染后日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的影响；将AMO-miR-307及相关对照混合WSSV后分别注射至日本囊对虾及克氏原螯虾体内，检测日本囊对虾及克氏原螯虾体内的血淋巴细胞活力。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：
WSSV感染后拟穴青蟹体内miR-307表达量的检测试验
选用30-40g的拟穴青蟹于10-12‰盐度的海水中驯养一周，水温保持在22℃左右。用1ml注射器在拟穴青蟹第四附肢关节处注射200μL/只，106拷贝数的WSSV稀释液，注射后0h、24h和48h收集血淋巴细胞，用RNA提取试剂盒提取RNA后再用cDNA反转录试剂盒进行cDNA的合成，所用反转录引物为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCACTGGATACGACCTCACTCA-3’，最后通过qRT-PCR检测miR-307的表达量，所用引物为P1和P2。
P1:5’-CGCCGTCACAACCTCCTTGAGTGAG-3’；
P2:5’-TGCAGGGTCCGAGGTCACTG-3’。
结果见图1，qRT-PCR的数据表明在WSSV感染后，拟穴青蟹体内血淋巴miR-307表达量显著下调，表明miR-307对病毒感染做出了响应，可能参与了宿主病毒间的互作过程，因此，miR-307是潜在的WSSV防治的新靶点。
实施例2：
miR-307模拟物上调拟穴青蟹体内miR-307表达量的试验
按实施例1的方法养殖拟穴青蟹并随机将其分为3组，实验组注射100μL/只体外合成的miR-307模拟物(10nM)，对照组分别注射100μL/只的miR-307-scrambled(miR-307模拟物打乱的序列)10nM或100μL/只的PBS，注射48h后收集血淋巴细胞并按实施例1方法检测拟穴青蟹体内miR-307的表达量。
结果见图2，数据表明注射miR-307模拟物可以显著上调青蟹体内miR-307的表达量，可用于后续功能试验。
实施例3：
miR-307模拟物促进WSSV在拟穴青蟹体内增殖的试验
按实施例2中方法将拟穴青蟹随机分为3组，实验组注射WSSV感染液与miR-307的混合液，阴性对照组注射WSSV感染液与miR-307-scrambled的混合液或仅注射WSSV感染液。注射后0h，24h，48h取适量拟穴青蟹腿部肌肉组织，使用基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取总DNA，然后通过qRT-PCR进行病毒拷贝数的检测，所用引物为P3和P4。
P3:5’-CAAATCTCCCCTTCATCTACTCAAC-3’；
P4:5’-AATAATTTTCCCGTTTCTGAATAGA-3’。
结果见图3，miR-307模拟物注射后24h和48h，拟穴青蟹体内的WSSV拷贝数显著多于对照组，表明miR-307对病毒的增殖起正向调控作用。因此，为筛选抗WSSV的药物，后续试验使用AMO-miR-307进行抗病毒试验。
实施例4：
AMO-miR-307抑制拟穴青蟹体内miR-307表达量的试验
按实施例1的方法养殖拟穴青蟹并随机将其分为3组，实验组注射100μL/只体外合成的AMO-miR-307(10nM)，对照组分别注射100μL/只的AMO-miR-307-scrambled(10nM)或100μL/只的PBS，注射48h后收集血淋巴细胞并按实施例1方法检测拟穴青蟹体内miR-307的表达量。
结果见图4，在拟穴青蟹中注射AMO-miR-307后，相较于对照组，miR-307的表达量明显下调，可用于后续功能试验。
实施例5：
AMO-miR-307抑制WSSV在拟穴青蟹体内增殖的试验
按实施例2中方法将拟穴青蟹随机分为3组，实验组注射WSSV感染液与AMO-miR-307的混合液，阴性对照组注射WSSV感染液与AMO-miR-307-scrambled的混合液或仅注射WSSV感染液。利用实施例3的方法分别检测注射0h、24h及48h后拟穴青蟹体内的病毒拷贝数。
结果见图5，AMO-miR-307注射后24h和48h，相较于对照组，拟穴青蟹体内的WSSV拷贝数显著降低，表明AMO-miR-307能够抑制病毒在体内的复制，增加拟穴青蟹的抗病毒能力。
实施例6：
AMO-miR-307增强WSSV感染后拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力的试验
按实施例1的方法养殖拟穴青蟹并随机将其分为4组，第1组只注射WSSV，第2组注射WSSV和AMO-miR-307，第3组注射WSSV和AMO-miR-307-scrambled，第4组不做任何处理，注射剂量参照实施例4。注射48h后利用Abnova公司的Cell Viability Assay Kit(GreenFluorescence)试剂盒检测拟穴青蟹血淋巴细胞的活力。
结果见图6，WSSV感染后，拟穴青蟹体内血淋巴细胞活力急剧降低，而注射AMO-miR-307后血淋巴细胞的活力显著回升，表明AMO-miR-307能够提高病毒感染后宿主血淋巴细胞的活力，有效增强了拟穴青蟹对病毒的抵抗能力。
实施例7：
AMO-miR-307促进拟穴青蟹血细胞凋亡的试验
按实施例1的方法养殖拟穴青蟹并随机将其分为3组，第1组仅注射PBS，第2组注射WSSV和AMO-miR-307的混合液，第3组注射WSSV和AMO-miR-307-scrambled的混合液，注射剂量参照实施例4。注射48h后收集血淋巴细胞，利用FITC Annexin V Apoptosis Detection试剂盒(BD Pharmingen TM)对细胞进行染色，并通过流式细胞仪检测血淋巴细胞的凋亡情况。
结果见图7，拟穴青蟹被WSSV感染后，相较于阴性对照组，注射AMO-miR-307后血淋巴细胞凋亡率显著升高，表明AMO-miR-307通过诱导宿主细胞发生凋亡进而抑制WSSV在拟穴青蟹体内的复制。
实施例8：
AMO-miR-307抑制WSSV在日本囊对虾及克氏原螯虾体内增殖的试验
取体重为10-12g的日本囊对虾和克氏原螯虾在实验室暂养一周以上并随机分为3组，第1组注射WSSV感染液与AMO-miR-307的混合液，第2组注射WSSV感染液与AMO-miR-307-scrambled的混合液，第3组仅注射WSSV感染液。利用实施例3的方法分别检测注射0h、24h及48h后日本囊对虾及克氏原螯虾体内的病毒拷贝数。
结果见图8和图9，AMO-miR-307注射后24h和48h，相较于对照组，日本囊对虾及克氏原螯虾体内的WSSV拷贝数显著降低，表明AMO-miR-307能够抑制病毒在体内的复制，增加日本囊对虾及克氏原螯虾的抗病毒能力。
实施例9：
AMO-miR-307增强WSSV感染后日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力的试验
取体重为10-12g的日本囊对虾及克氏原螯虾在实验室暂养一周以上并随机分为4组，第1组只注射WSSV，第2组注射WSSV和AMO-miR-307，第3组注射WSSV和AMO-miR-307-scrambled，第4组不做任何处理。注射48h后利用Abnova公司的Cell Viability Assay Kit(Green Fluorescence)试剂盒检测日本囊对虾及克氏原螯虾血淋巴细胞的活力。
结果见图10，WSSV感染后，日本囊对虾及克氏原螯虾体内血淋巴细胞活力急剧降低，而注射AMO-miR-307后血淋巴细胞的活力显著回升，表明AMO-miR-307能够提高病毒感染后宿主血淋巴细胞的活力，有效增强了日本囊对虾及克氏原螯虾对病毒的抵抗能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一种反义核酸AMO-miR-307在制备抗白斑综合症病毒制剂中的应用
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 未知
<400> 1
cucacucaag gagguuguga 20

Claims (7)

1.一种水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307，其特征在于，序列为：5’-CUCACUCAAGGAGGUUGUGA-3’。
2.根据权利要求1所述水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307在制备广谱抗白斑综合症病毒制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂包括含反义核酸AMO-miR-307的饲料添加剂、固体或者液体药物。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂可用于甲壳类动物。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述甲壳类动物包括海水养殖蟹类、海水养殖虾类和淡水养殖虾类。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述甲壳类动物包括日本囊对虾、克氏原螯虾和拟穴青蟹。
7.一种包含根据权利要求1所述水产养殖中高效抗白斑综合症病毒的反义核酸AMO-miR-307的制剂。
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