CN111560076A - 一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用，表达的CAR分子包括信号肽、冠状病毒刺突糖蛋白的结合受体、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域；所述CAR分子还包括分泌型ACE2，通过连接肽连接在信号传导结构域的羧基端；表达所述CAR分子的免疫细胞具有靶向清除新冠病毒感染细胞的能力，并释放分泌性ACE2分子竞争性结合病毒S蛋白，以实现异体回输治疗新冠感染人群，阻止轻症向危重症的转化，对ACE2受体结合的其他病毒也具有普适性疗效，具有战略储备价值，为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的治疗提供了新的方法和思路。

Description

一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术
近来新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肆虐全球，由此引发的2019年冠状病毒病(COVID-19)为全球公共健康带来巨大威胁和挑战。该病毒最初被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，与先前确定的可导致人类疾病的人类冠状病毒严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS)冠状病毒(MERS-CoV)类似，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)可能引发威胁生命的疾病并具有大流行的潜力。
冠状病毒感染始于与宿主细胞表面受体的结合。SARS-CoV和MERS-CoV均采用病毒表面的刺突糖蛋白(S蛋白)与其受体人血管紧张素转换酶2(hACE2)结合，才得以进入细胞。Nature杂志2020年2月3日分别发表了武汉病毒所石正丽团队和复旦大学公共卫生学院张永振团队的最新研究结果：SARS-CoV-2与SARS-CoV之间的核苷酸相似性达到89.1％，同样利用S蛋白结合人体细胞表面的ACE2进入细胞，激活免疫系统，通过细胞因子、炎症因子等导致肺部损伤、严重肺衰竭甚至死亡(Xintian Xu,et al.,Evolution of the novelcoronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike proteinfor risk of human transmission.SCIENCE CHINA Life Sciences,1,21,2020.)。
hACE2是人类血管紧张素转化酶(ACE)的同源物，功能上是一种肽酶。ACE2最初发现在心脏、肾脏和睾丸中表达，后来发现在肺和消化道中也广泛表达。在肺组织中，hACE2主要分布于Ⅱ型肺泡细胞(AT2)中，少量分布于I型肺泡细胞(AT1)、气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞中。
对于COVID-19这一新发疾病，目前尚无有效的治疗药物，国内外研究人员一直在积极探索攻克方法。从目前的临床实验情况来看，化药数量占比最高，其次为生物药、细胞疗法、疫苗和中药等。生物药主要包括中和性抗体和抗炎药两大类，如特异性免疫血浆和抗IL-6受体抗体(托珠单抗、Sarilumab)等。细胞治疗作为新兴的生物制药领域，在白血病、实体肿瘤和传染病的防治中已经取得了令人瞩目的成果，发展潜力巨大。
人γδT细胞是一类存在于外周血中、具备天然免疫和适应性免疫双重功能、可应用于肿瘤细胞免疫治疗的T细胞。γδT细胞可以广谱但选择性识别杀伤功能异常或被感染的细胞，其识别和杀伤涉及靶细胞表面的MICA/B、磷酸抗原等正常细胞不表达或低表达的分子，而且该过程不涉及MHC分子的限制性，具有开发成为“off the shelf(现货)”细胞产品的潜力。γδT细胞可用于异体治疗的特质及其在实体瘤和传染性疾病治疗中的潜力促使国际医药企业纷纷在该领域布局。
目前，γδT细胞尚未应用于冠状病毒感染性疾病的治疗。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用，所述嵌合抗原受体免疫细胞稳定表达冠状病毒刺突糖蛋白的结合受体为抗原识别域的嵌合抗原受体，能够特异性识别新型冠状病毒的刺突糖蛋白(spikeglycoprotein，S蛋白)，清除新型冠状病毒感染细胞，并分泌具有中和作用的可溶性ACE2，发挥免疫细胞固有的抗肿瘤、抗感染、免疫调节生物学活性，适用于异种受体，在新冠病毒感染的防治中发挥重要作用，同时对结合ACE2受体的其他病毒(如SARS)也具有普适性疗效，具有战略储备价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域；
所述抗原结合结构域包括冠状病毒刺突糖蛋白的结合受体。
冠状病毒主要通过病毒表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein，S蛋白)结合宿主细胞表面的受体从而侵入细胞，本发明采用冠状病毒刺突糖蛋白的结合受体作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，构建的CAR分子对冠状病毒的S蛋白具有特异性识别作用，表达所述CAR分子的免疫细胞特异性靶向冠状病毒感染细胞并发挥免疫杀伤作用，实现对冠状病毒感染细胞的清除作用。
优选地，所述抗原结合结构域包括ACE2或靶向冠状病毒刺突糖蛋白的单链抗体。
本发明中，采用冠状病毒S蛋白特异性结合的人细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)作为抗原结合结构域，或采用靶向S蛋白的单链抗体作为抗原结合结构域，实现CAR分子对冠状病毒感染细胞的靶向作用。
考虑到ACE2的结合蛋白或相互作用蛋白可能成为ACE2-CAR-sACE2-γδT细胞的潜在攻击靶点，ACE2-CAR-T细胞膜表达的ACE2存在被病毒感染的风险，本发明采用全长ACE2中识别S蛋白的氨基酸序列、即截短型ACE2蛋白(tACE2，Gln18～Asp615)作为CAR分子的抗原结合结构域，该截短型ACE2蛋白不包含SLC6A19与ACE2的结合区域和ADAM17切割的ACE2胞外近膜区域，理论上可以避免脱靶效应和被病毒感染的风险。
跨膜蛋白酶ADAM17切割ACE2的细胞外近膜区域，将催化活性的胞外域释放到细胞外环境中，影响病毒感染。SARS-CoV-2进入宿主细胞时需要有TMPRSS2跨膜蛋白酶的参与，辅助ACE2与SARS-CoV-2的结合。同样，ACE2也与B0AT1氨基酸转运蛋白SLC6A19相互作用，这是肠道上皮细胞中该转运蛋白的极化表面表达所必需的。据报道，ACE2作为完整分子和/或其跨膜区在感染时与病毒外壳一起被内化，此内吞作用对病毒感染至关重要，本发明研究ACE2的相互作用蛋白(ADAM17、TMPRSS2和SLC6A19)和ACE2内化机制，优化ACE2序列，以降低脱靶效应和被病毒感染的风险。
优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYAD。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括分泌型ACE2。
优选地，为进一步提高表达CAR分子的免疫细胞对冠状病毒感染细胞的杀伤作用，在CAR分子上添加分泌型ACE2结构域，所述分泌型ACE2通过连接肽连接在信号传导结构域的羧基端，表达CAR分子的免疫细胞一方面通过ACE2抗原结合结构域识别和直接清除冠状病毒感染细胞，另一方面分泌sACE2竞争性结合冠状病毒的S蛋白，发挥中和作用，阻断病毒对宿主的侵染。
优选地，所述分泌型ACE2包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
GPGATNFSLLKQAGDVEENPGPQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS*。
优选地，所述信号肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC。
优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区。
优选地，所述CD8α铰链区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD。
优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域。
优选地，所述CD8α跨膜结构域包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5：
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC。
优选地，所述共刺激结构域包括4-1BB。
优选地，所述4-1BB包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:6：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL。
优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ。
优选地，所述CD3ζ包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:7：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
作为优选技术方案，本发明提供了一种嵌合抗原受体ACE2-CAR，所述嵌合抗原受体由信号肽、ACE2抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体ACE2-CAR包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:8：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
优选地，所述嵌合抗原受体ACE2-CAR-sACE2由信号肽、ACE2抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ、P2A和分泌型ACE2串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体ACE2-CAR-sACE2包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:9：
MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARCQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGPGATNFSLLKQAGDVEENPGPQSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQLQALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYISPIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDPGNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAATPKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHDETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQYFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQPPVS*。
第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因。
第三方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括第二方面所述的编码基因。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞。
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。
第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。
本发明中，基于γδT细胞适用于异体治疗的特质以及在实体瘤和传染性疾病治疗中的潜力，构建表达ACE2-CAR或ACE2-CAR-sACE2的γδT细胞，如图1所示，通过对健康供体的γδT细胞进行精准的基因编辑，使得CAR-γδT细胞不仅可以通过ACE2抗原结合结构域识别和直接清除冠状病毒感染细胞，而且可以分泌sACE2竞争性结合冠状病毒的S蛋白，发挥中和作用，阻断病毒对宿主的侵染，有助于通过异体回输治疗新冠感染人群，阻止新冠疾病轻症向危重症转化的几率，同时对结合ACE2受体的其他病毒(如SARS)具有普适性疗效，为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的治疗带了新的方法和思路。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括第三方面所述的慢病毒载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括表达第一方面所述的嵌合抗原受体的T细胞、γδT细胞或NK细胞中的任意一种。
第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，所述方法包括将第三方面所述的慢病毒载体或第四方面所述的重组慢病毒导入免疫细胞的步骤。
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、γδT细胞或NK细胞中的任意一种。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的慢病毒载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的慢病毒载体、第四方面所述的重组慢病毒、第五方面所述的嵌合抗原受体免疫细胞或第七方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括冠状病毒感染性疾病。
优选地，所述疾病包括2019年冠状病毒病、人类冠状病毒严重急性呼吸综合征或中东呼吸综合征中的任意一种或至少两种的组合，优选为2019年冠状病毒病。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在CAR的识别区设计了截短型的ACE2蛋白分子(tACE2；氨基酸序列为Gln18-Asp615，包含ACE2序列中结合S蛋白的区域)，其不包含胞内、跨膜及胞外近膜端(不包含SLC6A19与ACE2的结合域和ADAM17切割的ACE2胞外近膜区域)，理论上将避免脱靶效应和被病毒感染的风险；
(2)本发明采用冠状病毒S蛋白特异性结合的ACE2作为嵌合抗原受体的抗原结合结构域，构建的ACE2-CAR分子对冠状病毒的S蛋白具有特异性识别作用，表达ACE2-CAR分子的免疫细胞特异性靶向冠状病毒感染细胞并发挥免疫杀伤作用，实现对冠状病毒感染细胞的清除作用；
(3)本发明在CAR分子上添加分泌型ACE2结构域，表达ACE2-CAR-sACE2分子的γδT细胞对健康供体的γδT细胞进行精准的基因编辑，一方面通过ACE2抗原结合结构域识别和直接清除冠状病毒感染细胞，另一方面分泌sACE2竞争性结合冠状病毒的S蛋白，发挥中和作用，阻断病毒对宿主的侵染；
(4)本发明经过基因编辑的CAR-γδT细胞有助于通过异体回输治疗新冠感染人群，阻止新冠疾病轻症向危重症转化的几率，同时对结合ACE2受体的其他病毒(如SARS)具有普适性疗效，为肿瘤、免疫疾病等多种人类重大疾病的治疗带了新的方法和思路。
(5)本发明基于γδT细胞的基因修饰，可适用于防治潜在的新病毒感染风险，一旦确定新病毒的入侵受体，可直接基于本发明的平台，利用病毒受体设计CAR结构及可溶性的中和分子，清除受感染的细胞并中和病毒，为病毒治疗提供了新的方法和思路。
附图说明
图1为ACE2-CAR-sACE2-γδT细胞的作用途径；
图2A为ACE2-CAR的序列示意图，图2B为ACE2-CAR-sACE2的序列示意图；
图3为ACE2-CAR和ACE2-CAR-sACE2的结构示意图；
图4A为CAR-γδT细胞对293T-SARS-CoV-2-S细胞的杀伤作用，图4B为CAR-γδT细胞对293T-SARS-CoV-S细胞的杀伤作用；
图5为ELISA检测CAR-γδT细胞对sACE2的分泌情况；
图6A为CAR-γδT细胞对SARS-CoV-2病毒S蛋白的中和作用，图6B原理示意图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1嵌合抗原受体的设计
本实施例构建了以人血管紧张素转换酶2(ACE2)的18～615位氨基酸为抗原结合结构域的嵌合抗原受体ACE2-CAR，并在ACE2-CAR的基础上构建了具有分泌人分泌型血管紧张素转化酶2(human secreted ACE2，sACE2)功能的嵌合抗原受体ACE2-CAR-sACE2，两种嵌合抗原受体的示意图如图2A、图2B和图3所示，ACE2-CAR包括信号肽(Leader)、ACE2胞外识别S蛋白的抗原结合结构域(tACE2)、CD8α铰链区(Hinge)和跨膜区(TM)、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号传导域，ACE2-CAR-sACE2包括信号肽(Leader)、ACE2胞外识别S蛋白的抗原结合结构域(tACE2)、CD8α铰链区(Hinge)和跨膜区(TM)、4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导域和分泌型ACE2(sACE2)；
各部分氨基酸序列如SEQ ID NO:1～7所示，完整的ACE2-CAR的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示，完整的ACE2-CAR-sACE2的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
实施例2慢病毒包装
分别将ACE2-CAR和ACE2-CAR-sACE2的编码基因构建至慢病毒载体中，采用四质粒系统对构建的两种慢病毒载体进行慢病毒包装，步骤如下；
将辅助质粒gag/pol、Rev和VSV-G与两种慢病毒载体之一按比例混合，总质量为10μg，加至一定体积的无血清DMEM中，混匀放置15min；将上述混合液加至铺有293T细胞的细胞培养瓶中，轻轻混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养6h；6h后更换新鲜培养基，继续培养，并加入10mM丁酸钠溶液；72h后收集慢病毒培养上清进行纯化检测。
实施例3 CAR-γδT细胞的制备
(1)分离PBMC
采集50mL外周血；在超净工作台中向2支50mL灭菌离心管中分别加入15mL淋巴细胞分离液，将25～30mL外周血缓慢注入含有淋巴细胞分离液的离心管中，按照淋巴细胞分离液的使用说明，将离心管在700g下室温离心20min，升速1，降速2，若血液储存超过2小时，将离心时间增至30min；
离心后，血液分为4层，由血浆(上层)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第2层)、分离液(第3层)和红细胞(底层)构成，用吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管中，加入20mL PBS稀释细胞悬液，500g离心10min；移除上清液，加入20mL PBS稀释细胞悬液，混匀，取20μL细胞悬液计数，余下悬液500g离心10min备用。
(2)γδT细胞增殖诱导
加入10mL RPMI-1640培养基重悬PBMC，取20μL细胞悬液计数；
将上述细胞悬液转入细胞培养瓶中，加入2mL灭活自体血浆，IL-2的终浓度为500IU/mL、唑来膦酸的终浓度为1μM，用RPMI-1640培养基调整细胞密度至(2～3)×106个/mL，37℃、5％CO2培养箱中培养3～4天。
(3)慢病毒感染和扩大培养
显微镜下观察细胞的生长状态，增殖诱导4天后，添加慢病毒(MOI＝10)过夜感染；
感染后更换新鲜的培养基(含10％灭活自体血浆的RPMI-1640培养基，IL-2的终浓度为500IU/mL)，调整细胞密度为(1～2)×106个/mL；每2～3天观察细胞生长状态，并添加含10％灭活自体血浆的RPMI-1640培养基至培养瓶，调整细胞密度为(1～2)×106个/mL；
活化培养7天后，将培养瓶中的细胞悬液移入培养袋，添加RPMI-1640培养基在37℃、5％CO2培养箱中继续培养；培养至第10天，收集细胞进行检测。
实施例4 CAR-γδT细胞的杀伤效率
(1)稳转细胞系的构建
构建表达SARS-CoV-2的S蛋白(SEQ ID NO:10)全长基因和荧光素酶基因的慢病毒，感染293T细胞(MOI＝1)；感染3天后添加嘌呤霉素(5μg/mL)进行阳性筛选；继续筛选10天获得稳转SARS-CoV-2的S蛋白基因的细胞293T-SARS-CoV-2-S；
稳转SARS-CoV病毒的S蛋白的293T细胞采用同样的方法构建；
SEQ ID NO:10：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT。
(2)荧光素酶法检测CAR-γδT的杀伤作用
将步骤(1)构建的靶细胞293T-SARS-CoV-2-S或293T-SARS-CoV-S按照每孔5万个细胞的浓度接种于黑色96孔板中(上海晶安，货号J09602)，根据不同的效靶比(E:T＝0、1、5或10)接种CAR-γδT细胞，小心振荡混匀后置于细胞培养箱中孵育4～6h；
加入等量(90～100μL)Reconstituted reagent(Bright-Glo Luciferase AssaySystem，货号E2620)，等待至少2min(2～5min)后，去除96孔板盖，采用FLUOstar OMEGA仪器进行荧光检测，根据以下公式计算CAR-γδT的杀伤率；
杀伤率(％)＝(1-RLU实验组/RLU靶细胞only组)×100％
结果如图4A和图4B所示，ACE2-CAR和ACE2-CAR-sACE2修饰的γδT细胞对293T-SARS-CoV-2-S靶细胞均具有显著的杀伤作用，同时对293T-SARS-CoV-S细胞也显示出杀伤效果。
实施例5 ELISA检测CAR-γδT分泌sACE2
离心收集CAR-γδT细胞培养上清，采用人血管紧张素转化酶2(ACE2)ELISA检测试剂盒检测细胞培养上清中的sACE2含量，具体步骤如下：
(1)分别设置空白孔、标准孔和待测样品孔，空白孔加100μL标准品稀释液，余孔分别加50μL样品稀释液和50μL样品，轻轻晃动混匀，酶标板加覆膜，37℃孵育30min；
(2)洗板3次，弃去液体，甩干或吸干，每孔中加入100μL配制好的酶标抗体工作液(在使用前30min配制)，酶标板加覆膜，37℃孵育30min；
(3)弃去液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2min，约350μL/每孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；
(4)于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液；
(5)酶标板加覆膜37℃避光孵育7～10min(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不超过30min，当标准孔出现明显梯度时，即可终止)；
(6)每孔加入50μL终止液，终止反应，此时蓝色立转黄色，终止液的加入顺序尽量与底物溶液的加入顺序相同；
(7)立即用酶标仪在450nm波长下测量各孔的光密度(OD)值。
结果如图5所示，ACE2-CAR-sACE2修饰的γδT细胞可分泌相当数量的sACE2，ACE2-CAR-γδT和对照γδT mock细胞上清中未检测到sACE2。
实施例6 CAR-γδT细胞培养上清阻断SARS-CoV-2假病毒对Huh-7细胞的侵染
(1)SARS-CoV-2假病毒的制备
采用聚醚酰亚胺(PEI)将psPAX2、pCDH-TagRFP657和编码SARS-CoV-2S包膜质粒共转染293T细胞；转染后72h收集上清液，0.45μm过滤器过滤，800×g离心5min，去除细胞碎片。
(2)流式检测CAR-γδT的中和作用
收集不同γδT细胞的培养上清，用0.45μm滤膜过滤后，用超滤管浓缩100倍；含sACE2上清与先与SARS-CoV-2假病毒在冰上共孵育1h，将前述混合物分别加至293T-ACE2细胞上，然后室温下离心孵育1h，6h后换成新鲜培养基，48h后流式检测细胞被感染的情况；1μg/mL sACE2作为阳性对照，完全培养基作为阴性对照，293T-ACE2细胞是过表达人ACE2的293T细胞。
结果如图6A和图6B所示，相比γδT mock和ACE2-CAR-γδT细胞，ACE2-CAR-sACE2修饰的γδT细胞(ACE2-CAR-sACE2-γδT)的培养上清液可明显抑制SARS-CoV-2假病毒的侵染能力，提示其分泌的sACE2能有效中和SARS-CoV-2病毒表面的S蛋白，从而抑制SARS-CoV-2病毒的侵染能力。
综上所述，本发明的通用型ACE2-CAR-γδT细胞稳定表达ACE2受体蛋白为抗原识别域的嵌合抗原受体，能够特异性识别新型冠状病毒的S蛋白，清除新型冠状病毒感染细胞，并分泌具有中和作用的可溶性ACE2，阻断病毒对宿主的侵染，适用于异种受体，在新冠病毒感染的防治中发挥重要作用，同时对结合ACE2受体的其他病毒(如SARS)也具有普适性疗效，具有战略储备价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州百暨基因科技有限公司
<120> 一种嵌合抗原受体免疫细胞及其制备方法和应用
<130> 20200515
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 7
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 8
<211> 843
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr
20 25 30
Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser
35 40 45
Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val
50 55 60
Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu
65 70 75 80
Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu
85 90 95
Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val
100 105 110
Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met
115 120 125
Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln
130 135 140
Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser
145 150 155 160
Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu
165 170 175
Val Gly Lys Gln Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys
180 185 190
Asn Glu Met Ala Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp
195 200 205
Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg
210 215 220
Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro
225 230 235 240
Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala
245 250 255
Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu
260 265 270
Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val
275 280 285
Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp
290 295 300
Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe
305 310 315 320
Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser
325 330 335
Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr
340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys
355 360 365
Val Thr Met Asp Asp Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile
370 375 380
Gln Tyr Asp Met Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly
385 390 395 400
Ala Asn Glu Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser
405 410 415
Ala Ala Thr Pro Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp
420 425 430
Phe Gln Glu Asp Asn Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala
435 440 445
Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp
450 455 460
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465 470 475 480
Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe
545 550 555 560
Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu
565 570 575
Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr
580 585 590
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595 600 605
Val Gly Trp Ser Thr Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Thr Thr Thr Pro
610 615 620
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
625 630 635 640
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
645 650 655
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
660 665 670
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
675 680 685
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690 695 700
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
705 710 715 720
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
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Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
740 745 750
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
755 760 765
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
770 775 780
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
785 790 795 800
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
805 810 815
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
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Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<210> 9
<211> 1590
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr
20 25 30
Phe Leu Asp Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser
35 40 45
Ser Leu Ala Ser Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val
50 55 60
Gln Asn Met Asn Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu
65 70 75 80
Gln Ser Thr Leu Ala Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu
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Thr Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val
100 105 110
Leu Ser Glu Asp Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met
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Ser Thr Ile Tyr Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln
130 135 140
Glu Cys Leu Leu Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser
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Leu Asp Tyr Asn Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu
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Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro
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Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala
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Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val
275 280 285
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305 310 315 320
Val Ser Val Gly Leu Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser
325 330 335
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340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys
465 470 475 480
Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val
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500 505 510
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515 520 525
Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu
530 535 540
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545 550 555 560
Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu
565 570 575
Asn Val Val Gly Ala Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr
580 585 590
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Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
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Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
645 650 655
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
660 665 670
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
675 680 685
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
690 695 700
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
705 710 715 720
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
725 730 735
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
740 745 750
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
755 760 765
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
770 775 780
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
785 790 795 800
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
805 810 815
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820 825 830
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Pro Gly
835 840 845
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
850 855 860
Pro Gly Pro Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp
865 870 875 880
Lys Phe Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala
885 890 895
Ser Trp Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met
900 905 910
Asn Asn Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr
915 920 925
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930 935 940
Leu Gln Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu
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Asp Lys Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile
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Tyr Ser Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu
980 985 990
Leu Leu Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr
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Asn Glu Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly
1010 1015 1020
Lys Gln Leu Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn
1025 1030 1035
Glu Met Ala Arg Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp
1040 1045 1050
Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser
1055 1060 1065
Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile
1070 1075 1080
Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu
1085 1090 1095
Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro
1100 1105 1110
Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg Phe Trp Thr Asn Leu
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Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro Asn Ile Asp Val
1130 1135 1140
Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln Arg Ile Phe
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1160 1165 1170
Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro Gly Asn
1175 1180 1185
Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
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Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
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Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met
1220 1225 1230
Ala Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu
1235 1240 1245
Gly Phe His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala
1250 1255 1260
Thr Pro Lys His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe
1265 1270 1275
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1280 1285 1290
Leu Thr Ile Val Gly Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys
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Trp Arg Trp Met Val Phe Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp
1310 1315 1320
Met Lys Lys Trp Trp Glu Met Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val
1325 1330 1335
Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu
1340 1345 1350
Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg
1355 1360 1365
Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu Cys Gln Ala Ala
1370 1375 1380
Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser Asn Ser Thr
1385 1390 1395
Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly Lys Ser
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Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr
1430 1435 1440
Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
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Leu Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn
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Glu Met Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln
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Asp Val Arg Val Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe
1520 1525 1530
Phe Val Thr Ala Pro Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr
1535 1540 1545
Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp
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Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro Pro Val Ser
1580 1585 1590
<210> 10
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
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Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
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805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
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Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
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1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域；
所述抗原结合结构域包括冠状病毒刺突糖蛋白的结合受体。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域包括ACE2或靶向冠状病毒刺突糖蛋白的单链抗体；
优选地，所述抗原结合结构域包括截短型ACE2，所述截短型ACE2缺失了SLC6A19结合区域和ADAM17切割区域；
优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括分泌型ACE2；
优选地，所述分泌型ACE2通过连接肽连接在信号传导结构域的羧基端；
优选地，所述分泌型ACE2包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述信号肽包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；
优选地，所述铰链区包括CD8α铰链区；
优选地，所述CD8α铰链区包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；
优选地，所述跨膜结构域包括CD8α跨膜结构域；
优选地，所述CD8α跨膜结构域包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
优选地，所述共刺激结构域包括4-1BB；
优选地，所述4-1BB包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
优选地，所述信号传导结构域包括CD3ζ；
优选地，所述CD3ζ包括SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由信号肽、ACE2抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB和CD3ζ串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体由信号肽、ACE2抗原结合结构域、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域、4-1BB、CD3ζ、P2A和分泌型ACE2串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
4.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体。
5.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括权利要求4所述的编码基因。
6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求5所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞；
优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为293T细胞。
7.一种嵌合抗原受体免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体免疫细胞表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞的基因组中整合有权利要求4所述的编码基因；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括权利要求5所述的慢病毒载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒；
优选地，所述嵌合抗原受体免疫细胞包括表达权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体的T细胞、γδT细胞或NK细胞中的任意一种。
8.一种权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求5所述的慢病毒载体或权利要求6所述的重组慢病毒导入免疫细胞的步骤；
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、γδT细胞或NK细胞中的任意一种。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5所述的慢病毒载体、权利要求6所述的重组慢病毒或权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的编码基因、权利要求5所述的慢病毒载体、权利要求6所述的重组慢病毒、权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用；
优选地，所述疾病包括冠状病毒感染性疾病；
优选地，所述疾病包括2019年冠状病毒病、人类冠状病毒严重急性呼吸综合征或中东呼吸综合征中的任意一种或至少两种的组合，优选为2019年冠状病毒病。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112062859A (zh) * 2020-07-24 2020-12-11 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病原体清除的嵌合抗原受体及其应用
US11149286B1 (en) * 2020-08-17 2021-10-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Adenovirus vectors and methods for using adenovirus vectors
WO2021232050A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Natural killer cell immunotherapy for the treatment or prevention of sars-cov-2 infection
CN113880947A (zh) * 2021-07-26 2022-01-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
CN113943709A (zh) * 2021-09-14 2022-01-18 复旦大学 一种多功能抗hiv-1的car-t细胞及其构建方法和应用
US20220033522A1 (en) * 2020-08-03 2022-02-03 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for multidirectional biotransportation in virotherapeutics
CN114106203A (zh) * 2021-11-26 2022-03-01 杭州乾合细胞生物科技有限公司 一种含有靶向Her-2 CAR序列的核酸构建体及其应用
WO2022043943A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 Mazumdar Shaw Medical Foundation Compositions and methods for treating coronavirus infection at different level of disease severity
US11279953B2 (en) 2008-03-06 2022-03-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Single cycle replicating adenovirus vectors
CN114249799A (zh) * 2020-09-21 2022-03-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN116656614A (zh) * 2022-02-17 2023-08-29 杭州乾合细胞生物科技有限公司 一种靶向Her-2的CAR-NK细胞及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492575A (zh) * 2011-01-18 2014-01-01 安姆根有限公司 NaV1.7敲除小鼠及其用途
CN109536455A (zh) * 2018-12-11 2019-03-29 武汉波睿达生物科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法和应用
CN109609465A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用
CN109762843A (zh) * 2018-12-29 2019-05-17 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的cd3阳性t细胞制备通用car-t细胞的方法
CN111518773A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103492575A (zh) * 2011-01-18 2014-01-01 安姆根有限公司 NaV1.7敲除小鼠及其用途
CN109536455A (zh) * 2018-12-11 2019-03-29 武汉波睿达生物科技有限公司 一种car-nk细胞及其制备方法和应用
CN109609465A (zh) * 2018-12-29 2019-04-12 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的γδT细胞制备CAR-T细胞的方法及该CAR-T细胞和应用
CN109762843A (zh) * 2018-12-29 2019-05-17 武汉波睿达生物科技有限公司 一种利用脐血来源的cd3阳性t细胞制备通用car-t细胞的方法
CN111518773A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗新型冠状病毒s蛋白的car-t细胞、制备方法及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RENHONG YAN 等: "Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2", 《SCIENCE》 *
SANGYA AGARWAL等: "Harnessing CAR T-cell Insights to Develop Treatments for Hyperinfl ammatory Responses in Patients with COVID-19", 《CANCER DISCOVERY》 *
SANJEETH RAJARAM等: "The Promise and Peril of Natural Killer Cell Therapies in Pulmonary Infection", 《IMMUNITY》 *
VANESSA MONTEIL等: "Inhibition of SARS-CoV-2 Infections in Engineered Human Tissues Using Clinical-Grade Soluble Human ACE2", 《CELL》 *
VERONIKA BACHANOVA等: "Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy During the COVID-19 Pandemic", 《BIOL. BLOOD MARROW TRANSPLANT》 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11795477B2 (en) 2008-03-06 2023-10-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Single cycle replicating adenovirus vectors
US11279953B2 (en) 2008-03-06 2022-03-22 Mayo Foundation For Medical Education And Research Single cycle replicating adenovirus vectors
WO2021232050A1 (en) * 2020-05-11 2021-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Natural killer cell immunotherapy for the treatment or prevention of sars-cov-2 infection
CN112062859A (zh) * 2020-07-24 2020-12-11 沣潮医药科技（上海）有限公司 用于病原体清除的嵌合抗原受体及其应用
US20220033522A1 (en) * 2020-08-03 2022-02-03 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for multidirectional biotransportation in virotherapeutics
US11149286B1 (en) * 2020-08-17 2021-10-19 Mayo Foundation For Medical Education And Research Adenovirus vectors and methods for using adenovirus vectors
WO2022043943A1 (en) * 2020-08-27 2022-03-03 Mazumdar Shaw Medical Foundation Compositions and methods for treating coronavirus infection at different level of disease severity
CN114249799A (zh) * 2020-09-21 2022-03-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN114249799B (zh) * 2020-09-21 2023-08-29 北京化工大学 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN113880947A (zh) * 2021-07-26 2022-01-04 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 小分子抗体及其编码基因和制备方法及应用和药物组合物
CN113943709A (zh) * 2021-09-14 2022-01-18 复旦大学 一种多功能抗hiv-1的car-t细胞及其构建方法和应用
CN114106203A (zh) * 2021-11-26 2022-03-01 杭州乾合细胞生物科技有限公司 一种含有靶向Her-2 CAR序列的核酸构建体及其应用
CN116656614A (zh) * 2022-02-17 2023-08-29 杭州乾合细胞生物科技有限公司 一种靶向Her-2的CAR-NK细胞及其应用

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