JP7231745B2 - 抗SARS-CoV-2薬の調製における干渉ポリペプチドの応用 - Google Patents
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Description
前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示す。
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前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示す。
本発明は、抗SARS-CoV-2薬の調製における干渉ポリペプチドの応用を提供し、前記干渉ポリペプチドは、トランスフェリン受容体とSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合部位に基づいて設計され、新型コロナウイルスに感染した細胞を効果的に治療できる。本発明の実施例において、SPR検証後、設計された7つの干渉ポリペプチドはすべてSARS-CoV-2-スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を有意に阻害し、それによってSARS-CoV-2感染を阻害する。
前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示す。
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前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示す。本発明の前記薬の有効成分である干渉ポリペプチドの作業濃度および比例関係などはすべて上記と同じであり、ここではさらに説明しない。
SARS-CoV-2スパイクタンパク質の受容体結合領域RBDとトランスフェリン受容体の結合に関するSPR検証
まず、トランスフェリン受容体(11020-H07H、Sino biological、China)を200μlの酢酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH5)で希釈(20μg/ml)し、次にCM5センサーチップ(BR100012、GE、USA)に流し、5μl/minの流量で流れ、2000共振ユニット(RU)に達した。チップ上の残りの活性部位を、75μlのエタノールアミン(1M、pH8.5)でブロックした。スパイクタンパク質RBD(3.90625、7.8125、15.625、31.25、62.5、125、250nM)含有のTris-HCl緩衝液は、10μl/minの流速で、それらと固定化されたトランスフェリン受容体との相互作用を分析した。BIAソフトウェア(GE、米国)を使用して、結合KDおよびKaとKdの速度定数を決定した。結果が図1に示されるように、SARS-CoV-2スパイクタンパク質RBDは強い結合能でトランスフェリン受容体に結合し、Ka、Kd、KDはそれぞれ9.36×104M-1s-1、4×10-3s-1および43nMであった。
SARS-CoV-2-スパイクタンパク質-トランスフェリン受容体結合部位のタンパク質ドッキング予測
トランスフェリン受容体の既知の結晶構造(PDB ID:1CX8)とSARS-CoV-2-スパイクタンパク質の結晶構造(PDB ID:6LZG)を使用し、タンパク質ドッキング分析にZDOCKを使用した結果を図2に示し、分子ドッキングの結果は、トランスフェリン受容体がスパイクタンパク質のRBD領域と相互作用することを示した。
干渉ポリペプチドの化学的調製法、Fmoc-Lys(Boc)-Wang Resinによる合成
1.樹脂の膨潤
置換度0.3のFmoc-Leu-Wang Resin 5gを秤量し、反応カラムに注ぎ、DCM50mlを加えて膨潤させ、30分間浸した。
2.脱保護
反応カラムからDCMをすべて吸引ろ過して除去し、20%ピペリジン/DMF溶液を加えてFmocを脱着除去し、窒素で30分間バブリングし、吸引ろ過して除去し、DMFで5回洗浄し、吸引ろ過して除去した。
3.縮合反応
TBTU/DIEA活性剤の組み合わせで縮合し、秤量したTBTUと接続されたアミノ酸を3倍の投与量で計算し、50mlのDMFで溶解して反応カラムに加え、DIEA(1.55ml)を加え、窒素でバブリングし、1時間反応させた。
4.検出、洗浄
サンプリングチューブを使用して反応カラムから少量の樹脂を取り出し、小さな試験管に注ぎ、DMFで一回洗浄し、DMFを捨て、液体A、B、Cをそれぞれ3滴ずつ加え(液体A:ニンヒドリンアルコール溶液、液体B:20%アルコールと80%フェノール混合溶液、液体C:再蒸留ピリジン)、ヒーターに入れ、120℃で3分間加熱し、取り出して、溶液及び樹脂の色を観察し、溶液が黄色、樹脂が無色または淡黄色である場合、縮合反応が完了したことを示し、反応カラム中の反応を停止し、吸引ろ過して除去して、DMFで3回洗浄した。
5.再入れ
樹脂の色が緑、青、紫などの他の色であることが検出された場合は、反応が完了していないことを示し、このときに同じ方法で3回吸引ろ過して除去して洗浄し、現在の反応の同量を秤量し、それを反応カラムに入れて、検出反応が完了するまで、再反応させた。
6.縮合し続け
後続のアミノ酸接続についてステップ2~5を繰り返し、異なるアミノ酸の秤量は同じアルゴリズムを使用して計算され、TBTU/DIEAの量は変更されなかった。
7.収縮
最後のアミノ酸接続が完了した後、2つのステップを繰り返し、DCMで3回洗浄し、メタノールで3回洗浄し、吸引ろ過して除去して、樹脂を注ぎ出し、オーブンランプで乾燥させて、500mlビーカーに入れた。
8.切削
ビーカーに100mlの切削液(比率はTFA/チオアニソール/フェノール/EDT/水=86/5/4/3/2)を加え、マグネチックスターラーに置き、ビーカーに磁石を入れ、2時間撹拌して反応させた後、サンドコアファンネルでろ過し、サンドコアの樹脂をTFAで2回すすぎ、切削液を600mlの氷エーテルに注ぎ、このとき、ポリペプチドが析出してポリペプチドエーテル懸濁液を形成し、大型遠心分離機を使用してそれぞれ遠心分離を繰り返し、上清を捨て、エーテルを加えて洗浄し、このプロセスを3回繰り返し、次にオーブンランプで焼いてエーテルの残留物を除去すると、得られた固体が標的ポリペプチドの粗生成物であった。
9.精製
粗生成物を水に溶解し、ろ過した後、高速液体クロマトグラフィーで分離精製し、最終的に純度95%以上の標的ペプチド生成物が得られた。
10.調製
7グラムの粗生成物を特定の比率ACN:H2O 1:4(V/V)溶液に溶解し、少量のサンプルを採取してサンプルのピーク時間を分析した。(高速液体クロマトグラフHPLC分析)カラム100DACを調製したカラムを選択し、サンプルをカラムに入れ、粗生成物のピーク時間に応じてグラジエントを選択し、分離に入り、HPLCチャートに従って不純物を個別に収集し、LC-MSを使用して収集した製品が必要かどうかを判断し、必要な物質を検出用に残した。HPLC認定製品を、回転蒸して凍結乾燥した。必要な量の製品を得た(白色粉末の状態)。
干渉ポリペプチドがSARS-CoV-2-スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合を阻害するSPR検証
異なる濃度の干渉ポリペプチド(0.5および5μM)をスパイクしたスパイクタンパク質(60nM)を、20μl/minの流速で、スパイクタンパク質とトランスフェリン受容体の結合に対する干渉ポリペプチドの阻害効果を検出した。
SARS-CoV-2に感染したVero-E6細胞に対する干渉ポリペプチドの阻害効果
Vero E6細胞(昆明細胞バンク)をさまざまな干渉ポリペプチドで1時間前処理し、SARS-CoV2ウイルスを加えて1時間感染させた。次に、ウイルス干渉ポリペプチド混合物を除去し、干渉ポリペプチドを含む新鮮な培地を使用して細胞をさらに培養した。48時間後、細胞上清を収集し、溶解緩衝液(15596018、Thermo、USA)で溶解して、さらなる細胞病原性効果(CPE)および定量的リアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)定量分析を行った。
Target-2-F(SEQ ID NO.8):GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT、
Target-2-R(SEQ ID NO.9):CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG、
Target-2-P(SEQ ID NO.10):5’-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’。
Claims (4)
- トランスフェリン受容体とSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合を阻害するための薬剤であって、前記薬剤の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、SL8、FG8、DL12、RK4、SD6、HF7及び/又はQK8からなり、
前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示すことを特徴とする薬剤。 - 前記干渉ポリペプチドの作用濃度は、60nMのSARS-CoV-2スパイクタンパク質当たり0.5~5μMであることを特徴とする請求項1に記載の薬剤。
- 抗SARS-CoV-2薬であって、前記薬の有効成分は、干渉ポリペプチドを含み、前記干渉ポリペプチドは、SL8、FG8、DL12、RK4、SD6、HF7及び/又はQK8からなり、
前記SL8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.1に、前記FG8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.2に、前記DL12のアミノ酸配列をSEQ ID NO.3に、前記RK4のアミノ酸配列をSEQ ID NO.4に、前記SD6のアミノ酸配列をSEQ ID NO.5に、前記HF7のアミノ酸配列をSEQ ID NO.6に、前記QK8のアミノ酸配列をSEQ ID NO.7に示すことを特徴とする薬。 - 前記薬の剤形には、粉末、錠剤、顆粒剤、カプセル、溶液、乳剤、懸濁液または注射乳剤が含まれることを特徴とする請求項3に記載の薬。
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- 2020-06-22 JP JP2021539893A patent/JP7231745B2/ja active Active
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