CN114774412A - 新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用，属于医学检验技术领域；所述新冠病毒vmiRNA前体序列包括nt 476‑‑‑nt 557、nt 2122‑‑‑nt 2197和nt 2312‑‑‑nt 2380中的一种或几种。本发明的新冠病毒vmiRNA前体序列的5’臂及3’臂能够在人体细胞内表达出成熟的vmiRNA。一方面这些vmiRNA可随细胞外泌体分泌到外周血、痰液、唾液等体液，可作为病毒感染的诊断标志物。另一方面，这些vmiRNA在人体细胞内可靶向人体基因，影响其表达及功能，与新冠患者临床症状密切相关。
Description
技术领域
本发明属于医学检验技术领域，具体涉及新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用。
背景技术
新冠疫情依旧是当前全球最关注的“突发公共卫生事件”，是人类健康面临的共同挑战，新冠肺炎的诊断国际上最普遍使用的方法是基于新冠病毒基因序列开发的核酸检测，受试样本包括鼻拭子、咽拭子、下呼吸道标本等。轻症患者可采集上呼吸道的鼻咽拭子，发病1～7天内采集。重症及人工气道患者优先采集下呼吸道的痰液或肺泡灌洗液等标本。根据最新版新冠病毒诊疗指南、防控方案及实验室检测专家共识，对新冠病毒的核酸检测阴性结果不能排除新冠病毒感染，需要考虑各环节中导致假阴性的原因，包括样本质量、口咽部采样位置、患者病期、样本保存和运输方式、以及其他技术本身存在的原因等。
除了核酸检测之外，抗体检测也是目前最常用的新冠感染诊断方法。根据2002年非典SARS冠状病毒和2012年中东呼吸综合征MERS冠状病毒的研究结果，病毒感染患者之后3～6天可以在外周血检测到IgM抗体，8天之后可以检测到IgG抗体。据此，利用IgG或者IgM抗体进行新冠病毒检测的试剂盒也在全球广泛使用。其优点是患者恢复期病毒核酸检测阴性，但依旧能检测到抗体阳性，缺点是抗体特异性问题，不能排除假阳性可能性。
核酸检测不能排除假阴性，抗体检测存在抗体特异性问题。研发针对新冠病毒的快速、精准、自动化检测新技术新方法、筛查特异性高的新型生物标志物，属于当下疫情诊断亟待解决的紧迫问题。
病毒感染人体后，有可能利用宿主细胞的酶系统，对病毒RNA序列进行编辑或剪切，产生病毒来源的非编码miRNA衍生物。病毒自身基因组可编码miRNA，称之为病毒miRNA(vmiRNA)。2004年，Pfeffer等首次发现埃博拉病毒基因组来源的vmiRNA。近年来随着高通量测序技术及生物信息学的发展，在乙型肝炎病毒、腺病毒、流感病毒、埃博拉病毒等感染的哺乳动物细胞中，均发现了vmiRNA。vmiRNA反之又能调控宿主细胞，抑制宿主细胞的免疫识别和反应能力。可见vmiRNAs能够“驯化”或者“改造”宿主细胞接纳病毒的入侵，在病毒感染宿主导致疾病发生和发展的过程中发挥“恶”性作用。另有研究表明，vmiRNA在可随着外泌体分布在被感染者外周血等体液，而且vmiRNA在血液中检测到的时间，要早于病毒基因组核酸检测到的时间。新冠病毒感染人体细胞之后，病毒RNA序列可能利用宿主细胞的酶系统，合成非编码miRNA小分子衍生物，后者能够随外泌体的分泌，进入体液以及外周血。但是目前还没有新冠病毒vmiRNA的相关记载和报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用，本发明的新冠病毒vmiRNA前体序列衍生的vmiRNA可作为新冠病毒感染的诊断标志物。
本发明提供了新冠病毒vmiRNA前体序列，包括nt 476---nt 557、nt 2122---nt2197和nt 2312---nt 2380中的一种或几种；所述nt 476---nt 557、nt 2122---nt 2197和nt 2312---nt 2380的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列在人体细胞内表达成熟的新冠病毒vmiRNA。
优选的，所述新冠病毒vmiRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.83所示的vmiRNA中的一种或几种。
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者所述的新冠病毒vmiRNA作为诊断标志物在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
优选的，所述应用的方法包括：
将受试者体液作为实验组，检测受试者体液中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
将健康人的正常体液作为对照组，获得健康人的正常血样中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
若所述实验组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平高于对照组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平，则判定存在新冠肺炎的风险或者已经发生了新冠肺炎。
本发明还提供了一种用于检测受试者体液中上述方案所述的新冠病毒vmiRNA的引物组；所述引物组包括第一引物、第二引物和第三引物中的一种或几种；所述第一引物、第二引物和第三引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.86所示。
本发明还提供了一种包含上述方案所述引物组的试剂盒。
本发明还提供了上述方案所述的引物组在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者所述的新冠病毒vmiRNA的抑制剂在制备治疗新冠肺炎的药物中的应用。
优选的，所述新冠病毒vmiRNA的抑制剂包括所述新冠病毒vmiRNA的反义寡核苷酸。
本发明提供了新冠病毒vmiRNA前体序列，包括nt 476---nt 557、nt2122---nt2197和nt 2312---nt 2380中的一种或几种；所述nt 476---nt 557、nt2122---nt 2197和nt 2312---nt 2380的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。本发明的新冠病毒vmiRNA前体序列的5’臂及3’臂能够在人体细胞内表达出成熟的vmiRNA。一方面这些vmiRNA可随细胞外泌体分泌到外周血、痰液、唾液等体液，可作为病毒感染的诊断标志物。另一方面，这些vmiRNA在人体细胞内可靶向人体基因，影响其表达及功能，与新冠患者临床症状密切相关。利用新冠病毒vmiRNA作为诊断标志物，优势包括(1)外泌体分泌均匀，不受采样位置或者方式的影响；(2)唾液、痰液等体液为样本，实现了受试者无创采样，避免了鼻、咽拭子采样的不适感；(3)提高诊断准确率，避免了现有核酸检测技术的假阴性问题；(4)vmiRNA稳定，储存环境和时间对其影响小；(5)利用生物信号和光电信号的转换，可研发快速检测试纸条或者诊断芯片，达到快速、高通量检测的目的。
附图说明
图1.SEQ ID NO.1的二级结构；
图2.SEQ ID NO.2的二级结构；
图3.SEQ ID NO.3的二级结构；
图4.SEQ ID NO.1的成熟vmiRNA在患者外周血样本的定量检测；Hsa-miR-16为管家基因miRNA；
图5.SEQ ID NO.2的成熟vmiRNA在患者外周血样本的定量检测；5S核糖体RNA为管家基因；
图6.SEQ ID NO.3的成熟vmiRNA在患者外周血样本的定量检测；Hsa-miR-16为管家基因miRNA；
图7.SEQ ID NO.1的成熟vmiRNA在病毒感染细胞的基因测序结果；
图8.SEQ ID NO.2的成熟vmiRNA在病毒感染细胞的基因测序结果；
图9.SEQ ID NO.3的成熟vmiRNA在病毒感染细胞的基因测序结果。
具体实施方式
本发明提供了新冠病毒vmiRNA前体序列，包括nt 476---nt 557、nt 2122---nt2197和nt 2312---nt 2380中的一种或几种；所述nt 476---nt 557、nt 2122---nt 2197和nt 2312---nt 2380的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示，具体如下：
nt 476---nt 557，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-AUCAAACGUUCGGAUGCUCGAACUGCACCUCAUGGUCAUGUUAUGGUUGAGCUGGUAGCAGAACUCGAAGGCAUUCAGUACG-3’
nt 2122---nt 2197，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-UGUUUAUGAAAAACUCAAACCCGUCCUUGAUUGGCUUGAAGAGAAGUUUAAGGAAGGUGUAGAGUUUCUUAGAGAC-3’
nt 2312---nt 2380，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-
AAUAAAUUUUUGGCUUUGUGUGCUGACUCUAUCAUUAUUGGUGGAGCUAAACUUAAAGCCUUGAAUUUA-3’。
在本发明中，所述nt 476---nt 557、nt 2122---nt 2197和nt 2312---nt 2380发夹结构的示意图如图1～图3所示。
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列在人体细胞内表达成熟的新冠病毒vmiRNA。
在本发明中，所述新冠病毒vmiRNA包括核苷酸序列分别如所述新冠病毒vmiRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.83所示的vmiRNA中的一种或几种，具体如表1所示。其中SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.33所述的vmiRNA是由nt 476---nt 557前体在人体细胞内生成的成熟体；SEQ ID NO.34～SEQ ID NO.65所述的vmiRNA是由nt 2122---nt 2197前体在人体细胞内生成的成熟体；SEQ ID NO.66～SEQ ID NO.83所述的vmiRNA是由nt2312---nt 2380前体在人体细胞内生成的成熟体。
表1新冠病毒vmiRNA
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者所述的新冠病毒vmiRNA作为诊断标志物在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
本发明还提供了一种用于检测受试者体液中上述方案所述的新冠病毒vmiRNA的引物组；所述引物组包括第一引物、第二引物和第三引物中的一种或几种；所述第一引物、第二引物和第三引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.86所示；
SEQ ID NO.84：ggtagcagaactcgaaggca；
SEQ ID NO.85：aactcaaacccgtccttgat；
SEQ ID NO.86：tggctttgtgtgctgact。
本发明还提供了一种包含上述方案所述引物组的试剂盒。
本发明还提供了上述方案所述的引物组在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
在本发明中，所述芯片优选的包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于所述新冠病毒vmiRNA的部分或全部序列。
在本发明中，所述体液优选的包括外周血、痰液或唾液。
在本发明中，所述应用的方法优选的包括：
将受试者体液作为实验组，检测受试者体液中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
将健康人的正常体液作为对照组，获得健康人的正常体液中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
若所述实验组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平高于对照组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平，则判定存在新冠肺炎的风险或者已经发生了新冠肺炎。
本发明还提供了上述方案所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者所述的新冠病毒vmiRNA的抑制剂在制备治疗新冠肺炎的药物中的应用。
在本发明中，所述新冠病毒vmiRNA的抑制剂优选的包括所述新冠病毒vmiRNA成熟体的反义寡核苷酸，可体外化学合成。在本发明中，所述新冠病毒vmiRNA的抑制剂优选的经过化学修饰，以增强新冠病毒vmiRNA的抑制剂的稳定性和其与新冠病毒vmiRNA成熟体结合的牢固性；本发明对所述化学修饰的类型没有特殊限制，采用本领域的常规化学修饰即可。本发明所述的vmiRNA抑制剂可以特异靶向敲低vmiRNA分子，削弱vmiRNA调控宿主细胞的功能。
本发明所述的药物是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。
本发明所述药物含有安全有效量的新冠病毒vmiRNA的抑制剂以及药学上可接受的载体。在本发明中，所述药学上可接受的载体指用于治疗剂给药的载体，包括赋形剂和稀释剂。在本发明中，所述药学上可接受的载体包括：水、葡萄套溶液、生理盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素和纳米凝胶中的一种或几种。在本发明中，所述药学上可接受的载体的选择与给药方式相匹配。
在本发明中，所述药物的剂型包括注射剂、口服制剂、透皮剂或缓释剂；所述口服制剂包括片剂、胶囊或口服液。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域的常规方法即可。在本发明中，所述药物优选的在无菌条件下制备。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
nt 476---nt 557，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-AUCAAACGUUCGGAUGCUCGAACUGCACCUCAUGGUCAUGUUAUGGUUGAGCUGGUAGCAGAACUCGAAGGCAUUCAGUACG-3’
nt 2122---nt 2197，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-UGUUUAUGAAAAACUCAAACCCGUCCUUGAUUGGCUUGAAGAGAAGUUUAAGGAAGGUGUAGAGUUUCUUAGAGAC-3’
nt 2312---nt 2380，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-AAUAAAUUUUUGGCUUUGUGUGCUGACUCUAUCAUUAUUGGUGGAGCUAAACUUAAAGCCUUGAAUUUA-3’
上述三条vmiRNA前体产生的成熟vmiRNA在患者外周血样本的定量检测。
检测过程如下所示：
1、血浆收集
1)静脉抽取3ml血样至EDTA抗凝采血管，上下颠倒采血管，防止凝血，采血时避免溶血。
2)4℃，1500rpm，离心10min，取上层血浆，200μL/管分装至无核酸酶离心管，-80℃保存备用。
2、血浆RNA抽提
1)每200μL血浆加1mL Trizol，反复用移液枪吹打或剧烈震荡，室温裂解5～10min；
2)以上离心管中，每1mL Trizol加200μL氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15s，室温静置2～3min，4℃、12000g离心15min；
3)取上层水相于新EP管中，加500μL异丙醇，每管加1μL糖原，-20℃放置过夜；
4)第二天将以上EP管于4℃、12000rpm离心15min；
5)小心除去上清，按加0.2ml预冷75％乙醇进行洗涤，4℃、12000rpm离心5min，弃上清；
6)重复步骤5)；
7)室温自然干燥沉淀；
8)用10μL RNase-free water溶解RNA沉淀，检测RNA浓度及质量，-80℃保存备用。
3、鼻咽拭子样本收集
1)撕开一次性采样拭子包装上的封口纸，取出一次性采样拭子
2)手持一次性采样拭子伸进鼻腔或口腔，深度达到鼻咽底部，停留片刻，轻轻旋转采样拭子并退出
3)采集完成后，将采样拭子放入采样试管内，在有折断标记的地方折断一次性采样拭子手柄，盖上采样试管盖并拧紧，充分振荡混匀。
4、鼻咽拭子RNA提取
使用MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Small Volume Kit(Roche,Mannheim,Germany)试剂盒抽提并纯化鼻咽拭子RNA。
5、miRNA cDNA链合成
miRNA cDNA链合成(Clontech，638315)；
EP管中依次加入：5μL mRQ缓冲液(2x)，1.25μL mRQ酶，0.1～0.2μg RNA，无酶水补足体积至10μL。37℃，放置1h。85℃，放置5min。-80℃保存备用。
6、miRNA实时荧光定量检测(Clontech，638316)
384孔中依次加入10μLddH2O，12.5μL TB Green Advantage Premix(2X)，0.5μLROX Dye(50X)，1μL miRNA前引物(第一引物，第二引物或第三引物序列)，1μL mRQ3’引物(10μM)，2μLcDNA。
反应程序：预变性：95℃，10sec；扩增40个循环：95℃，5sec，60℃，20sec；溶解曲线：95℃，60sec，55℃，30sec，95℃，30sec。
第一引物：ggtagcagaactcgaaggca；
第二引物：aactcaaacccgtccttgat；
第三引物：tggctttgtgtgctgact。
检测结果参见图4～图6。
图4：荧光定量PCR技术从三个新冠患者鼻拭子样本中检测nt 476---nt 557前体产生的成熟vmiRNA(CvmiR-SEQ-ID1-3p)。人源hsa-miR-16作为内对照。
图5：荧光定量PCR技术从三个新冠患者鼻拭子样本中检测nt 2122---nt 2197前体产生的成熟vmiRNA(CvmiR-SEQ-ID2-5p)。人源5s-rRNA作为内对照。
图6：荧光定量PCR技术从三个新冠患者鼻拭子样本中检测nt 2312---nt 2380前体产生的成熟vmiRNA(CvmiR-SEQ-ID3-5p)。人源hsa-miR-16作为内对照。
实施例2
实施例1中三条成熟vmiRNA在新冠感染细胞或者患者的基因测序结果参见图7～图9。
图7：新冠病毒感染患者基因测序数据库(GSE148729)检测到源自新冠病毒nt476---nt 557序列的67个成熟vmiRNA的reads片段，覆盖了SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.33序列。
图8：新冠病毒感染患者基因测序数据库(GSE148729)检测到源自新冠病毒nt2122---nt 2197序列的419个成熟vmiRNA的reads片段，覆盖了SEQ ID NO.34～SEQ IDNO.65序列。
图9：新冠病毒感染患者基因测序数据库(GSE148729)检测到源自新冠病毒nt2312---nt 2380序列的37个成熟vmiRNA的reads片段，覆盖了SEQ ID NO.66～SEQ IDNO.83序列。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> 新冠病毒vmiRNA前体序列、新冠病毒vmiRNA及应用
<160> 86
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 82
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aucaaacguu cggaugcucg aacugcaccu cauggucaug uuaugguuga gcugguagca 60
gaacucgaag gcauucagua cg 82
<210> 2
<211> 76
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uguuuaugaa aaacucaaac ccguccuuga uuggcuugaa gagaaguuua aggaaggugu 60
agaguuucuu agagac 76
<210> 3
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aauaaauuuu uggcuuugug ugcugacucu aucauuauug guggagcuaa acuuaaagcc 60
uugaauuua 69
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtagcagaa ctcgaaggca t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtagcagaac tcgaaggcat t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggtagcaga actcgaaggc a 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agcagaactc gaaggcattc ag 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctggtagcag aactcgaagg ca 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtagcagaa ctcgaaggca tt 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agctggtagc agaactcgaa ggc 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agctggtagc agaactcgaa ggca 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagctggtag cagaactcga aggc 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agcagaactc gaaggcattc agta 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtagcagaa ctcgaaggca ttcag 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gagctggtag cagaactcga aggca 25
<210> 16
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gagctggtag cagaactcga aggcat 26
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggtagcagaa ctcgaaggca ttcagta 27
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gagctggtag cagaactcga aggcatt 27
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtagcagaac tcgaaggcat tcagtacg 28
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtagcagaa ctcgaaggca ttcagtac 28
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggttgagctg gtagcagaac tcgaaggc 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agagctggta gcagaactcg aaggcatt 28
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttgagctgg tagcagaact cgaaggca 28
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggttgagctg gtagcagaac tcgaaggca 29
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggttgagctg gtagcagaac tcgaaggcat 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gagctggtag cagaactcga aggcattcag 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggttgagct ggtagcagaa ctcgaaggca 30
<210> 28
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctggtagcag aactcgaagg cattcagtac g 31
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agagctggta gcagaactcg aaggcattca g 31
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agctggtagc agaactcgaa ggcattcagt ac 32
<210> 31
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gagctggtag cagaactcga aggcattcag tacg 34
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggttgagctg gtagcagaac tcgaaggcat tcag 34
<210> 33
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttgagctgg tagcagaact cgaaggcatt cagta 35
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaaaactca aacccgtcct tgattggctt gaag 34
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaaaaactca aacccgtcct tgattggctt g 31
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaaaaactca aacccgtcct tgattggctt 30
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaaaaactca aacccgtcct tgattggct 29
<210> 38
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaaaaactca aacccgtcct tgattggc 28
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaaaaactca aacccgtcct tgattgg 27
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gaaaaactca aacccgtcct tgattg 26
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaaaaactca aacccgtcct tgatt 25
<210> 42
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gaaaaactca aacccgtcct tgat 24
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaaaaactca aacccgtcct tga 23
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
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<400> 44
gaaaaactca aacccgtcct t 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
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gaaaaactca aacccgtcct 20
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<212> DNA
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<400> 46
aaaaactcaa acccgtcctt gattggctt 29
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aaaaactcaa acccgtcctt gatt 24
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
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<210> 49
<211> 20
<212> DNA
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<400> 49
aaaaactcaa acccgtcctt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aaaaactcaa acccgtcct 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
aaactcaaac ccgtccttga t 21
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
aactcaaacc cgtccttgat tggcttg 27
<210> 53
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aactcaaacc cgtccttgat tggctt 26
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
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<400> 54
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aactcaaacc cgtccttgat tggc 24
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
aactcaaacc cgtccttgat t 21
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aactcaaacc cgtccttgat 20
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
actcaaaccc gtccttgatt ggcttg 26
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
actcaaaccc gtccttgatt ggctt 25
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
actcaaaccc gtccttgatt ggct 24
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
actcaaaccc gtccttgatt 20
<210> 63
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ctcaaacccg tccttgattg gcttgaag 28
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tcaaacccgt ccttgattgg cttg 24
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcaaacccgt ccttgattgg ct 22
<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
taaatttttg gctttgtgtg ctgactcta 29
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
taaatttttg gctttgtgtg c 21
<210> 68
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aaatttttgg ctttgtgtgc tgactctatc at 32
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atttttggct ttgtgtgctg actctatcat 30
<210> 70
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
atttttggct ttgtgtgctg actctatcat ta 32
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
atttttggct ttgtgtgctg actctatca 29
<210> 72
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
atttttggct ttgtgtgctg actctatcat ta 32
<210> 73
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
atttttggct ttgtgtgctg actctatcat ta 32
<210> 74
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
tttttggctt tgtgtgctga ctctatcatt a 31
<210> 75
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tttggctttg tgtgctgact ctatca 26
<210> 76
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ttggctttgt gtgctgactc tatcat 26
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
tggctttgtg tgctgactct atca 24
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
tggctttgtg tgctgactct atcatta 27
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
tggctttgtg tgctgactct atcat 25
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
tggctttgtg tgctgactct atcat 25
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
tggctttgtg tgctgactct atcat 25
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
tggctttgtg tgctgactct atcatta 27
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tggctttgtg tgctgactct a 21
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ggtagcagaa ctcgaaggca 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aactcaaacc cgtccttgat 20
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tggctttgtg tgctgact 18
Claims (10)
1.新冠病毒vmiRNA前体序列，包括nt 476---nt 557、nt 2122---nt 2197和nt2312---nt 2380中的一种或几种；所述nt 476---nt 557、nt 2122---nt 2197和nt2312---nt 2380的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的新冠病毒vmiRNA前体序列在人体细胞内表达成熟的新冠病毒vmiRNA。
3.根据权利要求2所述的新冠病毒vmiRNA，其特征在于，所述新冠病毒vmiRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4～SEQ ID NO.83所示的vmiRNA中的一种或几种。
4.权利要求1所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者权利要求2或3所述的新冠病毒vmiRNA作为诊断标志物在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：
将受试者体液作为实验组，检测受试者体液中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
将健康人的正常体液作为对照组，获得健康人的正常血样中的所述新冠病毒vmiRNA的表达水平；
若所述实验组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平高于对照组中的新冠病毒vmiRNA的表达水平，则判定存在新冠肺炎的风险或者已经发生了新冠肺炎。
6.一种用于检测受试者体液中权利要求2或3所述的新冠病毒vmiRNA的引物组；所述引物组包括第一引物、第二引物和第三引物中的一种或几种；所述第一引物、第二引物和第三引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.84～SEQ ID NO.86所示。
7.一种包含权利要求5所述引物组的试剂盒。
8.权利要求6所述的引物组在制备用于预判新冠肺炎风险和/或诊断新冠肺炎的试剂盒或芯片中的应用。
9.权利要求1所述的新冠病毒vmiRNA前体序列或者权利要求2或3所述的新冠病毒vmiRNA的抑制剂在制备治疗新冠肺炎的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述新冠病毒vmiRNA的抑制剂包括所述新冠病毒vmiRNA的反义寡核苷酸。
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