CN112806435A - 一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法 - Google Patents
一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,包括以下步骤:(1)制备抗原:根据SARS‑COV‑2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原;(2)将S蛋白重组抗原加入完全弗氏佐剂,得免疫用抗原;(3)将免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫,收集含抗新冠病毒抗体的牛奶;(4)将牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂,杀菌处理并灌装冷藏保存。本发明用纯化后的S蛋白抗原免疫SPF奶牛,得到含有抗新冠病毒免疫球蛋白的牛奶,检测其含量,达到标准即可进行进一步耐热处理后灭菌灌装成品,将上述牛奶注射小鼠后,能够显著性的降低新冠病毒感染小鼠的死亡率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别涉及一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法。
背景技术
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型引起的新型冠状病毒肺炎于2019年底出现并呈现全球爆发,严重危害人类健康和公共卫生安全,给世界社会和经济带来巨大负担,已引发全球范围内的高度关注。许多国内外学者推测新冠病毒或将类似于流感病毒,与人类长期共存。而且现有的研究报道和数据表明SARS-CoV-2的致死率远高于流感,然而到目前为止还没有专门针对抗新型冠状病毒的特效药,这就必须增强我们自身的免疫力,积极预防和抵抗新冠病毒的传播。
美国耶鲁大学的科学家们宣布研制成功世界上第一种人工合成抗体,它们可以吸附在致病细胞体上并帮助触发人体对病原的免疫反应。这种机制模仿了天然抗体的行为,后者同样会吸附到血液中致病细胞和细菌的表面,并引导白细胞对其进行攻击。科学家们表示他们此次研制的人工抗体可以在室温条件下存储,其将为治疗一些严重的疾病,如癌症,提供一种崭新而便捷的治疗方案。
本发明在人工合成抗体的基础上结合多克隆抗体制备工艺,通过提高牛奶中的新冠病毒特异性免疫球蛋白含量并保持大部分活性,使人体获得抵抗和预防新冠病毒的免疫力,从而在一定程度上降低新冠病毒的传播率,甚至提高新冠病毒引起的肺炎的治愈率。
发明内容
本发明提出含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,解决了现有技术中多克隆抗体中特异性抗体含量低以及牛奶在灭菌过程中活性免疫球蛋白遇热变性的问题。
本发明的技术方案是这样实现的:
一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备抗原:根据SARS-COV-2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原;
(2)将步骤(1)制备出的S蛋白重组抗原按1:1的体积比例加入完全弗氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得免疫用抗原;
(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫;每次免疫20天后,分别检测提取免疫奶牛所产牛奶,并进行编码标记,最终特异性免疫球蛋白经ELISA检测含量超过5mg/ml后开始收集牛奶;
(4)将步骤(3)制得的含抗新冠病毒抗体的牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂,所述活性免疫球蛋白复合热变性保护剂是由甘氨酸、蔗糖、甘露醇按照3.5:2:5的质量比例混合而成,然后将含有所述保护剂的牛奶进行75℃,5min的杀菌处理并灌装冷藏保存。
可选地,步骤(1)中所述制备抗原,包括以下步骤:
1)筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株;
2)发酵生产S蛋白抗原;
3)纯化抗原。
可选地,所述筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株,包括以下步骤:
1)构建用于表达S蛋白抗原的载体;
2)将所述构建的载体转化入酵母菌株中,并在质粒转化时添加抗生素,筛选出高纯度蛋白表达菌株。
可选地,所述发酵生产S蛋白抗原,包括如下步骤:
1)甘油流加阶段:当溶氧快速上升时,表明发酵液中的碳源耗尽,开始补加甘油,甘油流加速率为2.0~10.0g/min,当湿菌重升至250~300g/L,停止甘油流加,待溶氧再次上升半小时后,开始甲醇诱导;保持较低的甘油浓度既能满足菌体生物量的增长,也能够解阻遏MOX启动子,使得代谢相关的酶类得到表达;
2)甲醇诱导阶段:调整pH至5.0,温度30℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧在20%以上,罐压为0.5bar,通过甲醇电极控制甲醇浓度为4.5~8.5g/L,能够防止甲醇过量导致的反馈抑制,同时防止甲醇浓度不足导致的蛋白表达量过低;甲醇诱导时间为40~60h,既能增加抗原表达量,同时减少多聚体的产生,增加抗原的稳定性。可选地,甲醇浓度控制在4.5~8.3g/L。可选地,甲醇浓度控制在4.6~5.8g/L。可选地,甲醇浓度控制在5.0~6.5g/L。
可选地,所述载体的外源基因表达框使用的MOX启动子序列、AOX1终止子序列、ARS(自主复制序列)在宿主表达细胞中(ATCC 26012)无完全相同序列,表达载体上的“MOX启动子-外源基因-AOX终止子”表达框能有效降低对宿主细胞当中的“MOX启动子-MOX基因-MOX终止子”进行同源替换的可能性,从而降低MOX基因被外源基因插入破坏的概率。
可选地,所述甘油流加阶段之前还包括甘油初培养阶段,所述甘油初培养阶段使用BSM无机盐培养基,调整pH至5.0,温度37℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧大于40%,罐压为0.5bar;所述BSM无机盐包括:0.90g/L CaSO4·2H2O、11.67g/L MgSO4·7H2O、14.67g/L K2SO4、9.00g/L(NH4)2SO4、50g/L甘油和25.05g/L六偏磷酸钠。
可选地,所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组酵母菌株制成种子液。
可选地,所述抗原纯化阶段,包括如下步骤:
1)菌体破碎:取发酵得到的含有S蛋白抗原的酵母菌株,用25~100mM,pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬,向悬液中加入终浓度2~5mM的EDTA、0.3%~0.7%的Tween 20及2~5mM的苯甲基磺酰氟(PMSF),使用高压匀浆机破碎细胞,得匀浆液;
2)澄清:向所述匀浆液中加入终浓度为0.1~0.5M的NaCl及终浓度3%~7%的聚乙二醇6000(PEG6000)进行澄清,得澄清后的上清液;
3)硅胶吸附/解吸附:将所述上清液经硅胶吸附/解吸附以初步去除宿主杂质;
4)离子交换层析:将经硅胶吸附/解吸附所得的洗脱液经离子交换层析后得以进一步去除宿主核酸和杂蛋白,所述离子交换层析为SepharoseDEAE FF、Sepharose Q FF或Capto Q;
5)超滤浓缩:将经离子交换层析的洗脱液进行超滤浓缩,得浓缩液;
6)超速离心:将经超滤浓缩获得的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心,得到颗粒密度更加均一的抗原成分,并获得离心液;
7)分子筛层析:将经超速离心获得的离心液进行分子筛层析,所述分子筛层析树脂为Sepharose 4FF,所得洗脱液即为抗原原液。
可选地,在所述硅胶吸附/解吸附步骤中,用25mM,pH 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次,最终用50mM,pH 10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
可选地,所述离子交换层析步骤中,洗脱液为含有500mM NaCl,pH为8.0的缓冲液。
可选地,所述超滤浓缩步骤中,超滤系统进端压力保持在10~30psi,回流段压力保持在2~7psi,跨膜压(Transmembrane Pressure,TMP)控制在5~15psi。
其中,所述超速离心步骤中,所用介质为溴化钾,密度为1.05~1.30g/ml,离心转速控制在20000~30000rpm,离心时间控制在15~25h,离心温度控制在4~25℃。
可选地,所述分子筛层析步骤中,样品进样体积为柱体积的2%~5%,洗脱液为含有150mM NaCl,pH 7.2的磷酸盐缓冲液,收集色谱峰中对应的病毒样颗粒(Virus-likeParticles,VLP)组分即为原液。
可选地,所述免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫,包括初次免疫和四次增强免疫,所述四次增强免疫在初次免疫之后,其中,初次免疫采用5mg的抗原和完全弗氏佐剂按1:1的比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug;四次增强免疫均采用5mg的抗原和不完全弗氏佐剂按1:1的体积比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug。
可选地,所述SPF奶牛为在SPF环境下饲养的专门用于抗体生产的优质高产的中国荷斯坦奶牛,其所产牛奶的杂乱Ig含量低于6mg/ml。
可选地,所述特异性免疫球蛋白含量为5mg/ml以上。
本发明的有益效果是:
1、本发明的酵母表达S蛋白抗原的生产方法获得的菌株拷贝数高、遗传稳定;高密度发酵后酵母细胞仅需要破碎、澄清、硅胶吸附/解吸附、离子交换、超滤浓缩、超速离心和分子筛层析,即可获得高纯度、高回收率的S蛋白抗原,且工艺周期短、抗原纯度高、颗粒均一,质量稳定。
2、本发明用纯化后的S蛋白抗原免疫SPF奶牛,得到含有抗新冠病毒免疫球蛋白的牛奶,检测其含量,达到标准即可进行进一步耐热处理后灭菌灌装成品,将上述牛奶注射小鼠后,能够显著性的降低新冠病毒感染小鼠的死亡率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明含抗体牛奶抗原纯化结果图。
具体实施方式
为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果,以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明,否则文中使用的所有技术及科学上的字词,皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义,当有冲突情形时,应以本说明书的定义为准。
在本文中,用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase),其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言,含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已,而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外,除非有相反的明确说明,否则用语“或”是指涵盖性的“或”,而不是指排他性的“或”。例如,以下任何一种情况均满足条件“A或B”:A为真(或存在)且B为伪(或不存在)、A为伪(或不存在)且B为真(或存在)、A和B均为真(或存在)。此外,在本文中,用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由…所组成”及“实质上由…所组成”等封闭式或半封闭式连接词。
在本文中,所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此,数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值,特别是整数数值。举例而言,“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围,特别是由所有整数数值所界定的次级范围,且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明,否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容,不论范围广泛与否。
若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示,则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围,不论这些范围是否有分别公开。此外,本文中若提到数值的范围时,除非另有说明,否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。
在本文中,在可实现发明目的的前提下,数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说,数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。在本文中,对于使用马库什群组(Markush group)或选项式用语以描述本发明特征或实例的情形,本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或任何个别要素亦可用于描述本发明。举例而言,若X描述成“选自于由X1、X2及X3所组成的群组”,亦表示已经完全描述出X为X1的主张与X为X1及/或X2的主张。再者,对于使用马库什群组或选项式用语以描述本发明的特征或实例的情况,本领域技术人员应了解马库什群组或选项列表内所有要素的次级群组或个别要素的任何组合亦可用于描述本发明。据此,举例而言,若X描述成“选自于由X1、X2及X3所组成的群组”,且Y描述成“选自于由Y1、Y2及Y3所组成的群组”,则表示已经完全描述出X为X1或X2或X3而Y为Y1或Y2或Y3的主张。
以下具体实施方式本质上仅是例示性,且并不欲限制本发明及其用途。此外,本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
实施例1:
一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备抗原:根据SARS-COV-2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原;
(2)将步骤(1)制备出的S蛋白重组抗原按1:1的体积比例加入完全弗氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8000rpm高速匀化,形成油包水液体,即制得免疫用抗原;
(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫;每次免疫20天后,分别检测提取免疫奶牛所产牛奶,并进行编码标记,最终特异性免疫球蛋白经ELISA检测含量超过5mg/ml后开始收集牛奶;
(4)将步骤(3)制得的含抗新冠病毒抗体的牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂,所述活性免疫球蛋白复合热变性保护剂是由甘氨酸、蔗糖、甘露醇按照3.5:2:5的质量比例混合而成,然后将含有所述保护剂的牛奶进行75℃,5min的杀菌处理并灌装冷藏保存。
可选地,步骤(1)中所述制备抗原,包括以下步骤:
1)筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株;
2)发酵生产S蛋白抗原;
3)纯化抗原。
可选地,所述筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株,包括以下步骤:
1)构建用于表达S蛋白抗原的载体;
2)将所述构建的载体转化入酵母菌株中,并在质粒转化时添加抗生素,筛选出高纯度蛋白表达菌株。
可选地,所述发酵生产S蛋白抗原,包括如下步骤:
1)甘油流加阶段:当溶氧快速上升时,表明发酵液中的碳源耗尽,开始补加甘油,甘油流加速率为2.0~10.0g/min,当湿菌重升至250~300g/L,停止甘油流加,待溶氧再次上升半小时后,开始甲醇诱导;保持较低的甘油浓度既能满足菌体生物量的增长,也能够解阻遏MOX启动子,使得代谢相关的酶类得到表达;
2)甲醇诱导阶段:调整pH至5.0,温度30℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧在20%以上,罐压为0.5bar,通过甲醇电极控制甲醇浓度为4.5~8.5g/L,能够防止甲醇过量导致的反馈抑制,同时防止甲醇浓度不足导致的蛋白表达量过低;甲醇诱导时间为40~60h,既能增加抗原表达量,同时减少多聚体的产生,增加抗原的稳定性。可选地,甲醇浓度控制在4.5~8.3g/L。可选地,甲醇浓度控制在4.6~5.8g/L。可选地,甲醇浓度控制在5.0~6.5g/L。
可选地,所述载体的外源基因表达框使用的MOX启动子序列、AOX1终止子序列、ARS(自主复制序列)在宿主表达细胞中(ATCC 26012)无完全相同序列,表达载体上的“MOX启动子-外源基因-AOX终止子”表达框能有效降低对宿主细胞当中的“MOX启动子-MOX基因-MOX终止子”进行同源替换的可能性,从而降低MOX基因被外源基因插入破坏的概率。
可选地,所述甘油流加阶段之前还包括甘油初培养阶段,所述甘油初培养阶段使用BSM无机盐培养基,调整pH至5.0,温度37℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧大于40%,罐压为0.5bar;所述BSM无机盐包括:0.90g/L CaSO4·2H2O、11.67g/L MgSO4·7H2O、14.67g/L K2SO4、9.00g/L(NH4)2SO4、50g/L甘油和25.05g/L六偏磷酸钠。
可选地,所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组酵母菌株制成种子液,后期进行扩大培养。
可选地,所述抗原纯化阶段,包括如下步骤:
1)菌体破碎:取发酵得到的含有S蛋白抗原的酵母菌株,用25~100mM,pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬,向悬液中加入终浓度2~5mM的EDTA、0.3%~0.7%的Tween 20及2~5mM的苯甲基磺酰氟(PMSF),使用高压匀浆机破碎细胞,得匀浆液;
2)澄清:向所述匀浆液中加入终浓度为0.1~0.5M的NaCl及终浓度3%~7%的聚乙二醇6000(PEG6000)进行澄清,得澄清后的上清液;
3)硅胶吸附/解吸附:将所述上清液经硅胶吸附/解吸附以初步去除宿主杂质;
4)离子交换层析:将经硅胶吸附/解吸附所得的洗脱液经离子交换层析后得以进一步去除宿主核酸和杂蛋白,所述离子交换层析为SepharoseDEAE FF、Sepharose Q FF或Capto Q;
5)超滤浓缩:将经离子交换层析的洗脱液进行超滤浓缩,得浓缩液;
6)超速离心:将经超滤浓缩获得的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心,得到颗粒密度更加均一的抗原成分,并获得离心液;
7)分子筛层析:将经超速离心获得的离心液进行分子筛层析,所述分子筛层析树脂为Sepharose 4FF,所得洗脱液即为抗原原液。
可选地,在所述硅胶吸附/解吸附步骤中,用25mM,pH 7.2的磷酸盐缓冲液洗涤硅胶沉淀至3次,最终用50mM,pH 10.8的碳酸盐缓冲液进行洗脱。
可选地,所述离子交换层析步骤中,洗脱液为含有500mM NaCl,pH为8.0的缓冲液。
可选地,所述超滤浓缩步骤中,超滤系统进端压力保持在10~30psi,回流段压力保持在2~7psi,跨膜压(Transmembrane Pressure,TMP)控制在5~15psi。
其中,所述超速离心步骤中,所用介质为溴化钾,密度为1.05~1.30g/ml,离心转速控制在20000~30000rpm,离心时间控制在15~25h,离心温度控制在4~25℃。
可选地,所述分子筛层析步骤中,样品进样体积为柱体积的2%~5%,洗脱液为含有150mM NaCl,pH 7.2的磷酸盐缓冲液,收集色谱峰中对应的病毒样颗粒(Virus-likeParticles,VLP)组分即为原液。
可选地,所述免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫,包括初次免疫和四次增强免疫,所述四次增强免疫在初次免疫之后,其中,初次免疫采用5mg的抗原和完全弗氏佐剂按1:1的体积比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug;四次增强免疫均采用5mg的抗原和不完全弗氏佐剂按1:1的体积比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug。
可选地,所述SPF奶牛为在SPF环境下饲养的专门用于抗体生产的优质高产的中国荷斯坦奶牛,其所产牛奶的杂乱Ig含量低于6mg/ml。
可选地,所述特异性免疫球蛋白含量为5mg/ml以上。
对最终样品进行分析,结果如图1所示。本发明表达和纯化后的产品,S蛋白抗原纯度达到99%以上。结果显示,上述最终产品能够形成结构稳定、均一的VLP,使用本发明的酵母表达S蛋白抗原的生产方法获得的菌株拷贝数高、遗传稳定;高密度发酵后酵母细胞仅需要破碎、澄清、硅胶吸附/解吸附、离子交换、超滤浓缩、超速离心和分子筛层析,即可获得高纯度、高回收率的S蛋白抗原,且工艺周期短、抗原纯度高、颗粒均一,质量稳定。
实施例2:
将制备的重组蛋白免疫实验兔,提取特异性多克隆抗体,并进行病毒中和实验,以验证制备的重组抗原是否能产生有效的中和抗体。
试验需先滴定病毒毒价,试验时将其稀释成每一单位剂量含200个TCID50,再将待检血清倍比稀释加等量200个TCID50/ml的病毒液,混匀后37℃1h,每一稀释度接种24孔细胞培养板4孔,每孔0.2ml,置于5%CO2培养箱培养一定时间后,记录出现CPE孔数,如表1所示,以不出现CPE数和接种数的比为中和比值。按Karber法计算中和价。其公式如下:LogTCID50=L+d(S-0.5)(TCID50用对数计算,L为病毒最低稀释度的对数,d为组距,即稀释系数,在10倍系列稀释则为-1,S为各组CPE与接种数比值之和)
表1病毒液TCID50记录表
L=-1,d=-0.3,S=4/4+4/4+4/4+4/4+2/4=4.5
代入Karber公式:LogND50=-1-0.3*(4.5-0.5)=2.2
该抗血清ND50(半数中和单位)为10-2.2,即1/160,则其中和价为160ND50/ml。
实施例3:
用验证完毕的重组抗原免疫SPF实验奶牛,免疫流程如表2所示:
表2重组抗原免疫SPF实验奶牛流程表
免疫次数 | 免疫剂量 | 免疫部位 |
第一次免疫 | 5mg,弗氏完全佐剂 | 皮下,腋窝和背颈部20点 |
第二次免疫 | 5mg,弗氏不完全佐剂 | 皮下,腋窝和背颈部20点 |
第三次免疫 | 5mg,弗氏不完全佐剂 | 皮下,腋窝和背颈部20点 |
第四次免疫 | 5mg,弗氏不完全佐剂 | 皮下,腋窝和背颈部20点 |
第五次免疫 | 5mg,弗氏不完全佐剂 | 皮下,腋窝和背颈部20点 |
实施例4:
检测牛奶中特异性抗体效价,采用ELISA法,结果如表3所示。
表3 ELISA检测结果
Tab.3 The results of ELISA
结果表明,经过五次免疫后的牛奶中特异性抗体含量比较高,且线性关系良好,能够有效抑制病毒,可以进行牛奶的收集和处理。
实施例5:
对收集的牛奶进行进一步处理,使之在符合食品安全规范的前提下最大限度保留特异性的活性免疫球蛋白含量。在牛奶中添加复合热变性保护剂,配比为甘氨酸添加量3.5%,蔗糖添加量2%,甘露醇添加量5%,并在75℃,5min的条件下对牛奶进行灭菌操作。
复合热变性保护剂的配方研究
75℃加热5min,免疫活性lgG残留率与甘氨酸(X1)、蔗糖(X2)、甘露醇添加量(X3)的回归方程为:
Y=44.04+7.48X1+2.50X2+5.26X3+3.09X12-4.75X1Y2-1.5X1Xj-5.93X22+4.75X2X3-4.70X32。
利用回归模型预测甘氨酸、蔗糖、甘露醇对牛初乳免疫球蛋白IgG的复合热保护效果可达到60%以上,3个自变量对免疫活性IgG残留率的贡献为:甘氨酸>甘露醇>蔗糖。
75℃,5min条件下,牛奶免疫活性IgG复合热保护剂的较理想配方:甘氨酸:蔗糖:甘露醇的质量比为3.5:2:5。
实施例6:
处理完毕的牛奶进行活性免疫球蛋白检测。
经ELISA酶联免疫吸附检测,牛奶的活性免疫球蛋白残留量大于12mg/ml,结果显示复合热保护剂防止了灭菌过程中对蛋白的变性作用。
获得模型鼠:内源性小鼠ACE2(mACE2)替换为转基因小鼠ACE2(hACE2),hACE2小鼠在鼻内感染后均在肺、气管和脑中维持高病毒载体,在新冠病毒感染的hACE2小鼠中发现了间质性肺炎和细胞因子升高。
将50只模型鼠腹腔注射实施例6的牛奶,50只对照鼠腹腔注射不含抗新冠病毒免疫球蛋白的牛奶,腹腔注射均每天一次,每只小鼠200ul。发现饲喂牛奶的模型组的死亡率为11%,而对照组死亡率为89%,饲喂组死亡率明显低于对照组。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)制备抗原:根据SARS-COV-2S蛋白的基因序列采用酵母菌重组抗原的方法制备纯化新冠病毒抗原;
(2)将步骤(1)制备出的S蛋白重组抗原按1:1的体积比例加入完全弗氏佐剂,置入高速匀浆器中,以8000rpm高速匀化,形成油包水液体,即得免疫用抗原;
(3)将步骤(2)制备出的免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫;每次免疫20天后,分别检测提取免疫奶牛所产牛奶,并进行编码标记,最终特异性免疫球蛋白经ELISA检测含量超过5mg/ml后开始收集牛奶,即为含抗新冠病毒抗体的牛奶;
(4)将步骤(3)制得的含抗新冠病毒抗体的牛奶添加活性免疫球蛋白复合热变性保护剂,所述活性免疫球蛋白复合热变性保护剂是由甘氨酸、蔗糖、甘露醇按照3.5:2:5的质量比例混合而成,然后将含有所述保护剂的牛奶进行75℃,5min的杀菌处理并灌装冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述制备抗原,包括以下步骤:
1)筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株;
2)发酵生产S蛋白抗原;
3)纯化抗原。
3.根据权利要求2所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述筛选S蛋白抗原高蛋白表达的重组酵母菌株,包括以下步骤:
1)构建用于表达S蛋白抗原的载体;
2)将所述载体转化入酵母菌株中,并在质粒转化时添加抗生素,筛选出高蛋白表达菌株。
4.根据权利要求2所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述发酵生产S蛋白抗原,包括如下步骤:
1)甘油流加阶段:当溶氧快速上升时,甘油流加速率为2.0~10.0g/min,当湿菌重升至250~300g/L,停止甘油流加,待溶氧再次上升半小时后,开始甲醇诱导;
2)甲醇诱导阶段:调整pH至5.0,温度30℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧在20%以上,罐压为0.5bar,通过甲醇电极控制甲醇浓度为4.5~8.5g/L,诱导时间为40~60h。
5.根据权利要求4所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述甘油流加阶段之前还包括甘油初培养阶段,所述甘油初培养阶段使用BSM无机盐培养基,调整pH至5.0,温度37℃,通气量15.0~35.0L/min,控制溶氧大于40%,罐压为0.5bar。
6.根据权利要求5所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述甘油初培养阶段之前还包括将所述重组酵母菌株制成种子液。
7.根据权利要求2所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述抗原纯化阶段,包括如下步骤:
1)菌体破碎:取发酵得到的含有S蛋白抗原的酵母菌株,用25~100mM,pH 8.0的磷酸盐缓冲液重悬,向悬液中加入终浓度2~5mM的EDTA、0.3%~0.7%的Tween 20及2~5mM的苯甲基磺酰氟,使用高压匀浆机破碎细胞,得匀浆液;
2)澄清:向所述匀浆液中加入终浓度为0.1~0.5M的NaCl及终浓度3%~7%的聚乙二醇6000澄清,得澄清后的上清液;
3)硅胶吸附/解吸附:将所述上清液经硅胶吸附/解吸附以初步去除宿主杂质;
4)离子交换层析:将经硅胶吸附/解吸附所得的洗脱液经离子交换层析后得以进一步去除宿主核酸和杂蛋白,所述离子交换层析为SepharoseDEAE FF、Sepharose Q FF或CaptoQ;
5)超滤浓缩:将经离子交换层析的洗脱液进行超滤浓缩,得浓缩液;
6)超速离心:将经超滤浓缩获得的浓缩液进行溴化钾等密度梯度离心,得到颗粒密度更加均一的抗原成分,并获得离心液;
7)分子筛层析:将经超速离心获得的离心液进行分子筛层析,所述分子筛层析树脂为Sepharose 4FF,所得洗脱液即为抗原原液。
8.根据权利要求1所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述免疫用抗原对SPF奶牛进行免疫,包括初次免疫和四次增强免疫,所述四次增强免疫在初次免疫之后,其中,初次免疫采用5mg的抗原和完全弗氏佐剂按1:1的体积比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug;四次增强免疫均采用5mg的抗原和不完全弗氏佐剂按1:1的体积比例乳化,在SPF奶牛的腋窝、背部、颈部选择20个点进行皮下免疫,每个点免疫剂量为250ug。
9.根据权利要求8所述的一种含抗新冠病毒抗体牛奶的制备方法,其特征在于,所述特异性免疫球蛋白含量为5mg/ml以上。
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