CN115184432A - 用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，属于生物检测技术领域。本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，其工作电极为包括不锈钢片、双层塑封膜和导电碳浆层的不锈钢片碳浆电极，不锈钢片的一端塑封在双层塑封膜的夹层中，双层塑封膜上设有孔洞，不锈钢片暴露在孔洞处的部分设有导电碳浆层，导电碳浆层上修饰有能够与新型冠状病毒抗原特异性结合的抗体。所述传感器将新型冠状病毒抗原抗体通过吸附固定在不锈钢片碳浆电极表面来构建得到灵敏的传感界面，然后以构建的传感界面为敏感元件，通过电化学测定抗原抗体反应后传器界面电子转移的变化来实现SARS‑CoV‑2抗原的定量分析。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，属于生物检测技术领域。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是目前已知的第7种可感染人类的冠状病毒。相较于SARS病毒和流行性流感病毒，SARS-CoV-2的人际传播速度更快、潜伏期更长，并且，由于SARS-CoV-2在上呼吸道的病毒载量高，导致患者发病后具有强传染性。SARS-CoV-2感染的临床症状主要以发热、干咳、乏力为主；重症多发生呼吸困难，快速进展为急性呼吸窘迫综合征，脓毒症休克，甚至出现代谢性酸中毒和出凝血功能障碍等，严重危害人体健康。及时对患者进行 SARS-CoV-2检测对患者的病情诊断和后续治疗十分关键。
基于核酸的分子生物学检测方法是目前最主要的病毒检测方法。其中，实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR)技术因其灵敏度高、特异性强等特点，成为目前SARS-CoV-2检测最常用的手段之一。但是，实时荧光定量PCR技术仍存在很多缺点，例如，由于检测样本多来自于病人的呼吸道，样本中含病毒含量较高，使用实时荧光定量PCR技术进行SARS-CoV-2 检测对医护人员来说存在被感染的潜在风险；实时荧光定量PCR技术步骤繁琐，需要专业人员(持证上岗)和专业的PCR仪器，标准及规范的基因扩增实验室设置标准分区，各区通风良好，保证整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染，检测要求高；并且，由于涉及到专业人员和仪器，使用实时荧光定量PCR技术进行SARS-CoV-2检测成本高、检测耗时长且周转期长。
基于抗原抗体反应的免疫学分析技术具有检测快速、操作简便、快速、特异性高、相对成本低和周转时间快等优势，非专业人员亦可操作，通过目视或便携式设备即可判断结果，可快速、简便地对症状疑似人员、自我检测需求的人员或从事高风险人员进行筛查，足以弥补实时荧光定量PCR技术的不足，能够作为基于核酸的分子生物学检测方法的有益补充。目前，SARS-CoV-2抗原检测已成为SARS-CoV-2感染诊断的有效参考依据，显著缓解了SARS-CoV-2 感染人群筛查的压力，有效提高了SARS-CoV-2筛查的效率。
免疫传感器是一种生物传感器，它将传统的免疫分析和生物传感技术融为一体，不仅减少了分析时间，提高了灵敏度和测试精度，还简化了抗原检测过程，易于实现自动化，应用前景广泛。因此，可通过开发用于SARS-CoV-2抗原检测的免疫传感器进一步提高SARS-CoV-2筛查的效率。但是，现有的用于 SARS-CoV-2抗原检测的免疫传感器仍存在很多的缺陷，例如，Kiew等人将重组ACE2修饰钯纳米薄膜(Pd-NTF)涂层电极以构建用于SARS-CoV-2S蛋白检测的免疫传感器，此免疫传感器不仅用于筛选S蛋白-ACE2潜在的抑制剂，而且能够基于电化学阻抗谱对SARS-CoV-2S蛋白进行定量检测，但是，此免疫传感器检测SARS-CoV-2S蛋白检出限为0.1μg/mL，检测灵敏度有待进一步提高(参见文献：V.Kiew,C.Y.Chang,S.Y.Huang,P.W.Wang,C.H.Heh,C.T.Liu, C.H.Cheng,Y.X.Lu,Y.C.Chen,Y.X.Huang,S.Y.Chang.Development of flexible electrochemical impedancespectroscopy-based biosensing platform for rapid screening of SARS-CoV-2inhibitors Biosens.Bioelectron.,183(2021),113213.)。因此，亟需开发灵敏度高的用于SARS-CoV-2抗原检测的免疫传感器，以解决现有用于SARS-CoV-2抗原检测的免疫传感器存在的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种不锈钢片碳浆电极，所述不锈钢片碳浆电极包括不锈钢片和双层塑封膜；所述不锈钢片的一端塑封在双层塑封膜的夹层中；所述双层塑封膜上设有孔洞；所述不锈钢片暴露在孔洞处的部分设有导电碳浆层；所述导电碳浆层上修饰有能够与新型冠状病毒抗原特异性结合的抗体。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体在不锈钢片碳浆电极上的修饰浓度为0.01～0.1mg/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述抗体为抗SARS-CoV-2N蛋白或抗 SARS-CoV-2S蛋白；所述抗原为N蛋白或S蛋白。
本发明还提供了一种制备上述不锈钢片碳浆电极的方法，所述方法为：将不锈钢片用丙酮、乙醇和双蒸水分别进行超声清洗后烘干，得到经处理的不锈钢片；在双层塑封膜上打孔，得到经打孔的双层塑封膜；将经处理的不锈钢片的一端塑封在经打孔的双层塑封膜的夹层中，得到经封层的不锈钢片；将碳浆滴加在经封层的不锈钢片暴露在孔洞处的部分后干燥，形成导电碳浆层，得到修饰有导电碳浆层的不锈钢片；将抗体溶液滴加在修饰有导电碳浆层的不锈钢片的导电碳浆层上后进行孵育，得到修饰有抗体的不锈钢片；将牛血清白蛋白溶液滴加在修饰有抗体的不锈钢片的导电碳浆层上后进行孵育，得到不锈钢片碳浆电极。
本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，所述三电极体系电化学传感器以上述不锈钢片碳浆电极为工作电极。
在本发明的一种实施方式中，所述三电极体系电化学传感器以银-氯化银电极、铜电极或甘汞电极为参比电极，以铂丝电极或铂片电极为对电极。
本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系，所述检测体系包括上述三电极体系电化学传感器以及滤纸；所述滤纸通过不锈钢片碳浆电极双层塑封膜上的孔洞覆盖在不锈钢片碳浆电极的导电碳浆层上。
本发明还提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，所述试剂盒包括上述检测体系以及工作试剂；所述工作试剂为铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合溶液；所述混合溶液中添加有氯化钾。
在本发明的一种实施方式中，所述混合溶液中，铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度为1～10mmol/L，且铁氰化钾和亚铁氰化钾的摩尔比为1:0.5～2；所述混合溶液中，氯化钾的浓度为0.01～1mmol/L。
本发明还提供了一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法使用上述试剂盒，包括如下步骤：
标准曲线的绘制：将梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液分别滴加在三电极体系电化学传感器工作电极的导电碳浆层上进行反应后，吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极的滤纸上后，将电化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V 下测得梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液的电化学阻抗谱；以新型冠状病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的电化学阻抗谱为纵坐标，绘制标准曲线；
新型冠状病毒抗原的定量检测：将待测样本滴加在三电极体系电化学传感器工作电极的导电碳浆层上进行反应后，吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极的滤纸上后，将电化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下测得待测样本的电化学阻抗谱；将与待测样本对应的电化学阻抗谱带入标准曲线，得到待测样本中新型冠状病毒抗原的浓度。
本发明还提供了上述不锈钢片碳浆电极或上述三电极体系电化学传感器或上述检测体系或上述试剂盒或上述方法在新型冠状病毒抗原定量检测中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，所述三电极体系电化学传感器以不锈钢片碳浆电极为工作电极；所述工作电极为不锈钢片碳浆电极；所述不锈钢片碳浆电极包括不锈钢片、双层塑封膜和导电碳浆层；所述不锈钢片的一端塑封在双层塑封膜的夹层中；所述双层塑封膜上设有孔洞；所述不锈钢片暴露在孔洞处的部分设有导电碳浆层；所述导电碳浆层上修饰有能够与新型冠状病毒抗原特异性结合的抗体。所述三电极体系电化学传感器以新型冠状病毒抗原为检测对象，将新型冠状病毒抗原抗体通过吸附固定在不锈钢片碳浆电极表面来构建得到灵敏的传感界面，然后以构建的传感界面为敏感元件，通过电化学测定抗原抗体反应后传器界面电子转移的变化来实现SARS-CoV-2抗原的定量分析。与现有的使用丝网印刷电极(SPEs) 构建的免疫传感器相比，所述三电极体系电化学传感器以不锈钢片碳浆电极为工作电极，不仅检测样品用量少，能够降低检测成本，而且不锈钢片为三电极体系电化学传感器提供了良好的导电底，能够有效提高使用三电极体系电化学传感器检测新型冠状病毒抗原的灵敏度，增加窗口期检出率。与现有的使用玻碳电极构建的免疫传感器相比，所述三电极体系电化学传感器无需在每次检测前都需要仔细打磨抛光处理去除之前可能残留的污染(玻碳电极需要)，简化了生产程序，优化了三电极体系电化学传感器的生产工艺，节省了生产成本。综上，本发明提供的一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器灵敏度高、易制备、成本低廉、重现性好，在新型冠状病毒抗原检测方面有较好的应用前景。
附图说明
图1：用于检测新型冠状病毒的三电极体系电化学传感器的工作电极的结构示意图。图1中，不锈钢片1、双层塑封膜2、滤纸3、孔洞4、导电碳浆层5。
图2：用于检测新型冠状病毒的三电极体系电化学传感器的检测原理图。
图3：电极的CV曲线。
图4：电极的电化学阻抗谱。图4中，a：丝网印刷碳电极；b：不锈钢碳浆电极。
图5：使用梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液测得的DPV曲线。图5中， a：50pg/mL；b：5pg/mL；c：1.0pg/mL；d：0.5pg/mL；e：0.1pg/mL；f：0.05pg/mL (实施例3)。
图6：使用梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液测得的电化学阻抗谱。图6 中，a：50pg/mL；b：5pg/mL；c：1.0pg/mL；d：0.5pg/mL；e：0.1pg/mL；f： 0.05pg/mL。
图7：以新型冠状病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的DPV曲线为纵坐标绘制得到的标准曲线。
图8：以新型冠状病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的电化学阻抗谱为纵坐标绘制得到的标准曲线。
图9：使用梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液测得的DPV曲线。图9中，a：50pg/mL；b：5pg/mL；c：1.0pg/mL；d：0.5pg/mL；e：0.1pg/mL；f：0.05pg/mL (对比例3)。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器
如图1所示，本实施例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，所述三电极体系电化学传感器以不锈钢片碳浆电极为工作电极，以银-氯化银电极(购自上海辰华公司)为参比电极，以铂丝电极(购自上海辰华公司)为对电极；所述不锈钢片碳浆电极包括不锈钢片1和双层塑封膜 2；所述不锈钢片1的一端塑封在双层塑封膜2的夹层中；所述双层塑封膜2 上设有孔洞4；所述不锈钢片1暴露在孔洞4处的部分设有导电碳浆层5；所述导电碳浆层5上修饰有能够与新型冠状病毒N蛋白特异性结合的抗 SARS-CoV-2N蛋白抗体；所述不锈钢片的长度为2cm、宽度为1cm；所述双层塑封膜的长度为1.5cm、宽度为1cm；所述孔洞的直径为4mm(此三电极体系电化学传感器的检测原理见图2)。
上述工作电极的制备方法包括如下步骤：
工作电极的制备：将304不锈钢片(购自上海宇通公司)裁剪成1.0×2.0cm 的薄片；将薄片依次用丙酮、乙醇和双蒸水超声清洗15min后，于50℃下烘干，得到经处理的薄片；在1.0×1.5cm的双层塑封膜(购自淘宝)上打出直径4.0mm 的孔，得到经打孔的双层塑封膜；将经处理的薄片的一端高温塑封在经打孔的双层塑封膜的夹层中，得到经封层的不锈钢片；将碳浆(购自Scientific Plano 公司)与稀释液(购自Scientific Plano公司)按照体积比1：5混合，得到稀释碳浆；将3μL稀释碳浆滴加在经封层的不锈钢片暴露在孔洞处的部分后，于室温(25℃)下干燥以形成导电碳浆层，得到不锈钢片碳浆电极，此不锈钢片碳浆电极即工作电极；
工作电极的修饰及封闭：将浓度为5.35mg/mL的抗SARS-CoV-2N蛋白抗体(购自安源医药科技(上海)有限公司)用PBS缓冲液(0.1M，pH＝7.4，购自上海生工公司)稀释100倍至浓度为0.0535mg/mL，得到抗体溶液；将3.0μL 抗体溶液滴加在工作电极的导电碳浆层上后，将工作电极放入培养皿并覆上一层保鲜膜，37℃培养箱孵育2小时，得到经修饰的工作电极；用含0.05％(v/v) 吐温-20的PBS缓冲液清洗经修饰的工作电极表面后，氮气吹去工作电极表面残留液，得到经清洗的工作电极；将6.0μL含1％(v/v)牛血清白蛋白(BSA) 的PBS缓冲液滴加在经清洗的工作电极上后，将工作电极放入培养皿并覆上一层保鲜膜，室温(25℃)孵育20min，得到经封闭的工作电极；用含0.05％(v/v) 吐温-20的PBS缓冲液清洗经封闭的工作电极表面后，氮气吹去工作电极表面残留液，得到工作电极成品。
实施例2：一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系
如图1所示，本实施例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系，所述检测体系包含实施例1的三电极体系电化学传感器和滤纸3；所述滤纸3 通过双层塑封膜2上的孔洞4覆盖在导电碳浆层5上。
实施例3：一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒
本实施例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，所述试剂盒由实施例2的检测体系以及工作试剂组成；所述工作试剂为铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合溶液；所述混合溶液中添加有氯化钾；所述混合溶液中，铁氰化钾和亚铁氰化钾的浓度为5mmol/L，且铁氰化钾和亚铁氰化钾的摩尔比为1：1；所述混合溶液中，氯化钾的浓度为0.1mmol/L。
将10μL工作试剂滴加在工作电极的滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检测的工作电极的滤纸上确保三电极在同一体系中后(除抵接处以外，工作电极、参比电极和对电极互不接触)，将化学工作站的三个夹子分别夹在工作电极、参比电极和对电极上，于电压范围-1～1V、扫描速度0.1V/s下通过差分脉冲伏安法获得电极的CV曲线(CV曲线见图3)，并于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下通过电化学阻抗谱方法(EIS)获得电极的电化学阻抗谱(电化学阻抗谱见图4)。
实施例4：一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法
本实施例提供了一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法，所述方法使用实施例2所述的用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括如下步骤：
标准曲线的绘制：将SARS-CoV-2N蛋白(购自安源医药科技(上海)有限公司)用TRIS-HCl缓冲液(0.1M，pH＝8.0，购自上海生工公司)分别稀释至浓度为50、5、1、0.5、0.1和0.05pg/mL，得到梯度浓度的新型冠状病毒抗原稀释液；将3.0μL梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液分别滴加在三电极体系电化学传感器工作电极的导电碳浆层上静置反应15min后，氮气吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；将HRP标记的抗SARS-CoV-2N蛋白抗体(购自安源医药科技(上海)有限公司)用PBS缓冲液按照体积比抗SARS-CoV-2N 蛋白抗体：PBS缓冲液＝1：1000稀释，得到HRP标记的抗SARS-CoV-2N蛋白抗体稀释液；取3.0μLHRP标记的抗SARS-CoV-2N蛋白抗体稀释液滴加在反应工作电极的导电碳浆层上静置反应20min后，用含0.05％(v/v)吐温-20 的PBS缓冲液清洗工作电极，得到清洗工作电极；在清洗工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将10μL检测液(检测液为含TMB-H2O2的磷酸-柠檬酸缓冲液(0.1M，pH 5.0，购自上海生工)，其中，TMB在磷酸-柠檬酸缓冲液中的浓度为0.2mM、H2O2在磷酸-柠檬酸缓冲液中的浓度为2.0mM)滴加在滤纸上，得到待检工作电极A；于电压范围0.6～-0.1V下通过差分脉冲伏安法获得待检工作电极A在梯度浓度的新型冠状病毒抗原稀释液下的DPV曲线(DPV曲线见图5)；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将10μL工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极B；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极 B的滤纸上确保三电极在同一体系中后(除抵接处以外，工作电极、参比电极和对电极互不接触)，将化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极B、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下通过电化学阻抗谱方法(EIS)获得梯度浓度的新型冠状病毒抗原稀释液的电化学阻抗谱(电化学阻抗谱见图6)；以新型冠状病毒抗原溶液的浓度对数为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的DPV曲线为纵坐标，绘制标准曲线 (标准曲线见图7)；以新型冠状病毒抗原溶液的浓度对数为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的电化学阻抗值为纵坐标，绘制标准曲线(标准曲线见图8)；
新型冠状病毒抗原的定量检测：将3.0μL待测样本滴加在三电极体系电化学传感器的滤纸上进行静置反应15min后，氮气吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将10μL工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极的滤纸上确保三电极在同一体系中后(除抵接处以外，工作电极、参比电极和对电极互不接触)，将化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极 B、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V 下通过电化学阻抗谱方法(EIS)获得待测样本的电化学阻抗谱；将与待测样本对应的电化学阻抗谱带入标准曲线，得到待测样本中新型冠状病毒抗原的浓度。
由图5可知，峰电流随着新冠病毒N蛋白浓度的增大而增大，在0.05～20 pg/mL范围内，峰电流与新冠病毒N蛋白浓度的对数呈较的线性关系这是因为 N蛋白浓度越大，电极表面吸附HRP越多，测DPV时，峰电流值越大。
由图6和8可知，在0.05～20pg/mL范围内，测得的电化学阻抗谱和新冠病毒N蛋白浓度之间成线性关系，所得线性回归方程是Y＝0.2527X+1663.6，检测限为0.021pg/mL。
对比例1：一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器
本对比例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，所述三电极体系电化学传感器在实施例1的基础上，将工作电极由不锈钢碳浆电极替换为丝网印刷碳电极(购自宁波元感生物科技有限公司)。
对比例2：一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系
本对比例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系，所述检测体系在实施例2的基础上，将实施例1的三电极体系电化学传感器替换为对比例 1的三电极体系电化学传感器。
对比例3：一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒
本对比例提供了一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，所述试剂盒在实施例3的基础上，将实施例2的检测体系替换为对比例2的检测体系。
将10μL工作试剂滴加在工作电极的滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检测的工作电极的滤纸上确保三电极在同一体系中后(除抵接处以外，工作电极、参比电极和对电极互不接触)，将化学工作站的三个夹子分别夹在工作电极、参比电极和对电极上，于电压范围-1～1V、扫描速度0.1V/s下通过差分脉冲伏安法获得电极的DPV曲线(DPV曲线见图3)，并于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下通过电化学阻抗谱方法(EIS)获得电极的电化学阻抗谱(电化学阻抗谱见图4)。
由图3可知，不锈钢碳浆电极和丝网印刷碳电极均出现可逆的氧化还原峰，在相同的扫描速率下，不锈钢碳浆电极具有更高的电流响应，表明不锈钢碳电极具有更大的比电容。由图4可知，丝网印刷碳电极具有较大的半圆直径，不锈钢碳浆电极的直径明显的较小，这是由于不锈钢碳浆电极具有较好的导电性。
对比例4：一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法
本对比例提供了一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法，所述方法在实施例4的基础上，将实施例3的试剂盒替换为对比例3的试剂盒。所得DPV曲线见图9，所得以新型冠状病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的DPV曲线为纵坐标绘制得到的标准曲线见图7。
由图7和9可知，在0.05～50pg/mL范围内，测得的DPV曲线和新冠病毒 N蛋白浓度之间成线性关系，线性回归方程分别是Y＝1.3616X+2.3837(不锈钢碳浆电极)和Y＝0.3348X+1.0612(丝网印刷碳电极)，此结果说明不锈钢碳浆电极明显较丝网印刷碳电极灵敏。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种不锈钢片碳浆电极，其特征在于，所述不锈钢片碳浆电极包括不锈钢片和双层塑封膜；所述不锈钢片的一端塑封在双层塑封膜的夹层中；所述双层塑封膜上设有孔洞；所述不锈钢片暴露在孔洞处的部分设有导电碳浆层；所述导电碳浆层上修饰有能够与新型冠状病毒抗原特异性结合的抗体。
2.如权利要求1所述的不锈钢片碳浆电极，其特征在于，所述抗体在不锈钢片碳浆电极上的修饰浓度为0.01～0.1mg/mL。
3.如权利要求1或2所述的不锈钢片碳浆电极，其特征在于，所述抗体为抗SARS-CoV-2N蛋白或抗SARS-CoV-2S蛋白；所述抗原为N蛋白或S蛋白。
4.一种制备权利要求1～3任一项所述的不锈钢片碳浆电极的方法，其特征在于，所述方法为：将不锈钢片用丙酮、乙醇和双蒸水分别进行超声清洗后烘干，得到经处理的不锈钢片；在双层塑封膜上打孔，得到经打孔的双层塑封膜；将经处理的不锈钢片的一端塑封在经打孔的双层塑封膜的夹层中，得到经封层的不锈钢片；将碳浆滴加在经封层的不锈钢片暴露在孔洞处的部分后干燥，形成导电碳浆层，得到修饰有导电碳浆层的不锈钢片；将抗体溶液滴加在修饰有导电碳浆层的不锈钢片的导电碳浆层上后进行孵育，得到修饰有抗体的不锈钢片；将牛血清白蛋白溶液滴加在修饰有抗体的不锈钢片的导电碳浆层上后进行孵育，得到不锈钢片碳浆电极。
5.一种用于检测新型冠状病毒抗原的三电极体系电化学传感器，其特征在于，所述三电极体系电化学传感器以权利要求1～3任一项所述的不锈钢片碳浆电极为工作电极。
6.如权利要求5所述的三电极体系电化学传感器，其特征在于，所述三电极体系电化学传感器以银-氯化银电极、铜电极或甘汞电极为参比电极，以铂丝电极或铂片电极为对电极。
7.一种用于检测新型冠状病毒抗原的检测体系，其特征在于，所述检测体系包括权利要求5或6所述的三电极体系电化学传感器以及滤纸；所述滤纸通过不锈钢片碳浆电极双层塑封膜上的孔洞覆盖在不锈钢片碳浆电极的导电碳浆层上。
8.一种用于检测新型冠状病毒抗原的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求7所述的检测体系以及工作试剂；所述工作试剂为铁氰化钾和亚铁氰化钾的混合溶液；所述混合溶液中添加有氯化钾。
9.一种定量检测新型冠状病毒抗原的方法，其特征在于，所述方法非疾病的诊断和治疗目的，所述方法使用权利要求8所述的试剂盒，包括如下步骤：
标准曲线的绘制：将梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液分别滴加在三电极体系电化学传感器工作电极的导电碳浆层上进行反应后，吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极的滤纸上后，将电化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下测得梯度浓度的新型冠状病毒抗原溶液的电化学阻抗谱；以新型冠状病毒抗原溶液的浓度为横坐标，以与此新型冠状病毒抗原溶液对应的电化学阻抗谱为纵坐标，绘制标准曲线；
新型冠状病毒抗原的定量检测：将待测样本滴加在三电极体系电化学传感器工作电极的导电碳浆层上进行反应后，吹干工作电极表面残留液，得到反应工作电极；在反应工作电极的导电碳浆层上覆盖滤纸后，将工作试剂滴加在滤纸上，得到待检工作电极；将参比电极和对电极分别抵接在待检工作电极的滤纸上后，将电化学工作站的三个夹子分别夹在待检工作电极、参比电极和对电极上，于频率范围0.1～10000HZ、振幅0.005、开路电压-0.08V下测得待测样本的电化学阻抗谱；将与待测样本对应的电化学阻抗谱带入标准曲线，得到待测样本中新型冠状病毒抗原的浓度。
10.权利要求1～3任一项所述的不锈钢片碳浆电极或权利要求5或6所述的三电极体系电化学传感器或权利要求7所述的检测体系或权利要求8所述的试剂盒或权利要求9所述的方法在新型冠状病毒抗原定量检测中的应用，其特征在于，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。
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