TW201602347A - 對抗腸病毒感染之基於腺病毒載體之疫苗 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種重組腺病毒載體，可用於產生免疫力以對抗腸病毒感染。於一具體實施例中，本發明之重組腺病毒載體包含一表現卡匣，其編碼腸病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。於另一具體實施例中，本發明重組腺病毒載體包含一表現卡匣，其編碼腸病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。本發明亦關於一種疫苗組合物，包含所述之重組腺病毒載體。本發明提供一種使用該重組腺病毒載體及疫苗組合物以誘發個體產生免疫反應，對抗腸病毒感染的方法。進一步提供一種產生腸病毒之類病毒顆粒之方法，係藉由表現本文所述之腺病毒載體於哺乳動物細胞中。

Description

對抗腸病毒感染之基於腺病毒載體之疫苗 【相關申請案】

本案基於35 U.S.C.§ 119(e)，主張享有美國臨時專利申請案(申請號：61/985,803；申請日：2014年4月29日)之優先權，其文中所有內容皆以參考文獻方式引入本文中。

本發明一般係關於免疫領域，以及具體地，關於對抗腸病毒感染之基於腺病毒載體之疫苗。

腸病毒，屬於微小核糖核酸病毒科，為一種微小、無封套之含有正股RNA之病毒種類。腸病毒之種類，現包含12種：腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒E、腸病毒F、腸病毒G、腸病毒H、腸病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B及鼻病毒C。該等病毒感染腸道，卻可造成各種類型之疾病。典型的腸病毒疾病為腦膜炎、麻痺、心肌炎、手足口病(hand,foot and mouth-disease；HFMD)、疱疹性咽峽炎、胸膜痛、肝炎、急性呼吸性疾病(包括肺炎)。目前唯一用於人類之腸病毒疫苗為脊髓灰質炎病毒疫苗，其屬於腸病毒C型。目前尚無可供人類使用之對抗非脊髓灰質炎腸病毒疫苗。

於腸病毒A型間，腸病毒71(enterovirus 71；EV71)及克沙奇病毒A群(coxsackievirus A group；CVA)感染係最常見造成手足口病(HFMD) 及其他神經性疾病之主因。許多神經性疾病，包括腦炎、急性無力肢體麻痺、肺水腫(pulmonary edema；PE)、及出血、最終導致死亡，尤其是當EV71感染到5歲以下之幼童時，皆有報告過相關病例[1-5]。因為EV71及CVA感染可能對於全球公共健康造成新的危害[1,6-11]，因此，亟需一有效的抗病毒藥物及預防性疫苗。

腸病毒基因組係由單股的開放閱讀框架所組成，其編碼P1、P2及P3聚合蛋白。該P2及P3區編碼非結構性蛋白(如3CD)，該蛋白負責病毒之複製及致病性。於病毒RNA轉譯時，2A蛋白可催化其之順式N端切位，藉此從P2及P3區之初生非結構性蛋白中，釋放P1區中之殼體蛋白。藉由自主酶切方式，將3CD從P3前驅物中釋放。有一個3C’切位，位於3CD之3C及3D部分間之多蛋白殘基中，以生成2個產物，3C’、及3D’。當P1前驅物由P1區編碼時，其可被3C’蛋白酶切割為VP0、VP1及VP3。該3個蛋白自動地組裝成二十面體之前殼體，並將RNA基因組裝入該前病毒顆粒中，可成為一非感染性之空的(E)顆粒或具感染性之完整的(F)顆粒[12,13]。

人類清道夫受體B類成員2(human scavenger receptor class B,member 2；hSCARB2)，及人類P分泌素糖蛋白配體1(P-selectin glycoprotein ligand 1；PSGL-1)已知為EV71感染時重要之細胞受體[14,15]。吾人團隊[16]及Fujii等人[17]已成功發展可表現人類hSCARB2受體之轉殖基因小鼠。於此有希望之模式中，將臨床EV71分離株(B4及B5亞基因型)感染至該轉殖基因動物中，可發展類HFMD皮膚疹，而接種EV71 C2及C4亞基因型或CVA16者，患有嚴重的肢體麻痺及死亡。此外，將單株抗EV71 VP1中和抗體N3[26]以被動施予方式給予，可降低EV71 B5感染所誘發之症狀及保護該轉殖基因 小鼠，對抗EV71 C2誘發之嚴重的肢體麻痺及死亡。

於先前研究中[13]，吾人製備一種福馬林不活化之EV71 E59株(formalin-inactivated EV71；FI-EV71)候選疫苗，其係與鋁膠佐劑混合，並發現FI-EV71於hSCARB2-Tg小鼠攻毒模式中，展現效力[16]。於第一期人類臨床試驗中[18]，FI-EV71為安全的，且可誘發高度之中和抗體反應，以對抗目前常在之EV71分離株，但無法保護對抗CVA16之感染。另一方面中，相較於該不活化病毒疫苗，基於VP1(於EV71病毒中最重要之有效抗原)之DNA疫苗(100μg/小鼠)及重組蛋白疫苗(10μg/小鼠)，誘發較差的免疫反應，且無法有效保護小鼠對抗病毒感染[19]。

類病毒顆粒，或VLPs，可模擬病毒之外蛋白結構，且不含有遺傳物質(DNA或RNA)，該遺傳物質負責病毒之複製。沒有了遺傳物質，VLP疫苗自己則無法進行感染，且可同時以最真實之構型來呈現病毒抗原。EV71之VLPs由昆蟲細胞生產，亦被證明於小鼠中之效力[20]，其中說明了VLP蛋白可於昆蟲細胞中表現，且組裝成VLPs，經純化後，將該VLPs引入小鼠以進行免疫，來誘發免疫反應對抗病毒攻毒。然而，由非人類細胞生成之VLPs蛋白，其具有不同之後修飾作用(像是糖化作用)，可能於人類中誘發不同之免疫原性。此外，於生產高度純化之VLPs時亦遇上阻礙。

因此，目前仍亟需開發一有效之疫苗以對抗腸病毒感染。

本發明關於一種新穎的基於腺病毒載體之DNA疫苗，用來生成免疫力以對抗腸病毒感染。於一具體實施例中，本發明提供一種重組腺病毒載體，包含表現卡匣，其編碼腸病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。於另 一具體實施例中，本發明提供一種重組腺病毒載體，包含表現卡匣，其編碼腸病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。吾人不可預期地發現，本文所述之重組腺病毒載體之疫苗，可誘發增強的保護性免疫力，以對抗腸病毒感染，尤其是細胞的(T細胞)免疫反應。吾人亦發現本文所述之重組腺病毒載體之疫苗，可誘發專一3C之細胞免疫反應，因此可提供廣效之交叉保護力，以對抗不同種的腸病毒，至少包括腸病毒71及克沙奇病毒A，係因為3C蛋白酶之胺基酸序列於各種腸病毒間係高度保留的。

因此，於一方面，本發明提供一種重組病毒載體，可生成免疫力以對抗腸病毒感染，其包含表現卡匣，編碼腸病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。本發明亦提供一種重組腺病毒載體，可生成免疫力以對抗腸病毒感染，包含表現卡匣，其編碼腸病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。

於又一方面中，本發明提供一種疫苗組合物，用於生成免疫力，以對抗腸病毒感染，其包含有效量之本文所述的重組腺病毒載體。

於再一方面中，本發明提供一種於個體中誘發免疫反應以對抗腸病毒感染之方法，包含施予該個體一有效量之本文所述重組腺病毒載體或疫苗組合物。本發明亦提供本文所述之該重組腺病毒載體或疫苗組合物，於製造一醫藥(如疫苗)以於個體中誘發免疫反應，以對抗腸病毒感染之用途。

此外，吾人發現使用本發明之編碼P1及3CD蛋白之重組腺病毒載體，於哺乳動物細胞表現系統中，可形成類病毒顆粒。因此，本發明進一步提供一種產生腸病毒之類病毒顆粒之方法，包含： 於可表現該P1蛋白及3CD蛋白酶且可組裝該腸病毒之類病毒顆粒的 環境中，培養哺乳動物細胞，該細胞係經本文所述之重組腺病毒載體所轉染；以及收集培養後之哺乳動物細胞，並從中分離出腸病毒之類病毒顆粒。

本發明之一種或多種具體實施例之細節，係描述於以下說明書中。本發明之其他特徵或優點，可配合以下許多具體實施例之詳細說明以及所附之申請專利範圍得以明晰。

先前摘要，以及以下本發明之詳細說明，當閱讀時可配合所附圖式可使人更佳理解其內容。該等於圖式中之較佳具體實施例，係為闡述本發明之目的。然而，應可理解的是，本發明不受限於該等所述之明確排列方式及手段。

圖式中：圖1為一攜帶EV71 P1及3CD基因之重組腺病毒載體之構築，且該載體可表現出VLPs。(A)腺病毒構築體；表現P1基因之Ad-EVVLP，其由VP1至VP4亞單位序列所組成，且由CMV啟動子所驅動，以及該3CD基因，係由延長因子-1α啟動子(elongation factor-1α promoter；EF1p)所驅動。(B)使用可辨識P1、3CD及EF1p序列之特定引子，以增幅及偵測P1、3CD及EF-1α啟動子是否插入Ad-EVVLP構築體中。(C)源自293A轉染物之溶解物中的Ad-LacZ及Ad-EVVLP，係以免疫墨點法，搭配多株抗Ad5抗體分析。VLP形成之流程如圖所示；轉譯之P1多胜肽係由3CD蛋白酶所生成及切割，該3CD蛋白酶係由3CD RNA所表現，以得到個別之VP0、VP1及VP3亞單位蛋白。VP0、VP1及3C係以Mab979單株抗體或VP0、VP1或3C專一抗體進行偵 測。每個孔洞中共有10³pfu之純化的EV71 5746作為抗原，亦作為免疫墨點法之對照組。其中標示含有蛋白標記(M)之電泳道。

圖2顯示於Ad感染細胞中VLPs及Ad-EVVLP顆粒之同時產生。(A)以MOI=0.1Ad-EVVLP轉染293A細胞。經轉染24小時後製備細胞溶解物，並以材料及方法章節中所述之碘克沙醇密度梯度片段化。從Vero細胞中所產生之10⁷pfu EV71 5746株之片段。每一個片段遂以Mab979抗體進行西方墨點分析。VP0及VP2條帶之訊號強度遂以Image-Pro Plus 6.0軟體進行量化，並計算VP0/VP2比率，且表示於下方。(B)將Ad-EVLP片段7及8混合，以及(C)EV71樣本之片段8及9，以醋酸鈾醯處理，並以TEM檢驗。箭頭所指為對應於直徑為30-nm VLPs之完整顆粒。破損之VLPs以f標示呈現。(D)源自Ad-EVVLP感染細胞之溶解物，且未經片段化處理，亦以TEM檢驗，且可看到約直徑100-nm之腺病毒顆粒。

圖3顯示Ad-EVVLP誘發對EV71專一之IgG，可與E59及5746株交叉反應。將7週齡之BALB/c小鼠，以口服、皮下或腹腔方式將10⁸pfu Ad-EVVLP或Ad-LacZ，個別地初免(primed)及間隔14天後進行補強。收集第21天之血清樣本已分析IgG量，該IgG可由熱不活化之(A)5746及(B)E59附著之ELISA檢測而得。表示每個測試樣本之力價結果。對應於平均力價之標準差，源自每個實驗組中之5隻小鼠。

圖4顯示於Ad-EVVLP免疫小鼠中誘發之VLP專一的細胞激素反應。以PBS、Ad-LacZ、Ad-EVVLP、或FI-EV71皮下方式免疫小鼠兩次，並於疫苗補強後第7天犧牲。收集脾細胞，並於存在或不存在有10⁷pfu/mL UV-EV71 5746之環境中培養48小時。收集培養基，並藉由ELISA，及於材 料及方法章節中所述之方法定量(A)IFN-γ、(B)IL-4、(C)IL-13、及(D)IL-17A。每組中測試5隻小鼠。結果以每毫升微微克的細胞激素濃度表示。

圖5顯示於Ad-EVVLP免疫小鼠中，誘發VLP專一之CD4⁺及CD8⁺ T細胞反應。將源自個別小鼠之脾細胞培養於存在或不存在10⁷pfu UV-EV71 5746之環境中48小時，該小鼠係經以PBS、Ad-LacZ、Ad-EVVLP、或FI-EV71皮下免疫兩次。(A)以PE-Cy5-共軛之抗CD4抗體進行流式細胞分析，以分析相應於EV71顆粒所生成之CD4⁺ T細胞增生。(B)以PE-Cy5-共軛之抗CD8抗體進行脾細胞之染色，固定後，並以PE共軛之抗IFN-γ抗體染色，並使用流式細胞儀分析。該等結果係以CD4⁺或CD8⁺ T細胞經抗原刺激後之平均百分比呈現，相較於未經抗原刺激之基礎的CD4⁺ T細胞，係設定於0%。每組有5隻小鼠被分析。

圖6顯示於hSCARB2-Tg小鼠中，Ad-EVVLP提供保護力以對抗EV71。(A)以皮下兩次預接種方式，於出生後第1天及第7天分別施予PBS(◆)3×10⁷pfu Ad-LacZ(●)、或3×10⁶(■)或3×10⁷(▲)pfu Ad-EVVLP、或0.1μg FI-EV71疫苗(▼)，再以3×10⁶pfu EV71 5746進行皮下攻毒，來評估hSCARB2-Tg小鼠之存活率。轉殖基因小鼠之數量(N)如圖所示。使用對數等級方式來進行統計分析。(B)於感染後第4天，將小鼠犧牲，並從腦幹、脊髓及肌肉中萃取RNA進行定量RT-PCR，使用對EV71 RNA之VP1區域專一引子來偵測。另外，使用對β-肌動蛋白基因專一引子進行定量RT-PCR以作為內部對照組。於個別Ad-EVVLP免疫組織中之相對VP1 mRNA表現，係經個別樣本中β-肌動蛋白之表現正規化，再以平均相對正規化之VP1 mRNA表現量表示Ad-LacZ免疫樣本。每組中有7隻小鼠用來計算平均相對表現 量。使用非成對之學生t檢定及Welch校正以進行統計分析。

圖7顯示於Ad-EVVLP免疫小鼠中誘發之3C專一抗體，及CD4⁺及CD8⁺ T細胞反應。以PBS、10⁸pfu Ad-EVVLP或Ad-LacZ、或0.1μg FI-EV71，將BALB/c小鼠個別以皮下方式進行首免及補強，間隔為14天。犧牲小鼠並於第21天收集血清及脾細胞。(A)以抗重組3C附著之ELISA分析血清中之IgG。每一個測試樣本之結果係以力價表示。對應於每實驗組之平均力價的標準差亦表示之。將脾細胞培養於存在有或不存在有1.4μg重組3C蛋白之環境中48小時。(B)以抗CD4之PE-Cy5抗體藉由流式細胞儀分析對應於3C之CD4⁺ T細胞增生。(C)於脾細胞中活化之CD8⁺ T細胞，係以抗CD8之PE-Cy5共軛抗體染色，接著固定後，再以抗IFN-之PE共軛之抗體染色，接著使用流式細胞儀分析。結果係以經抗原刺激後之CD4⁺或CD8⁺ T細胞出現之平均百分比呈現，並與未受抗原刺激之基礎的CD4⁺ T細胞(設定為0%)比較。每組有5隻小鼠被分析。

圖8顯示Ad-EVVLP，但非FI-EV71，可保護hSCARB2-Tg小鼠免於CVA16之攻毒。將1日齡之hSCARB2-Tg小鼠以(A)PBS(●)、3×10⁷pfu Ad-LacZ(■)、或3×10⁷(▲)pfu Ad-EVVLP、或(B)1μg FI-EV71疫苗(●)，於出生後第1天及第7天進行皮下預接種兩次，再以5×10⁵pfu CVA16皮下進行攻毒。小鼠之存活率係每天觀察，達15天。圖上標示有轉殖基因小鼠之數量(N)。以對數等級方式進行統計分析。

圖9顯示，於Ad-EVVLP感染細胞中及源自EV71感染小鼠的血清中，VLP表現之免疫墨點分析。使用源自BALB/c小鼠之多株血清，及免疫墨點法分析經Ad-LacZ-及Ad-EVVLP感染之293A細胞的溶解物，該小 鼠係以10⁶pfu EV71 5746腹腔方式注射過。圖式中有標示蛋白標記(M)。

圖10顯示Ad-EVVLP免疫小鼠之脾臟中會分泌IFN-γ及IL-4之細胞的例子。經以Ad-LacZ或Ad-EVVLP腹腔或皮下免疫兩次之小鼠，從中製備脾細胞，並以含有鼠的IL-2之環境下培養，且該環境中存在有UV-EV71 E59，並於抗IFN-γ(A)或抗IL-4(B)之ELISPOT盤中之捕捉型抗體包覆孔洞培養2天。使用反應試劑及套組所附之方法，觀察細胞激素陽性之免疫斑點。每組結果係以專一之細胞激素免疫斑點±2標準差之數目表示。

圖11顯示源自重組3C，並佐以CFA/IFA佐劑之小鼠血清，不會誘發抗EV71及CVA16之中和活性。將7週齡BALB/c小鼠，個別以10μg重組的3C，佐以CFA(3C-CFA)，進行皮下首免，接著以相同劑量之3C-IFA，間隔14天後進行皮下補強。從第21天收集之血清，進行分析中和活性，分析方式為在加入RD細胞前，先將不同稀釋倍數之個別免疫血清與10²pfu EV71或CVA16進行作用。於培養後5天觀察CPE。結果係以中和力價呈現，對應於免疫血清之稀釋倍數，以降低50%細胞病變反應之TCID₅₀值表示。每組有5隻小鼠被分析。不同稀釋之Mab979抗體，及收集自以10⁶pfu CVA16感染後14天之BALB/c小鼠之血清，分別進行EV71及CVA16中和試驗，以作為陽性對照。

圖12顯示於Ad免疫小鼠之血清中，Ad5-專一IgG之誘發情形。將7週齡BALB/c小鼠分別以口服、皮下或腹腔方式，使用或未使用10⁸pfu Ad-EVVLP，進行首免，間隔14天後再補強。收集第21天之血清樣本，以熱不活化之Ad5附著之ELISA分析IgG。每個測試樣本之結果係以力價表示。每組實驗組中5隻小鼠的平均力價係有標準差標示。

圖13顯示Ad-3CD保護hSCARB2-Tg小鼠免於EV71及CVA16攻毒。將1日齡hSCARB2-Tg小鼠以皮下方式，將3×10⁷pfu Ad-3CD於出生後第1及7天進行預接種兩次，再以皮下注射3×10⁶pfu(▲)EV71或(▼)CVA16進行攻毒。對照組係以3×10⁷pfu Ad-LacZ進行免疫，並表示於表2中。每日觀察小鼠存活率，達15天。圖上標示(N)代表轉殖基因小鼠之數量。

圖14顯示於本發明之一具體實施例中之CMP啟動子-P1基因-IRES-3CD基因表現卡匣的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

圖15顯示於本發明之一具體實施例中之CMP啟動子-P1基因-EF-1α啟動子-3CD基因表現卡匣的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。

圖16顯示3C蛋白酶之序列資訊，包含EV71之3C蛋白酶及3CD蛋白酶之序列資訊。

圖17顯示EV71之P1蛋白之序列資訊。

除非另有定義，所有本文中技術及科學性術語，與本發明領域具有通常技藝者所習知者具有相同意義。

本文所用之冠詞「一(a)」及「一(an)」，係指一種或多於一種(即至少一種)本文中所述之物體。例如，「一元件」意指一種元件或多於一種元件。

「多核苷酸」或「核酸」乙詞係指一由核苷酸單位所組成之聚合物。多核苷酸包括天然存在之核酸，像是去氧核醣核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)，以及核酸相似物，包括該等具有非天然存在之核苷酸。多核苷酸可被合成，例如，使用自動DNA合成儀。應可理解的是，當核苷酸序列以 DNA序列(即A、T、G、C)代表時，亦包括了RNA序列(即A、U、G、C)，其中U取代了T。「cDNA」乙詞係指一DNA，無論是單股或雙股形態，係與一mRNA互補或相同。

「互補」乙詞係指兩個多核苷酸間之表面交互作用之拓撲相容性或彼此相符。因此，該兩分子可謂互補，且更進一步，接觸表面之特徵係彼此互補的。如果第一多核苷酸之核苷酸序列與第二多核苷酸結合對象之多核苷酸序列相同，則稱第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，該多核苷酸之序列5'-TATAC-3'係與多核苷酸之序列5'-GTATA-3'互補。

「編碼」乙詞係指於一多核苷酸中(如基因、cDNA、或mRNA)之特定核苷酸序列之固有特性，可於生物性反應過程中，作為合成其它聚合物及巨分子之模板，其可能具有一明確之核苷酸序列(即rRNA、tRNA及mRNA)，或一明確之胺基酸序列，及所衍生之生物性產物。因此，術語「一基因編碼一蛋白」意指由基因產生之mRNA轉錄及轉譯，可於細胞中或其他生物系統中生成該蛋白。對於一個具有技藝者應可理解的是多種不同之多核苷酸可編碼相同之多胜肽，係因基因密碼之簡併性。對於一個具有技藝者亦應可理解的是，使用常規技術，可進行核苷酸置換，且不會影響到該等多核苷酸所編碼之多胜肽序列，藉此置換以反映於各種特定宿主生物體中欲表達該多胜肽所需使用之密碼子。因此，除非特別另有說明，「核苷酸序列編碼胺基酸序列」包含所有核苷酸序列，其可能互為簡併版本，但編碼相同之胺基酸序列。核苷酸序列編碼蛋白，以及RNA可能包含內含子。

「重組」核酸乙詞係指一多核苷酸或核酸分子，其具有之序 列，並非自然就連接在一起。一重組的核酸可能以構築體形式呈現，如載體。「載體」可能含有所賦予之感興趣核苷酸序列及調控序列。載體可用於表現所賦予之核苷酸序列或維持所賦予之核苷酸序列以進行複製、操作、或轉移至不同位置(如不同生物體間)。載體可被引入一適當之宿主細胞中，以進行前述之目的。

本文所用之「操作式連接」乙詞可意指一多核苷酸係與一表現控制之序列連結，以該種連結方式可當一適當分子(如轉錄因子)結合至該表現控制序列時，使得該多核苷酸進行表現。

本文所用之「表現控制序列」或「調控序列」乙詞意指於特定宿主細胞中，一DNA序列可調控與其操作式連接之核酸序列的表現。

本文所用之「表現卡匣」乙詞係指一核酸分子之經定義片段，其包含用來生產由該核酸分子所編碼之轉錄或轉譯產物(RNA或蛋白)所需之最少的元件。例如，表現卡匣包括多核苷酸序列，其編碼可被表現之多胜肽，以及可控制其表現之序列，如啟動子，以及可選加的增強子序列，包括任何順式作用轉錄調控元件的組合。本文所述之腺病毒載體，表現卡匣典型地係指可表現異源性基因產物，而非表現編碼於腺病毒基因組中之腺病毒蛋白。

一般說來，於載體中，將所賦予之核苷酸序列以操作式連接方式與調控序列連接，即形成表現卡匣，使得當該載體被引入宿主細胞時，該所賦予之核苷酸序列可於該宿主細胞中，受到該調控序列之控制，來進行表現。該調控序列可包含，例如但不限於，啟動子序列(如巨細胞病毒(cytomegalovirus；CMV)啟動子、猿猴病毒40(simian virus 40；SV40)早期啟 動子、T7啟動子、乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子、內部核醣體進入位(internal ribosome entry site；IRES)及延長因子1a啟動子)、啟始密碼子、複製起點、增強子、操作子序列、分泌訊號序列(如交配型因子訊號)、及其他控制序列(如夏因-達爾加諾序列及中止序列)。較佳地，載體可進一步含有一標記序列(如一抗藥性標記基因序列)，以供後續篩選步驟所用。

「疫苗」乙詞係指一種藥劑或組合物，包含可於個體中有效誘發保護性免疫力之活性成分，以對抗特定病原菌或疾病。傳統上，疫苗之活性成分為源自該疫苗標的病原菌之多胜肽。「DNA疫苗」乙詞係指一種疫苗，其中之活性成分係由DNA所組成，例如表現所欲抗原蛋白之DNA構築體，其可誘發保護性免疫反應。如本文所述，DNA疫苗可意指表現病毒蛋白或病毒VLPs之DNA構築體，且經免疫後，可於該個體中誘發保護性免疫反應以對抗該病毒。

本文所用之「個體」乙詞係指人類或非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括，但不限於靈長目、有蹄類、犬及貓。

本文所用之「腺病毒」乙詞係指分離自人類之超過47種的腺病毒亞型，以及許多源自其他哺乳動物及禽類者。請參閱Strauss,“Adenovirus infections in humans,”in The Adenoviruses,Ginsberg,ed.,Plenum Press,New York,N.Y.,pp.451 596(1984)。

本文所用之「腺病毒載體」乙詞係指腺病毒，其腺病毒基因組已被改造過，以帶有一非原本該腺病毒基因組之核酸序列。因此，本文所用之「重組腺病毒載體」一般包含腺病毒基因組，以及表現卡匣，其中包含至少一編碼所欲蛋白(如P1蛋白、或3CD蛋白、或兩者兼有)之外源核酸 序列。

腺病毒載體較佳地含有至少各末端重複區之一部份，以供病毒DNA複製，較佳地至少約有90%之完整末端重複(inverted terminal repeat；ITR)序列，以及該DNA可將基因組進行殼體化以包入病毒殼體中。源自不同來源之腺病毒可被作為腺病毒載體之病毒基因組的來源。較佳為人類之腺病毒，例如，A亞型(如血清型12、18及31)，B亞型(如血清型3、7、11、及14等)，C亞型(如血清型1、2、5、及6等)，D亞型(如血清型8、9、10、13、15、17、19、及20等)，E亞型(如血清型4)，F亞型(如血清型40及41)及其他。較佳地，該腺病毒載體為人類C亞型，尤其是血清型2或甚至更佳地為血清型5。

該腺病毒載體可為具有複製能力的。一般來說，該腺病毒載體於宿主細胞中為不能複製的。「不能複製」乙詞意指該腺病毒載體中，於負責複製之腺病毒基因組(如E1、E3或E4區)中之一個或多個基因功能或區域有缺損，以致該載體於正常宿主細胞中僅有部分低下的複製能力或根本無法複製，尤其是指該等以腺病毒載體感染於人體中之腺病毒。該無法複製之腺病毒載體可確保疫苗之安全性。於一具體實施例中，該腺病毒載體於E1或E3或兩者是缺損的。於基因中之缺損可定義為突變或缺失，以完全性地移除或傷害基因功能，例如像是該基因產物之功能，相較於原本之基因，已被降低至少約2倍、5倍、10倍、20倍或更多倍。所產生之無法複製的腺病毒載體可接受一種或多種外源的核酸序列，已於腺病毒基因組中之適當位置以表現一種或多種所欲之蛋白，且仍可維持包裝成腺病毒殼體之能力。為了產生高力價之病毒載體以備用，一般將該無法複製之腺病毒載 體於互補細胞株中(像是293細胞)進行生產，其可提供一些基因功能，是於該無法複製之腺病毒載體中所沒有的。

於一方面中，本發明提供一重組的腺病毒載體以作為廣效DNA疫苗，以產生免疫力來對抗各種不同之腸病毒感染。

於一具體實施例中，本發明重組的腺病毒載體包含編碼腸病毒P1蛋白及3CD蛋白酶之表現卡匣。本發明之重組腺病毒載體，Ad-P1-3CD，經轉染於宿主細胞中，不僅可表現腺病毒結構蛋白，且也可表現腸病毒殼體蛋白，以及可形成腺病毒顆粒VLPs，係藉由將該等表現後之腸病毒殼體蛋白組裝而成，此點可由西方墨點法及穿透式電子顯微鏡所證明。Ad-P1-3CD可被作為廣效的DNA疫苗以產生免疫力對抗各種不同腸病毒之感染，特別是腸病毒A，其包含EV71及CVA。如下實例所示，於動物中，以Ad-P1-3CD進行免疫可誘發中和抗體以對抗EV71及專一之細胞的CD4⁴⁺及CD⁸⁺細胞免疫力，已對抗EV71及CVA；以及Ad-P1-3CD提供動物保護力以對抗EV71及CVA感染(免疫Ad-P1-3CD之小鼠，經EV71或CVA攻毒後，可達100%之存活率，相反的，接受生理食鹽水或對照腺病毒載體之小鼠則為0%之存活率)。

為了構築本發明之重組的腺病毒載體，使用標準的分子生物學及細胞培養技術(像是該等描述於Sambrook et al.,Molecular Cloning,a Laboratory Manual,3^rd edition,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring harbor,N.Y.(2001)中之方法)，將外源之DNA插入該載體之腺病毒基因組中適當位置。當該腺病毒載體包含兩種或多種外源核酸序列以表現蛋白時，該多重核酸序列，可以操作式連接方式，與不同或相同之啟動子連接，如：兩個 核酸序列操作式連接至相同啟動子，或該兩個核酸序列分別操作式連接至不同的啟動子。於此方法中，該啟動子可為一病毒性啟動子，像是T7啟動子、CMV啟動子、人類免疫缺損病毒(HIV)長末端重複啟動子、內部核醣體進入位(IRES)、皰疹胸苷激酶啟動子或與腺病毒有關之病毒啟動子，如p5啟動子及其類似物。或者，該啟動子可為細胞的啟動子，即於真核細胞(動物細胞或酵母菌細胞)中存在之啟動子、像是泛素啟動子、EF-1α啟動子、熱休克蛋白啟動子、β活化啟動子、或乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子。

於一部分具體實施例中，本發明重組的腺病毒載體包含表現卡匣，其包括第一核酸片段，編碼P1蛋白，以及第二核酸片段，編碼3CD蛋白酶。特定而言，該第一核酸片段可操作式與第一啟動子連接，以控制P1蛋白之表現，以及第二核酸片段可操作式與第二啟動子連接，以控制3CD蛋白酶之表現，其中第一啟動子及第二啟動子可為相同的或不同的。於本發明之重組腺病毒載體中的表現卡匣之具體實例，係分別如圖14及圖15所示，其中之一為CMV啟動子可操作式連接至P1基因，並以IRES啟動子操作式連接至3CD基因(CMV-P1-IRES-3CD)；以及另一者為CMV啟動子可操作式連接至P1基因，並與EF-1α啟動子操作式連接至3CD基因(CMV-P1-EF-1α-3CD)進行連接。

本文所用之「P1蛋白」為一蛋白產物，係由腸病毒P1基因所表現。該P1蛋白之胺基酸序列，及其對應之核酸係為該領域中可取得者。於部分具體實施例中，本文所述之P1蛋白係指源自EV71者，具體而言是指具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或源自其他腸病毒株，其與SEQ ID NO：1之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%相同性之序列。

本文所用之「3CD蛋白酶」為一蛋白產物，係由腸病毒之3CD基因所表現。該3CD蛋白之胺基酸序列，及其對應之核酸係為該領域中可取得者。於部分具體實施例中，本文所述之3CD蛋白係指源自EV71者，具體而言是指具有SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或源自其他腸病毒株，其與SEQ ID NO：2之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%相同性之序列。

於特定具體實施例中，該P1蛋白及3CD蛋白酶皆源自相同種類之腸病毒，例如EV71。

於部分實例中，本發明重組的腺病毒載體包含表現卡匣，其包括SEQ ID NO：3(CMV-P1-IRES-3CD)或SEQ ID NO：4(CMV-P1-EF-1α-3CD)之核酸序列。

於本發明中，亦揭露了3C專一細胞免疫力足以保護各種不同之腸病毒感染，至少腸病毒A型之感染，含括EV71及CVA感染。因此，本發明亦提供一種重組腺病毒載體，可用於生成免疫力以對抗腸病毒感染，其包含表現卡匣，編碼腸病毒3C蛋白酶或3CD蛋白酶。於一具體實施例中，本發明提供一種重組的腺病毒載體，其包含攜有外源DNA之表現卡匣，該外源DNA編碼腸病毒之3C蛋白酶。於另一具體實施例中，本發明提供一種重組的腺病毒載體，其包含攜有外源DNA之表現卡匣，該外源DNA編碼腸病毒之3CD蛋白酶。於特定實例中，該3C蛋白酶或3CD蛋白酶源自EV71。

本文所用之「3C」蛋白係指由腸病毒3C基因所表現之蛋白產物。該3C蛋白之胺基酸序列，及其對應之核酸係為該領域中可取得者。於部分具體實施例中，本文所述之3C蛋白係指源自EV71者，具體而言是指 具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列，或源自其他腸病毒株，其與SEQ ID NO：5之胺基酸序列具有至少85%、90%或95%相同性之序列。

為了決定兩個胺基酸序列之相同性百分比，將序列以最佳比較方式進行排列比對(如可引入間隔於第一胺基酸序列，以與第二胺基酸序列有較佳之排列比對)。於計算相同性百分比時，一般計算完美對應者。兩序列間之同源性或相同性之百分比的決定，可使用該領域所熟知之數學演算法進行，如BLAST及Gapped BLAST程式、NBLAST及XBLAST程式、或ALIGN程式。

本發明重組腺病毒載體之有效量，係與該活性成分與醫藥可接受載體調製成之組合物，且為了遞送、或吸收、或增強組合物穩定性之目的，以形成適當型態，來決定之。

本文所用之「醫藥可接受」意指於組合物中，該載劑可與該活性成分兼容，且較佳地可穩定該活性成分，且對於接受治療之個體是安全的。該載劑可為該活性成分之稀釋劑、載體、賦形劑、或基質。病毒載體可調製為溶液、或凍乾粉末方式以供非口服方式投藥。於使用前，粉末可以適用之稀釋液或其他醫藥可接受之載劑回溶。適用之稀釋液，如一般等滲透的生理食鹽水溶液，溶於水中之標準5%葡萄糖、或緩衝的鈉或醋酸銨溶液。病毒載體可被製備以口服方式施予。部分適當之固體載劑例子，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻酸、黃蓍樹膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、滅菌水、糖漿及甲基纖維素。該組合物可額外包含潤滑劑，像是滑石、硬脂酸鎂、及礦物油；濕潤劑；乳化及懸浮劑；防腐劑；像是甲基及丙基 羥苯酸酯；增甜劑；及增味劑。經施予至一個體後，本發明之組合物可提供快速、持續、或緩釋該活性成分之效果。

本發明之組合物包含本發明重組腺病毒載體，以作為疫苗組合物，可進一步包含佐劑來調製。為了增強疫苗組合物之功效的佐劑典型例子，包括但不限於，鋁鹽、水包油乳化配方、皂素佐劑、弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant；CFA)及弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant；IFA)。

本發明進一步提供一種於個體內誘發免疫反應以對抗腸病毒感染之方法，包含施予該個體有效量之重組腺病毒載體或如本文所述之疫苗組合物。亦提供該重組腺病毒載體或本文所述之疫苗組合物用於製造醫藥(如疫苗)，以於個體中誘發免疫反應以對抗腸病毒感染之用途。

「有效量」乙詞係指一劑量或數量，足以提供受治療個體所欲之醫療效果，例如，足以於接受治療者體內生成或誘發免疫反應以對抗病原菌(如腸病毒)或抗原(如腸病毒之3C或3CD蛋白)。治療有效量可能因各種理由而改變，像是施予路徑及頻率、體重、及接受該醫藥之個體物種、及施予之目的而改變。於該領域具有通常技藝者可於每一個病例中去決定劑量，係依照本文所揭露者、建立之法及其個人經驗。例如，於部分具體實施例中，本發明之重組的腺病毒載體係以一劑量為1×10⁷至1×10¹²噬菌斑形成單位(plaque-forming unit；pfu)，如1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、1×10¹¹、或1×10¹²pfu之劑量施予。

「免疫反應」乙詞可包括，但不限於體液反應及細胞媒介之免疫反應，如CD⁴⁺或CD⁸⁺細胞之活化。

病毒載體可以藉由任何生理學上可接受之路徑進行施予，像是口服、非經口的(如肌肉、靜脈、皮下及腹腔)、經鼻的、直腸給藥、經皮吸收的或吸入的。於部分具體實施例中，該病毒載體可以口服、皮下、或腹腔方式施予。免疫可藉由重複之施予以施行，一般包含起始施予，及接續之補強施予。

於本發明中發現，3C專一細胞免疫力足以保護各種不同腸病毒感染。因此，本發明之方法係有效提供交叉保護性免疫力，以對抗不同腸病毒株，係因3C蛋白之胺基酸序列於不同腸病毒株間是呈現高度保留的。於部分具體實施例中，本發明之方法可有效誘發免疫反應以對抗腸病毒A，且含括EV71及CVA，此兩者是造成HFMD之主要原因。

本發明亦提供一種於哺乳動物細胞系統中產生腸病毒類病毒顆粒之方法，包含：於可表現該P1蛋白及3CD蛋白酶且可組裝該腸病毒之類病毒顆粒的環境中，培養哺乳動物細胞，該細胞係以一含有編碼腸病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶之表現卡匣之重組腺病毒載體所轉染；以及收集培養後之哺乳動物細胞，並從培養的哺乳動物細胞中分離出腸病毒之類病毒顆粒。

轉染可以任何習知方法施行，且可達到暫時性的或穩定的轉染之結果。進行穩定轉染可建立一可產生所感興趣之VLPs的細胞株。

於部分具體實施例中，用於轉染哺乳動物細胞之重組腺病毒載體，是可複製的或不可進行複製的。

於部分具體實施例中，該哺乳動物細胞可藉由將該重組腺病 毒載體轉染入互補細胞中，其可互補所用之無法複製腺病毒載體中腺病毒基因組之缺陷。常見之互補細胞例子為293細胞或其他如US 6,677,156、US 6,913,927或US 20030017595中所述之細胞。

於哺乳動物細胞系統中所生成之VLPs，可被收集並以適用載劑調製後以形成疫苗組合物，以對抗腸病毒感染。根據本發明所製備之VLPs，其價值係與疫苗相同，係因其糖化狀態與在人類中相似。

本發明進一步以下列實施例闡述，所提供之例子僅用證明之目的，而非用於限制之目的。於該領域具有技藝者應，可藉由本發明之啟發，了解本發明所揭露之具體實施例，在不背離本發明之精神及範疇情況下，可進行各種改變，且可獲得相同或相似之結果。

實施例

於本研究中，吾人已設計及藉由基因工程改造一種重組腺病毒載體，帶有EV71 P1及3CD基因之Ad-EVVLP，該等基因係插入剔除E1/E3之腺病毒基因組中。Ad-EVVLP可於HEK-293A細胞中產出。除了Ad-EVVLP顆粒，藉由與EV71型殼體蛋白VP0、VP1及VP3物理性連結以形成類病毒顆粒(VLP)；其中該等殼體蛋白係為P1基因產物。該等病毒顆粒可被3CD蛋白酶酶切，且確認可被Ad-EVVLP-生成細胞所產生，並可藉由穿透式電子顯微鏡及西方墨點法所辨識。鼠的免疫原性研究顯示Ad-EVVLP-免疫的抗血清，可中和EV71型B4及C2基因型。VLP專一之CD4⁺及CD8⁺/IFN-γ T細胞的活化，係與Th1/Th2-平衡的IFN-、IL-17、IL-4、及IL-13之誘發有關聯；相對的，FI-EV71僅誘導Th2媒介之中和抗體，以對抗EV71型及低VLP專一之CD4⁺及CD8⁺ T細胞反應。於hSCARB2轉殖基因小鼠(hSCARB2-Tg)攻毒模 式中，以Ad-EVVLP免疫小鼠，很明顯地證實該免疫小鼠具有抗病毒之免疫力，以對抗EV71。經Ad-EVVLP-免疫之小鼠皆100%被保護，且證明可降低CNS及肌肉組織中之病毒載量。Ad-EVVLP成功地誘發抗CVA16免疫力。雖然抗血清對於CVA16沒有中和活性，CVA16為3C專一之CD4⁺及CD8⁺/IFN-γ T細胞，但其媒介了對抗CVA16攻擊之保護力。FI-EV71不會誘發3C媒介之免疫力，且對於CVA16攻擊不具有效力。該等結果顯示，Ad-EVVLP可增強中和抗體及具保護性之細胞免疫反應，以預防EV71型感染，及細胞免疫反應以對抗CV感染。Ad-EVVLP已與醫療需求相符，即如同常用之HFMD疫苗一樣，可用來對抗EV71型及CV感染。

1. 材料及方法

1.1 倫理道德之聲明

所有使用之實驗動物皆根據台灣國家衛生研究院(NHRI)之實驗動物中心的規範來進行。動物操作之計畫書係經NHRI機構之實驗動物照護及使用委員會評審及核定(核定計畫書編號NHRI-IACUC-100125-A)。於EV71型攻毒實驗中，存活率被作為最終評估對抗EV71型處理之保護效力的方式。於實驗動物模式中已有眾多研究報告[16,19,21,22]，存活率可作為評估EV71型感染致病性之指標。試驗完成後，試驗動物係以100% CO₂吸入5分鐘方式，及接續之頸椎錯位法進行安樂死，以降低痛苦。為了進行攻毒，在進行皮下或腹腔EV71型免疫前，先將小鼠置於含有異氟烷(起始階段：5%；維持階段：1.5%-2.5%)之麻醉吸入箱中1分鐘。

1.2 細胞、病毒、化合物及抗體

非洲綠猴腎細胞(Vero)(ATCC No.CCL-81)及人橫紋肌肉瘤 細胞(RD)(ATCC No.CCL-136)係由台灣疾病管制中心(台灣CDC)所提供；原始細胞株係源自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。Vero細胞於含有4mM L-麩醯胺酸(Gibco-Invitrogen,CA,USA)之VP-SFM培養基(Gibco-Invitrogen,CA,USA)中培養。該RD細胞株於含有10%胎牛血清(Gibco-Invitrogen,CA,USA)之DMEM培養基中培養。將細胞置於含有5% CO₂之37℃培養箱中培養。臨床上，EV71型分離株、E59分離株(B4)(GenBank：GQ150746.1)、Neu(pinf7-54A)株(C2)(GeneBank DQ060149)、Tainan/5746/98(C2)(GenBank：AF304457.1)、及CVA16株、及5079株(GenBank：AF177911.1)係源自台灣台南國立成功大學王貞仁博士，並以Vero細胞，於微載體細胞培養生物系統中繼代培養[23,24]。人類腺病毒5(Ad5；ATCC No.VR-1516^TM)係購自ATCC，並以293A細胞繼代培養。備用之病毒皆存於-80℃。備用病毒之力價係以標準的噬菌斑形成試驗測定[25]，並以噬菌斑形成單位(pfu)之數量計算。

可辨識VP0/VP2 EV71型之殼體蛋白的單株抗體Mab979係購自Millipore,Inc.,MA,USA[26]。自家生產之VP1專一之單株抗體E1係已於先前被敘述過[26]。對人類β-肌動蛋白(Cat.No.A5441)專一之抗體，係購自Sigma-Aldrich MO,USA。辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase；HRP)共軛之驢抗鼠抗體(Cat.No.715-036-150)或HRP共軛之兔抗山羊抗體(Cat.No.305-035-003)係購自Jackson Immunoresearch,Inc.,PA,USA。

1.3 構築及生成Ad-EVVLPI及Ad-EVVLPI

將EV71 Neu(pinf7-54A)株之P1及3CD基因係以PCR擴增，並將之個別插入運輸載體pENTR4(Invitrogen)中。將延長因子-1α(EF-1α)啟動子之核苷酸片段插入該P1基因之3’端，以及該3CD基因之5’端，以生成 pENTR4-P1/EF-1α/3CD構築體。將3CD基因單獨插入pENTR4中以生成pENTR4-3CD構築體。將pENTR4-P1/EF-1α/3CD及pENTR4-3CD構築體以酵素重組方式接入該△E1/△E3(無法複製的)Ad5載體pAd/CMV/V5-DEST[27]中，以分別形成重組的pAd-EVVLP及pAd-3CD。將pAd DNA轉染入293A包裹細胞株中以生成重組的腺病毒，稱為Ad-EVVLP及Ad-3CD。將帶有螢光素酶報導基因之Ad-LacZ作為對照組載體，係取得自Invitrogen。使用Vivapure adenoPACK 100RT(Satorius Stedin Biotech)以純化及濃縮該重組的病毒。該純化的病毒力價係以修改過之標準噬菌斑試驗法判定。將各種不同的Ad病毒稀釋皆加入6孔組織培養盤之每一孔洞中，其中293A細胞已被置於每一孔洞中。以含有0.75%甲基纖維素之DMEM覆蓋該培養物後，將之置於37℃培養10至12天，並計算噬菌斑。通常腺病毒可收獲量約為1×10⁹pfu/mL。

1.4 西方墨點法

西方墨點法係根據先前敘述之方式進行[25]。使用1至2×10⁶細胞及100μL冰冷的溶解緩衝液(0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，0.5% NP-40，50mM TRIS，150mM NaCl)，並加上蛋白酶抑制劑混合物(Roche,French)及1mM PMSF(Sigma-Aldrich,CA,USA)以製備總細胞溶解物。將溶解物以10,000rpm、4℃離心20分鐘以沈積該細胞碎片。細胞溶解物或片段之蛋白濃度係以Bradford法測定[28]。將含有10μg蛋白之細胞溶解物與追蹤染劑混合，並將之加入10% SDS-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE，Amersham Biosciences-GE Healthcare,USA)之每一個孔洞中，並於1x Tris-甘胺酸SDS電泳緩衝液中進行電泳。將溶解之蛋白轉移至硝化 纖維膜上(Hybond-ECL，Amersham Biosciences-GE Healthcare,USA)。將膜片浸於5%脫脂牛奶及1xPBS中，於室溫30分鐘，接著以含有0.05% Tween 20之1x PBS(PBS-T)清洗3次。將膜片與鼠抗3C(1：1000)、MAB979(1：5000)、或抗VP1抗體(1：1000)於4℃作用14至16小時，接續以PBS-T沖洗，接著以HRP共軛之抗大鼠或驢抗小鼠(供MAB979使用)抗體作用。經作用1小時後，將膜片以PBS-T清洗5次，接著將Super Signal West Pico化學發光受質(Pierce,IL,USA)覆蓋在膜上，並將之曝光於X光片(Kodak,NY,USA)上。如有需要，將該膜片以還原緩衝液(Pierce,IL,USA)拆下，並以另一個抗體進行墨點法。

1.5 流式細胞儀

從BALB/c小鼠收獲脾細胞，並以5-(6)-羧基螢光素二醋酸琥珀醯亞胺酯(CFSE)(Cat.No.C34554，Molecular Probes)標記。以10⁷pfu/mL UV-不活化之EV71 5746或1.4μg/mL純化之重組E59 3C蛋白以體外方式進行再刺激5天；其中該3C蛋白係以大腸桿菌表現(由莊再成博士提供，本發明之共同作者)。脾細胞之CD4⁺ T細胞之增生，係以流式細胞儀(BD FACSCalibur)及PE-Cy5-標記之抗CD4抗體分析。於CFSE-預染之CD4⁺ T細胞(沒有抗原刺激)中沒有螢光訊號變化之族群，設定為0%，並計量經抗原刺激後之陰性轉變之CD4⁺ T細胞(增殖細胞)之族群。於每組中個別增生CD4⁺ T細胞之相對平均百分比遂被計算。為了偵測CD8⁺IFN-γ⁺ T細胞之族群，將脾細胞與EV71抗原一起培養兩天，接著以布雷菲德菌素A(Cat.No.00-4506-51，eBioscience)處理3小時後再收獲。經刺激的脾細胞係以PE-Cy5-標記的抗CD8抗體染色30分鐘，接續將之進行固定及通透化。將該等細胞中 之一部份進一步以PE-共軛之抗IFN-γ⁺抗體(BD Bioscience)染色30分鐘，以偵測細胞內的IFN-γ。經清洗後，將樣本以流式細胞儀分析。

1.6 PCR及即時RT-PCR

將pAd-EVVLP質體DNA作為模版，以PCR及相對應之引子對來偵測位於pAd-EVVLP內之P1、3CD、及EF-1α啟動子區域。PCR之條件為：95℃ 3分鐘；於95℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘、及72℃ 3分鐘進行35個循環；及最終作用於72℃ 2分鐘。

使用TRIZOL試劑(Invitrogen,CA,USA)，及遵循製造商之指示，從組織中純化出總RNA，並將之進行即時RT-PCR。使用隨機引子(Genomics BioSci&Tech，Taiwan)及反轉錄酶(Bionovas,Toronto,Canada)以將總RNA轉變成cDNA。將合成之cDNA，以對EV71 P1 RNA之VP1區域的專一引子對，進行定量PCR分析(LightCycler 480 SYBR Green Real-Time PCR system)。人類β-肌動蛋白基因表現被用作為內部對照組。PCR條件為95℃ 3分鐘；於95℃ 10秒鐘、65℃ 20秒鐘、及72℃ 2秒鐘進行40個循環；及最終作用於72℃ 2分鐘。如此即可取得擴增轉錄物所需之循環次數。EV71 P1 RNA之相對表現係以下列方式計算：從實驗組或對照組取得之個別Ct值經與其對應Ct(β-肌動蛋白)互減後，以得到常態化之Ct，接著將2^{常態化Ct(源自未經病毒感染之樣本中的P1 RNA的VP1)}除以2^{常態化Ct(源自經病毒感染之樣本中的P1 RNA的VP1)}。該正向及反向引子，[5_-ACGCGCAAATGCGTAGAAAGGT-3_-正向的(SEQ ID NO：7)及5_-TTAGTGGCAGTTTGCCATGCGA-3_-反向的(SEQ ID NO：8)]，用於擴增及偵測VP1 RNA。使用引子對5_-ACCAACTGGGACGACATGGAGAAA-3_-正向的(SEQ ID NO：9)及5_ -TAGCACAGCCTGGATAGCAACGTA-3_-反向的(SEQ ID NO：10)以擴增人類β-肌動蛋白mRNA。標靶Ad-EVVLP之P1、3CD、及EF-1α啟動子區域的引子對如下所示：P1：5_-ATCGGAATTCATGGGCTCACAGGTGTCCAC-3_-正向的(SEQ ID NO：11)及5_-CTTGTCGACTTAGAGAG TGGTAATTGCTG-3_(SEQ ID NO：12)-反向的、3CD：5_-ATCGGAATTCATGGGGCCGAGCTTGGAC-3_-正向的(SEQ ID NO：13)及5_-ATCGCTCGAGAAACAATTCGAGCC-3_-反向的(SEQ ID NO：14)、EF-1α啟動子：5_-ATCGACGCGTGTGAGGCTCCGGTGCCC-3_-正向的(SEQ ID NO：15)及5_-ATCGCCCGGGGTTTTCACGACACCTG-3_-反向的(SEQ ID NO：16)。所有引子對係購自台灣Genomics BioSci&Tech合成者。

1.7 EV71 VLP及Ad之密度梯度純化

於接種Ad-EVVLP(以MOI=1感染)前一天，將HEK-293A細胞(1 x 10⁷)種在10孔盤中。經24小時感染後，收獲細胞並將之以1% NP-40溶解緩衝液(50mM Tris/HCl，pH 7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，及1% NP-40)，於冰上作用30分鐘進行溶解，並以1000xg離心10分鐘以移除細胞碎片。收獲上清液並以100,000xg、4℃進行超高速離心1小時而濃縮，接著將之溶解於30μL PBS中。將樣本裝入自製的碘克沙醇梯度中；該梯度是藉由將0.6mL S溶液(0.25M蔗糖，15mL EDTA，30mM Tris/HCl，pH 8.0)及0.42mL 60%(w/v)碘克沙醇(Cat.No.1114542，Optiprep；Axis Shield,UK)混合以形成一均質之溶液來製備。梯度係透過於4℃、162,000xg進行離心24小時生成。不同片段係以手動方式自頂端收獲(稱第一片段)，每一片 段0.1mL，及從每個樣本中連續收集10個片段。該等片段遂被以Mab979抗體進行西方墨點法，或以穿透式電子顯微鏡觀察。

1.8 穿透式電子顯微鏡

經Ad-EVVLP感染後24小時，收獲HEK-293A細胞，並將細胞碎片以-80℃ 30分鐘及37℃ 15分鐘進行凍融兩次。將溶解物於室溫、3000rpm離心15分鐘，並收獲上清液，供JEOL JEM-1400穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscope；TEM)分析腺病毒。透過密度梯度離心將溶解物片段化，且藉由於100,000xg進行超高速離心1小時以濃縮各個片段，並將之重新懸浮於200μL PBS中。接著將各片段以100 KDa-cut-off spin-X^RUF 20管柱(Corning)進行離心以淨化之。樣本以醋酸鈾醯處理後，以TEM分析。

1.9 ELISA

將96孔盤中以每孔100μL之熱不活化的(56℃經1小時)10³pfu EV71 5746(C2基因型)或E59(B4基因型)株、200pfu純化的Ad5、或700ng重組的3C蛋白及碳酸鹽包覆緩衝液進行包覆，以偵測血清中之抗EV71、抗Ad、或抗3C抗體。血清樣本係自免疫小鼠中收集，並以56℃進行不活化30分鐘。從8倍起始稀釋階開始將血清進行兩倍序列稀釋。將稀釋的血清加入孔洞中，並於室溫作用2小時。再以PBS-T清洗後，將HRP共軛的驢抗鼠IgG抗體加入孔洞中作用45分鐘。接著與100μL TMB受質(3,3’,5,5’-匹甲基聯苯胺)於黑暗中作用20分鐘以開始進行反應，並加入50μL 2N H₂SO₄以終止反應。使用微盤吸光讀值機(SPECTRA，MAX2，M2)，於450nm測定光學密度。為了偵測由脾細胞分泌之細胞激素，將源自培養兩天之以10⁷ pfu/mL UV-不活化EV71 5746進行再刺激之脾細胞之上清液進行分析，係使用一測熱能之三明治IFN-γ、IL-4、IL-13、及IL17A ELISA套組(分別為Cat.No.887314、88-7044、88-7137，及88-7371，eBioscience)分析。該分析是根據製造商之指示進行，並使用微盤吸光值讀取機於450nm測定光學密度。

1.10 中和能力分析

偵測中和活性之方法，即如同吾人先前研究中所述之方法[26]，將每一個樣本以新鮮細胞培養基進行2倍序列稀釋。將E59、5746、或CVA16株加入每一管含有100μL序列稀釋血清中以製備總共100μL 100 TCID₅₀之病毒懸浮液。於4℃培養18至24小時後，將100μL病毒血清混合物加入96孔盤中，其中種有橫紋肌肉瘤細胞(RD)，並將之於37℃培養7天，TCID₅₀值係以計算細胞病變效應(CPE)測量。50%中和抑制劑量(ID50)係將血清稀釋倍數之倒數與正常血清比較，並以Reed-Muench方法計算[29]。使用小鼠抗EV71 Mab979抗體(Chemicon International)做為內部的陽性對照組。

1.11 酵素結合免疫吸附分析法

含有5×10⁶無RBC之脾細胞的懸浮液係自個別小鼠製備，並將之種於96孔之過濾盤(Millipore)之個別孔洞中，該盤係預先以捕捉型單株抗體包覆，該單株抗體可辨識鼠IL-4或IFN-γ(0.5μg/well)(分別為Cat.No.16-7041-68或16-7313-68，eBioscience)，並以條件培養基(conditioned medium；CM)於室溫先阻斷1小時。將脾細胞加入溶於CM(100μL)中之10⁶pfu/well UV-不活化的EV71 5746。將脾細胞與Con A(10μg/mL)作用以作為一陽性對照組。將未刺激的脾細胞作為陰性對照組。將為96孔盤置於含有 5% CO₂之37℃培養箱中作用48小時。ELISPOT盤之個別孔洞係以PBS-T清洗3次，並將相對應之0.2μg生物素化的專一偵測IL-4-或IFN-γ的單株抗體加入，以偵測相對應之細胞激素。於室溫經2小時作用後，清洗該等96孔盤，並加入100μL鏈黴親和素鹼性磷酸酶(1：250稀釋倍數)於各別孔洞中。將該等盤置於室溫作用45分鐘。最後，將該等盤以清洗緩衝液清洗4次，並加入100μL AEC(3-胺-9-乙基咔唑，Sigma-Aldrich)受質於每一個孔洞中，並於室溫暗處作用30分鐘。將盤以水清洗乾淨，整夜風乾，並使用免疫斑點計算讀取機(Immunospot，Cellular Technology Ltd.)計算每一個孔洞的斑點。結果係以每5×10⁵脾細胞(於起始培養時所種之數量)中之細胞激素分泌細胞數量表示。

1.12 Ad-EVVLP免疫hSCARB2轉殖基因小鼠，係以EV71及CVA16攻毒

hSCARB2-Tg小鼠係以C57BL/6小鼠為底，係由吾人團隊先前生成的，且藉由將hSCARB2-Tg個體交配以維持得到自交小鼠[16]。將1日齡之hSCARB2-Tg小鼠，於第1及7天，以皮下方式注射PBS、3×10⁷pfu Ad-LacZ、或3×10⁶或3×10⁷pfu Ad-EVVLP或1μg FI-EV71疫苗，接著於第14天以3×10⁶pfu EV71 5746或5×10⁵pfu CVA16進行皮下方式攻毒。攻毒後15天，每日觀察小鼠之存活情形。

1.13 統計分析

對數等級檢定係用於分析經藥物處理及未處理之轉殖基因小鼠的存活率差異。非成對之T檢定及Welch’s校對統計係用於分析實驗組別中測試基因的表現差異。結果被認為具顯著差異者係以p<0.05表示。符號* 及**用於分別代表p值<0.05及<0.01。

2. 結果

2.1 於HEK-293A細胞生產Ad-EVVLP及VLP

吾人使用E1及E3剔除之腺病毒-5基因組，以構築Ad-EVVLP表現載體，其帶有全長之EV71型之P1及3CD基因(圖1A)。吾人以聚合酶連鎖反應(PCR)及對應之引子，以確認該插入物P1及3CD及延長因子-1α啟動子(EF-1p)是否有插入Ad-EVVLP構築體中。其PCR產物對應之大小為2585bps(P1)、2020bps(3CD)、及1186bps(EF-1p)(圖1B)。轉染至勝任HEK-293A細胞以持續表現E1蛋白，以生成重組的Ad。吾人使用多株抗體抗Ad5抗體進行西方墨點法，以分析Ad-EVVLP及對照組Ad-LacZ。其表現之每個Ad結構蛋白，包括異己酮蛋白、聚氯醚及蛋白V、VI、及VII(圖1C)。先前研究顯示VP0(38KDa，VP2+VP4的前軀產物)、VP1(36KDa)、VP2(28KDa)、VP3(25KDa)、及VP4(8KDa)之多重殼體蛋白可於EV71感染之細胞中被測得[26,30]。藉由Ad-EVVLP表現之VLP進一步分析其特性；EV71 VLPs之轉譯產物，包括VP0(VP4-VP2前軀物)但不包括VP2，可使用VP2專一的單株抗體Mab979[47]於293A細胞中測得。以西方墨點法偵測EV71抗原VP0及VP2(圖1C)。吾人藉由使用VP1專一抗體，確認了VP1的表現，其可對應於Ad-EVVLP感染的溶解物及EV71抗原樣本中之34至36kDa的條帶(圖1C)。相較於F顆粒(由VP2、VP4、VP1及VP3組成)，由Ad-EVVLP表現之VLPs抗原圖譜與源自EV71之E顆粒(由VP0、VP1、及VP3組成)相似，該E顆粒不含有病毒RNA[30]。此外，於缺少EV71遺傳的RNA情況下，3C’將P1多蛋白處理以形成VP0、VP1及VP3[30]。吾人使用抗3C蛋白可偵測到一18kDa條帶。 相對的，於未感染或Ad-LacZ轉染之293A細胞中，吾人無法測得該等條帶(圖1C)。然而，沒有可用之VP3專一抗體可用於偵測VP3。於EV71感染小鼠之血清中，吾人藉由墨點法無法測得VP3訊號(圖9)。

為了證明EV71 VLP顆粒可於Ad-生成細胞中同時產生，吾人使用密度梯度離心法使其片段化，藉此將病毒顆粒(virions)從Ad-EVVLP轉染子之細胞質中純化出來。吾人將片段化之EV71顆粒作為對照組。吾人將每一個片段化之樣本，使用Mab979抗體進行西方墨點分析以分析其特性。主要條帶為38kDa，可對應至VP0，另外有較低表現量之28kDa，其對應至VP2(VP0/VP2之強度比率分別為4及6)，於片段6及7，這兩者可生成EV71之E顆粒。相對的，與VP0/VP2表現相反之圖譜(分別為0.8、0.9、及0.8)可對應至F顆粒，其可於片段8、9、及10中觀察到。然而，僅有VP0訊號可於Ad-EVVLP感染之溶解物中的片段6至9中偵測到(圖2A)。EV71型之相似的抗原圖譜，已於先前研究中報告過[31]。

吾人將Ad-EVVLP樣本之片段7及8混合，並藉由TEM分析它們。TEM分析結果顯示於樣本中有部分破碎的VLPs(f)及細胞不純物，此係因樣本製備過程所致。另外，有兩個大小之完整顆粒亦存在，直徑超過100nm之顆粒對應至Ad顆粒(圖2D)，以及直徑約為30nm之顆粒對應至由Ad-EVVLP所表現之VLPs(圖2B)。於EV71樣本之片段8及9的混合物中之EV71顆粒亦被檢查(圖2C)。

2.2 於Ad-EVVLP免疫小鼠中EV71 VLP專一的體液性反應

為了分析及比較Ad-EVVLP及FI-EV71疫苗之免疫原性，吾人藉由腹腔(i.p.)、皮下(i.p.)或口服方式，將1×10⁸pfu Ad-EVVLP或 Ad-LacZ，於第1及14天投與成年BALB/c小鼠。於不同組別中之動物，以0.1μg或1μg FI-EV71兩次皮下注射，以評估及比較該等重組腺病毒之病毒專一性免疫反應。ELISA結果顯示(圖3A)，於Ad-EVVLP-免疫血清樣本(於第21天收集者)之抗EV71之平均力價(抗EV71 5746(C2亞基因型))為2240、7040、及130(分別為皮下、腹腔及口服之力價)。吾人於皮下注射Ad-LacZ-免疫小鼠之血清中無法測得力價(圖3A)。源自Ad-EVVLP免疫動物之血清抗體，與EV71 E59株(B4亞基因型)作用之平均力價為2240、8960及180(分別為皮下、腹腔及口服之力價)。同樣的，於Ad-LacZ免疫小鼠血清中無法測得E59之反應(圖3B)。源自Ad-EVVLP免疫小鼠血清具有EV71中和活性(表1)。相較於於口服投藥之動物的相當低的中和力價，可於腹腔及皮下投藥之Ad-EVVLP免疫小鼠中發現有較高之病毒中和力價(1/128)。於Ad-EVVLP免疫小鼠所產生之中和抗體，具有抗EV71型B及C株之有效中和活性。於皮下投藥0.1μg FI-EV71疫苗之小鼠中，中和抗體力價(1/256及1/512)具明顯之抗體力價。但於免疫Ad-EVVLP、FI-EV71疫苗、或PBS(<1：8；表1)之小鼠血清中無抗CVA16之中和活性。此等結果與先前報告[32]結果吻合，顯示FI-EV71疫苗無法誘發交叉保護之中和抗體以對抗CVA16。

*將七周齡BALB/c小鼠分別以10⁸pfu Ad-EVVLP或Ad-LacZ，以腹腔、皮下或口服方式，進行首免及補強，中間間隔14天。於第21天時收集血清以分析中和活性：先將個別免疫血清進行不同倍數稀釋，並與10²pfu 5746、E59或CVA16進行作用後，再加入RD細胞。培養後第5天觀察CPE。結果係以中和抗體力價表示，係對應至該稀釋倍數之免疫血清，以降低50%細胞病變反應來計算TCID₅₀值。

2.3 於Ad-EVVLP免疫小鼠誘發VLP專一細胞免疫

近期研究關於對抗EV71之宿主免疫反應，顯示T細胞免疫於提供保護以對抗EV71感染及控制疾病中，扮演很重要之腳色[33,34]。因此，吾人探討是否VLP專一之CD4⁺及CD8⁺T細胞反應是否可於Ad-EVVLP免疫小鼠中被誘發。免疫後7天，吾人從脾臟中分離出脾細胞，接著以經UV不活化之EV71(UV-EV71)進行體外再刺激。源自Ad-LacZ免疫小鼠之淋巴球可生產基礎量之IFN-γ。相對地，經施予Ad-EVVLP之小鼠，其淋巴球培養物中可測得較高之IFN-γ(圖4A)。源自FI-EV71疫苗免疫小鼠之淋巴球，亦僅有分泌出基礎量之IFN-γ(圖4A)。於Th2細胞激素試驗表中，源自Ad-EVVLP免疫小鼠之淋巴球，亦適度地分泌出IL-4(圖4B)及IL-13(圖4C)，意指平衡的Th1/Th2反應亦被活化了。有趣的是，免疫FI-EV71疫苗可產生最高量的IL-4及IL-13，意指偏向Th2反應被誘發了(圖4B及圖4C)。此結果與吾人之發現相同，即於hSCARB2-Tg小鼠中免疫FI-EV71，可誘發脾細胞IL-4但不會誘發IFN-γ之分泌，如先前研究所示[16]。從IFN-γ及IL-4 ELISPOT試驗結果可確認，腹腔注射Ad-EVVLP進行免疫，可於Ad-EVVLP免疫小鼠中，誘發明顯的脾細胞IFN-γ生成，及少量的IL-4分泌(圖10)。源自Ad-EVVLP免疫小鼠之脾細胞為因應EV71抗原，會生成適量之IL-17A。此結果與以Ad-LacZ或FI-EV71疫苗免疫之動物脾細胞所分泌之幾乎無法測得之IL-17，明顯不同(圖4D)。該等結果指出Ad-EVVLP可驅動T細胞活化，使得T細胞之亞群進行分化，其包含可產生Th1、Th2、及IL-17之表現型。

吾人測量於疫苗免疫後之脾細胞中，經以UV-EV71再刺激後，VLP專一之CD4⁺ T細胞增生情形；其中是使用流式細胞儀，並藉由分析5-(6)-羧基螢光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺脂(CFSE)-預染之CD4⁺ T細胞之螢 光訊號之陰性轉變情形以分析增生狀況。相較於PBS及Ad-LacZ免疫組僅可測得少量或幾乎沒有陰性轉變情形(分別為3%及8.4%)，而於Ad-EVVLP免疫組則可測到實質之陰性轉變(42%；圖5A)。於FI-EV71免疫小鼠中，經UV-EV71處理後，幾乎無法測得CD4⁺ T細胞之增生(8%；圖5A)，意指FI-EV71反應形成之VLP的抗原性已改變，因此免疫後的CD4⁺ T細胞無法藉由接觸到EV71顆粒後被完全活化。吾人進一步分析，於Ad-及FI-EV71-免疫動物中，VLP專一的CD8⁺ T細胞活化反應。經UV-EV71再刺激後，吾人以與抗體共軛之螢光染料將脾細胞進行染色，該抗體可與表面之CD8分子及細胞內的IFN-γ作用，再藉由流式細胞儀分析該等細胞。吾人發現於Ad-EVVLP免疫小鼠中，CD8⁺IFN-γ⁺ T細胞的數量(6.5%)較Ad-LacZ-或FI-EV71免疫小鼠者(分別為0.9%或1.5%；圖5B)高。該等結果顯示Ad-EVVLP可活化EV71 VLP專一的細胞免疫反應。

2.4 於hSCARB2-Tg小鼠中，Ad-EVVLP疫苗提供保護，以對抗EV71感染

吾人進一步藉由使用hSCARB2-Tg小鼠模式，以評估Ad-EVVLP於提供保護對抗EV71感染之效力分析。將1日齡hSCARB2-Tg小鼠，於第1及7天以Ad或FI-EV71疫苗，進行首免及皮下補強，接著以皮下攻毒方式，於出生後14天以3×10⁶pfu EV71 5746株進行攻毒。每日觀察小鼠之存活狀況。如圖6A所示，經以3×10⁷pfu Ad-LacZ或PBS免疫之小鼠，攻毒後8至9天便死亡了。相反的，經施予少量之3×10⁶pfu的Ad-EVVLP後，約有75%小鼠存活，以及經注射10倍劑量之Ad-EVVLP後，100%小鼠皆存活。與接受0.1μg FI-EV71疫苗之EV71攻毒小鼠相比，結果也是100%小鼠皆存活(圖 6A)，意指Ad-EVVLP的對抗EV71感染之保護效力與FI-EV71疫苗相仿。吾人進一步分析經疫苗免疫之動物及攻毒後之不同組織的病毒載量。吾人將感染後第4天之EV71攻毒Tg小鼠之不同器官中萃取RNA，使用VP1區域專一之引子進行即時RT-PCR來定量EV71轉錄。相較於Ad-LacZ免疫小鼠之較高的VP1表現，Ad-EVVLP免疫可實質地降低腦幹、脊髓、及肌肉之VP1表現(圖6B)，因此確認了Ad-EVVLP可壓抑EV71感染及複製。

2.5 於Ad-EVVLP免疫小鼠中，可生成3C專一之免疫反應

3C及3D為一保守的蛋白，其於EV71及CVs(A16、A6、A10、及A4)間具有至少90%之胺基酸序列同源性(表2)。

吾人分析藉由Ad-EVVLP免疫，是否可誘發3C專一之免疫反應。吾人收集經以皮下注射Ad-EVVLP、Ad-LacZ、或FI-EV71，首免及補強後第7天之小鼠血清進行分析。以重組3C蛋白包覆之ELISA捕捉型試驗法分析，源自Ad-EVVLP免疫小鼠之血清，可誘發抗3C蛋白之活性。於Ad-LacZ-或FI-EV71之免疫小鼠的血清中，無法測得抗3C之結合活性(圖7A)。與來自FI-EV71之抗血清相似，源自Ad-EVVLP免疫小鼠之抗血清對於CVA16不具有病毒中和活性(表1)。再者，以弗式完全佐劑(CFA)調製之10μg的重組3C蛋白進行小鼠首免，並以弗式不完全佐劑(IFA)調製之相同劑量的重組3C蛋白進行補強，其間間隔14天，所收集之血清，誘發3C結合活性，但不能中和EV71或CVA16感染(圖11)。綜上所述，該等結果顯示誘發3C專一抗體，無法提供保護力以對抗EV71感染。

吾人進一步於經Ad-EVVLP免疫之小鼠中，分析3C專一的細胞免疫反應。吾人分離經過疫苗補強後第7天且經過重組3C蛋白體外再刺激之脾細胞，並藉由流式細胞儀觀察CD4⁺及CD8⁺ T細胞活化情形(圖7)。源自 Ad-EVVLP免疫組之CD4⁺ T細胞，因應3C而被活化(平均值為32.6%)，但於PBS、Ad-LacZ-、及FI-EV71免疫小鼠中無法或僅有少量活化之脾細胞可被觀察到(平均值分別為2.3%、2.2%、及1.9%；圖7B)。相較於Ad-LacZ(平均值為0.5%)或FI-EV71(平均值為0.5%)之小量的CD8⁺IFN-γ⁺ T細胞，及源自經PBS緩衝液免疫小鼠所得之基礎量的CD8⁺IFN-γ⁺ T細胞(平均值為0.6%；圖7C)，於Ad-EVVLP免疫之脾細胞中，因應3C蛋白所活化之CD8⁺(CD8⁺IFN-γ⁺)T細胞係明顯地被活化(平均值為3.8%)。該等結果確認了Ad-EVVLP可誘發CD4⁺/CD8⁺ T細胞反應，以對抗VLP及3C蛋白。

2.6 於hSCARB2-Tg小鼠中，Ad-EVVLP疫苗提供保護以對抗CVA16感染

除了提供保護對抗EV71感染外，吾人亦探討Ad-EVVLP或FI-EV71是否可幫助hSCARB2-Tg小鼠對抗CVA16致死攻毒。經Ad-EVVLP免疫後，100%的hSCARB2-Tg小鼠皆存活，相對的，接受PBS或Ad-LacZ之hSCARB2-Tg小鼠，經CVA16攻毒後，存活率為0%(圖8A及表3)。Ad-EVVLP可完全保護動物，以對抗高於CVA16劑量(3×10⁶pfu)6倍之攻毒(表3)。與吾人先前報告一致[16,35]，免疫1μgFI-EV71疫苗無法保護hSCARB2-Tg小鼠，以對抗5x10⁵pfu CVA16攻毒，結果呈現0%之存活率(圖8B及表3)。綜上所述，該等結果顯示Ad-EVVLP疫苗可誘發有效的CD4⁺/CD8⁺ T細胞免疫反應，以控制EV71及CVA16，然而，FI-EV71疫苗所提供之保護僅可對抗EV71攻毒。表1呈現了該等結果呈一關聯性，以及於臨床試驗第I期的結果中，源自免疫FI-EV71疫苗之個體血清可中和不同EV71基因型，但無法交叉中和CV[32,36]。

*以PBS、3×10⁷pfu Ad-LacZ、3×10⁷pfu Ad-EVVLP、或1μg FI-EV71疫苗，分別於出生後第1天及第7天(攻毒前)對hSCARB2-Tg小鼠進行皮下預接種兩次，攻毒係以5×10⁵或3×10⁶pfu CVA16皮下方式攻毒。*每組全部數量之試驗小鼠中存活的小鼠數量，如表所示，並計算其存活率。

3. 討論

於先前研究中，EV71次單位疫苗包括DNA疫苗及重組VP1蛋白，可誘發不完全之免疫反應，且效力較低[19,37]。口服疫苗，像是該等可表現EV71 VP1之抗弱化之腸道沙門氏菌，證明對抗EV71僅具有限之效力，攻毒後僅能提高存活率至50%[38]。可表現VP1之轉殖基因番茄[39]及胜肽疫苗[40]亦被開發出來，但疫苗效力尚未於活體內被評估過。一個含有福馬林之變性的病毒顆粒作為疫苗(FI-EV71)，係於hSCARB2-Tg小鼠模式[16]、及人體臨床試驗[32]中被測試，其中證實了其之安全及保護效力。於一個發展流感VLP作為疫苗之先前研究顯示，破壞流感VLP結構會阻斷體液免疫反應及保護免疫力[41]。此外，變性之EV71顆粒具有線性的抗原決定基，可誘發抗EV71抗體；然而，其中大多數可能是不能被中和的，此與脊髓灰質炎病毒之案例相似[42]。喪失誘發有效中和抗體能力，可能與不活化過程中喪失之抗原決定基，像是藉由福馬林變性之EV71顆粒有關。以昆蟲 細胞表現之VLP，於猴子中所誘發之中和抗體力價甚至更低，增生更低、及細胞激素生成也減少[35]。此可能是因為於非人類細胞中之VLP蛋白的不同後轉譯修飾，而導致不同之免疫反應。相對的，從宿主細胞所生成之完整VLP，保留了構型依存之抗原決定基，其可能促使VLPs可與B細胞受體進行直接交互作用，進而活化B細胞及透過抗原呈現細胞進行抗原內化[43]。此可誘發有效之抗體反應[44]並與經刺激之CD4⁺ T細胞合作，交互輪替進行[45]。再者，最近的研究顯示中和抗體，特定而言是該等對抗EV71殼體蛋白之中和抗體，無法交叉保護CV感染[36,46]，指出該疫苗目前發展僅能提供保護力對抗EV71所誘發之HFMD。

於本研究中，吾人評估可表現EV71 VLP之腺病毒作為疫苗以對抗EV71及CVA16感染之可能性，評估方式藉由比較Ad-EVVLP及經由福馬林不活化製備之經典的EV71疫苗所誘發之效力及免疫反應。以Ad-LacZ免疫無法誘發EV71專一抗體力價，且僅有少量之T細胞反應，相較於Ad-EVVLP及FI-EV71疫苗，該兩者可高效誘發抗EV71抗體力價(圖3，表1)。由Ad-EVVLP誘發之抗體存在交叉反應性，以對抗臨床分離之EV71 C2及B4基因型(圖3)。除了抗VLP抗體外，該Ad-EVVLP疫苗可誘發抗3C抗體(圖7)。然而，吾人於免疫Ad-EVVLP-及FI-EV71-之小鼠血清中，無法觀察到有可對抗CVA16之中和活性(表1)。因為3C蛋白可能沒有表現，或表現於EV71或CV之內殼體中，此可能可解釋為何抗3C抗體無法結合至3C蛋白。

先前研究顯示，已存在之抗腺病毒抗體不會影響接續之體液反應之產生，該體液反應係由一透過黏膜施予之重組的腺病毒載體之抗原所誘發[47-49]。然而，口服免疫Ad-EVVLP所誘發之免疫反應，較以系統性 Ad-EVVLP免疫方式(皮下或腹腔；圖3及表1)之小鼠的免疫反應為低。吾人之結果顯示於疫苗首免動物中之血清中存在著低抗Ad抗體(圖12)，但不會因為口服、皮下或腹腔施予第二劑之Ad-EVVLP而影響小鼠血清中之二級VLP專一抗體。Ad-EVVLP之實際免疫效力仍需要於臨床試驗中被評估。

除了體液反應外，源自其它病毒之VLPs已有報告指出可誘發樹突細胞(DC)成熟，及細胞激素之分泌[16,17]，且可刺激CD4⁺[18]及CD8⁺ T細胞[19,20]。Ad為一個很強的DC活化子，其可進行酵素反應，並呈現與MHC第I型及第II型分子關連之抗原胜肽於表面上，以及接續地協調及刺激輔助T細胞及細胞毒殺性T細胞反應[50]。Ad-EVVLP免疫可誘發殼體蛋白專一之細胞的免疫反應，此點可由EV71 VLP誘發之CD4⁺及CD8⁺ T細胞活化(圖5)，及細胞激素的產生(圖4)證實。相較於FI-EV71疫苗免疫，其活化了Th2-調控之反應[16]，與IL-4及IL-13之分泌有關(圖4)，及經由Ad-EVVLP免疫之脾細胞所產生之高量之IFN-、IL-4及IL-13(圖4)，此顯示混和的Th1/Th2免疫反應可加強活化影響者之細胞反應及抗體生成。該等結果與流感病毒之VLP[21]及人類乳突病毒[51]所誘發之Th1/Th2免疫反應一致。相反地，於FI-EV71免疫小鼠中，無法觀察到該VLP所相應之CD4⁺及CD8+ T細胞活化現象(圖5)，指出FI-EV71疫苗之VLP的抗原決定基之抗原性，可能經福馬林不活化後，從原本型態之EV71 VLP被改變了。然而，結構分析顯示FI-EV71與感染性之EV71病毒顆粒並無不同[13]，且免疫原性研究已揭示經福馬林不活化之EV71之F及E顆粒，可誘發中和抗體，即便於小鼠中F顆粒較E顆粒更具效力[31]。因此，相較於FI-EV71疫苗之VLP，Ad-EVVLP表現之VLP之抗原性，於將來會針對細胞反應之活化進一步研究。

於Ad-EVVLP-，但非FI-EV71疫苗免疫小鼠中，可觀察到(圖7)對應於重組3C蛋白所產生之CD4⁺及CD8⁺ T細胞調控之細胞反應。吾人證明Ad-EVVLP免疫，可完全保護hSCARB2-Tg小鼠以對抗EV71(圖6)及CVA16攻毒(圖8及表3)。該等結果顯示透過Ad-EVVLP可提供保護對抗EV71感染，其中係藉由誘發EV71 VLP專一中和抗體，以及VLP及3C專一細胞免疫調控。於兒童及嬰兒之較低的中和抗體力價及伴隨之高傳染率，可見中和抗體對於預防EV71感染是很重要的[52,53]。吾人研究亦證實hSCARB2-Tg小鼠之EV71攻毒，再以VP1專一單株抗體治療，可預防EV71誘發之病狀[46]。然而，自發病第1天起，於80%之含有中和抗體之EV71感染的病患血清中，其抗體力價與疾病嚴重程度不具關聯性[54]。相反的，細胞免疫反應與疾病進展及臨床病狀有關連[33,55]。於EV71病患中，降低的細胞免疫力與增加的疾病嚴重度係有關連的，然而中和抗體於該等輕度及重度病例中並無區別[34]。該等研究顯示細胞免疫力可能對於提供保護力以對抗腸病毒感染十分重要。吾人結果顯示，由Ad-EVVLP誘發之3C專一細胞免疫力，可能足以保護以對抗CVA16感染(圖8及表3)，即便Ad-EVVLP無法誘發CVA16-VLP專一之中和抗體(表1)。因此，吾人構築僅可表現3CD基因之Ad-3CD，並將之免疫hSCARB2-Tg小鼠，接著以EV71或CVA16攻毒。該結果顯示Ad-3CD可完全保護動物免於EV71及CVA16攻毒(圖13)。意即3CD專一細胞免疫力足以提供保護力以對抗EV71及CVA16感染。

總結，透過無法複製之腺病毒於宿主細胞表現VLP，以模擬EV71顆粒之天然的結構，以誘發對抗VLP及3C蛋白之抗體，以及誘發專一於VLP及3C蛋白之細胞免疫力。由於3C蛋白於EV71及CVA間高度保守(表 2)，吾人證明了Ad-EVVLP可作為一多價疫苗以抑制EV71及CVA16誘發的疾病。吾人於發展一醫藥所需之腸病毒疫苗上，達到眾多突破性結果。首先，與EV71疫苗次單位、不活化EV71疫苗、或蛋白型VLPs僅能保護EV71誘發之HFMD有所不同，Ad-EVVLP可預防EV71及CVA所誘發之HFMD。再者，誘發3C專一之細胞免疫力，可能足以保護對抗CVA感染。

序列資訊

EV71 P1(SEQ ID NO：1)

EV71 3CD(SEQ ID NO：2)

EV71 3C(SEQ ID NO：5)

EV71 3D(SEQ ID NO：6)

參考文獻：

1. Ho M, Chen ER, Hsu KH, Twu SJ, Chen KT, Tsai SF, et al. An epidemic of enterovirus 71 infection in Taiwan. Taiwan Enterovirus Epidemic Working Group. N Engl J Med. 1999;341: 929-935.

2. Wang SM, Liu CC, Tseng HW, Wang JR, Huang CC, Chen YJ, et al. Clinical spectrum of enterovirus 71 infection in children in southern Taiwan, with an emphasis on neurological complications. Clin Infect Dis. 1999;29: 184-190.

3. Liu CC, Tseng HW, Wang SM, Wang JR, Su IJ. An outbreak of enterovirus 71 infection in Taiwan, 1998: epidemiologic and clinical manifestations. J Clin Virol. 2000;17: 23-30.

4. Perez-Velez CM, Anderson MS, Robinson CC, McFarland EJ, Nix WA, Pallansch MA, et al. Outbreak of neurologic enterovirus type 71 disease: a diagnostic challenge. Clin Infect Dis. 2007;45: 950-957.

5. Huang CC, Liu CC, Chang YC, Chen CY, Wang ST, Yeh TF. Neurologic complications in children with enterovirus 71 infection. N Engl J Med. 1999;341: 936-942.

6. AbuBakar S, Chee HY, Al-Kobaisi MF, Xiaoshan J, Chua KB, Lam SK. Identification of enterovirus 71 isolates from an outbreak of hand, foot and mouth disease (HFMD) with fatal cases of encephalomyelitis in Malaysia. Virus Res. 1999;61: 1-9.

7. Lin KH, Hwang KP, Ke GM, Wang CF, Ke LY, Hsu YT, et al. Evolution of EV71 genogroup in Taiwan from 1998 to 2005: an emerging of subgenogroup C4 of EV71. J Med Virol. 2006;78: 254-262.

8. Lu CH, Huang SW, Lai YL, Lin CP, Shih CH, Huang CC, et al. On the relationship between the protein structure and protein dynamics. Proteins. 2008;72: 625-634.

9. Melnick JL, Schmidt NJ, Mirkovic RR, Chumakov MP, Lavrova IK, Voroshilova MK. Identification of Bulgarian strain 258 of enterovirus 71. Intervirology. 1980;12: 297-302.

10. Nagy G, Takatsy S, Kukan E, Mihaly I, Domok I. Virological diagnosis of enterovirus type 71 infections: experiences gained during an epidemic of acute CNS diseases in Hungary in 1978. Arch Virol. 1982;71: 217-227.

11. Wu TN, Tsai SF, Li SF, Lee TF, Huang TM, Wang ML, et al. Sentinel surveillance for enterovirus 71, Taiwan, 1998. Emerg Infect Dis. 1999;5: 458-460.

12. McMinn PC. An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance. FEMS Microbiol Rev. 2002;26: 91-107.

13. Wang X, Peng W, Ren J, Hu Z, Xu J, Lou Z, et al. A sensor-adaptor mechanism for enterovirus uncoating from structures of EV71. Nat Struct Mol Biol. 2012;19: 424-429.

14. Yamayoshi S, Yamashita Y, Li J, Hanagata N, Minowa T, Takemura T, et al. Scavenger receptor B2 is a cellular receptor for enterovirus 71. Nat Med. 2009;15: 798-801.

15. Nishimura Y, Shimojima M, Tano Y, Miyamura T, Wakita T, Shimizu H. Human P-selectin glycoprotein ligand-1 is a functional receptor for enterovirus 71. Nat Med. 2009;15: 794-797.

16. Lin YW, Yu SL, Shao HY, Lin HY, Liu CC, Hsiao KN, et al. Human SCARB2 transgenic mice as an infectious animal model for enterovirus 71. PLoS One. 2013;8: e57591.

17. Fujii K, Nagata N, Sato Y, Ong KC, Wong KT, Yamayoshi S, et al. Transgenic mouse model for the study of enterovirus 71 neuropathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110: 14753-14758.

18. Chang JY, Chang CP, Tsai HH, Lee CD, Lian WC, Ih Jen S, et al. Selection and characterization of vaccine strain for Enterovirus 71 vaccine development. Vaccine.30: 703-711.

19. Wu CN, Lin YC, Fann C, Liao NS, Shih SR, Ho MS. Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus. Vaccine. 2001;20: 895-904.

20. Chung YC, Ho MS, Wu JC, Chen WJ, Huang JH, Chou ST, et al. Immunization with virus-like particles of enterovirus 71 elicits potent immune responses and protects mice against lethal challenge. Vaccine. 2008;26: 1855-1862.

21. Wang YF, Chou CT, Lei HY, Liu CC, Wang SM, Yan JJ, et al. A mouse-adapted enterovirus 71 strain causes neurological disease in mice after oral infection. J Virol. 2004;78: 7916-7924.

22. Khong WX, Yan B, Yeo H, Tan EL, Lee JJ, Ng JK, et al. A non mouse-adapted Enterovirus 71 (EV71) strain exhibits neurotropism causing neurological manifestations in a novel mouse model of EV71 infection. J Virol. 2012.

23. Wu SC, Liu CC, Lian WC. Optimization of microcarrier cell culture process for the inactivated enterovirus type 71 vaccine development. Vaccine. 2004;22: 3858-3864.

24. Liu CC, Lian WC, Butler M, Wu SC. High immunogenic enterovirus 71 strain and its production using serum-free microcarrier Vero cell culture. Vaccine. 2007;25: 19-24.

25. Lin YW, Lin HY, Tsou YL, Chitra E, Hsiao KN, Shao HY, et al. Human SCARB2-mediated entry and endocytosis of EV71. PLoS One. 2012;7: e30507.

26. Liu CC, Chou AH, Lien SP, Lin HY, Liu SJ, Chang JY, et al. Identification and characterization of a cross-neutralization epitope of Enterovirus 71. Vaccine. 2011;29: 4362-4372.

27. Mizuguchi H, Kay MA. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 1998;9: 2577-2583.

28. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 1976;72: 248-254.

29. Reed LJ MH. A simple method of estimating 50 percent end-points. Am J Hyg. 1938;27: 493-497.

30. Fundamental Virology. Fourth Edition ed.: Lippincott Williams and Wilkins; 2001.

31. Liu CC, Guo MS, Lin FH, Hsiao KN, Chang KH, Chou AH, et al. Purification and characterization of enterovirus 71 viral particles produced from vero cells grown in a serum-free microcarrier bioreactor system. PLoS One. 2011;6: e20005.

32. Liu CC, Chow YH, Chong P, Klein M. Prospect and challenges for the development of multivalent vaccines against hand, foot and mouth diseases. Vaccine. 2014 DOI: 10.1016/j.vaccine.2014.08.064.

33. Yang KD, Yang MY, Li CC, Lin SF, Chong MC, Wang CL, et al. Altered cellular but not humoral reactions in children with complicated enterovirus 71 infections in Taiwan. J Infect Dis. 2001;183: 850-856.

34. Chang LY, Hsiung CA, Lu CY, Lin TY, Huang FY, Lai YH, et al. Status of cellular rather than humoral immunity is correlated with clinical outcome of enterovirus 71. Pediatric research. 2006;60: 466-471.

35. Lin YL, Yu CI, Hu YC, Tsai TJ, Kuo YC, Chi WK, et al. Enterovirus type 71 neutralizing antibodies in the serum of macaque monkeys immunized with EV71 virus-like particles. Vaccine. 2012;30: 1305-1312.

36. Chou AH, Liu CC, Chang JY, Jiang R, Hsieh YC, Tsao A, et al. Formalin-Inactivated EV71 Vaccine Candidate Induced Cross-Neutralizing Antibody against Subgenotypes B1, B4, B5 and C4A in Adult Volunteers. PLoS One. 2013;8: e79783.

37. Lee MS, Chang LY. Development of enterovirus 71 vaccines. Expert Rev Vaccines. 2010;9: 149-156.

38. Chiu CH, Chu C, He CC, Lin TY. Protection of neonatal mice from lethal enterovirus 71 infection by maternal immunization with attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing VP1 of enterovirus 71. Microbes and infection/Institut Pasteur. 2006;8: 1671-1678.

39. Chen HF, Chang MH, Chiang BL, Jeng ST. Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71. Vaccine. 2006;24: 2944-2951.

40. Foo DG, Alonso S, Phoon MC, Ramachandran NP, Chow VT, Poh CL. Identification of neutralizing linear epitopes from the VP1 capsid protein of Enterovirus 71 using synthetic peptides. Virus Res. 2007;125: 61-68.

41. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM. Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. J Virol. 2007;81: 3514-3524.

42. Muir P, Kammerer U, Korn K, Mulders MN, Poyry T, Weissbrich B, et al. Molecular typing of enteroviruses: current status and future requirements. The European Union Concerted Action on Virus Meningitis and Encephalitis. Clinical microbiology reviews. 1998;11: 202-227.

43. Denis J, Majeau N, Acosta-Ramirez E, Savard C, Bedard MC, Simard S, et al. Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis C virus epitope: evidence for the critical function of multimerization. Virology. 2007;363: 59-68.

44. Zinkernagel RM. On natural and artificial vaccinations. Annual review of immunology. 2003;21: 515-546.

45. Gamvrellis A, Leong D, Hanley JC, Xiang SD, Mottram P, Plebanski M. Vaccines that facilitate antigen entry into dendritic cells. Immunology and cell biology. 2004;82: 506-516.

46. Chang HW, Lin YW, Ho HM, Lin MH, Liu CC, Shao HY, et al. Protective efficacy of VP1-specific neutralizing antibody associated with a reduction of viral load and pro-inflammatory cytokines in human SCARB2-transgenic mice. PLoS One. 2013;8: e69858.

47. Xiang ZQ, Gao GP, Reyes-Sandoval A, Li Y, Wilson JM, Ertl HC. Oral vaccination of mice with adenoviral vectors is not impaired by preexisting immunity to the vaccine carrier. J Virol. 2003;77: 10780-10789.

48. McCoy K, Tatsis N, Korioth-Schmitz B, Lasaro MO, Hensley SE, Lin SW, et al. Effect of preexisting immunity to adenovirus human serotype 5 antigens on the immune responses of nonhuman primates to vaccine regimens based on human-or chimpanzee-derived adenovirus vectors. J Virol. 2007,81: 6594-6604.

49. Shao HY, Yu SL, Sia C, Chen Y, Chitra E, Chen IH, et al. Immunogenic properties of RSV-B1 fusion (F) protein gene-encoding recombinant adenoviruses. Vaccine. 2009 DOI: S0264-410X(09)00992-X [pii] 10.1016/j.vaccine.2009.07.004.

50. Barouch DH, Nabel GJ. Adenovirus vector-based vaccines for human immunodeficiency virus type 1. Human gene therapy. 2005;16: 149-156.

51. Evans TG, Bonnez W, Rose RC, Koenig S, Demeter L, Suzich JA, et al. A Phase 1 study of a recombinant viruslike particle vaccine against human papillomavirus type 11 in healthy adult volunteers. J Infect Dis. 2001;183: 1485-1493.

52. Chang LY, King CC, Hsu KH, Ning HC, Tsao KC, Li CC, et al. Risk factors of enterovirus 71 infection and associated hand, foot, and mouth disease/herpangina in children during an epidemic in Taiwan. Pediatrics. 2002;109: e88.

53. Chang LY, Tsao KC, Hsia SH, Shih SR, Huang CG, Chan WK, et al. Transmission and clinical features of enterovirus 71 infections in household contacts in Taiwan. JAMA. 2004;291: 222-227.

54. Yang C, Deng C, Wan J, Zhu L, Leng Q. Neutralizing antibody response in the patients with hand, foot and mouth disease to enterovirus 71 and its clinical implications. Virol J. 2011;8: 306.

55. Chang LY, Chang IS, Chen WJ, Huang YC, Chen GW, Shih SR, et al. HLA-A33 is associated with susceptibility to enterovirus 71 infection. Pediatrics. 2008;122: 1271-1276.

<110> 財團法人國家衛生研究院

<120> 對抗腸病毒感染之基於腺病毒載體之疫苗

<130> NHR0008WO

<150> 61/985,803

<151> 2014-04-29

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 腸病毒71型(Enterovirus 71)

<400> 1

<210> 2

<211> 645

<212> PRT

<213> 腸病毒71型(Enterovirus 71)

<400> 2

<210> 3

<211> 5302

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣

<400> 3

<210> 4

<211> 5883

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表現卡匣

<400> 4

<210> 5

<211> 183

<212> PRT

<213> 腸病毒71型(Enterovirus 71)

<400> 5

<210> 6

<211> 462

<212> PRT

<213> 腸病毒71型(Enterovirus 71)

<400> 6

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子F(VP1)

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子R(VP1)

<400> 8

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子F(b-actin)

<400> 9

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子R(b-actin)

<400> 10

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子F(P1)

<400> 11

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子R(P1)

<400> 12

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子F(3CD)

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子R(3CD)

<400> 14

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子F(EF-1a)

<400> 15

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子R(EF-1a)

<400> 16

Claims (22)

1. 一種重組腺病毒載體，可用於產生免疫力以對抗腸病毒感染，包含表現卡匣，其編碼腸病毒之P1蛋白及3CD蛋白酶。
2. 如請求項1之重組腺病毒載體，其中該重組腺病毒載體是無法進行複製的。
3. 如請求項1之重組腺病毒載體，其中該P1蛋白或3CD蛋白酶係源自腸病毒71(EV71)。
4. 如請求項1之重組腺病毒載體，其中該P1蛋白具有如SEQ ID NO：1之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：1至少有85%、90%或95%相同性之胺基酸序列。
5. 如請求項1之重組腺病毒載體，其中該3CD蛋白酶具有如SEQ ID NO：2之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：2至少有85%、90%或95%相同性之胺基酸序列。
6. 如請求項1之重組腺病毒載體，其中該表現卡匣包括第一核酸片段，其編碼P1蛋白，及第二核酸片段，其編碼3CD蛋白酶。
7. 如請求項6之重組腺病毒載體，其中該第一核酸片段係與第一啟動子操作式連接，以控制該P1蛋白之表現；以及第二核酸片段係與第二啟動子操作式連接，以控制該3CD蛋白酶之表現，其中該第一啟動子及第二啟動子可為相同的或不同的啟動子。
8. 如請求項7之重組腺病毒載體，其中該第一啟動子及第二啟動子係獨立選自由巨細胞病毒啟動子、猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、T7啟動子、乙醇氧化酶基因(AOX1)啟動子、內部核醣體進入位(IRES)及延長因 子1a啟動子所組成之群組。
9. 如請求項7之重組腺病毒載體，其中該表現卡匣包括SEQ ID NO：3或4之核酸序列。
10. 一種重組腺病毒載體，可用於產生免疫力以對抗腸病毒感染，包含表現卡匣，其編碼腸病毒之3C蛋白酶或3CD蛋白酶。
11. 如請求項10之重組腺病毒載體，其中該重組腺病毒載體是無法進行複製的。
12. 如請求項10之重組腺病毒載體，其中該3C蛋白酶或3CD蛋白酶係源自腸病毒71(EV71)。
13. 如請求項10之重組腺病毒載體，其中該表現卡匣包括核酸片段，其編碼3C蛋白酶或3CD蛋白酶。
14. 如請求項13之重組腺病毒載體，其中該核酸片段係與啟動子操作式連接，以控制該3C蛋白酶或3CD蛋白酶之表現。
15. 一種疫苗組合物，可用於產生免疫力以對抗腸病毒感染，包含有效量之請求項1或14之重組腺病毒載體。
16. 一種如請求項1或14之重組腺病毒載體、或請求項15之疫苗組合物之用途，係用於製造醫藥，以於個體中誘發免疫反應，以對抗腸病毒感染。
17. 如請求項16之用途，其中該腸病毒感染係由腸病毒71型或克沙奇病毒A群所造成。
18. 如請求項16之用途，其中該重組線病毒載體或該疫苗組合物，係藉由皮下、腹腔、或口服方式施予。
19. 如請求項16之用途，其中該施予方式可重覆施予。
20. 如請求項16之用途，其中該免疫反應包括T細胞反應，以對抗腸病毒感染。
21. 如請求項20之用途，其中該T細胞反應是3C專一性的。
22. 一種產生腸病毒之類病毒顆粒之方法，包含於可表現該P1蛋白及3CD蛋白酶且可組裝該腸病毒之類病毒顆粒的環境中，培養哺乳動物細胞，該細胞係經如請求項1至9任一項中所定義之重組腺病毒載體所轉染；以及收集培養後之哺乳動物細胞，並從中分離出腸病毒之類病毒顆粒。