JP6419271B2 - ヒトエンテロウイルスに対する抗原及びワクチン - Google Patents
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Description
する予防・治療に効果のある抗原及びワクチンに関する。
コルナウイルス科の中でも、エンテロウイルス属のウイルスは、全てが密接な関係を持ち
、引き起こす一般疾患の数が特に多い。
呼吸器分泌物(例えば唾液、痰、鼻粘液など)や大便からよく見つけられる。エンテロウ
イルスは消化管を感染させるが、「エンテロウイルス(ENTERОVIRUS)」とい
う名称こそが「enteric(腸の)」を語源としている。歴史的に、エンテロウイル
ス、つまりポリオウイルスがもたらしてきた最も重大な疾患といえば、やはり急性灰白髄
炎である。ヒト疾患の原因となる非ポリオエンテロウイルスは62種が存在し、そのうち
23種はコクサッキーAウイルス、6種はコクサッキーBウイルス、28種はエコーウイ
ルス、5種はその他のエンテロウイルスである。ポリオウイルスは、コクサッキーウイル
スやエコーウイルスと同様に、糞口経路を介して拡散される。感染による症状の範囲は幅
広く、軽い呼吸器疾患(風邪)、手足口病、急性出血性結膜炎、無菌性髄膜炎、心筋炎、
重症新生児敗血症類似疾患(severe neonatal sepsis−like
disease)、急性弛緩性麻痺などが全て含まれる。
RNAを特徴とする、多種多様の小さなRNAウイルス群の属を代表する。全てのエンテ
ロウイルスは、約7500塩基で構成されるゲノムを含む上に、低い複製忠実度と頻繁な
組換えのため、突然変異率が非常に高いことで知られている。宿主細胞の感染後、ゲノム
はキャップ非依存的翻訳により単一ポリタンパク質に翻訳される。当該タンパク質は、ウ
イルスにコードされているプロテアーゼにより、構造殻タンパク質と非構造タンパク質と
に切断され、これらのタンパク質は主にウイルス複製に関与することになる。
抗体中和試験に基づき、66種のヒトエンテロウイルス血清型を区別している。更に、変
異株間の低減交差中和又は非相反交差中和(reduced or nonrecipr
ocal cross−neutralization)に基づいて、血清型のうちで追
加的に抗原変異体を追加的に定義した。エンテロウイルスは本来、人間及び動物における
病因を基準として、ポリオウイルス、コクサッキーAウイルス(CA)、コクサッキーB
ウイルス(CB)、エコーウイルスの4群に分類されていたが、異なる群に属しているウ
イルスの生物学的性状が著しく重なり合うことが気付かれるまであまり時間はかからなか
った。
・牛エンテロウイルス
・ヒトエンテロウイルスA
・ヒトエンテロウイルスB
・ヒトエンテロウイルスC
・ヒトエンテロウイルスD
・ヒトライノウイルスA
・ヒトライノウイルスB
・ヒトライノウイルスC
・豚エンテロウイルスB
・サルエンテロウイルスA
エンテロウイルス血清型のHEV71、EV−76、EV−89、EV−90、EV−
91、EV−92、並びにコクサッキーウイルスA16は、ヒトエンテロウイルスAで発
見された。
血清型コクサッキーウイルスB1(CV−B1)、CV−B2、CV−B3、CV−B
4、CV−B5(豚水疱病ウイルス[SVDV]を含む)、CV−B6、CV−A9、エ
コーウイルス1(E−1;E−8を含む)、E−2、E−3、E−4、E−5、E−6、
E−7、E−9(CV−A23を含む)、E−11、E−12、E−13、E−14、E
−15、E−16、E−17、E−18、E−19、E−20、E−21、E−24、E
−25、E−26、E−27、E−29、E−30、E−31、E−32、E−33、エ
ンテロウイルスB69(EV−B69)、EV−B73、EV−B74、EV−B75、
EV−B77、EV−B78、EV−B79、EV−B80、EV−B81、EV−B8
2、EV−B83、EV−B84、EV−B85、EV−B86、EV−B87、EV−
B88、EV−B93、EV−B97、EV−B98、EV−B100、EV−B101
、EV−B106、EV−B107、EV−B110(チンパンジー由来)、並びにサル
エンテロウイルスSA5は、ヒトエンテロウイルスBで発見された。
血清型EV−95、EV−96、EV−99、EV−102、EV−104、EV−1
05、EV−109は、ヒトエンテロウイルスCで発見された。
血清型EV−68、EV−70、EV−94は、ヒトエンテロウイルスDで発見された
。
ポリオウイルス血清型のPV−1、PV−2、PV−3はヒトエンテロウイルスCで発
見された。
原因となる疾患の中でも最も有名な疾患といえる。しかしながら、エンテロウイルス感染
の発現として最も一般的なものは、非特異的な発熱性疾患である。
30000〜50000人の髄膜炎患者が、エンテロウイルスを原因として発病している
。脳炎はエンテロウイルス感染の兆候としては珍しいケースであるが、一応発病すれば、
脳炎を最も頻発に引き起こすエンテロウイルスは、エコーウイルス9である。
時折は吐き気、頭痛、嘔吐を伴うこともなる。
心筋梗塞などの症状も報告されている。
のうち、最も一般的なものである。
は、慢性疲労症候群の要因となり得ると示唆している。
の構成員は、全て、一本鎖のプラス鎖RNAゲノムを有する。当該RNAゲノムは、ポリ
タンパク質P1をコード化する単一読取枠(open reading frame)を
有し、ポリタンパク質P1は、殻タンパク質のVP4、VP2、VP3、VP1、並びに
ポリタンパク質P1を個別の殻タンパク質VP1、VP3、VP0に開裂するウイルスプ
ロテアーゼ3C及び3CDを含む非構造タンパク質からなる。VP0は最終的にVP2及
びVP4に切断される。殻タンパク質は、ウイルス様粒子(VLP)に組織化することが
できる。
病(HFMD)の主な病原体としてよく知られているエンテロウイルス血清型である。H
EV71は、時折、様々な中枢神経系疾患に関わることもある。1969年、カリフォル
ニアで、神経系疾患の患者を対象とした研究においてHEV71の分離及び特徴付けは初
めて成功を収めた。現在まで、HEV71感染に対する宿主反応の分子機序に関して知ら
れている事実は極僅かに過ぎなかったが、ケモカインをコード化するmRNA、タンパク
質分解に関わるタンパク質、補体タンパク質、アポトーシス促進タンパク質の増加に関連
していると信じられてきた。
キーウイルスA10(CVA10)及びヒトエンテロウイルスA71(HEV71)など
のエンテロウイルスA群(ピコルナウイルス科)が原因となる、一般の自己限定性小児疾
病である。ウイルスは糞便中に排泄されるが、咽頭の分泌物からも検出できる。子供同士
の接触や環境汚染を介して伝染される場合が多い。当該疾病は、急性発熱が特徴とであり
、掌、足の裏、臀部、膝の発疹や、頬粘膜の小水疱などがそれに伴う。通常、症状は7〜
10日ほど経てば自然に解消する。HFMDを発症した小児の極一部だけが重病に発展す
る。
経系及び心血管系に関する重症疾患は、一般的に、HEV71感染のみで発症する。アジ
ア太平洋地域において最も致命的な神経学的症候群は脳幹脳炎であり、死亡率は40〜8
0%に達する。重症のHFMDを患っている子供は、回復にも数ヶ月は掛かり、運が悪け
れば永続的な神経障害を受ける可能性もある。現在、HFMDに対する特定の抗ウイルス
治療法や、ポリオを除く他のエンテロウイルス感染を防止するワクチンは存在しないのが
事実である。
功し、1974年に始めて報告された。それ以降、HEV71は世界中で検出され続けて
きたが、最近、HEV71の病原型が地域ごとに出現されるにつれ、アジアにおけるHF
MDの地域的流行の恐れが高まっている。死亡率の高いHFMDの大発生が始めて認識さ
れたのは1997年、マレーシアのサラワクからであった。当該発生に関わったウイルス
はHEV71だった。台湾は1998年の流行病発生において、129,106件のHF
MD発症、405種の重大疾患、そして78人の死亡者を出している。シンガポールは2
000年〜2001年の間、9000件の流行病が発症したことを報告した。死亡者は全
て7名。以降、シンガポールは2〜3年ごとに繰り返して流行病発症に悩まされている。
2008年の最初の8ヶ月間、シンガポールでが報告したHFMDの発症数は19,53
0件、死亡者は一人だった。それ以来、シンガポールは勿論、タイランド、マレーシア、
台湾、日本、韓国及びベトナムからもHEV71疾患の大発生が定期的に報告されている
。
年には、疾病の大発生が安徽省の阜陽市から始まり、中国全土に広がっていった。マスコ
ミ関係者たちはこの大発生を多角的に取材しながら、特に子女たちの健康に向ける親の心
配や、感染の鎖を断ち切るために保険所が断行した学校や託児所などの閉鎖による社会混
乱に重点を置いた。それ以降、中国は毎年大発生を記録している。
ら、人間においてのみ自然感染及び流行をもたらす伝染病だった。発展途上国では、未だ
に多くの人々が毎年ポリオに感染されている。従って、ポリオの根絶は、現在進行中の課
題であると言える。
て分類されていた。しかしながら現在、ポリオウイルス種は、エンテロウイルス属から排
除されている。ポリオウイルスは血清型、つまりヒトポリオウイルス1(PV−1)、ヒ
トポリオウイルス2(PV−2)、ヒトポリオウイルス3(PV−3)として分類され、
更に、ピコルナウイルス科エンテロウイルス属に属するヒトエンテロウイルスC種の亜型
として認識されている。エンテロウイルス属における基準種は、2008年、ポリオウイ
ルスからヒトエンテロウイルスCに変更された。
つ異なる殻タンパク質を有するという特徴を持つ。殻タンパク質は、細胞受容体特異性と
ウイルス抗原性を決定する。自然状態で最も遭遇し易い一般的な形態はPV−1であるが
、とにかく上記の3亜型は全て伝染率が非常に高く、脊髄に影響を及ぼして急性灰白髄炎
をもたらす原因となり得る。
接種には不活化全粒子ワクチン(inactivated whole virus v
accine)が用いられ、今でも有効である。Salkが開発した方法によって製造で
きる不活化急性灰白髄炎ワクチンは、良好な成果を出した上に、あらゆる面で改良されて
きた。通常、このようなワクチンは、不活化ポリオウイルスのMahoney株と、ME
F1株と、Saukett株の混合物を含有する。
にも関わらず、弱毒化ヒトエンテロウイルスCは、接種対象の体内で、若しくはウイルス
全体との接触により、病原性(麻痺系神経毒力)が逆戻りしてしまう危険性をはらんでい
る。従って、病原性を完全に取り除いた、完全かつ効率的なポリオワクチンの開発が求め
られる。
ペプチドの4種は、VP1、VP2、VP3、VP4として特定される。これらは、正二
十面体ウイルスの外殻の形成に関わる。通常的に、ヒトエンテロウイルスCの各ポリペプ
チドを用いるワクチン接種を行った所で分離ポリペプチドは人間及び動物の体内で中和抗
体を増やすことはできないと言われている(Meloen、et al.、J.Gen.
Virol.、45:761−763、1979)。
、つまりVP1、VP2、VP3、VP4は、人間及び動物の体内で中和抗体を増やす機
能を持たず、手足口病ウイルスの各ポリペプチドのうち、VP1のみがその機能を有する
と教示している。更に、米国特許第4508708号は、ヒトエンテロウイルスCII型M
EF1ウイルス粒子のVP1、VP2及びVP3ポリペプチドのうち、VP3のみが中和
抗体の誘導機能を持っており、その代わり、抗体力価は低いと明示している。しかしなが
ら、VP1、VP2及びVP3は、ピコルナウイルスの複製を選択的に抑制すると言われ
る広範囲の抗ウイルス物質に相当するアリルドンを用いて免疫化を執り行った場合にのみ
中和抗体を誘導できるということが明らかになった(Langford,et al.、
Antimicrobial Agents and Chemotherapy 28
:578−580、1985)。
効率的なワクチンを、抗ウイルス性化合物を使用せず製造する方法となる。防御免疫が必
要であるヒトエンテロウイルスとして、例えば、コクサッキーウイルスA16及びヒトエ
ンテロウイルス71を含むヒトエンテロウイルスA;コクサッキーウイルスB血清型、エ
コーウイルス、及びエンテロウイルス血清型を含むヒトエンテロウイルスB;ヒトポリオ
ウイルス1、ヒトポリオウイルス2、及びヒトポリオウイルス3を含むヒトエンテロウイ
ルスC;EV68を含むヒトエンテロウイルスDが挙げられる。
を含有し、患者又は動物に投与した場合、前記又ははそれに関する病原生物による感染に
対して能動免疫及び予防効果をもたらす(つまり防御免疫効果をもたらす)予防用物質又
は治療用物質と理解するものとする。
疫とは、少なくとも、ウイルスを中和させる中和抗体及び/又はT細胞免疫反応の誘導、
又は誘発を指す。
だに明確ではないことは既によく知られている。Ellis(Chapter29 of
ワクチン、Plotkin,et al.(eds)、WB Saunders、Ph
iladelphia、pp571、1998)は、「(ワクチン開発における)問題の
鍵は、自ら防御抗体の生成を誘導できるウイルス又は微生物病原体のタンパク質成分を特
定し、…従って病原体による攻撃から宿主を守ることである」と、前記の問題を例証して
いる。
d whole virus vaccine)により生成されるものと同様の防御抗体
を誘導し得る、ウイルスの外殻構造又はその構成要素を模倣する手段を試みた。こういう
手段は、病原性の逆戻りの可能性が最初から皆無であるため、死菌/不活化/弱毒化ワク
チンより安全である。
P2、VP3、VP4を含む同じゲノム構造を共有する。VP4及びVP2は、VP0、
並びに3C及び3D遺伝子におけるウイルスプロテアーゼと共に発現する。ウイルスプロ
テアーゼはP1遺伝子を切断し、それによってウイルスは、エンテロウイルスのウイルス
様粒子(VLP)、ウイルスカプソメア、錯体及び/又は抗原に組織化される。
礎として、エンテロウイルスの主要殻タンパク質であるVP1を含むサブユニットワクチ
ンを用いる方法が提案された(Wu、et al.、2001)こともあったが、中くら
いの成功を収めただけであった。
クチンの観点から接近する方法こそが最も想定し易い方法であった。しかしながら、ウイ
ルス力価があまりにも低いため、そのようなエンテロウイルスワクチンを製造することは
、冒険に近かったのは現状である。
し、神経毒力の一因となるウイルスRNAを持っていないワクチンに関する。本発明のワ
クチンは、抗原として、エンテロウイルスに対して中和抗体を誘導できる、ポリペプチド
P1又はVP0、或いは、VP1、VP2、VP3及び/又はVP4として指定されてい
る殻タンパク質(VP)、若しくは、これらの免疫的活性フラグメント又は生物活性フラ
グメントを含んでなる。
トエンテロウイルスペプチドであるVP2、VP3又はVP0、その免疫原性フラグメン
ト、及び/又はその抗原性決定基の形で発現される、ワクチンに関する。ピコルナウイル
スポリペプチドは、ヒトエンテロウイルスのアミノ酸配列又は核酸配列を用いたDNA組
換え技術、或いは化学合成により取得しても良い。
れた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む1種以上の免疫的活性抗原を含
むことを特徴とする、ワクチン。
することを特徴とする、ワクチン。
スB、ヒトエンテロウイルスC及びヒトエンテロウイルスDのうちから選ばれることを特
徴とする、ワクチン。
コクサッキーウイルスA16のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスBは、コクサ
ッキーウイルスBとエコーウイルスのうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスCは、
ヒトポリオウイルス1、ヒトポリオウイルス2、及びヒトポリオウイルス3のうちから選
ばれ、前記ヒトエンテロウイルスDは、EV68であることを特徴とする、ワクチン。
を特徴とする、ワクチン。
を特徴とする、ワクチン。
を特徴とする、ワクチン。
を特徴とする、ワクチン。
プチドを含むことを特徴とする、ワクチン。
ばれたヒトエンテロウイルスAであっても良いことを特徴とする、ワクチン。
エンテロウイルスCであっても良いことを特徴とする、ワクチン。
のうちから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記1種以上の
免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形態であるこ
とを特徴とする、ワクチン。
むことを特徴とする、ワクチン。
むことを特徴とする、ワクチン。
むことを特徴とする、ワクチン。
むことを特徴とする、ワクチン。
P1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた1
種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む1種以上の免疫的活性抗原を含むワク
チンの、前記被験者への投与の際にヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び/又
は中和免疫反応を誘導するほどの有効量を前記被験者に投与することを特徴とする、方法
。
を特徴とする、方法。
を特徴とする、方法。
を特徴とする、方法。
を特徴とする、方法。
のうちから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記1種以上の
免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形態であるこ
とを特徴とする、方法。
むことを特徴とする、方法。
むことを特徴とする、方法。
むことを特徴とする、方法。
むことを特徴とする、方法。
プチドを含むことを特徴とする、方法。
A16のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスAであっても良いことを特徴とする、方
法。
ちから選ばれたヒトエンテロウイルスCであっても良いことを特徴とする、方法。
プロモーターと、内部リボソーム導入部位(IRES)と、ヒトエンテロウイルス3CD
プロテアーゼをコード化する核酸とを含むことを特徴とする、発現カセット。
カセット。
P1ポリペプチドを処理することを特徴とする、発現カセット。
様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体を形成することを特徴とする、発現カセット
。
P3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれたポリペプチドの組み
合わせを含むことを特徴とする、発現カセット。
スCのうちから選ばれることを特徴とする、発現カセット。
うちから選ばれることを特徴とする、発現カセット。
リオウイルス2(PV−2)及びヒトポリオウイルス3(PV−3)のうちから選ばれる
ことを特徴とする、発現カセット。
を特徴とする、発現カセット。
われ、IRES活性が低減されていることを特徴とする、発現カセット。
クレオチド(A7)一つを加えることにより、遺伝子組換えを行われたことを特徴とする
、発現カセット。
する、発現カセット。
ット。
る、発現カセット。
IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操
作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
とを特徴とする、発現カセット。
1 IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と
操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
テロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード
化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
テロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード
化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
1 IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と
操作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操
作可能に結合していることを特徴とする、発現カセット。
きる期間の間、前記宿主細胞を培養し、前記宿主細胞及び/又は培養上清よりヒトエンテ
ロウイルスポリペプチドを回収することを特徴とする、ワクチンの製造方法。
ることを特徴とする、方法。
oplusia ni,drosophila、及びAedes albopictus
由来の蚊細胞のうちから選ばれることを特徴とする、方法。
ro、及びNIH3T3から選ばれることを特徴とする、方法。
び/又はワクチンとしてピコルナウイルス科のウイルスから得た、抗原のウイルス様粒子
(VLP)、ウイルスカプソメア、会合体、及び錯体を提供する。代表例は、エンテロウ
イルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルスなどを含む。
本発明の異なる様態は、中和抗体を誘導するウイルスのタンパク質、例えばP1タンパ
ク質、或いはピコルナウイルスのVP0タンパク質、VP1タンパク質、VP2タンパク
質、VP3タンパク質、及び/又はVP4タンパク質の組み合わせ、若しくはその免疫的
活性フラグメント又は生物活性フラグメントを提供する。本発明は、上述のウイルスタン
パク質及び/又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を含み、当該融合タンパク質は
、防御免疫性を持つ中和抗体の生成を誘導する、免疫的活性又は生物活性のものである。
タンパク質の組み合わせ、若しくはその免疫的活性フラグメントであっても良い。ウイル
スの外皮タンパク質/殻タンパク質は、VP0、VP1、VP2、VP3及び/又はVP
4タンパク質のうちいずれかの組み合わせであっても良く、ウイルス様粒子(VLP)、
カプソメア、錯体及び/又は会合体のうちいずれかの形を取っても良い。組み合わせは、
融合タンパク質の形になっても良い。
メア、錯体及び/又は会合体を生成する方法を含む。当該方法は、(i)ピコルナウイル
スのタンパク質、例えばP1タンパク質、或いはピコルナウイルスのVP0タンパク質、
VP1タンパク質、VP2タンパク質、VP3タンパク質、及び/又はVP4タンパク質
の組み合わせをそれぞれコード化する1種以上の核酸を含むプロモーターと操作可能に結
合している発現カセットを構築し、前記タンパク質は内部リボソーム導入部位(IRES
)と操作可能に結合しており、当該IRESは3C又は3CDプロテアーゼと操作可能に
結合しているステップと、(ii)当該発現カセットを以って適合な宿主細胞に対してトラ
ンスフェクション又は形質転換を行うステップと、(iii)カセットに含まれている核酸
の発現後、細胞によりウイルス様粒子(VLP)及び/又はカプソメア及び/又は抗原が
生成される条件下で当該宿主細胞を培養するステップとを含む。
V71、ヒトエンテロウイルスC(ヒトポリオウイルスPV1、PV2及び/又はPV3
)、EV68、若しくはその他のピコルナウイルスのタンパク質及びプロテアーゼをコー
ド化する読取枠を、コクサッキーウイルスA16、HEV71、ヒトエンテロウイルスC
、若しくはその他のピコルナウイルスの核酸配列を補完する適合設計プライマーを用いる
PCR増幅により増幅しても良い。適合なプライマーは、コクサッキーウイルスA16、
HEV71、ヒトエンテロウイルスC、若しくはその他のピコルナウイルスを含むエンテ
ロウイルスの入手可能な核酸配列から、従来の技術を用いて設計しても良い。全ゲノム塩
基配列は、GenBankで入手可能であり、更に、国立生物工学情報センター(NCB
I)で調べても良い。
スのP1タンパク質は、ポリペプチドとして発現する。続いて、当該ポリペプチドは3C
又は3CDプロテアーゼにより、ウイルスタンパク質のVP0、VP1、VP3、若しく
はその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントに切断される。エンテロウイル
スのタンパク質は、エンテロウイルスに対する中和抗体を誘導する。VP0タンパク質は
、やはりエンテロウイルスに対する中和抗体を誘導するVP2タンパク質とVP4タンパ
ク質、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントに更に切断されて
も良い。ウイルスタンパク質を、エンテロウイルスタンパク質のVLP、カプソメア及び
/又は会合体に自己組織化させても良い。更に、プロテアーゼ遺伝子は、VLP発現カセ
ットの同じDNA組換え分子、或いは異なるDNA組換え分子に含まれていても良く、及
び/又は、異なるプロモーターや翻訳要素から発現しても良い。
イルスの構造タンパク質又はプロテアーゼをコード化する読取枠をピコルナウイルスの核
酸配列を補完する適合設計プライマーを用いるPCR増幅により増幅しても良い。
構造タンパク質、若しくはその一部を有する融合タンパク質コード化しても良い。当該タ
ンパク質は、単一ポリペプチド抗原として発現される。
に対する遺伝子配列を提供するVLP発現カセットを包含する。当該遺伝子配列は、P1
タンパク質をウイルス外殻のタンパク質に切断するために必ず必要である。切断により、
エンテロウイルスVLPは自己組織化を執り行う。発現カセットは、エンテロウイルスの
P1タンパク質に対する核酸コード配列の上流に位置するプロモーターを用いる2シスト
ロン性ベクターである。P1タンパク質をコード化するシストロンの下流には、内部リボ
ソーム導入部位(IRES)配列が位置し、3CDプロテアーゼをコード化するヌクレオ
チド配列を含みシストロンがその後に続く。
て、3CDプロテアーゼ遺伝子は、IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳を施さ
れる。プロテアーゼ3CDの発現は、やや有毒であるため宿主細胞の早死の原因となり得
る。それによって、エンテロウイルスの殻タンパク質やVLPの収率が低減する。カセッ
トからのP1タンパク質の発現を高レベルで維持しながら、プロテアーゼの活性を低減し
ても良い。突然変異を含む様々なIRES及びIRES配列を発現カセットに挿入するこ
とで、細胞毒性を持つことなくP1を適切に切断できるよう、3CDプロテアーゼの発現
/活性を制御し、有効IRESを特定する。VLPの効率的生成のために、異なるウイル
ス種又は血清型からのIRESの制御の下で発現する完全P1コード配列と完全3CDプ
ロテアーゼコード配列を持つ組換えバキュロウイルスに対してテストを行った。
CV IRES、ヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操
作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
ウイルスC IRES、ヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核
酸と操作可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
IRES、ヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能
に結合しているプロモーターからなっても良い。
V IRES、ヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作
可能に結合しているプロモーターからなっても良い。
異により、VLPの最大収率を達成することができる。例えば、GenBankアクセス
番号DQ341362.1のアミノ酸1671番であるHEV71の3Cプロテアーゼの
グリシンは、変異HEV71 3Cの発現に対する部位特異的突然変異誘発法と、それに
続くHEV71のP1ポリペプチドの切断とによりアラニンに転換する。
する当該分野の一般的な知識とは逆に、実施形態において、本発明はタンパク質の活性を
低減して最大タンパク質収率を得ることに成功している。活性を低減させるIRES又は
3Cプロテアーゼ核酸の変異は、予想外に、エンテロウイルスの殻タンパク質とVLPの
収率を増加させる。
スによる感染を予防するワクチン用の抗原の発現・精製に関わる適合な宿主細胞にトラン
スフェクション/形質転換を行っても良い。
クションが可能であり、適合な増殖条件下で発現しても良いプラスミドからなっても良い
。適切な真核生物発現系は当業者に既に知られており、誘導性発現系と適合な真核宿主細
胞とを含んでなる。
過性のトランスフェクションができるものを含む。更に、哺乳動物細胞発現ベクターは、
トランスフェクション後の宿主細胞内で安定的に維持されるベクターであっても良い。
は一過性のトランスフェクションを行われたベクターを含んでも良い。ここにおいて、実
験対象のタンパク質の発現は、培地への誘導剤の添加するにより誘導することができる。
哺乳動物宿主細胞及び細胞株は、例えば、CHO、HEK 293、COS−1、HeL
a、Vero、NIH3T3細胞を含む。更に、当然ではあるが、他の真核宿主細胞は、
酵母細胞、又は他の哺乳動物細胞株を含んでも良い。
まれていても良い。当該目的に用いられ得る適合なウイルスには、バキュロウイルス、ワ
クシニアウイルス、シンドビスウイルス、SV40、センダイウイルス、レトロウイルス
やアデノウイルスが含まれる。適合な宿主細胞は、前記ウイルスと互換性のある宿主細胞
を含んでも良く、Spodoptera frugiperda細胞(例えばSf9細胞
)、Trichoplusia ni細胞、CHO細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、BHK
細胞、ヒトSW13細胞、ショウジョウバエ細胞、Aedes albopictus由
来の蚊細胞などの昆虫細胞がそれに当該する。
宿主細胞に取り組まれても良い。宿主細胞は、エンテロウイルス遺伝子及びタンパク質の
発現が許容される条件下で、増殖し培養される。
若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は
、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。
生成されたエンテロウイルスのVP2タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用い
られるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は
、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。
生成されたエンテロウイルスのVP4タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用い
られるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントをコード化する遺伝子は
、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。
生成されたエンテロウイルスのVP0タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用い
られるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
操作可能に結合し、プラスミドに挿入されても良い。当該プラスミドは、適合なプロモー
ターと結合しているエンテロウイルスプロテアーゼを示して二重組換えプラスミドを提供
する。当該二重組み替えプラスミドは、最終的に真核細胞発現系又は原核細胞発現系にお
いて発現されても良い。
適合なベクターには、コスミッドとプラスミドが含まれている。適合な発現系には、当業
者にも知られている原核生物発現系と、大腸菌を含み、原核細胞内のタンパク質の発現に
用いられるコスミッド又はプラスミドにより形質転換を行う原核宿主細胞とが含まれる。
細胞及び細胞株におけるタンパク質の発現に用いられるプラスミドにより形質変換を行う
真核宿主細胞とが含まれる。
細胞又は培養上清から得ても良い。
会合体は、トランスフェクション及び/又は形質転換を施された宿主細胞、或いは宿主細
胞の培地、上清及び溶解物から、当業者に知られている適切な精製手段により取得しても
良い。培地から遊離されたタンパク質の分離は、エンテロウイルスのVLP、カプソメア
、抗原及び/又は会合体を取得する簡便な方法である。エンテロウイルスのVLP、カプ
ソメア、抗原、その免疫的活性要素、及び/又はその会合体は、当業者に知られている手
段により、更に濃縮・精製を行われても良い。
抗原性補助剤(adjuvant)との組み合わせなど、ピコルナウイルス抗原を含有す
るワクチンを含む。ピコルナウイルスの抗原、その免疫的活性フラグメント、VLP及び
/又はカプソメアを、変異ワクシニアウイルス、免疫刺激複合体(ISCOM)、硫酸バ
ンド、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、不完全フロイントアジュバントや完全
フロイントアジュバント、Quil A、その他のサポニン、或いはVanselow(
1987)S.Vet.Bull.57 881−896の実施例に記載されているその
他の抗原性補助剤など、適切な抗原性補助剤と組み合わせて用いても良い。
語は、ワクチンの補助剤として相応しい水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムの形
状を全て含むものとする。
質配列に基づくポリペプチドの化学合成、若しくは化学合成により、製造しても良い。
供する。本明細書にて用いられる「ポリオウイルス抗原」又は「ヒトエンテロウイルスC
抗原」という表現は、ヒトエンテロウイルスCに対して中和抗体を刺激することができる
抗原全てを指す。ウイルス抗原は、外皮タンパク質/殻タンパク質、若しくはそのフラグ
メント、抗原性決定基、及び/又は他のヒトエンテロウイルスCのタンパク質からなって
も良い。
ク質を抗原として含む、ヒトエンテロウイルスCのサブユニットワクチンに関する。より
詳しくは、本発明は、ヒトエンテロウイルスCのVP2外皮タンパク質/殻タンパク質、
若しくはその免疫原性フラグメントを抗原として含むワクチンに関する。
又はVP4、若しくはVP0タンパク質を含む、ヒトエンテロウイルスCのウイルス様粒
子(VLP)、カプソメア、錯体及び/又は会合体を含むワクチンを含む。
又はプロテアーゼをコード化する読取枠を含む核酸を、ヒトエンテロウイルスCの核酸配
列を補完する適合設計プライマーを用いるPCR増幅により取得しても良い。適合なプラ
イマーは、ヒトエンテロウイルスCの入手可能な核酸配列、例えばその全ゲノム塩基配列
から、従来の技術を用いて設計しても良い。全ゲノム塩基配列は、GenBankで入手
可能であり、更に、国立生物工学情報センター(NCBI)で調べても良い。ヒトエンテ
ロウイルスCの全ゲノム、ポリオウイルスI型ゲノムに対するアクセス番号は、V011
49及びV01150である。
核酸からなっても良い。P1ポリペプチドは、発現カセットのIRESの制御の下で翻訳
された3CDプロテアーゼにより切断され、VP1、VP3及び/又はVP0ポリペプチ
ドを生成する。VP0、VP1、VP3の組み合わせはウイルス様粒子に自己組織化して
も良い。
るヒトエンテロウイルスCの外皮VP2タンパク質/殻VP2タンパク質と、他のポリオ
ウイルスのVP0、VP1、VP3及び/又はVP4外皮タンパク質/殻タンパク質との
組み合わせからなっても良い。ヒトエンテロウイルスCの外皮タンパク質/殻タンパク質
の組み合わせは、ウイルス様粒子(VLP)、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形を
していても良い。
は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い
。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離され
る。更に、ヒトポリオウイルスのVP2タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロ
モーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク
質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い
。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離され
る。更に、ヒトポリオウイルスのVP4タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロ
モーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク
質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い
。当該タンパク質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づき分離され
る。更に、ヒトポリオウイルスのVP0タンパク質をコード化する遺伝子は、適合なプロ
モーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞で発現されても良い。当該タンパク
質は、ワクチンとして用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用される。
プチド、及びその免疫的活性フラグメンのうち一つ以上を含む、1種以上の免疫的活性抗
原を含むワクチンを包含する。当該ワクチンはヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反
応及び/又は中和免疫反応を誘導する。
質をコード化する核酸、IRES、並びIRESの翻訳的制御下のエンテロウイルスの3
CDプロテアーゼにより構成される。当該プロテアーゼは、ヒトエンテロウイルスCのP
1ポリタンパク質を構造殻タンパク質に切断する。
び/又は生物活性フラグメント又は免疫的活性フラグメントを含むP1ポリタンパク質由
来のヒトエンテロウイルスA抗原を含むワクチンを提供する。ヒトエンテロウイルスA抗
原は、HEV71及び/又はコクサッキーウイルスA16から由来しても良い。HEV7
1抗原は、単独ヒトエンテロウイルスの外皮タンパク質/殻タンパク質であっても良い。
特に、HEV71抗原は、人間への投与により免疫反応を誘導する、HEV71のP1ポ
リタンパク質、VP4、VP2又はVP0ポリペプチド、若しくはそのフラグメントであ
っても良い。
ンパク質/殻タンパク質、若しくはその免疫的活性フラグメントの組み合わせであっても
良い。例えば、ヒトエンテロウイルスA抗原は、ポリオウイルスのVP2タンパク質と、
VP1、VP3及び/又はVP4ポリペプチドのうちから選ばれる、他のポリオウイルス
の外皮タンパク質/殻タンパク質との組み合わせからなっても良い。VP2ポリペプチド
と、他のポリオウイルスの外皮タンパク質/殻タンパク質との組み合わせは、ウイルス様
粒子(VLP)、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形をしていても良い。更に、当該
組み合わせは、融合タンパク質の形であっても良い。
ク質、若しくはその免疫原性フラグメントを抗原として含むワクチンに関する。
又はVP4、若しくはVP0タンパク質を含む、ヒトエンテロウイルスAのウイルス様粒
子(VLP)及び/又はカプソメアを含むワクチンを含む。
及び/又はプロテアーゼをコード化する読取枠を、ヒトエンテロウイルスAの核酸配列を
補完する適合設計プライマーを用いるPCR増幅により増幅しても良い。適合なプライマ
ーは、HEV71の入手可能な核酸配列から、従来の技術を用いて設計しても良い。HE
V71の全ゲノム塩基配列に対するアクセス番号は、DQ341362、AB20485
2、AF302996、及びAY465356である。
VP2、VP3及び/又はVP4、若しくはVP0タンパク質、並びにその免疫的活性フ
ラグメント、及びプロテアーゼをコード化する読取枠を、ヒトエンテロウイルスAの核酸
配列を補完する適合設計プライマーを用いるPCR増幅により増幅しても良い。
タンパク質又はポリペプチドを形成し、続いてポリタンパク質又はポリペプチドは、3C
又は3CDプロテアーゼによりVP0、VP1、及びVP3タンパク質に切断される。V
P0タンパク質は、更にVP2及びVP4タンパク質に切断されても良い。エンテロウイ
ルスのタンパク質を、エンテロウイルスのタンパク質のVLP、カプソメア、錯体及び/
又は会合体に自己組織化させても良い。更に、非構造遺伝子及びプロテアーゼ遺伝子は、
同じDNA組換え分子、或いは異なるDNA組換え分子に含まれていても良く、及び/又
は、異なるプロモーターや翻訳要素から発現しても良い。
核酸からなっても良い。P1ポリペプチドは発現カセットのIRESの制御の下で翻訳さ
れた3CDプロテアーゼにより切断され、VP1、VP3及び/又はVP0ポリペプチド
、並びにその免疫的活性フラグメントを生成する。VP0、VP1、VP3ポリペプチド
の組み合わせはウイルス様粒子に自己組織化しても良い。
コード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞
で発現されても良い。HEV71のVP2タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に
用いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用されても良い。
コード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞
で発現されても良い。分離されたVP4タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用
いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用されても良い。
コード化する遺伝子は、適合なプロモーターを含有するプラスミドに挿入され、宿主細胞
で発現されても良い。分離されたVP0タンパク質は、ワクチンの用途又は診断用途に用
いられるため、免疫原性組成物に基づいて分離/利用されても良い。
コード化する遺伝子は、適合なプロモーターと操作可能に結合し、プラスミドに挿入され
ても良い。当該プラスミドは、適合なプロモーターと結合しているヒトエンテロウイルス
Aのプロテアーゼを示して二重組換えプラスミドを提供する。当該二重組み替えプラスミ
ドは、最終的に真核細胞発現系又は原核細胞発現系において発現されても良い。
られている手段により適合な宿主細胞に取り組まれても良い。宿主細胞は、ヒトエンテロ
ウイルスA遺伝子及びタンパク質の発現が許容される条件下で、増殖し培養される。
プチド、及びその免疫的活性フラグメンのうち一つ以上を含む、1種以上の免疫的活性抗
原を含むワクチンを包含する。当該ワクチンはヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反
応及び/又は中和免疫反応を誘導する。
ク質をコード化する核酸、IRES、並びIRESの翻訳的制御下のエンテロウイルスの
3CDプロテアーゼにより構成される。当該プロテアーゼは、エンテロウイルスのP1ポ
リタンパク質をエンテロウイルスの構造殻タンパク質に切断する。当該構造タンパク質は
、VLP、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形をしていても良い。
抗体を誘導する抗原を提供する。当該抗体は機能性であり、HEV71、コクサッキーウ
イルスA16、ヒトエンテロウイルスC、若しくはその他のピコルナウイルスから選ばれ
たエンテロウイルスを高力価に中和することができる。
ドが抗血清の中和により認識されるエピトープを含んでいることを示唆する。
、VP2及びVP0ポリペプチドとより強く結合する。VP1ポリペプチドは当該分野に
おいて、中和抗体の生成に主に用いられる殻タンパク質として知られているため、VP2
ポリペプチドがHEV71感染に対する中和抗体の生成に重要な役割を果たすという事実
は、確実に予想外であった。
がエンテロウイルス感染に対する中和抗体の生成において、優性エピトープ若しくは抗原
性決定基の役割を果たしている。HEV71のVP2ポリペプチドは、単独で、若しくは
他のHEV71の殻タンパク質、例えばVP0ポリペプチドとの組み合わせで、HEV7
1に対する中和抗体を誘導する優性抗原として機能する。
エンテロウイルスのVP0及び/又はVP2構造タンパク質を免疫原性組成物に取り組ん
だワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物又はワクチンは、HEV71及び
コクサッキーウイルスA16含むヒトエンテロウイルスAから由来するVP0又はVP2
構造タンパク質、若しくはその組み合わせからなっても良い。免疫原性組成物は、接種対
象に投与され、ヒトエンテロウイルスに対する中和抗体を誘導する。免疫原性組成物は、
HEV71及び/又はコクサッキーウイルスA16などのヒトエンテロウイルスAが原因
となる手足口病を予防するために接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
イルスA16感染による合併症、例えば髄膜炎、脳炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫及び心不
全などの症候群として表われる神経系又は心血管系の合併症の予防及び/又は緩和を目的
として提供される。
エンテロウイルスCのVP0又はVP2構造タンパク質、例えばPV1、PV2、PV3
構造タンパク質、若しくはその組み合わせ、或いはその生物活性フラグメント又は免疫的
活性フラグメントを取り組んだワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物は、
PV1、PV2、PV3を含むヒトエンテロウイルスCが原因となるポリオを予防するた
めに接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
スAの両方から由来した抗原の組み合わせからなっても良い。
施形態において、エンテロウイルスのVLP、カプソメア、抗原及び会合体、並びにDN
A組換え分子の特定構築体を例示として挙げることにする。
ことができる。VP2ポリペプチドは、ヒトエンテロウイルスAのHEV71及びコクサ
ッキーウイルスA16;ヒトエンテロウイルスCの1型、2型、3型;ヒトエンテロウイ
ルスDのEV68などのピコルナウイルスによる感染に対するワクチンの考案に十分であ
るとも言える。
ルスの少なくともVP0及び/又はVP2、並びにVP4構造タンパク質を免疫原性組成
物に取り組んだワクチンを用いることが期待される。免疫原性組成物は接種対象に投与さ
れ、ピコルナウイルスに対する中和抗体を誘導する。免疫原性組成物は、ピコルナウイル
ス感染の予防を目的として接種対象に投与するワクチンに含まれていても良い。
、脳炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫及び心不全などの症候群として表われる神経系又は心血
管系の合併症の予防及び/又は緩和を目的として提供される。
組成物が提供される。
及び/又はVP4抗原を含む2価ワクチン又は多価ワクチンを提供する。例えば、ヒトエ
ンテロウイルスAのVP0及び/又はVP2及び/又はVP4抗原を結合しても良い。更
に、ヒトエンテロウイルスAの異なる血清型から得た上述の抗原、つまりコクサッキーウ
イルスA16及びHEV71由来の抗原を、例えばヒト手足口病に対するワクチンに組み
合わせることも可能である。
カセットから生成することができる。エンテロウイルス抗原は、ウイルス様粒子、カプソ
メア、錯体及び/又は会合体の形をしていても良い。
は多価ワクチンを提供する。当該抗原は、ジフテリア(D)、破傷風(T)、百日咳(P
)、b型インフルエンザ菌(Hib)、A型肝炎(HA)、B型肝炎(HB)、及びヒト
エンテロウイルス71型などの病原体のうち、一つ以上の病原体に対して免疫力を提供す
る。
型髄膜炎、中耳炎に効果的であると知られている抗原が含まれていても良い。
れる有害な副作用を伴うことなく、防御免疫反応を誘発できるほどの量として選ぶものと
する。前記量は、免疫原として採用されたものによって変わることになる。特定のワクチ
ンにおける最適量は、接種対象における抗体力価及び他の反応に対する観察を含む、一連
の一般研究により確定することができる。最初のワクチン接種では、防御免疫反応を提供
するため、最適の間隔を置いて、2〜3回にかけてワクチンを投与しても良い。
該方法は、上述した本発明の様態のうち一つによるワクチンの免疫学的有効量を以って、
それを必要とする被験者に治療を施すことを含む。
のアミノ酸配列を持つBリンパ球様細胞が生成する免疫グロブリン分子を指す。当該分子
は、抗原との具体的な反応をその特徴とする。
刺激に応じて血液及び/又はリンプ液に分泌される種類の免疫反応を指す。正常に機能す
る免疫反応において、抗体は細胞(例えば病原体)の表面上で特に抗原と結合し、食細胞
及び/又は補体媒介メカニズムにより破壊すべきものとして当該細胞マーキングする。
感作被験対象の抗体及び/又は免疫細胞と明白に反応する物質を指す。
は、免疫グロブリン又はT細胞受容体により認識される抗原の特定部位に相当する。
つ以上の遺伝子配列を組み合わせて作り上げたポリペプチドの発現により形成されたタン
パク質抗原を指す。
対する中和抗体を誘導するエンテロウイルスの構造タンパク質のフラグメントを指す。よ
って、本発明の文脈においては、免疫的活性フラグメントは特定の免疫反応を及ぼすため
に、より好ましくは誘導するために有機体の免疫系に現れ、エンテロウイルスによる感染
に対して有機体を予防的に保護するものとする。
が現れたことを認識し、特定の免疫反応を開始することを指す。
。本明細書にて用いられる「防御免疫反応」及び/又は「中和免疫反応」という用語は、
ワクチン接種被験者が、ワクチン接種を行った原因となった病原因子による感染に対して
抵抗、若しくは自らを保護する手段を指す。
排除できる特定のヘルパーT細胞とキラーT細胞を媒介として行われる種類の免疫反応を
指す。
事象の補助細胞を指す。抗原提示細胞(APC)と抗原の相互作用は、リンパ球が抗原分
子と遭遇しそれを認識して活性化させるようにするという点で、免疫誘導において非常に
重要な段階である。APCとしては、大食細胞、ランゲルハンス−樹状細胞、ろ胞樹状細
胞、B細胞などが挙げられる。
種類を指す。
染された宿主細胞を破壊することができる特殊なリンパ球を指す。
表現は、必須成分に加え他の成分も組成物内に存在し得るが、例え他の成分が存在してい
ても、組成物の本質的、基本的及び/又は新規特性は、その存在に対して影響を受けない
という意味である。
分同士が、お互い意図通りに機能できる関係を結んでいるという意味である。例えば、シ
ストロンの、若しくは一つ以上のシストロンの核酸と「操作可能に結合」しているプロモ
ーターは、単一のシストロン性伝令RNA、単一の2シストロン性伝令RNA、若しくは
単一の多シストロン性伝令RNA(mRNA)を生成できる方式で組み合わせていること
になる。伝令RNAのタンパク質発現は核酸配列の転写要素/翻訳要素により調整されて
も良い。IRES配列がシストロンより上流(5‘)側の方向で発現カセットに挿入され
たということは、つまり、シストロン性mRNAの翻訳がIRESの制御の下で調整され
るように、シストロンの核酸とIRES配列が結合するということである。
施形態において、ピコルナウイルスのVLP、カプソメア、抗原及び会合体、並びにDN
A組換え分子の特定構築体を例示として挙げることにする。
発現カセットは、当該分野で周知に手段により構築されても良い。
1.1.HEV71のVLP発現カセット[P1+IRES+3CD]
特徴:
カセットサイズ:5172bp
prPs:ポックスウイルスの強力初期/後期 合成プロモーター、43bp
P1:EV71−SB12736−SAR−03からのP1タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)終止コドンを添加
2588bp
IRES:内部リボソーム導入部位、585bp
3CD:EV71−SB12736−SAR−03からの、C及びDのP3タンパク質
のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)ATGを添加
開始コドン及び終止コドン、1940bp
PacI:レアカッター、カセットをpSNX01にクローニング
(MVA del 3組み込み型ベクター)
カセットはpDONR221ゲートウェイエントリーベクター(インビトロジェン)に
クローニングされ、pSN01を生成した。
発現カセットとpSN01プラスミドに関する概略図は、図1を参照すること。
1.2.HEV71のVLP発現カセット[P1+IRES+3C]
特徴:
カセットサイズ:3773bp
prPs:ポックスウイルスの強力初期/後期 合成プロモーター、43bp
P1:EV71−SB12736−SAR−03からのP1タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)終止コドンを添加
2588bp
IRES:内部リボソーム導入部位、585bp
3CD:EV71−SB12736−SAR−03からの、CのP3タンパク質のコー
ド配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)ATGを添加
開始コドン及び終止コドン、551bp
PacI:レアカッター、カセットをpSNX01にクローニング
(MVA del 3組み込み型ベクター)
カセットはpDONR221ゲートウェイエントリーベクター(インビトロジェン)に
クローニングされ、pSN03を生成した。
発現カセットとpSN03プラスミドに関する概略図は、図2を参照すること。
1.3.挿入HEV71[P1+IRES+3CD]又は[P1+IRES+3C]を
含む組換えバキュロウイルスの取得方法
HEV71のP1+3CDの原物質はpSN01であり、P1+3CはpSN03であ
る。目標は、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商標)マニュアル(2009
)の指示に従って、HEV71−VLPカセットを、LR CLONASE(登録商標)
を用いたattL/aaRインビトロ組換えにより、pSN01及びpSN03(エント
リーベクター)からバキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーション
ベクター)に組み込むことである。
これによって、二つのリコンビナーゼ反応を構成した。
pSN01(EV71−P1+3CD)×pDEST8:pSN07を生成
pSN03(EV71−P1+3C)×pDEST8:pSN08を生成
pSN07及びpSN08を用いて、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商
標)マニュアルに記載されているように、DH10Bacの形質転換により、組換えバク
ミドのbacSN07及びbacSN08を生成した。組換えバクミドにSf9細胞への
トランスフェクションを行うことで、組換えバキュロウイルスのSN07及びSN08を
レスキューする。組換えバキュロウイルスのSN07及びSN08を、6個のウェルプレ
ートに入っている感染Sf9細胞に用いて、切断した殻タンパク質の発現を評価した。V
P1に対して特異的である多クローン性ウサギ抗血清を用いて、組換えバキュロウイルス
に感染したSf9細胞から得た溶解物及び上清のウェスタンブロットでVP1タンパク質
を特定した。
1.4.SN07に感染したSf9細胞の上清におけるVP1の発現
感染Sf9細胞の上清は、感染後3日目から7日目にかけて毎日採取したものである。
タンパク質を12%SDS−PAGEで分解し、ニトロセルロース膜に移動させた後、多
クローン性ウサギ抗VP1抗血清(1:4000希釈率)で一晩中検査し、続いてHRP
共役抗ウサギ抗体(1:1000希釈率)を以って室温で1時間検査した。続いてTMB
を用いてウェスタンブロット法を行った。結果は図3を参照すること。HEV71のVP
1が切断されたことが分かり、感染後3日目と4日目の上清からタンパク質の発現が観測
され、その後、VP1の発現量は減衰していった。Sf9細胞を感染させることにより、
組換えバキュロウイルスのSN07は、上清で見付けられる抗原を生成する。
SN07、SN08、対照群のバキュロウイルスbacGUS、模倣感染(mock
infected)を含む組換えバキュロウイルス分離株により、Sf9細胞を感染効率
(MOI)10で感染させた。感染後3日目と4日目に上清及び溶解物を採取し、ウサギ
抗VP1抗血清(1:4000希釈率)を用いてウェスタンブロット法によりタンパク質
の発現を評価し、SN07及びSN08により生成されたタンパク質の収率を比較した。
図4に示されているように、感染後3日目と4日目の両日において、上清及び溶解物の両
方で、発現構築体SN07は、発現構築体SN08より多くの切断VP1を生成した。
の濃縮液に存在する。
感染後3日目にSN07に感染したSf9細胞からの上清を浄化し、100kDaのM
WCOと共にAMICON(登録商標)フィルタ(Millipore社)を通過させた
。濃縮液をテストし、切断したVP1及びVP0の存在を確認した。VP1の分子量は略
33kDa、VP0の分子量は略36kDaであるため、これらのタンパク質は、オリゴ
マー型でしか濃縮液に残存していられないと思われた。図5に示されているように、これ
らの抗原は、100kDaのMWCO限外ろ過装置にかけられた上清の濃縮液に残存して
いた。これは、当該抗原がオリゴマー型と関連していることを示唆している。よって、V
P1及びVP0は切断されており、他の殻タンパク質とオリゴマー関係(oligome
ric association)にあると結論を出すことができる。
導する。
実施例3で製造したSN07に感染したSf9からの上清濃縮物を非近交系の白いマウ
ス2群に接種した。使用した免疫化スケジュールは、図6に図示されている。
論に達しても良いと思われる。
ルス感染の予防のために投与するワクチンに含まれても良い。
Sf9細胞をSN07により感染させ、72時間目、96時間目、120時間目に溶解
物を採取した。免疫ブロット法でEV71のVP0に対する多クローン性ウサギ抗血清を
調べた。その結果、VP0は感染後72時間目に発現したことが分かった。図7に示され
ているように、VP0の一部は、感染後96時間目から切断されVP2となった。従って
、SN07感染細胞の溶解物にはVP0とVP2の両方が存在する。
たマウスから摘出したプール中和血清。ELISA法において組換えVP2に対し高い力
価を示した。
ELISAプレートを同量の組換えVP1及びVP2で被覆し、プール中和マウス抗血
清のテストに用いた。図8は、上清濃縮液から製造した抗原を接種されたマウスは、VP
1に比べVP2により良く結合することを図示している。従って、当該抗体が機能的であ
り、高い力価でHEV71を中和すると結論を出すことができる。
たマウスから摘出したプール中和血清。VP1に比べ、VP2及びVP0とより強く結合
する。
図9のウェスタンブロットは、プール中和マウス抗血清は、各ウェルに同じ総量のタン
パク質を添加した場合であっても、VP1に比べVP2及びVP0とより強く結合すると
いうことを図示している。これに基づいて、VP2及びVP0は、中和抗血清により認識
できるエピトープを含むと推定することができる。
びVP0こそが中和抗体の生成に必須である主要殻タンパク質であると見なされる。実際
、VP2は中和抗体の生成に重要な役割を果たしていると思われる。
P2は、HEV71、そしてコクサッキーウイルスA16、エコーウイルス30、並びに
ポリオウイルス1型、2型及び3型などを含むエンテロウイルスA、B、Cのうち何れか
の種に対するワクチンの製造するのに十分である可能性が高い。
ステップを含む、ポリオウイルスに対する直接的免疫反応を生成する方法を含む。
HEV71のVP1を含む免疫原性組成物は、マウスの免疫化に用いられる。同じく、
HEV71のVP2及び/又はVP0を含む免疫原性組成物も、マウスの免疫化に用いら
れる。HEV71のVP2び/又はVP0により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベル
を、HEV71のVP1により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルと比較する。HE
V71のVP2び/又はVP0により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルは、HEV
71のVP1により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルより著しく高い。
テアーゼ3CDの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築
本実施例は、プロテアーゼ3CDが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減さ
せることでヒトエンテロウイルスC(ポリオウイルス)のVLPを効率的に生成する方法
を提供する。
えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図1に図示されている。3CDプロテア
ーゼ遺伝子は、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳され
る。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用することができる。つまり、突然
変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する
最弱のIRESを探し出す。
に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。P1をコード化するシストロンの下流
には、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム導入部位(IRES)配列(Ge
nBankアクセス番号:AF113968.2;ヌクレオチド1666〜2251)が
あり、プロテアーゼ3CDをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に
続く。ヒトエンテロウイルスCのP1及び3CDの原物質は、アメリカ合衆国培養細胞系
統保存機関(ATCC)から入手してもよく、周知のヒトエンテロウイルスC配列(国立
生物工学情報センター(NCBI)を介してGenBankから入手可能)から合成して
も良い。
を用いて生成する(インビトロジェン)。簡単に言えば、LR CLONASE(登録商
標)を用いて、attL/aaRインビトロ組換えにより、ヒトエンテロウイルスCのV
LPカセットをバキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーションベク
ター)に取り組ませる。LR CLONASE(登録商標)反応を25℃で1時間行い、
続いて、プロテイナーゼKによる培養(incubation)を実施する。LR CL
ONASE(登録商標)反応混合物に、Library Efficiency DH5
αコンピテントセル(形質転換受容性細胞)への形質転換を施し、発現クローンを取得す
る。結果として得たコロニーからDNAを分離し、制限酵素分析によりヒトエンテロウイ
ルスCカセットの存在を確認する。発現カセットをT7転位リコンビナーゼによりDH1
0Bac細胞内のバキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築する。50
μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサ
イクリン、100μg/mlのX−gal、40μg/mlのIPTGを補充したLB寒
天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。PureLink
HiPureプラスミドDNAミニプレップキット(インビトロジェン)を用いて、D
H10Bac大腸菌より高品質のバクミドDNAを精製する。挿入物からのM13順方向
プライマー、M13逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、ヒトエンテロウイル
スCカセットの存在を確認する。EFFECTENE(登録商標)トランスフェクション
試薬(Qiagen)を用いて、DNAをSf9昆虫細胞にトランスフェクションするこ
とにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、T25フラスコ当た
り2百万のSf9細胞が播種され、28℃での6時間の培養により接着される。組換えバ
クミドDNA1マイクログラムをDNA濃縮緩衝液150μlに再懸濁させ、エンハンサ
ー溶液8μlを混合し室温で5分間培養する。続いて、EFFECTENE(登録商標)
試薬25μlをDNA混合物に添加し、室温で10分間培養する。培地1mlをトランス
フェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布され
るようにする。3日目、遠心分離により5分間500gの上清を採取する。続いてトラン
スフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを
一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。
ることによる、HEV71、並びにヒトエンテロウイルスCのVLPの生成。
本実験は、単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に
対する組換えバキュロウイルスベクターの構築に関するものである。プロテアーゼ遺伝子
3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。
図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用することがで
きる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量のプロ
テアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。P1をコード化するシストロンの下流
には、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム導入部位(IRES)配列があり
、プロテアーゼ3CDをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く
。図1を参照すること。実施例1に用いられたIRESは、天然のEMCV IRES配
列を含み、変異型も存在する。図10における天然EMCV IRES配列は、JKセグ
メントにA6分岐ループを示す。1つのヌクレオチド、例えばアデニン(A7)を加える
ことで、発現を低減することができる。更に、実施例1に用いられた構築体において、3
CDプロテアーゼはアミノ末端で脳心筋炎ウイルスのIRESと融合する。EMCVの開
始コドンと3CDプロテアーゼのコード配列のアウトフレーム(OUT FRAMING
)は下流遺伝子の発現をかなり低減しなければならない。図11を参照すること。両方の
組換えをpSN01aのEMCVIRES配列に組み込み、図12に示されているように
pSN01−M1と名付ける。続いて、DNA2.0を以って合成を行う。
ように実験を設計した。組換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いBAC−TO−
BAC(登録商標)系を用いて生成する(インビトロジェン)。簡単に言えば、LR C
LONASE(登録商標)を用いて、attL/aaRインビトロ組換えにより、HEV
71のVLPカセットをバキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーシ
ョンベクター)に取り組ませる。LR CLONASE(登録商標)反応を25℃で1時
間行い、続いて、プロテイナーゼKによる培養を実施する。LR CLONASE(登録
商標)反応混合物に、Library Efficiency DH5αコンピテントセ
ルへの形質転換を施し、発現クローンを取得する。結果として得たコロニーからDNAを
分離し、制限酵素分析によりHEV71/ポリオウイルスカセットの存在を確認する。p
SN07−M1の発現カセットをT7転位リコンビナーゼによりDH10Bac細胞内の
バキュロウイルスゲノムに取り組み、組換えバクミドを構築し、bacSN07−M1を
得る。50μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/ml
のテトラサイクリン、100μg/mlのX−gal、40μg/mlのIPTGを補充
したLB寒天培地上の白色表現型により組換えバクミドを立証することができる。Pur
eLink HiPureプラスミドDNAミニプレップキット(インビトロジェン)を
用いて、DH10Bac大腸菌より高品質のバクミドDNAを精製する。挿入物からのM
13順方向プライマー、M13逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、HEV7
1/ポリオウイルスカセットの存在を確認する。EFFECTENE(登録商標)トラン
スフェクション試薬(Qiagen)を用いて、DNAをSf9昆虫細胞にトランスフェ
クションすることにより組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、T2
5フラスコ当たり2百万のSf9細胞が播種され、28℃での6時間の培養により接着さ
れる。組換えバクミドDNA1マイクログラムをDNA濃縮緩衝液150μlに再懸濁さ
せ、エンハンサー溶液8μlを混合し室温で5分間培養する。続いて、EFFECTEN
E(登録商標)試薬25μlをDNA混合物に添加し、室温で10分間培養する。培地1
mlをトランスフェクション錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して
均一に分布されるようにする。3日目、遠心分離により5分間500gの上清を採取する
。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイ
ルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いること
ができる。問題のタンパク質を分析するために、10%グレース昆虫細胞用培地(インビ
トロジェン)で増殖したSf9細胞を1%FBS Sf900−II SFM培地(イン
ビトロジェン)に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に1ml当たり百万の密度で
播種した後、28℃で4時間培養した。ウイルスストックを10MOIでPBS洗浄細胞
に添加し、1時間なだらかに揺らす。感染細胞をPBSで3回洗浄し、細胞はSf900
II−SFMにて異なる時点で増殖した。フラスコを室温で30分間揺らして細胞を低張
ダウンス緩衝液(hypotonic douncing buffer)1%TRIT
ON(登録商標)X−100(TX−100)(1.5mMのMgCl2、50mMのK
Cl、20mMのHEPES、1%TX−100)に溶解させ、フラスコから回収した溶
解細胞を4℃の温度にて7000rmpで遠心分離に30分間かけ、細胞溶解物を取得す
る。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法とELISA法によ
り分析する。
ることによる、HEV71、並びにヒトエンテロウイルスC(ポリオウイルス)のVLP
の効率的生成。
単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に対する組換
えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図1に図示されている。プロテアーゼ遺
伝子3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳され
る。図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用すること
ができる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量の
プロテアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。P1をコード化するシストロンの下流
には、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム導入部位(IRES)配列があり
、プロテアーゼ3CDをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く
。図1を参照すること。実施例1に用いられたIRESは、天然のEMCV IRES配
列を含み、変異型も存在する。天然EMCV IRES配列は、JKセグメントにA6分
岐ループを示しており、1つのヌクレオチド(A7)を加えることで、発現を低減するこ
とができる。図10を参照すること。A6分岐ループはEMCV IRES配列のpSN
01にてA7に変異され、pSN01−M2と名付けられる。図13を参照すること。続
いて、DNA2.0を以って合成を行う。
換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いBAC−TO−BAC(登録商標)系を用
いて生成する(インビトロジェン)。簡単に言えば、LR CLONASE(登録商標)
を用いて、attL/aaRインビトロ組換えにより、HEV71のVLPカセットをバ
キュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーションベクター)に取り組ま
せる。LR CLONASE(登録商標)反応を25℃で1時間行い、続いて、プロテイ
ナーゼKによる培養を実施する。LR CLONASE(登録商標)反応混合物に、Li
brary Efficiency DH5αコンピテントセルへの形質転換を施し、発
現クローンを取得する。結果として得たコロニーからDNAを分離し、制限酵素分析によ
りHEV71/ポリオウイルスカセットの存在を確認する。pSN07−M2の発現カセ
ットをT7転位リコンビナーゼによりDH10Bac細胞内のバキュロウイルスゲノムに
取り組み、組換えバクミドを構築して、bacSN07−M2を得る。50μg/mlの
カナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、1
00μg/mlのX−gal、40μg/mlのIPTGを補充したLB寒天培地上の白
色表現型により組換えバクミドを立証することができる。PureLink HiPur
eプラスミドDNAミニプレップキット(インビトロジェン)を用いて、DH10Bac
大腸菌より高品質のバクミドDNAを精製する。挿入物からのM13順方向プライマー、
M13逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、HEV71/ポリオウイルスカセ
ットの存在を確認する。EFFECTENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Q
iagen)を用いて、DNAをSf9昆虫細胞にトランスフェクションすることにより
組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、T25フラスコ当たり2百万
のSf9細胞が播種され、28℃での6時間の培養により接着される。組換えバクミドD
NA1マイクログラムをDNA濃縮緩衝液150μlに再懸濁させ、エンハンサー溶液8
μlを混合し室温で5分間培養する。続いて、EFFECTENE(登録商標)試薬25
μlをDNA混合物に添加し、室温で10分間培養する。培地1mlをトランスフェクシ
ョン錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるように
する。3日目、遠心分離により5分間500gの上清を採取する。続いてトランスフェク
ションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れ
ば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。問題のタンパ
ク質を分析するために、10%グレース昆虫細胞用培地(インビトロジェン)で増殖した
Sf9細胞を1%FBS Sf900−II SFM培地(インビトロジェン)に再懸濁
させて単細胞を取得し、フラスコ内に1ml当たり百万の密度で播種した後、28℃で4
時間培養した。ウイルスストックを10MOIでPBS洗浄細胞に添加し、1時間なだら
かに揺らす。感染細胞をPBSで3回洗浄し、細胞はSf900II−SFMにて異なる
時点で増殖した。フラスコを室温で30分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液1%TR
ITON(登録商標)X−100(TX−100)(1.5mMのMgCl2、50mM
のKCl、20mMのHEPES、1%TX−100)に溶解させ、フラスコから回収し
た溶解細胞を4℃の温度にて7000rmpで遠心分離に30分間かけ、細胞溶解物を取
得する。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法とELISA法
により分析する。
ることによる、HEV71、並びにヒトエンテロウイルスC(ポリオウイルス)のVLP
の効率的生成。
単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に対する組換
えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図1に図示されている。プロテアーゼ遺
伝子3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳され
る。図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用すること
ができる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量の
プロテアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
に位置するポリヘドリンプロモーターを含有する。P1をコード化するシストロンの下流
には、脳心筋炎ウイルス(EMCV)の内部リボソーム導入部位(IRES)配列があり
、プロテアーゼ3CDをコード化するヌクレオチド配列を含むシストロンがその後に続く
。図1を参照すること。実施例1に用いられたIRESは、天然のEMCV IRES配
列を含み、変異型も存在する。pSN01において、3CDプロテアーゼはアミノ末端で
脳心筋炎ウイルスのポリタンパク質と融合する。EMCVの開始コドンと3CDプロテア
ーゼのコード配列のアウトフレームは下流遺伝子の発現をかなり低減しなければならない
。図11を参照すること。組換えをpSN01のEMCV IRES配列に組み込み、p
SN01−M3と名付ける。図14を参照すること。続いて、DNA2.0を以って合成
を行う。
換えバキュロウイルスは、製造者の指示に従いBAC−TO−BAC(登録商標)系を用
いて生成する(インビトロジェン)。簡単に言えば、LR CLONASE(登録商標)
を用いて、attL/aaRインビトロ組換えにより、HEV71のVLPカセットをバ
キュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーションベクター)に取り組ま
せる。LR CLONASE(登録商標)反応を25℃で1時間行い、続いて、プロテイ
ナーゼKによる培養を実施する。LR CLONASE(登録商標)反応混合物に、Li
brary Efficiency DH5αコンピテントセルへの形質転換を施し、発
現クローンを取得する。結果として得たコロニーからDNAを分離し、制限酵素分析によ
りHEV71/ポリオウイルスカセットの存在を確認する。pSN07−M3の発現カセ
ットをT7転位リコンビナーゼによりDH10Bac細胞内のバキュロウイルスゲノムに
取り組み、組換えバクミドを構築して、bacSN07−M3を得る。50μg/mlの
カナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサイクリン、1
00μg/mlのX−gal、40μg/mlのIPTGを補充したLB寒天培地上の白
色表現型により組換えバクミドを立証することができる。PureLink HiPur
eプラスミドDNAミニプレップキット(インビトロジェン)を用いて、DH10Bac
大腸菌より高品質のバクミドDNAを精製する。挿入物からのM13順方向プライマー、
M13逆方法プライマー及び内部プライマーを用いて、HEV71/ポリオウイルスカセ
ットの存在を確認する。EFFECTENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Q
iagen)を用いて、DNAをSf9昆虫細胞にトランスフェクションすることにより
組換えバキュロウイルスをレスキューする。簡単に言えば、T25フラスコ当たり2百万
のSf9細胞が播種され、28℃での6時間の培養により接着される。組換えバクミドD
NA1マイクログラムをDNA濃縮緩衝液150μlに再懸濁させ、エンハンサー溶液8
μlを混合し室温で5分間培養する。続いて、EFFECTENE(登録商標)試薬25
μlをDNA混合物に添加し、室温で10分間培養する。培地1mlをトランスフェクシ
ョン錯体を含むチューブに添加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるように
する。3日目、遠心分離により5分間500gの上清を採取する。続いてトランスフェク
ションを行い、高力価のウイルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れ
ば、目標タンパク質の発現に対する最適時期の決定に用いることができる。
ン)で増殖したSf9細胞を1%FBS Sf900−II SFM培地(インビトロジ
ェン)に再懸濁させて単細胞を取得し、フラスコ内に1ml当たり百万の密度で播種した
後、28℃で4時間培養した。ウイルスストックを10MOIでPBS洗浄細胞に添加し
、1時間なだらかに揺らす。感染細胞をPBSで3回洗浄し、細胞はSf900II−S
FMにて異なる時点で増殖した。フラスコを室温で30分間揺らして細胞を低張ダウンス
緩衝液1%TRITON(登録商標)X−100(TX−100)(1.5mMのMgC
l2、50mMのKCl、20mMのHEPES、1%TX−100)に溶解させ、フラ
スコから回収した溶解細胞を4℃の温度にて7000rmpで遠心分離に30分間かけ、
細胞溶解物を取得する。細胞溶解物と上清の成分を、特定の抗体を用いて免疫ブロット法
とELISA法により分析する。
野生型又は突然変異型のEMCV IRESの制御の下でHEV71の殻タンパク質を
発現する組換えバキュロウイルスを、EMCV IRESからのHEV71の殻タンパク
質の発現レベルについて評価した。バキュロウイルスは、実施例1におけるSN07から
の野生型EMCV IRES、並びに3つの突然変異型IRES、つまり実施例10、1
1、12からのM1、M2、M3の制御の下で発現するVLPを生成し、当該VLPをH
EV71の殻タンパク質のバキュロウイルス発現レベルに基づいて評価した。この試験に
は、異なるプロモーターの下でP1及び3CDを発現する組換えバキュロウイルス(F)
、及びbacGUSを発現する制御組換えバキュロウイルス(G)も含まれる。Sf9細
胞を5MOIで感染させ、実施例10〜12に記載されているように、3日目に溶解物と
上清を両方とも採取した。溶解物及び上清を抗VP1抗体を以って探知し、HEV71の
殻タンパク質の発現を検出した。
ば、突然変異型のM1及びM2は突然変異型のM3や2つのプロモーターに駆られた構築
体に比べ高いレベルのVP1を発現する。しかしながら、突然変異型のM2が上清におい
てより多いVP1を生成する。データを上方のパネルに示す。
制御の下で探知を行った場合のブロットを示している。免疫ブロットによれば、各試料は
同量のバキュロウイルスを生成している。
現、及び精製
本発明は、単一免疫原として融合し、ワクチン接種を受けた個体において防御免疫反応
を誘導する組換えHEV71とポリオウイルスの構造タンパク質の生成と用途に関する。
本発明は、一般的に、HEV71及び/又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質、
若しくはその免疫原性フラグメント、並びに組換えHEV71及び/又はポリオウイルス
のサブユニット融合タンパク質と組み合わせられる抗原性補助剤を含む組換えHEV71
及び/又はポリオウイルス由来の融合タンパク質ワクチン組成物に関する。HEV71及
びポリオウイルスのサブユニット融合タンパク質は、VP1、VP2、VP3、VP4、
それらの組み合わせ、及びそれらの免疫原性フラグメントの組み合わせから選ばれた殻タ
ンパク質からなっても良い。本実施形態の一様態において、組換えHEV71及び/又は
ポリオウイルスの融合タンパク質は、HEV71又はポリオウイルスのサブユニットタン
パク質、並びにHEV71又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質と遺伝的関連の
ある融合パートナータンパク質を含む。本発明は更に、大腸菌においてバキュロウイルス
は勿論、VP0、VP4−VP2−VP3融合物、VP2−VP3−VP1融合物などの
サブユニットワクチを発現する構築体を生成する方法を提供するものとして期待される。
るHEV71及び/又はポリオウイルスからcDNAを生成するために、精製ゲノムウイ
ルスRNAを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(High Pure核酸キット、Ro
che)を行う。遺伝子の5‘末端及び3’末端から順方向プライマー及び逆方向プライ
マーが作り上げられ、当該プライマーは開始コドン及び終止コドンを組み込む。増幅した
PCR生成物はEcoRI及びNotI制限酵素で消化され、図16に示されているよう
にpFastBac HTベクター(インビトロジェン)にクローニングされる。インビ
トロジェンからのBAC−TO−BAC(登録商標)発現系は市販されており、製造者の
指示に従って方法を用いた。融合遺伝子はpFastBac HTドナープラスミドにク
ローニングされ、組換えタンパク質の生成はBAC−TO−BAC(登録商標)のバキュ
ロウイルス発現系(インビトロジェン)に基づく。融合遺伝子を担うThe pFastBa
c HTドナープラスミドに、T7転位リコンビナーゼによる座位特異的組換えを用いて
バキュロウイルスシャトルベクター(バクミド)への形質転換を施す。この結果として、
大腸菌株DH10Bacを得た。DH10Bac細胞はバクミドを含み、バクミドはカナ
マイシン抵抗性とヘルパープラスミドを授け、ヘルパープラスミドはトランスポーゼース
をコード化し、テトラサイクリンに対する抵抗性を授ける。発現希望遺伝子を持つ組換え
pFastBac HTプラスミドは、転位に対してDH10Bac細胞への形質転換を
達成し、組換えバクミドを生成する。形質転換細胞は順次に希釈され、各希釈物は、50
μg/mlのカナマイシン、7μg/mlのゲンタマイシン、10μg/mlのテトラサ
イクリン、100μg/mlのX−gal、40μg/mlのIPTGを補充したLB寒
天培地上につけられ、37℃で少なくとも48時間培養される。白色コロニーを取り上げ
、再度画線を入れて白色表現型を確認した。組換えバクミドをPureLink HiP
ureプラスミドDNAミニプレップキット(インビトロジェン)により分離し、DNA
試料を40μlのTE(10mMのTris−HCl:pH8、1mMのEDTA)を溶
解させトランスフェクションに用いた。
し出す。EFFECTENE(登録商標)トランスフェクション試薬(Qiagen)を
用いて、DNAをSf9昆虫細胞にトランスフェクションすることによって組換えバキュ
ロウイルスをレスキューする。T25フラスコ当たり2百万のSf9細胞が播種され、2
8℃での6時間の培養により接着される。組換えバクミドDNA1マイクログラムをDN
A濃縮緩衝液150μlに再懸濁させ、エンハンサー溶液8μlを混合し室温で5分間培
養する。続いて、EFFECTENE(登録商標)試薬25μlをDNA混合物に添加し
、室温で10分間培養する。培地1mlをトランスフェクション錯体を含むチューブに添
加し、細胞培養フラスコに移相して均一に分布されるようにする。3日目、遠心分離によ
り5分間500gの上清を採取する。続いてトランスフェクションを行い、高力価のウイ
ルスストックを得る。高力価のウイルスストックを一度得れば、目標タンパク質の発現に
対する最適時期の決定に用いることができる。問題のタンパク質を分析するために、10
%グレース昆虫細胞用培地(インビトロジェン)で増殖したSf9細胞を1%FBS S
f900−II SFM培地(インビトロジェン)に再懸濁させて単細胞を取得し、フラ
スコ内に1ml当たり百万の密度で播種した後、28℃で4時間培養した。ウイルススト
ックを10MOIでPBS洗浄細胞に添加し、1時間なだらかに揺らす。感染細胞をPB
Sで3回洗浄し、細胞はSf900II−SFMにて異なる時点で増殖した。フラスコを
室温で30分間揺らして細胞を低張ダウンス緩衝液1%TRITON(登録商標)X−1
00(TX−100)(1.5mMのMgCl2、50mMのKCl、20mMのHEP
ES、1%TX−100)に溶解させ、フラスコから回収した溶解細胞を4℃の温度にて
7000rmpで遠心分離に30分間かけ、細胞溶解物を取得する。細胞における異種タ
ンパク質の発現は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)とHi
s Probe−HRP抗体(Thermo Scientific)をプローブとして
用いるウェスタンブロット法により確認した。バキュロウイルスの生成とタンパク質の発
現を一度確認すれば、ウイルスストックは増幅され、発現希望遺伝子を担うバキュロウイ
ルスの濃縮ストックを生成する。昆虫細胞を感染させるウイルスの最も適切な濃度、並び
に所望のタンパク質を生成する最適時期を、更に確立する。変性状態における精製のため
に、細胞を、100mMのNaH2PO4、10mMのTris、300mMのNaCl
、10mMのイミダゾールが6Mのグアニジニウム−HClを含有する溶解緩衝液(pH
8.0)に溶解させる。懸濁液は、1分/1パルスで、5パルスと60ワットの電力設定
により、氷の上において超音波により分解され、室温で1時間混合される。溶解物を30
分間27Kgで遠心分離にかけ、細胞残屑を取り除く。上清を、溶解緩衝液により予め平
衡状態となったHisTrap(GE healthcare life scienc
es)カラムにロードする。ロードの後、100mMのNaH2PO4、10mMのTr
is、300mMのNaCl、40mMのイミダゾールが6Mのグアニジニウム−HCl
を含有する溶液(pH8.0、洗浄緩衝液1)20カラム体積によりカラムを洗浄する。
続いて、100mMのNaH2PO4、10mMのTris、300mMのNaCl、4
0mMのイミダゾールが8Mの尿素を含む溶液(pH8.0、洗浄緩衝液2)20カラム
体積によりカラムを更に洗浄する。結合タンパク質を、8Mの尿素、100mMのNaH
2PO4、10mMのTris、300mMのNaCl、250mMのイミダゾールを含
有する緩衝液(pH8、溶出緩衝液)により溶出する。タンパク質を含むフラクションを
4℃で一晩中、PBSに対してプールし透析した。TEVプロテアーゼを用いてヒスチジ
ンタグを取り除き、製造者の指示に従ってタンパク質精製を行った。
リオウイルス)のサブユニットワクチンの発現と精製
ChampionTM pETSUMO 発現系(インビトロジェン)は、大腸菌にお
いて最高レベルの可溶性タンパク質を生成する。低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO
)融合物を用いて、発現融合タンパク質の溶解性を高める。発現後、11kDのSUMO
部分を、高度特異的活性SUMO(ULP−1)プロテアーゼによりカルボキシル端末で
切断することができる。更に、タンパク質の検出と精製に用いられるN末端6×Hisタ
グを含む。
れるpET SUMO−VP0、pET SUMO−VP4−VP2−VP3、pET
SUMO−VP2−VP3−VP1の発現ベクターの構築は、以下通りである。VP0、
VP4−VP2−VP3融合物、VP2−VP3−VP1融合物のフラグメントは、HE
V71とポリオウイルスのサブユニットワクチン用の抗原として用いられる。SUMOモ
チーフと6×Hisタグは、融合物のN末端と共役され、それぞれタンパク質の可溶化と
精製を補助する。抗原性融合タンパク質は、各タンパク質をコード化するcDNA配列を
発現ベクターにクローニングしてpET SUMO−VP0、pET SUMO−VP0
、pET SUMO−VP4−VP2−VP3、pET SUMO−VP2−VP3−V
P1の発現ベクターを形成するステップを含む遺伝子クローニング技術により生成される
。融合パートナーをコード化するDNAフラグメントに、順方向プライマーと逆方向プラ
イマーにおける開始コドンと終止コドンを含む特定のプライマーを用いて、PCR増幅を
かける。PCR生成物の連結反応は、次のように行われる。フレッシュPCR生成物、1
0×連結反応緩衝液、pET SUMOベクター(25ng/μl)2μl、滅菌水を添
加して総体積を9μlとし、1μlのT4 DNAリガーゼ(4.0Weiss単位)を
添加して、連結反応物を15℃で一晩中培養した後、One Shot(登録商標)Ma
ch1TM−T1R(インビトロジェン)コンピテントセルへの形質転換を行う。10個
のコロニーを選択し、PureLinkTMHQミニプラスミド精製キット(インビトロ
ジェン)を用いてコロニーからプラスミドDNAを分離する。プラスミドを制限分析によ
り分析して、挿入物の存在と正しい方向を確認する。組換え型から、前述したようにプラ
スミドDNAを分離する。プラスミドに、BL21(DE3)One Shot(登録商
標)細胞(インビトロジェン)への形質転換を施す。形質転換細胞を増殖させ、IPTG
による発現の誘発を数回行って発現の最適時期を決定する。毎回ごとに、誘発された培地
と未誘発の培地から500μlを取り除き、各細胞ペレットを80μlのSDS−PAG
E試料緩衝液に再懸濁させる。沸騰試料に遠心分離にかけた後、各資料の10μlをSD
S−PAGEゲルにロードし、 電気泳動をかける。
ces)を用いて組換え融合タンパク質の精製をスケールアップするために、次の工程を
導入する。一晩培養物(5%)を100〜300mlのLB+50μg/mlのカナマイ
シンに植菌し、2時間後、1mMのIPTGで誘導する。2時間後、10分間3000g
で遠心分離を行い、細胞を採取した。10%(培養物の総体積)の結合緩衝液(20mM
のリン酸ナトリウム、0.5MのNaCl、20mMのイミダゾール、pH7.4)にペ
レットを再懸濁させる。Misonic UltraSonicate Liquidプ
ロセッサにより、氷バケットで1分の間隔を置きながら1分ずつ、5回の超音波分解を細
胞に施す。超音波で分解した試料を、4℃にて4000rmpで1時間遠心分離を行い、
可溶型と不溶型に分離する。不溶型フラクションを、6Mの尿素を含有する結合緩衝液に
再懸濁させる。可溶型フラクションと不溶型フラクションの両方を、4℃にて4000r
mpで1時間遠心分離にかけ、その後、0.22μmフィルタユニットを用いて濾過する
。HisTrapカラムを結合緩衝液を用いて平衡状態にして、濾過した試料をカラムに
ロードする。次に、カラムを結合緩衝液と40mMのイミダゾールで洗浄し、組換えタン
パク質を0.5Mのイミダゾール(不溶型フラクションに対しては6Mの尿素)を含む結
合緩衝液により溶出する。回収した資料に対して、タンパク質用のクマシーブルー染色プ
ロトコールを用いてテストを行う。溶出フラクションを含む純粋組換えタンパク質を、T
ris−HCl緩衝液とMerckチューブを用いて透析する。透析後、タンパク質の濃
度をBradford試薬を用いて評価する。天然タンパク質をSUMOプロテアーゼを
用いて生成し、製造者の指示に従ってSUMOと6×Hisタグを含むN末端ペプチドに
切断する。
抗体。HEV71 VLPの構成要素全てと結合する。
VP1、VP2、VP0のコード配列を、それぞれ個別的に、実施例15に記載されて
いるpET SUMOベクターにクローニングする。個別の殻タンパク質は、大腸菌内で
発現し、実施例15に記載されている通りに精製される。精製タンパク質のVP0、VP
1、VP2、VP3には、ウェスタンブロット法が施され、実際例4で用いられたプール
中和血清により1:1000希釈で調べられる。実施例4で用いた対照群のマウス血清を
、本実験でも使用するものとする。
マウスから摘出したプール中和血清は、SN07に感染したSf9細胞の上清においてV
LPの構成要素全部、つまりVP0、VP1、VP2、VP3と結合するという事実が分
かる。
ダウン。
組換えバキュロウイルスSN07に感染した細胞から得た20mlの上清を、10ml
の単クローン性中和抗体(EV18/4/D6−1/F1/G9)に混合し、室温で1時
間放置する。PBSにより予め平衡状態となったMabSelect SuReTM(G
E Health Care)組換えタンパク質Aの1mlカラム(アガロースビードの
サイズ:85um)を介して混合物を徐々にロードし、その後、20mlのPBSで洗浄
し0.5mlの0.1Mグリシン−HCl(pH3.0)で溶出させる。30μlのTr
is−HCl(pH8.8)によりフラクションを中和させる。溶出フラクションにSD
S−PAGE、クマシーブルー染色、脱染を順にかける。
構成要素(VP0、VP1、VP3)を視認することができる。
バキュロウイルスSN07の上清濃縮液を用いて生じさせた単クローン性中和抗体(E
V18/4/D6−1/F1/G9)を以ってアフィニティーカラム(AFC)を用意す
る。ウェスタンブロット法により溶出フラクションを分析し、その結果を図20にした。
レーン1とレーン2の溶出フラクションを抗VP1抗体を用いて探知した結果、AFC精
製VLPにVP1が存在していることが分かった。レーン3とレーン4の溶出フラクショ
ンを抗VP2抗体を用いて探知した結果、AFC精製VLPにVP2も存在していること
が分かった。レーン5とレーン6の溶出フラクションを抗VP2単クローン性抗体を用い
て探知した結果、AFC精製VLPにVP2が存在していることが分かった。
実施例18における、アフィニティーカラム(AFC)から溶出されたフラクションを
電子顕微鏡を用いて評価した。AFC精製VLPの電子顕微鏡写真を図21に示す。電子
顕微鏡で評価した結果、HEV71の構造タンパク質がVLPに組み立てられていること
が分かった。
用いた抗原は、前述した通り組換えバキュロウイルスSN07の20x濃縮粗濃縮液で
ある。妊娠を示す膣栓を、交尾後の朝に付け、胎生0.5日目として見なす。100μl
の濃縮液をIMJECT(登録商標)(硫酸バンド)を混合した2回分の投与量を胎生3
.5日目の母獣に大して腹腔内投与を行う。体重測定により妊娠を確認し、胎生17.5
日目の母獣に2回目の投与を行う。1回目のワクチン投与に先立って、各マウスから最初
の血液試料を採取する。仔マウスへのウイルス攻撃から14日が経過するまで、試料を毎
週採取した。Balb/cマウスを3群に分け、20匹には免疫化を行い、ウイルス攻撃
をかけた。20匹には模倣免疫化(mock immunized)を行い、ウイルス攻
撃をかけた。5匹には免疫化もせず、ウイルス攻撃もかけなかった。生後5日の仔マウス
を、100×HD50のMP−26Mを含有するMP−26Mウイルス50μlで感染さ
せた。感染動物を1日に2回観察し、植菌後14日が経過するまで、疾病の臨床兆候を探
した。発育障害、体重減少、ラント症候群、空腹、昏睡、頭部後屈、猫背、粗い毛皮、脱
水、低体温、四肢麻痺を含む異常兆候が現れた。麻痺程度を、次の基準に従って採点した
。
0:正常
1:筋力は低下しているが四肢は動く
2:患肢を動かせない
3:四肢麻痺、つまり四肢を全く動かせない
た。標的臓器から摘出した部位に対して、病理組織学的検査を行った。
スを生み、母性を見せて仔たちをよく育てた。もう一匹の母獣が生んだ一匹の仔マウスは
非常に弱く、母マウスはあまり仔の面倒を見ようとはしなかった。
て防御力を見せたとの結論を出せる。
リード−ミュンヒ法(1938)により算出した人道的エンドポイント(HD50)は、
2.0×102TCID50のMP−26Mに決められた。免疫化を受けた母から生まれ
た仔マウスのうち83%が、ウイルス攻撃に対して防御力を示した。
匹のマウスは、HEV71ウイルスの攻撃を受けたが、感染の臨床兆候を全く見せなかっ
た。
、HEV71ウイルスの攻撃を受け、感染したしまった、無接種無ウイルス群に属する母
体から生まれた2匹は、感染の臨床兆候を見せなかった。
、同腹の仔マウスたちを防御するのに成功している(免疫化を受けた母マウスの仔6匹の
うち5匹/模倣免疫化を受けた母マウスの仔12匹のうち0匹)。
様々なポリオウイルスの発現カセットを構築し、ポリオウイルスVLPを生成する。発
現カセットは、全てポリオウイルスのP1ポリペプチドを含むが、それぞれ異なるIRE
Sを有する。IRESはポリオウイルスの3CDプロテアーゼの発現を誘導する役割を果
たす。(PV−P1+HEV71−IRES+PV−3CD)、(PV−P1+EMCV
−IRES+PV−3CD)、(PV−P1+PV−IRES+PV−3CD)の組み合
わせとなる。ポリオウイルスのVLP発現カセットを持つ組換えバキュロウイルスに対し
てテストを行う。感染後3日目にバキュロウイルス感染細胞から溶解物を採取し、ウサギ
抗PVP3抗体(1:2000)を用いてポリオウイルスVP3の発現を評価する。
CDプロテアーゼがHEV71−IRES又はEMCV−RESの制御の下にあるときは
、PV−IRES構築体とは違って、ポリオウイルスのVP3タンパク質は適切に切断さ
れず、結果的に、ポリウイルスVLPの生成に悪影響を及ぼす。従って、PV−IRES
を有するポリオウイルスのPV−VLP発現カセットは、ポリオウイルスVLPの生成に
非常に効率的である。
PV−VLP発現カセットからのポリオウイルスVLP生成を立証するため、PV−V
LP発現カセットを担う組換えバキュロウイルスからの溶解物及び上清を用いて、両サイ
トELISA法を行う。PV−3CDプロテアーゼは、ポリオウイルスIRESの制御の
下にある。Sf9細胞は、PV−IRESを含むPV−VLP発現カセットを担う組換え
バキュロウイルスにより感染される。感染後3日目に溶解物と上清を採取する。ポリオウ
イルスVLPの形成は、両サイトELISA法を用いて評価する。
3抗体を補足抗体として用意し、コーティング緩衝液、つまり0.05M炭酸水素塩緩衝
液、pH9.6に50μg/mLまで希釈する。100μl/ウェルの抗体をNUNC免
疫プレート(immunoplate)に分散させ、4℃にて一晩中保存する。PBST
(0.05%)で洗浄した後、免疫プレートを200μl/ウェルの遮断緩衝液、つまり
1%のカゼインを溶解させたPBSにより、室温で2時間遮断する。PV−VLP発現カ
セットを担う組換えバキュロウイルスからの溶解物及び上清の試料(PV−3CDプロテ
アーゼはポリオウイルスIRESの制御の下にある)は、希釈剤、つまり0.2%のカゼ
インを溶解させたPBSで希釈され、100μl/ウェルで分散され、1時間室温で培養
された後、PBST(0.05%)で洗浄される。
8/1;Dako)を0.2%のカゼインをPBSに溶解させた希釈剤により1:250
の希釈率で希釈して用意する。希釈した検出用の単クローン性抗体を、100μl/ウェ
ルで分散させ、室温で1時間培養する。抗マウスHRP共役2°抗体を、0.2%のカゼ
インをPBSに溶解させた希釈剤により1:1000の希釈率で希釈して用意する。PB
ST(0.05%)でプレートを洗浄した後、100μl/ウェルの希釈した2°抗体を
分散させ、プレートを室温で1時間培養する。プレートを洗浄緩衝液のPBST(0.0
5%)で洗浄した。SureBlueTMTMB 1(KPL)成分マイクロウェルペル
オキシダーゼ基質を100μl/ウェルで分散させ、室温で10分間培養し成長させる。
100μl/ウェルの停止液、つまり5mMのNaOHを添加し、反応を停止させた。各
ウェルの吸収度を650nmの光密度で読み取った。
ンパク質は、VLPがPV−VLP発現カセットから実際に形成されたことを示す相互関
係になることが分かる。
EV71 VLP発現カセットの構築体
HEV71−IRESを持つHEV71 VLPカセットの概略的構造を図24に図示
する。発現カセットは、3CDプロテアーゼの発現がEMCV IRESではなくHEV
71 IRESによるものであるということを除けば、実施例1に示されている構築体(
pSN01)と類似する。HEV71 IRES配列はGenBankで探すことができ
る(アクセス番号DQ341362.1;ヌクレオチド1〜747)。インビトロジェン
BAC−TO−BAC(登録商標)マニュアル(2009)の指示に従って、ベクターを
含むHEV71発現カセットを、LR CLONASE(登録商標)を用いたattL/
aaRインビトロ組換えにより、バキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デステ
ィネーションベクター)に組み込む。エントリーベクターとpDEST8間の組換えは発
現クローンを生成する。発現クローンは、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録
商標)マニュアルに記載されているように、DH10Bacの形質変換により組換えバク
ミドを生じさせる。Sf9細胞の組換えバクミドへのトランスフェクションは、P1、H
EV71 IRES、3CDを有する発現カセットを担う組換えバキュロウイルスをレス
キューする。
キュロウイルスを以って切断した殻タンパク質の発現を評価することができる。VP1、
VP0、VP3に対して特異的であるウサギ多クローン性抗原は、組換えバキュロウイル
スに感染したSf9細胞からの溶解物と上清に対してウェスタンブロット法を行うことに
より、組織化したVLPを特定する。
LP発現カセットの構築体
発現カセットは、3CDプロテアーゼの発現がHEV71−IRESではなくポリオウ
イルスIRES(PV−IRES)によるものであるというを除けば、実施例24に示さ
れている発現カセットと類似する。ポリオウイルスのIRES配列はGenBankで探
すことができる(アクセス番号V01150.12;ヌクレオチド1〜628)。
従って、ベクターを含むHEV71発現カセットを、LR CLONASE(登録商標)
を用いたattL/aaRインビトロ組換えにより、バキュロウイルス発現プラスミドp
DEST8(デスティネーションベクター)に組み込む。エントリーベクターとpDES
T8間の組換え反応は発現クローンを生成する。発現クローンは、インビトロジェンBA
C−TO−BAC(登録商標)マニュアルに記載されているように、DH10Bacの形
質変換により組換えバクミドを生じさせる。Sf9細胞の組換えバクミドへのトランスフ
ェクションは、P1、PV IRES、3CDを有する発現カセットを担う組換えバキュ
ロウイルスをレスキューする。
更に、本発明は次の実施の態様も包含する:
(1)
VP0、VP1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む1種以上の免疫的活性抗原を含むことを特徴とする、ワクチン。
(2)
ヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応、及び/又は中和免疫反応を誘導することを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(3)
前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスA、ヒトエンテロウイルスB、ヒトエンテロウイルスC及びヒトエンテロウイルスDのうちから選ばれることを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(4)
前記ヒトエンテロウイルスAは、ヒトエンテロウイルス71(HEV71)とコクサッキーウイルスA16のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスBは、コクサッキーウイルスBとエコーウイルスのうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスCは、ヒトポリオウイルス1、ヒトポリオウイルス2、及びヒトポリオウイルス3のうちから選ばれ、前記ヒトエンテロウイルスDは、EV68であることを特徴とする、請求項3に記載のワクチン。
(5)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP0ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(6)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP2ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(7)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP3ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(8)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP1ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(9)
前記ワクチンは、1種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(10)
前記種又は血清型は、HEV71とコクサッキーウイルスA16のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスAであることを特徴とする、前記(9)に記載のワクチン。
(11)
前記種又は血清型は、PV−1、PV−2、PV−3のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスCであることを特徴とする、前記(9)に記載のワクチン。
(12)
VP0、VP1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記1種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形態であることを特徴とする、前記(1)に記載のワクチン。
(13)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP0ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(12)に記載のワクチン。
(14)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP2ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(12)に記載のワクチン。
(15)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP3ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(12)に記載のワクチン。
(16)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP1ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(12)に記載のワクチン。
(17)
エンテロウイルス感染に対して被験者にワクチン接種を施す方法であって、
VP0、VP1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む1種以上の免疫的活性抗原を含むワクチンの、前記被験者への投与の際にヒトエンテロウイルスに対する防御免疫反応及び/又は中和免疫反応を誘導するほどの有効量を前記被験者に投与することを特徴とする、方法。
(18)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP0ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(19)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP1ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(20)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP3ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(21)
前記ワクチンは、免疫的活性エンテロウイルスVP2ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(22)
VP0、VP1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれた1種以上のヒトエンテロウイルスポリペプチドを含む前記1種以上の免疫的活性抗原は、ウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体の形態であることを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(23)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP0ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(22)に記載の方法。
(24)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP2ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(22)に記載の方法。
(25)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP3ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(22)に記載の方法。
(26)
前記ウイルス様粒子は、免疫的活性エンテロウイルスVP1ポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(22)に記載の方法。
(27)
前記ワクチンは、1種以上のエンテロウイルス種又は血清型に由来するポリペプチドを含むことを特徴とする、前記(17)に記載の方法。
(28)
前記エンテロウイルスの種又は血清型は、HEV71とコクサッキーウイルスA16のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスAであることを特徴とする、前記(27)に記載の方法。
(29)
前記エンテロウイルスの種又は血清型は、PV−1、PV−2、PV−3のうちから選ばれたヒトエンテロウイルスCであることを特徴とする、前記(27)に記載の方法。
(30)
ヒトエンテロウイルスP1ポリペプチドをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターと、内部リボソーム導入部位(IRES)と、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼをコード化する核酸とを含むことを特徴とする、発現カセット。
(31)
前記ポリペプチドはヒトエンテロウイルスP1であることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(32)
前記ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼは、前記ヒトエンテロウイルスP1ポリペプチドを処理することを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(33)
処理済みの前記ヒトエンテロウイルスP1ポリペプチドは、結合してウイルス様粒子、カプソメア、錯体及び/又は会合体を形成することを特徴とする、前記(32)に記載の発現カセット。
(34)
前記ヒトエンテロウイルスP1ポリペプチドは、VP0、VP1、VP2、VP3、VP4、及びその免疫的活性フラグメントのうちから選ばれたポリペプチドの組み合わせを含むことを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(35)
前記ヒトエンテロウイルスは、ヒトエンテロウイルスAとヒトエンテロウイルスCのうちから選ばれることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(36)
前記ヒトエンテロウイルスAは、HEV71とコクサッキーウイルスA16のうちから選ばれることを特徴とする、前記(35)に記載の発現カセット。
(37)
前記ヒトエンテロウイルスCは、ヒトポリオウイルス1(PV−1)、ヒトポリオウイルス2(PV−2)及びヒトポリオウイルス3(PV−3)のうちから選ばれることを特徴とする、前記(35)に記載の発現カセット。
(38)
前記IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)から由来したものであることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(39)
前記脳心筋炎ウイルス(EMCV)由来の前記IRESは、遺伝子組換えを行われ、IRES活性が低減されていることを特徴とする、前記(38)に記載の発現カセット。
(40)
前記EMCV由来の前記IRESは、JKセグメントのA6分岐ループに、ヌクレオチド(A7)一つを加えることにより、遺伝子組換えを行われたことを特徴とする、前記(39)に記載の発現カセット。
(41)
前記IRESは、ヒトエンテロウイルスから由来したものであることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(42)
前記プロモーターは真核生物プロモーターであることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(43)
前記真核生物プロモーターはポリヘドリンプロモーターであることを特徴とする、前記(42)に記載の発現カセット。
(44)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、EMCV IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(45)
前記EMCV IRESは、突然変異によりIRES活性が低減されていることを特徴とする、前記(44)に記載の発現カセット。
(46)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、HEV71 IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(47)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(48)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(49)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、HEV71 IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(50)
前記プロモーターは、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、EMCV IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合していることを特徴とする、前記(30)に記載の発現カセット。
(51)
前記(30)に記載の発現カセットを宿主細胞に取り込み、
前記発現カセットのポリペプチドを生成できる期間の間、前記宿主細胞を培養し、
前記宿主細胞及び/又は培養上清よりヒトエンテロウイルスポリペプチドを回収することを特徴とする、ワクチンの製造方法。
(52)
前記宿主細胞は真核細胞であることを特徴とする、前記(51)に記載の方法。
(53)
前記真核細胞は、昆虫細胞、哺乳動物細胞株、及び酵母細胞のうちから選ばれることを特徴とする、前記(52)に記載の方法。
(54)
前記昆虫細胞は、Spodoptera frugiperda、Trichoplusia ni,drosophila、及びAedes albopictus由来の蚊細胞のうちから選ばれることを特徴とする、前記(53)に記載の方法。
(55)
前記哺乳動物細胞株は、CHO、HEK293、COS−1、HeLa、Vero、及びNIH3T3から選ばれることを特徴とする、前記(53)に記載の方法。
Claims (6)
- ヒトエンテロウイルスCのウイルス様粒子を含むワクチンであって、ウイルス様粒子がヒトエンテロウイルスCのVP0ポリペプチド、VP1ポリペプチド、VP2ポリペプチド、VP3ポリペプチド及びVP4ポリペプチドを含み、当該ワクチンがヒトエンテロウイルスCに対する防御免疫反応及び/又は中和免疫反応を誘導することを特徴とする、前記ワクチン。
- 前記ヒトエンテロウイルスCは、ポリオウイルス1、ポリオウイルス2、及びポリオウイルス3のうちから選ばれる、請求項1に記載のワクチン。
- ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチドをコード化する核酸配列と操作可能に結合するプロモーターを含む発現カセットであって、
前記ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチドをコード化する核酸配列は、ヒトエンテロウイルスCの内部リボソーム導入部位(IRES)をコード化する核酸配列と操作可能に結合し、
前記IRESをコード化する核酸配列は、ヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸配列と操作可能に結合し、前記ヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼがIRESの転写制御下にある、前記発現カセット。 - 前記ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチドおよび前記ヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼが生成され、かつウイルス様粒子が形成されるのに十分な期間の間、請求項3に記載の発現カセットを含む真核宿主細胞を培養する工程を含む、ワクチンの製造方法。
- 前記真核宿主細胞及び/又は培養上清より前記ウイルス様粒子を回収する工程をさらに含む、請求項4に記載のワクチンの製造方法。
- ヒトエンテロウイルスC感染に対して被験者にワクチン接種するための薬物の製造における請求項1または2に記載のワクチンの使用。
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