TW201825676A - 嵌合型腸病毒病毒樣顆粒 - Google Patents

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瑪莉 卡朵莎
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馬來西亞商辛提奈斯特治療公司
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Abstract

本發明提供用於抵抗多於一種腸病毒的保護和/或治療之嵌合型腸病毒病毒樣顆粒(VLP)。更特定言之，本發明提供嵌合型EV-A71病毒樣顆粒，其展現CV-A16的VP1多肽且同時維持EV-A71本身之重要的中和抗體表位。更特定言之，本發明提供嵌合型CV-A16病毒樣顆粒，其展現EV-A71的VP1多肽。因此，本發明提供包含該嵌合型病毒樣顆粒之二價疫苗，該等嵌合型病毒樣顆粒誘導針對EV-A71及CVA-16兩者之免疫反應和/或中和抗體反應以供治療手足口病。

Description

嵌合型腸病毒病毒樣顆粒
[0001] 本發明關於衍生自腸病毒之嵌合型病毒樣顆粒(VLP)及包含此等VLP之疫苗，該疫苗針對多於一種的腸病毒誘導免疫反應及/或保護性中和抗體反應。
[0002] 腸病毒係屬於微小RNA病毒科(Picornaviridae)科中的微小RNA病毒(Picornavirus)屬的病毒屬。腸病毒代表一群大型且多樣的小RNA病毒的屬，特徵為單一正股基因體RNA。所有腸病毒都含有約7,500個鹼基的基因體，且已知由於低精確度複製和頻繁的重組而具有高突變率。宿主細胞感染後，基因體以蓋帽非依賴性(cap-independent)方式而轉譯成單一多蛋白(polyprotein)，該多蛋白之後再藉由病毒編碼之蛋白酶加工成結構性殼體(capsid)蛋白質和主要涉及病毒複製之非結構性蛋白質。 　　[0003] 腸病毒與數種哺乳動物疾病有關。腸病毒被分類為12種，如下所示：腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒E、腸病毒F、腸病毒G、腸病毒H、腸病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B和鼻病毒C。 　　[0004] 在這十二種腸病毒中，有很多血清型。血清學研究依抗體中和試驗，已分別出許多腸病毒血清型。 　　[0005] 腸病毒A包括例如血清型EV-A71(亦被稱為EV71或HEV71)、EV-A76、EV-A89、EV-A90、EV-A91、EV-A92、CV-A16(柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A16)、CV-A5、CV-A6和CV-A10。 　　[0006] 腸病毒C病毒種表現23種血清型，其包括例如PV-1(脊髓灰白質炎病毒(Poliovirus)1)、PV-2、PV-3、CV-A20、CV-A21、EV-C95、EV-C96、EV-C99、EV-C102、EV-C104、EV-C105及EV-C109。 　　[0007] 血清型EV-D68、EV-D70及EV-D94經分類為腸病毒D病毒種之下。 　　[0008] 腸病毒屬的所有成員，包括EV-A71、脊髓灰白質炎病毒和柯薩奇病毒A16均具有單股正義RNA基因體，其具有單一開讀框，其編碼多蛋白P1(由殼體結構蛋白VP0、VP3和VP1組成)及數種非結構蛋白(包括病毒蛋白酶3C和3CD，其負責截切多蛋白P1成個別的殼體蛋白VP1、VP3和VP0)，病毒RNA包被(encapsidation)之後，VP0最終會經截切成VP2和VP4。殼體蛋白VP0、VP1和VP3可組裝成病毒樣顆粒(VLP)而不會包被基因體，但是在天然病毒的成熟期間，RNA包被後，VP0會斷裂成VP2和VP4。 　　[0009] 腸病毒感染所引起的疾病包括脊髓灰質炎，其係腸病毒感染造成的疾病中，最著名的疾病。其他疾病的實例包括無菌性腦膜炎、手足口病(HFMD)、結膜炎、呼吸疾病和心肌炎。然而，非特異性發熱性疾病係腸病毒感染最常見的表現。 　　[0010] 感染腸病毒C，尤其是脊髓灰白質炎病毒，已經是一個普遍存在的問題，而脊髓灰質炎的流行病在歷史上，一直是20世紀期間造成數百萬死亡的重大全球性健康問題。不活化全病毒疫苗已經用於大規模免疫，且係目前可得且可用於預防脊髓灰白質炎病毒感染。在世界上大多數的國家，已經以不活化的脊髓灰質炎疫苗，得到了良好結果而根除脊髓灰質炎，該疫苗係根據Jonas Edward Salk所開發出的方法製備，並且之後已經針對幾個方面進行了改善。通常，這些疫苗含有不活化的脊髓灰質炎病毒之Mahoney、MEF1和Saukett病毒株混合物。雖然減毒脊髓灰白質炎病毒血清型PV-1、PV-2和PV-3病毒株(沙賓(Sabin))業經製造出並用作為減毒口服脊髓灰質炎疫苗，但是減毒沙賓疫苗偶爾產生突變回復體，導致被稱為疫苗相關麻痺性脊髓灰質炎(VAPP)。通常，含有脊髓灰質炎病毒之個別多胜肽的次單位形式之疫苗進行接種，已顯示經單離的多肽不能夠增加人和動物的中和抗體(Meloen, et al., J. Gen. Virol. 45：761-763, 1979)。 　　[0011] 此外，腸病毒是造成孩童無菌性腦膜炎最常見原因。在美國，腸病毒造成30,000至50,000例的腦膜炎。腦炎是一種罕見的腸病毒感染表徵；但是當它發生時，最常發現引起腦炎的腸病毒是腸道細胞病變人類孤病毒9型(echovirus 9)。腸病毒引起的肋肌痛之特徵為胸部和腹部發生嚴重陣發性疼痛，伴隨著發燒，有時會出現噁心、頭痛、和嘔吐。心包炎及/或心肌炎通常係由腸病毒所引起的。也曾有心律不整、心臟衰竭及心肌梗塞的報告。腸病毒也會引起急性出血性結膜炎。 　　[0012] 腸病毒感染會引起手足口病(HFMD)。手足口病是一種常見的、自限性孩童疾病，最常發生的原因是感染柯薩奇病毒A16型(CV-A16)病毒或EV-A71，還有其他腸病毒A血清型，諸如CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A7和CV-A10，也可能引起手足口病，且此外CV-B1、CV-B2和CV-B5也會引起HFMD(Li Y, Zhu R, Qian Y, Deng J(2012)The Characteristics of Blood Glucose and WBC Counts in Peripheral Blood of Cases of Hand Foot and Mouth Disease in China：A Systematic Review. PLoS ONE 7(1)：e29003；published January 3, 2012)。 　　[0013] 然而，腸病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A16型(CV-A16)係已知造成HFMD的主要致病體的腸病毒血清型，但此外，EV-A71也常與嚴重中樞神經系統併發症、及在一些情況下與心血管系統表徵有關。EV-A71首先於1969年在加州自神經系統疾病的病例分離及特徵分析。迄今為止，宿主對EV-A71感染的反應之分子機制知之甚少，但是已知涉及編碼趨化激素的mRNA、參與蛋白質降解之蛋白質、補體蛋白、和促凋亡蛋白的數量增加。 　　[0014] 在過去的十五年中，HFMD已成為全世界的公共健康問題，尤其是亞太地區，其中該疾病是由一組微小RNA病毒科的非脊髓灰質炎腸病毒所引起的，其中柯薩奇病毒A16型(CV-A16)和腸病毒71型(EV-A71)是最常見的病原。致命的EV-A71於1997年首次出現在馬來西亞的沙勞越，之後，1998年在台灣、並接著每年在任何一舍亞太地區國家中發生疫情大爆發。2008年在中國觀察到大量EV-A71爆發，且此疾病在中國和其他國家成為法定傳染病。根據世界衛生組織(WHO)的疫情更新(2013年12月11日)，在2013年，在各國之中，中國提報1,651,959起病例、其中死亡265人，越南提報71,627起病例報告、其中死亡19人，而日本提報294,535起病例，根據WHO，反映HFMD疾病深遠程度。在2013年5月，在澳洲新南威爾斯州，提報5例類脊髓灰質炎麻痺(1例在維多利亞州)、有27例嚴重EV-A71相關病例，這是已經在亞洲流行一段時間的EV-A71病毒株所造成的，直到最近才在澳洲發現，這意味著全球旅遊在促進疾病傳播上，扮演著重要的角色。在大多數HFMD病例發生地：中國，從2009年至2015年之間，仍持續在5月和6月份有定期的爆發高峰。 　　[0015] 在HFMD中，腸病毒係經排泄至糞便中，且在咽分泌物中也會發現。傳播與兒童之間的密切接觸和環境污染有關。疾病的特徵為急性發燒，伴隨在手掌、腳掌、臀部和膝蓋出現疹子，並在口頰的黏膜上出現水泡，通常在7-10天內緩解。然而，少部分患有HFMD的孩童會發生嚴重的中樞神經系統疾病，而這往往是致命的。 　　[0016] 主要涉及神經系統和心血管系統之嚴重HFMD疾病的表徵為諸如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫和心臟衰竭之症候群，通常只發生於EV-A71感染。在亞太地區，最具破壞性的神經症候群是腦幹腦炎，死亡率為百分之40-80。患有嚴重HFMD的孩童可能需要幾個月的時間來恢復，且在一些情況下，神經的損傷可能是永久性的。目前，未有具體的針對HFMD之抗病毒治療。 　　[0017] 關於疫苗的開發，有許多發表描述製備針對腸病毒A血清型諸如EV-A71和CV-A16的新穎疫苗方法，尤其是針對EV-A71型。受到EV-AV71疫情爆發影響最嚴重的國家-中國，有三家公司已經完成了不活化全病毒EV-A71單價疫苗的第III期試驗。這種疫苗的主要缺點係因為不完全滅活而導致的感染風險，以及生產過程中的環境風險。 　　[0018] 特別以EV-A71 VP1蛋白為基礎的次單元蛋白疫苗，已經在學術背景中進行了評估，尚未進一步擴大至商業開發。其中一個很好的實例是Wu等人的研究(Vaccine 20, 895-904(2002))，其中VP1次單元疫苗具致免疫性，而且會誘導中和抗體，但是其力價和效果期間並不如不活化全病毒疫苗對照組，只有在低力價病毒挑激中、但未在高力價病毒挑激中，觀察到產生體內的保護效果。 　　[0019] 此外，已使用更先進的最新技術針對EV-A71和CV-A16兩者開發原型疫苗和疫苗，目前已經進入早期臨床前階段。 　　[0020] 例如，腸病毒EV-A71型的病毒樣顆粒係由CHUNG等人(2006)(World J Gastroenterol 12(6)：921-927, 2006)、CHUNG等人(2008)(Vaccine 26：1855-1862, 2008)、及CHUNG等人(2010)(Vaccine 28：6951-6957, 2010)描述，揭示由EV-A71結構多肽VP0、VP1和VP3組成的EV-A71 VLP。 　　[0021] 此外，本案申請人稍早所公開的專利申請案國際公開號WO 2013/098655揭示了EV-A71、CV-A16和脊髓灰質炎病毒VLP包含VP0多肽、VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽和VP4多肽。 　　[0022] 由於EV-A71和CV-A16兩者都在東南亞同時流行，且引起HFMD的頻率大約相同，所以需要疫苗接種二種病原體以防止臨床HFMD疾病。在中國已進行單價不活化全病毒EV-A71疫苗的第III期臨床試驗，非常清楚地顯示，對於非EV-A71腸病毒並不會產生交叉保護的效果，如ZHU等人(The Lancet, 381：2024-2032, 2013)；ZHU等人(NEJM 370(9)：818-828, 2014)及LI等人(New England Journal of Medicine 370(9)：829-837, 2014)所示。 　　[0023] 不同腸病毒血清型之間缺乏交叉保護的作用呈現公共衛生的問題，特別是HFMD的領域。由於有數種腸病毒A血清型會引起臨床HFMD，但是只有EV-A71會導致嚴重的神經疾病和死亡，以EV-A71單一保護性疫苗治療，將只能預防EV-A71感染。 　　[0024] 預防EV-A71和其他腸病毒的有效疫苗，有強烈的需求，理想的是，應該是以二價疫苗的形式，作為最小程度的預防EV-A71和CV-A16感染，以提供完整的HFMD防護。 　　[0025] 此外，對於抵抗引起的神經疾病的腸病毒之疫苗，也有強烈的需求，而這種疫苗宜能提供保護以抵抗EV-A71和脊髓灰白質炎病毒兩者。 　　[0026] 抗手足口病(HFMD)的理想疫苗應至少為抗EV-A71和CV-A16兩者的二價疫苗。目前已研究了製備這種疫苗和疫苗製劑的數種策略。 　　[0027] 然而，在開發二價或多價疫苗的過程中，需要克服許多挑戰。一種包含單價腸病毒(諸如EV-A71和CV-A16)疫苗如的簡單混合物的商業化疫苗製劑應是可行的，但是疫苗的組份之間的免疫優勢和干擾是否會造成問題係未知，GONG等人(Journal of Virology 88(11)：6444-6452, 2014)。此外，這種方法還牽涉了二種或多種疫苗的疫苗開發和製造成本，且在世界上許多EV-A71和CV-A16是健康的風險因子地區，可能被禁止開發和銷售。 　　[0028] 然而，KU等人揭示：“由此，本研究的主要目的是判定包含EV71-VLP和CA16-VLP兩者的二價疫苗製劑是否誘發平衡的保護性免疫反應。結果顯示，二價VLP免疫作用引發對於該等病毒各者中和抗體反應係相當於對應單價VLP所誘發的程度，這表示就二種VLP誘發病毒特異性中和抗體的能力而言，二種VLP之間不存在干擾”，這表示，以實際的疫苗構築體、實際的疫苗組成物和在特定小鼠實驗中，就二種VLP誘發病毒特異性中和抗體的能力而言，二種VLP之間並不存在干擾和免疫優勢，這與在人的三價不活化脊髓灰質炎疫苗的經驗是相反的(KU, et al., Vaccine 32(34)：4296-303, 2014)。 　　[0029] 隨著越來越多先進的技術，已經將突變引入EV-A71 VLP疫苗中，以引入二價性。ZHAO等人(Scientific Reports 5：7878, 19 January 2015, DOI：10.1038/srep07878)揭示了一種經突變的EV-A71 VLP，其中在EV-A71 VP1的SP70胺基酸序列經替換成來自EV-A71 VLP中的CV-A16 VP1的同源SP70胺基酸序列(15個胺基酸中有4個不同)。雖然以突變的VLP進行免疫作用誘發了類似於EV-A71 VLP的抗EV-A71之強力的中和抗體反應，並且為新生小鼠提供了對於致死性EV-A71挑激的完整保護，但由突變或“嵌合型”VLP所誘發的中和抗體力價，針對CV-A16只有1：16。抗CV-A16中和抗體力價，遠低於先前使用不活化CV-A16疫苗所觀察到的抗CV-A16中和抗體的力價，其經報告指出誘導1：256的中和抗體力價，而CV-A16 VLP疫苗經報告指出誘導約1：128之中和抗體力價。因此，基於突變VLP所所誘發抗CV-A16的低量中和抗體力價，可得到的結論是，用於預防病毒感染的單一表位之療效係受到限制。 　　[0030] 上述的突變或所謂的“嵌合型”疫苗之實例使用線性表位並將彼等插入可能為EV-A71本身的載體中。該方法的問題之一是，經選擇以這種方式投遞的胜肽之療效。在大多數時，不同的群組之間，來自所使用之胜肽的結果並不總是具再現性，且所產生的中和抗體力價低，如同CHONG等人(Vaccines & Immunotherapeutics, 2012, 8：12, 1775-1783, DOI：10.4161/hv.21739)；及CHOU等人(Clinical and Developmental Immunology, 2012, DOI：10.1155/2012/831282)二篇回顧性論文中所述者。 　　[0031] 微小RNA病毒殼體結構特徵在於口袋因子(pocket factor)位於其中、穩定該殼體結構的峽谷樣結構(canyon)所包圍的五折頂點(five-fold vertex)。當病毒與其細胞受體相互作用時，受體通常與峽谷樣結構的壁結合、取代口袋因子並造成結構變化，導致病毒形成所謂的A顆粒，其中會有孔洞形成，使病毒基因體逃離進入該細胞。ROSSMANN等人(Trends in Microbiology(2002)vol10 No 7 324-331)已透徹地回顧了微小RNA病毒-受體的交互作用。因此，能夠阻斷殼體與病毒受體的交互作用之抗體，將發揮中和抗體及阻斷感染的作用。 　　[0032] EV-A71具有中和表位，其位於他處，而不是位在五折頂點，如PLEVKA等人(Proc. Natl. Acad. Sci. 111(6)：2134-9(2014))所示。在涉及VP3和VP2之間交互作用的雙折和三折軸上有中和的表位。 　　[0033] 腸病毒的VLP包含結構多肽VP0、VP1和VP3，可以從編碼腸病毒P1多肽和腸病毒3C和/或3CD蛋白酶的匣(cassette)製造(CHUNG, et al., World J Gastroenterol 12(6)：921-927, 2006)。 　　[0034] 申請人稍早所公開的專利申請案國際公開號WO 2013/098655顯示VLP可形成包含腸病毒VP0多肽、VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽和VP4多肽。此外，亦證實其中的VP2蛋白也含有中和抗體表位。 　　[0035] 目前尚未顯示可形成一種嵌合型殼體或嵌合型VLP，其中源自一個腸病毒的VP1多肽及VP0多肽和VP3多肽和/或另外來自不同腸病毒VP2多肽和VP4多肽自組裝(self-assemble)成VLP。 　　[0036] 目前尚未證實，這樣的嵌合型殼體或嵌合型VLP可以表現針對為該VP1、該VP0和VP3和/或另外VP2和VP4多肽來源的該等腸病毒中任一者或兩者之中和抗體表位。 　　[0037] 再者，目前尚未證實，這樣的殼體或嵌合型VLP作為疫苗可誘導針對為該VP1、VP0和VP3和/或另外VP2和VP4多肽來源的該等腸病毒兩者之保護和/或中和免疫反應。 　　[0038] 在疫苗領域中的確明瞭的是，還不清楚衍生自病原體的抗原是否會誘導保護性免疫。ELLIS(Chapter 29 of Vaccines, PLOTKIN, et al.(eds)WB Saunders, Philadelphia, at page 571,1998)在報告中例示了此問題：“該(疫苗開發)問題的關鍵是鑑定本身可誘導保護性抗體之產生、且由此保護宿主抵抗病原體的攻擊的病毒或微生物病原體之蛋白質組成。”在本發明中，已完成可行和具保護性VLP，其顯示預防腸病毒屬的多個成員。
[0039] 一種嵌合型病毒樣顆粒(VLP)，其係由腸病毒多肽VP0和VP3及異源性VP1多肽所組裝，其中該腸病毒係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D；此種 　　[0040] 嵌合型VLP，其係另由腸病毒多肽VP2和/或VP4所組裝；此種 　　[0041] 嵌合型VLP，其中該多肽VP0及VP3係衍生自腸病毒EV-A71且該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D；此種 　　[0042] 嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒CV-A16；此種 　　[0043] 嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒C；此種 　　[0044] 嵌合型VLP，其中該多肽VP0和VP3係衍生自腸病毒CV-A16且該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D；此種 　　[0045] 嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒EV-A71；此種 　　[0046] 包含嵌合型VLP之疫苗，該等嵌合型VLP係由腸病毒EV-A71的VP0和VP3多肽及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1多肽所組裝；此種 　　[0047] 疫苗，其中該等嵌合型VLP係另由腸病毒EV-A71的VP2和/或VP4多肽所組裝；此種 　　[0048] 疫苗，其中該嵌合型異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A；此種 　　[0049] 疫苗，其中該腸病毒A係CV-A16；此種 　　[0050] 疫苗，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒C；此種 　　[0051] 包含嵌合型VLP之疫苗，該等嵌合型VLP係由腸病毒CV-A16的VP0和VP3多肽及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1多肽所組裝；此種 　　[0052] 疫苗，其中該等嵌合型VLP係另由腸病毒CV-A16的VP2和/或VP4多肽所組裝；此種 　　[0053] 疫苗，其中該嵌合型異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A；此種 　　[0054] 疫苗，其中該腸病毒A係EV-A71；此種 　　[0055] 疫苗包括一或多種疫苗佐劑，此種 　　[0056] 疫苗，其中該(等)佐劑係選自ISCOMS、明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、Quil A或其他皂素；此種 　　[0057] 嵌合VLP，其係使用於疫苗，該疫苗供接種個體以抵抗多於一種腸病毒之感染，該使用包含投予該個體有效量的該嵌合型VLP以當被投予該個體時誘導針對該多於一種腸病毒的保護和/或中和免疫反應；此種 　　[0058] 在個體內提供免疫反應和/或中和免疫反應以抵抗多於一種腸病毒的感染之方法，該方法包含投予該個體有效量的嵌合型VLP以提供此種免疫反應和/或中和免疫反應；此種 　　[0059] 編碼核酸之表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼嵌合型腸病毒多肽P1的核酸之啟動子，該嵌合型多肽P1包含腸病毒結構多肽VP0和VP3及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1結構多肽，其中該編碼該嵌合型腸病毒多肽P1的核酸係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)及腸病毒3CD蛋白酶之核酸，其中該3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下；此種 　　[0060] 表現匣，其中該腸病毒結構多肽VP0和VP3係來自腸病毒EV-A71；此種 　　[0061] 表現匣，其中該異源性VP1結構多肽係來自腸病毒CV-A16；此種 　　[0062] 表現匣，其中該腸病毒結構多肽VP0和VP3係來自腸病毒CV-A16；此種 　　[0063] 表現匣，其中該異源性VP1結構多肽係來自腸病毒EV-A71；此種 　　[0064] 表現匣，其中該編碼該IRES的核酸序列係來自腦心肌炎病毒(EMCV)；此種 　　[0065] 表現匣，其中該編碼該IRES的核酸序列係已經基因修飾；此種 　　[0066] 表現匣，其中該編碼該3CD的核酸序列係已經基因修飾；此種 　　[0067] 表現匣，其中該IRES係衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)或腸病毒；此種 　　[0068] 製造嵌合型腸病毒VLP之方法，該方法包含將包含表現匣的宿主細胞培養足以製造該嵌合型腸病毒多肽P1及腸病毒3C或3CD蛋白酶及足以形成VLP的一段時間之步驟；此種 　　[0069] 方法另包含自該宿主細胞回收該等VLP之步驟；此種 　　[0070] 方法，其中該宿主細胞係真核細胞。
[0081] 本發明提供用於抵抗多於一種腸病毒的保護和/或治療之嵌合型病毒樣顆粒(VLP)。本發明另提供用於抵抗多於一種腸病毒的保護和/或治療之致免疫性組成物和/或疫苗形式之嵌合型病毒樣顆粒(VLP)。更特定言之，本發明提供嵌合型EV-A71病毒樣顆粒，其展現CV-A16的VP1多肽/表位且同時維持重要的EV-A71本身之重要的中和抗體表位。因此，本發明提供包含嵌合型病毒樣顆粒之疫苗，該嵌合型病毒樣顆粒誘導對EV-A71及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D之成員及任何這些病毒種之血清型病毒的不同腸病毒兩者之免疫反應和/或中和抗體反應。 　　[0082] 更特定言之，本發明提供包含嵌合型病毒樣顆粒之疫苗，該嵌合型病毒樣顆粒誘導針對包含一或多個EV-A71的VP0、VP2、VP3和/或VP4表位的多於一種腸病毒及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的不同腸病毒和任何這些病毒種之血清型病毒的一或多個VP1表位之免疫反應和/或中和抗體反應。令人驚訝地，經發現，此等嵌合型VLP事實上可組裝以形成安定的病毒樣顆粒。更重要地，此等病毒樣顆粒展現一或多個EV-A71的VP0、VP2、VP3和/或VP4表位及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的不同腸病毒和任何這些病毒種之血清型病毒的一或多個VP1表位。此等嵌合型VLP，當經以有效劑量投予時，誘導免疫反應和/或中和抗體反應，以抵抗由有該VP1的病毒種及血清型所造成的腸病毒感染及抵抗EV-A71兩者。 　　[0083] 本發明因此提供包含病毒樣顆粒之疫苗及疫苗調合物，該等病毒樣顆粒包括EV-A71多肽VP0和VP3、及隨意之腸病毒多肽EV-A71 VP2和/或VP4、及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1多肽。此等嵌合型病毒樣顆粒經顯示提供抵抗多於一種腸病毒的保護和/或中和抗體反應。為了澄清，此等免疫反應和/或中和抗體反應係針對多於一種腸病毒血清型，該反應係不同於抵抗相同血清型內的不同株之免疫反應和/或中和抗體反應。 　　[0084] 因此，本發明之VLP可包含選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之VP1多肽，該VP1多肽可包含該腸病毒之全部VP1序列。因此，本發明之VLP可包含選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之VP1多肽，該VP1多肽可包含選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之全部VP1序列，且另外來自異源性腸病毒VP3多肽C端部分側翼之達至50個胺基酸。或者，該VP1多肽可係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的該腸病毒之經截斷之VP1多肽，其另包含來自對應及同源於該些經刪除之該腸病毒VP1多肽胺基酸的異源性腸病毒的VP1多肽胺基酸。 　　[0085] 在一實施態樣中，該等嵌合型VLP包含腸病毒EV-A71的VP0和VP3多肽及腸病毒CV-A16的VP1多肽。 　　[0086] 在又一實施態樣中，該等嵌合型VLP包含腸病毒CV-A16的VP0和VP3多肽及腸病毒EV-A71的VP1多肽。 　　[0087] 在另外的實施態樣中，該等嵌合型VLP包含腸病毒EV-A71的VP0和VP3多肽及腸病毒脊髓灰白質炎病毒-1(PV1)的VP1多肽。 　　[0088] 本發明在另外態樣中包括用於製造該等嵌合型VLP之方法，該方法可包括下列步驟：(i)構築表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼嵌合型腸病毒P1多肽的核酸之啟動子，該核酸係可操縱地連接至內核糖體進入位點(IRES)，該IRES核酸亦係可操縱地連接至編碼腸病毒3C或3CD蛋白酶的核酸；(ii)以含有該表現匣的構築體轉染、轉形或感染適合的宿主細胞；(iii)在細胞於表現該匣中所包含的核酸後製造嵌合型病毒樣顆粒(VLP)的條件下培養該宿主細胞。 　　[0089] 在該表現匣中製造3CD蛋白酶截斷及突變可達到VLP的產率增加。舉例而言，EV-A71的3C蛋白酶之甘胺酸，其係GenBank登錄號DQ341362.1的第1671個胺基酸，可使用定點突變而有利地改變成丙胺酸(G1671A)，以表現EV-A71 3C突變型並之後加工腸病毒P1多肽。 　　[0090] 所提供的是係經選殖至載體(諸如例如桿狀病毒載體)中的表現匣，其經轉形、轉染或感染至適當的原核或真核宿主細胞中，諸如例如昆蟲細胞(諸如但不限於秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(例如Sf9細胞)，以表現並純化本發明之VLP。 　　[0091] 嵌合型P1多肽係經構築，其中包含在該P1多肽之結構多肽VP0和VP3係來自一種腸病毒種或血清型，且VP1結構多肽係衍生自異源性腸病毒種或血清型。 　　[0092] 在一實施態樣中，嵌合型P1多肽係經構築，其中該VP0和VP3結構多肽來自腸病毒EV-A71且該VP1結構多肽來自脊髓灰白質炎病毒(PV)。 　　[0093] 在一進一步實施態樣中，嵌合型P1多肽係經構築，其中該VP0和VP3結構多肽來自腸病毒EV-A71且該VP1結構多肽來自CV-A16。 　　[0094] 在另一實施態樣中，嵌合型P1多肽係經構築，其中該VP0和VP3結構多肽來自腸病毒CV-A16且該VP1結構多肽來自EV-A71。 　　[0095] 自該等表現匣所製造之該等嵌合型VLP展現結構殼體多肽，其表示該等嵌合型P1多肽業經EV-A71的3CD蛋白酶加工，且該等結構殼體多肽係經組裝成VLP。 　　[0096] 本發明之嵌合型VLP係使用EV18及EV19來分析，EV18及EV19係EV-A71特異性單株抗體，其辨識自VP0/2及VP3多肽(天然EV-A71病毒)適當組裝所形成之表位。這些單株抗體的結合足跡已述於PLEVKA等人之發表。亦使用Mab979(Merck Millipore)來分析本發明之嵌合型VLP。MAb979係商業上可獲得單株抗體，其辨識腸病毒VP2結構多肽中的直鏈表位。 　　[0097] 所顯示的是，單株抗體EV18及EV19的四級表位存在於嵌合型SXT8 VLP上，這顯示殼體蛋白的正確組裝，該等嵌合型VLP具有完整EV-A71特異性VP0/2及VP3中和表位。 　　[0098] 因此，該等嵌合型VLP含有經組裝之顆粒，其中該等嵌合型VLP之該VP0/2及VP3多肽係完整且具功能性，儘管事實上這些嵌合型VLP中的VP1結構多肽係來自CV-A16而非EV-A71。 　　[0099] 再者，經證實，來自經免疫接種的動物、針對嵌合型SXT8 VLP(含有CV-A16 VP1結構多肽)之血清抗體辨識CV-A16 VP1多肽。 　　[0100] 示於表1之結果證實由EV-A71 VP0/2及VP3結構多肽、及來自CV-A16的VP1結構多肽組成的嵌合SXT8 VLP誘導針對來自EV-A71及CV-A16兩者結構多肽之強烈免疫反應。 表1. [0101] 這證實EV-A71的重要功能性表位被保留，顯示該等VLP經正確組裝，且來自CV-A16的該等異源性VP1多肽亦係完整，致免疫性地展現在VLP上，且也誘導強烈抗體反應。 　　[0102] 又，本發明之嵌合型VLP經證實誘導抗EV-A71及CV-A16腸病毒兩者的保護和/或中和抗體反應。 　　[0103] 因此，二價疫苗可利用由本發明之該等嵌合型VLP組成的單一免疫原而達成。此等嵌合型VLP提供誘導二價免疫反應之表位，該反應預防EV-A71及CV-A16腸病毒兩者之感染。 　　[0104] 此發明所提供之嵌合型VLP由此能夠達成利用單一嵌合型VLP的二價腸病毒疫苗，因此可更便利製造此疫苗。因此，可更容易及價廉地製造二價腸病毒疫苗而不用一起製造、純化及混合多種不佳VLP、次單元、或抗原以達到二價性。 醫藥調合物(pharmaceutical Formulation)： 　　[0105] 可用於醫藥的包含本發明之嵌合型VLP之組成物可根據已知方法來調配，諸如摻和醫藥上及免疫上可接受之載體和/或佐劑和/或另外抗原決定位(antigenic determinant)。此等調合物之載體及方法的實例可見於Remington’s Pharmaceutical Sciences。為形成適用於有效投予醫藥上可接受之組成物，此等組成物會含有有效量的一或多種本發明之VLP。此等組成物可含有衍生自多於一種腸病毒之VLP。 　　[0106] 本發明之疫苗組成物可以足以誘導針對多於一種腸病毒的免疫反應和/或中和抗體反應的量投予至個體。該有效量可根據各種因素而異，諸如個體病況、體重、性別及年齡。其他因素包括投予模式。疫苗可藉由各種路徑提供個體，諸如皮下、局部、口服、黏膜、靜脈內、非經腸胃、及肌內。 　　[0107] 包含一或多種本發明之嵌合型VLP之疫苗可含有本技術領域中已熟知的另外抗原決定位和/或佐劑以在宿主內誘導免疫反應和/或中和抗體反應。此等疫苗通常安全且不具有毒性副作用，可藉由有效路徑來投予、安定、且相容於本技術領域中已知的疫苗載體。 　　[0108] 該疫苗可以本技術領域中已知的劑型投予，諸如例如、但不限於注射劑、膠囊、懸浮液、酏劑、或液態溶液形式。該疫苗可以單劑或多劑投予。本發明另一態樣包括一或多種本發明之VLP併以一或多種適合的佐劑，諸如ISCOMS、明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、Quil A及其他皂素或任何其他佐劑，如VANSELOW(1987)S. Vet. Bull. 57 881-896中所述者。用語“磷酸鋁”及“氫氧化鋁”的意義，如本文中所使用，包括適用於佐劑疫苗的所有磷酸鋁或氫氧化鋁形式。 定義： 　　[0109] 二價(bivalent)：二價當用於描述VLP時，意指VLP將誘導針對腸病毒屬二個成員的免疫反應。 　　[0110] 嵌合型(chimeric)：當用於描述VLP時，嵌合型是指VLP，其中一種腸病毒的結構多肽或殼體蛋白已被來自異源性腸病毒的相應結構多肽或殼體蛋白所置換。嵌合型VLP並非意指有胺基酸突變或在一或多個表位中有突變的VLP。 　　[0111] 異源性腸病毒(heterologous Enterovirus)：異源性腸病毒係屬於不同科、屬、血清型、基因群(genogroup)或株的二或更多種腸病毒。 　　[0112] 中和免疫反應(neutralizing immune response)：中和免疫反應是免疫系統特化細胞辨識抗原呈現、並啟動特異性免疫反應而預防來自例如病毒的病原的感染之免疫反應。 　　[0113] 在一實施態樣中，根據本發明之VLP可誘發免疫反應。用語“免疫反應”和/或“中和抗體”如本文中所使用，意欲表示經接種的個體可自身抵抗或預防投予疫苗接種所抵抗之病原體感染。 　　[0114] 可操縱地連接(operably linked)：可操縱地連接意指所描述的組件處於允許彼等以其預期方式發揮功能的關係中。因此，例如，與核酸“可操作地連接”的啟動子意指順反子或多於一個順反子的啟動子和核酸以此方式連接而會產生單一順反子、單一雙順反子、或單一多順反子信使RNA(mRNA)。信使RNA的蛋白質表現可根據啟動子和/或核酸的轉錄/轉譯元件來調控。在另一實例中，以在順反子上游(5’)的方向插入表現匣中的內核糖體進入位點(IRES)序列意指IRES序列和順反子的核酸連接的方式而在IRES下游、順反子mRNA轉譯係在IRES的控制下調控。 　　[0115] 病毒樣顆粒(virus-like particle)：病毒樣顆粒是病毒結構多肽、即殼體蛋白的組裝，該多肽組裝類似於與它們在結構上衍生的真正病毒，然而，VLP不包含病毒基因體。腸病毒VLP不包含RNA基因體。 　　[0116] 腸病毒P1：腸病毒P1多肽是腸病毒的主要結構多肽，可從中截切個別結構多肽VP0、VP1、VP2、VP3和VP4。結構多肽順序在P1多肽上的排列從N端開始是VP0、VP3和VP1。在RNA基因體包被在天然病毒中的期間，VP0經切割成多肽VP4和VP2。 實施例1. 嵌合型腸病毒P1多肽之構築 　　[0117] 腸病毒屬的所有成員，包括EV-A71、脊髓灰白質炎病毒和CV-A16均具有單股正義RNA基因體，其具有單一開讀框，其編碼P1多肽(由結構多肽VP0、VP1、VP2、VP3及VP4組成)，且該基因體編碼數種非結構蛋白(包括病毒蛋白酶3C和3CD，其負責截切P1多肽成個別結構多肽VP0、VP3和VP1)，其中VP0最終會經截切成VP2和VP4。 　　[0118] 嵌合型P1多肽係經構築，其中包含在該P1多肽之該結構多肽VP0和VP3係來自一種腸病毒種或血清型，且該VP1結構多肽係衍生自異源性腸病毒種或血清型。參見圖1A，其示出了腸病毒的P1多肽之組成物的組織。圖1B示出了具有一個異源性VP1結構多肽之嵌合P1多肽的組織，該異源性VP1結構多肽源自於與VP0和VP3結構多肽來源不同的腸病毒。 　　[0119] 在一個實施例中，構築出一個嵌合型多肽P1，其中VP0和VP3結構多肽係源自於腸病毒EV-A71，且VP1結構多肽源自於CV-A16。 　　[0120] 在另一個實施例中，構築出一個嵌合型多肽P1，其中VP0和VP3結構多肽係源自於腸病毒CV-A16，且VP1結構多肽源自於EV-A71。 　　[0121] 在進一步的實施例中，構築出一個嵌合型多肽P1，其中VP0和VP3結構多肽係源自於腸病毒EV-A71，且VP1結構多肽源自於脊髓灰白質炎病毒。 　　[0122] 可從 GenBank中取得腸病毒EV-A71和腸病毒CV-A16 以及脊髓灰白質炎病毒的全基因體序列，可於National Center for Biotechnology Information(NCBI)存取。 　　[0123] 可利用以下方式，建構出一個可編碼此一嵌合多肽P1的重組DNA分子：可使用適當設計而與腸病毒的核酸序列互補的引子，經由PCR增幅獲得編碼腸病毒結構多肽和蛋白酶的開放閱讀框。合適的引子可根據標準技術，利用可公開獲得的腸病毒核酸序列來設計，例如，可在 GenBank 中取得的完整基因體序列，可於National Center for Biotechnology Information(NCBI)存取。此外，遺傳序列可以透過本領域中已知的基因合成技術重新合成。 　　[0124] 例如，EV-A71的完整基因體的GenBank登錄號包括DQ341362、AB204852、AF302996和AY465356；而人類腸病毒CV-A16的完整基因體GenBank 登錄號包括KF924762.1；人類腸病毒C脊髓灰白質炎病毒I型基因體的完整基因體的GenBank 登錄號包括V01149和V01150。 實施例2. 構築表現匣以獲得嵌合型VLP。 　　[0125] 入門殖株pSN01已用於產生重組的桿狀病毒，該桿狀病毒可用於生產腸病毒VLP 的表現匣。入門殖株 pSN01係源自於PCT國際申請號PCT/IB2012/003114中所描述的工作，請參見實施例1、圖1，且其係重組的桿狀病毒表現構築體，SN07的來源，於PCT/IB2012/003114中描述。 　　[0126] 在圖10中所描繪的pSN01含有一種表現匣，其攜帶一個編碼腸病毒EV-A71 P1多肽、IRES及一個從EV-A71導出3CD蛋白酶的核酸。 　　[0127] pSN01可用於產生另一個表現匣，其攜帶來自於不同的腸病毒的P1多肽。這樣的表現匣的一個實例，可以是一個表現匣，其攜帶一個編碼腸病毒EV-A71 P1多肽、IRES及一個從EV-A71導出3CD蛋白酶的核酸。 　　[0128] 進行了廣泛的生物信息學分析，以識別用於腸病毒CV-A16 P1的共有的胺基酸序列，且CV-A16 P1 編碼的DNA序列進行了密碼子優化，使其具有物種專一性表現。 　　[0129] pSN01被用來產生表現匣，其中腸病毒CV-A16 的P1編碼序列取代了pSN0 1中的EV-A71編碼序列。CV-A16 P1編碼序列係經過優化的密碼子，用於在昆蟲細胞中表現，且經由本領域技術人員已知的方法合成P1編碼序列。在pSN01中的腸病毒EV-A71 P1經由本領域中已知的方法替換成CV-A16的P1編碼序列。這種結構會產生攜帶一個包含CV-A16P1多肽、IRES和源自於EV-A71之3CD蛋白酶的表現匣的質體pSXT6。 　　[0130] 例如，密碼子優化的CV-A16 P1基因係利用一個編碼區域的BgIII 位點上游(5’)、一個部分IRES及P1終止密碼子下游的BgII位點所合成的。將合成的DNA分子選殖到pUC57中。pUC57-CV-A16 P1- IRES(部分)BgII質體以BgII 和 BgIII消化，且純化含CV-A16 P1-IRES(部分)的BgII/BgIII DNA片段。pSN01 以BgII 和 BgIII 及BgII/BgIII 和pSN01的載體片段消化，其中，該EV-A71 P1-IRES(部分)已經被移除，經過純化並用作CV-A16 P1 DNA片段的載體。將純化的CV-A16 P1- IRES( 部分)DNA片段選殖到BgII/BgIII 消化的pSN01載體，便得到了CV-A16 P1-IRES-EV-A71 3CD表現構築體。 　　[0131] 這種結構產生了攜帶一個含CV-A16P1多肽、IRES和EV-A71衍生的3CD蛋白酶的表現匣的質體pSXT6。 　　[0132] pSN01 和pSXT6 被用來生成攜帶一個含嵌合P1多肽、IRES及自EV-A71衍生之3CD蛋白酶的桿狀病毒表現構築體。為了產生重組的桿狀病毒，以限制性內切酶 NdeI消化pSN01和pSXT6。 　　[0133] 將DNA片段，包括從限制性內切酶NdeI消化而得到的 NdeI質體載體片段進行純化。 　　[0134] 將包含EV-A71 VP1編碼序列的NdeI片段連接至NdeI消化的pSXT6質體載體中。簡而言之，將pSXT6中的EV-A71 VP1編碼序列換成CV-A16的VP1編碼序列。此一交換可以產生一個穿梭載體bacSXT7，其包含一個含有嵌合P1編碼序列的表現匣，尤其是CV-A16 VP0和VP3的編碼序列，以及來自EV-A71的VP1的編碼序列。請參閱圖2B，其為桿狀病毒表現構築體SXT7 的表現匣之圖形表示。 　　[0135] 將包含來自於CV-A16之VP1編碼序列的NdeI片段連接至NdeI 消化的pSN01質體載體中。簡而言之，將pSN01中的EV-A71 VP1編碼序列換成CV-A16 VP1編碼序列。此一交換可以產生一個穿梭載體bacSXT8，其包含一個含有嵌合P1編碼序列的表現匣，尤其是EV-A71 VP0和VP3的編碼序列，以及來自CV-A16的VP1的編碼序列。請參閱圖2A，其為桿狀病毒表現構築體SXT8的表現匣之圖形表示。 　　[0136] 依照標準的實驗步驟程序，例如Baculovirus Expression Vector Systems(BEVS)及 Insect Cell Culture Techniques(Waltham, MA)的Invitrogen’s Guide中所描述的實驗步驟程序，從bacSXT7或bacSXT8救出(rescue)重組的桿狀病毒，其含有它們各自的表現匣。特別是，重組的穿梭載體bacSXT7和重組的穿梭載體 bacSXT8使用PureLink® HiPure Plasmid Miniprep(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)進行純化，然後按照標準的實驗步驟程序轉染入Sf9細胞。3天後，收集上清液並指定為第1代(P1)的桿狀病毒存料(stock)。這是一個小規模的低滴定桿狀病毒存料，其感染Sf9細胞以增幅，而產生第2代(P2)桿狀病毒存料。第2代桿狀病毒用於感染Sf9細胞，以產生第3代(P3)的桿狀病毒存料，然後將其用於評估嵌合型VLP的表現。 　　[0137] 由bacSXT7產生的重組桿狀病毒被指定為SXT7。由bacSXT8產生的重組桿狀病毒被指定為SXT8。 　　[0138] 用於提供嵌合型VLP之構築體的表現匣的組成物之示意圖示，如圖2A和2B所示。桿狀病毒SXT8構築體的表現匣之核苷酸序列為SEQ ID NO：1。桿狀病毒SXT7構築體的表現匣之核苷酸序列為SEQ ID NO：2。 實施例3. 感染了Sf9細胞嵌合型VLP的桿狀病毒SXT7構築體或桿狀病毒SXT8構築體之表現。 　　[0139] 以0.01的病毒感染劑量(MOI)，將Sf9細胞感染桿狀病毒SXT7或桿狀病毒SXT8，並於接種後第3天收集。將培養物以3100xg 15℃離心30分鐘。將沉澱物以PBS洗滌一次，再懸浮於含有0.1%的TritonX100和無EDTA的蛋白酶抑製劑混合物(Sigma)的低滲透壓的緩衝液(1.5 mM MgCl2 ，50 mM氯化鉀、20 mM HEPES)，然後在室溫(RT)下搖晃30分鐘。接著以6600xg在4℃離心20分鐘，使細胞裂解物變得澄清。 　　[0140] 作為對照組，將Sf9細胞感染桿狀病毒SN07(在PCT International Application No. PCT/IB2012/ 003114中描述)。桿狀病毒SN07源自於表現株pSN01且包含一個來自人類的天然P1多肽腸病毒EV-A71。 　　[0141] 感染桿狀病毒SXT7、桿狀病毒SXT8或桿狀病毒SN07的細胞之裂解物，經由SDS-PAGE在12%凝膠上分離，然後電轉移到硝酸纖維素膜上。將膜以含有5%脫脂牛奶的PBS在室溫下進行阻斷反應1小時，然後利用稀釋比例為1：10,000的抗EV-A71 VP1之超免疫兔多株抗體作為探針，在室溫下培養過夜進行偵測。與辣根過氧化物酶(HRP)共軛之抗兔IgG抗體一同培養後1小時後，再與TMB基質於室溫下培養10分鐘進行顯色，以偵測結合的抗體。 　　[0142] 圖3中的西方印漬示出了自桿狀病毒SN07(軌跡2)得到的VLP的EV-A71 VP1多肽，以及從桿狀病毒SXT7的表現所得到的嵌合型VLP的EV-A71 VP1多肽(軌跡4)，可藉由多株兔抗EV-A71 VP1抗體而清楚地識別。從包含CV-A16 VP1的桿狀病毒SXT8之表現所得到的嵌合型VLP之西方印漬軌跡(軌跡3)，示出了只有低分子量的亮帶並未以抗EV-A71 VP1多株抗體清楚地識別，且抗體對於CV-A16 VP1多肽展現出交叉反應的特性。 　　[0143] 圖3進一步表明，從VP1結構多肽所產生之表現匣，會表現嵌合型VLP，這表示該嵌合P1經過EV-A71 3CD蛋白酶處理，且結構多肽被組裝成具免疫原性的VLP。 實施例4. 感染了桿狀病毒SXT7或桿狀病毒SXT8之Sf9細胞中嵌合型VLP之表現。 　　[0144] 感染桿狀病毒SXT7、桿狀病毒SXT8，或桿狀病毒SN07的細胞之裂解物經由SDS-PAGE在12%凝膠上進行分離，然後電轉移到硝酸纖維素膜上。膜以含有5%脫脂牛奶的PBS在室溫下進行阻斷反應1小時，然後以抗CV-A16 VP1的小鼠單株抗體(F6/2/A1-1/2/A3)作為探針，在室溫下培養過夜進行偵測。以與辣根過氧化物酶共軛之抗小鼠IgG抗體一同培養後1小時後，再與TMB基質於室溫下培養10分鐘進行顯色，以偵測結合的抗體。 　　[0145] 圖4中的西方印漬示出了自桿狀病毒SN07(軌跡2)得到的VLP的EV-A71 VP1多肽，以及從桿狀病毒SXT7的表現所得到的嵌合型VLP的EV-A71 VP1多肽(軌跡4)，無法藉由抗CV-A16 VP1專一性單株抗體F6/2/A1-1/2/A3所識別。不過，從桿狀病毒SXT8之表現所獲得的嵌合型VLP的CV-A16 VP1多肽(軌跡3)清楚地顯示出CV-A16 VP1多肽的存在(箭頭)。這表示，從桿狀病毒SXT8之表現所獲得的VLP之VP1結構多肽係CV-A16 VP1多肽。 實施例5. 由重組的桿狀病毒SXT7所製造的VLP可產生抗EV-A71結構多肽VP1抗體，但並不會抗EV-A71結構多肽VP0。 　　[0146] 以桿狀病毒SXT7(含有EV-A71 VP1結構多肽)表現所得到的嵌合型VLP進行免疫的小鼠所採集的血清，利用間接的ELISA進行檢測，其中細胞培養孔塗覆EV-A71 VP1多肽作為抗原以進行測試。 　　[0147] 將塗覆了重組的次單元EV-A71 VP1多肽抗原(圖5，圖A)或EV-A71 VP0多肽抗原(圖5，圖B)之ELISA微量盤，與取自於由桿狀病毒SXT7獲得之嵌合型VLP進行免疫之小鼠的血清進行反應，或是與取自於由非嵌合型桿狀病毒SN07之VLP進行免疫之小鼠的血清進行反應(描述於PCT/IB2012/003114中)。 　　[0148] 圖5示出了取自於由桿狀病毒SXT7獲得之VLP進行免疫之小鼠的血清及由桿狀病毒SN07獲得之VLP進行免疫之小鼠的血清，都包含可以與EV-A71 VP1多肽抗原結合的抗體，參見圖A。然而，只有由非嵌合型桿狀病毒SN07之VLP進行免疫之小鼠的血清，含有可以與EV-A71 VP0結構多肽抗原結合的抗體(圖B)。 　　[0149] 因此，由桿狀病毒SN07取得之非嵌合型VLP進行免疫之小鼠的血清或由桿狀病毒SXT7取得之嵌合型VLP進行免疫之小鼠的血清，都含有可與EV-A71 VP1結構多肽抗原結合的抗體。由桿狀病毒SXT7取得之嵌合型VLP進行免疫之小鼠的血清無法與EV-A71 VP0多肽抗原結合，是因為EV-A71 VP0多肽並未從SXT7表現匣表現。 實施例6. 證明從桿狀病毒SXT8所得到的VLP可表現出如在天然EV-A71病毒所發現到的功能性EV-A71中和表位。 　　[0150] 將細胞培養孔塗覆兔的多株抗體，其對於來自EV-A71和CV-A16的腸病毒A VP1結構多肽具有抗體交叉反應。細胞培養孔以牛血清白蛋白阻斷反應，且受到桿狀病毒SXT8感染之Sf9細胞的裂解物以1：10的比例稀釋，並加入到培養孔中，並且在室溫下培養1小時。塗覆的兔多株抗體將與任何含有VP1結構多肽的VLP結合。 　　[0151] 將第二種抗體加入細胞培養孔中，以偵測在VLP上發現的表位，如VP2結構多肽和VP3結構多肽，或從VP2結構多肽和VP3結構多肽中的任何一個或組合所形成的任何不連續表位。 　　[0152] 單株抗體E18、E19和MAB979的檢測，係於3個獨立的細胞培養孔組中進行。將這些單株抗體添加至培養孔中，並在室溫下培養1小時。與培養孔上的VLP結合的單株抗體之偵測，可透過加入與HRP共軛的抗小鼠IgG，並且在室溫下培養1小時。顯色的步驟是加入TMB基質，並且在室溫下作用5分鐘。加入0.1N 的HCl 終止溶液，在450nm吸光度下測量光密度(OD 450 )。 　　[0153] E18和E19係對於EV-A71四元表位具有專一性的單株抗體，而且只會與該病毒結合或與具有這些構象表位的VLP結合。MAb979係可以識別腸病毒A之VP2結構多肽中的線性表位的單株抗體，而且應該與EV-A71 VP2結構多肽以及CV-A16 VP2結構多肽結合。 　　[0154] 圖6示出了由桿狀病毒SXT8所生產的嵌合型VLP經由腸病毒VP1多株抗體，結合至ELISA微量盤的培養孔中。此外，圖中示出了該嵌合型VLP表現出的表位，可由全部三種單株抗體(EV18、EV19及MAb979)識別。 　　[0155] EV18和EV19係對於EV-A71有專一性的單株抗體，可識別從VP0/2和天然EV-A71病毒的VP3的正確地組裝形成的表位。這些單株抗體的結合印跡已在PLEVKA, et al的出版物中描述。 　　[0156] MAb979(Merck Millipore)係市售的單株抗體，其可以識別腸病毒VP2結構多肽中的一個線性表位。因此，本實施例和圖6顯示，由桿狀病毒SXT8所產生的嵌合型VLP係經過組裝的顆粒，且該嵌合型VLP的VP0/2和VP3多肽係完整的且具功能性的，儘管事實為，這些VLP的VP1結構多肽來自CV-A16，而不是EV-A71。 　　[0157] 可以得到的結論為，單株抗體EV18和EV19的四元表位存在於由桿狀病毒SXT8感染的細胞中獲得的嵌合型VLP，這表示殼體蛋白係正確地組裝的，具有完整的EV-A71專一性VP0/2和VP3中和表位。 實施例7. 證實當重組的桿狀病毒SXT8所生產的VLP被用於免疫小鼠，並未產生抗EV-A71 VP1的抗體。 　　[0158] 來自於桿狀病毒SXT8之嵌合型VLP所免疫的小鼠之血清(含有CV-A16 VP1結構多肽)，以及來自於桿狀病毒SN07之嵌合型VLP所免疫的小鼠之血清，如實施例5，以間接ELISA進行測試，其中ELISA微量盤的培養孔以重組EV-A71 VP1結構多肽塗覆以作為抗原。 　　[0159] 圖7A示出了只有來自於由桿狀病毒SN07獲得之非嵌合EV-A71的VLP所免疫的小鼠血清，才包含可以和EV-A71 VP1多肽抗原結合的抗體。由SXT8獲得之VLP免疫的小鼠的血清(其組裝如同實施例6和圖6中的VLP)無法與EV-A71 VP1結構多肽抗原結合，這是因為該VLP包含CV-A16 VP1多肽。 　　[0160] 此外，很顯然的，二組小鼠的相同血清(以來自於桿狀病毒SXT8的VLP進行免疫或以來自於桿狀病毒SN07的VLP進行免疫)包括可與EV-A71 VP0結構多肽結合的抗體，如圖7B所示。 實施例8. 以抗嵌合型SXT8 VLP免疫的動物之血清抗體(包含CV-A16 VP1結構多肽)可識別CV-A16 VP1。 　　[0161] ELISA微量盤的培養孔塗覆了來自EV-A71和CV-A16的純化的VP1結構多肽或VP0結構多肽。以受到桿狀病毒SXT8感染的細胞所獲得的嵌合型VLP進行免疫的動物之血清(含有CV-A16 VP1結構多肽)加入培養孔中，以1：500至1：16000連續稀釋的比例，在室溫下培養1小時。與培養孔中的抗原結合的抗體之偵測，係透過與HRP共軛之抗小鼠IgG在室溫下一起培養1小時。清洗後，顯色的步驟係加入TMB基質，並且在室溫下作用5分鐘，接著加入0.1N 的HCl 終止溶液。在450 nm波長下測量吸光度(OD 450 )。 　　[0162] 表1顯示以SXT8 VLP免疫的動物血清中，針對各個來自CV-A16和EV-A71的結構多蛋白之抗體的力價。 　　[0163] 不令人意外的是，血清的抗體可識別EV-A71的VP0，而無法識別CV-A16的VP0結構多肽。 　　[0164] 此外，該血清的抗體識別CV-A16的VP1，而且無法識別EV-A71的VP1結構多肽。 　　[0165] 在表1所示出的結果顯示，嵌合型SXT8的VLP，其由EV-A71 VP0/2和VP3結構多肽以及來自CV-A16的VP1結構多肽所組成，會引發針對相關的結構多肽的免疫反應。具體而言，血清中含有對於EV-A71的VP0多肽產生強烈反應的抗體，而不會對於CV-A16的VP0多肽產生強烈的反應，因為CV-A16的VP0並非嵌合型VLP的組成物之一。然而，血清中還含有對於CV-A16的VP1多蛋白產生強烈反應的抗體，但是對於EV-A71的VP1多肽只會產生非常微弱的反應。 　　[0166] 關於由桿狀病毒SXT8獲得的VLP，已證實EV-A71的重要功能性表位係獲得保留的，這表示VLP被正確地組裝，而且來自CV-A16的異源VP1多肽也是完整的，這表現於VLP上，也會引起強烈的抗體反應。 實施例9. 以嵌合型VLP免疫的小鼠之血清中存在著抗體 　　[0167] 以來自桿狀病毒SXT7的嵌合型VLP免疫的動物之血清，或是來自桿狀病毒SXT8的嵌合型VLP免疫的動物之血清中，存在著抗EV-A71和CV-A16的抗體。細胞培養孔塗覆模擬感染、EV-A71-感染，或CV-A16感染的橫紋肌肉瘤(RD)細胞的裂解物。以來自桿狀病毒SXT7的嵌合型VLP免疫的動物或以來自桿狀病毒SXT8的嵌合型VLP免疫的動物之血清，以1/100的比例稀釋後加入培養孔中。小鼠以對照組的抗原FGUS進行免疫。清洗培養孔，然後用HRP共軛的抗小鼠抗體進行培養。加入TMB基質並於450nm測量光密度(OD)。淨OD值之計算，係將塗覆RD感染的細胞裂解物的OD值，減去模擬感染RD細胞的裂解物的OD值。 　　[0168] 圖8中的結果顯示，以對照抗原FGUS免疫的小鼠，不會顯著地與病毒感染的細胞裂解物結合。圖8顯示，經由桿狀病毒SXT7或桿狀病毒SXT8表現而得到的嵌合型VLP，會引起抗腸病毒CV-A16和腸病毒EV-A71的抗體反應。 　　[0169] 因此，在本文中證實了，利用本發明的嵌合型VLP之單一免疫原可以製造出二價疫苗。這種嵌合型VLP提供了能夠引起二價免疫反應的表位，對於腸病毒EV-A71和CV-A16的感染具有保護的效果。 　　[0170] 因此，由本發明所提供的嵌合型VLP可以實現以單一的VLP製造出二價的腸病毒疫苗，因此使得二價腸病毒疫苗的製造更方便、更容易且更便宜，而無需混合多種VLP、次單元，或抗原來達到二價的效果。 實施例10. 具有脊髓灰白質炎病毒VP1結構多肽之嵌合型VLP替換EV-A71 VP1結構多肽之構築。 　　[0171] pSN01係用於生成一個包含來自脊髓灰白質炎病毒(PV)的P1多肽、一個IRES及一個來自EV-A71之3CD蛋白酶的表現匣。 　　[0172] 已進行了廣泛的生物信息學分析，以識別出脊髓灰白質炎病毒血清型第1型(PV1)P1多肽的共有胺基酸序列，且該PV1 P1編碼之DNA序列係經過優化而用於物種專一性表現的密碼子。根據本領域技術人員所知的方法，合成了密碼子優化的PV1 P1基因。 　　[0173] pSN01以限制性內切核酸酶BgIII和BgIIII裁切，因此從pSN01活化了EV-A71 P1基因，含有pSN01載體骨架的片段被純化了。將一段具有相容的末端的經純化之PV1 P1 DNA片段，選殖到經消化的pSN01載體骨架，以得到一個包含PV1 P1結構多肽、一個IRES 和EV-A71 3CD蛋白酶的表現匣。該接合以PCR篩選，且所有入門殖株都經由限制性消化來驗證。選中了一種分離物pSXT11。 　　[0174] pSXT11被用來生成一個穿梭載體，bacSXT11，且該重組的穿梭載體經過序列的驗證。 　　[0175] 在進一步的實施例中，建構了嵌合型P1多肽，其中VP0和VP3結構多肽起源於腸病毒EV-A71，而VP1結構多肽起源於脊髓灰白質炎病毒。 　　[0176] pSN01(描述於PCT/IB2012/003/003114)被用來產生表現匣，其中PV-1的VP1編碼序列取代了pSN01中的EV-A71之編碼序列。 　　[0177] 簡而言之，EV-A71 VP1編碼序列以編碼pSN01中的PV-1序列之VP1交換。此交換產生了穿梭載體，bacSXT18，其包含了含有嵌合型P1編碼序列之表現匣，特別是用於EV-A71 VP0和VP3多肽的編碼序列，以及用於來自PV-1之VP1多肽的編碼序列。 　　[0178] 由bacSXT11產生的重組桿狀病毒被指定為SXT11。由bacSXT18產生的重組桿狀病毒被指定為SXT18。 　　[0179] 圖9A和圖9B分別示出了用於SXT11和SXT18構築體以提供嵌合型VLP之表現匣的組成物的示意性說明。桿狀病毒SXT11之表現匣的核苷酸序列為SEQ ID NO：3。桿狀病毒SXT18之表現匣的核苷酸序列為SEQ ID NO：4。 實施例11. 感染了桿狀病毒SXT11或桿狀病毒SXT18之Sf9細胞中，嵌合型VLP的表現。 　　[0180] 以0.01的病毒感染劑量(MOI)，將Sf9細胞感染桿狀病毒SXT11或桿狀病毒SXT18，並於接種後第3天收集。將培養物以3100xg 15℃離心30分鐘。將沉澱物以PBS洗滌一次，再懸浮於含有0.1%的TritonX100和無EDTA的蛋白酶抑製劑混合物(Sigma)的低滲透壓的緩衝液(1.5 mM MgCl2 ，50 mM氯化鉀、20 mM HEPES)，然後在室溫(RT)下搖晃30分鐘。接著以6600xg在4℃離心20分鐘，使細胞裂解物變得澄清。 　　[0181] 該嵌合型VLP和VP1結構多肽經由西方印漬進行檢測。感染桿狀病毒SXT11或桿狀病毒SXT18的細胞之裂解物，經由SDS-PAGE在12%凝膠上分離，然後電轉移到硝酸纖維素膜上。將膜以含有5%脫脂牛奶的PBS在室溫下進行封阻1小時，然後以抗VP1多肽之超免疫兔多株抗體作為探針，在室溫下培養過夜進行偵測。與辣根過氧化物酶共軛之抗兔IgG一同培養後1小時後，再與TMB基質於室溫下培養10分鐘進行顯色，以偵測結合的抗體。 　　[0182] 對應於脊髓灰白質炎病毒VP1多肽的亮帶可清楚地識別出，這表示嵌合型VLP係由表現匣所產生，並表現出VP1結構多肽，這表示該嵌合P1係經過EV-A71 3CD蛋白酶處理，且該結構多肽被組裝成VLP。 實施例12. 由重組的桿狀病毒SXT18所生產的VLP可產生抗PV1 VP1結構多肽的抗體。 　　[0183] 由桿狀病毒SXT18之表現而得到的嵌合型VLP所免疫的小鼠之血清(含有脊髓灰白質炎病毒-1 VP1結構多肽)，以間接ELISA進行測試，其中ELISA微量盤的培養孔塗覆了脊髓灰白質炎病毒VP1多肽以作為抗原。 　　[0184] 將塗覆了重組的次單元脊髓灰白質炎病毒VP1多肽抗原之ELISA微量盤，與取自於由桿狀病毒SXT18獲得之嵌合型VLP進行免疫之小鼠的血清進行反應，或是與取自於由非嵌合型桿狀病毒SXT11之VLP進行免疫之小鼠的血清進行反應。 　　[0185] 由桿狀病毒SXT18獲得之VLP免疫的小鼠的血清，以及由桿狀病毒SXT11獲得之VLP免疫的小鼠的血清，可與脊髓灰白質炎病毒VP1多肽抗原結合之抗體。 實施例13. 以嵌合型VLP免疫的小鼠的血清中存在著抗體。 　　[0186] 血清中是否存在抗脊髓灰白質炎病毒和EV-A71抗體，係利用ELISA微量盤來進行評估，其中細胞培養孔被塗覆了模擬感染、以EV-A71-感染，或脊髓灰白質炎病毒感染的橫紋肌肉瘤裂解物(RD)細胞之裂解物。將來自桿狀病毒SXT18的嵌合型VLP免疫的動物之血清加入培養孔中。小鼠以對照組的抗原進行免疫。清洗培養孔，然後用HRP共軛的抗小鼠抗體進行培養。加入TMB基質並於450nm測量光密度(OD)。淨OD值之計算，係將塗覆RD感染的細胞裂解物的OD值減去模擬感染RD細胞的裂解物之OD值。 　　[0187] 結果顯示，以對照抗原進行免疫的小鼠，不會顯著地與病毒感染的細胞裂解物結合，而且由桿狀病毒SXT18表現而得到的嵌合型VLP，會引起抗腸病毒PV-1和腸病毒EV-A71的抗體反應。 * * * * * 　　[0188] 本發明之範圍並非意欲受限於本文中所述之特定實施態樣。事實上，除了本文中所述者，熟習本技術領域者自上文說明，將清楚明瞭本發明之各種修飾。此等改良係意欲為後附之申請專利範圍之範圍內。 　　[0189] 本文中所有引用之專利、申請案、公開發表、測試方法、文獻及其他材料係以引用方式併入本案。 * * * * * 參考資料 1.CHUNG, et al. , World J Gastroenterol 12(6): 921-927, 2006. 2.CHUNG, et al. Vaccine 26:1855-1862, 2008. 3.CHUNG, et al. Vaccine 28:6951-6957, 2010. 4.ELLIS , Vaccines, Chapter 29, PLOTKIN, et al. (eds) WB Saunders, Philadelphia, at page 571,1998). 5.Gong M, Zhu H, Zhou J, Yang C, Feng J, Huang X, Ji G, Xu H, Zhu P. Cryo-electron microscopy study of insect cell-expressed enterovirus 71 and coxsackievirus a16 virus-like particles provides a structural basis for vaccine development. J Virol. 2014 Jun;88(11):6444-52. doi: 10.1128/JVI.00200-14. Epub 2014 Mar 26. PubMed PMID: 24672036; PubMed Central PMCID: PMC4093858. 6.Ku Z, Liu Q, Ye X, Cai Y, Wang X, Shi J, Li D, Jin X, An W, Huang Z. A virus-like particle based bivalent vaccine confers dual protection against enterovirus 71 and coxsackievirus A16 infections in mice. Vaccine. 2014 July 23;32(34):4296-303. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.06.025. Epub 2014 Jun 17. PubMed PMID: 24950363. 7.LI, et al. New England Journal of Medicine 370(9):829-837, 2014. 8.Li Y, Zhu R, Qian Y, Deng J. 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[0071] 圖1. A. 描繪天然P1多肽的結構殼體蛋白之排列。B. 描繪嵌合型P1多肽的結構殼體蛋白之排列，其中該VP1多肽係源自於一個腸病毒，且該腸病毒與VP0和VP3多肽所起源之腸病毒不同。 　　[0072] 圖2. 嵌合型腸病毒表現匣[嵌合型P1+IRES+3CD]。A. 嵌合型表現構築體SXT8，該表現匣編碼EV-A71 VP0和VP3多肽及CV-A16 VP1多肽。B. 嵌合型表現構築體SXT7，該表現匣編碼CV-A16 VP0和VP3多肽及EV-A71 VP1多肽。 　　[0073] 圖3. 來自以桿狀病毒表現構築體所感染的細胞之溶裂物的西方印漬。該西方印漬以針對EV-A71 VP1多肽的兔子多株抗體作為探針。該VP1多肽以箭頭指示。 　　[0074] 圖4. 來自以桿狀病毒表現構築體所感染的細胞之溶裂物的西方印漬。該西方印漬以針對CV-A16 VP1多肽的小鼠單株抗體F6/2/A1-1/2/A3作為探針。該VP1多肽以箭頭指示。 　　[0075] 圖5. 經塗覆重組型EV-A71殼體蛋白VP1(圖5A)或EV-A71殼體蛋白VP0(圖5B)次單元之ELISA盤係用以與獲自經嵌合型SXT7之VLP免疫接種之小鼠的血清或以與獲自經非嵌合型SN07之VLP(具有天然EV-A71 P1多肽)免疫接種之小鼠的血清反應。SXT7 VLP具有源自腸病毒EV-A71之VP1多肽。該圖顯示來自以SXT7 VLP和非嵌合型EV-A71 VLP免疫接種的小鼠之血清兩者與EV-A71的VP1蛋白結合(圖A)。來自以該非嵌合型EV-A71 VLP免疫接種的小鼠之血清、而非來自以該SXT7 VLP免疫接種的小鼠之血清，與EV-A71 VP0結合(圖B)。 　　[0076] 圖6.三明治型ELISA(sandwich ELISA)偵測VLP上的各種單株抗體表位之存在。E18及E19係對天然腸病毒EV-A71病毒上的EV-A71四級表位(quarternary epitope)具特異性之單株抗體。Y軸顯示在波長450nm的光學密度(OD450 )。如正值訊號所示，單株抗體EV18及EV19的四級表位存在於SXT8 VLP上，這顯示具有完好EV-A71特異性中和表位之殼體蛋白的正確組裝。 　　[0077] 圖7. 使用來自以SXT8 VLP免疫接種的小鼠之血清之間接ELISA。經塗覆重組型EV-A71殼體多肽VP1(圖5A)或EV-A71殼體多肽VP0(圖5B)次單元之ELISA盤係用以與來自經嵌合型SXT8之VLP免疫接種之小鼠的血清或經非嵌合型SN07之VLP(具有天然EV-A71 P1多肽)免疫接種之小鼠的血清反應。 　　[0078] 圖8. 來自以嵌合型SXT7之VLP免疫接種的動物、以嵌合型SXT8之VLP免疫接種的動物、或以對照抗原FGUS免疫接種的動物之血清中，抗EV-A71和CV-A16的抗體之存在。孔中經塗覆來自於經假擬感染(mock-infected)橫紋肌肉瘤(RD)細胞、經CV-A16感染的RD細胞(圖A)、或經EV-A71感染的RD細胞(圖B)的溶裂物。將塗覆著來自病毒感染的RD細胞的溶裂物的孔之OD值，減去經塗覆以假擬感染的RD細胞之溶裂物的孔之OD值，計算出450nm的淨OD值。 　　[0079] 圖9. 腸病毒的表現匣包含脊髓灰白質炎病毒PV1結構多肽。A. 表現構築體SXT11，該表現匣編碼脊髓灰白質炎病毒PV1天然P1多肽、IRES和EV-A71 3CD蛋白酶。B. 嵌合型表現構築體SXT18，該表現匣編碼EV-A71 VP0和VP3多肽及脊髓灰白質炎病毒PV1 VP1多肽、IRES和EV-A71 3CD蛋白酶。 　　[0080] 圖10. 在pSN01桿狀病毒表現構築體中的EV-A71 VLP表現匣[P1+IRES+3CD]，其產生了桿狀病毒表現構築體SN07，其描述於PCT/IB2012/003114中，包含腸病毒EV-A71 P1、IRES和EV-A71 3CD蛋白酶。

Claims (32)

  1. 一種嵌合型病毒樣顆粒(VLP)，其係由腸病毒多肽VP0和VP3及異源性VP1多肽所組裝，其中該腸病毒係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D。
  2. 如請求項1之嵌合型VLP，其另由腸病毒多肽VP2和/或VP4所組裝。
  3. 如請求項1之嵌合型VLP，其中該多肽VP0及VP3係衍生自腸病毒EV-A71且該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D。
  4. 如請求項3之嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒CV-A16。
  5. 如請求項3之嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒C。
  6. 如請求項1之嵌合型VLP，其中該多肽VP0及VP3係衍生自腸病毒CV-A16且該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D。
  7. 如請求項6之嵌合型VLP，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒EV-A71。
  8. 一種包含嵌合型VLP之疫苗，該等嵌合型VLP係由腸病毒EV-A71的VP0和VP3多肽及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1多肽所組裝。
  9. 如請求項8之疫苗，其中該等嵌合型VLP係另由腸病毒EV-A71的VP2和/或VP4多肽所組裝。
  10. 如請求項8或9之疫苗，其中該嵌合型異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A。
  11. 如請求項10之疫苗，其中該腸病毒A係CV-A16。
  12. 如請求項8或9之疫苗，其中該異源性腸病毒VP1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒C。
  13. 一種包含嵌合型VLP之疫苗，該等嵌合型VLP係由腸病毒CV-A16的VP0和VP3多肽及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1多肽所組裝。
  14. 如請求項13之疫苗，其中該等嵌合型VLP係另由腸病毒CV-A16的VP2和/或VP4多肽所組裝。
  15. 如請求項13或14之疫苗，其中該嵌合型異源性腸病毒VP1多肽係來自腸病毒A。
  16. 如請求項15之疫苗，其中該腸病毒A係EV-A71。
  17. 9、13及14中任一項之疫苗，其包括一或多種疫苗佐劑。
  18. 如請求項17之疫苗，其中該(等)佐劑係選自ISCOMS、明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、Quil A或其他皂素。
  19. 如請求項1之嵌合VLP，其係使用於疫苗，該疫苗供接種個體以抵抗多於一種腸病毒之感染，該使用包含投予該個體有效量的該嵌合型VLP以當被投予該個體時誘導針對該多於一種腸病毒的保護和/或中和免疫反應。
  20. 一種如請求項1之嵌合型VLP於製備在個體內提供抵抗多於一種腸病毒感染的免疫反應和/或中和免疫反應的疫苗之用途。
  21. 一種編碼核酸之表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼嵌合型腸病毒多肽P1的核酸之啟動子，該嵌合型腸病毒多肽P1包含腸病毒結構多肽VP0和VP3及選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D的腸病毒之異源性VP1結構多肽，其中該編碼該嵌合型腸病毒多肽P1的核酸係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)及腸病毒3CD蛋白酶之核酸，其中該3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下。
  22. 如請求項21之表現匣，其中該腸病毒結構多肽VP0及VP3係來自腸病毒EV-A71。
  23. 如請求項22之表現匣，其中該異源性VP1結構多肽係來自腸病毒CV-A16。
  24. 如請求項21之表現匣，其中該腸病毒結構多肽VP0和VP3係來自腸病毒CV-A16。
  25. 如請求項24之表現匣，其中該異源性VP1結構多肽係來自腸病毒EV-A71。
  26. 如請求項21之表現匣，其中該編碼該IRES的核酸序列係來自腦心肌炎病毒(EMCV)。
  27. 如請求項21之表現匣，其中該編碼該IRES的核酸序列係已經基因修飾。
  28. 如請求項21之表現匣，其中該編碼該3CD的核酸序列係已經基因修飾。
  29. 如請求項21之表現匣，其中該IRES係衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)或腸病毒。
  30. 一種製造嵌合型腸病毒VLP之方法，該方法包含將包含如請求項21之表現匣的宿主細胞培養足以製造該嵌合型腸病毒多肽P1及腸病毒3C或3CD蛋白酶及足以形成VLP的一段時間之步驟。
  31. 如請求項30之方法，其另包含自該宿主細胞回收該等VLP之步驟。
  32. 如請求項30或31之方法，其中該宿主細胞係真核細胞。
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