TW201825675A - 用於獲得腸病毒病毒樣顆粒之表現匣及方法 - Google Patents

Abstract

本發明關於衍生自腸病毒之病毒樣顆粒(VLP)及包含此等VLP之疫苗，該VLP針對腸病毒誘導免疫反應和/或保護性中和抗體反應。本發明提供用於製造腸病毒CV-A16 VLP及富集CV-A16 VLP之組成物的表現匣及方法，該CV-A16 VLP展現誘導免疫反應和/或中和抗體反應之構形表位，可被使用於針對腸病毒CV-A16之疫苗。

Description

用於獲得腸病毒病毒樣顆粒之表現匣及方法

[0001] 本發明關於衍生自腸病毒之病毒樣顆粒(VLP)及包含此等VLP之疫苗，該VLP針對腸病毒誘導免疫反應和/或保護性中和抗體反應。

[0002] 腸病毒係屬於微小RNA病毒科(Picornaviridae)科中的微小RNA病毒(Picornavirus)屬的病毒屬。腸病毒代表一群大型且多樣的小RNA病毒的屬，特徵為單一正股基因體RNA。所有腸病毒都含有約7,500個鹼基的基因體，且已知由於低精確度複製和頻繁的重組而具有高突變率。宿主細胞感染後，基因體以蓋帽非依賴性(cap-independent)方式而轉譯成單一多蛋白(polyprotein)，該多蛋白之後再藉由病毒編碼之蛋白酶加工成結構性殼體(capsid)蛋白質和主要涉及病毒複製之非結構性蛋白質。 　　[0003] 腸病毒與數種人及哺乳動物疾病有關。腸病毒被分類為12種，如下所示：腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C、腸病毒D、腸病毒E、腸病毒F、腸病毒G、腸病毒H、腸病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B和鼻病毒C。 　　[0004] 在這十二種腸病毒中，有很多血清型。血清學研究依抗體中和試驗，已分別出許多腸病毒血清型。 　　[0005] 腸病毒A包括例如血清型EV-A71(亦被稱為EV71或HEV71)、EV-A76、EV-A89、EV-A90、EV-A91、EV-A92、CV-A16(柯薩奇病毒(Coxsackievirus) A16)、CV-A5、CV-A6和CV-A10。 　　[0006] 腸病毒C病毒種表現23種血清型，其包括例如PV-1(脊髓灰白質炎病毒(Poliovirus) 1)、PV-2、PV-3、CV-A20、CV-A21、EV-C95、EV-C96、EV-C99、EV-C102、EV-C104、EV-C105及EV-C109。 　　[0007] 血清型EV-D68、EV-D70及EV-D94經分類為腸病毒D病毒種之下。 　　[0008] 腸病毒屬的所有成員，包括EV-A71、脊髓灰白質炎病毒和柯薩奇病毒A16均具有單股正義RNA基因體，其具有單一開讀框，其編碼多蛋白P1(由殼體結構蛋白VP0、VP3和VP1組成)及數種非結構蛋白(包括病毒蛋白酶3C和3CD，其負責截切多蛋白P1成個別的殼體蛋白VP1、VP3和VP0)，病毒RNA包被(encapsidation)之後，VP0最終會經截切成VP2和VP4。殼體蛋白VP0、VP1和VP3可組裝成病毒樣顆粒(VLP)而不會包被基因體，但是在天然病毒的成熟期間，RNA包被後，VP0會斷裂成VP2和VP4。(CHUNG, et al., World J Gastroenterol 12(6):921-927, 2006))。 　　[0009] 腸病毒感染所引起的疾病包括脊髓灰質炎，其係腸病毒感染造成的疾病中，最著名的疾病。其他疾病的實例包括無菌性腦膜炎、手足口病(HFMD)、結膜炎、呼吸疾病和心肌炎。然而，非特異性發熱性疾病係腸病毒感染最常見的表現。 　　[0010] 感染腸病毒C，尤其是脊髓灰白質炎病毒，已經是一個普遍存在的問題，而脊髓灰質炎的流行病在歷史上，一直是20世紀期間造成數百萬死亡的重大全球性健康問題。不活化全病毒疫苗已經用於大規模免疫，且係目前可得且可用於預防脊髓灰白質炎病毒感染。在世界上大多數的國家，已經以不活化的脊髓灰質炎疫苗，得到了良好結果而根除脊髓灰質炎，該疫苗係根據Jonas Edward Salk所開發出的方法製備，並且之後已經針對幾個方面進行了改善。通常，這些疫苗含有不活化的脊髓灰質炎病毒之Mahoney、MEF1和Saukett病毒株混合物。雖然減毒脊髓灰白質炎病毒血清型PV-1、PV-2和PV-3病毒株(沙賓(Sabin))業經製造出並用作為減毒口服脊髓灰質炎疫苗，但是減毒沙賓疫苗偶爾產生突變回復體，導致被稱為疫苗相關麻痺性脊髓灰質炎(VAPP)。通常，含有脊髓灰質炎病毒之個別多胜肽的次單位形式之疫苗進行接種，已顯示經單離的多肽不能夠增加動物的中和抗體(Meloen, et al., J. Gen. Virol. 45:761-763, 1979)。 　　[0011] 此外，腸病毒是造成孩童無菌性腦膜炎最常見原因。在美國，腸病毒造成30,000至50,000例的腦膜炎。腦炎是一種罕見的腸病毒感染表徵；但是當它發生時，最常發現引起腦炎的腸病毒是腸道細胞病變人類孤病毒9型(echovirus 9)。腸病毒引起的肋肌痛之特徵為胸部和腹部發生嚴重陣發性疼痛，伴隨著發燒，有時會出現噁心、頭痛、和嘔吐。心包炎及/或心肌炎通常係由腸病毒所引起的。也曾有心律不整、心臟衰竭及心肌梗塞的報告。腸病毒也會引起急性出血性結膜炎。 　　[0012] 腸病毒感染會引起手足口病(HFMD)。手足口病是一種常見的、自限性孩童疾病，最常發生的原因是感染柯薩奇病毒A16型(CV-A16)病毒或腸病毒EV-A71，還有其他腸病毒A血清型，諸如CV-A2、CV-A4、CV-A5、CV-A6、CV-A7和CV-A10，也可能引起手足口病，且此外CV-B1、CV-B2和CV-B5也會引起HFMD(Li, et al., The Characteristics of Blood Glucose and WBC Counts in Peripheral Blood of Cases of Hand Foot and Mouth Disease in China: A Systematic Review. PLoS ONE 7(1): e29003; published January 3, 2012)。 　　[0013] 然而，腸病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A16型(CV-A16)係已知造成HFMD的主要致病體的腸病毒血清型，但此外，EV-A71也常與嚴重中樞神經系統併發症、及在一些情況下與心血管系統表徵有關。EV-A71首先於1969年在加州自神經系統疾病的病例分離及特徵分析。迄今為止，宿主對EV-A71感染的反應之分子機制知之甚少，但是已知涉及編碼趨化激素的mRNA、參與蛋白質降解之蛋白質、補體蛋白、和促凋亡蛋白的數量增加。 　　[0014] 在過去的十五年中，HFMD已成為全世界的公共健康問題，尤其是亞太地區，其中該疾病是由一組微小RNA病毒科的非脊髓灰質炎腸病毒所引起的，其中柯薩奇病毒A16型(CV-A16)和腸病毒71型(EV-A71)是最常見的病原。致命的EV-A71於1997年首次出現在馬來西亞的沙勞越，之後，1998年在台灣、並接著每年在任何一舍亞太地區國家中發生疫情大爆發。2008年在中國觀察到大量EV-A71爆發，且此疾病在中國和其他國家成為法定傳染病。根據世界衛生組織(WHO)的疫情更新(2013年12月11日)，在2013年，在各國之中，中國提報1,651,959起病例、其中死亡265人，越南提報71,627起病例報告、其中死亡19人，而日本提報294,535起病例，根據WHO，反映HFMD疾病深遠程度。在2013年5月，在澳洲新南威爾斯州，提報5例類脊髓灰質炎麻痺(1例在維多利亞州)、有27例嚴重EV-A71相關病例，這是已經在亞洲流行一段時間的EV-A71病毒株所造成的，直到最近才在澳洲發現，這意味著全球旅遊在促進疾病傳播上，扮演著重要的角色。在大多數HFMD病例發生地：中國，從2009年至2015年之間，仍持續在5月和6月份有定期的爆發高峰。 　　[0015] 在HFMD中，腸病毒係經排泄至糞便中，且在咽分泌物中也會發現。傳播與兒童之間的密切接觸和環境污染有關。疾病的特徵為急性發燒，伴隨在手掌、腳掌、臀部和膝蓋出現疹子，並在口頰的黏膜上出現水泡，通常在7-10天內緩解。然而，少部分患有HFMD的孩童會發生嚴重的中樞神經系統疾病，而這往往是致命的。 　　[0016] 主要涉及神經系統和心血管系統之嚴重HFMD疾病的表徵為諸如腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痺、肺水腫和心臟衰竭之症候群，通常只發生於EV-A71感染。在亞太地區，最具破壞性的神經症候群是腦幹腦炎，死亡率為百分之40-80。患有嚴重HFMD的孩童可能需要幾個月的時間來恢復，且在一些情況下，神經的損傷可能是永久性的。目前，未有具體的針對HFMD之抗病毒治療。 　　[0017] 關於疫苗的開發，有許多發表描述製備針對腸病毒A血清型諸如EV-A71和CV-A16的新穎疫苗方法，尤其是針對EV-A71型。受到EV-AV71疫情爆發影響最嚴重的國家-中國，有三家公司已經完成了不活化全病毒EV-A71單價疫苗的第III期試驗。這種疫苗的主要缺點係因為不完全滅活而導致的感染風險，以及生產過程中的環境風險。 　　[0018] 特別以EV-A71 VP1蛋白為基礎的次單元蛋白疫苗，已經在學術背景中測試，尚未進一步擴大至商業開發。其中一個很好的實例是Wu等人的研究(Vaccine 20, 895-904 (2002))，其中VP1次單元疫苗具致免疫性，而且會誘導中和抗體，但是其力價和效果期間並不如不活化全病毒疫苗對照組，只有在低力價病毒挑激中、但未在高力價病毒挑激中，觀察到產生體內的保護效果(相較於不活化病毒疫苗)。 　　[0019] 此外，已使用更先進的最新技術針對EV-A71和CV-A16兩者開發原型疫苗和疫苗，目前已經進入早期臨床前階段。 　　[0020] 已研究於疫苗調合物中使用VLP。腸病毒EV-A71型的病毒樣顆粒係由CHUNG等人(2006) (World J Gastroenterol 12(6):921-927, 2006)、CHUNG等人(2008) (Vaccine 26:1855-1862, 2008)、及CHUNG等人(2010) (Vaccine 28:6951-6957, 2010)描述，其中腸病毒EV-A71 VLP由EV-A71結構殼體多肽VP0、VP1和VP3組成。 　　[0021] 此外，本案申請人稍早所公開的專利申請案國際公開號WO 2013/098655揭示了EV-A71、CV-A16和脊髓灰質炎病毒VLP包含VP0多肽、VP1多肽、VP2多肽、VP3多肽和VP4多肽。 　　[0022] 由於EV-A71和CV-A16兩者都在東南亞同時流行，且引起HFMD的頻率大約相同，所以需要疫苗接種二種病原體以防止臨床HFMD疾病。在中國已進行單價不活化全病毒EV-A71疫苗的第III期臨床試驗，非常清楚地顯示，對於非EV-A71腸病毒並不會產生交叉保護的效果，如ZHU等人(The Lancet, 381:2024-2032, 2013)；ZHU等人(NEJM 370(9):818-828,2014)及LI等人(NEJM 370(9):829-837, 2014)所示。 　　[0023] 對於抵抗造成神經疾病的腸病毒(諸如EV-A71)之疫苗，也有強烈的需求。因此，亟需針對腸病毒EV-A71及腸病毒CV-A16的疫苗。 　　[0024] 因此，極重要的是開發有效單價EV-A71及CV-A16疫苗，其可分別或一起使用以供疫苗接種來抵抗腸病毒EV-A71及腸病毒CV-A16感染。 　　[0025] 在疫苗領域中的確明瞭的是，還不清楚衍生自病原體的抗原是否會誘導保護性免疫。ELLIS (Chapter 29 of Vaccines, Plotkin, et al. (eds) WB Saunders, Philadelphia, at page 571,1998)在報告中例示了此問題：“該(疫苗開發)問題的關鍵是鑑定本身可誘導保護性抗體之產生、且由此保護宿主抵抗病原體的攻擊的病毒或微生物病原體之蛋白質組成。” 　　[0026] 先前誘導針對腸病毒CV-A16的抗體之抗原性組成物在文獻中已有報導；然而，目前未有疫苗可得。 　　[0027] VLP疫苗具有致免疫性、非感染性(noninfectious)的優點，且可易達到品質管制和在生產期間規模擴大。本技術領域中可了解的是，VLP係非感染性係因VLP不包含基因體。腸病毒VLP不包含RNA基因體。 　　[0028] 近期針對CV-A16的疫苗的開發已著重在藉由利用桿狀病毒-昆蟲細胞表現系統所獲得的腸病毒CV-A16的病毒樣顆粒的製造。 　　[0029] 本領域已知用於製造腸病毒CV-A16 VLP的表現系統有賴於CV-A16 3CD蛋白酶切割CV-A16 P1多肽以提供殼體結構多肽，其自組裝成VLP。例如請參閱LIU等人 (A virus-like particle vaccine for coxsackievirus A16 potently elicits neutralizing antibodies that protect mice against lethal challenge. Vaccine. 30 (2012) 6642-6648)、Ku等人(Vaccine 32:4296-4303, 2014)及Gong等人(J. Virol. 88:6444-52, 2014)。 　　[0030] 當在桿狀病毒中製造CV-A16病毒樣顆粒並用於免疫接種小鼠時，據報導中和力價在40至320(GONG等人)、512至8192(KU等人)及1600至32000(LIU等人)的寬廣範圍內。此種來自不同研究的寬廣力價範圍，尤其是來自相同群組內的不同研究(KU等人及LIU等人)，呈現反應的異質性，這表明所獲得的CV-A16之VLP產物是異質的(heterogeneous)。 　　[0031] 事實上，藉由共表現CV-A16 P1多肽和CV-A16 3CD蛋白酶在昆蟲細胞中的桿狀病毒表現提供具有二個不同族群產物的組成物，如藉由蔗糖梯度沉降分布(sedimentation profile)和西方印漬所示。(LIU, et al., Vaccine 30:6642-48, 2012)。這種CVA-16 VLP必須藉由份化(fractionation)來部分純化以產生用於免疫作用的VLP均質製劑。 　　[0032] 關於文獻中報導觀察到該些VLP製劑誘導的免疫反應的異質性，對這些結果的一種可能解釋是VLP製造導致VLP聚集。 　　[0033] 本技術領域中已知VLP具有聚集成高分子量實體(entity)傾向。VLP聚集的生物重要性，例如抗原性及致免疫性，並不清楚。 　　[0034] 關於疫苗開發，VLP的聚集在製造過程中呈現巨大的挑戰，例如在純化和配製過程中。例如，不可能力價測定(titer)包含已聚集之VLP的VLP產物，因此，這些產物不可用於疫苗接種並且不被監管機構許可。因此，VLP的聚集對下游製程和隨後的疫苗批准增加困難。 　　[0035] VLP抗原的一致性對於疫苗生產至關重要，以確保疫苗品質和療效。 　　[0036] 本發明提供用於製造VLP及富集CV-A16 VLP之組成物的方法，該CV-A16 VLP展現誘導免疫反應和/或中和抗體反應之構形表位，可被使用於針對腸病毒CV-A16之疫苗。 　　[0037] 藉由利用本表現匣的本方法所獲得的組成物(其中CV-A16 P1多肽藉由EV-A71 3CD蛋白酶加工成結構多肽)展現誘導免疫反應和/或中和抗體反應的單一VLP族群。該組成物基本上不含VLP聚集體。 　　[0038] 本文中所述之方法減少VLP聚集且改善功能性VLP產率。 　　[0039] 再者，從未顯示藉由利用表現腸病毒P1多肽和EV-A71 3CD蛋白酶的表現匣可以形成腸病毒VLP，其中該P1多肽係衍生自非EV-A71的腸病毒。更重要的是，尚未顯示任何此種腸病毒P1切割可預期提供組裝形成VLP的結構性殼體多肽，且，此外，尚未顯示構形表位經保留在VLP的表面上，使得VLP可誘導針對腸病毒的保護性和/或中和免疫反應(該腸病毒為P1多肽之來源)。 　　[0040] 令人驚訝的是EV-A71 3CD蛋白酶可將腸病毒CV-A16 P1多肽加工成其同族(cognate)結構性殼體多肽，且，此外，此類結構性殼體多肽將組裝以提供VLP，其提供免疫反應和/或中和抗體反應，使得該VLP可用於針對腸病毒CV-A16的疫苗中。 　　[0041] 再者，未預期的是，腸病毒CV-A16 P1多肽藉由腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶加工成結構性殼體多肽將提供不展現顯著聚集的VLP並且其可用於針對腸病毒CV-A16的疫苗中。 　　[0042] 因此，本發明解決了與開發腸病毒VLP疫苗相關的問題，例如，非所欲的VLP聚集和較低的致免疫性。 　　[0043] 當用作為疫苗時，本發明的VLP的特徵在於提供無法預期的免疫反應改善，相較於先前技術VLP製劑，該免疫反應可更加一致和可預測。 　　[0044] 本發明提供製造腸病毒病毒樣顆粒的經改善之方法和包含病毒樣顆粒且基本上不含VLP聚集或聚集體的組成物，並且該VLP誘導有效的免疫反應和/或中和抗體反應，使得該VLP可用於針對腸病毒CV-A16的疫苗。

[0045] 一種病毒樣顆粒(VLP)，其誘導抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應，該VLP之腸病毒結構多肽係衍生自該腸病毒；此種 　　[0046] VLP，其中該腸病毒係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D；此種 　　[0047] VLP，其係形成自CV-A16 P1多肽，其會由EV-A71 3CD蛋白酶來加工，該VLP特徵在於相較於未由EV-A71 3CD蛋白酶所形成之VLP的經改善之致免疫性；此種 　　[0048] VLP，其中該腸病毒係CV-A16；此種 　　[0049] VLP，其中該腸病毒係選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型；此種 　　[0050] 編碼核酸之表現匣(nucleic acid encoding an expression cassette)，其包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽的核酸之啟動子，該腸病毒P1多肽包含結構多肽VP0、VP3及VP1，其係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)之核酸，且該IRES係可操縱地連接至編碼EV-A71 3CD蛋白酶之核酸；此種 　　[0051] 編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D之腸病毒；此種 　　[0052] 編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自腸病毒CV-A16；此種 　　[0053] 編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒；此種 　　[0054] 編碼核酸之表現匣，其中該EV-A71 3C或3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下；此種 　　[0055] 編碼核酸之表現匣，其中該編碼該IRES的核酸序列係已經基因修飾；此種 　　[0056] 編碼核酸之表現匣，其中該編碼該3CD的核酸序列係已經基因修飾；此種 　　[0057] 編碼核酸之表現匣，其中該IRES係衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)或腸病毒；此種 　　[0058] 製造腸病毒VLP之方法，其包含下列步驟：將包含編碼核酸之表現匣的原核或真核宿主細胞培養足以製造腸病毒P1多肽及EV-A71 3CD蛋白酶及足以形成VLP的一段時間，該表現匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽的核酸之啟動子，該腸病毒P1多肽包含結構多肽VP0、VP3及VP1，其係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)之核酸，且該IRES係可操縱地連接至編碼EV-A71 3CD蛋白酶之核酸；此種 　　[0059] 方法另包含自該宿主細胞回收該等VLP之步驟；此種 　　[0060] 組成物，其包含由該方法所製造之腸病毒CV-A16 VLP，其中該組成物基本上係無腸病毒CV-A16 VLP之聚集體(aggregate)；此種 　　[0061] 疫苗，其包含VLP，其誘導抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應，該VLP之腸病毒多肽係衍生自該腸病毒；此種 　　[0062] 疫苗，其包含VLP，其誘導抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應，該腸病毒多肽衍生自該腸病毒，係基本上不聚集；此種 　　[0063] 疫苗，其包含VLP，其誘導抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應，該腸病毒多肽衍生自該腸病毒，係基本上無聚集體；此種 　　[0064] 疫苗，其包含VLP，其誘導抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應，該腸病毒多肽衍生自該腸病毒，係基本上無VLP聚集體；此種 　　[0065] 疫苗，其中該腸病毒係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D；此種 　　[0066] 疫苗，其中該腸病毒係CV-A16；此種 　　[0067] 疫苗，其中該腸病毒係選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型；此種 　　[0068] 疫苗，其包含自該方法所獲得之VLP；此種 　　[0069] VLP，其係使用於疫苗，該疫苗供接種個體以抵抗腸病毒之感染，該使用包含投予該個體有效量的該腸病毒病毒樣顆粒以當被投予該個體時誘導針對該腸病毒的免疫反應和/或中和抗體反應；此種 　　[0070] 在個體內提供免疫反應和/或中和抗體反應以抵抗腸病毒的感染之方法，該方法包含投予該個體有效量的病毒樣顆粒以在該個體內提供此種抵抗腸病毒感染之免疫反應和/或中和抗體反應。

發明詳述 　　[0077] 本發明提供用於製造腸病毒病毒樣顆粒及組成物之方法，該組成物較本技術領域中已知之方式所獲得之包含腸病毒病毒樣顆粒的組成物有所改善。 　　[0078] 本發明在一態樣中包括用於製造該腸病毒病毒樣顆粒(VLP)之方法，該方法可包括下列步驟：(i) 構築表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽的核酸之啟動子，該核酸係可操縱地連接至內核糖體進入位點(IRES)，該IRES係可操縱地連接至腸病毒3C或3CD蛋白酶；(ii) 以該表現匣轉染或轉形適合的宿主細胞；(iii) 在細胞於表現該匣中所包含的核酸後製造VLP的條件下培養該宿主細胞。 　　[0079] 可由開讀框獲得核酸或重組DNA分子，該開讀框編碼人腸病毒(包括柯薩奇病毒A16、EV-A71和/或EV68、多肽及蛋白酶)，可使用經適當設計、與該腸病毒核酸序列互補之引子藉由PCR擴增來擴增獲得。適合的引子可根據標準技術自公開可獲得腸病毒核酸序列來設計。再者，核酸序列可藉由本技術領域中已知的技術來從頭合成。完整基因體序列可在GenBank中獲得，並可在國家生物技術資訊中心(NCBI)存取。 　　[0080] 在一實施態樣中，腸病毒CV-A16 P1多肽可經表現為多肽，其隨後被腸病毒EV-A71 3C或3CD蛋白酶切割成VP0、VP1和VP3病毒多肽、或其免疫或生物活性片段，該腸病毒多肽誘導針對腸病毒的中和抗體。該VP0蛋白質可進一步截切成VP2和VP4蛋白質、或其免疫或生物活性片段，其誘導針對腸病毒的中和抗體。該病毒多肽自組裝成VLP。進一步，應理解的是，蛋白酶基因可被包含在該VLP表現匣的相同DNA重組分子中或在不同DNA重組分子中，和/或由不同的啟動子或轉譯元件表現。 　　[0081] 可以設計VLP表現匣的重組DNA分子和核酸，由此編碼人腸病毒CV-A16結構及人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶之開讀框可使用適當設計、與人腸病毒核酸序列互補引子藉由PCR擴增而獲得，或可根據本領域已知的技術從頭合成。 　　[0082] 本發明包括VLP表現匣，其帶有腸病毒結構(即P1區)與蛋白酶(3CD)基因序列，該蛋白酶為加工P1多肽成個別病毒殼體多肽、從而允許結構性殼體多肽自組裝成腸病毒VLP所必要。該表現匣係雙順反子載體，其使用在編碼腸病毒P1多肽序列的核酸上游之啟動子。編碼P1多肽的順反子之下游係內核糖體進入位點(IRES)序列，接著該順反子含有編碼腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶之核苷酸。 　　[0083] 從單一雙順反子訊息進行表現P1多肽及3CD蛋白酶，其中該3CD蛋白酶基因係在IRES的轉譯控制下以蓋帽-非依賴性方式轉譯。 　　[0084] 舉例而言，本發明之表現匣可包含啟動子，其係可操縱地連接至編碼人腸病毒A P1多肽、IRES、及人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶的核酸。 　　[0085] 在一實施態樣中，本發明之表現匣可包含啟動子，其係可操縱地連接至編碼人腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES、及人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶的核酸。 　　[0086] 雙順反子載體經構築，其中質體含有多角體蛋白(polyhedrin)啟動子(在該腸病毒P1多肽編碼序列上游)。編碼P1多肽的順反子之下游係腦心肌炎病毒(EMCV)內核糖體進入位點(IRES)序列(GenBank登錄號AF113968.2；第1666至2251個核苷酸)，接著該順反子含有編碼腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶之核苷酸。 　　[0087] 在一實施態樣中，本發明之表現匣可包含啟動子，其係可操縱地連接至編碼人腸病毒CV-A16 P1多肽、EMCV IRES、及人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶的核酸。 　　[0088] 利用表現匣(包含人腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES、及人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶)之桿狀病毒表現提供誘導保護和/或中和免疫反應之功能性病毒樣顆粒。 　　[0089] 令人驚訝的是，衍生自腸病毒EV-A71而非腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶以供斷裂腸病毒CV-A16 P1多肽的3CD蛋白酶產生病毒樣顆粒。 　　[0090] 腸病毒CV-A16病毒樣顆粒及用於製造VLP之方法係本技術領域中已知。舉例而言，LIU等人、KU等人(Vaccine 32:4296-4303, 2014)及Gong等人(J. Virol. 88: 6444-52, 2014)描述藉由共表現腸病毒CV-A16及CV-A16 3CD蛋白酶於宿主細胞中形成VLP。當病毒樣顆粒併以明礬作為佐劑投予小鼠時，據報導中和力價在40至320(Gong等人)、512至8192(Ku等人)及1600至32000(LIU等人)的寬廣範圍內。此種來自不同研究的寬廣力價範圍，呈現反應的異質性，值得進一步研究。 　　[0091] 類似於上述引用技術中公開的方法，申請人在桿狀病毒表現系統中製造腸病毒CV-A16病毒樣顆粒，其中CV-A16 P1多肽在宿主細胞中被CV-A16 3CD蛋白酶切割，並獲得宿主細胞溶裂物用於分析並與根據本發明獲得的腸病毒CV-A16病毒樣顆粒進行比較，其中CV-A16病毒樣顆粒是藉由EV-A71蛋白酶斷裂CV-A16 P1多肽來製造。 　　[0092] 關於本發明用於製造腸病毒CV-A16 VLP的方法，並且與前述相反，以帶有如圖1所描繪之表現匣SXT-6之桿狀病毒來感染昆蟲細胞。該表現匣包含啟動子，其係可操縱地連接至編碼CV-A16 P1多肽、IRES、及EV-A71 3CD蛋白酶的核酸，其中該EV-A71 3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下。在經感染的宿主細胞中，CV-A16 P1多肽被EV-A71 3CD蛋白酶切割成結構性殼體多肽，並且該殼體多肽組裝成誘導保護性和/或中和免疫反應的功能性病毒樣顆粒。 　　[0093] 藉由本領域公開的方法所製造的包含病毒樣顆粒的宿主細胞溶裂物和藉由本方法所獲得的宿主細胞溶裂物係藉由粒徑篩析層析術於SEPHACRYL® S500(根據它們的大小分離經組裝的顆粒，較大的實體先自管柱沖提)上分離。收集級分並分析VLP的存在。 　　[0094] 在各級分中存在的腸病毒CV-A16VLP係藉由三明治ELISA檢定來判定，該檢定使用針對腸病毒CV-A16抗原的2種不同抗體以偵測經組裝之CV-A16多肽的存在。圖2及3顯示藉由粒徑篩析層析術所獲得的個別級分之ELISA檢定結果。 　　[0095] 分析經桿狀病毒感染的細胞中產生的VLP，顯示當藉由腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶加工腸病毒CV-A16 P1多肽時，顯然有2個具有不同大小的顆粒粒子被製造。見圖2。 　　[0096] 利用本方法，其中該腸病毒CV-A16 P1多肽係藉由腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶來加工，製造出單一顆粒族群。參見圖3。 　　[0097] 這些數據顯示，腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶以導致無效率製造具有正確構形以用在疫苗中的病毒樣顆粒的方式加工腸病毒CV-A16 P1多肽。 　　[0098] 事實上，圖2中左側的峰表示在粒徑篩析分析中具有較大顆粒的部分，出現在空隙體積中，並且因此由經組裝的多肽的聚集體組成。圖2中右側的峰對應於具有較小顆粒的級分，代表不是聚集形式的VLP。 　　[0099] 如圖2所示，聚集形式的VLP的量代表大部分VLP於宿主細胞中藉由利用與P1多肽天然結合的蛋白酶的方法來製造。在疫苗開發中，這代表可用於有效疫苗的那些VLP的產量的顯著損失。 　　[0100] 由於許多原因，例如對生產、純化、品質、溶解度和穩定性，在藥物或疫苗製備中，要避免多肽、蛋白質、經組裝的VLP、病毒等的聚集。因此，如圖3所示，製備腸病毒CV-A16 VLP的方法(其中腸病毒CV-A16 P1多肽由腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶加工)，產生優良產物，其中VLP並非在聚集形式。 　　[0101] 利用包含腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES和腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶的表現匣的桿狀病毒表現的本方法減少了VLP聚集並改善了功能性VLP產率，如圖3粒徑篩析分析的單峰所示。 　　[0102] 藉由如本文所述之方法所製造之包含VLP的組成物提供自結構性殼體多肽所組裝之VLP。參見圖4，其證實根據本方法所形成的VLP存在有結構性殼體多肽。 　　[0103] 藉由如本文所述之方法所製造包含VLP的組成物提供了VLP，其主要為經證明可誘導抗體的構形，該抗體具有功能並能夠將腸病毒(如腸病毒CV-A16)中和至高力價。 　　[0104] 例如，藉由本文所述方法產生的腸病毒CV-A16 VLP(即來自攜帶包含腸病毒CV-A16 P1多肽和腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶(圖1中的SXT6)的表現匣的桿狀病毒的表現)的致免疫性，與攜帶包含腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES和腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶(圖1中的SXT9)的表現匣的桿狀病毒產生的腸病毒CV-A16 VLP的致免疫性相比較。 　　[0105] 藉由CV-A16 P1(SXT9)的CV-A16 3CD蛋白酶加工產生的腸病毒CV-A16 VLP具有致免疫性並在小鼠中誘導抗體。這些抗體能夠辨識腸病毒CV-A16病毒抗原。再者，藉由CV-A16 P1(SXT6)的EV-A71 3CD蛋白酶加工產生的腸病毒CV-A16 VLP具有致免疫性並在小鼠中誘導抗體。參見圖5。 　　[0106] 藉由表現桿狀病毒表現匣SXT6(即藉由EV-A71 3CD蛋白酶加工CV-A16 P1產生的CV-A16 VLP)獲得的腸病毒CV-A16 VLP提供免疫反應係相較於當VLP獲自桿狀病毒表現匣SXT9時，觀察到的免疫反應有無法預期地改善。參見圖5，其比較了由桿狀病毒SXT6的表現匣獲得的腸病毒CV-A16 VLP與藉由利用桿狀病毒SXT9的表現匣的桿狀病毒表現獲得的腸病毒CV-A16 VLP的免疫反應。 　　[0107] 由桿狀病毒SXT6產生的腸病毒CV-A16 VLP，即藉由EV-A71 3CD蛋白酶加工CV-A16 P1產生的CV-A16 VLP，證實無法預期地改善了針對腸病毒CV-A16病毒的免疫反應(相較於當CV-A16 P1多肽係藉由同族CV-A16 3CD蛋白酶而獲得的VLP)。 　　[0108] 此種用於產生針對腸病毒CV-A16病毒的功能性抗體及經改善之免疫反應的VLP品質改善係無法預期的。本發明的致免疫性VLP可投予個體以誘導針對人腸病毒的優異的免疫反應及中和抗體和賦予增強預防腸病毒CV-A16病毒感染。 　　[0109] 本發明因此提供用於抵抗腸病毒的保護和/或治療之病毒樣顆粒(VLP)。本發明另提供用於抵抗腸病毒的保護和/或治療之致免疫性組成物和/或疫苗形式之病毒樣顆粒(VLP)。更特定言之，本發明提供腸病毒CV-A16 VLP，其誘導抵抗腸病毒CV-A16病毒感染的免疫反應和中和抗體反應。再更特定言之，本發明提供了腸病毒CV-A16之組裝，係自表現CV-A16 P1多肽及EV-A71 3CD蛋白酶的表現構築體而組裝，其中該VLP基本上沒有聚集。 　　[0110] 本發明達到提供包含腸病毒VLP之新穎疫苗，該VLP誘導免疫反應、保護和/或中和抗體反應，抵抗選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D之腸病毒及這些病毒種的任何血清型病毒，其中該腸病毒P1多肽係利用自衍生自異源性腸病毒(特言之，腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶)的蛋白酶而加工。 　　[0111] 本發明進一步達到提供包含腸病毒CV-A16 VLP的新穎疫苗，該VLP誘導抵抗CV-A16的免疫反應和/或中和抗體反應。這成就更顯著的是在於：這種腸病毒CV-A16 VLP自藉由EV-A71 3CD蛋白酶所加工的CV-A16 P1多肽組裝。以本發明，提供了包含VLP的疫苗的生產，該VLP誘導一或多種對腸病毒的VP0、VP2、VP3和/或VP4表位的免疫反應和/或中和抗體反應，該腸病毒選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D和任何這些病毒種之血清型病毒，係自EV-A71 3CD蛋白酶來加工腸病毒P1多蛋白。這藉由令人驚訝的VLP組裝來實現，該VLP誘導一或多種腸病毒及任何腸病毒基因型(其藉由異源性EV-A71 3CD蛋白酶自腸病毒P1多蛋白加工而來，該EV-A71 3CD蛋白酶不是天然地與該特定P1多肽締合)的VP0、VP1、VP2、VP3和/或VP4的表位中和抗體表位。 　　[0112] 令人驚訝地發現，根據本發明，當自匣來製造時，人腸病毒VLP實際上可組裝以模擬天然病毒抗原性，該匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽核酸序列的啟動子，其中該編碼腸病毒P1多肽的核酸序列係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)的核酸序列，其中編碼該IRES的該核酸序列係可操縱地連接至編碼異源性EV-A71 3CD蛋白酶之核酸序列，其中該異源性EV-A71 3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下以提供誘導保護性和/或中和免疫反應之VLP。 　　[0113] 特定言之，經發現，儘管藉由EV-A71 3CD蛋白酶加工，但根據本發明之CV-A16 VLP誘導抵抗腸病毒CV-A16感染之保護性和/或中和免疫反應。 　　[0114] 本發明因此提供包含腸病毒VLP的新穎組成物及疫苗調合物，該VLP自表現匣來製造，該表現匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽核酸序列的啟動子，其中該編碼腸病毒P1多肽的核酸序列係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)的核酸序列，其中編碼該IRES的該核酸序列係可操縱地連接至編碼異源性EV-A71 3CD蛋白酶之核酸序列，其中該異源性EV-A71 3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下以提供誘導中和抗體之腸病毒VLP。 　　[0115] 根據本發明，係提供製備本發明之VLP之方法。 　　[0116] 因此，本發明在另外態樣中包括用於製造本發明之VLP之方法，該方法可包括下列步驟：構築表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽的核酸的啟動子，其中該編碼腸病毒P1多肽的核酸係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)的核酸，其中編碼該IRES的核酸係可操縱地連接至編碼EV-A71 3CD蛋白酶的核酸，其中該EV-A71 3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下以提供誘導免疫反應和/或中和抗體反應之腸病毒VLP。 　　[0117] 所提供的是係經選殖至適合載體(諸如例如桿狀病毒載體)中的表現匣，其經轉形/轉染至適當的宿主細胞中，諸如例如昆蟲細胞(諸如秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(例如Sf9細胞)，以表現並純化本發明之VLP。 　　[0118] 本發明在另外態樣中包括用於製造該等VLP之方法，該方法可包括下列步驟：(i) 構築表現匣，該表現匣包含可操縱地連接至編碼腸病毒多肽P1的核酸之啟動子，該核酸係可操縱地連接至內核糖體進入位點(IRES)，該IRES亦係可操縱地連接至編碼腸病毒EV-A71 3C或3CD蛋白酶的核酸；(ii) 以含有該表現匣的構築體轉染、轉形或感染適合的宿主細胞；(iii) 在細胞於表現該匣中所包含的核酸後製造病毒樣顆粒(VLP)的條件下培養該宿主細胞。 　　[0119] 在該表現匣中製造3CD蛋白酶截斷及突變可達到VLP的產率增加。舉例而言，EV-A71的3C蛋白酶之甘胺酸，其係GenBank登錄號DQ341362.1的第1671個胺基酸，可使用定點突變而有利地改變成丙胺酸(G1671A)，以表現EV-A71 3C突變型並之後加工腸病毒P1多肽。 　　[0120] 所提供的是係經選殖至載體(諸如例如桿狀病毒載體)中的表現匣，其經轉形、轉染或感染至適當的宿主細胞中，諸如例如昆蟲細胞(諸如但不限於秋夜盜蛾(Spodoptera frugiperda)(例如Sf9細胞)，以表現並純化本發明之VLP。 　　[0121] 可用於醫藥的包含本發明之VLP之組成物可根據已知方法來調配，諸如摻和醫藥上及免疫上可接受之載體和/或佐劑和/或另外抗原決定位(antigenic determinant)。此等調合物之載體及方法的實例可見於Remington's Pharmaceutical Sciences。為形成適用於有效投予醫藥上可接受之組成物，此等組成物會含有有效量的一或多種本發明之VLP。此等組成物可含有衍生自多於一種腸病毒之VLP。 　　[0122] 本發明之疫苗組成物可以足以誘導針對一或多種腸病毒的免疫反應和/或中和抗體反應的量投予至個體。該有效量可根據各種因素而異，諸如個體病況、體重、性別及年齡。其他因素包括投予模式。疫苗可藉由各種路徑提供個體，諸如皮下、局部、口服、黏膜、靜脈內、非經腸胃、及肌內。 　　[0123] 包含一或多種本發明之VLP之疫苗可含有本技術領域中已熟知的必要另外抗原決定位和/或佐劑以在宿主內誘導保護和/或中和免疫反應。此等疫苗通常安全且不具有毒性副作用，且可藉由有效路徑來投予、且安定、且相容於本技術領域中已知的疫苗載體。 　　[0124] 該疫苗可以本技術領域中已知的劑型投予，諸如例如、但不限於注射劑、膠囊、懸浮液、酏劑、或液態溶液形式。該疫苗可以單劑或多劑投予。本發明另一態樣包括一或多種本發明之VLP併以一或多種適合的佐劑，諸如ISCOMS、明礬、氫氧化鋁、磷酸鋁、Quil A及其他皂素或任何其他佐劑，如Vanselow (1987) S. Vet. Bull. 57 881-896中所述者。用語“磷酸鋁”及“氫氧化鋁”的意義，如本文中所使用，包括適用於佐劑疫苗的所有磷酸鋁或氫氧化鋁形式。 　　[0125] 如本文中及申請專利範圍中所使用，下列所述之用語及短語具有下列之意義。 　　[0126] “抗體”係指免疫球蛋白分子，其由B淋巴細胞(B lymphoid cell)製造、具有特定胺基酸序列、藉由抗原(免疫原)在人或其他動物中所誘發。這些分子特徵在於與抗原特異性反應。 　　[0127] “抗體反應”或“體液反應(humoral response)”係指某一類免疫反應，其中抗體係藉由B淋巴細胞製造並反應抗原刺激而分泌到血液和/或淋巴中。在正常功能的免疫反應中，抗體特異性結合至細胞(例如病原體)表面上的抗原、標記要由吞噬細胞和/或補體介導的機制所破壞的細胞。 　　[0128] “抗原”係指任何物質，當其與適當細胞接觸導致誘發敏感及/或免疫反應性之狀態，且在體內或試管內與該經致敏之個體的抗體及/或免疫細胞以可顯現之方式反應。 　　[0129] “表位”係指在複合抗原分子上最簡單形式之抗原決定位。此為免疫球蛋白或T細胞受體所辨識之抗原的特定部分。 　　[0130] “細胞反應”或“細胞宿主反應”係指一種由能直接清除病毒感染或癌細胞之特定輔助及殺手T細胞所媒介之免疫反應。 　　[0131] “抗原呈現細胞(Antigen-presenting cell)”係指抗原誘導事件之附屬細胞，其主要功能為處理及呈現抗原給淋巴細胞。抗原呈現細胞(APC)與抗原之交互作用係免疫誘導中之關鍵步驟，因為其使淋巴細胞能面對及辨識抗原性分子並變得活化。例示性APC包括巨噬細胞、蘭氏(Langerhans)樹突細胞、濾泡樹突細胞及B細胞。 　　[0132] “B-細胞”係指一種製造與抗原交互反應之免疫球蛋白或抗體之淋巴細胞。 　　[0133] “細胞毒性T淋巴細胞”係一種特化之淋巴細胞，其能摧毀外來細胞及受到感染原感染之宿主細胞，該等細胞製造病毒性抗原。 　　[0134] “基本上無聚集或聚集體(Essentially free of aggregation or aggregates)”，當使用於在此說明書中以描述VLP、疫苗及組成物時，意指VLP、疫苗、或組成物包含少於5%、少於2%、少於1%的聚集或聚集體。 　　[0135] 用語“基本上由...組成(consisting essentially of)或(consists essentially of)”係指除了該些必備成份以外，其他成份亦可能存在於組成物中，惟其該等組成物之實質、基本及/或新穎特徵不受彼等存在之實質影響。 　　[0136] 二價(bivalent)：二價當用於描述疫苗時，意指疫苗將誘導抵抗二種腸病毒的免疫反應。 　　[0137] 異源性(heterologous)：異源性，如關於腸病毒，係屬於不同科、屬、血清型、基因群(genogroup)或株的二或更多種腸病毒。異源性，如關於蛋白酶，意指蛋白酶來源的腸病毒，係不同於P1多肽來源的腸病毒(即源自異源腸病毒)的腸病毒。腸病毒P1多肽係藉由非天然與3CD蛋白酶相聯的蛋白酶(即非同族蛋白酶)而加工。 　　[0138] 中和抗體反應(neutralizing antibody response)：中和抗體反應是免疫系統特化細胞辨識抗原呈現、並啟動特異性免疫反應而預防來自例如病毒的病原感染標的細胞之免疫反應。 　　[0139] 在一實施態樣中，根據本發明之VLP可誘發免疫反應。用語“免疫反應”和/或“中和抗體”如本文中所使用，意欲表示經接種的個體可自身抵抗或預防疫苗接種所抵抗之病原體感染。 　　[0140] 可操縱地連接(operably linked)：可操縱地連接意指所描述的組件處於允許彼等以其預期方式發揮功能的關係中。因此，例如，與核酸“可操作地連接”的啟動子意指順反子或多於一個順反子的啟動子和核酸以此方式連接而會產生單一順反子、單一雙順反子、或單一多順反子信使RNA(mRNA)。信使RNA的蛋白質表現可根據啟動子和/或核酸的轉錄/轉譯元件來調控。在另一實例中，以在順反子上游(5')的方向插入表現匣中的內核糖體進入位點(IRES)序列意指IRES序列和順反子的核酸連接的方式而在IRES下游、順反子mRNA轉譯係在IRES的控制下調控。 　　[0141] 病毒樣顆粒(virus-like particle)：病毒樣顆粒是病毒結構多肽、即殼體多肽VP0、VP1、VP2、VP3、VP4的組合，該殼體多肽/蛋白質組裝方式及構形類似於結構上真正病毒，然而，VLP不包含病毒基因體。 　　[0142] 顆粒可由天然殼體特點來特徵分析。 　　[0143] 微小RNA病毒殼體結構特徵在於口袋因子(pocket factor)位於其中、穩定該殼體結構的峽谷樣結構(canyon)所包圍的五折頂點(five-fold vertex)。當病毒與其細胞受體相互作用時，受體通常與峽谷樣結構的壁結合、取代口袋因子並造成結構變化，導致病毒形成所謂的A顆粒，其中會有孔洞形成在殼體，使病毒基因體逃離進入該細胞。Rossmann等人(Trends in Microbiology (2002) vol10 No 7 324-331)已透徹地回顧了微小RNA病毒-受體的交互作用。因此，能夠阻斷殼體與病毒受體的交互作用之抗體，將發揮中和抗體及阻斷感染的作用。 　　[0144] EV-A71具有中和表位，其位於他處，而不是位在五折頂點，如Plevka等人(PNAS 111(6):2134-9 (2014))所示。在涉及VP3和VP2之間交互作用的雙折和三折軸上有中和的表位。 　　[0145] 腸病毒P1：腸病毒P1多肽是腸病毒的主要結構多肽，可從中截切個別結構多肽VP0、VP1、VP2、VP3和VP4。結構多肽順序在P1多肽上的排列從N端開始是VP0、VP3和VP1。在RNA基因體包被在天然病毒中的期間，VP0經切割成多肽VP4和VP2。 　　[0146] 基本上不含、基本上無(essentially free)：意指組成物多於90%不含VLP聚集體。一實施態樣可提供組成物係多於95%不含VLP聚集體。又，一實施態樣可提供組成物係多於99%不含VLP聚集體。 　　[0147] 在一實施態樣中，該表現匣基本上由編碼人腸病毒A P1多肽、IRES及衍生自不同種/基因型的人腸病毒3CD蛋白酶之核酸組成，其中該3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下，且該3CD蛋白酶加工該人腸病毒A P1多肽成結構性殼體多肽。該結構性殼體多肽自組裝成病毒樣顆粒。 　　[0148] 在一實施態樣中，該表現匣基本上由編碼人腸病毒CV-A16 P1多肽、EMCV IRES及衍生自不同種/基因型的人腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶之核酸組成，該3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下，且該腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶加工該人腸病毒CV-A16 P1多肽成結構性殼體多肽，該結構性殼體多肽自組裝成病毒樣顆粒。 　　[0149] 可參照如所附圖式中描繪的本發明之各種實施態樣。 實施例1.構築表現匣 　　[0150] 腸病毒屬的所有成員，包括EV-A71、脊髓灰白質炎病毒和CV-A16均具有單股正義RNA基因體，其具有單一開讀框，其編碼多肽P1(由結構多肽VP0、VP1、VP2、VP3及VP4組成)，及數種非結構蛋白(包括病毒蛋白酶3C和3CD，其負責截切多肽P1成個別結構性殼體多肽VP0、VP3和VP1)，其中VP0最終會經截切成VP2和VP4。 　　[0151] 腸病毒EV-A71和CV-A16以及脊髓灰白質炎病毒的完整基因體序列可在GenBank中獲得，並可在國家生物技術資訊中心(NCBI)存取。 　　[0152] 可構築編碼P1多肽的重組DNA分子，由此編碼腸病毒結構多肽及蛋白酶之開讀框可使用經適當設計、與腸病毒核酸序列互補之引子藉由PCR擴增獲得。適合的引子可根據標準技術自公開可獲得腸病毒核酸序列、諸如可在GenBank中獲得並可在國家生物技術資訊中心(NCBI)存取的完整基因體序列來設計。再者，基因序列可藉由本技術領域中已知的技術來從頭合成。 　　[0153] 例如，腸病毒EV-A71的完整基因體的GenBank登錄號包括DQ341362、AB204852、AF302996和AY465356；人的腸病毒CV-A16的完整基因體的GenBank登錄號包括KF924762.1；人的腸病毒C脊髓灰白質炎病毒I型(PV1)基因體的完整基因體的GenBank登錄號包括V01149和V01150。 實施例2.構築表現匣以獲得CV-A16 VLP。 　　[0154] pSN01已用於產生攜帶用於製造腸病毒VLP的表現匣的重組桿狀病毒。入門殖株pSN01係源自於PCT國際申請號PCT/IB2012/003114中所描述的工作，請參見實施例1及圖1，且是桿狀病毒表現構築體SN07的來源，於PCT國際申請號PCT/IB2012/003114中描述。 　　[0155] pSN01帶有表現匣，其包含編碼腸病毒EV-A71 P1多肽、IRES及源自腸病毒EV-A71的腸病毒3CD蛋白酶之核酸。 　　[0156] 可使用pSN01以產生進一步表現匣，其包含不同P1多肽。此表現匣之實例可係包含來自CV-A16的P1多肽之表現匣。 　　[0157] 進行了廣泛的生物資訊學分析，以識別用於腸病毒CV-A16 P1的共通胺基酸序列。CV-A16 P1編碼序列係針對在昆蟲細胞中表現作密碼子最佳化，且P1編碼序列係藉由本技術領域中已知的基因合成技術從頭合成。 　　[0158] 使用圖6中所描繪的pSN01以產生表現匣，其中在pSN01中的EV-A71的P1編碼序列藉由本技術領域中已知方式置換成CV-A16之P1編碼序列。 　　[0159] 舉例而言，經密碼子最佳化之CV-A16 P1基因係經合成，有該編碼區域上游(5’)的BglI位點、部分IRES、及P1終止密碼子下游的BglI位點。該合成DNA分子係經選殖至pUC57中。pUC57-CV-A16 P1-IRES(部分)-BglI質體以BglI和BglII消化，且純化含CV-A16 P1-IRES(部分)的BglI/BglII DNA片段。pSN01以BglI和BglII及BglI/BglII和pSN01的載體片段消化，其中該EV-A71 P1-IRES(部分)已經被移除，經過純化並用作CV-A16 P1 DNA片段的載體。將純化的CV-A16 P1-IRES(部分)DNA片段選殖到BglI/BglII消化的pSN01載體，便得到了pSXT6質體。 　　[0160] pSXT6包含表現匣，其包含CV-A16 P1多肽、IRES及源自EV-A71的3CD蛋白酶。 　　[0161] 包含CV-A16 P1多肽、IRES、及CV-A16 3CD蛋白酶之桿狀病毒表現構築體係利用已知的編碼該P1多肽及3CD蛋白酶的CV-A16基因序列而獲得，其中編碼此P1多肽及3CD蛋白酶的核酸可根據本技術領域中已知技術從頭合成。編碼該P1多肽及該3CD蛋白酶的核酸可用根據本技術領域中已知及本文中所述之方法以pSN01中的P1多肽及3CD蛋白酶中取代。 　　[0162] pSXT9包含表現匣，其包含CV-A16 P1多肽、IRES及CV-A16 3CD蛋白酶。 　　[0163] pSN01、pSXT6及pSXT9係用以產生桿狀病毒表現構築體，該SN01及SXT6構築體帶有包含腸病毒P1多肽、IRES、及衍生自腸病毒EV-A71的3CD蛋白酶的表現匣。使用來產生重組桿狀病毒穿梭質體(bacmid)之方法係如Invitrogen的GATEWAY®系統使用手冊(Waltham, MA)中所述。pSN01、pSXT6和pSXT9被用於產生重組桿狀病毒穿梭質體，其中重組桿狀病毒穿梭質體係經序列驗證。使用PureLink^® HiPure Plasmid Miniprep (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)純化重組桿狀病毒穿梭質體，並接著按照標準操作程序轉染到Sf9細胞中，例如在Invitrogen的Guide to Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS)和Insect Cell Culture Techniques中所述之操作程序。 　　[0164] 3天後，收集上清液並命其為傳代1(passage 1)(p1)桿狀病毒庫存。這是小量低力價桿狀病毒庫存，其藉由來感染Sf9細胞擴增以產生傳代2(p2)桿狀病毒庫存。該傳代2桿狀病毒係用於感染Sf9細胞以產生傳代3(p3)桿狀病毒庫存，其接著用於評估VLP表現。 　　[0165] 自pSN01所製造之重組桿狀病毒係在本文中命為SN07，並且描述於PCT/IB2012/003114。由pSXT9所製造之重組桿狀病毒係命為SXT9。 　　[0166] 由bacSXT6所製造之重組桿狀病毒係命為SXT6。 　　[0167] 用於構築體以提供CV-A16 VLP的表現匣的元件之代表示意圖係示於圖1。該桿狀病毒SXT6構築體的表現匣之核苷酸序列係提供於SEQ ID NO: 1。 　　實施例3.以重組桿狀病毒SXT6感染之Sf9細胞中表現CV-A16病毒樣顆粒。 　　[0168] 用重組桿狀病毒SXT6以0.01的病毒感染劑量(multiplicity of infection)(MOI)來感染Sf9細胞，並在接種後第3天收穫。將培養物予以3100xg在15℃離心30分鐘(min)。將沉澱物以PBS洗滌一次，再懸浮於含有0.1%的Triton X100和無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(Sigma)的低滲透壓緩衝液(1.5 mM MgCl₂ , 50 mM KCl, 20 mM HEPES)，然後在室溫(RT)下搖晃30分鐘。接著以6600xg在4℃離心20分鐘，使細胞溶裂物變得澄清。 　　[0169] 將樣本經由SDS-PAGE在12%凝膠上分離，並接著電轉移到硝化纖維素膜上。將膜以含有5%脫脂牛奶的PBS在室溫(RT)下封阻1小時(hr)，並接著以針對腸病毒A VP0的小鼠單株抗體(MAb 979)、針對腸病毒VP1的兔子高免疫多株抗體、或針對腸病毒VP3的兔子高免疫多株抗體為探針，在室溫下過夜。與辣根過氧化物酶(HRP)共軛之抗小鼠IgG一同培育1小時後，接著在TMB基質中於室溫下培育10分鐘進行顯色，以偵測結合的抗體。 　　[0170] 圖4顯示CV-A16結構多肽VP0、VP1及VP3存在於經重組桿狀病毒SXT6(其攜有CV-A16 (P1)及EV-A71 3CD蛋白酶編碼序列)感染之Sf9細胞之溶裂物中。該圖顯示CV-A16多肽係藉由EV-A71 3CD蛋白酶來加工以提供結構性殼體多肽，其組裝以形成VLP。 實施例4.當重組桿狀病毒SXT6產生的VLP被用於免疫小鼠時，抗CV-A16 VP1和VP0/VP2的抗體產生。 　　[0171] 在弗氏完全佐劑存在下，用200 μL經部分純化的重組桿狀病毒產生的SXT6 VLP腹膜內免疫接種8-10週大的雌性Balb/c小鼠。二週後，再用200 μL經部分純化的重組桿狀病毒產生的SXT6 VLP在弗氏不完全佐劑存在下免疫接種這些小鼠。二週後，將小鼠安樂死，並將收獲血清並存於-80°C以供進一步分析。將血清樣本在56°C下培育30 min，之後將它們使用於接下來所述之免疫分析。 　　[0172] 使用經純化之來自CV-A16的重組次單元殼體多肽VP0、VP1及VP3進行間接ELISA。將孔在4°C下塗覆以重組次單元殼體多肽過夜。將孔洗滌、封阻、並接著以各種濃度來自經免疫小鼠的血清在室溫下培育1 hr。以經HRP共軛之抗小鼠IgG在室溫下培育1 hr、接著加入TMB基質、在室溫下5 min後，偵測CV-A16特異性抗體的存在。加入0.1N HCl來阻斷反應。測量在450 nm波長下的吸光度。 　　[0173] 表1顯示來自個別小鼠的抗血清結合至來自CV-A16個別殼體蛋白之力價。血清對VP0表現出範圍在1:1000至大於1:32,000的高力價；對VP1的範圍從1:4000到大於1:32,000；且對CV-A16 VP3的力價至少為1:500，其中一隻小鼠的力價高達1:8,000。一隻小鼠(小鼠2)並未有好的反應，對VP0及VP1的力價低於偵測極限。 　　[0174][0175] 此實施例顯示所有主要殼體蛋白均有表現且能夠誘導小鼠中的抗體。 實施例5. 藉由重組桿狀病毒所製造之VLP產生針對CV-A16病毒之抗體。 　　[0176] 在弗氏完全佐劑存在下，用200 μL經部分純化的SXT6 VLP腹膜內免疫接種8-10週大的雌性Balb/c小鼠。二週後，再用200 μL經部分純化的的SXT6 VLP在弗氏不完全佐劑存在下免疫接種這些小鼠。二週後，將小鼠安樂死，並將收獲血清並存於-80°C以供進一步分析。將血清樣本在56°C下培育30 min，之後將它們使用於免疫分析。 　　[0177] 使用來自經CV-A16感染之橫紋肌肉瘤細胞的經感染之細胞的溶裂物進行間接ELISA。將ELISA盤的孔以經感染之細胞的溶裂物在4°C培育過夜來塗覆。將孔洗滌、封阻、並接著以稀釋1:100的來自經SXT6 VLP免疫小鼠的血清在室溫下培育1 hr。以經HRP共軛之抗小鼠IgG在室溫下培育1 hr、接著加入TMB基質、在室溫下5 min後，偵測CV-A16特異性抗體的存在。加入0.1N HCl來阻斷反應。測量在450 nm波長下的吸光度。 　　[0178] 圖5顯示來自用重組桿狀病毒SXT6及SXT9 VLP免疫的所有小鼠之血清(1:100稀釋)結合至經CV-A16感染的細胞溶裂物，而用對照抗原FGUS免疫的小鼠未顯著結合經CV-A16感染的細胞溶裂物。這顯示SXT6 VLP和SXT9 VLP能夠誘導在小鼠內辨識天然CV-A16病毒的抗原之抗體。相較於由SXT9 VLP所獲得者，SXT6 VLP提供無法預期地經改善之免疫反應。 實施例6.當重組桿狀病毒產生的VLP被用於免疫小鼠時，抗CV-A16 的中和抗體產生。 　　[0179] 溶菌斑減少中和試驗50(plaque reduction neutralization test 50)(PRNT₅₀ )係進行如下。37℃下將連續稀釋的小鼠血清與300 PFU/mL的EV-A71或CV-A16病毒一起培育1小時。然後將血清-病毒混合物加入到24孔板中的Vero細胞單層中，37℃下2小時。加入羧甲基纖維素覆蓋培養基，並將平板在37℃下培育。接種後4至5天，將單層固定並用萘藍黑染色並手動計數溶菌斑。PRNT₅₀ 力價是相較於接種病毒且無血清的對照組盤孔，在溶菌斑數產生≥50%減少的血清最低稀釋度。 　　[0180] 表2顯示了來自由重組桿狀病毒SXT6所製造的CV-A16 VLP所免疫接種的每隻個別小鼠的血清之倒數PRNT₅₀ 力價。來自所有測試小鼠的血清能夠以1:20至1:160範圍的力價中和CV-A16病毒，而來自用對照桿狀病毒FGUS免疫的小鼠的血清不能中和CV-A16病毒。結果證實由重組桿狀病毒SXT6產生的VLP含有功能性CV-A16中和表位。 　　[0181][0182] 當PRNT₅₀ 力價於中獲自對照小鼠及經SXT6 VLP免疫接種小鼠的血清中作比較時，經SXT6 VLP免疫接種小鼠製造中和抗體。 　　[0183] 本發明之範圍並非意欲受限於本文中所述之特定實施態樣。事實上，除了本文中所述者，熟習本技術領域者自上文說明，將清楚明瞭本發明之各種修飾。此等改良係意欲為後附之申請專利範圍之範圍內。 　　[0184] 本文中所有引用之專利、申請案、公開發表、測試方法、文獻及其他材料係以引用方式併入本案。 參考資料 　　1. 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[0071] 圖1.用於重組桿狀病毒表現構築體以提供腸病毒CV-A16 VLP的表現匣的元件之代表示意圖。腸病毒表現匣[P1+IRES+3CD]。A. 表現構築體SXT6，該表現匣編碼腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES和腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶。B. 表現構築體SXT9，該表現匣編碼腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES和腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶。 　　[0072] 圖2.粒徑篩析分析腸病毒CV-A16 VLP，其係使用提供包含腸病毒CV-A16 P1多肽及腸病毒CV-A16 3CD蛋白酶的表現匣的重組桿狀病毒所製造。 　　[0073] 圖3.粒徑篩析分析腸病毒CV-A16 VLP，其係使用提供包含腸病毒CV-A16 P1多肽、IRES及腸病毒EV-A71 3CD蛋白酶的表現匣的重組桿狀病毒所製造。 　　[0074] 圖4.西方印漬顯示腸病毒CV-A16結構多肽VP0、VP1及VP3(箭頭)存在於經重組桿狀病毒表現構築體SXT6感染之Sf9細胞之溶裂物中，其中該表現匣包含CV-A16 P1多肽及EV-A71 3CD蛋白酶之編碼序列。圖4A係以抗腸病毒A VP0/VP2之小鼠單株抗體作為探針偵測；圖4B係以抗VP1的兔子高免疫多株抗體作為探針偵測；而圖4C係抗VP3的兔子高免疫多株抗體以作為探針偵測。箭頭分別指出圖4A、4B及4C的殼體蛋白VP0、VP1、及VP3。 　　[0075] 圖5.間接型ELISA顯示當小鼠以病毒樣顆粒作為免疫原來接種時，製造了針對腸病毒CV-A16病毒抗原之抗體。藉由包含表現匣(包含CV-A16 P1多肽、IRES及EV-A71 3CD蛋白酶(SXT6))重組桿狀病毒所製造之VLP所誘導之抗體量，與藉由包含表現匣(包含CV-A16 P1多肽、IRES及CV-A16 3CD蛋白酶(SXT9))重組桿狀病毒所製造之VLP所誘導之抗體量比較。來自以SXT6 VLP或SXT9 VLP免疫接種的小鼠之血清結合至來自經CV-A16感染橫紋肌肉瘤細胞溶裂物的CV-A16抗原實心方形符號代表來自以對照抗原FGUS免疫接種的對照小鼠個別血清。實心圓形代表來自以SXT6 VLP免疫接種的小鼠個別血清。空心圓形代表來自以SXT9 VLP免疫接種的小鼠個別血清。Y軸代表在450 nm波長淨光學密度讀值(OD₄₅₀ )。 　　[0076] 圖6.在pSN01桿狀病毒表現構築體中的EV-A71 VLP表現匣[P1+IRES+3CD]，其描述於PCT/IB2012/003114中，包含腸病毒EV-A71 P1、IRES和EV-A71 3CD蛋白酶。

Claims (19)

1. 一種病毒樣顆粒(VLP)，其誘導抵抗腸病毒感染之保護和/或中和抗體反應，該腸病毒係該VLP的腸病毒多肽來源。
2. 如請求項1之VLP，其中該腸病毒係選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D。
3. 如請求項1之VLP，其中該腸病毒係CV-A16。
4. 如請求項1之VLP，其中該腸病毒係選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型。
5. 一種編碼核酸之表現匣(nucleic acid encoding an expression cassette)，其包含可操縱地連接至編碼腸病毒P1多肽的核酸之啟動子，該腸病毒P1多肽包含結構多肽VP0、VP3及VP1，其係可操縱地連接至編碼內核糖體進入位點(IRES)之核酸，且該IRES係可操縱地連接至編碼EV-A71 3CD蛋白酶之核酸。
6. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自選自腸病毒A、腸病毒B、腸病毒C或腸病毒D之腸病毒。
7. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自腸病毒CV-A16。
8. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中該腸病毒P1多肽係來自選自脊髓灰白質炎病毒1型、脊髓灰白質炎病毒2型或脊髓灰白質炎病毒3型之腸病毒。
9. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中該EV-A71 3C或3CD蛋白酶係在該IRES的轉譯控制下。
10. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中編碼該IRES的該核酸序列係已經基因修飾。
11. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中編碼該3CD的該核酸序列係已經基因修飾。
12. 如請求項5之編碼核酸之表現匣，其中該IRES係衍生自腦心肌炎病毒(EMCV)或腸病毒。
13. 一種製造腸病毒VLP之方法，該方法包含下列步驟：將包含如請求項5之編碼核酸之表現匣的原核或真核宿主細胞培養足以製造腸病毒多肽P1及EV-A71 3CD蛋白酶及足以形成VLP的一段時間。
14. 如請求項13之方法，其另包含自該宿主細胞回收該等VLP之步驟。
15. 一種組成物，其包含由如請求項13之方法所製造之腸病毒CV-A16 VLP，其中該組成物基本上係無腸病毒CV-A16 VLP之聚集體(aggregate)。
16. 一種疫苗，其包含如請求項1之VLP。
17. 一種疫苗，其包含自如請求項13之方法所獲得之VLP。
18. 如請求項1之VLP，其係使用於疫苗，該疫苗供接種個體以抵抗腸病毒之感染，該使用包含投予該個體有效量的該腸病毒病毒樣顆粒以當被投予該個體時誘導針對該腸病毒的免疫反應和/或中和抗體反應，該VLP之該多肽係衍生自該腸病毒。
19. 一種有效量之如請求項1之病毒樣顆粒於製備在個體內提供抵抗腸病毒感染的免疫反應和/或中和抗體反應的藥物之用途。