JP6190378B2 - ヒトエンテロウイルスに対する抗原及びワクチン - Google Patents
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Description
・牛エンテロウイルス
・ヒトエンテロウイルスA
・ヒトエンテロウイルスB
・ヒトエンテロウイルスC
・ヒトエンテロウイルスD
・ヒトライノウイルスA
・ヒトライノウイルスB
・ヒトライノウイルスC
・豚エンテロウイルスB
・サルエンテロウイルスA
エンテロウイルス血清型のHEV71、EV−76、EV−89、EV−90、EV−91、EV−92、並びにコクサッキーウイルスA16は、ヒトエンテロウイルスAで発見された。
血清型コクサッキーウイルスB1(CV−B1)、CV−B2、CV−B3、CV−B4、CV−B5(豚水疱病ウイルス[SVDV]を含む)、CV−B6、CV−A9、エコーウイルス1(E−1;E−8を含む)、E−2、E−3、E−4、E−5、E−6、E−7、E−9(CV−A23を含む)、E−11、E−12、E−13、E−14、E−15、E−16、E−17、E−18、E−19、E−20、E−21、E−24、E−25、E−26、E−27、E−29、E−30、E−31、E−32、E−33、エンテロウイルスB69(EV−B69)、EV−B73、EV−B74、EV−B75、EV−B77、EV−B78、EV−B79、EV−B80、EV−B81、EV−B82、EV−B83、EV−B84、EV−B85、EV−B86、EV−B87、EV−B88、EV−B93、EV−B97、EV−B98、EV−B100、EV−B101、EV−B106、EV−B107、EV−B110(チンパンジー由来)、並びにサルエンテロウイルスSA5は、ヒトエンテロウイルスBで発見された。
血清型EV−95、EV−96、EV−99、EV−102、EV−104、EV−105、EV−109は、ヒトエンテロウイルスCで発見された。
血清型EV−68、EV−70、EV−94は、ヒトエンテロウイルスDで発見された。
ポリオウイルス血清型のPV−1、PV−2、PV−3はヒトエンテロウイルスCで発見された。
本発明の異なる様態は、中和抗体を誘導するウイルスのタンパク質、例えばP1タンパク質、或いはピコルナウイルスのVP0タンパク質、VP1タンパク質、VP2タンパク質、VP3タンパク質、及び/又はVP4タンパク質の組み合わせ、若しくはその免疫的活性フラグメント又は生物活性フラグメントを提供する。本発明は、上述のウイルスタンパク質及び/又はそのフラグメントを含む融合タンパク質を含み、当該融合タンパク質は、防御免疫性を持つ中和抗体の生成を誘導する、免疫的活性又は生物活性のものである。
発現カセットは、当該分野で周知に手段により構築されても良い。
1.1.HEV71のVLP発現カセット[P1+IRES+3CD]
特徴:
カセットサイズ:5172bp
prPs:ポックスウイルスの強力初期/後期 合成プロモーター、43bp
P1:EV71−SB12736−SAR−03からのP1タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)終止コドンを添加
2588bp
IRES:内部リボソーム導入部位、585bp
3CD:EV71−SB12736−SAR−03からの、C及びDのP3タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)ATGを添加
開始コドン及び終止コドン、1940bp
PacI:レアカッター、カセットをpSNX01にクローニング
(MVA del 3組み込み型ベクター)
カセットはpDONR221ゲートウェイエントリーベクター(インビトロジェン)にクローニングされ、pSN01を生成した。
発現カセットとpSN01プラスミドに関する概略図は、図1を参照すること。
1.2.HEV71のVLP発現カセット[P1+IRES+3C]
特徴:
カセットサイズ:3773bp
prPs:ポックスウイルスの強力初期/後期 合成プロモーター、43bp
P1:EV71−SB12736−SAR−03からのP1タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)終止コドンを添加
2588bp
IRES:内部リボソーム導入部位、585bp
3CD:EV71−SB12736−SAR−03からの、CのP3タンパク質のコード配列
(GenBankアクセス番号:DQ341362)ATGを添加
開始コドン及び終止コドン、551bp
PacI:レアカッター、カセットをpSNX01にクローニング
(MVA del 3組み込み型ベクター)
カセットはpDONR221ゲートウェイエントリーベクター(インビトロジェン)にクローニングされ、pSN03を生成した。
発現カセットとpSN03プラスミドに関する概略図は、図2を参照すること。
1.3.挿入HEV71[P1+IRES+3CD]又は[P1+IRES+3C]を含む組換えバキュロウイルスの取得方法
HEV71のP1+3CDの原物質はpSN01であり、P1+3CはpSN03である。目標は、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商標)マニュアル(2009)の指示に従って、HEV71−VLPカセットを、LR CLONASE(登録商標)を用いたattL/aaRインビトロ組換えにより、pSN01及びpSN03(エントリーベクター)からバキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーションベクター)に組み込むことである。
これによって、二つのリコンビナーゼ反応を構成した。
pSN01(EV71−P1+3CD)×pDEST8:pSN07を生成
pSN03(EV71−P1+3C)×pDEST8:pSN08を生成
pSN07及びpSN08を用いて、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商標)マニュアルに記載されているように、DH10Bacの形質転換により、組換えバクミドのbacSN07及びbacSN08を生成した。組換えバクミドにSf9細胞へのトランスフェクションを行うことで、組換えバキュロウイルスのSN07及びSN08をレスキューする。組換えバキュロウイルスのSN07及びSN08を、6個のウェルプレートに入っている感染Sf9細胞に用いて、切断した殻タンパク質の発現を評価した。VP1に対して特異的である多クローン性ウサギ抗血清を用いて、組換えバキュロウイルスに感染したSf9細胞から得た溶解物及び上清のウェスタンブロットでVP1タンパク質を特定した。
1.4.SN07に感染したSf9細胞の上清におけるVP1の発現
感染Sf9細胞の上清は、感染後3日目から7日目にかけて毎日採取したものである。タンパク質を12%SDS−PAGEで分解し、ニトロセルロース膜に移動させた後、多クローン性ウサギ抗VP1抗血清(1:4000希釈率)で一晩中検査し、続いてHRP共役抗ウサギ抗体(1:1000希釈率)を以って室温で1時間検査した。続いてTMBを用いてウェスタンブロット法を行った。結果は図3を参照すること。HEV71のVP1が切断されたことが分かり、感染後3日目と4日目の上清からタンパク質の発現が観測され、その後、VP1の発現量は減衰していった。Sf9細胞を感染させることにより、組換えバキュロウイルスのSN07は、上清で見付けられる抗原を生成する。
SN07、SN08、対照群のバキュロウイルスbacGUS、模倣感染(mock infected)を含む組換えバキュロウイルス分離株により、Sf9細胞を感染効率(MOI)10で感染させた。感染後3日目と4日目に上清及び溶解物を採取し、ウサギ抗VP1抗血清(1:4000希釈率)を用いてウェスタンブロット法によりタンパク質の発現を評価し、SN07及びSN08により生成されたタンパク質の収率を比較した。図4に示されているように、感染後3日目と4日目の両日において、上清及び溶解物の両方で、発現構築体SN07は、発現構築体SN08より多くの切断VP1を生成した。
感染後3日目にSN07に感染したSf9細胞からの上清を浄化し、100kDaのMWCOと共にAMICON(登録商標)フィルタ(Millipore社)を通過させた。濃縮液をテストし、切断したVP1及びVP0の存在を確認した。VP1の分子量は略33kDa、VP0の分子量は略36kDaであるため、これらのタンパク質は、オリゴマー型でしか濃縮液に残存していられないと思われた。図5に示されているように、これらの抗原は、100kDaのMWCO限外ろ過装置にかけられた上清の濃縮液に残存していた。これは、当該抗原がオリゴマー型と関連していることを示唆している。よって、VP1及びVP0は切断されており、他の殻タンパク質とオリゴマー関係(oligomeric association)にあると結論を出すことができる。
実施例3で製造したSN07に感染したSf9からの上清濃縮物を非近交系の白いマウス2群に接種した。使用した免疫化スケジュールは、図6に図示されている。
Sf9細胞をSN07により感染させ、72時間目、96時間目、120時間目に溶解物を採取した。免疫ブロット法でEV71のVP0に対する多クローン性ウサギ抗血清を調べた。その結果、VP0は感染後72時間目に発現したことが分かった。図7に示されているように、VP0の一部は、感染後96時間目から切断されVP2となった。従って、SN07感染細胞の溶解物にはVP0とVP2の両方が存在する。
ELISAプレートを同量の組換えVP1及びVP2で被覆し、プール中和マウス抗血清のテストに用いた。図8は、上清濃縮液から製造した抗原を接種されたマウスは、VP1に比べVP2により良く結合することを図示している。従って、当該抗体が機能的であり、高い力価でHEV71を中和すると結論を出すことができる。
図9のウェスタンブロットは、プール中和マウス抗血清は、各ウェルに同じ総量のタンパク質を添加した場合であっても、VP1に比べVP2及びVP0とより強く結合するということを図示している。これに基づいて、VP2及びVP0は、中和抗血清により認識できるエピトープを含むと推定することができる。
HEV71のVP1を含む免疫原性組成物は、マウスの免疫化に用いられる。同じく、HEV71のVP2及び/又はVP0を含む免疫原性組成物も、マウスの免疫化に用いられる。HEV71のVP2び/又はVP0により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルを、HEV71のVP1により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルと比較する。HEV71のVP2び/又はVP0により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルは、HEV71のVP1により免疫化を受けたマウスの中和抗体レベルより著しく高い。
本実施例は、プロテアーゼ3CDが媒介するバキュロウイルス感染細胞の破壊を低減させることでヒトエンテロウイルスC(ポリオウイルス)のVLPを効率的に生成する方法を提供する。
本実験は、単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築に関するものである。プロテアーゼ遺伝子3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図1に図示されている。プロテアーゼ遺伝子3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
単一2シストロン性伝令からの、P1領域及びプロテアーゼ3CDの発現に対する組換えバキュロウイルスベクターの構築は、例えば、図1に図示されている。プロテアーゼ遺伝子3CDは、EMCV IRESの制御の下で、キャップ非依存的翻訳により翻訳される。図10を参照すること。当該系は、プロテアーゼ3CDの発現の調整に利用することができる。つまり、突然変異IRES配列を評価し、P1タンパク質に比べて少ない量のプロテアーゼを生産する最弱のIRESを探し出す。
野生型又は突然変異型のEMCV IRESの制御の下でHEV71の殻タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスを、EMCV IRESからのHEV71の殻タンパク質の発現レベルについて評価した。バキュロウイルスは、実施例1におけるSN07からの野生型EMCV IRES、並びに3つの突然変異型IRES、つまり実施例10、11、12からのM1、M2、M3の制御の下で発現するVLPを生成し、当該VLPをHEV71の殻タンパク質のバキュロウイルス発現レベルに基づいて評価した。この試験には、異なるプロモーターの下でP1及び3CDを発現する組換えバキュロウイルス(F)、及びbacGUSを発現する制御組換えバキュロウイルス(G)も含まれる。Sf9細胞を5MOIで感染させ、実施例10〜12に記載されているように、3日目に溶解物と上清を両方とも採取した。溶解物及び上清を抗VP1抗体を以って探知し、HEV71の殻タンパク質の発現を検出した。
本発明は、単一免疫原として融合し、ワクチン接種を受けた個体において防御免疫反応を誘導する組換えHEV71とポリオウイルスの構造タンパク質の生成と用途に関する。本発明は、一般的に、HEV71及び/又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質、若しくはその免疫原性フラグメント、並びに組換えHEV71及び/又はポリオウイルスのサブユニット融合タンパク質と組み合わせられる抗原性補助剤を含む組換えHEV71及び/又はポリオウイルス由来の融合タンパク質ワクチン組成物に関する。HEV71及びポリオウイルスのサブユニット融合タンパク質は、VP1、VP2、VP3、VP4、それらの組み合わせ、及びそれらの免疫原性フラグメントの組み合わせから選ばれた殻タンパク質からなっても良い。本実施形態の一様態において、組換えHEV71及び/又はポリオウイルスの融合タンパク質は、HEV71又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質、並びにHEV71又はポリオウイルスのサブユニットタンパク質と遺伝的関連のある融合パートナータンパク質を含む。本発明は更に、大腸菌においてバキュロウイルスは勿論、VP0、VP4−VP2−VP3融合物、VP2−VP3−VP1融合物などのサブユニットワクチを発現する構築体を生成する方法を提供するものとして期待される。
ChampionTM pETSUMO 発現系(インビトロジェン)は、大腸菌において最高レベルの可溶性タンパク質を生成する。低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)融合物を用いて、発現融合タンパク質の溶解性を高める。発現後、11kDのSUMO部分を、高度特異的活性SUMO(ULP−1)プロテアーゼによりカルボキシル端末で切断することができる。更に、タンパク質の検出と精製に用いられるN末端6×Hisタグを含む。
VP1、VP2、VP0のコード配列を、それぞれ個別的に、実施例15に記載されているpET SUMOベクターにクローニングする。個別の殻タンパク質は、大腸菌内で発現し、実施例15に記載されている通りに精製される。精製タンパク質のVP0、VP1、VP2、VP3には、ウェスタンブロット法が施され、実際例4で用いられたプール中和血清により1:1000希釈で調べられる。実施例4で用いた対照群のマウス血清を、本実験でも使用するものとする。
組換えバキュロウイルスSN07に感染した細胞から得た20mlの上清を、10mlの単クローン性中和抗体(EV18/4/D6−1/F1/G9)に混合し、室温で1時間放置する。PBSにより予め平衡状態となったMabSelect SuReTM(GE Health Care)組換えタンパク質Aの1mlカラム(アガロースビードのサイズ:85um)を介して混合物を徐々にロードし、その後、20mlのPBSで洗浄し0.5mlの0.1Mグリシン−HCl(pH3.0)で溶出させる。30μlのTris−HCl(pH8.8)によりフラクションを中和させる。溶出フラクションにSDS−PAGE、クマシーブルー染色、脱染を順にかける。
バキュロウイルスSN07の上清濃縮液を用いて生じさせた単クローン性中和抗体(EV18/4/D6−1/F1/G9)を以ってアフィニティーカラム(AFC)を用意する。ウェスタンブロット法により溶出フラクションを分析し、その結果を図20にした。レーン1とレーン2の溶出フラクションを抗VP1抗体を用いて探知した結果、AFC精製VLPにVP1が存在していることが分かった。レーン3とレーン4の溶出フラクションを抗VP2抗体を用いて探知した結果、AFC精製VLPにVP2も存在していることが分かった。レーン5とレーン6の溶出フラクションを抗VP2単クローン性抗体を用いて探知した結果、AFC精製VLPにVP2が存在していることが分かった。
実施例18における、アフィニティーカラム(AFC)から溶出されたフラクションを電子顕微鏡を用いて評価した。AFC精製VLPの電子顕微鏡写真を図21に示す。電子顕微鏡で評価した結果、HEV71の構造タンパク質がVLPに組み立てられていることが分かった。
用いた抗原は、前述した通り組換えバキュロウイルスSN07の20x濃縮粗濃縮液である。妊娠を示す膣栓を、交尾後の朝に付け、胎生0.5日目として見なす。100μlの濃縮液をIMJECT(登録商標)(硫酸バンド)を混合した2回分の投与量を胎生3.5日目の母獣に大して腹腔内投与を行う。体重測定により妊娠を確認し、胎生17.5日目の母獣に2回目の投与を行う。1回目のワクチン投与に先立って、各マウスから最初の血液試料を採取する。仔マウスへのウイルス攻撃から14日が経過するまで、試料を毎週採取した。Balb/cマウスを3群に分け、20匹には免疫化を行い、ウイルス攻撃をかけた。20匹には模倣免疫化(mock immunized)を行い、ウイルス攻撃をかけた。5匹には免疫化もせず、ウイルス攻撃もかけなかった。生後5日の仔マウスを、100×HD50のMP−26Mを含有するMP−26Mウイルス50μlで感染させた。感染動物を1日に2回観察し、植菌後14日が経過するまで、疾病の臨床兆候を探した。発育障害、体重減少、ラント症候群、空腹、昏睡、頭部後屈、猫背、粗い毛皮、脱水、低体温、四肢麻痺を含む異常兆候が現れた。麻痺程度を、次の基準に従って採点した。
0:正常
1:筋力は低下しているが四肢は動く
2:患肢を動かせない
3:四肢麻痺、つまり四肢を全く動かせない
様々なポリオウイルスの発現カセットを構築し、ポリオウイルスVLPを生成する。発現カセットは、全てポリオウイルスのP1ポリペプチドを含むが、それぞれ異なるIRESを有する。IRESはポリオウイルスの3CDプロテアーゼの発現を誘導する役割を果たす。(PV−P1+HEV71−IRES+PV−3CD)、(PV−P1+EMCV−IRES+PV−3CD)、(PV−P1+PV−IRES+PV−3CD)の組み合わせとなる。ポリオウイルスのVLP発現カセットを持つ組換えバキュロウイルスに対してテストを行う。感染後3日目にバキュロウイルス感染細胞から溶解物を採取し、ウサギ抗PVP3抗体(1:2000)を用いてポリオウイルスVP3の発現を評価する。
PV−VLP発現カセットからのポリオウイルスVLP生成を立証するため、PV−VLP発現カセットを担う組換えバキュロウイルスからの溶解物及び上清を用いて、両サイトELISA法を行う。PV−3CDプロテアーゼは、ポリオウイルスIRESの制御の下にある。Sf9細胞は、PV−IRESを含むPV−VLP発現カセットを担う組換えバキュロウイルスにより感染される。感染後3日目に溶解物と上清を採取する。ポリオウイルスVLPの形成は、両サイトELISA法を用いて評価する。
HEV71−IRESを持つHEV71 VLPカセットの概略的構造を図24に図示する。発現カセットは、3CDプロテアーゼの発現がEMCV IRESではなくHEV71 IRESによるものであるということを除けば、実施例1に示されている構築体(pSN01)と類似する。HEV71 IRES配列はGenBankで探すことができる(アクセス番号DQ341362.1;ヌクレオチド1〜747)。インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商標)マニュアル(2009)の指示に従って、ベクターを含むHEV71発現カセットを、LR CLONASE(登録商標)を用いたattL/aaRインビトロ組換えにより、バキュロウイルス発現プラスミドpDEST8(デスティネーションベクター)に組み込む。エントリーベクターとpDEST8間の組換えは発現クローンを生成する。発現クローンは、インビトロジェンBAC−TO−BAC(登録商標)マニュアルに記載されているように、DH10Bacの形質変換により組換えバクミドを生じさせる。Sf9細胞の組換えバクミドへのトランスフェクションは、P1、HEV71 IRES、3CDを有する発現カセットを担う組換えバキュロウイルスをレスキューする。
発現カセットは、3CDプロテアーゼの発現がHEV71−IRESではなくポリオウイルスIRES(PV−IRES)によるものであるというを除けば、実施例24に示されている発現カセットと類似する。ポリオウイルスのIRES配列はGenBankで探すことができる(アクセス番号V01150.12;ヌクレオチド1〜628)。
Claims (15)
- ウイルス様粒子を含むワクチンであって、前記ウイルス様粒子がヒトエンテロウイルスA VP0ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスA VP1ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスA VP2ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスA VP3ポリペプチド、及びヒトエンテロウイルスA VP4ポリペプチドを含み、当該ワクチンはヒトエンテロウイルスに対する免疫反応及び/又は中和免疫反応を誘導することを特徴とする、ワクチン。
- 前記ヒトエンテロウイルスAは、ヒトエンテロウイルス71(HEV71)またはコクサッキーウイルスA16である、請求項1に記載のワクチン。
- ヒトエンテロウイルスP1ポリペプチドと、内部リボソーム導入部位(IRES)およびヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼをコード化する核酸と操作可能に結合しているプロモーターを含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にあることを特徴とする、発現カセット。
- 前記IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)またはエンテロウイスルから由来したものであることを特徴とする、請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、EMCV IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にある請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、HEV71 IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にある請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスAのP1ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスAの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にある請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、ヒトエンテロウイルスC IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にある請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、HEV71 IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含む、請求項3に記載の発現カセット。
- 前記発現カセットが、ヒトエンテロウイルスCのP1ポリペプチド、EMCV IRES、及びヒトエンテロウイルスCの3CDプロテアーゼをコード化する核酸を含み、ヒトエンテロウイルス3CDプロテアーゼがIRESの翻訳的制御下にある請求項3に記載の発現カセット。
- ヒトエンテロウイルスのP1ポリペプチド及びヒトエンテロウイルスの3CDプロテアーゼを生成でき、ウイルス様粒子を形成するのに十分な期間、
請求項3〜10のいずれか一つに記載の発現カセットを含む宿主細胞を培養する工程を含む、ワクチンの製造方法。 - 前記宿主細胞及び/又は培養上清より前記ウイルス様粒子を回収する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項11に記載の製造方法。
- 前記宿主細胞が真核細胞であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
- ヒトエンテロウイルス感染に対して被験者にワクチン接種するための薬物の製造における請求項1または2に記載のワクチンの使用。
- ヒトエンテロウイルス感染に対して被験者にワクチン接種するための請求項1または2に記載のワクチン。
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