MXPA06001146A - Vacunas seguras - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a vacunas seguras y métodos para preparar dichas vacunas. Las vacunas de la presente invención contienen al menos dos virus mutantes de la misma familia o moléculas deácido nucleico que codifican dichos virus, en donde cada ubo de de los virus o losácidos nucleicos codificadores contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable y las mutaciones en los virus que están en el mismo sitio genómico de manera que los virus mutantes no pueden recombinarse el uno con el otro para eliminar las mutaciones.

Description

VACUNAS SEGURAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a vacunas adecuadas para la administración a animales frente a infecciones víricas. Más específicamente, la presente invención se refiere a vacunas seguras y métodos para preparar dichas vacunas. Las vacunas de la presente invención contienen al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada uno de los virus o los ácidos nucleicos codificadores contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable y la mutaciones en los virus están en el mismo sitio genómico, de manera que los virus mutantes no pueden recombinarse el uno con el otro para eliminar las mutaciones.

FUNDAMENTO DE LA INVENCIÓN La familia vírica Flaviviridae consiste en los géneros Pestivirus, Flavivirus y Hepacivirus. El género Pestivirus está representado por las especies del virus de diarrea vírica Bovina 1 (BVDV-1), BVDV-2, virus de la peste porcina clásica y virus de la enfermedad de Border. Los viriones de los miembros de la familia encapsulan genomas de RNA de hebra positiva de aproximadamente 9,5 a 12,3 kb. Los RNA genómicos contienen largas estructuras contiguas de lectura abierta (ORF) que se traducen en poliproteínas que se procesan mediante proteasas celulares y víricas para dar «- * » i lugar a las proteínas víricas maduras. Para los miembros de Pestivirus, el ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos que se procesa de manera co-traslacional y post-traslacional a las siguientes proteínas víricas maduras (de 5' a 3'): Npro, C, Ems, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B. Entre algunos miembros de Pestivirus se encuentran dos biotipos basados en su efecto en las células de cultivo de tejido, llamados citopatogénico (citopático o cp) y no citopatogénico (no citopático o ncp). Los análisis del genoma revelan inserciones de secuencias celulares, algunas veces acompañadas por duplicación de secuencias virales, reagrupamientos genómicos y/o eliminaciones de secuencias virales en los genomas de pestivirus cp, aunque no en los RNA de los correspondientes pestivirus ncp. Esto sugiere que los pestivirus cp se desarrollan a partir de los pestivirus ncp mediante recombinación de RNA. El BVDV es un patógeno del ganado ampliamente distribuido. El BVDV-1 normalmente produce sólo diarrea ligera en animales inmunocompetentes, mientras que el BVDV-2 puede producir trombocitopenia, hemorragias y enfermedad fatal agua. El BVDV es capaz de cruzar la placenta de ganado preñado y puede dar por resultado el nacimiento de terneros infectados de forma persistente (Pl) (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152:763-768 (1968); Ross, et al., J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619 (1986)). Los terneros virémicos son inmunotolerantes al virus y virémicos de manera persistente para el resto de sus vidas. Proporcionan una fuente para g___hJ¡_¡ÉiAi-Í * .jj..--ití.?-.'i.* .<..^i¿ifei-..„ ,¿. <-..¿ ,i ,¿ la epidemia de enfermedad de mucosa (Liess, et al., Dtsch. Tieraerztl. Wschr. 81:481-487 (1974)) y están altamente predispuestos a la infección con microorganismos que provocan enfermedades tales como neumonía y enfermedad entérica (Barber, et al., Vet. Rec. 117:459-464 (1985)). Pueden existir virus de cualquier genotipo como uno de los dos biotipos, cp o ncp. El fenotipo cp correlaciona con la expresión de NS3, ya que las células infectadas con BVDV, o bien cp o ncp, expresan ambas el NS2-3, mientras que el NS3 se detecta sólo después de la infección con BVDV cp. El NS3 es colineal a la parte C-terminal del NS2-3. La expresión del NS3 parece ser un resultado de alteraciones genómicas observadas para el BVDV cp. Las vacunas virales disponibles en la actualidad incluyen vacunas virales muertas o de vida atenuada, vacunas de vectores vivos, vacunas de sub-unidades y vacunas de DNA o RNA. Véase Roth et al., "New Technology For Improved Vaccine Safety And Efficacy", Veterinary Clinics North America: Food Animal Practice 17(3):585-597 (2001). La atenuación de los virus puede lograrse mediante radiación UV, tratamiento químico, o alto paso en serie in vitro. El número, posición y naturaleza de las mutaciones inducidas por estos métodos son desconocidas ausentes los análisis de secuencia genómica. La atenuación puede lograrse también haciendo alteraciones genéticas definidas, por ejemplo, la eliminación específica de secuencias virales conocidas por provocar virulencia, o la inserción de secuencias en el genoma viral. Una preocupación respecto al uso de vacunas virales de vida atenuada es que los virus mutantes atenuados tienen el Xí? l potencial de recombinarse in vivo para eliminar la(s) mutación(es) atenuante(s), restaurando así la virulencia. Por ejemplo, en presencia de una cepa de campo virulenta (tipo salvaje), los virus atenuados que tienen eliminaciones en el genoma viral tienen el potencial de recombinarse con la cepa virulenta para restaurar la secuencia eliminada. Véase, por ejemplo, Roth et al., supra. Los pestivirus citopáticos que tienen inserciones celulares se han observado que también dan lugar a virus no citopáticos en cultivo celular mediante la eliminación de las secuencias celulares, posiblemente mediante la recombinación de RNA. Véase, por ejemplo, Baroth et al., "Insertion of cellular NEDD8 coding sequences in a pestivirus", Virology, 278(2):456-66, (2000), y Becher et al., "RNA recombination between persisting pestivirus and a vaccine strain: generation of cytopathogenic virus and induction of lethal disease", Journal of Virology 75(14):6256-65 (2001). Donde se desea incluir dos virus mutantes atenuados de la misma especie, género o familia en una composición de vacuna, hay una preocupación de que los dos virus puedan recombinarse en el animal vacunado eliminando así las mutaciones atenuantes. Véase, por ejemplo, Glazenburg et al., "Genetic recombination of pseudorabies virus: evidence that homologous recombination between insert sequences is less frequent than between autologous sequences", Archives of Virology, 140(4):671 -85 (1995). Permanece una necesidad de desarrollar vacunas seguras y eficaces que protejan a los animales frente a infecciones víricas. , Á í iLl.

SUMARIO DE LA TNVENCION La presente invención proporciona vacunas seguras que contienen al menos dos virus mutantes vivos de la misma familia o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en las que cada virus o el ácido nucleico codificador contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus están en el mismo sitio genómico, de manera que los virus mutantes no pueden recombinarse el uno con el otro para eliminar las mutaciones. La presente invención proporciona también un método para preparar una vacuna viral segura seleccionando o construyendo dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, en el que cada virus contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable, y las mutaciones en los virus reside en el mismo sitio genómico, de manera que los virus mutantes no pueden sufrir recombinación de homólogos para eliminar las mutaciones. La presente invención proporciona además un método para proteger a un animal frente a infecciones víricas administrando al animal una composición de vacuna de la presente invención.

Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Alineación de las inserciones celulares y secuencias virales de flanqueo de las regiones NS2-3 de la cepa BVDV-1 NADL y la cepa BVDV-2 53637. . ?.i.1 Descripción Detallada de la Invención Únicamente se ha reconocido de acuerdo con la presente invención que los virus mutantes vivos de la misma familia que contienen mutaciones en el mismo sitio genómico de los virus, no pueden recombinarse con cualquier otro para eliminar las mutaciones. Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona composiciones de vacuna seguras que contienen al menos dos, es decir, dos o más, virus mutantes vivos de la misma familia, o moléculas de ácido nucleico que codifican dichos virus, en los que las mutaciones en los virus están en el mismo sitio genómico, de manera que los virus mutantes no pueden recombinarse el uno con el otro para eliminar las mutaciones. En otra realización, la presente invención proporciona un método para preparar una vacuna viral segura, como se describe en adelante. De forma específica, una vacuna segura se prepara seleccionando o construyendo dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, en la que cada virus contiene una mutación que confiere un fenotipo deseable (por ejemplo, atenuación de la virulencia, alteración de tropismo celular o biotipo, alteración del tropismo de la especie, o expresión de un módulo de genes extraños), y las mutaciones en los virus están en el mismo sitio genómico, de manera que los virus mutantes no pueden sufrir recombinación de homólogos el uno con el otro para eliminar las mutaciones. El término "vacuna" o "composición de vacuna" se refiere a una composición que contiene virus mutantes vivos que, mediante inoculación en Ü2¿_ un animal, induce una inmunidad completa o parcial a la versión patogénica de los virus o alivia los síntomas de enfermedades provocadas por las versiones patogénicas de los virus. Los efectos protectores de una composición de vacuna frente a un virus se alcanzan normalmente induciendo en el sujeto una respuesta inmune, o bien una respuesta inmune mediada por células o humoral, o una combinación de ambas. Hablando generalmente, las incidencias eliminadas o reducidas de infección vírica, la mejora de los síntomas o la eliminación acelerada de los virus de los sujetos infectados, son indicativas de los efectos protectores de la composición de vacuna. Por "animal" se pretende incluir pájaros, por ejemplo, pollos, pavos, aves acuáticas domésticas, y cualquier mamífero, por ejemplo, ganado vacuno, oveja, cerdo, cabras, perros, gatos y caballos. La terminología "virus", "aislados virales" o "cepas virales" como se usa en este documento, se refiere a partículas virales o viriones que contienen DNA o RNA genómico vírico, proteínas asociadas y otros constituyentes químicos (tales como lípidos). Por "molécula de ácido nucleico que codifica un virus" o "molécula de ácido nucleico de un virus" se entiende la molécula de ácido nucleico genómico del virus, o bien en forma de RNA o de DNA. Por "mutación" se pretende incluir la eliminación, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, o una de sus combinaciones. De acuerdo con la presente invención, la mutación confiere preferiblemente un fenotipo deseable, por ejemplo, atenuación de la virulencia, alteración del ._ ; , ._ ___..,j .. - ,A i i tropismo celular o biotipo, alteración del tropismo de la especie o expresión de un módulo de gen extraño. Las mutaciones especialmente preferidas son mutaciones que confieren virulencia atenuada. Por "atenuación" se entiende que el virus ha perdido algo o toda su capacidad de proliferar y/o provocar enfermedad en un animal infectado con el virus. Por ejemplo, un virus atenuado puede ser un virus que no es capaz de replicarse del todo o está limitado a uno o a algunos círculos de replicación, o restringido en el tropismo celular o de tejido, cuando está presente en un animal en que una versión patogénica de tipo salvaje del virus atenuado puede replicarse. Un virus atenuado puede tener una o más mutaciones en un gen o genes que están implicados en la capacidad patogénica del virus. Dichas mutaciones también se refieren en este documento como "mutación(es) atenuante(s)". Un virus atenuado puede producirse a partir del virus patogénico de tipo salvaje mediante radiación UV, tratamiento químico, o el alto paso en serie de virus patogénico de tipo salvaje in vitro. De manera alternativa, un virus atenuado puede producirse a partir del virus patógeno de tipo salvaje, haciendo una eliminación específica de secuencias virales conocidas para conferir virulencia, inserción de secuencias en el genoma viral, o haciendo mutaciones en uno o más puntos en el genoma vírico. Un virus atenuado puede ser un aislado vírico obtenido de un animal, cuyo aislado se deriva de la versión patogénica de tipo salvaje del virus a través de acontecimientos diferentes a medios artificiales, por ejemplo, acontecimientos , í, iiiiiil ijáÜrÉrtiál ?í . ff i?htfJrtMhif» ^*^¿— .tifeéi i que han ocurrido en un animal anfitrión tal como la recombinación. Los dos o más virus mutantes vivos presentes en las composiciones de vacuna de la presente invención contienen mutaciones que están en el mismo sitio genómico. Por "mismo sitio genómico" se entiende que cuando las secuencias genómicas de nucleótidos de los virus se alinean, las mutaciones en los genomas víricos traslapan con cualquier otra tal que no hay oportunidad para la recombinación de homólogos entre los genomas víricos para eliminar las mutaciones. En otras palabras, cuando las secuencias genómicas de nucleótidos de los virus se alinean, hay al menos una parte contigua de las secuencias alineadas donde las secuencias en los genomas víricos alineados son secuencias mutantes. Hay un número de programas informáticos que comparan y alinean secuencias de ácidos nucleicos que puede usar un experto en la técnica. Las secuencias se alinean con propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una secuencia de ácido nucleico para la óptima alineación con una segunda secuencia de ácido nucleico). Por ejemplo, los programas NBLAST y XBLAST como se describen en Altschul, et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410, el programa Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, y el programa PSI-Blast como se describe en Altschul et al., 1997, supra. Cuando se utilizan los programas BLAST, Gapped BLAST y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) (véase http://www.ncbi.nim.nih.gov). **, ^i-t *.-ߣ? i, „ta*mMi? iMfi atsfmMimft&k áa?at!* -*. & * A i JÉ Generalmente hablando, el concepto de la presente invención, es decir, incluyendo en la misma composición de vacuna dos o más virus mutantes vivos de la misma familia que tienen mutaciones en el mismo sitio genómico, se aplica a virus mutantes de cualquier familia donde los genomas víricos tienen suficiente identidad secuencial para permitir la recombinación de homólogos. Se ha mostrado que una identidad de nucleótidos tan corto como 15 nucleótidos puede llevar a la eficaz recombinación de homólogos (Nagy y Bujarski, J. Virol. 69:131-140, 1995). La presente invención se aplica especialmente a virus de la familia Flaviviridae. La familia Flaiviridae consiste en los géneros Pestivirus, Flavivirus y Hepacivirus. Los viriones de los miembros de la familia Flaiviridae encapsulan genomas RNA de hebra positiva de aproximadamente 9,5 a 12,3 kb. Los RNA genómicos que contienen largas estructuras contiguas de lectura abierta, que se traducen en poliproteínas que se procesan mediante proteasas celulares y víricas para dar lugar a las proteínas víricas maduras. Preferiblemente, los virus mutantes de la composición de vacuna de la presente invención son del mismo género, de especies o bien iguales o diferentes. En una realización preferida, la composición de vacuna de la presente invención contiene dos o más virus mutantes vivos del género Pestivirus. El género Pestivirus se representa por las especies del Virus de Diarrea Vírica Bovina Tipo 1 (BVDV-1), Virus de Diarrea Vírica Bovina Tipo 2 (BVDV-2), virus de peste porcina clásica y virus de la enfermedad de Border.

El ORF codifica una poliproteína de aproximadamente 3900 aminoácidos, que se procesa de forma co-translacional y post-translacional a las siguientes proteínas víricas maduras (de 5' a 3'): Npro, C, Ems, E1, E2, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A y NS5B. Normalmente, el BVDV tiene un genoma en forma de RNA. El RNA puede transcribirse en forma inversa a DNA para usar en la clonación. Así, las referencias hechas en este documento a secuencias de ácido nucleico y BVD viral abarcan tanto secuencias de RNA como secuencias de DNA vírico derivadas de las secuencias de RNA vírico. Por conveniencia, las secuencias genómicas de BVDV como se representan en el LISTADO DE SECUENCIA posterior, sólo se refieren a las secuencias de DNA. La secuencia de RNA correspondiente para cada uno es fácilmente aparente para los expertos en la técnica. En una realización más preferida, la composición de vacuna de la presente invención contiene un BVDV-1 citopático y un BVDV-2 citopático, en los que las mutaciones en ambos virus asociadas con el biotipo citopático están en el mismo sitio genómico, por lo que los dos virus mutantes no pueden recombinarse para eliminar las mutaciones. BVDV-1 y BVDV-2 representan dos genotipos estrechamente relacionados de BVDV. Las secuencias de nucleótidos de los dos virus oscilan aproximadamente en el 70% de la identidad sobre el genoma total, y un porcentaje de identidad ligeramente superior dentro de la región NS2-3. Se cree que el porcentaje de identidad entre los genomas virales de BVDV-1 y i . » 1 BVDV-2, al menos en la región NS2-3, es suficiente para permitir la recombinación de homólogos. Los BVDV-1 normalmente producen sólo diarrea ligera en los animales, mientras que los BVDV-2 son virus con alta virulencia que pueden producir trombocitopenia, hemorragias y enfermedad fatal aguda (Corapi et al., J. Virol. 63:3934-3943; Bolin et al., Am. J. Vet. Res. 53:2157-2163; Pellerin et al., Virology 203:260-268, 1994; Ridpath et al., Virology 205:66-74, 1994; Carman et al., J. Vet. Diagn. Invest. 10:27-35, 1998). Los dos tipos de virus tienen distintas antigenicidades determinadas por un panel de Mab y por neutralización cruzada usando antisuero específico para el virus obtenido en animales (Corapi et al., Am. J. Vet. Res. 51:1388-1394, 1990). Los virus de cualquier genotipo pueden existir como uno de los dos biotipos, citopatogénico (citopático o cp) o no citopatogénico (no citopático o ncp). Los virus cp inducen efectos citopáticos (por ejemplo, lisis celular) en células cultivadas, mientras que los virus no citopáticos no. Es deseable preparar vacunas que proporcionen protección tanto frente a BVDV-1 como a BVDV-2. Sin embargo, por el alto grado de identidad secuencial entre los dos virus, hay una posibilidad de que un BVDV-1 citopático vivo y un BVDV-2 citopático vivo incluidos en la misma composición de vacuna pudieran recombinarse uno con el otro en el animal vacunado para dar virus no citopáticos. Se ha documentado la recombinación entre BVDV-1 y BVDV-2. Véase, por ejemplo, Ridpath et al., Virology 212:259-262 (1995). La infección del feto en una vaca preñada con virus ncp antes de desarrollarse la inmunocompetencia puede dar por resultado que el feto permanezca virémico a lo largo del periodo de gestación y el posterior nacimiento de un ternero que permanece virémico de forma persistente. Dicho ternero puede morir de enfermedad mucosa por superinfección con un BVDV cp. Por consiguiente, las composiciones de vacuna proporcionadas mediante la presente invención, que contiene BVDV-1 cp vivo y BVDV-2 cp vivo que tienen mutaciones en el mismo sitio genómico, son especialmente deseables para proteger animales tanto frente a BVDV-1 como a BVDV-2. En una realización, los aislados de BVDV cp obtenidos a partir de animales, pueden usarse en la composición de vacuna de la presente invención. Los aislados cp tanto de BVDV-1 como de BVDV-2 se han presentado y están disponibles para los expertos en la técnica, por ejemplo, BVDV-1 NADL (ATCC n° VR-1422 o VR-534), BVDV-2 cepa 53637 (depositada con el ATCC como PTA-4859), y aislados de campo tipo 2 tales como los descritos por Ridpath y Neill, J. Virol 74:8771-8774 (2000). Los aislados cp presentados tan lejos, contienen típicamente una inserción de una secuencia heteróloga, por ejemplo, una secuencia que codifica la ubiquitina (número de adquisición del Genbank M96687 o De Moerlooze et al., J. Gen. Virol. 74:1433-1438 (1993)), una secuencia que codifica la NEDD8 bovina (Baroth et al., supra), o una secuencia que codifica el DnaJI Bos taurus (como se describe en los Ejemplos posteriores), entre otros. En otra realización, un BVDV cp se genera haciendo alteraciones definidas en el genoma de BVDV, por ejemplo, eliminando secuencias virales específicas, insertando secuencias en un sitio genómico viral específico, o haciendo una o más sustituciones, o sus combinaciones. Donde se genera un BVDV cp insertando una secuencia heteróloga (es decir, extraña al virus) en un sitio genómico específico, la naturaleza de la secuencia a insertar generalmente no es crítica para la presente invención. Además, la inserción no está limitada a cualquier sitio particular mientras la inserción de por resultado un fenotipo atenuado. Ya que las secuencias heterólogas en aislados cp se encuentran a menudo en la región NS2-3, la región NS2-3, especialmente la parte circundante al sitio putativo de división de NS2-3 que corresponde a, por ejemplo, residuos de aminoácidos n° 1679 a n° 1680 de la cepa BVDV-1 NADL (la numeración se basa en la secuencia genómica publicada con n° de adquisición del Genbank M31182, SEQ ID NO: 4), es una posición preferida para las inserciones. Un BVDV-1 cp puede generarse haciendo una alteración genómica definida que imita la mutación identificada en un aislado de BVDV-2 cp obtenido de un animal, de modo que estos virus tengan mutaciones asociadas con el biotipo cp en el mismo sitio genómico. De manera similar, un BVDV-2 cp puede generarse por medio de generar una alteración genómica definida que imite la mutación identificada en un aislado de BVDV-1 cp obtenido de un animal. En una realización preferida, la composición de vacuna de la presente invención contiene NADL (un aislado de BVDV-1 cp) y BVDV-2 53637 (un aislado de BVDV-2 cp), donde cada uno de los dos aislados de cp ,4k í contienen una mutación en el mismo sitio genómico que da por resultado el biotipo citopático. La secuencia genómica de la cepa BVDV-1 NADL se propone en SEQ ID NO: 4, y la cepa BVDV-2 53637 se depositó con el ATCC como PTA-4859. Ambos aislados contienen una inserción en la región NS2-3. El BVDV-1 cp atenuado contiene una inserción de una secuencia 3' de la timidina que codifica DnaJ1 Bos taurus en la posición de nucleótido n° 4993 (numeración de la secuencia de NADL), que es el tercer nucleótido del codón que codifica el residuo de glicina en ia posición de aminoácido 1536. El BVDV-2 cp atenuado contiene una inserción de una secuencia que codifica DnaJ1 Bos taurus en el mismo sitio genómico. Según la presente invención, los aislados de BVDV cp empleados en la presente composición de vacuna se han atenuado y son por lo tanto no patogénicos. Se conocen métodos de atenuación por los expertos en la técnica y también se describen más tarde. En otra realización, la composición de vacuna de la presente invención contiene un BVDV-1 atenuado y un BVDV-2 atenuado, en los que las mutaciones atenuantes en ambos virus están en el mismo sitio genómico, de manera que los dos virus mutantes no pueden recombinarse para eliminar las mutaciones atenuantes. Un BVDV atenuado se genera por radicación UV, tratamiento químico o alto paso en serie de la versión patogénica de los virus in vitro. El análisis de la secuencia puede llevarse a cabo para determinar la naturaleza y la posición genómica de mutaciones generadas por estos métodos. La . ---"»-^***"-^>- ~""*^- mutación puede estar en forma de eliminación, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, o una de sus combinaciones. De forma alternativa, un BVDV atenuado se genera haciendo alteraciones definidas en el genoma del BVDV, por ejemplo, eliminando secuencias virales específicas, insertando secuencias en un sitio genómico viral específico o haciendo una o más sustituciones, o sus combinaciones. Como se describe anteriormente, los virus mutantes vivos para usar en la composición de vacuna de la presente invención pueden ser de la misma familia, género o especie, donde los genomas virales tienen suficiente identidad de secuencia para permitir la recombinación de homólogos. Ejemplos adicionales de combinaciones de virus apropiadas para usar en la composición de vacuna de la presente invención incluyen, aunque no están limitados a, combinaciones de diferentes tipos de virus de la polio, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas del virus de la bronquitis infecciosa, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas del virus de la enfermedad de Newcastle, combinaciones de adenovirus-1 canino y adenovirus-2 canino, combinaciones del virus-1 del herpes equino y del virus-4 del herpes equino, combinaciones de múltiples cepas mutantes vivas del virus de la gripe, combinaciones de múltiples cepas atenuadas vivas del calicivirus felino, combinaciones de múltiples serotípos de Rotavirus, combinaciones de múltiples serotipos de Rinovirus, combinaciones de múltiples serotipos del virus de la Fiebre aftosa, combinaciones de los genotipos Europeo y Norteamericano del virus del síndrome reproductor y J i,¡ ,i:.i respiratorio porcino, combinaciones de las cepas patrón y variante del virus de la bursitis infecciosa. De acuerdo con la presente invención, aunque las partículas víricas son la forma preferida para usar en las vacunas, las moléculas de ácido nucleico que codifican virus mutantes de la misma familia, género o especie, pueden usarse directamente en vacunas también. La molécula de DNA o RNA puede estar presente en una forma "desnuda" o puede estar combinada con un agente que facilita la absorción celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). Las vacunas y los procedimientos de vacunación que utilizan ácidos nucleicos (DNA o mRNA) se han descrito bien en la técnica, por ejemplo, Patente de EE.UU. n° 5.703.055, Patente de EE.UU. n° 5.580.859, Patente de EE.UU. n° 5.589.466, Publicación de Patente Internacional WO 98/35562, y por Ramsay et al., 1997, Immunol. Cell Biol. 75:360-363; Davis, 1997, Cur. Opinión Biotech. 8:635-640; Manickan et al., 1997, Critical Rev. Immunol. 17:139-154; Robinson, 1997, Vaccine 15(8):785-787; Robinson et al., 1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12(5):455-457; Lai y Bennett, 1998, Critical Rev. Immunol. 18:449-484; y Vogel y Sarver, 1995, Clin. Microbio!. Rev. 8(3):406-410, todos los cuales se incorporan en este documento por referencia. Además de dos o más virus mutantes vivos de la misma familia, género o especie, las composiciones de vacuna pueden incluir otros componentes antigénicos. Otros componentes antigénicos apropiados para usar de acuerdo con la presente invención incluyen, aunque no están limitados a, antígenos preparados a partir de bacterias patogénicas tales como Mycoplasma hyopneumonia, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Bacilus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma Bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycoplasma gallisepticum, Mycobacterium Bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Lawsonia intracellularis, Listeria monocytogenes, Rickettsia rickettsii, Borrelia spp., Ehrlichia spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp., Salmonella entérica serovars, Leptospira spp., hongos patogénicos tales como Candida, protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Elmeria spp., Babesia spp., Giardia spp., helmintos tal como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola; o bien en la forma de un preparado celular inactivado total o parcial, o en la forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Antígenos adicionales incluyen virus patogénicos tales como virus de la enfermedad de Marek, virus de la bursitis infecciosa, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la anemia del pollo, virus de la viruela de las aves de corral, virus de leucosis aviar, virus de laringotraqueitis infecciosa, virus reticuloendotelial, parvovirus canino, virus del moquillo canino, virus del herpes canino, coronavirus canino, parainfluenza-5 canina, virus de panleucopenia felina, virus del herpes felino, calicivirus felino, iiitÉ-llilUniifTtrüÉil . ?i i ,ÍUt i virus de inmunodeficiencia felina, virus de peritonitis infecciosa felina, virus del herpes equino, virus de arteritis equina, virus de anemia infecciosa equina, virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus de encefalitis equina venezolana, virus del Nilo occidental, virus de gastroenteritis transmisible, coronavirus bovino, virus-1,3,6 del herpes bovino, virus de parainfluenza bovina, virus sincitial respiratorio bovino, virus de leucosis bovina, virus de la peste bovina, virus de la fiebre aftosa, virus de la rabia, virus de la fiebre del cerdo Africano, parvovirus porcino, virus PRRS, circovirus porcino, virus de la gripe, virus de la enfermedad vesicular porcina, virus de la fiebre de Techen, virus de la pseudorabia, o bien en la forma de preparado vírico (atenuado) vivo modificado, un preparado de virus inactivado total o parcial, o en la forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Cuando se usan virus vivos atenuados adicionales, dichos virus adicionales serían preferiblemente de una familia diferente de aquella de los dos virus atenuados principales, como se describe anteriormente. En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene un BVDV-1 cp atenuado derivado de la cepa BVDV-1 NADL, un BVDV-2 cp atenuado derivado de la cepa BVDV-2 53637, donde cada uno de los dos aislados cp contienen una mutación asociada con el biotipo cp en el mismo sitio genómico, y al menos uno (es decir, uno o más) de los siguientes componentes antigénicos, o bien en forma inactivada o viva modificada: virus-1 del herpes bovino, virus sincitial r.«a*Í_.l_- _feil_ ¿&4M_ »r , . , _» í-?. i ,1 I respiratorio bovino, virus-3 de parainfluenza, Campylobacter fetus, Leptospira canteóla, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Lectospira leterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, o Mannhemia haemplytica. Además, las composiciones de vacuna de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables. Como se usa en este documento, "un vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifungicidas, agentes isotónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, mannitol, sorbitol y lactosa entre otros. Los estabilizadores incluyen albúmina entre otros. Las composiciones de vacuna pueden incluir además uno o más agentes inmunomodulatorios distintos tales como, por ejemplo, interleuquinas, interferonas y otras citoquinas. Adyuvantes adecuados para usar en las composiciones de vacuna incluyen, aunque no están limitados a, el sistema adyuvante RIBI (Ribi inc), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund, co-polímero de bloque (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, colesterol, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), u otras fracciones saponinas, lípido A monofosforilo, adyuvante lípido-amina Avridine, enterotoxina móvil al calor de E. Coli (recombinante o de otra forma), toxina del cólera o dipéptido de muramilo, entre muchos otros. Típicamente, un virus mutante vivo está presente en una vacuna en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 1 x 108 partículas de virus por dosis, con un vehículo veterinariamente aceptable, en un volumen de entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5 mi. La cantidad precisa de un virus en una composición de vacuna eficaz para proporcionar un efecto protector puede determinarse por un veterinario experto. Donde se usa la molécula de DNA o RNA del virus en la vacuna, la cantidad de los ácidos nucleicos estarían generalmente entre aproximadamente 0,1 µg/ml y aproximadamente 5,0 mg/ml. Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden hacerse de diversas formas dependiendo de la ruta de administración. Por ejemplo, las composiciones de vacuna pueden hacerse en forma de disoluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o hacerse en formas liofilizadas usando técnicas de secado por congelación. Las composiciones liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4°C, y pueden reconstituirse en una disolución de estabilización, por ejemplo, solución salina o/y HEPES, con o sin adyuvante. Las composiciones de vacuna de la presente invención pueden administrarse a un animal para tratar o prevenir una enfermedad provocada por las versiones patogénicas de los virus en las composiciones de vacuna. Por lo tanto, los métodos de vacunación de un animal frente a una i. i. i .i.-l » enfermedad provocada por un virus también se proporcionan por la presente invención. En la práctica de los métodos actuales, una composición de vacuna de la presente invención se administra a un animal preferiblemente por medio de rutas parenterales, aunque pueden usarse también otras rutas de administración, tal como por ejemplo, por administración oral, intranasal, intramuscular, dentro del nodo linfático, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, rectal o vaginal, o por una combinación de rutas. Pueden necesitarse regímenes de estimulación y el régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar una vacunación óptima. La presente invención se ilustra adicionalmente por, aunque de ningún modo limitado a, los siguiente ejemplos.

EJEMPLO 1 Determinación De La Posición De La Inserción Celular En La Cepa BVDV2 53637 Se determinó una parte de la secuencia de la región NS2-3 de BVDV2-53637 para identificar y trazar un mapa de la posición de cualquier inserción celular en la región. Un producto RT-PCR de 670 bases se amplificó a partir del RNA viral, usando un iniciador directo 53637U1 (5'-CGTCCACAGATGGTTTGGT-3'; SEQ ID NO: 1) y un iniciador inverso 53637L (5'-GGCTATGTATTGGACGTAACCC-3'; SEQ ID NO: 2). El producto RT-PCR se purificó y se sometió a análisis secuencial (SEQ ID NO: 3). feti-l <Í J ^¡g¡j¡ Cuando se alineó con BVDV1-NADL (número de adquisición del Genbank M31182, SEQ ID NO: 4), se observaron similitudes llamativas (FIGURA 1). Ambos virus contenían una inserción en la estructura derivada del gen DnaJ1 Bos taurus. En el caso de NADL, la inserción era de 90 aminoácidos (270 nucleótidos) de longitud y estaba situada entre la glicina-1536 y la prolina-1627 en la poliproteína NADL. Estas coordenadas correspondían a la glicina-1536 y la prolina-1537 en cepas BVDV1 no citopáticas tales como SD-1 (número de adquisición del Genbank AAA42860, SEQ ID NO: 6), indicando que la alteración del genoma en el NADL era una inserción sencilla sin eliminación concomitante o duplicación de las secuencias virales de flanqueo. Como BVDV1-NADL, había una inserción de una parte del gen DnaJ1 Bos taurus en BVDV2-53637. La inserción celular era mayor (131 aminoácidos, 393 nucleótidos), extendiéndose en ambas direcciones respecto a la inserción en BVDV1-NADL. La posición de la inserción celular dentro de la región NS2-3 era idéntica en ambos virus. A diferencia de BVDV1-NADL, la inserción de BVDV2-53637 estaba acompañada por una eliminación de 5 aminoácidos (15 nucleótidos) de secuencias virales de flanqueo. Tres residuos de aminoácido estaban ausentes flanqueando el extremo 5' de la inserción, mientras dos residuos de aminoácido estaban ausentes flanqueando el extremo 3' de la inserción. Porque las inserciones celulares estaban en la misma posición genómica en los dos virus de la vacuna, no podían sufrir recombinación de homólogos para eliminar la inserción para generar un virus quimérico no citopático. , *,*_- . r r?»?tí«{Íi-ll to Kii. -i-á.J., I.U , EJEMPLO II Intentos Para Detectar Virus BVDV No Citopáticos En Cultivos BVDV1-NADL/BVDV2-53637 Co-Pasados Para determinar si los dos virus de vacuna son capaces de recombinarse para generar niveles detectables de BVDV no citopáticos, los virus se co-cultivaron en células susceptibles y se usó un ensayo RT-PCR hemi-encajado sensible para detectar virus no citopáticos potenciales de entre un exceso de productos muy citopáticos que aún contenían la inserción celular. Para aumentar la probabilidad de recombinación intertípica in vitro, cada virus se inoculó simultáneamente en células BK-6 confluentes en placas de 6 pocilios en una multiplicidad de infección de 2-4 (12 replicados por experimento). Después de 2-3 días de co-cultivo, las células se congelaron y descongelaron dos veces, y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugado de baja velocidad. El fluido sobrenadante resultante se usó después como inoculador para el siguiente paso. Un total de siete pasos en serie se llevaron a cabo en varios estudios. Durantes los pasos, BVDV1-NADL creció más rápidamente que BVDV2-53637, aunque el virus tipo II era aún detectable después de siete pasos usando RT-PCR encajado. Se empleó un ensayo RT-PCR hemi-encajado sensible en un intento de detectar cualquier virus no citopático. En el RT-PCR del primer recorrido, se usaron iniciadores directos 53637U1 (SEQ ID NO: 1) o NADL4744 (5'-CGTGGCTTCTTGGTACGGG-3\ SEQ ID NO: 7) en conjunto con i i i i iniciadores inversos 53637L (SEQ ID NO: 2) o NADL5305 (5'-AGCGGTATATTGTACAAAGCCA-3\ SEQ ID NO: 8). Las cuatro combinaciones de iniciadores directos e inversos se usaron para detectar BVDV1, BVDV2 y recombinantes intertípicos. El tamaño esperado del producto RT-PCR era 562 bp para BVDV1-NADL citopático y 670 bp para BVDV2-53637 citopático. Los virus no citopáticos, si estuvieran presentes a niveles detectables, se esperaría que dieran productos del primer recorrido de 292 bp (BVDV1-NADL) o 277 bp (BVDV2-53637). Los recombinantes intertípicos serían similares en tamaño a uno de los padres, o de longitud intermedia, dependiendo de la posición del sitio de recombinación. Los BVDV no citopáticos nunca se detectaron después del RT-PCR de primer recorrido. Para aumentar la sensibilidad de detección de BVDV no citopático en presencia de un gran exceso de BVDV citopático, se incluyó una etapa de digestión de enzima de restricción antes del PCR encajado para destruir los mayores templados de NS2-3 derivados de los virus citopáticos. Una combinación de Mspl y Oral se seleccionó en base a la observación de que cortaban dentro de la Inserción DnaJ1 Bos taurus pero no cortaba las secuencias virales de flanqueo. En el PCR de segundo recorrido (hemi-encajado), se usaron iniciadores directos 53637U2 (5'-TGCACGATCTGTGAAGGGAAAGAA-3\ SEQ ID NO: 9) o NADL4844 (5'-TGCACTGTATGTGAGGGCCGAGAG-3', SEQ ID NO: 10) en conjunto con los mismos dos iniciadores inversos 53637L o NADL5305. Se usaron combinaciones apropiadas de iniciadores para t Intentar detectar recombinantes intertípicos además de Svffíft f ß»V . El tamaño esperado de producto RT-PCR era 462 bp para BVDV1-NACI; €j atico y 570 bp para BVDV2-53637 citopático (presente en baf?$r*jivfeies ebidos la ft§estíón incompleta de los productos RT-PCR de BVDV citopático). Los virus o eitofático$» si estuvieran presentes a niveles detectables, se esperaría que dieran pró Istó ite segundo recorrido de 192 bp (BVDV1-NADL) o 177 bp (BVDV2-53637). Los recornbina?tes intertípicos serían similares en tamaño a uno de los padres o de longitud Intermedia, dependiendo de '"" la posición del sitio de recombinación. Los BVDV no citopálicos nunca se detectaron después del PCR de segundo recorrido. En algunas reacciones individuales, se vieron bandas aberrantes de diversos tamaños. Todas las bandas entre 100 y 300 bp se consideraron que eran productos no citopáticos potenciales y se sometíeron al análisis secuencial de DNA. En todos los casos la banda aberrante fue el resultado de falso inicio durante el PCR. No hubo evidencia de virus no citopáticos en ninguno de los estudios.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición de vacuna que comU ?de al menit dos virus mutantes vivos de la misma familia, en donde cada virus contiene una mut#í t? tns^el genoma viral y las mutaciones en los virus residen en el mismo sitio genómico que los virus mutantes no pueden recombinar uno con otro para eliminar las mutaciones. • 2. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde dicha familia es la familia de Flaviviridae. 10 3. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, en donde dos virus mutantes vivos son ambos del género de Pestivirus. 4. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , en donde los 15 dos virus vivos mutantes consisten de un mutante BVDV-1 y un mutante BVDV-2. 5. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 4, en donde los dos virus vivos mutantes consisten de un citopático (cp) BVDV*1 y un cp BVDV-2 y ambos son atenuados. 20 6. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5» en donde el cp BVDV-1 y el cp BVDV-2 ambos comprenden una mutación en la región NS2 que • resulta en un biotipo citopático. 25 7. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, en donde el cp BVDV-1 es BVDV-1 NADL y el cp BVDV-2 es BVDV-2 53637. mutaciones. 15 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicha mutaoí n se selecciona de una eliminación, una inserción, una sustitución o «Wa combinación de tes mismas. i 20 12. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicha mutación confiere un fenotipo seleccionad de atenuación de virulencia, alteración del tropismo celular o biotipo, alteración del tropismo de la especie, exprfeie de un módulo de nes • extraños o una combinación de los mismos. 25 13. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicha familia es la familia de Flaviviridae. * ¿,tc¿%vjk '% < ? t, 14. El método de conformidad con la reivindicación 10* én dfende iiichos dos virus mutantes vivos son del género de Pestivirus. 15. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde los dos virus mutantes vivos consisten de un mutante BVDV-1 y un mutante BVDV-2. fe • ?ÍS-H í«Jt*,