BRPI0712558A2

BRPI0712558A2 - determinante de virulÊncia dentro da glicoproteÍna estrutural e2 do vÍrus da febre clÁssica

Info

Publication number: BRPI0712558A2
Application number: BRPI0712558-5A
Authority: BR
Inventors: Manuel V Borca; Guillermo R Risatti
Original assignee: Us Of America As Represented By The Scretary Of Agriculture
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2007-05-29
Publication date: 2012-11-20
Also published as: CN101478985B; KR101432840B1; JP5377296B2; CN101478985A; CR10508A; GT200800269A; UA98620C2; WO2007143442A3; KR20090025291A; WO2007143442A2; US20070280955A1; EP2023953B1; EP2023953A2; RU2008150400A; EP2023953A4; ZA200810285B; MX2008015215A; US8846055B2; JP2009538628A; RU2451746C2

Abstract

DETERMINANTE DE VIDRULÊNCIA DENTRO DA GLICOPROTEÍNA ESTRUTURAL E2 DO VÍRUS DA FEBRE SUÍNA CLÁSSICA. A glicoproteína E2 do vírus da febre suína clássica (CSFV) é um principal indutor de anticorpos de neutralização e imunidade protetora em suínos. A E2 media a adsorção de vírus nas células alvo e abriga determinantes genéticos associados à virulência do vírus. A E2 de CSFV também contém, entre os resíduos 829 e 837, um é pitopo distinto (TAVSTTLR) reconhecido pelo anticorpo monoclonal (mAb) WH303, sendo para diferenciar CSFV dos Pestivírus Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV) e Vírus da Doença de Manchas (BDV). Nesse relatório, um clone infeccioso de CSFV do isolado virulento Brescia (BICv) foi usado para realizar mutações progressivas no epítopo WH303 do mAb de E2 de CSFV à sequência de aminoácido homóloga da cepa NADL E2 (TSFNMDTLA) de BVDV. Embora os mutantes virais resultantes T1v (TSFSTTLR) T2v (TSIWTTLR), T3v (TSFNMTTLR) tenham demonstrado características de crescimento in vitro similares àquelas do BICv percursor, os mutantes T4v (TSFNMDTLR) and T5v (TSFNMDTLA) exibiram uma diminuição de 10 vezes na produção viral e uma diminuição significativa no tamanho de placa com relação ao BICv precursor. Reatividade imunohistoquímica com WH303 foi perdida apenas em T3v, T4v e T5v.

Description

"DETERMINANTE DE VIRULÊNCIA DENTRO DA GLICOPROTEÍNA ESTRUTURAL E2 DO VÍRUS DA FEBRE SUÍNA CLÁSSICA"

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção

A presente invenção se refere ao isolamento e à caracterização de novos Determinan- tes de virulência do Vírus da Febre Suína Clássica (CSFV) dentro da Glicoproteína E2 estrutural e utilização dos referidos novos determinantes de virulência para projetar vacinas CSF atenuadas vivas.

Descrição da Técnica Relacionada

A febre suína clássica (CSF) é uma doença altamente contagiosa de suínos que pode ser de natureza ou aguda ou crônica (van Oirschot1 J. T. 1986. In: Diseases ofswine, 6th edition, Leman et al„ eds., Iowa State University Press, Ames, lowa, página 289). O agente etiológico, Vírus CSF (CSFV), é um pequeno vírus encapsulado com um genoma de RNA de fita simples e positivo e, juntamente com vírus da diarréia viral bovina (BVDV) e o vírus da doença de fronteira (BDV), é classificado como um membro do gênero Pestivirus dentro da família Flaviridae (Hulst et al. 2001. J. Virol. 75: 9585 - 9595). O genoma CSFV 12.5 kb contém uma estrutura única de leitu- ra aberta que codifica um poliproteína de 4000 amino ácidos e por ultimo produz 11 a 12 produtos de clivagem final (NH2-Npro-C-Ems-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH) atra- vés de processamento co- e pós-translacional da poliproteína por proteases celulares e virais (Ri- ce, C. M. 1996. In: Fundamental Virology, 3rd edition, Fields e Howley, eds., Lippincott Raven1 Philadelphia, pp. 931 - 959).

A virulência e fenótipos da faixa de hospedeiro variam entre os CSFV isolados e entre os pestivírus. Infecção com cepas de CSFV altamente virulentas leva a morte nos animais infecta- dos, enquanto que isolados de virulência moderada a baixa induzem a uma doença crônica pro- longada (van Oirschot, supra). Adicionalmente, BVDV e BDV, embora agentes etiológicos de doenças em espécies de bovinos e ovinos, respectivamente, podem também infectar suínos sem induzir a doenças clínicas (van Oirschot, supra). Apesar da disponibilidade das seqüências ge- nômicas a partir de CSFV de diferentes fenótipos de virulência, BVDV, e BDV, a base genética da virulência de CSFV no hospedeiro natural permanece ainda pobremente entendido (van Oirschot, supra). O uso de genética invertida permitiu a identificação de determinantes virais da virulência facilitando o desenvolvimento de vacinas candidatas de CSF atenuadas vivas (Mayer et al., 2004. Vacina 22: 317 - 328; Meyers et al. 1999. J. Virol, 73:10224 - 10235; Moorman et al. 1996. J. Virol. 70: 763 - 770; Moser et al. 2001. Vírus Genes 23: 63 - 68; Risatti et al. 2005a. J. Virol. 79: 3787 - 3796; Risatti et al. 2005b. Virology 343:116 - 117; Ruggli et al. 1996. J. Virol.70: 3478 - 3487; Tratschin et al. 1998. J. Virol. 72: 7681 - 7684; van Gennip et al. 2000. Vacina 19:447-459).

A proteína de capsídeo, e glicoproteínas Ems1 E1, e E2 são os componentes estruturais do Vírion de CSFV com E1 e E2 ancorados à cápsula por suas terminações carboxila e Ems frouxamente associado à cápsula viral (Thiel etal., 1991. J. Virol. 65:4705 - 4712; Weilandet al.,1990. J. Virol.64:3563 -3569; Weiland et al., 1999. J. Geri. Virol. 80: 1157 - 1165). Todas as três glicoproteínas estiveram associadas com Virulência de CSFV (Meyers, supra; Risatti et al.

2005 a, b, supra).

A glicoproteína E2 é considerada essencial para a Replicação de CSFV, na medida em que os vírus mutantes que contêm deleções parciais ou completas do gene E2 provaram não ser viáveis (van Gennip et al., 2002. Vacina 20: 1544 - 1556). E2 esteve implicado, junto com Ems (Mayer et al., supra) e E1 (Wang et al., 2004. Virology 330: 332 - 341), na adsorção viral em células hospedeiras; de fato, pestivírus quiméricos exibem infectividade e fenótipos de tropismo celular consistentes com aqueles do doador do gene E2 (van Gennip et al., 2000, 2002, supra). E2 é a mais imunogênicas das glicoproteínas CSFV (Konig et al., 1995. J. Virol. 69: 6479 - 6486; Weiland et al., 1990, supra), induzindo a neutralização dos anticorpos e a proteção contra desafi- os letais. E2 de CSFV também contém, entre resíduos 829 e 837, um epítopo reconhecido pelo anticorpo monoclonal (mAb) WH303 (Lin et al. 2000. J. Virol. 74: 11619 - 11625), um reagente que falha em reagir com BVDV ou BDV E2 e é rotineiramente usado para diagnóstico de CSF.

Reportamos aqui os efeitos de mutações dentro do epítopo WH303 de E2 de CSFV, mu- tações que mudam a seqüência de amíno ácidos de CSFV de Brescia virulenta progressivamente em direção à seqüência de amino ácidos homóloga de NADL de cepa de BVDV, demonstrando um efeito aditivo para a virulência viral em suínos e a completa atenuação após seis mudanças de amino ácidos. Os referidos vírus atenuados permitem a configuração racional de vacinas CSF atenuadas vivas. Os animais infectados com vírus mutantes foram protegidos quando desafiados com vírus Brescia virulento em 3 e 21 dias pós vacinação. A modificação neste campo dentro do Epítopo WH303 permite o desenvolvimento de um teste diagnóstico para diferenciar animais va- cinados de animais infectados.

SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

Foi identificado um novo Determinante de virulência de CSFV dentro da glicoproteína E2.

De acordo com a referida descoberta, é um objetivo da presente invenção proporcionar um vírus recombinante da Febre Suína Clássica (CSFV) compreendendo um DNA que codifica uma glicoproteína E2 de CSFV modificada.

É ainda um objetivo da presente invenção proporcionar um vírus recombinante da Febre Suína Clássica compreendendo um DNA que codifica Glicoproteína E2 de CSFV que tenha sido modificado ao progressivamente produzir mutações em uma porção do gene E2 de Brescia de cepa altamente patogênica, resultando no vírus E2 mutante que se assemelha mais proximamente à seqüência do Epítopo WH303 do gene E2 homólogo da BVDV, a modificação resultando na ate- nuação de CSFV.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar composições imunogênicas que cximpreendem um Vírus da Febre Suína Clássica recombinante viável que compreende uma glicoproteína E2 de CSFV modificada.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar uma vacina de CSFV atenu- ada viva projetada racionalmente que reduza a gravidade da CSF.

Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma vacina de CSFV atenuada viva projetada racionalmente eficaz para proteger um animal de doença CSF clínica quando desafiados com CSFV de Brescia virulenta.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar uma vacina de marcação que permite a distinção sorológica entre animais vacinados e animais infectados com CSFV.

Um objetivo adicional da presente invenção é proporcionar um método para proteger um animal contra CSF ao administrar uma quantidade eficaz de vacina de CSFV atenuada viva racio- nalmente projetada.

Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarão aparentes a partir da descrição a seguir.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 ilustra uma comparação de CSFV de Brescia, Cepa NADL de BVDV e Vírus mutante CSFV T1-5 na área de mAb do Epítopo WH303 da Glicoproteína E2. As posições dos resíduos de amino ácido na Poliproteína CSFV são indicados. Os itálicos indicam os resíduos diferentes daqueles em E2 de Brescia, tanto na Cepa NADL de BVDV como CSFV Τ1 ν a T5v.

As figuras 2A e 2B comparam as características dos T1v - T5v mutantes e BICv. A figura .2A mostra as características de crescimento in vitro dos T1v - T5v mutantes e BICv. As monoca- madas SK6 foram infectadas (MOI= 0.01) com T1v, T2v, T3v, T4v, T5v ou BICv e o rendimento viral titulado em momentos pós infecção. Os dados representam os desvios de média e padrão a partir de dois experimentos independentes. A figura 2B mostra a formação de placa e reatividade mAb dos T1v - T5v mutantes e BICV. As monocamadas SK6 foram infectadas com 50 a 100 TCID50, cobertas com 0.5% de agarose e incubadas a 37°C por 3 dias. As placas foram fixadas com 50% (vol/vol) etanol-acetona e diferentemente coradas por imunohistoquímica com mAb WH303 e mAb WH308.

A figura 3 mostra a pontuação clínica registrada a partir de porcos infectados com vírus T1v-T5v e BICv recombinantes. As pontuações clínicas foram calculadas como anteriormente descrito com modificações e foram baseadas em observações de dois (T1v, T2v, T3v e T4v) ou seis (T5v e BICv) animais.

As figuras 4A - B mostram célula sangüínea branca periférica (figura 4A) e a contagem de plaquetas (figura 4B) em porcos infectadas com vírus T1v-T5v e BICv recombinantes. As con- tagens são expressas como números/mL e cada ponto representa a média e os erros padrão para dois (T1 v, T2v, T3v e T4v) ou seis {T5v e BICv) animais.

As figuras 5A - C ilustram a titulação viral no sangue (figura 5A), swabs nasais (figura .5Β), e esfregaço de amídalas (figura 5C) a partir de porcos infectadas com T1v - T5v mutantes ou BICv. Cada ponto representa a média TCID50ZmL e o desvio padrão para dois (T1v, T2v, T3v e T4v) ou seis (T5v e BICv) animais.

As figuras 6A - B mostram célula sangüínea branca periférica (figura 6A) e a contagem de plaquetas (figura 6B) em porcos simulados vacinados ou vacinados com T5v e desafiados a 3 ou 21 DPI com BICv. Os valores para o controle, vacinados simulados, e animais desafiados são representados com quadrados cheios. As contagens são expressas como números/mL e represen- tam a média para quatro indivíduos com as barras de erro indicando o erro padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO O desenvolvimento de estratégias de controle de doenças no caso de um Ataque de

CSFV requer a rápida instalação da proteção, o que se torna um parâmetro mais importante do desempenho da vacina do que, por exemplo, a duração da proteção. O desenvolvimento das referidas vacinas implicaria na produção das cepas de vacina de CSFV atenuadas vivas racional- mente projetadas.

A base genética e os mecanismos moleculares subjacentes à virulência do Pestivírus

ainda não são claras. No caso de CSFV, diferentes relatórios descreveram associações entre proteínas virais ou regiões genômicas específicas com virulência. Mutações de códon simples ou duplo que eliminam a atividade de RNase cepa Alfort de glicoproteína Ems de CSFV, atenuaram os vírus em porcos (Meyers et ai, supra). Resultados similares foram também observados ao se produzir mutações do domínio de RNase da Glicoproteína Ems de BVDV (Meyer et ai 2002. J. Virot. 76: 8494 - 8503). Mais recentemente, foi mostrado que a deleção de Npro a partir das ce- pas virulentas de CSFV Alfort/187 e Eystrup resultou em vírus atenuados vírus atenuados em suínos (Mayer et al., supra). Uma substituição de amino ácido na Glicoproteína E2 de CSFV as- sociada com três substituições de amino ácidos em Ems resultou em reduzida virulência em por- cos (van Gennip et al. 2004. J. Virol. 78: 8812 -8823). Adicionalmente, uma inserção na estrutura de 19 amino ácidos no Gene E1 da Cepa Brescia de CSFV levou à atenuação in vivo (Risatti et ai2005b, supra). E2 DE CSFV esteve também implicado na virulência. A substituição do gene E2 na Cepa Brescia de CSFV com o gene E2 da cepa CS de vacina resultou em um vírus quimérico que apresenta uma atenuação significante in vivo (Risatti et ai 2005a, supra). Nenhum das 22 substituições de amino ácido na Proteína E2 do vírus de vacina CS, em comparação com a se- qüência E2 da proteína de Brescia, afetou mAb do epítopo WH 303. Todos os três vírus, Brescia, CS e o quimera, reagiram fortemente com mAb 303 sugerindoa existência, de um outro determi- nante genético associado com a atenuação CSFV.

Aqui, foi mostrado que as mutações introduzidas em mAb de Epítopo WH 303 na glico- proteína E2 da cepa Brescia altamente patogênica de CSFV resultou na atenuação do vírus. As mudanças progressivas foram introduzidas no epítopo WH 303 Brescia de CSFV (TAVSPTTLR; SEQ ID NO:1) para se assemelhar aos resíduos encontrados na mesma posição {TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) na Cepa NADL de Glicoproteína de BVDV. Interestingly, TSFNMDTLR (T4v) ou TSFNMDTLA (T5v) são desprovidos de reatividade para mAb WH 303, mostram uma morfologia de pequena placa, e são significantemente atenuados in vivo. Diferente da doença fatal aguda indu- zida por BICv, a infecção por T4v e T5v foi sub-clínica, caracterizada por uma replicação viral reduzida nos órgãos alvo e reduzida liberação de vírus.

A relevância de WH 303 como um epítopo imunodominante principal foi recentemente observada durante a caracterização dos anticorpos monoclonais neutralizantes para E2 de CSFV e Ems usando biblioteca de peptídeos de exibição de fago (Zhang et al, 2006. Archives of Virol- ogy 151 (1): 37 - 54). Foi observado que os referidos anticorpos monoclonais se ligavam a um motive comum SPTxL que também mapeia o Epítopo WH 303 (SPTTL). Ademais, vacinas de múltiplos peptídeos, contendo o Epítopo WH 303, que consiste em seis peptídeos sobrepostos que variam entre 20 a 25 amino ácidos de comprimento, induziu imunidade contra CSFV (Dong et al., 2005. Vacina 23:3630 - 3633).

A atenuação de T5v em porcos de modo concebível pode envolver alguns aspectos de fixação de vírus e/ou entrada eficiente em células alvos fundamentais in vivo. Ems, E1 e E2 são glicoproteínas estruturais no vírion da cápsula de CSFV (Thiel et al., supra). Ancorados à cápsu- la, E2 parece tanto como homo e heterodímeros ligado por pontes de dissulfeto (Thiel et al., su- pra; Weiland et al. 1990, 1999, supra) e, junto com Ems (Hulst et al. 1997. J. Gen. Virol 78: 2779 - 2787) e E1 (Wang et al., supra) mostraram ser importantes para a recepção do vírus. Pestivírus trabalhados por engenharia contendo proteínas quiméricas E2 apresentam uma faixa de hospe- deiro alterada. Um BVDV quimérico que abriga o gene E2 completo do Vírus de doença de fron- teira (BDV), um Pestivirus de ovelha, perdeu a sua capacidade de formar placas em células de rins de bovino (MDBK) mas manteve a sua capacidade de formar placas em células de ovelhas (Lian et al. 2003. J. Gen. Viol. 84: 1269 - 1274). Entretanto, células MDBK ainda foram permissi- vas à quimera embora a diferença no rendimento da progenia viral, 24 horas após a infecção, tenha sido 100 vezes menor do que BVDV do tipo selvagem. Da mesma forma, a substituição parcial da terminação amino da cepa CSFV C E2 com a seqüência homóloga de BVDV resultou em uma redução de 10 vezes da progenia viral em células de rins de suínos (SK6). As células SK6 foram de modo similar permissivas para a quimera e doador de BVDV E2; entretanto, a qui- mera não adquiriu capacidade de BVDV para infectar células epiteliais bovinas fetais (van Gennip et al, 2000, supra). De modo similar, T4v e T5v apresentaram uma redução no rendimento da progenia viral de 10 vezes nas células SK6 em comparação com BICv, T1v, T2v e T3v (Figura2A), e falta de capacidade de replicar de modo eficaz em células de rins de bovino (MDBK) (da- dos não mostrados).

T4v e T5v exibiram uma redução de tamanho de placa de aproximadamente 70% em

comparação com a BICv parental nas células SK6 (Figura 2B). Um fenótipo similar de pequena placa foi observado com a cepa NADL de BVDV em células SK6 (dados não mostrados), suge- rindo que os referidos vírus apresentam uma capacidade alterada in vitro de fixação e/ou dissemi- nação. Embora, uma associação entre redução de tamanho de placa in vitro e atenuação in vivo de CSFV ainda não seja estabelecida, há algumas observações que sugerem a referida relação. Hulst et al., (J. Virol 74: 9553 - 9561; Huist et al., 2001, supra) observaram que a CSFrV de varian- tes dependentes de ligação a sulfato de heparina em Brescia obtidas após passagens em série em células de rins de suíno cultivadas reduziram o tamanho da placa. As referidas variantes, contendo uma única mutação de amino ácido na proteína Ems, foram virulentas em porcos (Hulst et al. 2000, 2001, supra). Entretanto, dois diferentes vírus recombinantes derivados de cepas Brescia de CSFV em E1 (Risatti et al. 2005b, supra) e E2 (Risatti et al. 2005a, supra) mostram um fenótipo de tamanho de placa reduzido em células renais de suíno cultivadas e foram atenuadas em suínos.

Em suma, um novo determinante de virulência genética de CSFV associada com Glico- proteína E2 foi identificado. Embora o mecanismo subjacente de atenuação permaneça desco- nhecido, é interessante que a perda gradual de reatividade com o mAb WH 303 correlacionado à perda de virulência in vivo, conduz a uma atenuação final de CSFV, sugerindo uma ligação entre a falta da seqüência de epítopo e a incapacidade de induzir doença por outros pestivírus (BVDV e BDV) em suínos. Aprimorando o entendimento de uma base genética da virulência de CSFV será permitida a configuração racional de vacinas CSF atenuadas vivas de maior segurança, eficácia e utilidade. Adicionalmente, no caso particular dos vírus T4v e T5v a falta de reatividade com mAb WH303, que reconhece um epítopo altamente específico e conservado de CSFV, se abre um uso potencial dos referidos mutantes virais como vacina de marcação atenuada.

EXEMPLOS

Tendo agora descrito geralmente a presente invenção, a mesma sera melhor entendida com referência a determinados exemplos específicos, os quais são aqui incluídos integralmente apenas para ilustrar adicionalmente a presente invenção e não pretendem limitar o âmbito da pre- sente invenção como definido pelas reivindicações.

EXEMPL01

Vírus e Culturas Celulares

Células de rins de suínos (SK6) (29), livres de BVDV, foram cultivadas em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM) {Gibco, Grand island, NY) com 10% soro bovino fetal (FCS) (A- tlas Biologicals, Fort Collins, CO). Cepa Brescia de CSFV foi propaganda em Células SK6 e usa- das para a construção de um clone de cDNA infeccioso (17). A titulação de CSFV a partir de a- mostras clínicas foi realizada usando células SK6 em placas de 96 cavidades {Costar, Cambridge, MA). A infectividade viral foi detectada, após 4 dias em cultura, por teste de imunoperoxidase u- sando os anticorpos monoclonais WH303 ou WH308 (1) de CSFV e o kit Veetastain ABC (Vector Laboratories, Buringames, CA) (25). As titulações foram calculadas usando o método de Reed e Muench (14) e expressos como TCID5o/mL. Como realizada, o teste de sensibilidade foi >1,8 TCID50/mL.

EXEMPLO 2

Construção de clones infecciosos Tl - T5 de CSFV

Um clone infeccioso de comprimento total (IC) do isolado de Brescia virulento (pBIC) (17) foi usado como a matriz na qual seis resíduos do Epítopo WH303 (TAVSPTTLR; SEQ ID NO: 1) entre resíduos 829 a 837 de E2 sofreram mutação para refletir os referidos resíduos homó- logos presentes no NADL isolado de BVDV (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:2) (Lin et ai, supra). As mutações foram adicionadas progressivamente, produzindo cinco IC para o resgate dos mutan- tes virais a seguir: T1v (TSFSPTTLR; SEQ ID NO:3)t T2v (TSFNPTTLR; SEQ ID NO:4), T3v (TSFNMTTLR; SEQ ID NO:5), T4v (TSFNMDTLR; SEQ ID NO:6) e T5v (TSFNMDTLA; SEQ ID NO:7) (Figura 1). As mutações foram introduzidas por mutagênese direcionada por campo usando o kit QuickChange XL de Mutagênese direcionada a Campo (Stratagene, Cedar Creek, TX) reali- zada de acordo com as instruções do fabricante e usando primers e plasmídeos alvo descritos na tabela 1.

Tabela 1. Primers usados para construer os vírus T1 - T5. <table>table see original document page 8</column></row><table>

* apenas as seqüência de primers dianteiras são proporcionadas. Os primers invertidos correspondem à seqüência complementar.

RNA infeccioso foi transcrito in vitro a partir de ICs de comprimento total de Cepa Bres- cia de CSFV ou mutantes T1 a T5 e usado para transfectar células SK6 (Figura 1A). O vírus foi resgatado a partir das células transfectadas em cerca do dia 4 pós-transfecção. As seqüências de nucleotídeos dos genomas virais resgatados foram idênticas aos plasmídeos de DNA parental, confirmando que apenas as mutações no lócus que codifica o Epítopo WH303 foram refletidas em Τ1ν- Τ5ν. EXEMPLO 3

Resgate In Vitro de Brescia de CSFV e vírus mutantes de T1 - T5v

Os clones infecciosos genômicos de comprimento total foram Iinearizados com Srfl e transcritos in vitro usando o sistema T7 Megascript (Ambion, Austin, TX). Os produtos de RNA foram precipitados com LICI e transfectados em células SK6 por eletroporação a 500 volts, 720 ohms, 100 watts com um eletroporador BTX 630 (BTX, San Diego, CA). As células foram lamina- das em placas de 12 cavidades e frascos de 25 cm2, e incubadas por 4 dias a 37EC e 5% de at- mosfera de CO2. Vírus foi detectado por coloração de imunoperoxidase usando um E2 de CSFV específico para anticorpo monoclonal (WH308). Estoques de vírus resgatados foram armazena- dos a -70C. A precisão das mutações introduzidas foi verificada por seqüenciamento do gene E2 dos vírus mutantes.

EXEMPLO 4

Análise In Vitro e In Vivo de T1v - T5v

O desenvolvimento In vitro das características de T1v - T5v com relação ao pBICv pa- rental foram avaliados em uma curva de crescimento de múltiplas etapas (Figura 2A). Culturas de células SK6 foram infectadas por uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0.01 TCID50 por célula. Os vírus foram adsorvidos por 1 hora (tempo zero), e as amostras foram coletadas em tempos pós infecção por 72 horas. Embora os mutantes T1v, T2v, e T3 tenham exibido caracte- rísticas de desenvolvimento praticamente indistinguíveis a partir de pBICv, T4 e T5v exibiram uma redução de 10 vezes no rendimento viral final. T4v e T5v exibiram também uma redução de 80% - .90% no tamanho da placa com relação a BICv1 T1v, T2v, e T3v (Figura 2B). Finalmente, embora a reatividade imunocitoquímica com a MAb WH303 tenha sido equivalente para Tiv1 T2v, e p- BICv, a reatividade foi parcialmente perdida em T3v e completamente abolida em células T4v e T5v infectadas (Figura 2B). Os referidos resultados indicaram que as mutações do epítopo WH303 que afeta a capacidade do CSFV em replicar in vitro apresenta um efeito similar na reatividade de WH303.

Para examinar o efeito progressivo da mutação do epítopo WH303 na virulência de CSFV em suínos, fenótipos de virulência dos vírus T1v - T5v mutantes e BICv de tipo selvagem foram comparados em 6 grupos de porcos Yorkshire inoculados por via intranasal com 105 TCID50 de vírus e monitorados para doença clínica. Os resultados do referido experimento são mostrados na Tabela 2 e nas figuras 3 - 5. A identidade e a estabilidade das mutações do epítopo WH303 foram confirmadas por análise da seqüência de nucleotídeos do vírus recuperado a partir das amídalas de animais infectados porTIv - T5v em 6 DPI (dados não mostrados).

Tabela 2. Sobrevivência de suínos e resposta de febre em seguida de infecção com T1 - T5v ou BICv. <table>table see original document page 10</column></row><table>

# Inclui animais usados em estudos de proteção.

Embora BICv1 como esperado, tenha sido altamente patogênico, a eficácia de indução de febre, sinais clínicos, e morte em suínos, T1v - T5v mutantes pareceram ser dotados de fenótipos de virulência que foram cada vez mais atenuados (Tabela 2, figura 3). T1v e T2v foram também altamente patogênicos, induzindo febre e morte em suínos de maneira similar àquela de BICv {Ta- bela 2); entretanto, T2v demonstrou um relativo retardo nas pontuações clínicas com relação ao BICv (Tabela 3). T3v induziu uma doença letal mas com retardamento da cinética com relação ao BICv, na medida em que a morte ocorreu de 4 - 8 dias após (Tabela 2). De modo notável, T4v e T5v falharam na indução da doença letal, com T4v induzindo apenas uma febre transitória e suave e T5v induzindo quase nenhuma doença clínica (Tabela 2, figura 3). De modo similar, a infecção por BICv, T1v, T2v e T3v resultou de 6 DPI em uma drástica redução nas células sangüíneas brancas (WBC) e a contagem de plaquetas que permaneceu baixa até a morte, embora T4v e T5v- infectadas induziram um efeito transitório e menos dramático (Figura 4).

Tabela 3. A titulação viral1 em amostras clínicas e tecidos em seguida de infecção com T5v ou BICv.

<table>table see original document page 10</column></row><table> <table>table see original document page 11</column></row><table>

.1. Titulação expressão como TC D50ZmL

.2. DPI, dias pós-infecção

.3 Neg: <1.80 TCID50/mL

.4. ND: Não determinado

A atenuação de T1v - T5v também se refletiu em viremia e excreção viral. Embora

T1v e T2ν tenham induzido à titulações virêmicas comparáveis àquelas induzidas por BICv1 as titulações de T3v foram reduzidas em 101 a 102 Iog10 e T4v e T5v induziram à titulações de 103 a 108 Iog10 menores do que as titulações de BICv em momentos pós-infecção simila- res (Fig. 5a). Um padrão similar foi observado para titulações de vírus de esfregações nasais e curetagens das tonsilas (Figs. 5B e C1 respectivamente), com as titulações de T3v, T4v e T5v caindo abaixo dos níveis detectáveis em DPI posterior.

Para um estudo mais detalhado de patogênese, animais infectados com T5v e BICv sofreram eutanásia a 2, 4, 6, 8 e 14 DPI (um animal/ponto de tempo/grupo) e as titulações de vírus foram determinadas para amostras de tecidos das tonsilas, nódulo linfático sub- mandibular, baço, sangue e amostras de tecido dos rins e para amostras do esfregaço nasal e curetagem das tonsilas (Tabela 3). T5v exibiu níveis significativamente menores de repli- cação viral nas tonsilas (aproximadamente 102 a 104 Iog10) com relação ao BICv. Diferenças similares entre T5v e BICv foram observadas em titulações de vírus de drenagem regional do nódulo linfático mandibular, baço e rim (Tabela 3). Esses resultados indicam que um número aumentado de mutações dentro do epí-

topo WH303 do CSFV E2 tinha um efeito aditivo na atenuação do vírus para suínos, com mutações presentes em T4v e T5v resultando em diminuição significativa na virulência viral. Além disso, infecção por T5v é caracterizada por uma doença clínico muito branda e transi- tória, replicação viral diminuída nas tonsilas e tecidos alvo e excreção viral dramaticamente reduzida.

EXEMPLO 5

Seqüenciamento e análise de DNA

Clones infecciosos de comprimento total, vírus recuperados in vitro e vírus recupe- rados de animais infectados foram completamente seqüenciados com primers CSFV- específicos através do método de término de cadeia em dideóxinucleotídeo (Sanger e cola- boradores, 1977. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74; 5463 - 5467). As reações de seqüencia- mento foram preparadas com o Kit Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer, Boston, MA). Os produtos da reação foram seqüenciados com um Seqüenciador de DNA Automático PRISM 3730x1 (PE Biosystems, Foster City, CA). Os dados de seqüência foram montados com o programa de software Phrap gram (www.phrap.oral com montagens confirmatórias realizadas usando CAP3. A seqüência de consenso de DNA final representava, em média, redundância de cinco vezes em cada posição de base. Comparações de seqüência foram conduzidas usando BioEdit. EXEMPLO 6

Infecções em Animais

Cada um dos mutantes T1v-T5v foi inicialmente selecionado quanto a seu fenótipo de virulência em suínos com relação ao vírus virulento Brescia. Os suínos usados em todos os estudos com animais eram porcos de quarenta libras de 10 a 12 semanas de idade, ino- culados intranasalmente com 105 TCID50 de vírus mutante ou do tipo silvestre. Para seleção, 12 porcos foram aleatoriamente alocados em 6 grupos de 2 animais cada e os porcos em cada grupo foram inoculados com um dos mutantes T1v-T5v ou pBICv. Sinais clínicos (ano- rexia, depressão, febre, descoloração púrpura da pele, locomoção cambaleante, diarréia e tosse) foram observados diariamente por todo o experimento e classificados conforme ante- riormente descrito com modificações.

Para avaliar o efeito de mutações T5v sobre a excreção e distribuição de vírus em diferentes órgãos durante infecção, 10 porcos foram aleatoriamente alocados em 2 grupos de 5 animais cada e inoculados com T5v ou pBICv. Um porco por grupo foi sacrificado a 2, 4, 6, 8 e 14 DPI. Amostras de sangue, esfregaços nasais e curetagem das tonsilas foram obtidos dos porcos na necropsia. Amostras de tecido (tonsilas, nódulo linfático mandibular, baço e rim) foram congeladas em nitrogênio líquido para titulação do vírus.

Para estudos de proteção, 12 porcos foram aleatoriamente alocados em 3 grupos de 4 animais cada. Porcos nos grupos 1 e 2 foram inoculados com T5v, os animais no grupo 3 foram infectados com placebo. A 3 DPI (grupo 1) ou 21 DPI (grupo 2), os animais foram estimulados com BICv junto com os animais no grupo 3. Sinais clínicos e a temperatura cor- poral foram registrados diariamente por todo o experimento, conforme descrito acima. Soro, sangue, esfregaços nasais e curetagens das tonsilas foram coletados em momentos após estímulo, com sangue obtido da veia cava anterior em tubos com EDTA (Vacutainer) para contagens diferenciais e totais de células sangüíneas brancas. Contagens diferenciais e totais de células sangüíneas brancas e plaquetas foram obtidas usando um Beckman Coul- ter ACT (Beckman, Coulter, CA). EXEMPLO 7

Infecção com T5v protege suínos contra estímulo com BICv patogênico A capacidade do T5v de induzir à proteção contra estímulo com BICv foi avaliada. Suínos vacinados com T5v foram estimulados a 3 ou 21 DPI com 105 TCID50 de BICv pato- gênico. Porcos de controle vacinados com placebo não receberam T5v. Porcos que recebe- ram T5v desenvolveram anorexia, depressão e febre em 4 dias pós-estímulo (DPC) com BICv e desenvolveram uma redução acentuada de leucócitos e plaquetas em circulação no dia 7 DPC e morreram ou estavam moribundos e sofreram eutanásia a 12 DPC (Tabela 4 e Fig. 6).

Tabela 4. Sobrevivência de suínos e resposta de febre de animais T5-infectados após estímulo com BICv

<table>table see original document page 13</column></row><table>

.1 Dias pós-infecção com T5

.2 Dois de 4 animais apresentaram febre

.3 Controle: os animais foram vacinados com placebo

Notavelmente, T5v induziu à proteção completa em 3 DPI contra doença clinica in- duzida por BICv. Todos os porcos sobreviveram à infecção e permaneceram clinicamente normais, com apenas dois animais apresentando uma febre transitória a 4 DPC (Tabela 4) e sem alterações significativas em seus valores hematológicos (Fig. 6). Similarmente, porcos estimulados a 21 dias pós-infecção com T5v permaneceram clinicamente normais (Tabela4).

A viremia e excreção de vírus BICv, conforme especificamente detectado com mAb WH303, foram também examinadas a 4, 6, 8, 14 e 21 DPC (dados não mostrados). Confor- me esperado, em animais de controle vacinados com placebo, a viremia pelo BIC foi obser- vada em 5 DPI, com titulações de vírus permanecendo altas (106 TCID50/ml em 8 DPC) até a morte e a titulação de BICv a partir de esfregaços nasais e curetagens das tonsilas em 4 DPC atingindo IO4-IO5 TCID50/mI em 8 DPC. Em contraste, BICv estava ausente em todas as amostras clinicas (sangue, esfregaços nasais ou curetagens das tonsilas) de suínos vaci- nados com T5v após estímulo. Esses resultados indicam que T5v é capaz de induzir rapi- damente a uma proteção completa contra estímulo com CSFV letal, pelo fato de que suínos T5v-imunes não demonstram viremia ou excreção detectáveis do vírus de estimulação.

Assim, T5v é capaz de induzir, em animais experimentalmente vacinados, a uma proteção completa contra a presença de doença clínica e a replicação do vírus de estímulo quando estimulados com o vírus precursor virulento Brescia em 3 ou 28 dias após vacinação com T5.

Todas as publicações e patentes mencionadas na presente especificação são aqui incorporadas por referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou patente indivi- dual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.

A descrição precedente e determinadas modalidades representativas e detalhes da invenção foram apresentados para fins de ilustração e descrição da invenção e não se des- tinam a ser exaustivos ou limitar a invenção às formas precisas divulgadas. Será evidente para aqueles habilitados na técnica que modificações e variações podem ser feitas na mes- ma sem se desviar do escopo da invenção. LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Borca1 Manuel V.

Risatti1 Guillermo <120> Novo determinando de virulência em E2estrutural Glicoproteína do Vírus da Febre Suína Clássica

<130> 0088.06 <160> 12

<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> desconhecido <220>

<223> quimicamente sintetizado <400> 1

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg 1 5

<210> 2 <211> 9 <212> PRT

<213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 2

Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala

<210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 3

Thr Ser Phe Ser Pro Thr Thr Leu Arg

<210> 4 <211> 9 <212> PRT

<213> Desconhecido

<220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 4

Thr Ser Phe Asn Pro Thr Thr Leu Arg 1 5

<210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Quimicamente sintetizado <400> 5

Thr Ser Phe Asn Met Thr Thr Leu Arg 1 5

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Desconhecido <220> <223> Quimicamente sintetizado <400> 6

Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Arg 1 5

<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 7

Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala 1 5

<210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 8

gggtgttata gagtgcacgt catttagccc gacaactctg agaac 45

<210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 9

gggtgttata gagtgcacgt catttaatcc gacaactctg agaac 45

<210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 10

gggtgttata gagtgcacgt catttaatat gacaactctg agaac 45

<210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 11

gagtgcacgt catttaatat ggacactctg agaacagaag tggta 45

<210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Desconhecido <220>

<223> Quimicamente sintetizado <400> 12

tcatttaata tggacactct ggcaacagaa gtggtaaaga ccttc 45

Claims

1. Vírus da Febre suína clássica (CSFV) recombinante, CARACTERIZADO pelo fa- to de que compreende DNA que codifica uma glicoproteína E2 modificada de CSFV.

2. Vírus da Febre suína clássica recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende DNA que codifica a glicoproteína E2 de CSFV a qual foi modificada através de mutação progressiva de uma porção do gene de E2 da cepa altamente patogênica Brescia para se assemelhar parcialmente o gene E2 homólogo de BVDV1 uma modificação que re- sulta em atenuação de CSFV.

3. Vírus da Febre suína clássica recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende DNA que codifica a glicoproteína E2 de CSFV a qual foi modificada através de mutação progressiva de uma região do gene de E2 da cepa altamente patogênica Brescia, em que a referida região codifica os aminoácidos 829-837 da glicoproteína E2 de CSFV e pelo que mutações progressivas no referido DNA resultam em uma alteração de um a seis aminoácidos característicos da glicoproteína E2 de CSFV a um a seis aminoácidos caracte- rísticos da região homóloga da glicoproteína E2 de BVDV1 uma modificação que resulta em atenuação de CSFV.

4. Vírus da Febre suína clássica recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende DNA que codifica a glicoproteína E2 de CSFV tendo a seqüência TSFNMDTLR (SEQ ID NO: 6), uma modificação que resulta em atenuação de CSFV.

5. Vírus da Febre suína clássica recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende DNA que codifica uma glicoproteína E2 de CSFV com mutação tendo a se- qüência TSFNMDTLA (SEQ ID NO: 7), uma modificação que resulta em atenuação de CSFV.

6. Vacina contra CSF atenuada viva racionalmente projetada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus da febre suína clássica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3.

7. Vacina contra CSF atenuada viva racionalmente projetada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus da febre suína clássica recombinante de acordo com a reivindicação 4.

8. Vacina contra CSF atenuada viva racionalmente projetada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um vírus da febre suína clássica recombinante de acordo com a reivindicação 5.

9. Método de imunização de um animal contra CSF1 CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração, ao referido animal, de uma vacina compreendendo um vírus da febre suína clássica recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações .1-5.

10. Método de proteção de um animal contra CSF, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração, ao referido anima, de uma quantidade da vacina de acor- do com a reivindicação 8 para proteger o referido animal de CSF clínica.

11.Método para distinguir animais infectados com CSFV de animais vacinados com a vacina contra CSF atenuada viva racionalmente projetada, de acordo com a reivindicação .8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a análise do soro de um animal sob avaliação em um ELISA competitivo para determinar se o referido soro inibe a ligação do mAb 303.

12.Método para distinguir animais infectados com CSFV de animais vacinados com a vacina contra CSF atenuada viva racionalmente projetada, de acordo com a reivindicação .7, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a análise do soro de um animal sob avaliação em um ELISA competitivo para determinar se o referido soro inibe a ligação do mAb 303.

13.Estratégia para a produção de um vírus da febre suína clássica recombinante atenuado, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (A)identificação de um determinante de virulência na cepa altamente patogênica Brescia; (B)identificaçãode um determinante de virulência homólogo em um vírus relaciona- do, o referido vírus não patogênico em suínos; (C)mutaçãoprogressiva e seqüencial do DNA que codifica o referido determinante de virulência, pelo que mutações progressivas no referido DNA resultam em uma alteração de aminoácidos característicos do determinante de virulência de CSFV em aminoácidos ca- racterísticos do determinante de virulência homólogo; e (D)Obtençãode atenuação de CSFV.

14.Estratégia, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADA pelo fato de que o vírus relacionado é BVDV ou BDV.

15.Método de produção de um vírus da febre suína clássica recombinante atenua- do, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende DNA que codifica uma glicoproteína E2 de CSFV modificada compreendendo: (a)mutação progressiva de uma região do gene E2 da cepa altamente patogênica Brescia, em que a referida região codifica os aminoácidos 829-837 da glicoproteína E2 de CSFV e pelo que mutações progressivas no referido DNA resultam em uma alteração de um a seis aminoácidos característicos da glicoproteína E2 de CSFV para um a seis aminoácidos característicos da região homóloga da glicoproteína E2 de BVDV; e (b)obtenção de atenuação de CSFV como um resultado de tal modificação.