MX2008015215A - Determinante de virulencia novedoso dentro de la glicoproteina estructural e2 del virus clasico de fiebre porcina. - Google Patents

Abstract

La glicoproteína E2 del Virus Clásico de Fiebre Porcina (CSFV) es un inductor mayor de los anticuerpos neutralizantes y de la inmunidad protectora en los cerdos. E2 media la adsorción del virus hacia la célula objetivo, y aloja los determinantes genéticos asociados con la virulencia del virus. La E2 del CSFV también contiene, entre los residuos 829 y 837, un epítopo separado (TAVSPTTLR) reconocido por el anticuerpo monoclonal (mAb) WH303, utilizado para diferenciar el CSFV de los Pestivirus relacionados de Virus de Diarrea Viral Bovina (BVDV) y Virus de Enfermedad Limítrofe (BDV). En este reporte, se utilizó un clon infeccioso de CSFV del aislado virulento de Brescia (BICv) para mutar progresivamente el epítopo del anticuerpo monoclonal WH303 de la E2 del CSFV hasta la secuencia de aminoácidos homóloga de la E2 de la cepa NADL del BVDV (TSFNMDTLA). Aunque los mutantes del virus resultantes T1v (TSFSPTTLR), T2v (TSFNPTTLR), T3v (TSFNMTTLR) demostraron características de crecimiento in vitro similares a aquéllas del BICv progenitor, los mutantes T4v (TSFNMDTLR) y T5v (TSFNMDTLA) exhibieron una disminución de 10 veces en la producción del virus, y una disminución significativa en el tamaño de las placas en relación con el BICv progenitor. La reactividad inmunohistoquímica con WH303 se perdió solamente en T3v, T4v, y T5v.

Description

DETERMINANTE DE VIRULENCIA NOVEDOSO DENTRO DE LA GLICOPROTEINA ESTRUCTURAL E2 DEL VIRUS CLASICO DE FIEBRE PORCINA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Campo de la invención Esta invención se relaciona con el aislamiento y la caracterización de nuevos determinantes de virulencia del virus clásico de fiebre porcina (CSFV) dentro de la glicoproteína estructural E2 y la utilización de estos nuevos determinantes de virulencia para diseñar vacunas atenuadas vivas contra la CSF.

Descripción de la Técnica Relacionada La fiebre porcina clásica (CSF) es una enfermedad muy contagiosa de los cerdos que puede ser de naturaleza aguda o crónica (van Oirsc ot, J. T. 1986. En: Diseases of Swine, 6th edition, Leman et al., ed., lowa State University Press, Ames, lowa, página 289). El agente etiológico, el virus de la CSF (CSFV), es un virus pequeño, envuelto con un genoma de ARN monocatenario positivo y, junto con el virus de la diarrea viral bovina (BVDV) y el virus de la enfermedad de la frontera (BDV), se clasifica como integrante del género pestivirus dentro de la familia Flaviridae (Hulst et al. 2001. J. Virol. 75: 9585-9595). El genoma del CSFV de 12,5 kb contiene un único marco de lectura abierto que codifica una poliproteina de 4.000 aminoácidos y, en última instancia, produce entre 11 y 12 productos finales de segmentación (NH2-Npro-C-Erns-E 1 -E2-p7-NS2- NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH) a través del procesamiento cotraslacional y postraslacional de la poliproteína por proteasas celulares y virales (Rice, C. M. 1996. En: Fundamental Virology, 3rd edition, Fields and Howley, ed., Lippincott Raven, Philadelphia, pp. 931-959). La virulencia y los fenotipos de rango de huésped varían entre los aislados del CSFV y entre los pestivirus. La infección con cepas del CSFV muy virulentas produce la muerte en animales infectados, mientras que los aislados de virulencia moderada a baja inducen una enfermedad crónica prolongada (van Oirschot, supra). Además, si bien el BVDV y el BDV son agentes etiológicos de enfermedades en especies bovinas y ovinas, respectivamente, también pueden infectar a los cerdos sin inducir enfermedad clínica (van Oirschot, supra). A pesar de la disponibilidad de las secuencias genómicas del CSFV de fenotipos de virulencia diferente, el BVDV y el BDV, aún no se comprende con exactitud el fundamento genético de la virulencia del CSFV en el huésped natural (van Oirschot, supra). El uso de genética inversa ha permitido la identificación de determinantes de virulencia, lo que facilita el desarrollo de vacunas atenuadas vivas contra la CSF experimentales ( ayer et al. 2004. Vaccine 22: 317-328; Meyers et al. 1999. J. Virol. 73: 10224-10235; Moorman et al. 1996. J. Virol. 70: 763-770; Moser et al. 2001. Virus Genes 23: 63-68; Risatti et al. 2005a. J. Virol. 79: 3787-3796; Risatti et al. 2005b.

Virology 343: 116-117; Ruggli et al. 1996. J. Virpl. 70: 3478-3487; Tratschin et al. 1998. J. Virol. 72: 7681- 7684; van Gennip et al. 2000. Vaccine 19: 447-459). La proteína de la cápside, y las glicoproteínas Erns, E1 y E2 son los componentes estructurales del virión del CSFV con las glicoproteinas E1 y E2 ancladas a la envoltura a través del carboxilo terminal y la glicoproteína Erns unida en forma laxa a la envoltura viral (Thiel et al. 1991. J. Virol. 65: 4705-4712; Weiland et al. 1990. J. Virol. 64: 3563-3569; Weiland et al. 1999. J. Gen. Virol. 80: 1157-1165). Las tres glicoproteínas han sido relacionadas con la virulencia del CSFV (Meyers, supra; Risatti et al. 2005 a, b, supra). La glicoproteína E2 se considera esencial para la replicación del CSFV, dado que se ha demostrado que los mutantes del virus que contienen eliminaciones parciales o completas del gen de la E2 no son viales (van Gennip et al. 2002. Vaccine 20: 1544-1556). La E2 ha estado implicada, junto con la Erns ( ayer et al., supra) y la E1 (Wang et al. 2004. Virology 330: 332-341 ), en la adsorción viral a las células huésped; de hecho, los pestivirus quiméricos muestran fenotipos de infectividad y de tropismo celular coherentes con los del donante del gen de la E2 (van Gennip et al. 2000, 2002, supra). La E2 es la más inmunogénica de las glicoproteínas del CSFV (Konig et al. 1995. J. Virol. 69: 6479-6486; Weiland et al. 1990, supra), que inducen la producción de anticuerpos neutralizantes y la protección contra provocaciones mortales. La E2 del CSFV también contiene, entre los residuos 829 y 837, un epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal (mAb) WH303 (Lin et al. 2000. J. Virol. 74:11619-11625), un reactivo que no reacciona con la E2 del BVDV ni del BDV y se utiliza en forma rutinaria para diagnosticar CSF. En la presente, se reporatn los efectos de las mutaciones dentro del epítopo del WH303 de la E2 del CSFV, mutaciones que cambian progresivamente la secuencia de aminoácidos del CSFV Brescia virulento a la secuencia de aminoácidos homologa de la cepa NADL del BVDV, y demuestra un efecto aditivo para la virulencia viral en cerdos y una atenuación completa después de seis cambios de aminoácidos. Estos virus atenuados permiten el desarrollo racional de vacunas atenuadas vivas contra la CSF. Los animales infectados con los mutantes del virus estuvieron protegidos cuando se los provocó con el virus Brescia virulento 3 y 21 días después de la vacunación. La modificación en este sitio dentro del epítopo del WH303 permite el desarrollo de una prueba de diagnóstico para diferenciar a los animales vacunados de los infectados.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha identificado un determinante novedoso de virulencia del CSFV dentro de la glicoproteína E2. De acuerdo con este descubrimiento, un objeto de la invención es proporcionar un virus clásico de fiebre porcina (CSFV) recombinante que comprenda ADN que codifique una glicoproteína E2 del CSFV modificada.

También es un objeto de la invención proporcionar un virus clásico de fiebre porcina recombinante que comprenda ADN que codifique la glicoproteína E2 del CSFV que ha sido modificada a través de la mutación progresiva de una porción del gen de la E2 de la cepa Brescia altamente patógena, lo que produce el virus de la E2 mutado que se asemeja bastante a la secuencia del epitopo del WH303 del gen de la E2 homólogo del BVDV, una modificación que produce la atenuación del CSFV. Un objeto adicional de la invención es proporcionar composiciones inmunogénicas que comprendan un virus clásico de fiebre porcina recombinante viable que comprenda una glicoproteína E2 del CSFV modificada. Un objeto adicional de la invención es proporcionar una vacuna atenuada viva contra el CSFV diseñada en forma racional que reduzca la gravedad de la CSF. Otro objeto de la invención es proporcionar una vacuna atenuada viva contra el CSFV diseñada en forma racional que sea efectiva para proteger a un animal contra la enfermedad de la CSF clínica cuando se lo provoca con el CSFV Brescia virulento. Otro objeto de la invención es proporcionar una vacuna marcadora que permita realizar una distinción serológica entre los animales vacunados y los animales infectados por el CSFV. Otro objeto adicional de la invención es proporcionar un método para proteger a un animal contra la CSF a través de la administración de una cantidad efectiva de una vacuna atenuada viva contra el CSFV diseñada en forma racional. Otros objetos y ventajas de esta invención se obtendrán a partir de la descripción proporcionada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS En la Figura 1 , se proporciona una comparación del CSFV Brescia, de la cepa NADL del BVDV y de los virus mutantes T1-5 del CSFV en el área del epítopo del mAb WH303 de la glicoproteina E2. Se indican las posiciones de los residuos de aminoácidos en la poliproteína del CSFV. La cursiva indica residuos distintos de aquellos de la E2 de Brescia, tanto en la cepa NADL del BVDV como en los mutantes T1v a T5v del CSFV. En las Figuras 2A y 2B, se comparan las características de los mutantes T1v-T5v y de BICv. En la Figura 2A, se muestran las características de crecimiento in vitro de los mutantes T1v-T5v y de BICv. Se infectaron monocapas de SK6 [multiplicidad de infección (multiplicity of infection, MOI)= 0,01] con T1v, T2v, T3v, T4v, T5v o BICv, y se realizó la titulación de la producción de virus en ciertos puntos en el tiempo después de la infección. Los datos representan medias y desvíos estándares de dos experimentos independientes. En la Figura 2B, se muestra la formación de placas y la reactividad del mAb de los mutantes T1v-T5v y de BICv. Se infectaron monocapas de SK6 con 50 a 100 dosis infecciosas del 50% del cultivo tisular (tissue culture infectious dose, TCID50), superpuestas con agarosa al 0,5% e incubadas a una temperatura de 37 °C durante 3 días. Se fijaron las placas con etanol-acetona al 50% (vol/vol) y se tiñeron en forma diferencial mediante inmunohistoquímica con el mAb WH303 y el mAb WH308. En la Figura 3, se muestran los puntajes clínicos registrados de cerdos infectados con virus T1v-T5v y BICv recombinantes. Los puntajes clínicos se calcularon como se describió anteriormente con modificaciones y se basaron en las observaciones de dos (T1v, T2v, T3v y T4v) o seis (T5v y BICv) animales. En las Figuras 4A-B, se muestran los recuentos de glóbulos blancos periféricos (Figura 4A) y de plaquetas (Figura 4B) en cerdos infectados con virus T1v-T5v y BICv recombinantes. Los recuentos se expresan en cantidad/ml y cada punto representa la media y los errores estándares de dos (T1v, T2v, T3v y T4v) o seis (T5v y BICv) animales. En las Figuras 5A-C, se representan los títulos o titulaciones virales en sangre (Figura 5A), hisopados nasales (Figura 5B) y raspajes de las amígdalas (Figura 5C) de cerdos infectados con mutantes T1v-T5v o BICv. Cada punto representa la TCID50/ml medía y el desvío estándar para dos (T1v, T2v, T3v y T4v) o seis (T5v y BICv) animales. En las Figuras 6A-B, se muestran los recuentos de glóbulos blancos periféricos (Figura 6A) y de plaquetas (Figura 6B) en cerdos a los que se les administró una vacuna falsa o que fueron vacunados con T5v y fueron provocados con BICv 3 ó 21 días después de la infección (days post-infection, DPI). Los valores para los animales de control, a los que se les administró una vacuna falsa, y los animales provocados se representan con cuadrados negros. Los recuentos se expresan como cantidad/ml y representan la media para cuatro sujetos con barras de error que indican el error estándar.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El desarrollo de estrategias de control de enfermedades en caso de una epidemia del CSFV requiere un inicio rápido de la protección, lo que se vuelve un parámetro más importante de la eficacia de la vacuna que, por ejemplo, la duración de la protección. El desarrollo de este tipo de vacunas implicaría la producción de cepas para la vacuna atenuada viva contra el CSFV diseñada en forma racional. Aún no son claros los fundamentos genéticos y los mecanismos moleculares relacionados con la virulencia de los pestivirus. En el caso del CSFV, en diferentes informes se describieron asociaciones entre las proteínas virales o la región genómica especifica y la virulencia. Las mutaciones simples o dobles de codones que eliminan la actividad de la ARNasa de la glicoproteina Alfort Erns de la cepa del CSFV atenuaron el virus en cerdos (Meyers et al., supra). También se observaron resultados similares mediante la mutación del dominio de la ARNasa de la glicoproteina Erns del BVDV (Meyer et al. 2002. J. Virol. 76: 8494-8503). Más recientemente, se ha demostrado que, al borrar la secuencia Npro de las cepas virulentas del CSFV Alfort/187 y Eystrup, se produce la atenuación de los virus en cerdos (Mayer et al., supra). Una sustitución de aminoácidos en la glicoproteína E2 del CSFV asociada con sustituciones de tres aminoácidos en Erns produjo la reducción de la virulencia en cerdos (van Gennip et al. 2004. J. Virol. 78: 8812-8823). Además, la inserción dentro del marco de 19 aminoácidos en el gen de la E1 de la cepa Brescia del CSFV produjo atenuación in vivo (Risatti et al. 2005b, supra). La E2 del CSFV también se ha visto implicada en la virulencia. El reemplazo del gen de la E2 de la cepa Brescia del CSFV con el gen de la E2 de la cepa CS de la vacuna produjo un virus quimérico que tiene una atenuación significativa in vivo (Risatti et al. 2005a, supra). Ninguna de las sustituciones de los 22 aminoácidos en la proteína E2 del virus de la vacuna del CS, en comparación con la secuencia de la proteina E2 de Brescia, afecta el epítopo del mAb WH303. Los tres virus, Brescia, CS y quimérico, reaccionan fuertemente con el mAb 303, lo que sugiere la existencia de otro determinante genético relacionado con la atenuación del CSFV. En la presente, mostramos que las mutaciones introducidas en el epítopo del mAb WH303 en la glicoproteína E2 de la cepa Brescia del CSFV altamente patógena produjo la atenuación del virus. Se introdujeron cambios progresivos en el epítopo del WH303 de la cepa Brescia del CSFV (TAVSPTTLR; SEC ID NO. 1) para que se asemejen a los residuos encontrados en la misma posición (TS FN M DTLA; SEC ID NO. 2) en la glicoproteína E2 de la cepa NADL del BVDV. Cabe destacar que ni TSFN DTLR (T4v) ni TSFNMDTLA (T5v) presentan reactividad contra el mAb WH303 y que muestran una morfología de la placa reducida y se atenúan significativamente in vivo. A diferencia de la enfermedad mortal aguda inducida por la infección por BICv, la infección por T4v y T5v fue subclinica y estuvo caracterizada por una disminución en la replicación viral en los órganos objetivo y redujo la eliminación del virus. Se observó recientemente la relevancia del WH303 como epítopo inmunodominante importante durante la caracterización de anticuerpos monoclonales neutralizantes contra la E2 y la Erns del CSFV utilizando una biblioteca aleatoria de péptidos expresados en fagos (Zhang et al. 2006. Archives of Virology 151 (1 ): 37-54). Se determinó que aquellos anticuerpos monoclonales unían un motivo SPTxL común que también mapea al epítopo del WH303 (SPTTL). Asimismo, las vacunas multipeptídicas, que contienen el epítopo del WH303, que consiste en seis péptidos superpuestos que oscilan entre 20 y 25 aminoácidos de longitud, indujeron inmunidad contra el CSFV (Dong et al. 2005. Vaccine 23:3630-3633). La atenuación del T5v en cerdos podría implicar algún aspecto de la unión viral y/o el ingreso eficaz en las células objetivo críticas in vivo. Erns, E1 y E2 son glicoproteínas estructurales presentes en la envoltura del virión del CSFV (Thiel et al., supra). Anclada a la envoltura, la E2 aparece como homodímero y heterodímero unida por puentes disulfuro (Thiel et al., supra; Weiland et al. 1990, 1999, supra) y, junto con la Erns (Hulst et al. 1997. J. Gen. Virol. 78: 2779-2787) y la E1 (Wang et al., supra), han demostrado ser importantes para la recepción del virus. Los pestivirus genomanipulados que contienen las proteínas E2 quiméricas han alterado el rango de huéspedes. Un BVDV quimérico que incluye el gen de la E2 completo del virus de la enfermedad de la frontera (BDV), un pestivirus ovino, perdió su capacidad de formar placas en células renales bovinas (MDBK), pero conservó su capacidad de formar placas en células ovinas (Lian et al. 2003. J. Gen. Viol. 84: 1269-1274). No obstante, las células MDBK aún eran permisivas con la quimera, aunque la diferencia en la producción de la progenie viral, 24 horas después de la infección, fue 100 veces menor que en el BVDV de tipo salvaje. Del mismo modo, el reemplazo parcial del amino terminal de la E2 de la cepa C del CSFV con la secuencia homologa del BVDV produjo una disminución de 10 veces en la producción de la progenie viral en células renales porcinas (SK6). Las células SK6 fueron similarmente permisivas para la quimera y el donante de E2 del BVDV; no obstante, la quimera no obtuvo la capacidad del BVDV para infectar células epiteliales bovinas fetales (van Gennip et al. 2000, supra). En forma similar, T4v y T5v presentaron una reducción de 10 veces en la producción de la progenie viral en células SK6 en comparación con BICv, T1v, T2v y T3v (Fig. 2A), y no tenían la capacidad de replicarse en forma eficaz en células renales bovinas (MDBK) (no se muestran los datos). El T4v y el T5v mostraron una reducción del tamaño de la placa de aproximadamente el 70% en comparación con el BICv parental en células SK6 (Fig. 2B). Se observó un fenotipo de placa pequeña similar con la cepa NADL del BVDV en células SK6 (no se muestran los datos), lo que sugiere que estos virus tienen una capacidad in vitro alterada de unirse y/o diseminarse. Si bien aún no se ha establecido una asociación entre la reducción del tamaño de la placa in vitro y la atenuación del CSFV in vivo, hay algunas observaciones que sugieren una relación. Hulst et al. (J. Virol 74:9553-9561; Hulst et al. 2001, supra) han observado que las variantes de la cepa Brescia del CSFV dependientes de la unión a sulfato de heparina obtenidas después de pasadas en serie en células renales porcinas cultivadas presentan una reducción en el tamaño de la placa. Estas variantes, que contienen una mutación de un solo aminoácido en la proteína Erns, fueron virulentas en cerdos (Hulst et al. 2000, 2001 supra). No obstante, dos virus recombinantes derivados de la cepa Brescia del CSFV diferentes que contienen mutaciones en E1 (Risatti et al. 2005b, supra) y E2 (Risatti et al. 2005a, supra) mostraron una reducción en el fenotipo del tamaño de la placa en células renales porcinas cultivadas y se atenuaron en cerdos. En resumen, se ha identificado un nuevo determinante de virulencia genético del CSFV relacionado con la glicoproteina E2. Si bien aún se desconoce el mecanismo que produce la atenuación, cabe destacar que la pérdida gradual de reactividad con el mAb WH303 se correlacionó con una pérdida de la virulencia in vivo, lo que provocó la atenuación final del CSFV; esto sugiere un vínculo entre la falta de la secuencia del epítopo y la incapacidad de inducir enfermedad por otros pestivirus (BVDV y BDV) en cerdos. La mejora de la comprensión del fundamento genético de la virulencia del CSFV permitirá el desarrollo racional de vacunas atenuadas vivas contra la CSF con una mejora en la seguridad, la eficacia y la utilidad. Además, en el caso particular de los virus T4v y T5v, la falta de reactividad con el mAb WH303, que reconoce un epítopo del CSFV altamente específico y conservado, plantea el posible uso de esos mutantes virales como vacuna marcadora atenuada.

EJEMPLOS Habiendo descrito en forma general esta invención, se comprenderá mejor lo explicado mencionando algunos ejemplos específicos, que se incluyen en la presente únicamente para ilustrar mejor la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones.

EJEMPLO 1 Virus y cultivos celulares Se cultivaron células renales porcinas (SK6) (29) sin BVDV en medio mínimo esencial de Dulbecco (Dulbecco's mínimal essential médium, DMEM) (Gibco, Grand Island, NY) con suero fetal bovino (fetal calf serum, FCS) al 10% (Atlas Biologicals, Fort Collins, CO).

Se propagó la cepa Brescia del CSFV en células SK6 y se utilizó para la elaboración de un clon infeccioso de ADNc (17). Se realizó la titulación del CSFV de muestras clínicas utilizando células SK6 en placas de 96 cavidades (Costar, Cambridge, MA). Después de 4 días en cultivo, se detectó infectividad viral mediante determinación con inmunoperoxidasa utilizando los anticuerpos monoclonales del CSFV WH303 o WH308 (1) y el kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Buringames, CA) (25). Se calcularon los títulos utilizando el método de Reed y Muench (14) y se expresaron como TCID50/ml. Como se realizó, la sensibilidad de la prueba fue >1,8 TCID50/ml.

EJEMPLO 2 Elaboración de clones infecciosos del CSFV T1 - T5 Se utilizó un clon infeccioso (infectious clone, IC) de longitud completa del aislado Brescia virulento (pBIC) (17) como molde en el cual se mutaron seis residuos del epítopo del WH303 (TAVSPTTLR; SEC ID NO. 1) entre los residuos 829 y 837 de la E2 para reflejar los residuos homólogos presentes en el aislado NADL del BVDV (TSFNMDTLA; SEC ID NO.2) (Lin et al., supra). Las mutaciones se agregaron progresivamente y se produjeron cinco IC para rescatar los siguientes mutantes virales: T1v (TSFSPTTLR; SEC ID NO. 3), T2v (TSFNPTTLR; SEC ID NO. 4), T3v (TSFNMTTLR; SEC ID NO. 5), T4v (TSFNMDTLR; SEC ID NO. 6) y T5v (TSFNMDTLA; SEC ID NO. 7) (Fig. 1). Se introdujeron mutaciones mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL (Stratagene, Cedar Creek, TX). Esto se realizó según las indicaciones del fabricante, y utilizando los cebadores y los plásmidos objetivo que se describen en el Cuadro 1.

Cuadro 1. Iniciadores utilizados para elaborar los virus T1 *Únicamente se proporcionan secuencias de iniciadores directos. Los iniciadores inversos corresponden a la secuencia complementaria.

Se transcribió el ARN infeccioso in vitro a partir de IC infeccioso de longitud completa de la cepa Brescia del CSFV o los mutantes T1 a T5 y se utilizó para transfectar las células SK6 (Fig. 1A). El día 4 después de la transfección, se rescató el virus de las células transfectadas . Las secuencias de nucleótidos de los genomas de los virus rescatados fueron idénticas a los plásmidos de ADN parental, lo que confirma que únicamente las mutaciones en la ubicación que codifica el epítopo del WH303 se reflejaron en T1v-T5v.

EJEMPLO 3 Rescate in vitro de la cepa Brescia del CSFV y virus mutantes T1 - T5v Se linearizaron clones infecciosos genómicos de longitud completa con Srñ y se transcribieron in vitro utilizando el sistema T7 Megascript (Ambion, Austin, TX). Se precipitaron los productos del ARN con LiCI y se transfectaron a células SK6 mediante electroporación a 500 voltios, 720 ohmios, 100 vatios con un electroporador BTX 630 (BTX, San Diego, CA). Las células se colocaron en placas de 12 pocilios y en matraces de 25 cm2, y se incubaron durante 4 días a una temperatura de 37°C y en una atmósfera de C02 al 5%. Se detectó el virus mediante tinción con inmunoperoxidasa utilizando un anticuerpo monoclonal específico (WH308) contra la E2 del CSFV. Las soluciones de virus rescatados se almacenaron a una temperatura de -70°C. Se verificó la exactitud de las mutaciones introducidas mediante la secuenciacion del gen de la E2 de los virus mutados.

EJEMPLO 4 Análisis in vitro e in vivo de T1v-T5v Se evaluaron las características de crecimiento in vitro de T1v-T5v en relación con el pBICv parental en una curva de crecimiento de múltiples pasos (Fig. 2A). Se infectaron cultivos de células SK6 con una multiplicidad de infección (MOI) de 0,01 TCID50 por célula. Se adsorbió el virus durante 1 h (tiempo cero), y se recolectaron las muestras en puntos en el tiempo posteriores a la infección durante 72 h. Mientras los mutantes T1v, T2v y T3 mostraron características de crecimiento que prácticamente no pueden distinguirse de las del pBICv, los mutantes T4 y T5v mostraron una disminución de 10 veces en la producción de virus final. Los mutantes T4v y T5v también mostraron una reducción de entre el 80 y el 90% en el tamaño de la placa en relación con BICv, T1v, T2v y T3v (Fig. 2B). Por último, mientras que la reactividad inmunocitoquímica con el MAb WH303 fue equivalente para T1v, T2v y pBICv, la reactividad se perdió parcialmente en T3v y se suprimió por completo en las células infectadas con T4v y T5v (Fig. 2B). Estos resultados indican que las mutaciones del epítopo del WH303, que afectan la capacidad del CSFV para replicarse in Vitro, tienen un efecto similar en la reactividad del WH303. A fin de examinar el efecto de la mutación progresiva del epítopo del WH303 en la virulencia del CSFV en cerdos, se compararon los fenotipos de virulencia de los mutantes T1v-T5v con los virus BICv de tipo salvaje en 6 grupos de cerdos Yorkshire que fueron inoculados por vía intranasal con 105 TCID50 de virus y fueron monitoreados para detectar la presencia de enfermedad clínica. Los resultados de este experimento se muestran en el Cuadro 2 y en las Figuras 3-5. Se confirmaron la identidad y la estabilidad de las mutaciones del epítopo del WH303 a través del análisis de la secuencia de nucleótídos de los virus recuperados de las amígdalas de animales infectados por T1v-T5v a los 6 DPI (no se muestran los datos) .

Cuadro 2. Supervivencia de los cerdos y respuesta de' fiebre después de la infección por T1 - T5v o BICv Tiempo medio Tiempo medio de Tiempo medio hasta el comienzo duración de la Temp. diaria Sobrevivientes/ hasta la muerte de la fiebre fiebre máx. prom.

Virus Total Días (SD) Días (SD) Días (SD) (SD) T1v 0/2 8,5(2,1) 3,0(1,4) 4,5 (2,1) 107,2(0,0) T2v 0/2 14,5 (2,1) 4,5(0,7) 9,5(0,7) 106,6(1,7) .

T3v 0/2 19,0 (0,0) 5,0 (0,0) 6,0 (1,4) 105,7(1,6) T4v 4/4 - 5,0 (0,0) 2,5 (2,1)* 106,2 (0,6) T5v 6/6" - - - 104,8 (0,6) BICV 0/2" 12,5 (2,1) 4,5 (0,7) 4,5 (0,7) 105,8 (0,3) * Dos de cuatro animales experimentaron fiebre. # Incluye animales utilizados en estudios de protección.

Mientras que el BICv, como se previo, fue altamente patógeno, indujo fiebre en forma efectiva, produjo signos clínicos y la muerte en los cerdos, los mutantes T1v-T5v parecieron presentar fenotipos de virulencia que estaban cada vez más atenuados (Cuadro 2, Figura 3). El T1v y el T2v también fueron altamente patógenos, indujeron fiebre y provocaron la muerte en cerdos en forma similar al BICv (Cuadro 2); no obstante, el T2v mostró un ligero retraso en los puntajes clínicos en relación con el BICv (Cuadro 3). El T3v indujo enfermedad mortal, pero con un retraso en la cinética, en relación con el BICv, dado que la muerte se produjo entre 4 y 8 días más tarde (Cuadro 2). Cabe destacar que el T4v y el T5v no provocaron enfermedad mortal, el T4v indujo únicamente fiebre leve y transitoria, y el T5v prácticamente no provocó enfermedad clínica (Cuadro 2, Figura 3). En forma similar, la infección por BICv, T1v, T2v y T3v provocó a los 6 DPI una reducción drástica en los recuentos de glóbulos blancos (white blood ce 11 , WBC) y plaquetas, que permanecieron bajos hasta el momento de la muerte, mientras que la infección por T4v y T5v indujo un efecto transitorio mucho menos pronunciado (Fig. 4).

Cuadro 3. Títulos o titulaciones1 de virus en muestras y tejidos clínicos después de la infección por T5v o BICv.

Virus BICv T5v DPI' 2 4 6 8 14 2 4 6 8 14 Hisopado nasal NegJ 1,97 Neg Neg Neg Neg Neg 1,97 4,63 3,97 Raspajes de Neg Neg 2,63 Neg Neg Neg Neg 1,97 4,97 2,97 las amígdalas Sangre Neg D4 2,97 3,97 Neg Neg 3,13 6,47 6,30 6,80 Amígdala 2,13 2,97 3,30 1,97 2,80 1,97 4,63 5,13 5,47 6,13 Ganglio linfático 2,80 3,30 3,63 2,47 3,30 1,80 2,80 4,80 5,80 5,97 mandibular Bazo Neg 2,97 2,63 3,47 2,80 Neg 2,13 2,80 5,63 6,30 Riñón Neg 2,47 2,97 3,13 2,13 Neg Neg 2,80 4,80 5,97 1 Títulos o titulaciones expresados como TCID50/ml 2 DPI, días después de la infección 3 Neg: < 1.80 TCID50/ml 4 ND: No Determinado La atenuación de T1v-T5v también se vio reflejada en la viremia y la eliminación del virus. Mientras T1v y T2v indujeron títulos virémicos similares a los inducidos por BICv, los títulos de T3v disminuyeron entre 101 y 102 log10, y el T4v y el T5v indujeron títulos entre 103 y 105 log10 más bajos que los títulos de BICv en puntos en el tiempo similares después de la infección (Fig. 5A). Se observó un patrón similar para los títulos de los virus de hisopados nasales y raspajes de las amígdalas (Fig. 5B y C, respectivamente), con una reducción en los títulos de T3v, T4v y T5v por debajo de los niveles detectables en DPI posteriores. A fin de realizar un estudio más detallado de la patogénesis del T5v, los animales infectados por T5v y BICv fueron sometidos a eutanasia a los 2, 4, 6, 8 y 14 DPI (un animal/punto en el tiempo/grupo) y se determinaron los títulos de los virus para las muestras de tejido de las amígdalas, el ganglio linfático submandibular, el bazo, de sangre y de tejido renal, y para las muestras de hisopado nasal y raspajes de las amígdalas (Cuadro 3). El T5v mostró niveles significativamente más bajos de replicacion del virus en las amígdalas (aproximadamente entre 102 y 104 log 0) en relación con BICv. Se observaron diferencias similares entre el T5v y el BICv en los títulos de virus del ganglio linfático mandibular con drenaje regional, del bazo y del riñon (Cuadro 3). Estos resultados indican que un aumento en la cantidad de mutaciones dentro del epítopo del WH303 de la E2 del CSFV tuvo un efecto aditivo en la atenuación del virus para los cerdos, con mutaciones presentes en T4v y T5v, lo que produce una disminución significativa de la virulencia del virus. Asimismo, la infección por T5v se caracteriza por una enfermedad clínica muy leve y transitoria, una disminución en la replicacion viral en las amígdalas y los tejidos objetivo, y una reducción notable de la eliminación del virus.

EJEMPLO 5 Secuenciación y Análisis del ADN A través del método de terminación con cadena de didesoxinucleótidos, se secuenciaron completamente con iniciadores específicos del CSFV clones infecciosos de longitud completa, virus rescatados in vitro y virus recuperados de animales infectados (Sanger et al. 1977. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467). Se prepararon las reacciones de secuenciación con el kit de secuenciación Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer, Boston, MA). Los productos de reacción se secuenciaron en un secuenciador automático de ADN PRISM 3730x1 (PE Biosystems, Foster City, CA). Se ensamblaron los datos de la secuencia utilizando el software Phrap (www.phrap.org) y se realizaron ensambles confirmatorios utilizando CAP3. La secuencia de ADN final consensuada representó, en promedio, una redundancia de cinco veces en la posición de cada base. Se realizaron comparaciones de las secuencias utilizando BioEdit.

EJEMPLO 6 Infecciones en Animales Cada uno de los mutantes T1v-T5v se analizó inicialmente para determinar su fenotipo de virulencia en cerdos en relación con el virus Brescia virulento. Todos los cerdos que se utilizaron en los estudios con animales tenían entre 10 y 12 semanas de vida, eran cerdos de cuarenta libras inoculados por vía intranasal con 105 TCID50 del virus muíante o del virus de tipo salvaje. Para el análisis, se asignaron en forma aleatoria 12 cerdos en 6 grupos de 2 animales cada uno, y se inocularon los cerdos de cada grupo con uno de los mutantes T1v-T5v o con pBICv. Se observaron los signos clínicos (anorexia, depresión, fiebre, coloración púrpura de la piel, marcha vacilante, diarrea y tos) en forma diaria durante todo el experimento y se otorgaron puntajes como se describió previamente con las modificaciones. Para evaluar el efecto de las mutaciones del T5v en la eliminación del virus y la distribución en diferentes órganos durante la infección, se asignaron en forma aleatoria 10 cerdos en 2 grupos de 5 animales cada uno y fueron inoculados con T5v o pBICv. Se sacrificó un cerdo por grupo a los 2, 4, 6, 8 y 14 DPI. Se obtuvieron muestras de sangre, hisopados nasales y raspajes de las amígdalas de los cerdos en el momento de la autopsia. Las muestras de tejido (amígdalas, ganglio linfático mandibular, bazo y riñon) se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para realizar la titulación de los virus. Para los estudios de protección, se asignaron al azar 12 cerdos en 3 grupos de 4 animales cada uno. Los cerdos en los grupos 1 y 2 fueron inoculados con T5v, los animales en el grupo 3 fueron infectados con vacuna falsa. A los .3 DPI (grupo 1) o 21 DPI (grupo 2), los animales fueron provocados con el BICv junto con los animales del grupo 3. Se registraron en forma diaria los signos clínicos y la temperatura corporal durante todo el experimento como se describió anteriormente. Se recolectaron muestras de sangre, suero, hisopados nasales y raspajes de las amígdalas en ciertos puntos en el tiempo después de la provocación, la sangre se obtuvo de la vena cava anterior en tubos que contenían EDTA (Vacutainer) para realizar los recuentos totales y diferenciales de glóbulos blancos. Se obtuvieron los recuentos totales y diferenciales de glóbulos blancos y plaquetas utilizando un equipo Beckman Coulter ACT (Beckman, Coulter, CA).

EJEMPLO 7 Infección por T5v Protege a los Cerdos Contra la Provocación con el BICv Patogénico Se evaluó la capacidad del T5v para inducir la protección contra la provocación con el BICv. Los cerdos vacunados con T5v fueron provocados a los 3 ó 21 DPI con 105 TCID50 de BICv patógeno. Los cerdos de control a los que se les administró una vacuna falsa y no recibieron T5v experimentaron anorexia, depresión y fiebre a los 4 días después de la provocación (days post challenge, DPC) con BICv, experimentaron una reducción marcada de los leucocitos y las plaquetas circulantes a los 7 DPC, y murieron o estaban moribundos y fueron sometidos a eutanasia a los 12 DPC (Cuadro 4 y Fig. 6).

Cuadro 4. Supervivencia de los cerdos y respuesta de fiebre de los animales infectados por T5 después de la provocación con BICv. 1 Días después de la infección por T5 2 Dos de cuatro animales experimentaron fiebre 3 Control: los animales recibieron una vacuna fals Cabe destacar que el T5v indujo la protección completa contra la enfermedad clínica inducida por el BICv a los 3 DPI. Todos los cerdos sobrevivieron a la infección y permanecieron normales desde el punto de vista clínico, y únicamente dos animales presentaron fiebre transitoria a los 4 DPC (Cuadro 4) y no presentaron cambios significativos en los valores hematológicos (Fig. 6). En forma similar, los cerdos provocados a los 21 días después de la infección por T5v permanecieron normales desde el punto de vista clínico (Cuadro 4).

También se examinaron la viremia y la eliminación del virus de provocación BICv, según se detectaron específicamente con mAb WH303, a los 4, 6, 8, 14 y 21 DPC (no se muestran los datos). Como se previo, en los animales de control que recibieron la vacuna falsa se observó viremia del BICv a los 5 DPC, con títulos del virus que permanecieron altos (108 TCID50/ml a los 8 DPC) hasta la muerte, y se realizó la titulación del BICv de los hisopados nasales y los raspajes de las amígdalas a los 4 DPC, estos alcanzaron títulos de 104- 105 TCIDso/ml a los 8 DPC. En contraposición, el BICv estuvo ausente en todas las muestras clínicas (sangre, hisopados nasales o raspajes de las amígdalas) de los cerdos vacunados con T5v después de la provocación. Estos resultados indican que el T5v puede inducir rápidamente una protección completa contra la provocación con el CSFV mortal, y que los cerdos inmunizados con T5v no mostraron viremia ni eliminación detectables del virus de provocación. Por ello, el T5v puede inducir en animales vacunados en forma experimental una protección completa contra la presencia de la enfermedad clínica y la replicacion del virus de provocación cuando se lo provoca con el virus Brescia parental virulento a los 3 o a los 28 días después de la vacunación con T5. Todas las publicaciones y patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia en la misma forma en que si se indicara en forma específica e individual que cada publicación o patente individual se incorpora por referencia. La descripción precedente y ciertas condiciones y detalles representativos de la invención se han presentado con fines ilustrativos y descriptivos de la invención. No pretende ser completa ni limitar la invención a las formas precisas divulgadas. Será evidente para los especialistas en la materia que pueden derivarse de la presente modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un virus clásico de fiebre porcina (CSFV) recombinante que comprende ADN que codifica una glicoproteina E2 del CSFV modificada.

2. Un virus clásico de fiebre porcina recombinante que comprende ADN que codifica la glicoproteina E2 del CSFV que ha sido modificada a través de la mutación progresiva de una porción del gen de la E2 de la cepa Brescia altamente patogénica para que se asemeje parcialmente al gen de la E2 homólogo del BVDV, una modificación que produce la atenuación del CSFV.

3. Un virus clásico de fiebre porcina recombinante que comprende ADN que codifica la glicoproteina E2 del CSFV que ha sido modificada a través de la mutación progresiva de una región del gen de la E2 de la cepa Brescia altamente patogénica, en donde dicha región codifica los aminoácidos 829-837 de la glicoproteina E2 del CSFV, y a través de los cuales las mutaciones progresivas en dicho ADN provocan un cambio de entre uno y seis aminoácidos característicos de la glicoproteina E2 del CSFV a entre uno y seis aminoácidos característicos de la región homologa de la glicoproteina E2 del BVDV, una modificación que produce la atenuación del CSFV.

4. Un virus clásico de fiebre porcina recombinante que comprende ADN que codifica la glicoproteina E2 del CSFV mutada que tiene la secuencia TSFNMDTLR (SEC ID NO: 6), una modificación que produce la atenuación del CSFV.

5. Un virus clásico de fiebre porcina recombinante que comprende ADN que codifica la glicoproteina E2 del CSFV mutada que tiene la secuencia TSFNMDTLA (SEC ID NO: 7), una modificación que produce la atenuación del CSFV.

6. Una vacuna atenuada viva contra la CSF diseñada en forma racional que comprende un virus clásico de fiebre porcina recombinante, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

7. Una vacuna atenuada viva contra la CSF diseñada en forma racional que comprende un virus clásico de fiebre porcina recombinante, de acuerdo con la reivindicación 4.

8. Una vacuna atenuada viva contra la CSF diseñada en forma racional que comprende un virus clásico de fiebre porcina recombinante, de acuerdo con la reivindicación 5.

9. Un método para inmunizar a un animal contra la CSF, que comprende la administración a dicho animal de una vacuna que comprende un virus clásico de fiebre porcina recombinante, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

10. Un método para proteger a un animal contra la CSF, que comprende la administración a dicho animal de una cantidad de la vacuna de la reivindicación 8 efectiva para proteger a dicho animal contra la CSF clínica.

11. Un método para distinguir a los animales infectados por el CSFV de los animales vacunados con la vacuna atenuada viva contra la CSF diseñada en forma racional de la reivindicación 8, que comprende el análisis del suero de un animal en evaluación en un ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (Enzyme Linked-lmmuno-Sorbent Assay, ELISA) competitivo para determinar si dicho suero inhibe la unión del mAb 303.

12. Un método para distinguir a los animales infectados por el CSFV de los animales vacunados con la vacuna atenuada viva contra la CSF diseñada en forma racional de la reivindicación 7, que comprende el análisis del suero de un animal en evaluación en un ELISA competitivo para determinar si dicho suero inhibe la unión del mAb 303.

13. Una estrategia para la producción de un virus clásico de fiebre porcina recombinante atenuado que comprende: (a) la identificación de un determinante de virulencia en la cepa Brescia altamente patogénica; (b) la identificación de un determinante homólogo de virulencia en un virus relacionado, dicho virus no es patogénico en cerdos; (c) la mutación progresiva y secuencial del ADN que codifica dicho determinante de virulencia, a través de la cual las mutaciones progresivas en dicho ADN producen un cambio de los aminoácidos característicos del determinante de virulencia del CSFV a los aminoácidos característicos del determinante de virulencia homólogo; y (d) lograr la atenuación del CSFV.

14. La estrategia de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el virus relacionado es BVDV o BDV.

15. Un método para la producción de un virus clásico de fiebre porcina recombinante atenuado que comprende ADN que codifica una glicoproteína E2 del CSFV modificada, que comprende: (a) la mutación progresiva de una región del gen de la E2 de la cepa Brescia altamente patogénica, en donde dicha región codifica los aminoácidos 829-837 de la glicoproteína E2 del CSFV, y a través de la cual las mutaciones progresivas en dicho ADN provocan un cambio de entre uno y seis aminoácidos característicos de la glicoproteína E2 del CSFV a entre uno y seis aminoácidos característicos de la región homologa de la glicoproteína E2 del BVDV; y (b) lograr la atenuación del CSFV como resultado de dicha modificación.