KR20090025291A - 돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자 - Google Patents

돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자 Download PDF

Info

Publication number
KR20090025291A
KR20090025291A KR1020087031827A KR20087031827A KR20090025291A KR 20090025291 A KR20090025291 A KR 20090025291A KR 1020087031827 A KR1020087031827 A KR 1020087031827A KR 20087031827 A KR20087031827 A KR 20087031827A KR 20090025291 A KR20090025291 A KR 20090025291A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
virus
swine
csfv
cholera virus
glycoprotein
Prior art date
Application number
KR1020087031827A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101432840B1 (ko
Inventor
메뉴얼 브이 보르카
길레르머 알. 리사티
Original Assignee
더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬춰
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬춰 filed Critical 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러테리 오브 애그리컬춰
Publication of KR20090025291A publication Critical patent/KR20090025291A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101432840B1 publication Critical patent/KR101432840B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24311—Pestivirus, e.g. bovine viral diarrhea virus
    • C12N2770/24361—Methods of inactivation or attenuation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

돼지 콜레라 바이러스(CSFV) E2 당단백은 돼지에서 중화 항체 및 보호적 면역성의 주요 유도자이다. E2는 목적 세포에서의 바이러스 흡착을 매개하고, 바이러스 병원성과 관련된 유전적 결정 인자를 함유한다. CSFV E2는 또한 관련된 페스티바이러스들인 소 바이러스성 설사증 바이러스(BVDV) 및 보더병 바이러스(BDV)로부터 CSFV를 차별화하기 위해 사용되는 모노클로날 항체(mAb) WH303에 의해 인식되는, 잔기 829 내지 837 사이의 구별되는 에피토프(TAVSPTTLR)를 포함한다. 본 연구에서는, CSFV E2의 mAb WH303 에피토프를 BVDV 균주 NADL E2의 상동적 아미노산 서열(TSFNMDTLA)로 점진적으로 돌연변이시키기 위하여 병원성 브레시아 분리주(BICv)의 CSFV 감염성 클론을 사용하였다. 수득된 바이러스 돌연변이체 T1v(TSFSPTTLR), T2v(TSFNPTTLR), T3v(TSFNMTTLR)은 모체 BICv의 그것과 유사한 시험관내 성장 특성을 나타낸 반면, 돌연변이체 T4v(TSFNMDTLR) 및 T5v(TSFNMDTLA)는 모체 BICv와 비교시 바이러스 수율에서 10배의 감소 및 플라크 크기에서 유의적인 감소를 나타내었다. WH303과의 면역세포화학적 반응성은 T3v, T4v 및 T5v에서만 소실되었다. 흥미롭게도, WH303 에피토프의 점진적 돌연변이는 돼지에서 바이러스 약독화에 부가적인 영향을 나타냈는데, 돌연변이체 T1v, T2v 또는 T3v는 점진적으로 약하지만 변함없이 치명적인 CSF를 유도하였고, T4v는 단지 경미하고 일시적인 임상적 질환을 유도하였으며, T5v는 질환을 유도하지 않았다. T4v 또는 T5v로 감염된 돼지는 편도, 배수 림프절, 비장 및 신장에서의 감소된 바이러스 복제, 및 바 이러스 배출의 유의적 감소를 나타내었다. 결국, T5v로 감염된 동물은 T5v 접종후 3일 또는 21일째 병원성 브레시아 바이러스로 면역성 테스트시 임상적 질환으로부터 보호되었다. 이러한 결과는 E2의 아미노산 잔기 830 내지 834가 돼지에서 CSFV의 병원성에 결정적이고 이러한 유전자 위치에서의 엔지니어링이 합리적으로 디자인된 생균 약독화 CSF 백신을 위한 기초를 제공할 수 있다는 것을 가리킨다.

Description

돼지 콜레라 바이러스의 Ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자{ NOVEL VIRULENCE DETERMINANT WITHIN THE E2 STRUCTURAL GLYCOPROTEIN OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS}
본 발명은 E2 구조 당단백질 내의 신규한 돼지 콜레라 바이러스(Classical Swine Fever Virus, CSFV) 병원성 결정인자의 분리 및 특성화와 생균 약독화 CSF 백신의 디자인을 위한 이들 신규 병원성 결정인자의 이용에 관한 것이다.
돼지 콜레라(CSF)는 본질상 급성 또는 만성일 수 있는 돼지의 고도의 전염성 질환이다(van Oirschot, J.T. 1986. In: Diseases of Swine, 6th edition, Leman et al., eds., Iowa State University Press, Ames, Iowa, page 289). 병인학적 인자인 CSF 바이러스(CSFV)는 양성, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는 소형 피막 바이러스로서, 소 바이러스성 설사증 바이러스(BVDV) 및 보더병 바이러스(BDV)와 함께, 플라비리대(Flaviridae)과의 페스티바이러스(Pestivirus)속의 하나로서 분류된다(Hulst et al. 2001. J. Virol. 75: 9585-9595). 12.5 kb의 CSFV 게놈은 4000개의 아미노산 다단백을 암호화하고, 결국 세포질 및 바이러스 단백질분해효소에 의한 다단백의 공- 및 후-번역 조작을 통하여 11 내지 12개의 최종 절단 산물(NH2-Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH)을 생성하는, 단일 개방 리딩 프레임을 포함한다(Rice, C.M. 1996. In: Fundamental Virology, 3rd edition, Fields and Howley, eds., Lippincott Raven, Philadelphia, pp. 931-959).
병원성 및 숙주 범위 표현형은 CSFV 분리주 및 페스티바이러스에 따라서 다양하다. 고도의 병원성인 CSFV 균주로 감염되면 감염된 동물을 치사시키는 반면, 중등도 내지 낮은 병원성의 분리주는 장기간의 만성 질환을 유도한다(상기 van Oirschot의 문헌). 또한, 각각 소(bovine) 및 양(ovine)과에서 질환의 병인학적 인자들인 BVDV 및 BDV도 임상적 질환을 유도하지 않고 돼지를 감염시킬 수 있다(상기 van Oirschot의 문헌). 병원성 표현형, BVDV, 및 BDV를 구별하는 CSFV로부터 유래하는 게놈 서열의 이용가능성에도 불구하고, 야생의 숙주에서 CSFV 병원성의 유전적 근거는 잘 이해되지 않은 상태이다(상기 van Oirschot의 문헌). 역유전학적 방법(reverse genetics)의 사용으로 생균 약독화 CSF 백신 후보의 개발을 촉진하는 병원성의 바이러스성 결정 인자 동정이 가능해졌다(Mayer et al. 2004. Vaccine 22: 317-328; Meyers et al. 1999. J. Virol. 73: 10224-10235; Moorman et al. 1996. J. Virol. 70: 763-770; Moser et al. 2001. Virus Genes 23: 63-68; Risatti et al. 2005a. J. Virol. 79: 3787-3796; Risatti et al. 2005b. Virology 343: 116-117; Ruggli et al. 1996. J. Virol. 70: 3478-3487; Tratschin et al. 1998. J. Virol. 72: 7681-7684; van Gennip et al. 2000. Vaccine 19:447-459).
캡시드 단백, 및 당단백 Erns, E1 및 E2는 CSFV 비리온의 구조적 성분들로서, E1 및 E2는 이들의 카복실 말단들에 의하여 피막에 고정되고, Erns는 바이러스 피막에 느슨하게 결합된다(Thiel et al. 1991. J. Virol. 65: 4705-4712; Weiland et al. 1990. J. Virol. 64: 3563-3569; Weiland et al. 1999. J. Gen. Virol. 80: 1157-1165). 3가지 당단백 모두가 CSFV 병원성과 관련되어 있다(상기 Meyers의 문헌; 상기 Risatti et al.의 문헌, 2005a, b).
E2 유전자의 부분적 또는 완전 결실을 포함하는 바이러스 돌연변이(mutant)가 생존 불가능한 것으로 밝혀졌기 때문에, E2 당단백은 CSFV 복제에 필수적인 것으로 간주된다(van Gennip et al. 2002. Vaccine 20: 1544-1556). Erns(상기 Mayer et al.의 문헌) 및 E1(Wang et al. 2004. Virology 330: 332-341)과 함께, E2는 숙주 세포로의 바이러스 흡착에 관련되어 있다; 사실, 키메릭 페스티바이러스는 감염성 및 E2 유전자 공여자의 그것과 일치하는 세포 친화성(cell tropism) 표현형을 나타낸다(상기 van Gennip et al.의 문헌, 2000, 2002). 중화 항체 및 치사량 면역성 테스트에 대한 보호를 유도하는, CSFV 당단백들 중에서 E2는 가장 면역성이 강하다(Konig et al. 1995. J. Virol. 69: 6479-6486; 상기 Weiland et al.의 문헌, 1990). CSFV E2도 잔기 829 및 837 사이에, BVDV 또는 BDV E2와의 반응에 실패하고 CSF 진단을 위하여 통상적으로 사용되는 반응 시약인, 모노클로날 항체(mAb) WH303(Lin et al. 2000. J. Virol. 74: 11619-11625)에 의하여 인식되는 에피토프를 포함한다.
본원에서는, 돼지에서 바이러스 병원성의 부가적 효과 및 6개의 아미노산 변화후의 완전한 약독화(attenuation)를 밝히면서, CSFV E2의 WH303 에피토프 내의 돌연변이, 병원성 브레시아(Brescia) CSFV의 아미노산 서열을 BVDV 균주 NADL의 상 동적인 아미노산 서열로 점진적으로 변화시키는 돌연변이의 영향을 보고한다. 이러한 약독화 바이러스는 생균 약독화 CSF 백신의 합리적인 디자인을 가능하게 한다. 백신 투여 3일 및 21일 후에 병원성 브레시아 바이러스로 면역성 테스트(challenge)하였을 때, 바이러스 돌연변이체로 감염시킨 동물은 보호되었다. WH303 에피토프 내에서 이러한 부위의 변형은 감염된 동물로부터 백신이 접종된 동물을 구별하는 진단적 테스트의 개발을 가능하게 한다.
발명의 요약
본원에서는, E2 당단백 내의 신규 CSFV 병원성 결정 인자를 동정하였다.
이러한 발견에 따라서, 본 발명의 목적은 변형된 CSFV E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 돼지 콜레라 바이러스(CSFV)를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 고도의 병원성 균주 브레시아의 E2 유전자 일부를 점진적으로 돌연변이시켜서, BVDV로부터 유래된 상동적 E2 유전자의 WH303 에피토프 서열에 보다 근접하게 닮은 돌연변이된 E2 바이러스(즉, CSFV의 약독화를 야기하는 변형)를 야기함으로써 변형된, CSFV E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 돼지 콜레라 바이러스(CSFV)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 변형된 CSFV E2 당단백을 포함하는 생존가능한 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 면역성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CSF의 중증도를 경감시키는 합리적으로 디자인된 생균 약독화 CSFV 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 병원성 브레시아 CSFV로 면역성 테스트하였을 때, 임상적 CSF 질환으로부터 동물을 보호하는데 효과적인, 합리적으로 디자인된 생균 약독화 CSFV 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 백신이 접종된 동물과 CSFV에 감염된 동물 사이의 혈청학적 구별을 허용하는 마커 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유효량의 합리적으로 디자인된 생균 약독화 CSFV 백신을 투여함으로써 CSF로부터 동물을 보호하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 잇점은 이후의 기재로부터 쉽게 명백해질 것이다.
본 발명의 상세한 설명
CSFV 발병의 경우 질병 조절 전략의 개발은 예컨대, 보호의 기간보다 백신 성능의 더욱 중요한 변수가 되는, 보호의 빠른 시작을 요구한다. 이러한 백신의 개발은 합리적으로 디자인된 생균 약독화 백신 CSFV 균주의 생산을 내포할 것이다.
페스티바이러스 병원성의 유전적 근거 및 분자 매커니즘 여전히 명확하지 않다. CSFV의 경우, 상이한 보고에 바이러스 단백질 또는 특정 유전 영역과 병원성 간의 관련성이 기재되었다. CSFV 균주 알포트(Alfort) Erns 당단백의 RNA 분해효소 활성을 없애는 단일 또는 이중 코돈 돌연변이가 돼지에서 바이러스를 약독화시켰다(상기 Meyers et al.의 문헌). 또한, BVDV Erns 당단백의 RNA 분해효소 도메인을 돌연변이시킴으로써 유사한 결과가 관찰되었다(Meyers et al., 2002, J. Virol. 76: 8494-8503). 보다 최근에는, CSFV 병원성 균주 알포트/187 및 이스트럽(Eystrup)으로부터 Npro를 결실시킴으로써 돼지에서 약독화된 바이러스를 가져오는 것으로 나타났다(상기 Mayer et al.의 문헌). Erns에서의 3개 아미노산 치환과 관련된, CSFV E2 당단백에서 아미노산 치환은 돼지에서 병원성을 감소시켰다(van Gennip et al., 2004, J. Virol . 78: 8812-8823). 추가적으로, CSFV 균주 브레시아의 E1 유전자 내로 19개 아미노산을 프레임 내 삽입(in frame insertion)시키면, 생체내에서 약독화를 가져왔다(상기 Resatti et al.의 문헌, 2005b). 또한, CSFV E2는 병원성과 관련되어 있다. CSFV 균주 브레시아의 E2 유전자를 백신 균주 CS로부터 유래한 E2 유전자로 대체하여, 유의적인 생체내 약독화를 나타내는 키메릭 바이러스를 얻었다(상기 Risatti et al.의 문헌, 2005a). 브레시아 E2 단백질 서열과 비교하여 CS 백신 바이러스 E2 단백질의 22개 아미노산 치환중 어느 것도 mAb WH303 에피토프에 영향을 미치지 않는다. 브레시아, CS 및 키메라의 3개 바이러스 모두 mAb 303과 강력하게 반응하여, CSFV 약독화와 관련된 또 다른 유전적 결정 인자의 존재를 제시한다.
본원에서, 고도 병원성 CSFV 균주 브레시아의 E2 당단백에서 mAb WH303 에피토프내로 도입된 돌연변이가 바이러스의 약독화를 초래한다는 것을 나타낸다. BVDV 균주 NADL E2 당단백에서 동일 위치에서 발견되는 잔기들(TSFNMDTLA; 서열번호: 2)과 유사하도록, 점진적인 변화가 CSFV 브레시아 WH303 에피토프(TAVSPTTLR; 서열번호: 1)로 도입된다. 흥미롭게도, mAb WH303과의 반응성이 결여되어 있는 TSFNMDTLR(T4v) 또는 TSFNMDTLA(T5v)는 작은 플라크(plaque) 형상을 나타내고, 생체내에서 유의적으로 약독화된다. BICv에 의해 유도되는 급성의 치명적 질환과 달리, T4v 및 T5v 감염은 무증상이고, 목적 기관에서 바이러스 복제의 감소 및 바이러스 배출(virus shedding)의 감소를 특징으로 한다.
주요 면역결정성(immunodominant) 에피토프로서 WH303의 관련성은 최근에 파지-디스플레이된 무작위 펩티드 라이브러리를 이용하여 CSFV E2 및 Erns에 대한 모노클로날 중화 항체를 특성화하는 동안 관찰되었다(Zhang et al., 2006, Archives of Virology 151(1): 37-54). 이들 모노클로날 항체는 또한 WH303 에피토프로 맵핑되는(SPTTL) 공통된 모티프 SPTxL에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 나아가, WH303 에피토프를 포함하고 20 내지 25개 아미노산 길이 범위의 6개의 중복되는 펩티드로 이루어지는 다중 펩티드-백신이 CSFV에 대한 면역성을 유도하였다(Dong et al., 2005. Vaccine 23: 3630-3633).
돼지에서 T5v의 약독화는 생각할 수 있는 바로는 바이러스의 부착 및/또는 생체내 결정적인 목적 세포 내로의 효율적인 진입의 일부 측면과 관련될 수 있었다. Erns, E1 및 E2는 CSFV 비리온 피막에 있는 구조적 당단백들이다(상기 Thiel et al.의 문헌). 피막에 고정되어 있는 E2는 이황화 브릿지에 의해 연결된 동종 및 이종이합체 모두로 보이며(상기 Thiel et al.의 문헌; 상기 Weiland et al.의 문헌, 1990, 1999), Erns(Hulst et al., 1997, J. Gen . Virol . 78: 2779-2787) 및 E1(상기 Wang et al.의 문헌)과 함께, 바이러스 수용에 중요한 것으로 나타났다. 키메릭 E2 단백질을 포함하는 엔지니어링된 페스티바이러스는 숙주 범위를 변경시켰다. 양의 페스티바이러스인 보더병 바이러스(BDV)로부터 유래한 완전한 E2 유전자를 함유하는 키메릭 BVDV는 소 신장 세포(MDBK)에서 플라크을 형성하는 능력은 소실되지만, 양 세포에서 플라크을 형성하는 능력은 유지된다(Lian et al., 2003, J. Gen. Viol. 84: 1269-1274). 그러나, MDBK 세포는 감염 24시간 후 바이러스 자손 수율에서의 차이가 야생형 BVDV보다 100배 미만이었지만, 여전히 키메라의 복제를 허용하였다. 마찬가지로, CSFV C 균주 E2의 아미노 말단을 BVDV로부터 유래한 상동적 서열로 부분적으로 대체하면, 돼지 신장 세포(SK6)에서 바이러스 자손 수율이 10배 감소되었다. SK6 세포는 유사하게 키메라 및 BVDV E2 공여자에 대하여 복제를 허용하였다; 그러나, 키메라는 소 태아 상피 세포를 감염시키는 BVDV 능력을 얻지 못하였다(상기 van Gennip et al.의 문헌, 2000). 유사하게, T4v 및 T5v는 BICv, T1v, T2v 및 T3v와 비교하여 SK6 세포에서 10배의 바이러스 자손 수율 감소나타내었고(도 2A), 소 신장 세포(MDBK)에서 효율적으로 복제하는 능력이 결여되었다(결과 미도시).
T4v 및 T5v는 SK6 세포에서 모체 BICv와 비교하여 대략 70%의 플라크 크기 감소를 나타내었다(도 2B). 유사한 작은 플라크 표현형이 SK6 세포 상에서 BVDV 균주 NADL로도 관찰되었으며(결과 미도시), 이는 이들 바이러스의 시험관 내 부착 및/또는 확산 능력의 변화를 제시한다. 시험관내 플라크 사이즈 감소 및 CSFV의 생체내 약독화 사이의 관련성이 확립되지 않았지만, 관련성을 암시하는 일부 ㄱ겨결과들이 있다. Hulst 등(J. Virol 74: 9553-9561; 상기 Hulst et al.의 문헌, 2001)은 배양된 돼지 신장 세포에서 연속적 통과 후 얻은 CSFV 브레시아 헤파린 설페이트 결합 의존적 변이체가 감소된 플라크 크기를 가짐을 관찰하였다. Erns 단백질에서 단일 아미노산 돌연변이를 포함하는 이들 변이체는 돼지에서 병원성이었다(상기 Hulst et al.의 문헌, 2000, 2001). 그러나, E1(상기 Risatti et al.의 문헌, 2005b) 및 E2(상기 Risatti et al.의 문헌, 2005a)에 돌연변이를 포함하는, 2개의 상이한 CSFV 균주 브레시아 기원의 재조합 바이러스가 배양된 돼지 신장 세포에서 감소된 플라크 크기 표현형을 나타내었고, 돼지에서 약독화되었다.
요약하면, E2 당단백과 관련된 신규 CSFV 유전적 병원성 결정 인자가 확인되었다. 약독화의 매커니즘은 알려지지 않았지만, 흥미롭게도, mAb WH303과의 반응성의 점차적인 소실은 CSFV의 최종적인 약독화를 가져오는, 생체내 병원성의 소실과 연관성이 있었으며, 이는 에피토프 서열 결여와 돼지에서 다른 페스티바이러스(BVDV 및 BDV)에 의하여 질환이 유도될 수 없는 점 사이의 관련성을 제시한다. CSFV 병원성의 유전적 근거에 대한 이해의 향상은 개선된 안전성, 효능 및 유용성을 갖는, 생균 약독화 CSF 백신의 합리적 디자인을 가능하게 할 것이다. 추가적으로, T4v 및 T5v 바이러스의 특정 경우에서, 고도로 특이적이고 보존된 CSFV 에피토프를 인식하는, mAb WH303과의 반응성 결여가 약독화된 마커 백신으로서 이들 바이러스 돌연변이체의 잠재적 사용 가능성을 열어 놓는다.
도 1은 E2 당단백의 mAb WH303 에피토프 영역에서 CSFV 브레시아, BVDV 균주 NADL 및 CSFV T1-5 돌연변이 바이러스들의 비교를 나타낸다. CSFV 다단백에서 아미노산 잔기 위치들을 나타낸다. 이탤릭체는 BVDV 균주 NADL 및 CSFV T1v 내지 T5v 둘다에서 브레시아 E2에서의 그것과 상이한 잔기들을 나타낸다.
도 2A 및 2B는 T1v-T5v 돌연변이체 및 BICv의 특징들을 비교한 것이다. 도 2A는 T1v-T5v 돌연변이체 및 BICv의 시험관내 성장 특성을 보여준다. SK6 단일층들을 T1v, T2v, T3v, T4v, T5v 또는 BICv로 감염시켰고(MOI=0.01), 바이러스 수율을 감염후 때때로 역가 측정하였다. 데이터는 2개의 독립적 실험으로부터 얻은 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 도 2B는 돌연변이체 T1v-T5v 및 BICv의 플라크(plaque) 형성 및 mAb 반응성을 보여준다. SK6 단일층들을 50 내지 100 TCID50으로 감염시키고, 0.5% 아가로즈를 오버레잉한 다음, 37℃에서 3일간 배양하였다. 플레이트를 50%(부피/부피) 에탄올-아세톤으로 고정하고 mAb WH303 및 mAb WH308로 면역조직화학법에 의해 차등하여 염색하였다.
도 3은 재조합 바이러스 T1v-T5v 및 BICv로 감염된 돼지에서 기록된 임상 점수를 보여준다. 임상 점수는 변형체를 가지고 이전에 기재한 것처럼 계산하였고 2마리(T1v, T2v, T3v 및 T4v) 또는 6마리(T5v 및 BICv) 동물의 관찰결과에 기초하였다.
도 4A-B는 재조합 바이러스 T1v-T5v 및 BICv로 감염된 돼지에서 말초 백혈구 수(도 4A) 및 혈플라크 수(도 4B)를 나타낸다. 수를 갯수/ml로서 표시하고 각 지점은 2마리(T1v, T2v, T3v 및 T4v) 또는 6마리(T5v 및 BICv) 동물에 대한 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
도 5A-C는 T1v-T5v 돌연변이체 또는 BICv로 감염된 돼지로부터 얻은 혈액(도 5A), 비강 면봉(도 5B), 및 편도 찰과(도 5C)에서의 바이러스 역가(virus titers)를 도시한다. 각 지점은 평균 TCID50/mL 및 2마리(T1v, T2v, T3v 및 T4v) 또는 6마 리(T5v 및 BICv) 동물에 대한 표준 편차를 나타낸다.
도 6A-B는 거짓 백신 접종되거나 T5v로 백신 접종되고, BICv로 감염 후 3일 또는 21일에 면역성 테스트된 돼지에서의 말초 백혈구 수(도 6A) 및 혈플라크 수(도 6B)를 나타낸다. 대조 동물, 거짓 백신접종된 동물, 및 면역성 테스트된 동물에 대한 값을 채워진 사각형으로 표시한다. 수는 갯수/ml로 표시되고 표준 오차를 지시하는 오차 막대기를 갖는 4마리 개체의 평균을 나타낸다.
이제 일반적으로 기재된 본 발명이 특정 구체적인 실시예를 참조하여 더욱 잘 이해될 것이며, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 추가로 설명하기 위하여 본원에 포함된 것일 뿐, 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되지는 않는다.
실시예 1
바이러스 및 세포 배양
BVDV가 없는 돼지 신장 세포(SK6)(29)를 10% 태아 송아지 혈청(FCS, Atlas Biologicals, Fort Collins, Co)이 함유된 둘베코의 최소 필수 배지(DMEM, Gibco, Grand Island, NY)에서 배양하였다. CSFV 브레시아 균주를 SK6 세포에서 증식시켜서 감염성 cDNA 클론(17)을 구축하기 위해 사용하였다. 임상 시료로부터 CSFV의 역가 측정은 96웰 플레이트(Costar, Cambridge, MA)에서 SK6 세포를 이용하여 수행하였다. CSFV 모노클로날 항체 WH303 또는 WH308(1) 및 벡타스테인 ABC 키 트(Vector Laboratories, Buringames, Ca)(25)를 사용한 면역과산화효소 분석에 의하여, 배양 4일 후 바이러스 감염성이 검출되었다. 리드 및 문크(Reed and Muench)의 방법(14)을 사용하여 역가를 계산하여 TCID50/ml로 표시하였다. 수행시, 테스트 민감도는 1.8 TCID50/ml보다 컸다.
실시예 2
CSFV 감염성 클론 T1 - T5 의 구축
병원성 브레시아 분리주(pBIC)의 전장 감염성 클론(IC)(17)을, E2의 잔기 829 내지 837 사이에 있는 WH303 에피토프(TAVSPTTLR; 서열번호: 1)의 6개 잔기들을 돌연변이시켜서 BVDV 분리주 NADL에 존재하는 상동적 잔기들(TSFNMDTLA; 서열번호: 2)을 나타내는 주형으로서 사용하였다(상기 Lin et al.의 문헌). 돌연변이는 점진적으로 부가되어서 하기 바이러스 돌연변이체의 구조를 위한 5개의 IC를 생산하였다: T1v(TSFSPTTLR; 서열번호: 3), T2v(TSFNPTTLR; 서열번호: 4), T3v(TSFNMTTLR; 서열번호: 5), T4v(TSFNMDTLR; 서열번호: 6) 및 T5v(TSFNMDTLA; 서열번호: 7)(도 1). 표 1에 기재된 프라이머 및 목적 플라스미드를 사용하여, 제조자의 지시에 따라서 수행된 퀵체인지 XL 부위 지향 돌연변이 유발 키트(Stratagene, Cedar Creek, TX)를 이용한 부위 지향된 돌연변이 유발에 의하여 돌연변이를 도입하였다.
Figure 112008089984954-PCT00001
감염성 RNA가 시험관 내에서 CSFV 균주 브레시아 또는 돌연변이체 T1 내지 T5의 전장 IC로부터 전사되어 SK6 세포를 형질감염시키기 위하여 사용되었다(도 1A). 형질감염후 4일째까지 형질감염된 세포로부터 바이러스를 구제(rescue)하였다. 구제된 바이러스 게놈의 뉴클레오티드 서열은 모체 DNA 플라스미드와 동일하여, WH303 에피토프를 암호화하는 유전자 위치에서의 돌연변이만이 T1v-T5v에 반영되었음을 확인하였다.
실시예 3
CSFV 브레시아 및 T1 - T5v 돌연변이 바이러스의 시험관내 구제
전장 게놈 감염성 클론을 SrfI로 선형화시키고 T7 메가스크립트 시스템(Ambion, Austin, TX)을 이용하여 시험관내에서 전사시켰다. RNA 산물을 LiCl로 침전시키고, BTX 630 전기천공기(BTX, San Diego, CA)로 500볼트, 720ohms, 100와트에서 전기천공에 의하여 SK6 세포로 형질감염시켰다. 12웰 플레이트 및 25cm2 플라스크에서 세포를 평판 배양시켜서 37EC 및 5% CO2 대기에서 4일동안 배양하였다. CSFV E2 특이적 모노클로날 항체(WH308)을 사용하여 면역과산화효소 염색에 의하여 바이러스를 검출하였다. 구제된 바이러스의 스탁(stock)을 -70℃에서 저장하였다. 도입된 돌연변이의 정확성을 돌연변이된 바이러스의 E2 유전자를 시퀀싱함으로써 확인하였다.
실시예 4
T1v - T5v 의 시험관내 및 생체내 분석
모체 pBICv에 대한 T1v-T5v의 시험관내 성장 특성을 다단계 성장 곡선에서 평가하였다(도 2A). 세포당 0.01 TCID50의 다중감염도(multiplicity of infection, MOI)에서 SK6 세포 배양물을 감염시켰다. 바이러스를 1시간 동안 흡착시키고(시간 0), 감염후 때때로 72시간에 걸쳐서 시료를 채취하였다. 돌연변이체 T1v, T2v, 및 T3v는 pBICv와 실제적으로 식별불가능한 성장 특성을 나타낸 반면, T4v 및 T5v는 최종 바이러스 수율에서 10배 감소를 나타내었다. T4v 및 T5v도 BICv, T1v, T2v 및 T3v와 비교하여 플라크 크기에서 80-90% 감소를 나타내었다(도 2B). 결국, MAb WH303과의 면역세포화학적 반응성은 T1v, T2v, 및 pBICv가 동등하였지만, 반응성은 T3v로 감염된 세포에서 부분적으로 소실되었고 T4v 및 T5v로 감염된 세포에서 완전히 제거되었다(도 2B). 이러한 결과는 CSFV가 시험관 내에서 복제하는 능력에 영향을 미치는 WH303 에피토프의 돌연변이가 WH303 반응성에 유사한 영향을 미친다는 점을 가리킨다.
점진적인 WH303 에피토프 돌연변이가 돼지에서의 CSFV 병원성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, T1v-T5v 돌연변이체 및 BICv 야생형 바이러스의 병원성 표현형들을 105 TCID50의 바이러스로 비강내 접종시킨 요크셔 돼지 6개의 그룹에서 비교하고, 임상적 질병을 모니터링하였다. 이 실험의 결과를 표 2 및 도 3-5에 나타낸다. 감염후 6일째 T1v-T5v 감염된 동물의 편도로부터 회수된 바이러스를 뉴클레오티드 서열 분석함으로써 WH303 에피토프 돌연변이의 동일성 및 안정성을 확인하였다(데이터는 도시 안됨).
Figure 112008089984954-PCT00002
* 4마리 동물 중 2마리에서 발열이 나타남.
# 보호 연구에서 사용된 동물을 포함함.
ICv는 예상한 바와 같이, 고도의 병원성으로서 돼지에서 발열, 임상적 징후, 및 사망을 효과적으로 유도한 반면, T1v-T5v 돌연변이체는 점점 약독화된 병원성 표현형을 갖는 것으로 보였다(표 2, 도 3). T1v 및 T2v도 고도로 병원성이어서 BICv와 유사한 방식으로 돼지에서 발열 및 사망을 유도하였다(표 2). 그러나, T2v는 BICv와 비교하여 임상 점수에서 약간의 지연을 나타내었다(표 3). T3v는 치명적 질환을 유도하였지만, 사망이 4-8일 이후에 나타났기 때문에 BICv와 비교시 지연된 동력학을 나타내었다(표 2). 현저히, T4v 및 T5v는 치명적 질환을 유도하지 못하였고, T4v는 단지 경미하고 일시적인 발열을 유도하였으며, T5v는 거의 임상적 질환을 유도하지 못하였다(표 2, 도 3). 유사하게, BICv, T1v, T2v 및 T3v 감염은 감염후 6일까지 백혈구(WBC) 및 혈플라크 수에서 급격한 감소를 초래하였고 이는 사망할 때까지 낮게 유지된 반면, T4v 및 T5v 감염은 일시적이고 훨씬 덜한 효과를 유도하였다(도 4).
Figure 112008089984954-PCT00003
또한, T1v-T5v의 약독화는 바이러스혈증 및 바이러스 배출에 반영되었다. T1v 및 T2v가 BICv에 의해 유도되는 것들에 필적하는 바이러스 혈증 역가를 유도한 반면, T3v 역가는 101 내지 102log10까지 감소되었고, T4v 및 T5v는 감염후 유사한 시점에서 BICv 역가보다 103 내지 105log10 더 낮은 역가를 유도하였다(도 5A). 비강 면봉 및 편도 찰과로부터 바이러스 역가에 대하여 유사한 패턴이 관찰되었는데(각각 도 5B 및 C), T3v, T4v 및 T5v 역가는 감염후 후기의 일자에서 검출가능한 수준보다 낮았다.
T5v 병인성의 보다 상세한 연구를 위하여, T5v 및 BICv로 감염된 동물을 감염후 2, 4, 6, 8 및 14일째 안락사시키고(1마리 동물/시점/군), 편도, 악하 림프절, 비장, 혈액 및 신장의 조직 시료 및 비강 면봉 및 편도 찰과 시료에서 바이러스 역가를 측정하였다(표 3). T5v는 BICv와 비교시 편도에서 유의적으로 더 낮은 수준(대략 102 내지 104log10)의 바이러스 복제를 나타내었다. T5v 및 BICv의 유사한 차이가 국부 배수(regional draining) 하악 림프절, 비장 및 신장의 바이러스 역가 사이에서 관찰되었다.
이러한 결과는 CSFV E2의 WH303 에피토프 내에서의 증가된 돌연변이 수가 돼지에 대한 바이러스를 약독화하는데 있어서 부가적 효과를 가지고, T4v 및 T5v에 존재하는 돌연변이가 바이러스 병원성의 유의적 감소를 초래한다는 것을 가리킨다. 더욱이, T5v 감염은 매우 경미하고 일시적인 임상적 질환, 편도 및 목적 조적에서 감소된 바이러스 복제, 및 급격하게 감소된 바이러스 배출을 특징으로 한다.
실시예 5
DNA 시퀀싱 및 분석
전장 감염성 클론들, 시험관 내에서 구제된 바이러스들, 및 감염된 동물들로부터 회수된 바이러스들을 디데옥시뉴클레오티드 사슬-종결법(Sanger et al. 1977, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 74: 5463-5467)에 의하여 CSFV 특이적 프라이머로 완전히 시퀀싱하였다. 염료 종결자 사이클 시퀀싱 키트(Perkin-Elmer, Boston, MA)로 시퀀싱 반응들을 준비하였다. 반응 생성물을 PRISM 3730xl 자동화 DNA 시퀀싱 장치(PE Biosystems, Foster City, CA)에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 데이터를 Phrap 소프트웨어 프로그램(www.phrap.org)을 가지고 어셈블리 언어로 번역하였고, 보강 어셈블리를 CAP3를 이용하여 수행하였다. 최종 DNA 공통 서열은 각 염기 위치에서 평균 5배의 중복성을 나타내었다. 서열 비교를 BioEdit를 사용하여 수행하였다.
실시예 6
동물 감염
병원성 브레시아 바이러스와 비교하여 돼지에서 T1v-T5v 돌연변이체 각각의병원성 표현형을 초기 스크리닝하였다. 본 실시예의 모든 동물 연구에서 사용된 돼지는 105 TCID50의 돌연변이 또는 야생형 바이러스를 비강 내로 접종시킨, 10 내지 12주령, 40파운드의 돼지였다. 스크리닝을 위하여, 12마리의 돼지를 무작위로 2마리씩 6개의 그룹으로 할당하였고, 각 그룹의 돼지에 T1v-T5v 돌연변이체 또는 pBICv 중 하나를 접종시켰다. 임상적 징후(오심, 우울증, 발열, 자색 피부 변색, 비틀 걸음, 설사 및 기침)를 실험 전체에 걸쳐서 매일 관찰하였고, 변형체를 가지고 이전에 기재된 바와 같이 점수매겼다.
T5v 돌연변이가 감염 동안 바이러스 배출 및 상이한 조직에서의 분포에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 10마리의 돼지를 무작위로 각각 5마리씩 2그룹으로 할당하였고 T5v 또는 BICv를 접종하였다. 각 그룹당 한 마리의 돼지를 감염후 2, 4, 6, 8 및 14일째 희생시켰다. 혈액, 비강 면봉 및 편도 찰과 시료를 부검한 돼지에서 얻었다. 조직 시료(편도, 하악 림프절, 비장 및 신장)를 바이러스 역가 측정을 위하여 액체 질소에서 스냅-냉동(snap-frozen)시켰다.
보호 연구를 위하여, 12마리의 돼지를 무작위로 각각 4마리씩 3개의 그룹으로 할당하였다. 그룹 1 및 2의 돼지에 T5v를 접종하였고, 그룹 3의 동물은 거짓(mock) 감염시켰다. 감염후 3일(그룹 1) 또는 21일(그룹 2)째에, 그룹 3의 동물과 함께 동물에 BICv로 면역성 테스트를 하였다. 임상적 증후 및 체온을 상기한 바와 같이 실험 전체에 걸쳐서 매일 기록하였다. 혈액, 혈청, 비강 면봉 및 편도 찰과를 면역성 테스트후 때때로 채취하였는데, 전대정맥에서 얻은 혈액은 전체 및 차별적 백혈구 수를 계수하기 위하여 EDTA 함유 튜브(Vacutainer)에 담았다. 전체 및 차별적 백혈구 및 혈플라크 수를 베크만 코울터 ACT(Beckman, Coulter, CA)를 이용하여 얻었다.
실시예 7
T5v 감염이 병원성 BICv 로 면역성 테스트시 돼지를 보호함
BICv 면역성 테스트에 대한 보호를 유도하는 T5v의 능력을 평가하였다. T5v로 백신 접종된 돼지에 감염후 3일 또는 21일째 105 TCID50의 병원성 BICv로 면역성테스트하였다. T5v를 수용하지 않은 거짓 백신 접종된 대조군 돼지는 BICv로 면역성 테스트후 4일까지 오심, 우울증 및 발열을 나타내었고, 면역성 테스트후 7일까지 순환 백혈구 및 혈플라크 수의 현저한 감소를 나타내었으며, 면역성 테스트후 12일까지 사망하거나 빈사 상태였고 안락사되었다(표 4 및 도 6).
BICv로 면역성 테스트후 T5 감염된 동물의 돼지 생존 및 발열 반응
면역성 테스트 DPI1 생존자/전체 사망까지 평균 시간 일수(SD) 발열 개시 평균 시간 일수(SD) 발열 지속 평균 시간 일수(SD) 최고 일일 체온의 평균(SD)
3 4/4 - 4(0.8)2 1(0.0) 103.1(0.6)
21 4/4 - - - 102.9(0.3)
대조군3 0/2 12(0.0) 4(0.0) 5(0.7) 105.9(0.7)
1 T5로 감염후 일수
2 4마리의 동물중 2마리가 발열을 나타냄
3 대조군: 동물을 거짓 백신 접종시킴
현저히, T5v는 BICv 유도된 임상 질환에 대한 완벽한 보호를 감염후 3일까지 유도하였다. 모든 돼지는 감염에서 살아남았고 임상적으로 정상 상태였는데, 2마리의 동물만이 혈액학적 수치에 유의적인 변화없이(도 6) 면역성 테스트 4일째 일시적인 발열을 나타내었다(표 4). 유사하게, T5v 감염후 21일째에 면역성 테스트받은 돼지도 임상적으로 정상 상태였다(표 4).
특이적으로 mAb WH303으로 검출되는 것으로서 BICv 면역성 테스트 바이러스의 바이러스 혈증 및 바이러스 배출을 또한 면역성 테스트후 4, 6, 8, 14 및 21일째에 조사하였다(데이터는 도시 안됨). 거짓 백신접종받은 대조군 동물에서 예상된 대로, BICv 바이러스 혈증이 면역성 테스트후 5일까지 관찰되었고, 바이러스 역가는 사망시까지 높은 상태(면역성 테스트후 8일까지 106 TCID50/ml)로 유지되었으며, 면역성 테스트후 4일까지 비강 면봉 및 편도 찰과로부터 BICv 바이러스 역가를 측정하였는데, 면역성 테스트후 8일까지 104-105 TCID50/ml의 역가에 도달하였다. 반면에, 면역성 테스트후 T5v 백신 접종받은 돼지로부터 얻은 모든 임상 시료(혈액, 비강 면봉 또는 편도 찰과)에서 BICv가 없었다. 이러한 결과는 T5v가 치명적인 CSFV 면역성 테스트에 대한 완벽한 보호를 빠르게 유도할 수 있음을 나타내고, T5v-면역성 돼지에서는 면역성 테스트 바이러스로부터 유래된 바이러스 혈증 또는 배출을 검출할 수 없음을 가리킨다.
따라서, T5v는 실험적으로 백신 접종된 동물에서, T5 백신 접종후 3일 또는 28일째에 병원성 모체 바이러스 브레시아로 면역성 테스트시 면역성 테스트 바이러스의 복제 및 임상적 질환의 존재 모두에 대하여 완전한 보호를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허는, 각 개별 문헌 또는 특허가 참조로서 편입되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어진 것처럼 동일한 정도로 본원에 참조로서 편입된다.
상기 기재 및 특정 대표적 실시 양태 및 본 발명의 세부 사항은 본 발명의 설명 및 예시 목적으로 제시되었다. 권리가 소진되거나 개시된 정확한 형태로 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않는다. 관련 분야의 통상의 기술자에게 변형 및 변화가 본 발명의 범위를 벗어남 없이 본원에서 이루어질 수 있음이 명백할 것이다.
<110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESNTED BY THE SECRETARY OF AGRICULTURE <120> A Novel Virulence Determinant Within The E2 Structural Glycoprotein of Classical Swine Fever Virus <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 1 Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 2 Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 3 Thr Ser Phe Ser Pro Thr Thr Leu Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized <400> 4 Thr Ser Phe Asn Pro Thr Thr Leu Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 5 Thr Ser Phe Asn Met Thr Thr Leu Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 6 Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Arg 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically Synthesized <400> 7 Thr Ser Phe Asn Met Asp Thr Leu Ala 1 5 <210> 8 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T1F <400> 8 gggtgttata gagtgcacgt catttagccc gacaactctg agaac 45 <210> 9 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T2F <400> 9 gggtgttata gagtgcacgt catttaatcc gacaactctg agaac 45 <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T3F <400> 10 gggtgttata gagtgcacgt catttaatat gacaactctg agaac 45 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T4F <400> 11 gagtgcacgt catttaatat ggacactctg agaacagaag tggta 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T5F <400> 12 tcatttaata tggacactct ggcaacagaa gtggtaaaga ccttc 45

Claims (15)

  1. 변형된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백(glycoprotein)을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 돼지 콜레라 바이러스(CSFV).
  2. 소 바이러스성 설사증 바이러스(BVDV)로부터 유래된 상동적 E2 유전자와 부분적으로 유사하도록 고도의 병원성 균주 브레시아(Brescia)의 E2 유전자 일부를 점진적으로 돌연변이시켜 변형된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하고, 상기 변형은 돼지 콜레라 바이러스의 약독화(attenuation)를 야기시키는 재조합 돼지 콜레라 바이러스.
  3. 고도의 병원성 균주 브레시아(Brescia)의 E2 유전자 영역을 점진적으로 돌연변이시켜 변형된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하는 재조합 돼지 콜레라 바이러스로서, 상기 영역은 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백의 아미노산 829 내지 837을 암호화하고, 상기 DNA에서의 점진적인 돌연변이는 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백의 특징인 1 내지 6개의 아미노산을 소 바이러스성 설사증 바이러스의 E2 당단백의 상동적 영역의 특징인 1 내지 6개의 아미노산으로 변화시키며, 상기 변형은 돼지 콜레라 바이러스의 약독화를 야기시키는 재조합 돼지 콜레라 바이러스.
  4. 서열 TSFNMDTLR(서열번호: 6)를 갖는 돌연변이된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하고, 변형 결과 돼지 콜레라 바이러스의 약독화(attenuation)를 야기시키는 재조합 돼지 콜레라 바이러스.
  5. 서열 TSFNMDTLA(서열번호: 7)를 갖는 돌연변이된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하고, 변형 결과 돼지 콜레라 바이러스의 약독화(attenuation)를 야기시키는 재조합 돼지 콜레라 바이러스.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 합리적으로 디자인된 생균 약독화(live attenuated) 돼지 콜레라 백신.
  7. 제4항에 따른 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 합리적으로 디자인된 생균 약독화 돼지 콜레라 백신.
  8. 제4항에 따른 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 합리적으로 디자인된 생균 약독화 돼지 콜레라 백신.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 포함하는 백신을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 콜레라에 대하여 동물을 면역시키는 방법.
  10. 임상적 돼지 콜레라로부터 동물을 보호하기에 효과적인 양의 제8항의 백신을 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 콜레라에 대하여 동물을 보호하는 방법.
  11. 혈청이 mAb 303의 결합을 저해하는지의 여부를 확인하는 경쟁효소면역검사법(competitive ELISA)의 평가로 동물로부터 혈청을 분석하는 단계를 포함하는, 제8항에 따른 합리적으로 디자인된 생균 약독화 돼지 콜레라 백신으로 백신 접종된 동물로부터 돼지 콜레라 바이러스로 감염된 동물을 구별하는 방법.
  12. 혈청이 mAb 303의 결합을 저해하는지의 여부를 확인하는 경쟁효소면역검사법(competitive ELISA)의 평가로 동물로부터 혈청을 분석하는 단계를 포함하는, 제
    7항에 따른 합리적으로 디자인된 생균 약독화 돼지 콜레라 백신으로 백신 접종된 동물로부터 돼지 콜레라 바이러스로 감염된 동물을 구별하는 방법.
  13. (a) 고도의 병원성 균주 브레시아(Brescia)에서 병원성 결정 인자를 확인하는 단계;
    (b) 돼지에서 병원성이 아닌 관련 바이러스에서 상동적 병원성 결정 인자를 확인하는 단계;
    (c) 상기 병원성 결정 인자를 암호화하는 DNA를 점진적이고 순차적으로 돌연변이시킴으로써, 상기 DNA에서의 점진적 돌연변이가 돼지 콜레라 바이러스(CSFV) 병원성 결정 인자의 특징인 아미노산을 상동적 병원성 결정 인자의 특징인 아미노산으로 변화시키도록 하는 단계; 및
    (d) 돼지 콜레라 바이러스의 약독화를 달성하는 단계를 포함하는, 약독화된 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 생산하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 관련 바이러스가 소 바이러스성 설사증 바이러스(BVDV) 또는 보더병 바이러스(BDV)인 것을 특징으로 하는 약독화된 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 생산하는 방법.
  15. (a) 고도의 병원성 균주 브레시아(Brescia)의 E2 유전자 영역을 점진적으로 돌연변이시키는 단계로서, 상기 영역은 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백의 아미노산 829 내지 837을 암호화하고, 상기 DNA에서의 점진적인 돌연변이가 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백의 특징인 1 내지 6개의 아미노산을 소 바이러스성 설사증 바이러스(BVDV)의 E2 당단백의 상동적 영역의 특징인 1 내지 6개의 아미노산으로 변화시키는 단계; 및
    (b) 상기 변형의 결과로서 돼지 콜레라 바이러스의 약독화를 달성하는 단계를 포함하는, 변형된 돼지 콜레라 바이러스의 E2 당단백을 암호화하는 DNA를 포함하는 약독화된 재조합 돼지 콜레라 바이러스를 생산하는 방법.
KR1020087031827A 2006-05-30 2007-05-29 돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자 KR101432840B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/443,132 US8846055B2 (en) 2006-05-30 2006-05-30 Virulence determinant within the E2 structural glycoprotein of classical swine fever virus
US11/443,132 2006-05-30
PCT/US2007/069852 WO2007143442A2 (en) 2006-05-30 2007-05-29 A novel virulence determinant within the e2 structural glycoprotein of classical swine fever virus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090025291A true KR20090025291A (ko) 2009-03-10
KR101432840B1 KR101432840B1 (ko) 2014-09-22

Family

ID=38790491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087031827A KR101432840B1 (ko) 2006-05-30 2007-05-29 돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8846055B2 (ko)
EP (1) EP2023953B1 (ko)
JP (1) JP5377296B2 (ko)
KR (1) KR101432840B1 (ko)
CN (1) CN101478985B (ko)
BR (1) BRPI0712558A2 (ko)
CA (1) CA2656560A1 (ko)
CR (1) CR10508A (ko)
GT (1) GT200800269A (ko)
MX (1) MX2008015215A (ko)
RU (1) RU2451746C2 (ko)
UA (1) UA98620C2 (ko)
WO (1) WO2007143442A2 (ko)
ZA (1) ZA200810285B (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8114852B2 (en) * 2008-01-15 2012-02-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture N-linked glycosylation alteration in E1 glycoprotein of classical swine fever virus and novel classical swine fever virus vaccine
US20100104597A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 Manuel Borca N-linked glycosylation alteration in E0 and E2 glycoprotein of classical swine fever virus and novel classical swine fever virus vaccine
EP2202298A1 (en) * 2008-12-23 2010-06-30 Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Recombinant classical swine fever virus (CSFV) comprising a modified E2 protein and methods for generating said recombinant CSFV
PL2571519T3 (pl) 2010-05-18 2017-07-31 Idt Biologika Gmbh Szczepionka markerowa dla klasycznego pomoru świń
CN102175849B (zh) * 2010-12-22 2013-07-03 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 一种快速检测猪瘟抗体的试剂盒及其制备方法
CN102268079B (zh) * 2011-05-03 2013-04-03 新乡学院 猪瘟病毒csfv e2蛋白配体表位多肽及其应用
CN103499693A (zh) * 2013-10-11 2014-01-08 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 猪瘟病毒抗体竞争AlphaLISA检测试剂盒及检测方法
RU2689143C1 (ru) 2013-12-19 2019-05-24 Интервет Интернэшнл Б.В. Усовершенствованный диагностический тест для csfv антител
DK3146042T3 (da) * 2014-05-23 2019-09-30 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Rekombinant klassisk svinepestvirus (CSFV) med substitution i E2-proteinets TAV-epitop
CN104483490B (zh) * 2014-12-09 2016-06-08 武汉科前生物股份有限公司 一种猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及应用
US9814771B2 (en) * 2015-09-11 2017-11-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Live attenuated classical swine fever vaccine based in genetic manipulation of a putative fusion peptide area in the virus structural glycoprotein E2
RU2727847C2 (ru) * 2016-05-12 2020-07-24 Биоэппликейшнз Инк. Растительная композиция для вакцинации против чумы свиней и способ ее приготовления
US9808520B1 (en) * 2016-07-01 2017-11-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Rationally developed african swine fever attenuated virus strain protects against challenge with parental virus georgia 2007 isolate
CN106749519B (zh) * 2016-11-15 2020-04-07 河南省农业科学院 基于计算机模拟的csfv e2蛋白靶向结合的肽配基序列设计及应用
CN109324193A (zh) * 2018-12-07 2019-02-12 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用
CN112961224B (zh) * 2021-03-26 2022-09-27 中国农业大学 牛病毒性腹泻病毒1型病毒样颗粒的制备及应用
EP4105225A1 (en) * 2021-06-18 2022-12-21 Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries Peptide-based assay to differentiate animals infected with csfv from vaccinated animals

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0982402A1 (en) * 1998-08-14 2000-03-01 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Pestivirus vaccination

Also Published As

Publication number Publication date
CN101478985A (zh) 2009-07-08
WO2007143442A2 (en) 2007-12-13
UA98620C2 (uk) 2012-06-11
WO2007143442A3 (en) 2008-03-13
RU2451746C2 (ru) 2012-05-27
CN101478985B (zh) 2013-10-30
ZA200810285B (en) 2010-07-28
EP2023953B1 (en) 2014-11-19
GT200800269A (es) 2009-05-04
JP5377296B2 (ja) 2013-12-25
JP2009538628A (ja) 2009-11-12
US20070280955A1 (en) 2007-12-06
CA2656560A1 (en) 2007-12-13
MX2008015215A (es) 2009-02-06
US8846055B2 (en) 2014-09-30
EP2023953A2 (en) 2009-02-18
EP2023953A4 (en) 2010-01-20
KR101432840B1 (ko) 2014-09-22
RU2008150400A (ru) 2010-07-10
CR10508A (es) 2009-02-23
BRPI0712558A2 (pt) 2012-11-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101432840B1 (ko) 돼지 콜레라 바이러스의 ｅ2 구조 당단백질 내의 신규 병원성 결정인자
Risatti et al. Identification of a novel virulence determinant within the E2 structural glycoprotein of classical swine fever virus
CN102317449B (zh) 包括经修饰的e2蛋白质的重组猪瘟病毒（csfv）和用于生成所述重组csfv 的方法
CN103352030A (zh) 含有减毒瘟病毒的疫苗
CN100516221C (zh) 突变体猪瘟病毒株的核苷酸序列,由这些序列编码的多肽及它们的应用
US20150290314A1 (en) Marker vaccine
CN106456741A (zh) 包含e2蛋白tav表位中的取代的重组经典猪瘟病毒(csfv)
US8133495B2 (en) Live attenuated antigenically marked classical swine fever virus
Wehrle et al. Chimeric pestiviruses: candidates for live-attenuated classical swine fever marker vaccines
US8961996B2 (en) N-linked glycosylation alteration in E0 and E2 glycoprotein of classical swine fever virus and novel classical swine fever virus vaccine
US7332170B1 (en) Classical swine fever virus virulence determinant and a novel classical swine fever vaccine
US8426575B2 (en) N-linked glycosylation alteration in E1 glycoprotein of classical swine fever virus and novel classical swine fever virus vaccine
CN112020509A (zh) 转基因的瘟病毒及其作为标记疫苗的应用
Zhang Molecular comparison and antigenic differentiation of the structural proteins of virulent and attenuated strains of equine arteritis virus
Fan Development of a Recombinant Noncytopathic Bovine Viral Diarrhea Virus Stably Expressing Enhanced Green Fluorescent Protein

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee