CN105861453A - 表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒c株及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株及其构建方法和应用，属于标记猪瘟病毒C株的构建及应用领域。本发明以C株感染性克隆为骨架，将猪瘟病毒强毒石门株Npro蛋白替换C株Npro蛋白，再将EGFP基因引入Npro蛋白第13和14位氨基酸之间，获得一株表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12039。本发明获得的标记猪瘟病毒C株能够稳定表达EGFP基因，并成功观察到其绿色荧光，而且其保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性，能够应用于制备预防猪瘟的标记疫苗。本发明证实在C株Npro蛋白上可以进行修饰以获得标记的猪瘟病毒，为发展标记C株疫苗奠定基础。

Description

表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及标记猪瘟病毒C株，尤其涉及表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株，本发明还涉及表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株的构建方法及其在制备标记疫苗中的应用，属于标记猪瘟病毒C株的构建及应用领域。
背景技术
猪瘟(Classical swine fever，CSF)是猪的一种以高热稽留和广泛出血为主要特征的高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为须申报的(Notifiable)动物传染病。中国的“国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)”将其列为五种优先防治的一类动物疫病之一。
猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)是CSF的病原，它属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)成员。其基因组全长约12.3kb，包含5′非编码区(untranslated region，UTR)，一个大的开放阅读框和3′-UTR，其阅读框编码由3898个氨基酸组成的多聚蛋白，这一多聚蛋白在2种细胞内蛋白酶和3种病毒蛋白酶(Npro、NS2和NS3)的作用下裂解为12个成熟的病毒蛋白，分别为4种结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Lindenbach,B.D.,et al.,The C terminus of hepatitis C virus NS4A encodes an electrostatic switch that regulates NS5A hyperphosphorylation and viral replication.J.Virol.2007,81:8905-8918；Rümenapf,T.,et al.,Molecular biology of pestiviruses,2008,pp 39-96.In Mettenleiter T.,Sobrino F.(ed),Animal viruses:molecular biology.Caister Academic Press,United Kingdom；Tautz,N.,et al.,Establishment and characterization of cytopathogenic and noncytopathogenic Pestivirus replicons.J.Virol.1999,73: 9422-9432.)。
猪瘟兔化弱毒疫苗株(C株或HCLV株)是中国学者在20世纪50年代通过将CSFV强毒株在兔体内连续传480余代后培育而成的(周泰冲.猪瘟病毒与防制猪瘟的研究进展.兽医科技杂志,1980,4:23-33.)。该疫苗株在家兔上有其独特的生物学特性，主要包括该疫苗株接种家兔后能引起家兔的定型热反应和在家兔脾脏中复制。该疫苗株能使各种日龄的猪体产生极好的免疫保护，从而使其能够抵抗致死性强毒的攻击。然而，作为中国具有自主知识产权的优秀疫苗株，具有在血清学上不能鉴别感染动物和免疫动物的缺点。因此，构建表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的标记C株，将C株改进为标记疫苗，将具有重要的意义和价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株，该标记猪瘟病毒C株中的EGFP基因得到稳定遗传和表达，并可以观察到EGFP的绿色荧光，而且该标记猪瘟病毒C株保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性，能够应用于制备预防猪瘟的标记疫苗。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株的构建方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
本发明首先公开了一株表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株，是以猪瘟病毒C株为骨架，用猪瘟病毒石门株Npro蛋白替换猪瘟病毒C株Npro蛋白后，再将EGFP基因插入到猪瘟病毒石门株Npro蛋白的第13位和第14位氨基酸之间。
本发明具体以猪瘟病毒C株感染性克隆为骨架，将CSFV强毒石门株 Npro蛋白替换C株Npro蛋白后，再将EGFP基因引入石门株Npro蛋白的第13和第14位氨基酸之间，成功获得了一株标记疫苗株rHCLV-Npro(SM)-EGFP，其能够稳定表达EGFP基因，可以成功观察到EGFP的绿色荧光，而且其保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性。
本发明将稳定表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12039；分类命名为：表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2016年02月02日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
猪瘟病毒C株是预防猪瘟的最好弱毒活疫苗之一。但是C株疫苗不能使感染动物和免疫动物之间产生血清学的差异，因此它的应用通常会导致严重的贸易限制。为了获得标记的CSFV C株，本发明首先将EGFP基因插入C株感染性克隆Npro蛋白的第13和14位氨基酸之间，获得标记的CSFV C株rHCLV-EGFP。分析表明，尽管rHCLV-EGFP携带完整EGFP基因，不同代次rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因没有发生缺失或者突变，但不能从其感染的细胞中观察到EGFP的绿色荧光；而且检测发现其表达的Npro-EGFP蛋白分子量是预期大小的两倍，表明rHCLV-EGFP的Npro-EGFP蛋白可能在病毒感染的细胞内形成了同源二聚体。
然而在rHCLV-EGFP的基础上，本发明以C株为骨架，将CSFV强毒石门株Npro蛋白替换C株Npro蛋白后再引入EGFP获得的标记疫苗株rHCLV-Npro(SM)-EGFP，能够稳定表达EGFP，其绿色荧光得到了恢复，在感染细胞中可以观察到它的绿色荧光。
生长特性分析表明，rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP与拯救病毒rHCLV株有相似的生长特性，说明不论是EGFP基因直接插入到病毒基因组还是Npro基因被CSFV强毒石门株的Npro替换后再插入EGFP都 不影响拯救病毒的生长。家兔试验表明，接种C株或rHCLV的家兔都在接种后24h或36h出现发热，持续18-24h；但标记病毒rHCLV-EGFP却不能够诱导家兔产生定型热反应。荧光定量RT-PCR结果表明，rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP均能在家兔脾脏中复制。CSFV特异性抗体检测结果证实，免疫rHCLV-EGFP或rHCLV-Npro(SM)-EGFP的家兔在免疫后10d均可以诱导家兔产生高水平的抗E2抗体。这些数据表明，与C株相比，rHCLV-Npro(SM)-EGFP保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性，而rHCLV-EGFP在家兔体内丧失了部分生物学特性。
尽管Li等(Li,Y.,Shen,L.,Sun,Y.,Yuan,J.,Huang J.,Li,C.,Li,S.,Luo,Y.,Qiu,H.J.A simplified serum-neutralization test based on enhanced green fluorescent protein-tagged classical swine fever virus.J.Clin.Microbiol.2013,51:2710-2712.)将EGFP基因插入到CSFV石门株Npro蛋白氨基酸13和14位点间，获得了表达EGFP的重组CSFV石门株(命名为EGFP-CSFV)，经过多次传代后，EGFP-CSFV的EGFP基因仍然能够稳定表达，但由于石门株和C株迥异的生物学特性，因此EGFP基因在C株上的表达和稳定情况是难以预料的。在本发明中，将EGFP基因引入C株感染性克隆Npro蛋白的第13和14位氨基酸之间获得的病毒rHCLV-EGFP的EGFP没有荧光。尽管来自rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因是完整没有突变的，但表达的Npro-EGFP分子量大小却是预期的两倍，这可能会影响EGFP的发色基团的形成或EGFP的功能。重要的是，当EGFP基因与以C株为骨架的CSFV强毒石门株的Npro融合时，EGFP恢复了其荧光。CSFV石门株和C株之间Npro蛋白氨基酸序列或者结构的差异可能影响EGFP的荧光。
通过耳缘静脉接种C株的家兔表现出持续18-24h的定型热反应，这是C株在家兔体上重要生物学特性之一。与C株相反，CSFV强毒石门株不能引起家兔的定型热反应，不能在家兔的脾脏和淋巴组织中复制，也就 是说两毒株有着迥异的生物学特性。之前的研究表明，C株的UTRs被CSFV石门株的UTRs替换后不能诱导家兔产生定型热反应，但是会保持其免疫原性(Li,C.,Li,Y.,Shen,L.,Huang,J.,Sun,Y.,Luo,Y.,Zhao,B.,Wang,C.,Yuan,J.,Qiu H.J.The role of noncoding regions of classical swine fever virus C-strain in its adaptation to the rabbit.Virus Res.2014,183:117-122.)，这证明C株基因组的微小改变可能会影响它在家兔体内的生物学特性，但是不会影响其免疫原性。因此，石门株Npro蛋白的替换理论上可能会影响C株的生物学特性。然而，本发明试验结果却证实，rHCLV-Npro(SM)-EGFP保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性。
本发明所述标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP能够应用于制备预防猪瘟的标记疫苗。
本发明进一步公开了一种预防猪瘟的疫苗组合物，包括：预防上有效量的所述标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP。所述疫苗组合物中还可以加入药学上可接受的佐剂，以增强疫苗组合物的抗原性。
本发明还公开了一种所述标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP的构建方法，包括以下步骤：(1)构建猪瘟病毒C株感染性克隆；(2)用猪瘟病毒石门株Npro蛋白编码基因替换步骤(1)所述猪瘟病毒C株感染性克隆中的猪瘟病毒C株Npro蛋白编码基因，然后将EGFP基因插入猪瘟病毒石门株Npro蛋白的第13位和第14位氨基酸之间，获得嵌合标记病毒感染性克隆；(3)将嵌合标记病毒感染性克隆转染细胞，收获病毒，即得。
本发明所述标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP的构建方法中，步骤(1)所述猪瘟病毒C株感染性克隆为pCSFV-HCLV；其构建方法包括：(a)将猪瘟病毒C株感染性克隆pOKHCLV经XhoI和BamHI双酶切的目的片段(6227bp)替换pSM-HCLV5NCR 5′半端的相应片段，获得pBRHCLV-5h；(b)将猪瘟病毒C株感染性克隆pOKHCLV经BamHI 和HindIII双酶切的目的片段(5298bp)替换pSM-HCLV3NCR 3′半端的相应片段，获得pBRHCLV-3h；(c)将pBRHCLV-5h经SalI和BamHI双酶切的目的片段(7558bp)和pBRHCLV-3h经SalI和BamHI双酶切的目的片段(9959bp)连接，即获得pCSFV-HCLV。
步骤(2)所述嵌合标记病毒感染性克隆为pHCLV-Npro(SM)-EGFP，其构建方法包括：(Ⅰ)以猪瘟病毒C株感染性克隆pCSFV-HCLV为骨架，将EGFP基因插入到猪瘟病毒C株Npro蛋白的第13和第14位氨基酸之间，获得pHCLV-EGFP；(Ⅱ)以猪瘟病毒石门株感染性克隆pEGFP-CSFV为模板，用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物进行PCR扩增(扩增包含部分5′-UTR，Npro和EGFP序列的基因)，回收PCR产物；(Ⅲ)将PCR产物插入pHCLV-EGFP中，替换其中的相应区域，即得。其中，所述将EGFP基因插入到猪瘟病毒C株Npro蛋白的第13和第14位氨基酸之间所用的引物为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示引物对1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物对2。
本发明所述标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP的构建方法中，步骤(3)所述细胞为SK6细胞。
本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明首次构建了插入标记基因的C株，并对其体外和体内特性进行了评估。本发明用CSFV强毒石门株Npro基因替换C株Npro基因后再引入EGFP获得的标记猪瘟病毒C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP，稳定表达EGFP基因并且保留了亲本病毒的生物学特性和免疫原性，表明在弱毒活疫苗C株中插入标记抗原是可行性的。本发明证实，CSFV C株能够在Npro蛋白上改造为在家兔体内保持免疫原性的标记C株，这将为进一步开发C株作为标记苗奠定基础。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。
术语“佐剂”意指包括一种或多种物质的组合物，所述物质增强疫苗组合物的抗原性。佐剂可以充当缓慢释放抗原的组织储存，并且还充当非特异性增强免疫应答的淋巴样系统激活。有时，在不存在佐剂的情况下，用单独抗原的初次疫苗接种将无法引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括但不限于完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性物质。
术语“反向遗传操作技术”意指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒DNA分子水平上对其进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究，以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等。
附图说明
图1为表达EGFP的标记C株rHCLV-EGFP(A)和嵌合标记C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP(B)的感染性克隆的构建策略；
图2为表达EGFP的标记C株rHCLV-EGFP的ELISA(A)和免疫荧光(B)检测结果；
图3为表达EGFP的标记C株rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因的RT-PCR结果(A)和Western blotting检测结果(B：抗EGFP抗体；C：抗Npro抗体)，其中对照病毒EGFP-CSFV为表达EGFP的重组CSFV石门株；
图4为表达EGFP的嵌合标记C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP的EGFP荧光(A)，Npro-EGFP基因的RT-PCR结果(B)和Western blotting检测Npro-EGFP蛋白的表达(C：抗Npro抗体；D和E：抗EGFP抗体)，其中对照病毒EGFP-CSFV为表达EGFP的重组CSFV石门株；
图5为表达EGFP的重组C株rHCLV-EGFP和嵌合重组C株rHCLV-Npro(SM)-EGFP的生长曲线；
图6为标记病毒接种家兔后的病毒分离(A)和EGFP基因扩增(B)结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株的构建及其生物学特性和免疫性评价
1、材料和方法
1.1 质粒、细胞和病毒
本发明人实验室此前构建的C株的感染性克隆pOKHCLV(王明杰.猪瘟兔化弱毒疫苗株cDNA分子克隆与嵌合分子克隆的构建.新疆农业大学,2006.)和pSM-HCLV5NCR的5′半端和pSM-HCLV3NCR的3′半端(李超.猪瘟兔化弱毒疫苗株适应家兔的分子基础.中国农业科学院,2013；Li,C.,Li,Y.,Shen,L.,Huang,J.,Sun,Y.,Luo,Y.,Zhao,B.,Wang,C.,Yuan,J.,Qiu,H.J.The role of noncoding regions of classical swine fever virus C-strain in its adaptation to the rabbit.Virus Res.2014,183:117-122.)由本发明人实验室制备和保存。SK6细胞在含5％胎牛血清的DMEM培养基(不含牛病毒性腹泻病毒和牛病毒性腹泻病毒的抗体)中培养，放在含5％CO2的37℃的温箱中。C株也称为中国株或者猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)(GenBank登录号AY805221)，从感染性cDNA克隆拯救出的rHCLV和标记C株均在SK6细胞中培养。CSFV强毒石门株的GenBank登录号为AY775178。
1.2 感染性克隆pHCLV-EGFP和pHCLV-Npro(SM)-EGFP的构建
将pOKHCLV经XhoI和BamHI双酶切后的目的片段(6227bp)替换pSM-HCLV5NCR 5′半端的相应片段，获得pBRHCLV-5h；将pOKHCLV的BamHI-HindIII片段(5298bp)替换pSM-HCLV3NCR 3′半端的相应片段，获得pBRHCLV-3h；最后将pBRHCLV-5h经SalI和BamHI双酶切的目的片段(7558bp)和pBRHCLV-3h经SalI和BamHI双酶切的目的片段(9959bp)连接，获得pCSFV-HCLV，并用多种核酸限制性内切酶分析和测序对获得的pCSFV-HCLV进行鉴定。
以CSFV C株的感染性克隆pCSFV-HCLV为骨架构建标记的C株感染性克隆pHCLV-EGFP(图1A)。步骤包括：用表1中列出的相应引物通过重叠PCR将EGFP基因插入到Npro蛋白氨基酸13和14位点间。然 后，将PCR产物用标准分子克隆技术插入pCSFV-HCLV中获得pHCLV-EGFP，并用多种核酸限制性内切酶酶切和测序对获得的pHCLV-EGFP进行鉴定。
在pHCLV-EGFP基础上构建嵌合标记病毒感染性克隆pHCLV-Npro(SM)-EGFP(图1B)。步骤包括：用表1中所列的相应引物通过PCR将包含部分5′-UTR，Npro和EGFP序列的基因从带有EGFP标签的CSFV石门株感染性克隆pEGFP-CSFV扩增得到(Li,Y.,Shen,L.,Sun,Y.,Yuan,J.,Huang J.,Li,C.,Li,S.,Luo,Y.,Qiu,H.J.A simplified serum-neutralization test based on enhanced green fluorescent protein-tagged classical swine fever virus.J.Clin.Microbiol.2013,51:2710-2712.)。然后，用标准分子克隆技术将PCR产物插入pHCLV-EGFP中来获得pHCLV-Npro(SM)-EGFP，同样用多种核酸限制性内切酶酶切和测序对获得的pHCLV-Npro(SM)-EGFP进行鉴定。
表1本发明中所用的引物
注：下划线标记的是限制性内切酶识别的序列。
1.3 标记CSFV C株的拯救
本发明参照之前报道的方法(Li,C.,et al.,Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system.Arch.Virol.2013,158:901-907.)拯救标记CSFV C株rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP，略有改进。具体方法如下：将4μg pHCLV-EGFP或者pHCLV-Npro(SM)-EGFP转染SK6细胞，然后将细胞进行10次传代。通过荧光显微镜对每代病毒的EGFP荧光进行实时观 察。通过3次冻融收获拯救出来的病毒。用CSFV抗原检测试剂盒检测rHCLV-EGFP或者rHCLV-Npro(SM)-EGFP第1代到第10代Erns蛋白的表达。通过基于E2特异性单克隆抗体6E10的间接免疫荧光试验，检测rHCLV-EGFP或者rHCLV-Npro(SM)-EGFP第6代到第10代E2蛋白的表达(Peng,W.P.,et al.,Identification of a conserved linear B-cell epitope at the N-terminus of the E2glycoprotein of classical swine fever virus by phage-displayed random peptide library.Virus Res.2008,135:267-272.)。
通过RT-PCR从由拯救出的病毒上清中提取的病毒基因组中扩增Npro-EGFP融合基因、E2、NS5B或者其它的基因，并进行测序鉴定。用抗GFP的单克隆抗体(Genscript)或者自制的抗Npro鼠血清检测rHCLV-EGFP或者rHCLV-Npro(SM)-EGFP的Npro-EGFP表达情况。
1.4 rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP的生长曲线
将rHCLV-EGFP、rHCLV-Npro(SM)-EGFP、CSFV C株或rHCLV分别以MOI值为0.1感染量接种培养在24孔板中的SK6细胞，37℃孵育2h后，弃去接种液，更换新的培养液，再将细胞放在含5％CO2的37℃温箱中培养。每12h收获上清，用Reed-Muench方法通过间接免疫荧光试验检测每种病毒的滴度，并用每毫升TCID50表示。实验重复3次，然后计算出平均值和标准偏差。
1.5 家兔体内病毒的接种和攻毒试验
本发明动物实验经过了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物福利委员会批准，其执照为SYXK(黑龙江)2011022。将30只14周龄新西兰白兔随机分为5组，每组6只(表2)。第一组家兔通过耳缘静脉接种rHCLV-EGFP，第二组接种rHCLV-Npro(SM)-EGFP，第三组接种rHCLV，第四组接种C株，第五组接种DMEM。接种之后，每6h记录家兔的直肠温度来监测它们的定型热反应。接种3d后每组随机选择3只进行安乐死。
在病毒接种后3、7和10d采集家兔血清，将采集到的血清样本用CSFV抗体检测试剂盒(IDEXX)检测E2抗体以监测标记C株的免疫原性。剩余的三只家兔通过耳缘静脉用104TCID50C株攻毒。攻毒后3d所用的兔子实施安乐死。家兔脾脏中病毒的RNA拷贝数用实时RT-PCR定量进行检测(Zhang,X.J.,et al.,Development of a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-type and HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea virus 1.Res.Vet.Sci.2012,92:512-518.)。
1.6 病毒基因组的定量
本发明用实时RT-PCR检测家兔脾脏中病毒的RNA水平(Zhang et al.,2012)。具体方法如下：实时RT-PCR用25μl的反应体系，包含3μl cDNA,2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl的dNTP(每个含2.5mM)，1μl的HCLV-F/HCLV-R(10μM)，0.5μl HCLV-JOE(10μM)探针和2U的Hot Star EX Taq polymerase(TaKaRa)。循环条件为95℃预变性5min，95℃变性30s和60℃退火/延伸45s(40个循环)。每个样本的实验进行3个重复。通过标准曲线计算病毒基因组的RNA拷贝数。
2、实验结果
2.1 从cDNA克隆pHCLV-EGFP中拯救出标记病毒rHCLV-EGFP
本发明将重组质粒转染SK6细胞拯救标记病毒rHCLV-EGFP。通过直接观察EGFP的荧光，抗原捕捉ELISA和间接免疫荧光对rHCLV-EGFP进行检测。用pHCLV-EGFP(第1代病毒)转染的细胞表现出零星的EGFP荧光，这表明EGFP可以正确表达。然而，在传代过程中用荧光显微镜没有观察到rHCLV-EGFP第2代到第10代的EGFP荧光。
尽管将病毒进行10次传代之后，未能观察到EGFP的荧光，但ELISA的结果(图2A)和E2蛋白的免疫染色(图2B)证实了不同代次病毒的 存在，这表明本发明获得了标记的活病毒rHCLV-EGFP。
2.2 rHCLV-EGFP的EGFP基因保持完整且没有突变
为了回答为什么rHCLV-EGFP的EGFP没有荧光，本发明首先将第6代到第10代rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因进行RT-PCR扩增并测序。结果表明Npro-EGFP基因和预期的大小一样为1218bp(图3A)，进一步序列分析发现Npro-EGFP基因不存在突变。这些数据证实不同代次rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因没有发生缺失或者突变。
2.3 rHCLV-EGFP的Npro-EGFP以同源二聚体的形式表达
为了进一步分析rHCLV-EGFP的EGFP为什么没有荧光，本发明通过用抗GFP单克隆抗体或者自制的抗Npro鼠血清进行Western blotting检测第10代病毒rHCLV-EGFP的Npro-EGFP基因的表达。尽管用抗GFP单克隆抗体没有检测到Npro-EGFP蛋白信号(图3B)，然而用抗Npro鼠血清发现Npro-EGFP蛋白分子量是预期大小的两倍(图3C)，同时用抗Npro鼠血清检测到rHCLV预期大小的Npro蛋白(图3C)。这个结果表明rHCLV-EGFP的Npro-EGFP蛋白可能在病毒感染的细胞内形成了同源二聚体。
2.4 标记病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP表达了可见荧光的EGFP
为了检测当EGFP与以C株为骨架的CSFV强毒石门株的Npro蛋白融合时，它的荧光是否可以恢复，本发明从重组质粒pHCLV-Npro(SM)-EGFP中拯救出嵌合标记病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP并通过直接观察EGFP、Western blotting和RT-PCR进行了检测。
结果表明：用荧光显微镜可以观察到第5代病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP的EGFP荧光(图4A)；通过RT-PCR扩增到第5代和第10代rHCLV-Npro(SM)-EGFP病毒上清中的Npro-EGFP基因(图4B)，进一步序列分析发现Npro-EGFP基因没有发生突变；通过Western blotting在感染rHCLV-Npro(SM)-EGFP的细胞中分别用针对Npro的抗体 (图4C)和针对EGFP的抗体(图4D)检测到EGFP-Npro融合蛋白，而且Western blotting可以检测到第5代到第10代rHCLV-Npro(SM)-EGFP表达的Npro-EGFP(图4E)。
综上所述，与rHCLV-EGFP的EGFP没有荧光相比，rHCLV-Npro(SM)-EGFP稳定表达了EGFP，并且在感染细胞中可以观察到它的荧光。
本发明将标记病毒rHCLV-Npro(SM)-EGFP提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12039。
2.5 rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP的生长特性与亲本病毒相似
本发明评估了rHCLV-EGFP或者rHCLV-Npro(SM)-EGFP的体外生长特点。尽管拯救的病毒rHCLV的生长能力低于亲本病毒，但rHCLV与rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP却具有相似的生长特性(图5)，这表明不论是EGFP基因直接插入到病毒基因组还是Npro基因被CSFV强毒石门株的Npro替换后再插入EGFP都不影响拯救病毒的生长。
2.6 rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP在家兔体内的生物学特性和免疫原性的检验
为了检验rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP在家兔体内的生物学特性和免疫原性，本发明按表2的设计进行了家兔试验，检测了接种家兔的体温、脾脏中病毒的复制情况和血清中的抗体水平。虽然接种C株或rHCLV的家兔都在接种后24h或36h出现发热，持续18-24h，但标记病毒rHCLV-EGFP却不能够诱导家兔产生定型热反应(表2)。荧光定量RT-PCR结果表明，rHCLV-EGFP和rHCLV-Npro(SM)-EGFP均能在家兔脾脏中复制(表2)。CSFV特异性抗体检测结果证实，免疫rHCLV-EGFP或rHCLV-Npro(SM)-EGFP的家兔在免疫后10d均可以诱导家兔产生高水 平的抗E2抗体(表2)。这些数据表明，与C株相比，rHCLV-EGFP在家兔体内丧失了部分生物学特性，但它和rHCLV-Npro(SM)-EGFP均保持了亲本病毒在家兔体内的免疫原性。
表2标记病毒接种后家兔的定型热反应、病毒脾脏中复制和血清转阳结果
2.7 EGFP基因在体内保持稳定
本发明不仅在家兔脾脏中检测到103拷贝数的标记C株RNA，还在接种标记C株的家兔脾脏中分离到标记病毒(图6A)，而且也能检测到插入的EGFP基因(图6B)，进一步序列分析发现EGFP基因没有发生突变。这些数据表明，标记C株基因组中的EGFP基因在体内是稳定的。

Claims (10)

1.一株表达增强型绿色荧光蛋白的标记猪瘟病毒C株，其特征在于：以猪瘟病毒C株为骨架，用猪瘟病毒石门株Npro蛋白替换猪瘟病毒C株Npro蛋白后，再将EGFP基因插入到猪瘟病毒石门株Npro蛋白的第13位和第14位氨基酸之间。
2.按照权利要求1所述的标记猪瘟病毒C株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC No.12039。
3.权利要求1或2所述的标记猪瘟病毒C株在制备预防猪瘟的标记疫苗中的应用。
4.一种预防猪瘟的疫苗组合物，其特征在于，包括：预防上有效量的权利要求1或2所述标记猪瘟病毒C株。
5.一种权利要求1或2所述标记猪瘟病毒C株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建猪瘟病毒C株感染性克隆；
(2)用猪瘟病毒石门株Npro蛋白编码基因替换步骤(1)所述猪瘟病毒C株感染性克隆中的猪瘟病毒C株Npro蛋白编码基因，然后将EGFP基因插入猪瘟病毒石门株Npro蛋白的第13位和第14位氨基酸之间，获得嵌合标记病毒感染性克隆；
(3)将嵌合标记病毒感染性克隆转染细胞，收获病毒，即得。
6.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述猪瘟病毒C株感染性克隆为pCSFV-HCLV，其构建方法包括：
(a)将猪瘟病毒C株感染性克隆pOKHCLV经XhoI和BamHI双酶切的目的片段替换pSM-HCLV5NCR 5′半端的相应片段，获得pBRHCLV-5h；(b)将猪瘟病毒C株感染性克隆pOKHCLV经BamHI和HindIII双酶切的目的片段替换pSM-HCLV3NCR 3′半端的相应片段，获得pBRHCLV-3h；(c)将pBRHCLV-5h和pBRHCLV-3h分别经SalI和BamHI双酶切，连接相应的目的片段，即得。
7.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述嵌合标记病毒感染性克隆为pHCLV-Npro(SM)-EGFP。
8.按照权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述嵌合标记病毒感染性克隆pHCLV-Npro(SM)-EGFP的构建方法包括：
(Ⅰ)以猪瘟病毒C株感染性克隆pCSFV-HCLV为骨架，将EGFP基因插入到猪瘟病毒C株Npro蛋白的第13位和第14位氨基酸之间，获得pHCLV-EGFP；(Ⅱ)以猪瘟病毒石门株感染性克隆pEGFP-CSFV为模板，用SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示引物进行PCR扩增，回收PCR产物；(Ⅲ)将PCR产物插入pHCLV-EGFP中，即得。
9.按照权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述将EGFP基因插入到猪瘟病毒C株Npro蛋白的第13和第14位氨基酸之间所用的引物为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示的引物对1和SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的引物对2。
10.按照权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述细胞为SK6细胞。
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