CN104017779B - 表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒及其应用，属于表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒的拯救和应用领域。本发明通过重叠PCR方法将萤火虫荧光素酶基因克隆到猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆pBRCISM的N^pro蛋白编码区内，利用基于RNA聚合酶II的反向遗传操作技术拯救了一株稳定表达萤火虫荧光素酶基因的重组病毒CSFV-N^proFluc，其微生物保藏编号为：CGMCC？No.9058。本发明重组猪瘟病毒所携带的荧光素酶基因在连续传代过程中稳定遗传，猪瘟病毒感染性没有发生变化，在抗体效价测定以及高通量筛选猪瘟病毒特异性抑制剂等方面有广泛的应用前景。

Description

表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒及其应用

技术领域

本发明涉及重组猪瘟病毒，尤其涉及一株表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒，本发明还涉及该重组猪瘟病毒在抗体效价测定和筛选猪瘟病毒特异性抑制剂中的应用，属于表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒的拯救和应用领域。

背景技术

猪瘟(classicalswinefever，CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的一种接触性、致死性传染病，以高热和出血为其典型特征，发病率和死亡率极高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病。猪瘟对养猪业危害严重，常造成巨大经济损失，也是中国计划要消灭的重大动物疫病之一。目前，对猪瘟疫情的防控主要是通过对感染猪进行严格扑杀和对周边地区进行消毒防疫。

猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，CSFV基因组为单股正链线性RNA分子，基因组大小为12.3kb，两端分别为5′端非翻译区(untranslatedregion，UTR)和3′端UTR，中间包含一个大的开放阅读框(openreadingframe，ORF)，其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解为11种病毒特异性蛋白，包括4种病毒结构蛋白(C、E^rns、E1和E2)和7种非结构蛋白(N^pro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Moennig,V.,2000.Introductiontoclassicalswinefever:virus,diseaseandcontrolpolicy.Vet.Microbiol.73,93–102.)。

反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选(Beer,M.,Reimann,I.,Hoffmann,B.,Depner,K.,2007.Novelmarkervaccinesagainstclassicalswinefever.Vaccine25,5665–5670.)。例如，携带增强型绿色荧光蛋白的CSFV可用于病毒感染的快速检测和中和抗体效价的测定(Li,Y.,Shen,L.,Sun,Y.,Yuan,J.,Huang,J.,Li,C.,Li,S.,Luo,Y.,Qiu,H.J.,2013.Simplifiedserumneutralizationtestbasedonenhancedgreenfluorescentprotein-taggedclassicalswinefevervirus.J.Clin.Microbiol.51,2710–2712.)。但是，绿色荧光蛋白的检测需要通过借助荧光显微镜进行判断，因此在高通量筛选方面受到了限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是拯救一株能够稳定表达萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase，Fluc)基因的重组CSFV，该稳定表达萤火虫荧光素酶的重组CSFV能够快速检测CSFV的复制并能高通量筛选抗猪瘟病毒因子，解决现有技术中用绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒的检测需要借助荧光显微镜进行判断以至在高通量筛选方面受到限制等问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为：

本发明通过重叠PCR方法将萤火虫荧光素酶基因克隆到猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆pBRCISM的N^pro编码区内第412位碱基和第413位碱基之间(即N^pro蛋白第13位和第14位氨基酸之间)，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-N^proFluc；利用基于RNA聚合酶II的反向遗传操作技术用pBRCISM-N^proFluc拯救出5株携带Fluc基因的重组猪瘟病毒，即：CSFV-N^proFluc、CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4，其中重组病毒CSFV-N^proFluc在所表现出的Fluc活性以及遗传稳定性方面明显优于另外4株重组猪瘟病毒；本发明将性能最为优异的重组猪瘟病毒CSFV-N^proFluc提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9058；分类命名为：表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年4月11日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了拯救携带Fluc基因的重组病毒CSFV-N^proFluc的方法，包括以下步骤：

(1)扩增Fluc基因；

(2)扩增CSFV病毒第215-412位碱基和第413-684位碱基之间的基因片段；

(3)通过重叠PCR将步骤(1)和(2)的扩增片段融合，获得融合片段Fluc-N^pro；

(4)将步骤(3)获得的融合片段Fluc-N^pro克隆至猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆中，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-N^proFluc；

(5)将质粒pBRCISM-N^proFluc转染SK6细胞，将细胞传代后，收获病毒，即得。

其中，步骤(3)中重叠PCR所用引物序列为SEQIDNO.1-6所示；步骤(4)中所用猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆为pBRCISM；步骤(4)中用XhoI和AgeI双酶切融合片段Fluc-N^pro和猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆。

本发明通过间接免疫荧光试验(IFA)和RT-PCR方法均显示重组病毒CSFV-N^proFluc拯救成功。测定病毒生长曲线后发现该重组病毒与亲本病毒Shimen株相比，病毒滴度下降了近10倍。该重组病毒在两种猪源细胞系(PK-15和SK6)上连续传代的过程中，其所携带的Fluc基因并没有发生丢失，且在传代的过程中病毒滴度和表达Fluc基因能力未发生明显变化，证明了该重组病毒的遗传稳定性。

通过在不同时间点检测CSFV-N^proFluc的Fluc活性发现，在感染重组病毒后4.5h检测到CSFVN^pro蛋白的表达。Westernblot检测结果表明，在CSFV-N^proFluc感染SK6细胞12h后，可以检测到预期大小的N^pro-Fluc融合蛋白。随着感染时间的延长，目的蛋白免疫染色的信号强度逐渐增大，同Fluc活性增强的趋势相同。

CSFV基因组为12.3kb，其允许外源基因插入的容量是未知的。本发明插入的Fluc基因(1653bp)片段较大，是EGFP基因(717bp)的两倍多，在CSFV基因组中引入较大基因片段能否成功拯救病毒、乃至所拯救的重组病毒是否保持亲本病毒的特性具有不可预见性。

本发明以相同的方法通过重叠PCR将Fluc-FMDV2A融合基因引入猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆pBRCISM的N^pro蛋白编码序列之前，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-Fluc2A；利用基于RNA聚合酶II的反向遗传操作技术，将pBRCISM-Fluc2A转染SK6细胞，但是未能拯救出重组猪瘟病毒。

本发明以相同的方法通过重叠PCR将Fluc基因引入猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆pBRCISM的NS5A编码序列之中(即NS5A蛋白第3166位和第3167位氨基酸之间)，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-NS5A-Fluc。利用基于RNA聚合酶II的反向遗传操作技术，用pBRCISM-NS5A-Fluc转染SK6细胞，同样也未能拯救出重组猪瘟病毒。

本发明还提供了携带Fluc基因的重组病毒CSFV-N^proFluc在抗体效价测定中的应用。

本发明用该重组病毒对免疫攻毒后的50份猪血清进行了中和试验，结果表明，CSFV-Fluc-NT测定的抗CSFV中和抗体滴度与由IDEXX-ELISA测定的抗体阻断率呈现良好的相关性(R²＝0.9194)，表明CSFV-N^proFluc可以用来定量检测中和抗体。

本发明还提供了携带Fluc基因的重组病毒CSFV-N^proFluc在筛选CSFV特异性抑制剂中的应用。

本发明用该重组病毒测定了12个针对CSFV基因组不同区域的siRNA的干扰效果。结果表明，利用该重组病毒成功的筛选出了3个对CSFV复制具有较强干扰效果的siRNA分子。

与传统的CSFV中和试验(CSFV-wt-NT)相比，CSFV-Fluc-NT具有较多优势。首先，CSFV-Fluc-NT无抗体的孵育和染色程序，从而可以节省时间；其次，CSFV-Fluc-NT中Fluc活性的测定可以在仪器上快速进行，并不需要用目视判定结果的IFA。此外，CSFV-Fluc-NT可以在冷冻储存板(细胞裂解后)储存3d后进行，也可以用于批量分析。本发明拯救的CSFV-N^proFluc适用于高通量筛选抗病毒药物。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“反向遗传操作技术”意指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上对病毒基因组进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究，以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等。

术语“基因组”意指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。

术语“核苷酸序列”意指DNA或RNA中碱基的排列顺序。

术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。

术语“转染”意指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)、半数致死量(LD₅₀)和半数组织感染量(TCID₅₀)。

术语“免疫”意指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。

术语“中和抗体”意指当病原微生物侵入机体时会产生相应的抗体，能够与病原微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止侵入细胞。

术语“抗血清”意指一种含有多克隆抗体的血清。

术语“传代”意指当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。

附图说明

图1为pBRCISM(A)、pBRCISM-N^proFluc(B)、pBRCISM-Fluc2A(C)和pBRCISM-NS5A-Fluc(D)的构建示意图；

图2为CSFV-N^proFluc的Fluc基因表达的动力学；

图3为用RT-PCR检测CSFV-N^proFluc在SK6细胞上连续传代过程中不同代次(P0、P1、P2、P3、P8、P9和P10)病毒基因组中的Fluc-N^pro基因；M1：DL-15,000DNAmarker；P0、P1、P2、P3、P8、P9和P10：CSFV-N^proFluc在传代过程中基因组中的Fluc-N^pro基因的RT-PCR检测；Shimen：亲本病毒Shimen株基因组中的N^pro基因的RT-PCR检测；NT：为阴性对照(Negativecontrol)，即不加RNA模板进行RT-PCR检测；M2：DL-2000DNAmarker；

图4为IFA测定CSFV-N^proFluc在连续传代过程中的病毒滴度；

图5为测定CSFV-N^proFluc在连续传代过程中表达的Fluc活性；

图6为CSFV-N^proFluc的免疫荧光试验检测结果；

图7为CSFV-N^proFluc与亲本病毒Shimen株的生长曲线；*，p＜0.05；

图8为用Westernblot检测N^pro-Fluc融合蛋白的表达；

图9为CSFV-N^proFluc表达Fluc活性的最早时间；**，p＜0.01；***；p＜0.001；

图10为CSFV-Fluc-NT和IDEXX-ELISA检测中和抗体滴度的相关性分析；

图11为CSFV-N^proFluc用于抗病毒siRNA的筛选结果；**，p＜0.01；

图12为CSFV-N^proFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性分析结果；

图13为siRNA对亲本病毒Shimen株的抑制效果验证结果；**，p＜0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

1、实验材料

CSFV石门(Shimen)株(GenBank登录号AF092448.2)和PK-15细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存；SK6细胞由瑞典国家兽医研究所LihongLiu博士惠赠。

包含Fluc基因的质粒pGEM-luc购自Promega公司；pMD18-TSimple载体购自TaKaRa公司；CSFVShimen株的全长感染性克隆pBRCISM由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建和保存。针对CSFVE2蛋白的单克隆抗体和抗N^pro蛋白的血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室制备和保存；抗β-tubulin单克隆抗体和FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。

双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；中和试验所用血清来源于用嵌合载体疫苗rAdV-SFV-E2免疫、用亲本病毒Shimen株攻毒后的试验猪(Sun,Y.,Tian,D.Y.,Li,S.,Meng,Q.L.,Zhao,B.B.,Li,Y.,Li,D.,Ling,L.J.,Liao,Y.J.,Qiu,H.J.,2013.Comprehensiveevaluationoftheadenovirus/alphavirus-repliconchimericvector-basedvaccinerAdV-SFV-E2againstclassicalswinefever.Vaccine31,538–544.)。

实施例1携带Fluc基因的重组CSFV的拯救

1、实验方法

1.1携带Fluc基因的全长感染性克隆的构建

根据pGEM-luc质粒中Fluc基因设计引物N^proFluc-2-F/N^proFluc-2-R(表1)，以该质粒为模板扩增Fluc基因；根据亲本病毒Shimen株全长序列设计引物N^proFluc-1-F/N^proFluc-1-R和N^proFluc-3-F/N^proFluc-3-R(表1)，用这两对引物分别扩增病毒第215-412位碱基和第413-684位碱基之间的基因片段；最后，以N^proFluc-1-F/N^proFluc-3-R为引物，通过重叠PCR获得融合片段Fluc-N^pro，并将此融合片段Fluc-N^pro连至pMD18-TSimple载体进行测序鉴定。

表1引物名称及其序列

将测序正确的Fluc-N^pro片段用XhoI和AgeI进行双酶切并克隆至用相同限制性内切酶处理的pBRCISM载体中，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-N^proFluc。

同时，通过另外两种策略将Fluc-FMDV2A融合基因引入N^pro序列之前或者直接将Fluc基因引入NS5A基因中。其中引入Fluc-FMDV2A融合基因构建方法如下：设计引物FMDV2A-1-F/FMDV2A-1-R、FMDV2A-2-F/FMDV2A-2-R和FMDV2A-3-F/FMDV2A-3-R(表1)。以全长感染性克隆为模板，以FMDV2A-1-F/FMDV2A-1-R和FMDV2A-3-F/FMDV2A-3-R为引物扩增出159-373位之间基因片段；以pGEM-luc质粒为模板，以FMDV2A-2-F/FMDV2A-2-R为引物扩增出包含全长Fluc基因及部分FMDV2A序列的基因片段；以全长感染性克隆为模板以FMDV2A-3-F/FMDV2A-3-R为引物扩增包含部分FMDV2A序列及374-685位之间基因片段；最后以FMDV2A-1-F/FMDV2A-3-R为引物，通过重叠PCR获得Fluc-FMDV2A融合基因，并用XhoI和AgeI进行双酶切并克隆至用相同限制性内切酶处理的pBRCISM载体中，构建出含有Fluc2A融合基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-Fluc2A。

将Fluc基因引入NS5A编码序列中的方法如下：设计引物NS5AFluc-1-F/NS5AFluc-1-R和NS5AFluc-3-F/NS5AFluc-3-R(表1)，以全长感染性克隆为模板，用这两对引物分别扩增第8132-9769位碱基和第9770-10636位碱基之间的基因片段；根据pGEM-luc质粒中Fluc基因设计引物NS5AFluc-2-F/NS5AFluc-2-R(表1)，以该质粒为模板扩增Fluc基因,最后以NS5AFluc-1-F/NS5AFluc-3-R为引物，通过重叠PCR方式获得NS5A-Fluc融合片段，并将测序正确的融合片段用限制性内切酶ApaI单酶切后克隆至经同样酶切处理的pBRCISM载体中，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-NS5A-Fluc。具体构建策略见图1。

1.2重组病毒的拯救

提取pBRCISM-N^proFluc、pBRCISM-Fluc2A和pBRCISM-NS5A-Fluc质粒，用DNA纯化试剂盒纯化。按照X-tremeGENEHPDNA转染试剂说明书将纯化好的质粒转染至生长为70％的SK6细胞的6孔细胞培养板中，转染剂量为3μg。并于转染6h后将细胞培养液换为含4％胎牛血清的DMEM，60h后将细胞传代至5mL小细胞瓶中。将细胞传代5次后，37℃/-80℃反复冻融3次，混合后于3000r/min离心5min，收集病毒。

2、试验结果

经过限制性内切酶分析验证及测序验证，获得携带Fluc基因的全长感染性克隆阳性质粒pBRCISM-N^proFluc、pBRCISM-Fluc2A和pBRCISM-NS5A-Fluc；将质粒pBRCISM-N^proFluc、pBRCISM-Fluc2A和pBRCISM-NS5A-Fluc分别转染SK6细胞后，用pBRCISM-N^proFluc拯救出携带Fluc基因的5株重组CSFV，分别命名为CSFV-N^proFluc、CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4；而用pBRCISM-Fluc2A和pBRCISM-NS5A-Fluc转染SK6细胞后均未能拯救出重组猪瘟病毒。

实施例2重组猪瘟病毒的筛选

1、试验方法

1.1重组病毒的荧光素酶活性分析

用双荧光素酶检测试剂盒检测实施例1拯救的5株重组猪瘟病毒的荧光素酶活性。将SK6细胞接种于24孔细胞培养板中，当细胞生长至80％时，分别用实施例1拯救的5株重组病毒和亲本病毒Shimen株按MOI＝0.1剂量感染SK6细胞，并置于5％CO₂、37℃环境中继续培养。在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h，将细胞培养上清弃掉，并用PBS洗涤细胞1次，然后加入100μL裂解液，在冰上裂解15min后，将细胞裂解液加入含有荧光素酶检测试剂的白板中，立即放入荧光检测仪读数。

1.2重组病毒的遗传稳定性分析

将实施例1拯救的5株重组病毒分别在SK6和PK-15两种细胞上进行10次传代，以检查插入的Fluc基因在病毒基因组中的遗传稳定性。

将上述5株重组猪瘟病毒(定义为P0)以MOI＝0.1剂量感染SK6和PK-15细胞。在感染后72h，收获病毒，并定义为P1，之后将200μLP1代病毒液加入到新鲜SK6和PK-15细胞中培养(定义为P2)。经过10轮类似的传代，提取P0、P1、P2、P3、P8、P9和P10病毒的RNA，并进行RT-PCR扩增Fluc-N^pro基因，以亲本病毒Shimen株作对照。

按照病毒RNA提取说明书(QIAGEN)提取病毒基因组RNA，将病毒基因组RNA用DNaseI处理后作为模板反转录为cDNA，反转录体系为5×AMVbuffer4μL，dNTPs1μL，DTT2μL，RRI0.5μL，随机引物2μL，病毒基因组RNA4μL，DEPC水6μL，反转录酶0.5μL，共20μL。将上述反转录体系常温放置5min，42℃水浴50min，-70℃保存备用。以反转录获得的cDNA作为PCR扩增的模板，利用N^pro引物N^pro-F和N^pro-R(表1)，特异性扩增CSFVN^pro蛋白的完整编码序列。反应总体系为25μL，其中ddH₂O8μL、5×PSBuffer5μL、dNTPs(2.5mM)2μL、上游引物N^pro-F1μL、下游引物N^pro-R1μL、PrimeSTARHSDNAPolymerase0.25μL、cDNA模板3μL。反应循环为：95℃5min；98℃10s，58℃15s，72℃2.5min，循环30次；72℃终延伸10min。

另外，对RT-PCR产物进行测序。

测定上述5株重组猪瘟病毒各代次病毒滴度并将各代次病毒以100TCID₅₀接毒剂量分别感染SK6细胞和PK-15细胞，48h后测定P0-P10代病毒感染SK6和PK-15细胞后的Fluc活性。

2、试验结果

2.1重组病毒的荧光素酶活性分析结果

分别用5株重组病毒和亲本病毒Shimen株按MOI＝0.1剂量感染SK6细胞，并在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h测量Fluc的活性。结果表明，重组病毒CSFV-N^proFluc的Fluc活性最高，在感染后12h，CSFV-N^proFluc的Fluc活性约为亲本病毒Shimen株感染细胞的15倍，而在感染后60h，Fluc活性达到峰值，约为Shimen株感染细胞的5×10⁶倍(图2)。另外4株重组病毒(CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4)在感染后60h，其Fluc活性最高值也仅为Shimen株感染细胞的10^4-5倍。

2.2重组病毒遗传稳定性分析

RT-PCR结果表明，从P0、P1、P2、P3、P8、P9和P10七个代次的重组病毒CSFV-N^proFluc基因组中都可以扩增大小为2151bp的片段(图3)，同样在PK-15中传代的CSFV-N^proFluc的基因组为模板也可扩增到预期大小的片段，而且从亲本病毒Shimen株基因组中只扩增到约0.5kb的片段。另外，通过对RT-PCR产物的测序表明，该Fluc基因在各代CSFV-N^proFluc的基因组中均保持完整性和正确性。而另外4株重组病毒(CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4)在两种细胞系中传代4-5次后，用RT-PCR已不能扩增到预期大小的片段，说明这4株重组猪瘟病毒的遗传稳定性较差。

测定病毒滴度结果表明，CSFV-N^proFluc的病毒滴度在两种细胞系上连续传代的过程中均未发生明显变化，在PK-15细胞上传代的病毒滴度介于10^4.13和10^4.45TCID₅₀/mL之间，在SK6细胞上为10^4.34和10^4.80TCID₅₀/mL之间(图4)；而另外4株重组病毒(CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4)在两种细胞系中传代4-5次后，病毒滴度均明显下降。

Fluc活性测定结果表明，各代次CSFV-N^proFluc感染两种细胞系后(感染剂量为100TCID₅₀)，表达的Fluc活性稳定，PK-15细胞中Fluc活性介于10^5.91和10^6.14之间，比SK6细胞中Fluc活性约低6倍(10^6.34和10^6.81之间)(图5)；而另外4株重组病毒(CSFV-N^proFluc-1、CSFV-N^proFluc-2、CSFV-N^proFluc-3和CSFV-N^proFluc-4)在两种细胞系中传代4-5次后，几乎不能检测到Fluc基因的表达，进一步说明了4株重组猪瘟病毒的遗传稳定性较差。

本发明将Fluc活性高且遗传最为稳定的重组猪瘟病毒CSFV-N^proFluc提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9058。

试验例1重组病毒CSFV-N^proFluc在SK6细胞上生长特性的研究

1、试验方法

1.1间接免疫荧光试验(IFA)

将实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc接种于生长至70％的SK6中，2h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2遍并换为新鲜的含4％胎牛血清的DMEM，在5％CO₂、37℃环境中继续培养，48h后用抗E2单克隆抗体进行IFA试验。

具体操作如下：弃掉培养液，用PBS清洗细胞2遍，然后用冷无水乙醇固定细胞，30min后加入抗E2单克隆抗体，在室温下作用2h后用PBS洗涤细胞5次，并加入1∶90稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，于室温中避光作用1h，用PBS洗涤细胞5次，5min/次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2重组病毒CSFV-N^proFluc滴度的测定

将SK6细胞铺于96孔细胞培养板中，于5％CO₂、37℃的培养箱中过夜，待细胞生长至80％时，将实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc进行10倍系列稀释，接种于96孔细胞培养板中，每个病毒稀释度重复4孔。3h后弃掉病毒稀释液，用PBS洗涤3次，每孔加入含4％胎牛血清的DMEM，于5％CO₂、37℃培养箱中培养48h。用IFA测定病毒的毒价，按照Reed-Münch公式计算，以3次重复试验结果的算术平均值作为该病毒的滴度。

1.3重组病毒CSFV-N^proFluc生长曲线的测定

将实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc和亲本病毒Shimen株分别按每孔MOI＝0.1的感染量接种于生长至单层的SK6细胞，并在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒。将不同时间点收获的病毒分别用IFA测定病毒滴度，并绘制出病毒的生长曲线。

1.4重组病毒CSFV-N^proFluc的蛋白质免疫印迹分析

在SK6细胞感染实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc后12h、24h、36h、48h、60h和72h用Westernblot检测N^pro-Fluc融合蛋白的表达情况，以亲本病毒Shimen株作为对照。

将重组病毒CSFV-N^proFluc和亲本病毒Shimen株感染的SK6细胞用NP-40裂解液(50mMTris，pH8.0；150mMNaCl；0.5％NP-40；0.5mMEDTA)在冰上裂解20min，离心后取上清，将裂解样品进行SDS-PAGE电泳，之后将SDS-PAGE凝胶中的蛋白转至硝酸纤维素膜上，用5％脱脂牛奶封闭1.5h，分别加入抗N^pro血清(1∶400)和抗β-tubulin单克隆抗体(1∶1000)，37℃孵育2h，用PBS洗5次后，加入1∶10000倍稀释的绿色荧光标记的羊抗鼠IgG，37℃作用50min，用PBS洗涤5次，最后用Odyssey红外荧光成像系统扫描并捕获图像。

1.5重组病毒CSFV-N^proFluc表达Fluc活性的最早时间测定

为了确定实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc表达Fluc活性的最早时间，用CSFV-N^proFluc按MOI＝0.1剂量感染SK6细胞，并在感染后0h、1.5h、3h、4.5h、6h、7.5h、9h、10.5h和12h测定Fluc活性。

1.6统计学分析

应用SAS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异；其中*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

2、试验结果

2.1间接免疫荧光试验(IFA)

间接免疫荧光试验证实，重组病毒CSFV-N^proFluc能被猪瘟病毒E2抗体所识别(图6)。

2.2重组病毒滴度的测定

试验结果表明，感染后48h，重组病毒CSFV-N^proFluc的滴度可达10^4.5TCID₅₀/mL。

2.3重组病毒CSFV-N^proFluc生长曲线的测定

比较CSFV-N^proFluc与亲本病毒Shimen株的生长动力学，结果显示，CSFV-N^proFluc滴度的峰值为10⁵TCID₅₀/mL，比Shimen株的滴度(10⁶TCID₅₀/mL)约低10倍(图7)。

2.4重组病毒CSFV-N^proFluc的蛋白质免疫印迹分析

Westernblot检测结果表明，在CSFV-N^proFluc感染SK6细胞12h后，可以检测到预期大小的N^pro-Fluc融合蛋白(图8)，亲本病毒Shimen株感染的细胞中检测到约16kDa的N^pro蛋白；随着感染时间的延长，目的蛋白免疫染色的信号强度逐渐增大，同Fluc活性增强的趋势相同。

2.5重组病毒CSFV-N^proFluc表达Fluc活性的最早时间测定

试验结果表明，Fluc信号在重组病毒感染后4.5h比0h高两倍，且差异显著(p＝0.0098)(图9)。而在感染后10h，用Westernblot仍难以检测到N^pro的表达。以上结果表明，CSFV-N^proFluc以其高敏感性可以作为检测病毒基因表达的有用工具。

试验例2基于萤火虫荧光素酶活性的中和试验

1、试验方法

基于萤火虫荧光素酶活性的中和试验(Flucactivity-basedneutralizationtest，CSFV-Fluc-NT)在96孔细胞培养板中进行。所有血清先在56℃水浴锅中灭活30min，以除去血清中的补体成分。将血清从1∶10起倍比稀释至1∶2560，并加入96孔细胞培养板中，每个梯度重复4次，每孔含稀释血清50μL。将实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc稀释至200TCID₅₀/100μL，并将病毒稀释液50μL加入到含有稀释血清50μL的96孔细胞培养板中进行感作。1h后将病毒血清混合液加入到含单层SK6细胞的96孔细胞培养板中。在5％CO₂、37℃的细胞培养箱中培养。48h后弃去96孔细胞培养板中的细胞培养液，每孔加入20μL细胞裂解液，按照荧光素酶活性分析法进行分析。

为了比较CSFV-Fluc-NT和IDEXX-ELISA检测血清中和抗体的关系，对50份猪血清的中和抗体滴度分别用CSFV-N^proFluc进行滴定和用IDEXX-ELISA检测。

2、试验结果

试验结果表明，CSFV-Fluc-NT测定的抗CSFV中和抗体滴度与由IDEXX-ELISA测定的抗体阻断率呈现良好的相关性(R²＝0.9194)(图10)，表明CSFV-N^proFluc可以用来定量检测中和抗体。

试验例3抗CSFV的siRNA的筛选

1、试验方法

1.1RNA干扰试验

由于SK6细胞不具有干扰素信号通路，为方便今后对CSFV抑制剂的筛选，本实验用PK-15细胞作为抗病毒抑制剂的筛选细胞，设计了12种特异性干扰CSFV基因组编码序列的siRNA分子，分别靶向N^pro、P7、NS5A和NS5B的编码序列，siRNA分子核苷酸序列见表2。

RNA干扰试验在48孔细胞培养板中进行，将100nM的各siRNA分子用X-tremeGENEsiRNA干扰分子转染试剂分别转染长满70％单层的PK-15细胞，6h后换为含2％胎牛血清细胞DMEM，24h后每孔接50TCID₅₀的实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后测定萤火虫荧光素酶活性。

应用SAS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。

表2干扰性RNA分子名称及序列

1.2CSFV-N^proFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性试验

为了进一步验证不同浓度siRNA对CSFV-N^proFluc的抑制效果，本发明分析了四种基因的siRNA(siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在不同浓度的抗病毒效果。具体方法如下：将上述4种siRNA分子用X-tremeGENEsiRNA转染试剂以不同浓度(50nM、100nM和150nM)转染长满70％单层的PK-15细胞的48孔细胞培养板中，每个浓度重复3个孔，6h后换为含2％胎牛血清DMEM，24h后每孔接50TCID₅₀的实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后测定萤火虫荧光素酶活性。以3次重复试验结果的算术平均值作为该孔萤火虫荧光素酶活性。

1.3siRNA对Shimen株的抑制效果试验

为了进一步验证上述siRNA对Shimen株的抑制效果，并对两种病毒的筛选方法进行比较，本发明分析了上述四种基因的siRNA(siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在不同浓度的抗病毒效果。具体方法如下：将上述4种siRNA分子用X-tremeGENEsiRNA转染试剂以不同浓度(50nM、100nM和150nM)转染长满70％单层的PK-15细胞的48孔细胞培养板中，每个浓度重复3个孔，6h后换为含2％胎牛血清DMEM，24h后每孔接50TCID₅₀的亲本病毒Shimen株，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后反复冻融细胞收毒，用IFA测定每孔病毒的滴度，按照Reed-Münch公式计算，以3次重复试验结果的算术平均值作为该孔病毒的滴度。

2、试验结果

2.1RNA干扰试验结果

本发明对针对N^pro、P7、NS5A和NS5B基因的12条CSFV特异性siRNA进行了检测。RNA干扰试验结果表明，在干扰分子浓度为100nM时，Fluc活性降低，尤其是siN^pro-108(p＝0.0011)、siNS5A-239(p＝0.0032)和siNS5B-1234(p＝0.0054)处理的细胞，Fluc活性显著下降(图11)。2.2CSFV-N^proFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性实验结果

试验结果表明，4种siRNA(siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在50nM、100nM和150nM不同浓度均对CSFV-N^proFluc病毒有显著的抑制作用(图12)。对于150nM的siScr处理的细胞,CSFV-N^proFluc的Fluc活性为10^5.59，而150nM的siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理的细胞的Fluc活性分别为10^3.08、10^4.40、10^4.08和10^3.55，与siScr处理细胞相比，Fluc活性分别降低了332、15.8、32.45和113.2倍。

2.3siRNA对Shimen株的抑制效果试验结果

试验结果表明，4种siRNA(siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在50nM、100nM和150nM不同浓度均对亲本病毒Shimen株有显著的抑制作用(图13)。对于150nM的siScr，Shimen株滴度达到10⁴TCID₅₀/mL，与未经siRNA处理的细胞的Shimen株滴度(约10^4.44TCID₅₀/mL)类似，而150nM的siN^pro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理的细胞的Shimen株滴度分别为10^1.09、10^2.38、10^1.87和10^1.54TCID₅₀/mL，与siScr处理细胞的Shimen株的滴度相比，分别降低了870.9、44.3、111.3和313.3倍(图13)。以上结果与Fluc活性测定的结果一致，进一步证实实施例1拯救的重组病毒CSFV-N^proFluc具有用于高通量筛选抗病毒药物的潜力。

Claims (4)

1.一株表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒，其特征在于：其微生物保藏编号为：CGMCCNo.9058。

2.权利要求1所述的重组猪瘟病毒在抗体效价测定中的应用。

3.权利要求1所述的重组猪瘟病毒在筛选猪瘟病毒抑制剂中的应用。

4.权利要求1所述的重组猪瘟病毒在高通量筛选抑制猪瘟病毒复制的药物中的应用。