CN104152476A - 乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，包含乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列，或乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因组cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列。本发明还公开了一种乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，该弱毒株是乙型脑炎病毒弱毒株10S3的克隆毒株，所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，在细胞上拯救出的乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保护，非常有利于乙型脑炎病毒的预防和控制。

Description

乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒及其应用。

背景技术

乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis Virus,JEV）是一种重要的人畜共患病病原，属黄病毒科黄病毒属(Flavivirus)，该属重要成员还包括黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)、登革病毒(Dengue Virus,DENV)和西尼罗河病毒(West nile virus,WNV)等。JEV基因组是一单股正义RNA，有5’帽、无3’多聚腺苷尾，全长约11kb。基因组编码单一长开放阅读框，两侧是5’非编码区(5’-untranslated region,5’-UTR)和3’非编码区(3’-UTR)。单个长开放阅读框翻译产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在翻译中或翻译后裂解成10个蛋白。N端占多聚蛋白长度四分之一的序列编码结构蛋白(C-prM-E)，其余部分是非结构蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)。依据E蛋白基因序列，可将JEV分成五个基因型(genotype)。

JEV由蚊传播，可感染人和马、猪、野生水禽等多种动物。感染人和马，主要呈现脑炎神经症状。人感染发病后，死亡率可高达20%，而幸存者大多留有脑炎后遗症，危害甚重。而猪只不分大小均可感染该病毒，临床可表现出新生仔猪脑炎和种猪繁殖障碍，如流产、死胎和睾丸炎，给养猪业造成重大经济损失。其它动物则表现为隐性感染。猪在JEV循环传播中也起重要作用，猪不仅是中间宿主，还是JEV传播的扩增器。猪感染JEV后，病毒血症持续的时间长，病毒滴度高，吸食猪血的蚊都可被感染成为带毒蚊，从而扩大蚊对JEV的传播。因此，必须加强对猪群中JEV的防治工作。

我国是JEV的主要流行地区，目前除青海未报道外，其他各省市均存在JEV流行，每年JE病例在数千例以上。分子流行病学调查显示，1978年前我国流行的JEV均属基因III型(Genotype III,GIII)，但1978年出现首株基因I(Genotype I,GI)，在随后的20年间我国处于GI和GIII共流行的态势。近年来，我国从脑炎患者、猪、蚊体内分离出多株GI，GI JEV流行呈上升趋势。疫苗接种是预防JE的有效途径。目前，我国普遍给儿童接种JEV疫苗株SA14-14-2，而猪用JEV疫苗株也为SA14-14-2。SA14-14-2是由SA14株致弱而来，同属GIII。研究显示，GIII疫苗诱导抗体，对GI JEV仅具有部分中和能力。因此，需要开发新的兽用疫苗，来预防猪群中JEV的流行。

自上世纪八十年代以来，病毒感染性克隆技术的兴起和发展极大地促进了病毒的研究。由于感染性克隆技术可以直接操作病毒基因组序列，可以根据研究者的目的改变病毒的遗传序列，已逐渐成为研究病毒基因组复制与表达、病毒蛋白的功能、病毒与宿主间的相互作用、构建新型病毒载体和研制新型疫苗的重要平台。但在利用感染性克隆技术研究JEV过程中，存在一大障碍就是JEV基因组cDNA克隆在宿主菌中不稳定，容易产生核苷酸缺失、插入等突变现象，导致病毒的感染性克隆难以建立。

发明内容

本发明要解决目前预防乙型脑炎的GIII疫苗诱导的抗体对GI型JEV仅具有部分中和能力，急需开发新的乙脑兽用疫苗的技术问题，提供一种乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，通过该重组感染性克隆质粒拯救出的感染性JEV病毒，在免疫小鼠后可使小鼠抵抗乙型脑炎病毒GI株的攻击，为动物提供完全的免疫保护，适于开发成乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒疫苗株。

此外，还需要提供一种上述乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒的应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种重组质粒，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一个方面，提供了一种重组质粒，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列内部引入的标记性酶切位点是通过定点突变将该弱毒株10S3的全长基因第9291位碱基C突变成G而引入的SacII酶切位点。

优选的，所述全长基因cDNA序列5’末端还加设有T7启动子；所述全长基因cDNA序列3’末端还加设有丁型肝炎病毒核酶序列（HDVr序列）。

在本发明的另一方面，提供了一种感染性克隆弱毒株，所述感染性克隆弱毒株是通过将上述重组质粒线性化，再将该线性化的全长cDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得的感染性乙型脑炎病毒。

在本发明的另一方面，还提供了一种乙型脑炎病毒弱毒株，所述乙型脑炎病毒弱毒株的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述乙型脑炎病毒弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述感染性克隆弱毒株在制备区分乙型脑炎疫苗免疫毒株与自然感染毒株的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感染毒株的检测试剂盒，包含：针对引入的标记性酶切位点设计的特异性引物、标记性的限制性内切酶。

利用针对引入的标记性酶切位点设计合成的特异性引物，通过RT-PCR及进一步的限制性酶切，可以有效区分出乙型脑炎的感染性克隆疫苗株与自然感染毒株。

优选的，针对引入的位于病毒基因组9287-9292位核苷酸的SacII酶切位点设计特异性引物。

本发明乙型脑炎病毒弱毒株重组感染性克隆质粒，在细胞上拯救出的乙型脑炎病毒感染性克隆弱毒株，不仅在免疫动物后能对动物抵抗乙型脑炎病毒提供完全的免疫保护，而且能有效区分乙型脑炎疫苗免疫动物与乙型脑炎病毒自然感染动物，满足临床上对乙型脑炎病毒疫苗免疫毒株与自然感染毒株的鉴别诊断，非常有利于乙型脑炎病毒的预防和控制，应用前景十分广阔。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2的10S3弱毒株全基因组扩增结果图；

图2是本发明实施例3加T7启动子序列的PCR产物电泳结果图；

图3是本发明实施例3加HDVr序列的PCR产物电泳结果图；

图4是本发明实施例3全长克隆pAHEN构建示意图；

图5是本发明实施例3转录本RNA电泳图；

图6是本发明实施例3的10S3全长感染性克隆线性化转录后在BHK-21细胞上转染及传代结果图；

图7是本发明实施例3的JEV NS3单抗的间接免疫荧光鉴定结果图；

图8是本发明实施例3引物PJEF8791/PJER10965的PCR扩增结果图；

图9是本发明实施例3的SacII酶切结果图；

图10是本发明实施例4的vAHEN和10S3的一步生长曲线比较图；

图11是本发明实施例4的vAHEN和10S3的空斑试验结果图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本发明将猪源JEV GI野毒株HEN0701在BHK-21细胞上连续传代，并经过纯化和筛选获得一株弱毒株10S3株。克隆并测定了弱毒株10S3的全基因组（SEQ ID NO.1），发现其与野毒株存在19处核苷酸变异。然后，本发明利用反向遗传操作技术，采用分段克隆逐一拼接的策略在pBR322载体中构建了弱毒株10S3的全长克隆pAHEN，通过定点突变方法，pAHEN在病毒基因组9291处携带有SacII遗传标记。pAHEN线性化后体外转录出RNA，RNA转染BHK-21细胞，拯救出病毒vAHEN。vAHEN能与JEN NS3特异性单抗结合，通过检测也发现vAHEN携带有SacII遗传标记，该引入的SacII遗传标记在自然流行毒株的基因组中并不存在，它是本发明人工构建的感染性克隆毒株的特有标志，而且本发明的构建既不影响病毒复制和免疫保护效果，又可以用来区分乙型脑炎感染性克隆弱毒株与自然感染毒株。

本发明拯救出的乙型脑炎感染性克隆弱毒株vAHEN，通过一步生长曲线和空斑试验，显示vAHEN与10S3体外生长特征相似。vAHEN通过颅内和皮下接种，均不致死小鼠，呈现弱毒特征。vAHEN接种小鼠，能保护抵抗HEN0701攻击。本发明成功构建出的JEV弱毒株的感染性克隆pAHEN，为利用反向遗传学研究JEV、开发新型感染性克隆弱毒疫苗和构建新型病毒载体等都具有重要意义。

下面通过实施例，具体阐述本发明。

在本发明的下述实施例中，使用的实验材料如下：

病毒和细胞:BHK-21细胞(美国细胞保藏中心ATCC，保藏号为：CCL-10)，乙型脑炎病毒HEN0701株(本实验室保存；发表文章见：郑浩,张建武,袁世山.猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及其E基因分析.中国兽医科学,2009,39(6):476-481)。

质粒与菌株：pBR322，购自Promega；pCR-Blunt II-TOPO购自Invitrogen公司；TOP10感受态购自北京天根。

其他试剂:MEM,GIBCO公司产品；NotI、SacI、XhoI、XmaI和T4DNA连接酶,NEB公司产品；SuperScriptP^TM PII Reverse Transcriptase购自Invitrogen公司；DNA片段小量快速回收试剂盒，北京博大泰克生物基因技术公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit和QIAprep Spin miniprep Kit,QIAGEN公司产品。

在本发明的实施例中，BHK-21细胞的培养方法如下：

BHK-21细胞在含有10%FBS的MEM培养基的T25细胞培养瓶中贴壁长满单层后，弃去细胞培养瓶中培养基，并以PBS洗一次，以0.25%的胰酶将细胞消化下，加入新的含有10%FBS的MEM培养基，以1:8的比例分种于细胞瓶或细胞培养板中。

实施例1乙型脑炎病毒（JEV）HEN0701传代致弱株的筛选

将JEV GI株HEN0701在BHK-21细胞上连续传代100代，并以空斑连续纯化10次，挑选6个克隆毒通过皮下和颅内接种小鼠，筛选弱毒株。具体过程如下：

1.1病毒传代

将35mm细胞培养皿中生长成融合单层的BHK-21细胞，以1mL PBS洗一次，将HEN0701株接种BHK-21细胞。37℃孵育1h后，以1mL PBS洗一次，每平皿加入2.5mL含2%FBS的MEM维持培养液，置于37℃含5%CO₂的培养箱。接种HEN0701的平皿中BHK-21细胞病变达70-80%时，收获细胞上清，分装于1.5mL离心管，冻存于-70℃，该批病毒称之为HEN0701P1。按上述方法，将HEN0701P1以原液0.3mL接种BHK-21细胞，收获病毒称为HEN0701P2。将HEN0701P2接种BHK-21细胞，收获HEN0701P3。如此，将病毒在BHK-21细胞上传代至HEN0701P100。

1.2病毒的空斑纯化

以DMEM将HEN0701P100以1:10稀释至10^-5和10^-6。生长于60mm平皿中的融合单层BHK-21细胞，以PBS洗两次，将10^-5和10^-6的病毒稀释液分别以1mL接种一平皿。37℃孵育1h后，每平皿以3mL DMEM洗二次，加入12mL含1%低熔点琼脂糖和2%FBS的覆盖培养基。于37℃、5%CO₂中培养4d，挑起单个病毒空斑置入0.3mL DMEM中，冻存于-75℃。以上述方法，挑取6个空斑连续纯化10轮，获得6株克隆毒,分别称之为：8S1、8S2、9S1、10S1、10S2和10S3。

1.3对小鼠的致病力

以DMEM培养液将6株克隆毒和HEN0701P1作适当稀释，并添加青霉素-链霉素至100IU/mL，分别以脑内和皮下两种方式接种3w小鼠。传代克隆毒株，分别以0.05mL(含10⁶pfu)脑内接种和0.1mL(含2×10⁶pfu)皮下接种小鼠，各7只；HEN0701以10³pfu脑内接种和2×10⁴pfu皮下接种小鼠，各7只；同时以DMEM0.05mL脑内接种和0.1mL皮下接种7只小鼠作对照。皮下接种小鼠，接种前以接种针穿刺脑膜。接种后观察2w。6株克隆株皮下接种，小鼠全部存活，无伤残。通过脑内接种，8S2和10S3组全部存活，且无伤残；9S1组7只均存活，但其中一只后腿瘫痪；10S1组6只存活，1只死亡，无伤残；10S2组5只存活，2只死亡，存活小鼠中有一只后腿瘫痪；8S1组7只小鼠全部死亡。HEN0701株通过脑内和皮下接种小鼠，3d后开始出现死亡，至11d全部死亡。对照组小鼠脑内和皮下接种，均存活。以上结果显示，经过细胞传代和纯化，6株克隆株都丧失了对3周小鼠的脑外毒力，但仅有8S2和10S3丧失了对3周小鼠的脑内毒力，而8S1、9S1、10S1和10S2保留有脑内毒力。

为了进一步比较8S2和10S3的毒力，以0.1mL病毒液(含2×10⁶pfu)腹部皮下接种8只7d乳鼠，将同窝剩余的3-4只乳鼠接种0.1mL DMEM作对照，接种前以接种针穿刺脑膜。接种后3w，8S2组5只存活，3只死亡；10S3组8只均存活。这表明，10S3比8S2毒力要弱。

实施例210S3全基因组的克隆

根据Genbank中登录号为FJ495189的JEV HEN0701株全基因组序列，设计合成4对引物，分别作为RT和PCR引物。从JEV致弱株10S3感染上清中提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，以其作为PCR模板，利用4对引物进行PCR扩增，获得4个cDNA片段，将4个cDNA片段分别克隆入pCR-Blunt II-TOPO载体中，挑选阳性克隆并测定克隆cDNA序列。利用DNAStar中的SeqMan软件,将测得序列进行拼接，获得全长病毒基因组序列。并用DNAStar中的MegAlign软件将测得的10S3基因组序列与HEN0701进行比对分析。具体过程如下：

2.1引物设计

根据Genbank中登录号为FJ495189的JEV HEN0701株全基因组序列，设计合成4对引物，分别命名为：PJEF1/PJER2913、PJEF2371/PJER5675、PJEF5455/PJER9204、PJEF8791/PJER10965。具体引物序列见下表1：

表110S3全基因组cDNA片段扩增引物

2.210S3全基因组克隆

2.2.1病毒基因组的提取

以10S3感染BHK-21细胞，收获细胞上清。按说明书操作，取140μl上清以QIAamp ViralRNA Mini Kit提取病毒基因组RNA。

2.2.2病毒基因组cDNA的合成

参照SuperScript^TM II Reverse Transcriptase产品说明书,以PJER10965为RT引物,20μl反应体系，包括引物1μl（10μmol/L）,Nuclease-Free Water5μl,dNTP(2.5mM each)2μl,病毒RNA5μl，混匀，65℃水浴5min，随后加入5×First-Strand Buffer4μl、0.1M DTT2μl和1μlSuperScriptTM II RT，混匀，42℃水浴1h。反应结束后70℃水浴15min灭活，合成cDNA保存于-20℃。

2.2.3病毒cDNA的PCR扩增

参照PfuUltra^TM Hotstart High-Fidelity DNA Polymerase产品说明书，以2.2.2中合成的cDNA为模板，全基因组分成四个片段进行扩增，使用的四对引物分别为：PJEF1/PJER2913,PJEF2371/PJER5675,PJEF5455/PJER9204和PJEF8791/PJER10965。每个PCR体系50μl，包括10×PfuUltra HF Reaction Bufffer5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，PfuUltra^TM HotstartHigh-Fidelity DNA Polymerase1.0μl，上、下游引物各1μl（10μmol/L），cDNA2μl，补充水至50μl。按常规PCR条件扩增。

PCR完成后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，获得了大小分别约为2900bp、3300bp、3700bp和2200bp的四条目的片段。图1中，1：DNA分子质量标准DL1500；2：基因组1-2913nt片段；3：基因组2371-5657nt片段；4：基因组5455-9204nt片段；5：基因组8791-10965nt片段。

2.2.4目的片段克隆

以小量DNA片段快速回收试剂盒回收PCR目的条带，具体操作按产品说明书进行。回收的四个DNA片段分别克隆进pCR-Blunt II-TOPO载体，参照说明书，每个反应体系6μl，包括：回收产物4.4μl、Salt solution1μl和pCR-Blunt II-TOPO0.6μl，22℃连接15min，转化TOP10感受态细胞，25℃培养转化菌。以小量质粒快速提取纯化试剂盒提取质粒，并以EcoRI酶切鉴定，获得的四个片段克隆分别称之为pA10SC1、p A10SC2、pA10SC3和pA10SC4。

2.310S3株全基因组序列

将pA10SC1、p A10SC2、pA10SC3和pA10SC4委托上海英骏生物公司进行序列测定，并以DNASTAR中的SeqMan软件，将测得的序列进行拼接，获得了10S3株全基因组序列，全长10965bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。与野毒株HEN0701（FJ495189）相比，10S3基因组不存在核苷酸序列的缺失和插入，但存在19处核苷酸位点的突变，见下表2。

表210S3基因组的19处核苷酸突变位点

427

540

1390

1391

2685

2757

3188

3489

3570

4913

HEN0701

T

T

G

A

G

C

A

T

c

a

10S3-5-6

C

C

A

G

A

T

G

C

t

c

6864

7101

7487

8156

8506

8615

9267

9618

10705

HEN0701

g

a

t

g

a

t

t

t

c

10S3-5-6

a

c

c

a

g

c

a

c

t

实施例3JEV弱毒株10S3全长感染性克隆的构建

设计合成引物，通过PCR方法在10S3基因组5’末端加上T7启动子序列，在3’末端加上丁型肝炎病毒核酶序列（delta hepatitis virus ribozyme,HDVr）序列，并通过定点突变PCR方法，将基因组9291位碱基C突变成G，从而在该位点形成一SacII位点。通过特定酶切位点，将两端经修饰的cDNA片段和中间的2个cDNA片段在pBR322载体中构建出10S3株全长cDNA克隆pAHEN。pAHEN经酶切线性化，体外转录出RNA转染BHK-21细胞，获得感染性病毒，称之为vAHEN。vAHEN感染BHK-21细胞，能被JEV NS3单克隆抗体特异性识别。以PJEF8791/PJER10965扩增的vAHEN cDNA片段，能被SacII切开。具体过程如下：

3.1引物设计

根据10S3基因组序列、T7启动子序列和丁型肝炎核酶(HDVr)序列，设计合成下列表3中的引物。

表3构建10S3全长感染性克隆的引物序列

3.210S3基因组cDNA末端修饰及定点突变

以PJEF1-T7/PJER2913为引物，以pA10SC1为模板，以PCR方法在病毒基因组5’末端加T7启动子序列。PCR体系50μl，包括10×PfuUltra HF Reaction Bufffer5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，PfuUltra^TM Hotstart High-Fidelity DNA Polymerase1.0μl，上、下游引物各1μl（10μmol/L），100倍稀释的pA10SC11μl，补充水至50μl。PCR反应参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸3min，共进行32个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收约3000bp大小的目的条带(图2，图2中，1：DNA分子质量标准DL1500；2：基因组1-2913nt加T7启动子序列片段)，按照2.2.4中方法克隆进pCR-Blunt II-TOPO，转化Top10感受态。以EcoRI筛选阳性克隆，称之为pA10SC1T7。

以PJEF8791为上游引物，分别PJE-HDVr、PHDVR2和PHDVR3为下游引物，通过PCR扩增，在病毒基因组3’末端加HDVr序列。PCR体系50μl，包括10×PfuUltra HF Reaction Bufffer5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，PfuUltraP^TM PHotstart High-Fidelity DNA Polymerase1.0μl，引物PJEF8791/PJE-HDVr各1μl（10μmol/L），100倍稀释的pA10SC41μl，补充水至50μl。PCR参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸2min30s，共进行32个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收约2000bp的目的条带，作为第二轮PCR的模板。第二轮PCR以PJEF8791/PHDVR2为引物，PCR体系与参数不变，扩增获得的目的条带作为第三轮PCR的模板。第三轮PCR以PJEF8791/PHDVR3为引物，扩增出约2000bp目的条带（图3，图3中，1：DNA分子质量标准DL1500；2：基因组8791-10965nt加HDVr序列片段），琼脂糖凝胶电泳回收目的条带并克隆进pCR-Blunt II-TOPO，转化Top10感受态。以EcoRI筛选阳性克隆，称之为pA10SC4HR。

以互补的PJE9291F和PJE9291R为引物，以pA10SC4HR模板，通过PCR定点突变方法将病毒基因组9291位碱基C突变成G，从而在该位点形成一SacII位点。PCR体系50μl，包括10×PfuUltra HF Reaction Bufffer5μl，dNTP(2.5mM each)4μl，PfuUltraP^TM PHotstart High-FidelityDNA Polymerase1.0μl，引物PJEF9291F/PJE9291R各1μl（10μmol/L），10倍稀释的pA10SC41μl，补充水至50μl。PCR参数：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸6min，共进行22个循环；72℃延伸10min。PCR完成后，向管中加入2μl DpnI，37℃作用5h，取8μl反应物转化Top10感受态。提取质粒，以SacII和XbaI作双酶切鉴定，阳性质粒称之为pA10SC4S，并测定了pA10SC4S全序列。

3.3pBR322载体改造

合成一对互补的寡聚核苷酸序列(5’-agctcacgcgtctacctcgagcttgaggatccagtctagaccatgcggccgc-3’(SEQ ID NO.16)和5’-tcgagcggccgcatggtctagactggatcctcaagctcgaggtagacgcgtg-3’(SEQ ID NO.17))，经变性退火后形成双链。以HindIII和SalI酶切pBR322载体，并回收大片段。将寡聚核苷酸双链与大片段连接，获得经修饰pBR322载体，称之为pBR322M，其含有的序列(5’-agctcacgcgtctacctcgagcttgaggatccagtctagaccatgcggccgctcga-3’(SEQ ID NO.18))包含MluI、XhoI、BamHI、XbaI和NotI位点。

3.4全长克隆的构建

全长克隆构建策略如图4所示，具体如下：以XhoI和NotI双酶切pA10SC4S和pBR322M，将pA10SC4S中修饰的病毒cDNA片段移入pBR322M中，获得pBAHENC4；以SacI和NotI双酶切pA10SC3和pBAHENC4，将pA10SC3中病毒cDNA片段移入pBAHENC4中，获得pBAHENC34；再以XmaI和NotI双酶切pA10SC2和pBAHENC34，将pA10SC2中病毒cDNA片段移入pBAHENC34中，获得pBAHENC234；最后以AgeI和NotI双酶切pA10SC1T7和pBAHENC234，将pA10SC1T7中修饰的病毒cDNA片段移入pBAHENC234中，获得全长克隆pAHEN。分别以EcoRV和EcoRI单酶切鉴定pAHEN，出现了预期大小的酶切片段。

3.5体外转录

以MluI酶切2μl pAHEN，37℃酶切过夜。参照说明书，以QIAquick PCR Purification kit回收酶切质粒，获得纯化的线性化质粒。参照说明书方法，以T7mMessage mMachine Kit(Ambion公司)转录纯化的线性化质粒，获得转录本RNA（见图5），冻存于-70℃。

3.6转染

生长于35mm培养皿中的BHK-21细胞，细胞融合达70-85%。以PBS洗2次，参照说明书方法，以DMRIE-C(Invitrogen公司)分别转染3μl和6μl转录本RNA。转染后每天观察，于第四天转染RNA的细胞均出现病变（见图6，图6中，A.RNA转染细胞，B.阴性对照，C.转染细胞上清传1代，D.阴性对照上清传1代）。收获病变细胞上清，冻存于-70℃。将转染获得的病毒称之为vAHEN。将vAHEN在细胞上连传2代，均出现稳定的细胞病变。

3.7间接免疫荧光(IFA)鉴定

将vAHEN和10S3分别作1000倍稀释，接种于35mm培养皿中融合单层BHK-21细胞，并设一35mm细胞培养皿中的BHK-21细胞作为空白对照。感染2d后，以抗JEV NS3单克隆抗体作IFA，具体方法如下：将细胞以PBS洗一次，每平皿加入1ml冰甲醇在-20℃固定10min。以含0.5%的Tween-20的PBS洗两次，每次5min。加入含2%BSA的PBS37℃封闭30min，加入抗JEV NS3的特异性单抗37℃孵育1.5h，PBS洗5次，每次3-5min，再加入FITC标记羊抗鼠的二抗，37℃孵育1h，PBS洗5次后，在荧光显微镜下观察结果。如图7所示，vAHEN和10S3感染细胞均显示荧光，均位于细胞浆中，而空白对照细胞未显示荧光。这表明，JEV NS3的特异性单抗识别vAHEN。图7中，A.vAHEN感染细胞，B.10S3感染细胞，C.空白对照细胞。

3.8vAHEN遗传标记检测

参照2.2中的方法，提取vAHEN和10S3的基因组RNA，并以PJER10965为RT引物合成病毒cDNA。以PJEF8791/PJER10965为引物，进行PCR扩增，PCR结果如图8，图8中，1.DNA Marker DL15000，2.10S3，3.vAHEN，4.空白对照，5.DNA Marker DL2000。回收约2200bp的目的片段，以SacII进行酶切，琼脂糖凝胶电泳结果如图9所示，vAHEN的扩增片段能被SacII所切开，形成两条分别为500bp和1700bp的条带，而10S3的扩增片段不被SacII所酶切，仍呈2200bp的条带，图9中，1.DNA Marker DL15000，2.10S3，3.vAHEN，4.空白对照，5.DNA Marker DL2000。这显示，通过定点突变在全长克隆pAHEN引入的SacII存在于拯救病毒vAHEN中。

实施例4vAHEN的生物特性分析

通过一步生长曲线和空斑试验，揭示了vAHEN与10S3的体外生长特征一致。将vAHEN通过皮下或颅内接种小鼠，不引致死亡或发病，表明vAHEN保持了亲本株10S3的弱毒特征。将vAHEN接种小鼠，可抵抗野毒株HEN0701的攻击。具体过程如下：

4.1一步生长曲线

将vAHEN和亲本弱株10S3以5MOI分别接种35mm平皿的BHK-21细胞。37℃孵育1h后，以DMEM洗二次，每平皿加入3mL2%FBS的MEM。接种后分别于2h,4h,8h,12h,16h,20h,24h,28h,32h,36h取培养上清0.2mL，并补加0.2mL含2%FBS的MEM。收获上清冻存于-75℃，以96孔板中的BHK-21细胞测定不同时间点上清中的病毒TCID₅₀/ml。

病毒TCID₅₀/ml测定方法如下：以含2%FBS的MEM将样品作10倍系列稀释，每个96孔板稀释2个样品；生长于96孔板中的单层BHK-21细胞，弃掉培养液后接种稀释病毒，每个样品接种5个稀释梯度，每个梯度接种8孔，100μl/孔；2列孔接种含2%FBS的MEM作为空白对照。接种后的96孔板置37℃CO₂培养箱中培养5d后观察并记录细胞病变，以Reed-Muench法计算病毒滴度，并以GraphPad Prism软件绘制病毒的生长曲线。

生长曲线如图10，在对数生长期vAHEN的生长速度与10S3的相同，只是在24h和28h时vAHEN稍低，但随后二者又接近。这表明vAHEN和10S3在细胞上生长速度相近。

4.2空斑试验

将vAHEN和10S3作10倍系列稀释至10^-5，分别取10^-3、10^-4和10^-5稀释病毒液200μl接种6孔板中的BHK-21细胞单层。37℃吸附1h后，以PBS将细胞洗涤二次，每孔加入5ml覆盖培养基（含2%FBS和1%琼脂糖）。在CO₂培养箱中培养4天后，以5%的结晶紫染色。空斑结果如图11，vAHEN所致空斑与10S3所致空斑大小相近。

4.3vAHEN对小鼠的毒力

参照1.3中方法，将vAHEN以10⁶pfu颅内接种3周龄小鼠7只，以2×10⁶pfu皮下接种3周龄小鼠7只，接种后观察3周。vAHEN接种小鼠均未出现发病或死亡，与对照小鼠无差异。这表明vAHEN不具有脑内神经毒力和脑外神经侵袭力。

4.4vAHEN对小鼠的免疫保护

将vAHEN以0.1ml(含2×10⁵pfu)皮下接种3周龄小鼠10只，另一组10只接种含2%FBS的MEM作对照。接种后2周，以200LD₅₀的HEN0701通过皮下接种小鼠，并于种前以接种针穿刺脑膜。接种后观察三周。vAHEN接种小鼠，全部存活。对照小鼠攻毒后，10只仅存活1只，9只死亡。这表明vAHEN接种后可抵抗HEN0701攻击。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种重组质粒，其特征在于，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种重组质粒，其特征在于，包含：乙型脑炎病毒弱毒株10S3的全长基因cDNA序列内部引入标记性酶切位点的全长cDNA序列，该弱毒株10S3的全长基因cDNA序列如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述弱毒株10S3的全长基因cDNA序列内部引入的标记性酶切位点是通过定点突变将该弱毒株10S3的全长基因第9291位碱基C突变成G而引入的SacII酶切位点。

4.一种感染性克隆弱毒株，其特征在于，所述感染性克隆弱毒株是通过将权利要求1所述重组质粒线性化，再将该线性化的全长cDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得的感染性乙型脑炎病毒。

5.一种感染性克隆弱毒株，其特征在于，所述感染性克隆弱毒株是通过将权利要求2所述重组质粒线性化，再将该线性化的全长cDNA体外转录成RNA后转染细胞而获得的感染性乙型脑炎病毒。

6.一种乙型脑炎病毒弱毒株，其特征在于，所述乙型脑炎病毒弱毒株的全长基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

7.权利要求4或5所述的感染性克隆弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。

8.权利要求6所述的乙型脑炎病毒弱毒株在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。

9.权利要求5所述的感染性克隆弱毒株在制备区分乙型脑炎感染性克隆弱毒株与自然感染毒株的产品中的应用。

10.一种区分乙型脑炎的感染性克隆弱毒株与自然感染毒株的检测试剂盒，其特征在于，包含：针对引入的标记性酶切位点设计的特异性引物、标记性的限制性内切酶。