PT2540312E - Vlps quiméricas de gripe aviária - Google Patents

Vlps quiméricas de gripe aviária Download PDF

Info

Publication number
PT2540312E
PT2540312E PT121857122T PT12185712T PT2540312E PT 2540312 E PT2540312 E PT 2540312E PT 121857122 T PT121857122 T PT 121857122T PT 12185712 T PT12185712 T PT 12185712T PT 2540312 E PT2540312 E PT 2540312E
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
influenza
protein
vlps
proteins
virus
Prior art date
Application number
PT121857122T
Other languages
English (en)
Inventor
Gale Smith
Peter Pushko
Original Assignee
Novavax Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novavax Inc filed Critical Novavax Inc
Publication of PT2540312E publication Critical patent/PT2540312E/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/6072—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
    • C12N2810/609—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses positive strand RNA viruses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

DESCRIÇÃO
VLPS QUIMÉRICAS DE GRIPE AVIARIA ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 vírus da gripe é um membro da família Orthomyxoviridae (para revisão, veja-se Murphy e Webster, 1996). Existem três subtipos de vírus da gripe designados A, B, e C. 0 virião da gripe contém um genoma de ARN de sentido negativo segmentado. 0 virião da gripe inclui as seguintes proteínas: hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), matriz (Ml), proteína de canais de iões de protões (M2), nucleoproteína (NP), proteína básica de polimerase 1 (PBl), proteína básica de polimerase 2 (PB2), proteína ácida de polimerase (PA), e proteína não estrutural 2 (NS2) . A HA, NA, Ml, e M2 estão associadas à membrana, enquanto a NP, PBl, PB2, PA, e NS2 são proteínas associadas à nucleocápside. A NS1 é a única proteína não estrutural que não está associada com partículas de virião mas é especifica para células infetadas com gripe. A proteína Ml é a proteína mais abundante nas partículas da gripe. As proteínas HA e NA são glicoproteínas do envelope, responsáveis pela ligação do vírus e penetração das partículas virais na célula, e as fontes dos epitopos principais imunodominantes para a neutralização virai e imunidade protetora. Ambas as proteínas HA e NA são consideradas os componentes mais importantes para as vacinas profiláticas contra a gripe porque são altamente imunogénicas.
Até à data, todas as vacinas contra a gripe comercialmente disponíveis para estirpes não pandémicas nos Estados Unidos foram propagadas em ovos embrionados de galinha. Embora o vírus da gripe cresça bem em ovos de galinha, a produção da vacina é dependente da disponibilidade de ovos. Os fornecimentos de ovos devem ser organizados, e as estirpes para a produção de vacinas selecionadas com meses de antecedência da próxima temporada de gripe, limitando a flexibilidade da sua abordagem, e resultando normalmente em atrasos e escassez na produção e distribuição. Infelizmente, algumas estirpes do vírus da gripe, não se replicam bem em ovos embrionados de galinha, e têm de ser isolados através de cultura celular num procedimento dispendioso e moroso.
Também foram desenvolvidos nos últimos anos sistemas para produção de vírus da gripe em cultura celular (veja-se, por exemplo, Furminger. Vaccine Production, em Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza pp. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, in Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151). Tipicamente, estes métodos envolvem a infeção de células hospedeiras imortalizadas adequadas com uma estirpe selecionada de vírus. Enquanto eliminam muitas das dificuldades relacionadas com a produção de vacinas em ovos de galinha, nem todas as estirpes patogénicas de gripe crescem bem ou podem ser produzidas de acordo com métodos de culturas de tecidos estabelecidos. Adicionalmente, muitas estirpes com características desejáveis, por exemplo, atenuação, sensibilidade à temperatura e adaptação ao frio, adequadas para a produção de vacinas vivas atenuadas, não foram cultivadas com sucesso em cultura de tecidos utilizando os métodos estabelecidos. Adicionalmente, os vírus vivos atenuados não foram aceites pelo público geral devido a receios de reversão numa estirpe virulenta.
As partículas idênticas a vírus imitam a estrutura geral de uma partícula virai sem a necessidade de conterem material infecioso. As VLPs carecem de um genoma de ADN ou ARN virai, mas retêm a estrutura tridimensional de um vírus autêntico. As VLPS possuem a capacidade de estimular respostas mediadas por células B, respostas proliferativas de CD4 e respostas de linfócitos T citotóxicos (veja-se, Schirmbeck et al. (1996) Eur. J. Immunol., 26, 2812-2822) .
Adicionalmente, as partículas idênticas a vírus induzem respostas de células T restringidas a MHC de classe I. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção compreende um método de aumentar a eficiência da produção de VLP de gripe que compreende expressar uma Ml de gripe aviária e HA de gripe sazonal e proteínas NA numa célula hospedeira. A proteína Ml de gripe aviária é uma proteína Ml de gripe A/Indonesia/5/05. A dita HA ou NA pode ter atividade de hemaglut inina e neuraminidase, respetivamente. 0 presente pedido também descreve uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita proteína de gripe não aviária é HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita proteína de gripe não aviária é uma proteína de gripe sazonal. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA tem atividade de hemaglut inina ou neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares da HA e/ou NA de gripe aviária ou heteróloga. Noutra forma de realização, a dita proteína de gripe não aviária é a partir de um agente infecioso. 0 presente pedido também descreve uma formulação antigénica que compreende uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA são proteínas quiméricas. 0 presente pedido também descreve vacinas que compreendem uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de qripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA são proteínas quiméricas. 0 presente pedido também descreve um método de indução da imunidade num vertebrado que compreende administrar ao dito vertebrado uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita resposta imunitária é uma resposta imunitária humoral. Numa forma de realização, a dita resposta imunitária é uma resposta imunitária celular. 0 presente pedido também descreve um método de prevenção e/ou redução de uma infeção virai ou sintoma da mesma, que compreende administrar a um vertebrado uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. 0 presente pedido também descreve um método de redução da gravidade da gripe numa população, que compreende administrar a VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária a suficientes indivíduos na dita população de modo a prevenir ou diminuir a probabilidade de transmissão do vírus da gripe a outro indivíduo na dita população.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 ilustra um gel de SDS-PAGE corado derivado a partir de VLPs fabricadas a partir de diferentes construções após isolamento a partir de um gradiente de sacarose. A Figura 2 ilustra um western blot corado derivado a partir de VLPs fabricadas a partir de diferentes construções após isolamento a partir de um gradiente de sacarose. A Figura 3 é um gel de SDS-PAGE derivado a partir de VLPs fabricadas a partir de híbridos ou de tipo selvagem de Ml de A/Indonesia/5/05 e HA e NA de A/Fujian/411/2002. A Figura 4 ilustra um western blot corado derivado a partir de VLPs fabricadas a partir de híbridos ou de tipo selvagem de Ml de A/Indonesia/5/05 e HA e NA de A/Fujian/411/2002. A Figura 5 ilustra a sequência de aminoácidos da proteína S de SARS com o domínio terminal carboxilo e transmembranar de HA de Indonesia H5N1 (sublinhado). A Figura 6 ilustra a sequência de aminoácidos da proteína Ml de Indonesia H5N1. A Figura 7 ilustra o vetor pFastBac 1 que contém as sequências codificantes para SARS S com o domínio TM/CT de HA de Indonesia H5N1 e a proteína Ml de Indonesia H5N1. A Figura 8 ilustra as VLPs quiméricas S de SARS /Ml de Indo purificadas. A Pista 1 é a coloração com azul de Coomassie. A Pista 2 é um western blot, painel superior: anti SARS S; painel inferior: anti Ml de gripe. A Figura 9 ilustra VLPs de SARS de tipo selvagem purificadas compostas pelas proteínas S, M e E de SARS. A) Coloração com azul de Coomassie; B) Western blot, painel superior: anti SARS S; painel inferior: anti SARS M. A Figura 10 ilustra o resultado da análise do tamanho de partículas para VLPs quiméricas S de SARS /Ml de Indo com Malvern Zetasizer. A Figura 11A-C ilustra a coloração negativa de microscopia eletrónica (ME) para VLPs quiméricas S de SARS /Ml de Indo. A) Imagem de ME para o controlo de tampão; B) Imagens de ME selecionadas para VLPs; C) Imagens de ME selecionadas para VLPs em magnitude mais elevada. A Figura 12A-C ilustra imagens de ME publicadas para SARS-CoV e coronavirus. A Figura 13 ilustra construções de expressão para a produção de VLPs de B/Florida/4/06 em células Sf9 de inseto. É apresentada a localização dos genes de HA, NA, e Ml, bem como as localizações do promotor poliedrina. Também são apresentadas as construções para expressão individual dos genes de HA e NA para propósitos de reagente. A Figura 14 ilustra os níveis de expressão de VLPs de gripe B/Florida/4/06 através da coloração de Coomassie (painel da esquerda) e ensaios de HA/NA (painel da direita) . Pista 1. Amostra de VLPs de B/Florida/4/06 contendo Ml de B/Florida/4/06, Pista 2. Amostra de VLPs de B/Florida/4/06 contendo Ml de B/Ann Arbor/1/1986, Pista 3 Amostra de VLPs de B/Florida/4/06 contendo Ml de A/Indonesia/5/05 (H5N1). Os painéis da direita mostram a atividade de HA e NA através dos ensaios de atividade enzimática de hemaglutinina e neuraminidase. A Figura 15 ilustra a microscopia eletrónica de VLPs purificadas. Microscopia eletrónica de transmissão de coloração negativa de VLPs de gripe B/Florida/4/06 contendo Ml a partir de A/Indonesia/5/05 (H5N1) (esquerda), B/Ann Arbor/1/1986 (centro), e B/Florida/4/06 (direita).
DESCRIÇÃO DETALHADA
Conforme utilizado no presente documento, o termo "formulação antigénica" ou "composição antigénica" refere- se a uma preparação que, quando administrada a um vertebrado, especialmente uma ave ou um mamífero, induzirá uma resposta imunitária.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "adjuvant" refere-se a um composto que, quando utilizado em combinação com um imunogénio específico (por exemplo, uma VLP) numa formulação, aumenta, ou de outra forma, modifica a resposta imunitária resultante. A modificação da resposta imunitária inclui a intensificação ou ampliação da especificidade de um ou ambos um anticorpo e respostas imunitárias celulares. A modificação da resposta imunitária pode também significar a diminuição ou supressão de determinadas respostas específicas de antigénio.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "vírus da gripe aviária" refere-se a vírus da gripe encontrados principalmente em aves mas que também podem infetar seres humanos ou outros animais. Em alguns casos, os vírus da gripe aviária podem ser transmitidos ou espalhados a partir de um ser humano para outro. Um vírus da gripe aviária que infeta seres humanos possui o potencial para causar uma pandemia de gripe, isto é, morbilidade e/ou mortalidade em seres humanos. Uma pandemia ocorre quando uma nova estirpe de vírus da gripe (um vírus para o qual os seres humanos não possuem imunidade natural) emerge, difundindo-se além das localidades individuais, possivelmente por todo o mundo, e infetando muitos seres humanos de uma só vez.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "proteína quimérica" refere-se a construções que ligam pelo menos duas proteínas heterólogas numa macromolécula única (proteína de fusão).
Conforme utilizado no presente documento, o termo "VLP quimérica" refere-se a uma partícula idêntica a vírus que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína, ou porção da mesma, que não procede de um vírus de gripe aviária.
Conforme utilizado no presente documento, uma "dose eficaz" refere-se geralmente a uma quantidade da VLP da invenção suficiente para induzir imunidade, para prevenir e/ou atenuar a infeção pelo vírus da gripe ou para reduzir pelo menos um sintoma da infeção por gripe e/ou para melhorar a eficácia de outra dose de uma VLP. Uma dose eficaz pode referir-se à quantidade da VLP suficiente para atrasar ou minimizar o inicio de uma infeção por gripe. Uma dose eficaz também pode referir-se à quantidade da VLP que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou gestão da infeção por gripe. Além disso, uma dose eficaz é a quantidade em relação às VLPs da invenção isoladamente, ou em combinação com outras terapêuticas, que proporciona um benefício terapêutico no tratamento ou gestão de uma infeção virai por gripe. Uma dose eficaz também pode ser a quantidade suficiente para melhorar a própria resposta imunitária de um sujeito (por exemplo, um ser humano) contra uma exposição subsequente ao vírus da gripe. Os níveis de imunidade podem ser monitorizados, por exemplo, através da medição das quantidades de anticorpos séricos e/ou secretores neutralizantes, por exemplo, através de neutralização em placa, fixação de complemento, ensaio de imunoabsorção enzimática ou de neutralização. No caso de uma vacina, uma "dose eficaz" é uma que previne a doença ou reduz a gravidade dos sintomas.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "domínio externo", quando se refere a proteínas associadas à membrana, refere-se ao (s) domínio(s) da proteína que são externos à célula e/ou citosol e/ou a um lúmen. 0 domínio externo de uma proteína também é conhecido como um ectodomínio.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "VLP de gripe" refere-se a uma VLP que compreende pelo menos uma proteína de gripe. As ditas VLPs podem compreendem proteínas de gripe e/ou não de gripe.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "atividade de hemaglutinina" refere-se à capacidade de proteínas, VLPs, ou porções das mesmas gue contêm HA, para ligar e aglutinar glóbulos vermelhos (eritrócitos).
Conforme utilizado no presente documento, o termo "atividade de neuraminidase" refere-se à atividade enzimática de proteínas, VLPs, ou porções das mesmas gue contêm NA, para clivar resíduos de ácido siálico incluindo proteínas tais como fetuína.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "agente infecioso" refere-se a microrganismos gue causam uma infeção num vertebrado. Normalmente, os organismos são vírus, bactérias, parasitas e/ou fungos. 0 termo também se refere a variações antigénicas diferentes do mesmo agente infecioso.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "estimulador imunitário" refere-se a um composto gue melhora uma resposta imunitária através dos próprios mensageiros químicos do corpo (citocinas) . Estas moléculas compreendem várias citocinas, linfocinas e guimiocinas com atividades imunoestimuladoras, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator de estimulação de colónias (CSF) de granulócitos-macrófagos (GM)); e outras moléculas imunoestimuladoras, tais como fator inflamatório de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas estimuladoras da imunidade podem ser administradas na mesma formulação gue as VLPs de gripe, ou podem ser administradas separadamente. Tanto a proteína como um vetor de expressão codificante da proteína podem ser administrados para produzir um efeito imunoestimulador.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "imunidade" refere-se à indução do sistema imunitário de um vertebrado em que a dita indução resulta na prevenção, melhoria, e/ou redução de pelo menos um sintoma de uma infeção no dito vertebrado. Imunidade também se pode referir a um titulo de inibição da hemaglutinação (IH) de > 40 quando as VLPs da invenção foram administradas a um vertebrado e as ditas VLPs induziram uma resposta imunitária contra uma HA de um vírus da gripe.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "proteína de gripe não aviária" refere-se a uma proteína que é heteróloga a um vírus da gripe aviária. A dita proteína de gripe não aviária pode ser expressa de forma recombinante a partir de um vetor de expressão e pode ser heteróloga com o vetor de expressão.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "vírus da gripe sazonal" refere-se às estirpes virais da gripe que foram determinadas como passando entre a população humana para uma determinada temporada de gripe com base em inquéritos epidemiológicos realizados por Centros Nacionais de Gripe em todo o mundo. Estes estudos epidemiológicos, e alguns vírus da gripe isolados, são enviados para um dos quatro laboratórios de referência da Organização Mundial da Saúde (OMS), um dos quais se encontra nos Centros de Controlo e Prevenção de Doenças (CDC) em Atlanta para testes detalhados. Estes laboratórios testam o quão bem os anticorpos fabricados para a vacina atual reagem ao vírus circulante e novos vírus da gripe. Esta informação, juntamente com informação sobre a atividade da gripe, é resumida e apresentada a um comité assessor da Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos e numa reunião da OMS. Estas reuniões resultam na seleção de três vírus (dois subtipos de vírus da gripe A e um vírus da gripe B) para entrarem em vacinas contra a gripe para o seguinte outono e inverno. A seleção ocorre em fevereiro para o hemisfério norte e em setembro para o hemisfério sul. Normalmente, uma ou duas das três estirpes de vírus na vacina altera-se cada ano.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "vacina" refere-se a uma preparação de agentes patogénicos mortos ou enfraquecidos, ou de determinantes antigénicos derivados que é utilizada para induzir a formação de anticorpos ou imunidade contra o agente patogénico. A vacina é administrada para proporcionar imunidade à doença, por exemplo, à gripe, que é causada pelos vírus da gripe. Adicionalmente, o termo "vacina" também se refere a uma suspensão ou solução de um imunogénio (por exemplo, VLP) que é administrado a um vertebrado para produzir imunidade protetora, isto é, imunidade que impede ou reduz a gravidade da doença associada com a infeção. A presente invenção proporciona composições de vacina que são imunogénicas e podem proporcionar proteção contra uma doença associada com a infeção.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "vertebrado" ou "sujeito" ou "paciente" refere-se a qualquer membro do subfilo cordata, incluindo, sem limitação, seres humanos e outros primatas, incluindo primatas não humanos tais como chimpanzés e outras espécies de macacos e símios. Animais pecuários, como bovinos, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; mamíferos domésticos tais como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores tais como ratinhos, ratos e porquinhos-da-índia; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça tais como galinhas, perus e outras aves galináceas, patos, gansos e semelhantes também são exemplos não limitantes. Os termos "mamíferos" e "animais" estão incluídos nesta definição. Ambos os indivíduos adultos como recém-nascidos destinam-se a estar cobertos.
Conforme utilizado no presente documento, o termo "partícula idêntica a vírus" (VLP) refere-se a uma estrutura na qual pelo menos um atributo se assemelha a um vírus, mas que não foi demonstrada como sendo infeciosa. As partículas idênticas a vírus de acordo com a invenção não carregam informação genética que codifica as proteínas das partículas idênticas a vírus. No geral, as partículas idênticas a vírus não possuem um genoma virai e, portanto, não são infeciosas. Adicionalmente, as partículas idênticas a vírus podem, muitas vezes, ser produzidas em grandes quantidades através da expressão heteróloga e podem ser facilmente purificadas. VLPs da invenção e métodos de fabrico de VLPs
No geral, as partículas idênticas a vírus (VLPs) carecem de um genoma virai e, portanto, não são infeciosas. Adicionalmente, as partículas idênticas a vírus podem, muitas vezes, ser produzidas através de expressão heteróloga e podem ser facilmente purificadas. A maioria das VLPs compreende pelo menos uma proteína de núcleo virai. Esta proteína de núcleo geralmente conduz à gemulação e libertação de partículas a partir de uma célula hospedeira. Exemplos de tais proteínas compreendem M de RSV, Ml de gripe, gag de VIH e proteína M do vírus da estomatite vesicular (VSV) . No geral, as VLPs são úteis para a preparação de formulações antigénicas e/ou vacinas contra agentes infeciosos, por exemplo, gripe.
No entanto, a produção de VLP não foi particularmente eficiente. Um objetivo da produção de VLP consiste na otimização das condições de cultura para se obter a maior produtividade possível. Até mesmo os aumentos incrementais na produtividade podem ser economicamente significativos e podem salvar vidas. Os inventores da presente invenção descobriram inesperadamente que a expressão de Ml aviária numa célula hospedeira aumenta significativamente a produção de VLPs a partir de células hospedeiras.
Assim, a invenção descrita no presente documento compreende métodos de produção de VLPs quiméricas que compreendem uma proteína Ml de gripe aviária A/Indonesia/5/05 e HA e/ou NA de gripe sazonal. Numa forma de realização, a dita gripe sazonal de HA ou NA são A/Wisconsin/67/2005 e/ou A/Fujian/411/02 . Noutra forma de realização, a dita HA ou NA tem atividade de hemaglutinina ou neuraminidase, respetivamente.
As VLPs quiméricas são úteis para a preparação de vacinas e composições imunogénicas. Uma característica importante das ditas VLPs quiméricas é a capacidade de expressar proteínas sobre a superfície das ditas VLPs de modo a que o sistema imunitário de um vertebrado possa induzir uma resposta imunitária contra a dita proteína. No entanto, nem todas as proteínas podem ser expressas na superfície das VLPs. Pode haver muitas razões pelas quais certas proteínas não são expressas, ou fracamente expressas, sobre a superfície de VLPs. Uma razão é que a dita proteína não é dirigida para a membrana de uma célula hospedeira ou que a dita proteína não tem um domínio transmembranar. As sequências perto do terminal carboxilo da hemaglutinina da gripe podem ser importantes para a incorporação de HA à bicamada lipídica de nucleocápsides com envelope de gripe maduras e para a montagem da interação do trímero de HA com a proteína de núcleo da gripe Ml (Ali et al., (2000) J. Virol. 74, 8709-19) . Assim, um método para ultrapassar a incapacidade de expressar proteínas de influenza não aviária sobre a superfície de VLPs, e/ou aumentar a expressão das ditas proteínas, consiste em fundir os domínios citoplasmáticos e/ou transmembranares de HA e/ou NA de gripe com uma proteína de gripe não aviária criando, assim, uma proteína quimérica.
Deste modo, descrevem-se no presente documento VLPs quiméricas que compreendem pelo menos uma proteína quimérica. A dita proteína quimérica pode compreender pelo menos um domínio externo (ectodomínio) de sequências de proteína HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos de uma HA e/ou NA heteróloga. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA de domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos heterólogos são a partir de vírus da gripe sazonal e/ou gripe aviária. Noutra forma de Realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir de uma estirpe de gripe sazonal A/Wisconsin/67/2005 e os domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos de HA e/ou NA são a partir de uma estirpe de gripe aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Fujian/411/02 os domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos de HA e/ou NA são a partir de uma estirpe de gripe aviária. Os ditos domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos de HA e/ou NA a partir de gripe aviária podem ser derivados a partir do grupo que consiste no vírus da gripe H9N2 e/ou vírus da gripe H5N1. A dita HA e/ou NA a partir da estirpe de gripe H9N2 pode ser isolada a partir de qualquer um dos vírus da gripe a partir do grupo que consiste em A/quail/Hong Kong/Gl/97, A/Hong Kong/1073/99, A/Hong Kong/2108/03, Duck/HK/Y280/97, CK/HK/G9/97, Gf/HK/SSP607/03, Ph/HK/CSWl323/03, WDk/ST/4808/01, CK/HK/NT142/03, CK/HK/WF12 6/03, SCk/HK/WF285/03, CK/HK/YU463/03, CK/HK/YU577/03, SCk/HK/YU663/03, Ck/HK/CSWl61/03, e GF/HK/NT101/03. Numa forma de realização, a dita estirpe de gripe H9N2 é A/Hong Kong/1073/99. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA a partir da estirpe de gripe H5N1 pode ser a partir do ciado 1 e/ou ciado 2. Noutra forma de realização, a dita H5N1 é a partir do ciado 1. Noutra forma de realização, a dita H5N1 é a partir do ciado 2. Noutra forma de realização, a dita H5N1 é selecionada a partir do grupo que consiste em A/Vietnam/1194/04, A/Vietnam/1203/04, A/Hongkong/213/03, A/Indonesia/2/2005, A/Bar headed goose/Quinghai/1A/2005, A/Anhui/1/2005, e A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita estirpe de H5N1 é A/Indonesia/5/05.
As VLPs quiméricas descritas no presente documento compreendem uma proteína Ml de gripe aviária. A dita proteína Ml pode ser derivada a partir da estirpe de gripe H9N2 ou H5N1. A dita Ml de gripe de H9N2 pode ser isolada a partir de qualquer um dos vírus da gripe a partir do grupo que consiste em A/quail/Hong Kong/Gl/97, A/Hong Kong/1073/99, A/Hong Kong/2108/03, Duck/HK/Y280/97, CK/HK/G9/97, Gf/HK/SSP 607/03, Ph/HK/CSWl323/03, WDk/ST/4 8 0 8/01, CK/HK/NT142/03, CK/HK/WF12 6/03, SCk/HK/WF285/03, CK/HK/YU463/03, CK/HK/YU577/03, SCk/HK/YU663/03, Ck/HK/CSWl61/03, e GF/HK/NT101/03. Numa forma de realização, a dita estirpe de gripe H9N2 é A/Hong Kong/1073/99. Noutra forma de realização, a dita Ml pode ser a partir de uma estirpe de gripe de H5N1. Noutra forma de realização, a dita H5N1 é selecionada a partir do grupo que consiste em A/Vietnam/1194/04, A/Vietnam/1203/04, A/Hongkong/213/03, A/Indonesia/2/2005, A/Bar headed goose/Quing-hai/1A/2005, A/Anhui/1/2005, e A/Indonesia/5/05. Nas VLPs produzidas através dos métodos da invenção, a dita estirpe de H5N1 é A/Indonesia/5/05.
Noutra forma de realização, as ditas VLPs quiméricas compreendem proteínas quiméricas a partir de vírus B de gripe. Numa forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe B fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares de uma região citoplasmática e/ou transmembranar de HA e/ou NA heteróloga. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA heteróloga é a partir de gripe sazonal A/Wiscon-sin/67/2005 e/ou A/Fujian/411/02 e/ou gripe aviária A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, os ditos vírus de gripe B são a partir de B/Shanghai/361/2002 e/ou B/Hong Kong/330/2001.
Também são descritas no presente documento VLPs quiméricas que compreendem uma Ml aviária com uma proteína a partir de outro agente infecioso (proteína da gripe não aviária). A dita proteína a partir de outro agente infecioso pode ser uma proteína de tipo 1 e/ou uma proteína de tipo 2. Uma proteína de tipo I tem um terminal-C localizado no citosol (o domínio transmembranar localiza-se perto da extremidade C-terminal), ao passo que uma proteína de tipo II tem uma extremidade N-terminal que está localizada no citosol (o domínio transmembranar localiza-se perto da extremidade N-terminal). Noutra forma de realização, a dita proteína pode compreender epitopos que podem induzir uma resposta imunitária contra a dita proteína quando administrada a um vertebrado. Noutra forma de realização, a dita proteína pode associar-se com Ml de gripe aviária direta ou indiretamente. Noutra forma de realização, a dita proteína é expressa na superfície da VLP. Noutra forma de realização, a dita proteína, ou porção da mesma, pode ser fundida com uma proteína heteróloga criando uma proteína quimérica. Por exemplo, os domínios externos de proteínas a partir de agentes infeciosos, tais como vírus de gripe não aviária, coronavírus, VZV, dengue, ou febre-amarela e/ou outros agentes podem ser utilizados para gerar proteínas quiméricas através da fusão das ditas proteínas dos agentes infeciosos com um proteína que se associa com a Ml de gripe aviária. Numa forma de Realização, disse proteína que se associa com a gripe aviária Ml é uma proteína da gripe. Noutra forma de realização, a dita proteína que se associa com a Ml de gripe aviária é uma HA e/ou NA de gripe. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é de um vírus da gripe sazonal. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é de um vírus da gripe aviária. Noutra forma de realização, o dito vírus da gripe aviária é H5N1. Noutra forma de realização, a dita estirpe de H5N1 é A/Indonesia/5/05.
Também se descreve no presente documento, uma VLP que compreende uma proteína quimérica que compreende o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmática da HA de gripe e/ou NA de influenza fundida a uma proteína de um agente infecioso. Noutra forma de realização, o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmática da proteína HA e/ou NA estende-se desde o terminal N ou C até, aproximadamente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 até cerca de 50 aminoácidos além do domínio transmembranar e está fundido com a dita proteína de outro agente infecioso. Noutra forma de realização, a porção da proteína de outro agente infecioso que compreende o domínio citoplasmático e o transmembranar é substituído por um domínio citoplasmático e/ou transmembranar a partir de uma proteína da gripe (isto é, NA e/ou HA de gripe aviária e/ou sazonal). Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe sazonal são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e/ou A/Fujian/411/02 e/ou gripe aviária A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir de uma estirpe de gripe aviária H5N1. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe H9N2. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Hong Kong/1073-1099. Noutra forma de realização, o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmática de HA e/ou NA de A/Wisconsin/67/2005 está fundida com uma proteína de um agente infecioso. Noutra forma de realização, o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmática de HA e/ou NA de A/Fujian/411/02 está fundida a uma proteína de um agente infecioso. Noutra forma de realização, o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmática de HA e/ou NA de A/Indonesia/5/05 está fundida com uma proteína de um agente infecioso.
Noutra forma de realização, o domínio transmembranar e/ou cauda citoplasmát ica da HA de gripe e/ou NA de gripe fundida com uma proteína de um agente infecioso compreende uma sequência espaçadora entre os segmentos da proteína. As ditas sequências espaçadoras podem ser qualquer aminoácido não na proteína. Esta sequência espaçadora pode ser importante para a expressão da dita proteína a partir de um agente infecioso na superfície da VLP. Exemplos de sequências espaçadoras incluem aminoácidos poli-G. 0 dito espaçador pode ter desde 1 até cerca de 100 aminoácidos de comprimento.
As VLP produzidas de acordo com a invenção podem compreender mais do que uma proteína a partir de um agente infecioso. Nesta forma de realização, as ditas VLPs são VLP s multivariantes capazes de induzir uma resposta imunitária a várias proteínas de agentes infeciosos. Numa forma de realização, as ditas VLPs compreendem proteínas a partir de pelo menos dois vírus da gripe diferentes. Por exemplo, as ditas VLPs multivariante podem compreender uma HA e/ou NA de um vírus da gripe sazonal A e/ou B. Esta forma de realização compreende também a apresentação de HA e/ou NA dos três vírus da gripe (dois subtipos de vírus da gripe A e um vírus da gripe B) que são escolhidos pela OMS e o CDC (ver acima) para figurarem nas vacinas contra a gripe para o outono e inverno numa única VLP. Noutra forma de realização, as ditas VLPs multivariantes compreendem proteínas a partir de diversos vírus, bactérias e/ou parasitas. Por exemplo, as ditas VLPs compreendem proteínas a partir de gripe e RSV, gripe, RSV e parainfluenza. Noutra forma de realização, as ditas proteínas são proteínas quiméricas em que cada proteína compreende a HA e/ou NA de um vírus da gripe. Na forma de realização de acordo com a presente invenção, as ditas VLPs multivalentes compreendem uma proteína Ml de A/Indonesia/5/05 e HA e NA de gripe sazonal.
Também são descritas no presente documento, VLPs que compreendem proteínas quiméricas que compreendem uma fusão entre a HA de gripe com a proteína, ou uma porção da mesma, a partir de um agente infecioso. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem uma fusão entre as proteínas, ou uma porção das mesmas, de dois agentes infeciosos ou variações antigénicas do mesmo agente. A dita proteína de fusão compreenderá agentes antigénicos de cada proteína a partir do dito agente infecioso. Noutra forma de realização, a dita proteína quimérica compreende um ligante de aminoácidos entre as proteínas. Um exemplo desta forma de realização é uma fusão entre a HA de gripe e a proteína F de RSV. Um exemplo desta forma de realização é uma fusão entre a HA de gripe e a proteína F1 de RSV (por exemplo, SEQ ID NO 12) . Noutra forma de realização, a dita proteína quimérica compreende o domínio transmembranar e/ou citoplasmático de HA e/ou NA a partir de um vírus da gripe aviária. Noutra forma de realização, as ditas VLPs multivalentes compreendem uma proteína Ml de gripe aviária. Noutra forma de realização, a dita gripe aviária é A/Indonesia/5/05.
Noutra forma de realização, os genes quiméricos (conforme descrito acima), que podem ser otimizados por codões, são sintetizados e clonados através de uma série de etapas numa construção de bacmídeo seguido de resgate de baculovírus recombinante através de isolamento em placas e análise de expressão. As VLPs para cada um destes alvos pode depois ser resgatadas por coinfeção com o uso de dois baculovírus recombinantes (1) que expressam a Ml aviária, e (2) que expressam a proteína quimérica a partir de um agente infecioso (por exemplo, VZV, RSV, dengue, febre-amarela) com o domínio citoplasmático e/ou transmembranar de HA e/ou NA de um vírus da gripe sazonal e/ou aviária. Noutra forma de realização, as VLPs podem ser resgatadas por infeção com o uso de um baculovírus recombinante que expressa a Ml aviária e a proteína quimérica a partir de um agente infecioso (por exemplo, VZV, RSV, dengue, febre-amarela) com o domínio citoplasmático e transmembranar de HA e/ou NA de gripe.
Os agentes infeciosos podem ser vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas. Uma proteína que pode ser expressa sobre a superfície de VLPs quiméricas da invenção pode ser derivada a partir de vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas. Noutras formas de realização, as proteínas expressas na superfície das ditas VLPs quiméricas podem ser antigénios tumorais ou cancerosos. As proteínas derivadas a partir de vírus, bactérias, fungos e/ou parasitas podem induzir uma resposta imunitária (celular e/ou humoral) num vertebrado que irá prevenir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença infeciosa no dito vertebrado.
Exemplos não limitantes de vírus a partir dos quais as ditas proteínas de agente infecioso podem ser derivadas são os seguintes: coronavírus (por exemplo, o agente que causa a SARS) , vírus da hepatite A, B, C, D e E3, vírus da imunodeficiência humana (VIH), vírus herpes 1, 2, 6 e 7, citomegalovirus, varicela zoster, papilomavirus, vírus Epstein Barr, vírus parainfluenza, vírus sincicial respiratório (RSV), metapneumovírus humano, adenovirus, vírus bunya (por exemplo, virus hanta), vírus coxsakie, picornavírus, rotavirus, rinovírus, vírus da rubéola, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus da poliomielite (múltiplos tipos), adenovirus (múltiplos tipos), vírus parainfluenza (múltiplos tipos), gripe aviária (vários tipos), vírus da febre do transporte, encefalomielite equina ocidental e oriental, encefalomielite japonesa, varíola aviária, vírus da raiva, vírus lentos cerebrais, vírus do sarcoma de Rous, Papovaviridae, Parvoviridae, Picomaviridae, Poxviridae (tais como varíola ou Vaccinia), Reoviridae (por exemplo, Rotavirus), Retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, Lentivirus), Togaviridae (por exemplo, Rubivirus), vírus da doença de Newcastle, vírus da febre do Nilo Ocidental, encefalite transmitida por carraças, febre-amarela, vírus chikungunya e vírus da dengue (todos os serotipos).
Noutra forma de realização, as proteínas específicas de vírus podem compreender: HA e/ou NA do vírus da gripe (incluindo aviária), proteína S de coronavírus, gpl60, gpl40 e/ou gp41 de VIH, gp I a IV e Vp de varicela zoster, E e preM/M do vírus da febre-amarela, dengue (todos os sorotipos) ou quaisquer flavivírus. Também estão incluídas quaisquer proteínas de um vírus que podem induzir uma resposta imunitária (celular e/ou humoral) num vertebrado que pode impedir, tratar, controlar e/ou melhorar uma doença infeciosa no dito vertebrado.
Exemplos não limitantes de bactérias a partir das quais as ditas proteínas de agente infecioso podem ser derivadas são os seguintes: B. pertussis, Leptospira pomona, S. paratyphi A e B, C. diphtheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringens, C. feseri e outras bactérias de gangrena gasosa, B. anthracis, P. pestis, P. multocida, Neisseria meningitidis, N. gonorrheae, Hemophilus influenzae, Actinomyces (por exemplo, Norcardia) , Acinetobacter, Bacillaceae (por exemplo, Bacillus anthrasis), Bacteroides (por exemplo, Bacteroides fragilis), Blastomycosis, Bordetella, Borrelia (por exemplo, Borrelia burgdorferi) , Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Coccidioides, Corynebacterium (por exemplo, Colynebacterium diptheriae) , E. coli (por exemplo, E. coli enterotoxigénica e E. coli enterohemorrágica) , Enterobacter (por exemplo, Enterobacter aerogenes) , Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi, Salmonella enteritidis, Serratia, Yersinia, Shigella) , Erysipelothrix, Haemophilus (por exemplo, Haemophilus influenza tipo B) , Helicobacter, Legionella (por exemplo, Legionella pneumophila), Leptospira, Listeria fpor exemplo, Listeria monocytogenes), Mycoplasma, Mycobacterium (por exemplo, Mycobacterium leprae e Mycobacterium tuberculosis), Vibrio (por exemplo, Vibrio cholerae), Pasteurellacea, Proteus, Pseudomonas (por exemplo,
Pseudomonas aeruginosa) , Rickettsiaceae, Espiroquetas (por exemplo, Treponema spp., Leptospira spp., Borrelia spp.), Shigella spp., Meningiococcus, Pneumococcus e Streptococcus (por exemplo, Streptococcus pneumoniae e Streptococci dos Grupos A, B, e C) , Ureaplasmas. Treponema pollidum, Staphylococcus aureus, Pasteurella haemolytica, toxoide de Corynehacterium diptheriae, polissacarídeo meningocdcico, Bordetella pertusis, Streptococcus pneumoniae, toxoide de Clostridium tetani e Mycobacterium bovis.
Exemplos não limitantes de parasitas a partir dos quais as ditas proteínas de agente infecioso podem ser derivadas são os seguintes: leishmaniose (Leishmania tropica mexicana, Leishmania tropica, Leishmania major, Leishmania aethiopica, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Leishmania infantum, Leishmania chagasi), tripanossomose (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense), toxoplasmose (Toxoplasma gondii), esquistossomose (Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni, Schistosoma mekongi, Schistosoma intercalatum), malária (Plasmodium virax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae and Plasmodium ovale) Amebiase (Entamoeba histolytica) , Babesiose (Babesiosis microti), Criptosporidiose (Cryptosporidium parvum) , Dientamebiase (Dientamoeba fragilis) , Giardiase (Giardia / amblia), Helmintiase e Trichomonas (Trichomonas vaginalis) .
Exemplos não limitantes de fungos a partir dos quais as ditas glicoproteinas podem ser derivadas são os seguintes: Absidia (por exemplo, Absidia corymbifera), Ajellomyces (por exemplo, Ajellomyces capsulatus, Ajellomyces dermatitidis), Arthroderma (por exemplo, Arthroderma benhamiae, Arthroderma fulvum, Arthroderma gypseum, Arthroderma incurvatum, Arthroderma otae, Arthroderma vanbreuseghemii) , Aspergilus (por exemplo, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger) , Candida (por exemplo, Candida albicans, Candida albicans var. stellatoidea, Candida dublinensis, Candida glabrata, Candida guilliermondii (Pichia guilliermondii) , Candida krusei (Issatschenkia orientalis) , Candida parapsilosis, Candida pelliculosa (Pichia anomala) , Candida tropicalis) , Coccidioides (por exemplo, Coccidioides immitis) , Cryptococcus (por exemplo, Cryptococcus neoformans (Filobasidiella neoformans) , Histoplasma (por exemplo, Histoplasma capsulatum (Ajellomyces capsulatus), Microsporum (por exemplo, Microsporum canis (Arthroderma otae), Microsporum fulvum (Arthroderma fulvum), Microsporum gypseum, Género Pichia (por exemplo, Pichia anomala, Pichia guilliermondii), Pneumocystis (por exemplo, Pneumocystis jirovecii), Cryptosporidium, Malassezia furfur, Paracoccidiodes.
As listas anteriores destinam-se a ser ilustrativas e não pretendem, de modo algum, limitar a invenção a estes organismos bacterianos, virais ou parasitários particulares. A invenção também abrange variantes das ditas proteínas expressas sobre ou nas VLPs quiméricas da invenção. As variantes podem conter modificações nas sequências de aminoácidos das proteínas constituintes. 0 termo "variante", com respeito a uma proteína refere-se a uma sequência de aminoácidos que é alterada em um ou mais aminoácidos em relação a uma sequência de referência. A variante pode ter alterações "conservadoras", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas semelhantes, por exemplo, a substituição de leucina por isoleucina. Alternativamente, uma variante pode ter alterações "não conservadoras", por exemplo, substituição de uma glicina com um triptofano. Pequenas variações análogas podem também incluir a eliminação ou inserção de aminoácidos, ou ambas. Uma orientação para determinar que resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou eliminados sem eliminar a atividade biológica ou imunológica pode ser encontrada utilizando programas de computador bem conhecidos na técnica, por exemplo, o software DNASTAR.
As variantes naturais podem ocorrer devido a mutações nas proteínas. Estas mutações podem conduzir a variabilidade antigénica dentro de grupos individuais de agentes infeciosos, por exemplo, a gripe. Assim, uma pessoa infetada com uma estirpe da gripe desenvolve anticorpos contra esse vírus, à medida que aparecem estirpes de vírus mais recentes, os anticorpos contra as estirpes mais antigas deixam de reconhecer o vírus mais recente e a reinfeção pode ocorrer. A invenção engloba toda a variabilidade antigénica e genética de proteínas de agentes infeciosos para fabricar VLPs quiméricas.
Textos gerais que descrevem técnicas de biologia molecular, que são aplicáveis à presente invenção, como a clonagem, mutação, cultura de células e semelhantes, incluem Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (Berger); Sambrook et al. , Molecular Cloning--A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 2000 ("Sambrook") e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, urn empreendimento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., ("Ausubel"). Estes textos descrevem a mutagénese, a utilização de vetores, promotores e muitos outros tópicos relevantes relacionados com, por exemplo, a clonagem e a mutação de HA, NA e/ou proteínas de agentes infeciosos, etc. Assim, a invenção também engloba a utilização de métodos conhecidos de tecnologia de manipulação de proteínas e de ADN recombinante para melhorar ou alterar as características das proteínas expressas sobre ou dentro das VLPs da presente invenção. Vários tipos de mutagénese podem ser utilizados para produzir e/ou isolar ácidos nucleicos de variantes que codificam moléculas de proteínas e/ou para modificar/mutar adicionalmente as proteínas sobre ou no interior das VLPs da presente invenção. Eles incluem, mas não se limitam a, mutagénese sítio dirigida, mutagénese de ponto aleatório, recombinação homóloga (DNA shuffling) , mutagénese utilizando modelos contendo uracilo, mutagénese dirigida a oligonucleótidos, mutagénese de ADN modificado por fosforotioato, mutagénese utilizando ADN duplex com lacunas ou semelhantes. Métodos adequados adicionais incluem reparação de não emparelhamento de ponto, mutagénese utilizando estirpes hospedeiras de reparação deficiente, seleção de restrição e purificação de restrição, mutagénese de deleção, mutagénese por síntese génica total, reparação de rutura de cadeia dupla, e semelhantes. Mutagénese, por exemplo, envolvendo construções quiméricas, também está incluída na presente invenção. Numa forma de realização, a mutagénese pode ser guiada por informação conhecida da molécula de ocorrência natural ou molécula de ocorrência natural alterada ou mutada, por exemplo, sequência, comparações de sequências, propriedades físicas, estrutura cristalina ou semelhantes. A invenção compreende adicionalmente as variantes de proteínas que apresentam atividade biológica substancial, por exemplo, capazes de induzir uma resposta de anticorpo eficaz, quando expressas sobre ou em VLPs da invenção. Estas variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem pouco efeito na atividade.
Os métodos de clonagem das referidas proteínas são conhecidos na técnica. Por exemplo, o gene que codifica uma proteína de vírus específica pode ser isolado através de RT-PCR a partir de ARNm poliadenilado extraído a partir de células que tinham sido infetadas com um vírus (vírus de ADN ou ARN) ou PCR a partir de células que tinham sido infetadas com um vírus de ADN. 0 produto genético resultante pode ser clonado como um inserto de ADN num vetor. 0 termo "vetor" refere-se aos meios pelos quais um ácido nucleico pode ser propagado e/ou transferido entre organismos, células, ou componentes celulares. Os vetores incluem plasmídeos, vírus, bacteriófagos, pró-vírus, fagemídeos, transposões, cromossomas artificiais e semelhantes, que se replicam de forma autónoma ou podem ser integrados num cromossoma de uma célula hospedeira. Um vetor também pode ser um polinucleót ido de ARN nu, um polinucleótido de ADN nu, um polinucleótido composto por ambos ADN e ARN dentro da mesma cadeia, um ADN ou ARN conjugado com poli-lisina, um ADN ou ARN conjugado com péptido, um ADN conjugado com lipossoma, ou semelhantes, que não se replica de forma autónoma. Em muitas, mas não todas, as formas de realização comuns, os vetores da presente invenção são plasmídeos ou bacmídeos.
Assim, descrevem-se no presente documento nucleótidos que codificam proteínas, incluindo moléculas quiméricas, clonadas num vetor de expressão que pode ser expresso numa célula que induz a formação de VLPs da presente invenção. Um "vetor de expressão" é um vetor, tal como um plasmídeo que é capaz de promover a expressão, bem como a replicação de um ácido nucleico nele incorporado. Tipicamente, o ácido nucleico a ser expresso está "operativamente ligado" a um promotor e/ou potenciador, e é sujeito a controlo regulador da transcrição pelo promotor e/ou potenciador. Numa forma de realização, os ditos nucleótidos codificam uma proteína de gripe não aviária e/ou proteína quimérica (conforme discutido acima). Noutra forma de realização, o dito vetor compreende os nucleótidos que codificam uma proteína de gripe não aviária e/ou proteína quimérica e uma Ml de gripe aviária. Noutra forma de realização, o dito vetor compreende os nucleótidos que codificam uma proteína quimérica que compreende o domínio citoplasmático e/ou transmembranar de HA e/ou NA de proteína de gripe sazonal e/ou aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe sazonal são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e as ditas HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, o dito vetor compreende nucleótidos que codificam Ml a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05 e uma proteína quimérica que compreende o domínio citoplasmático e/ou transmembranar de HA e/ou NA de A/Wisconsin/67/2005 (gripe sazonal). Noutra forma de realização, o dito vetor compreende nucleótidos que codificam Ml a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05 e uma proteína quimérica que compreende um domínio citoplasmático e/ou transmembranar de HA e/ou NA de A/Indonesia/5/05 (gripe aviária).
Em algumas formas de realização, as ditas proteínas podem compreender, mutações que contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silenciosas, mas não alteram as propriedades ou atividades da proteína codificada ou como as proteínas são feitas. Variantes nucleotídicas podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de codões para um determinado hospedeiro (alteração de codões no ARNm humano para os preferidos por células de inseto tais como células Sf9) . Veja-se a publicação de patente U.S 2005/0118191.
Adicionalmente, os nucleótidos podem ser sequenciados para assegurar que as regiões de codificação corretas foram clonadas e que não contêm quaisquer mutações indesejadas. Os nucleótidos podem ser subclonados num vetor de expressão (por exemplo, baculovírus) para expressão em qualquer célula. A descrição acima é apenas um exemplo de como as proteínas da gripe (incluindo proteínas quiméricas) podem ser clonadas. Um perito na especialidade entende que métodos adicionais estão disponíveis e são possíveis. 0 pedido também descreve construções e/ou vetores que compreendem nucleótidos que codificam a Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas (conforme descrito acima). As construções e/ou vetores que compreendem a Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas, devem estar operativamente ligadas a um promotor apropriado, tal como o promotor AcMNPV da poliedrina (ou outro baculovírus), promotor PL do fago lambda, o lac de E. coli, promotores phoA e tac, os promotores precoces e tardios de SV40, e promotores de LTRs retrovirais, são exemplos não limitantes. Outros promotores adequados serão conhecidos pelos peritos na especialidade, dependendo da célula hospedeira e/ou da taxa de expressão desejada. As construções de expressão irão conter adicionalmente sítios para a iniciação da transcrição, terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação ao ribossoma para a tradução. A porção codificante dos transcritos expressos pelas construções irá incluir, de preferência, um codão de iniciação da tradução no início e um codão de terminação apropriadamente posicionado na extremidade do polipéptido a ser traduzido.
Os vetores de expressão incluirão preferivelmente pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem di-hidrofolato redutase, G418 ou resistência à neomicina para cultura de células eucarióticas e genes de resistência à tetraciclina, canamicina ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Entre os vetores preferidos encontram-se os vetores de vírus, tais como baculovírus, poxvirus (por exemplo, vírus vaccinia, género avipoxvirus, vírus da varíola do canário, vírus da varíola aviária, vírus da varíola do guaxinim, vírus da varíola suína, etc.), adenovirus (por exemplo, adenovirus canino), herpesvirus, e retrovirus. Outros vetores que podem ser utilizados com a invenção compreendem vetores para utilização em bactérias, que compreendem pQE70, pQE60 e pQE-9, vetores pBluescript, vetores Phagescript, pNH8A, pNHl6a, pNHl8A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5. Entre os vetores eucarióticos preferidos estão pFastBacl pWINEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG, pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL. Outros vetores apropriados serão prontamente evidentes para um perito na especialidade.
Em seguida, as construções recombinantes mencionadas acima podem ser utilizadas para transfetar, infetar ou transformar e podem expressar Ml aviária e uma proteína de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas, em células eucarióticas e/ou células procarióticas. Assim, as células hospedeiras podem compreender um vetor (ou vetores) que contêm ácidos nucleicos que codificam proteínas quiméricas e Ml aviária, e permitem a expressão das ditas construções na dita célula hospedeira sob condições que permitam a formação de VLPs.
Entre as células hospedeiras eucarióticas estão células hospedeiras de leveduras, insetos, aves, plantas, C. elegans (ou nemátode) e células hospedeiras de mamíferos. Exemplos não limitantes de células de inseto são, células de Spodoptera frugiperda (Sf), por exemplo, Sf9, Sf21, células de Trichoplusia ni, por exemplo, células High Five, e células S2 de Drosophila. Exemplos de células hospedeiras de fungos (incluindo leveduras), são S. cerevisiae, Kluyveromyces lactis (K. lactis), espécies de Candida, incluindo C. albicans e C. glabrata, Aspergillus nidulans, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe), Pichia pastoris e Yarrowia lipolytica. Exemplos de células de mamíferos são células COS, células de rim de hámster bebé, células L de ratinho, células LNCaP, células de ovário de hámster chinês (CHO), células de rim embrionário humano (HEK) e células de macaco verde africano, células CV1, células MDCK, células HeLa, células Vero e Hep-2. Oócitos de Xenopus laevis, ou outras células de origem anfíbia, também podem ser utilizados. Células hospedeiras procarióticas incluem células bacterianas, por exemplo, E. coli, B. subtilis e micobactérias.
Os vetores, por exemplo, vetores que compreendem os polinucleótidos de Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas, podem ser transfetados em células hospedeiras de acordo com métodos bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, a introdução de ácidos nucleicos em células eucarióticas pode ser realizada através de co-precipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofeção e transfeção empregando reagentes de transfeção de poliamina. Numa forma de realização, o dito vetor é um baculovirus recombinante. Noutra forma de realização, o dito baculovirus recombinante é transfectado numa célula eucariótica. Numa forma de realização preferida, a dita célula é uma célula de inseto. Noutra forma de realização, a dita célula de inseto é uma célula Sf9.
Noutra forma de realização, o dito vetor e/ou célula hospedeira compreende nucleótidos que codificam a Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, o dito vetor e/ou célula hospedeira consiste essencialmente em Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas. Numa forma de realização adicional, o dito vetor e/ou célula hospedeira consiste em Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas. Estes vetor e/ou célula hospedeira contêm Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas, e podem conter marcadores adicionais, tais como uma origem de replicação, marcadores de seleção, etc. A invenção também proporciona métodos que irão aumentar adicionalmente a eficiência da produção de VLPs. Por exemplo, a adição de sequências líder à Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas, pode melhorar a eficiência do transporte de proteínas dentro da célula. Por exemplo, uma sequência de sinal heteróloga pode ser fundida com a Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas. Numa forma de realização, a sequência de sinal pode ser derivada a partir do gene de uma pré-proteína de inseto e fundida com Ml aviária e proteínas de gripe não aviária e/ou proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, o péptido de sinal é a sequência de sinal da quitinase, que funciona eficientemente em sistemas de expressão de baculovírus. A invenção compreende um método para aumentar a eficiência de produção de VLPs quiméricas que compreendem a expressão de uma Ml de gripe aviária e HA e/ou NA de gripe sazonal. Numa forma de realização, as ditas HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. A dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Numa forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005.
Noutra forma de realização da invenção, o aumento da produção de VLP, para VLP quiméricas ou não quiméricas, é cerca de 2 vezes, cerca de 4 vezes, cerca de 8 vezes, cerca de 16 vezes, cerca de 20 vezes, cerca de 25 vezes, sobre 30 vezes, cerca de 35 vezes, cerca de 40 vezes, cerca de 45 vezes, cerca de 50 vezes, cerca de 55 vezes, cerca de 60 vezes, cerca de 65 vezes, cerca de 70 vezes, cerca de 75 vezes, cerca de 80 vezes, cerca de 85 vezes, cerca de 90 vezes, cerca de 95 vezes, cerca de 100 vezes, ou mais, quando comparada com a produção de VLP compreendendo uma proteína Ml de gripe aviária sob condições semelhantes, por exemplo Ml de gripe sazonal. Numa forma de realização, a eficiência de produção de VLPs de gripe é aumentada em cerca de 10%, cerca de 20% cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50% cerca de 60%, cerca de 70% cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 250%, cerca de 300%, cerca de 350%, cerca de 400%, cerca de 450%, cerca de 500%, cerca de 550%, cerca de 600%, cerca de 650%, cerca de 700%, cerca de 750%, cerca de 800%, cerca de 850%, cerca de 900%, cerca de 950%, cerca de 1000% em comparação com a produção de VLP que compreende uma proteína Ml de gripe não aviária sob condições semelhantes. Uma Ml preferida é a partir de A/Indonesia/5/05 (SEQ ID NO. 3) . A invenção proporciona métodos de produção de VLPs, os ditos métodos compreendendo a expressão de uma Ml aviária de acordo com as reivindicações e uma HA e NA sazonal sob condições que permitem a formação de VLPs. Dependendo do sistema de expressão e da célula hospedeira selecionada, as VLPs são produzidas por cultura de células hospedeiras transformadas por um vetor de expressão sob condições pelas quais as proteínas recombinantes, incluindo Ml aviária e HA e NA sazonais são expressas e são VLPs são formadas. A seleção das condições de cultura apropriadas está dentro da habilidade de um perito na especialidade.
Os métodos para cultivar as células manipuladas para produzir as VLPs da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, lote, alimentação por lotes, técnicas de cultura de células contínua e de perfusão. A cultura de células significa o crescimento e a propagação de células num biorreator (uma câmara de fermentação), onde as células são propagadas e a proteína é expressa (por exemplo, proteínas recombinantes) para purificação e isolamento. Tipicamente, a cultura celular é realizada sob condições de temperatura e atmosféricas controladas e estéreis num biorreator. Um biorreator é uma câmara utilizada para cultivar células no qual as condições ambientais, tais como temperatura, atmosfera, agitação e/ou pH podem ser monitorizadas. Numa forma de realização, o dito biorreator é uma câmara de aço inoxidável. Noutra forma de realização, o dito biorreator é um saco de plástico pré-esterilizado (por exemplo Cellbag®, Wave Biotech, Bridgewater, NJ). Noutra forma de realização, os ditos sacos de plástico pré-esterilizados são sacos de cerca de 50 1 a 1000 1.
As VLPs são depois isoladas utilizando métodos que preservam a sua integridade, tal como por centrifugação em gradiente, por exemplo, de cloreto de césio, sacarose e iodixanol, bem como técnicas de purificação padrão, incluindo, por exemplo, cromatografia de permuta iónica e de filtração em gel. O que se segue é um exemplo de como as VLPs da invenção podem ser fabricadas, isoladas e purificadas. Normalmente, as VLPs são produzidas a partir de linhas de células recombinantes manipuladas para criar uma VLP quando as ditas células são cultivadas em cultura celular (veja-se acima). Um perito na técnica entenderia que existem métodos adicionais que podem ser utilizados para fabricar ou purificar partículas VLPs do presente invenção, portanto, a invenção não está limitada ao método descrito. A produção de VLPs da presente invenção pode começar por sementeira de células Sf9 (não infetadas) em frascos de agitação, o que permite que as células se expandam e aumente a escala à medida que as células crescem e se multiplicam (por exemplo a partir de um frasco de 125 ml, para um saco Wave de 50 1) . O meio usado para cultivar a célula é formulado para a linha celular apropriada (de preferência meios livres de soro, por exemplo, meio de inseto ExCell-420, JRH) . A seguir, as ditas células são infetadas com o baculovirus recombinante na multiplicidade de infeção mais eficiente (por exemplo, desde cerca de 1 até cerca de 3 unidades formadoras de placas por célula) . Uma vez que a infeção tenha ocorrido, a Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína heteróloga de gripe aviária são expressas a partir do genoma do vírus, são auto montadas em VLPs são secretadas a partir das células aproximadamente 24 a 72 horas após a infeção. Normalmente, a infeção é mais eficiente quando as células estão na fase mid-log de crescimento (4-8 x 106 células/ml) e são, pelo menos, cerca de 90% viáveis.
As VLPs da presente invenção podem ser colhidos em aproximadamente 48 a 96 horas após a infeção, quando os níveis de VLPs no meio de cultura celular estão perto do máximo, mas antes da lise celular extensa. A densidade de células Sf9 e viabilidade no momento da colheita pode ser de cerca de 0,5 x 106 células/ml até cerca de 1,5 x 106 células/ml com, pelo menos, 20% de viabilidade, como mostrado pelo ensaio de exclusão com corante. A seguir, o meio é removido e clarificado. NaCl pode ser adicionado ao meio a uma concentração de cerca de 0,4 até cerca de 1,0 M, preferivelmente até cerca de 0,5 M, para evitar a agregação de VLP. A remoção de células e detritos celulares a partir do meio de cultura celular contendo VLPs da invenção pode ser realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF), com um cartucho de filtro de 0,5 ou 1,00 pm de fibra oca pré-esterilizada e de utilização única ou um dispositivo semelhante.
Em seguida, as VLPs no meio de cultura clarificado podem ser concentradas por ultrafiltração usando um cartucho de fibra oca com redução da massa molecular de 500.000. As VLPs concentradas podem ser diafiltradas contra 10 volumes de solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7,0 a 8,0 contendo NaCl a 0,5 M para remover os componentes residuais do meio.
As VLPs diafiltradas e concentradas podem ser adicionalmente purificadas num gradiente de sacarose descontínuo de 20% a 60% em tampão PBS, pH 7,2 com NaCl a 0,5 M por centrifugação a 6.500 x g durante 18 horas a cerca de 4 °C até cerca de 10 °C. Normalmente as VLPs formarão uma banda visível distinta entre cerca de 30% a cerca de 40% de sacarose ou na interface (num gradiente em passos de 20% e 60%) que pode ser recolhida a partir do gradiente e armazenada. Este produto pode ser diluído para conter NaCl a 200 mM, como preparação para o próximo passo no processo de purificação. Este produto contém VLPs e pode conter partículas de baculovírus intactas. A purificação adicional de VLPs pode ser conseguida por cromatografia de permuta aniónica, ou centrifugação com almofada de sacarose isopícnica a 44%. Na cromatografia de permuta aniónica, a amostra a partir do gradiente de sacarose (veja-se acima) é carregada na coluna contendo um meio com um anião (por exemplo, Matrix Fractogel EMD TMAE) e eluída através de um gradiente de sal (desde cerca de 0,2 M a cerca de 1,0 M de NaCl) que pode separar a VLP a partir de outros contaminantes (por exemplo, baculovírus e ADN/ARN). No método de almofada de sacarose, a amostra compreendendo a VLP é adicionada a uma almofada de sacarose a 44% e centrifugada durante cerca de 18 horas, a 30.000 g. As VLPs formam uma banda na parte superior da sacarose a 44%, enquanto o baculovírus precipita no fundo e outras proteínas contaminantes permanecem na camada de sacarose a 0% na parte superior. O pico ou banda de VLPs é recolhido.
Os baculovírus intactos podem ser inativados, se desejado. A inativação pode ser conseguida por métodos químicos, por exemplo, formalina ou lactona β-propilo (BPL) . A remoção e/ou inativação de baculovírus intactos também pode ser grandemente realizada utilizando precipitação seletiva e métodos cromatográficos conhecidos na técnica, tal como exemplificado anteriormente. Os métodos de inativação compreendem a incubação da amostra que contém as VLPs em BPL a 0,2% durante 3 horas a cerca de 25 °C até cerca de 27 °C. Os baculovírus também podem ser inativados por incubação da amostra que contém as VLPs em BPL a 0,05% a 4 °C durante 3 dias, depois a 37 °C durante uma hora.
Após a etapa de inativação/remoção, o produto compreendendo as VLPs pode ser passado através de outra etapa de diafiltração para remover qualquer reagente da etapa de inativação e/ou qualquer sacarose residual, e para colocar as VLPs para o tampão desejado (por exemplo, PBS). A solução que compreende as VLPs pode ser esterilizada por métodos conhecidos na técnica (por exemplo, filtração estéril) e armazenada no frigorífico ou no congelador.
As técnicas acima podem ser praticadas numa variedade de escalas. Por exemplo, frascos T, frascos de agitação, garrafas giratórias, até biorreatores de porte industrial. Os biorreactores podem compreender um tanque de aço inoxidável ou um saco de plástico pré-esterilizado (por exemplo, o sistema vendido pela Wave Biotech, Bridgewater, NJ) . Um perito na técnica saberá o que é mais desejável para os seus propósitos. A expansão e produção de vetores de expressão de baculovírus e infeção de células com baculovírus recombinante para produzir VLPs de gripe recombinantes podem ser alcançadas em células de inseto, por exemplo células de inseto Sf9 tal como foi previamente descrito.
Numa forma de realização preferida, as células são Sf9 infetadas com baculovírus recombinante manipulado para produzir as VLPs da invenção.
Formulações Vacinais ou Farmacêuticas e Administração 0 presente pedido descreve uma formulação antigénica que compreende uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais transmembranares ou citoplasmáticos da região citoplasmática de HA e/ou NA aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e as ditas HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005. O presente pedido descreve uma vacina que compreende uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares da região citoplasmática de HA e/ou NA aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e as ditas HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005.
As composições farmacêuticas úteis no presente documento contêm um portador farmaceuticamente aceitável, incluindo qualquer diluente ou excipiente adequado, que inclui qualquer agente farmacêutico que não induza ele próprio a produção de uma resposta imunitária prejudicial para o vertebrado que recebe a composição, e que podem ser administradas sem toxicidade indevida e uma VLP da invenção. Conforme utilizado no presente documento, o termo "farmaceuticamente aceitável" significa ser aprovado por uma agência reguladora do governo federal ou de um governo estatal ou listado na Farmacopeia dos Estados Unidos, Farmacopeia Europeia ou outro farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em mamíferos, e mais particularmente em humanos. Estas composições podem ser úteis como uma vacina e/ou composições antigénicas para induzir uma resposta imunitária protetora num vertebrado. 0 presente pedido descreve uma formulação antigénica que compreende uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares da região citoplasmática de HA e/ou NA aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e as ditas HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005. O presente pedido descreve uma vacina que compreende uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita VLP compreende HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA ou NA têm atividade de hemaglutinina e neuraminidase, respetivamente. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares da região citoplasmática de HA e/ou NA aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e as ditas HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005.
As ditas formulações compreendem uma formulação que compreende VLPs compreendendo uma proteína Ml aviária e, pelo menos, uma proteína a partir de uma proteína de gripe não aviária (por exemplo, uma proteína a partir de um agente infecioso descrito anteriormente) e um portador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Portadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, tampão aquoso isotónico estéril, e combinações dos mesmos. Uma discussão minuciosa sobre portadores, diluentes, e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis é apresentada em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co. N.J. edição atual). A formulação deverá adaptar-se ao modo de administração. Noutra forma de realização, a formulação é adequada para a administração a seres humanos, preferivelmente em não-particulado ou não-pirogénico estéril. A composição, se for desejado, pode também conter quantidades mínimas de agentes humectantes e emulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. A composição pode estar sob a forma sólida, tal como um pó liofilizado adequado para reconstituição, uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de libertação prolongada, ou pó. A formulação oral pode incluir portadores padrão tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. 0 presente pedido também descreve uma embalagem ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes cheios com um ou mais dos ingredientes das formulações vacinais da invenção. Numa forma de realização, o kit compreende dois recipientes, um contendo VLPs e o outro contendo um adjuvante. Noutra forma de realização, o kit compreende dois recipientes, um contendo VLPs liofilizadas e o outro contendo uma solução para ressuspensão das ditas VLPs. Um aviso sob a forma prescrita por uma agência governamental que regula o fabrico, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência do fabrico, uso ou venda para administração humana, pode estar associado com tal recipiente ou recipientes. 0 presente pedido também prevê que a formulação de VLP seja embalada num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade de composição. Numa forma de realização, a composição de VLP é fornecida como um líquido, numa outra forma de realização, como um pó liofilizado seco esterilizado ou um concentrado isento de água num recipiente hermeticamente selado, e pode ser reconstituída, por exemplo, com água ou solução salina até uma concentração adequada para administração a um sujeito. Numa forma de realização, o dito recipiente compreende, pelo menos, cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 pg/ml, pelo menos cerca de 200 pg/ml, pelo menos 500 pg/ml, ou pelo menos 1 mg/ml de um antigénio associado com as VLPs da invenção.
Numa forma de realização alternativa, a composição de VLP é fornecida na forma líquida num recipiente hermeticamente selado, indicando a quantidade e a concentração da composição de VLP. A forma líquida da composição de VLP é fornecida num recipiente hermeticamente selado, pelo menos, cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100 pg/ml, pelo menos cerca de 200 pg/ml, pelo menos 500 pg/ml, ou pelo menos 1 mg/ml de um antigénio associado com VLPs da presente invenção.
De um modo geral, as VLPs produzidas de acordo com a invenção são administradas numa quantidade eficaz ou quantidade (conforme definido acima) suficiente para estimular uma resposta imunitária contra um ou mais agentes infeciosos. Preferivelmente, a administração da VLP da invenção desencadeia a imunidade contra um agente infecioso. Tipicamente, a dose pode ser ajustada dentro deste intervalo com base em, por exemplo, idade, condição física, peso corporal, sexo, dieta, momento de administração, e outros fatores clínicos. A formulação vacinai profilática é administrada sistemicamente, por exemplo, por injeção subcutânea ou intramuscular utilizando uma agulha e seringa, ou um dispositivo de injeção sem agulha. Alternativamente, a formulação vacinai é administrada por via sistémica, por gotas, em aerossol de partículas grandes (maiores do que cerca de 10 micra), ou pulverização no trato respiratório superior. Embora qualquer uma das vias de administração acima resulte numa resposta imunitária, a administração intranasal confere o benefício adicional de estimular a imunidade da mucosa no local de entrada de muitos vírus, incluindo o RSV e gripe.
Assim, o presente pedido também descreve um método de formulação de uma vacina ou composição antigénica que induz imunidade contra uma infeção ou pelo menos um sintoma da mesma num mamífero, compreendendo a adição à dita formulação de uma dose eficaz de VLPs.
Os métodos de administração de uma composição que compreende VLPs (formulações vacinas e/ou antigénicas) incluem, mas não estão limitados a, administração parentérica (por exemplo, intradérmica, intramuscular, intravenosa e subcutânea), epidural e mucosa (por exemplo, intranasal ou oral ou vias pulmonares ou por supositórios). Numa forma de realização específica, as composições da presente invenção são administradas por via intramuscular, intravenosa, subcutânea, por via transdérmica ou por via intradérmica. As composições podem ser administradas por qualquer via conveniente, por exemplo por infusão ou injeção de bolus, absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa oral, cólon, conjuntiva, nasofaringe, orofaringe, vagina, uretra, bexiga urinária e mucosa intestinal, etc.) e podem ser administradas conjuntamente com outros agentes biologicamente ativos. Em algumas formas de realização, as vias de administração intranasal ou por outras vias mucosas de uma composição compreendendo VLPs pode induzir um anticorpo ou outra resposta imunitária que é substancialmente mais elevada do que outras vias de administração. Noutra forma de realização, a administração intranasal ou por outras vias mucosas de uma composição compreendendo VLPs pode induzir um anticorpo ou outra resposta imunitária que irá induzir a proteção cruzada contra outras estirpes ou organismos que causam infeção. Por exemplo, uma VLP que compreende proteína da gripe, quando administrada a um vertebrado, pode induzir proteção cruzada contra várias estirpes de gripe. A administração pode ser sistémica ou local.
Ainda noutra forma de realização, a formulação vacinai e/ou antigénica é administrada de modo a atingir tecidos de mucosas, a fim de desencadear uma resposta imunitária no local de imunização. Por exemplo, tecidos de mucosas, tais como tecido linfoide associado ao intestino (GALT) podem ser alvos para a imunização usando a administração oral de composições que contêm adjuvantes com propriedades de direcionamento da mucosa particulares. Tecidos de mucosas adicionais também podem ser direcionados, tais como o tecido linfoide da nasofaringe (NALT) e tecido linfoide associado aos brônquios (BALT).
As vacinas e/ou formulações antigénicas podem também ser administradas num regime de dosagem, por exemplo, uma administração inicial da composição vacinai com administrações de reforço subsequentes. Em formas de realização particulares, uma segunda dose da composição é administrada em qualquer momento desde duas semanas até um ano, preferivelmente desde cerca de 1, cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5 até cerca de 6 meses, após a administração inicial. Adicionalmente, uma terceira dose pode ser administrada após a segunda dose, e desde cerca de três meses até cerca de dois anos, ou mesmo mais, preferivelmente cerca de 4, cerca de 5, ou cerca de 6 meses ou cerca de 7 meses até cerca de um ano após a administração inicial. A terceira dose pode ser administrada, opcionalmente, quando são detetados no soro e/ou urina ou secreções mucosas do sujeito, após a segunda dose, níveis baixos ou inexistentes de imunoglobulinas específicas. Numa de realização preferida, uma segunda dose é administrada cerca de um mês após a primeira administração e uma terceira dose é administrada cerca de seis meses após a primeira administração. Noutra forma de realização, a segunda dose é administrada cerca de seis meses após a primeira administração. Noutra forma de realização, as ditas VLPs podem ser administradas como parte de uma terapêutica de combinação. Por exemplo, as VLPs podem ser formuladas com outras composições imunogénicas, antivirais e/ou antibióticos. A dosagem da formulação farmacêutica pode ser facilmente determinada pelo perito na especialidade, por exemplo, identificando primeiramente as doses eficazes para provocar uma resposta imunitária profilática ou terapêutica, por exemplo, através da medição do título sérico de imunoglobulinas específicas de vírus ou através da medição da razão inibidora de anticorpos em amostras de soro ou amostras de urina, ou secreções mucosas. As ditas dosagens podem ser determinadas a partir de estudos com animais. Uma lista não limitante de animais utilizados para estudar a eficácia de vacinas incluem o porquinho-da-índia, hámster, furões, chinchila, ratinho e rato do algodão. A maioria dos animais não são hospedeiros naturais para agentes infeciosos, mas podem servir em estudos de vários aspetos da doença. Por exemplo, qualquer um dos animais acima pode ser administrado com doses de um candidato a vacina, por exemplo, VLPs, para caracterizar parcialmente a resposta imunitária induzida e/ou para determinar se quaisquer anticorpos neutralizantes foram produzidos. Por exemplo, muitos estudos têm sido realizados no modelo do ratinho porque os ratinhos são de tamanho pequeno e o seu baixo custo permite que os investigadores realizem estudos em maior escala.
Adicionalmente, estudos clínicos em seres humanos podem ser realizados para determinar a dose eficaz preferida para os seres humanos por um perito na especialidade. Tais estudos clínicos são rotina e são bem conhecidos na técnica. A dose precisa a ser empregue também dependerá da via de administração. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas a partir de sistemas de teste em animais ou in vitro.
Tal como também é bem conhecido na técnica, a imunogenicidade de uma composição particular pode ser aumentada através da utilização de estimuladores não específicos da resposta imunitária, conhecidos como adjuvantes. Os adjuvantes têm sido utilizados experimentalmente para promover um aumento generalizado na imunidade contra antigénios desconhecidos (por exemplo, documento de patente U.S. N.° 4.877.611) . Os protocolos de imunização utilizaram adjuvantes para estimular respostas durante muitos anos, e como tal, os adjuvantes são bem conhecidos para um perito na especialidade. Alguns adjuvantes afetam a maneira como os antigénios são apresentados. Por exemplo, a resposta imunitária é aumentada quando os antigénios de proteínas são precipitados por alúmen. A emulsificação de antigénios também prolonga a duração da apresentação de antigénio. A inclusão de um adjuvante descrita em Vogel et al., "A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients (2a Edição)", é prevista dentro do âmbito da presente invenção.
Adjuvantes exemplares incluem adjuvante completo de Freund (um estimulador não especifico da resposta imunitária contendo Mycobacterium tuberculosis morto), adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio. Outros adjuvantes compreendem GMCSP, BCG, hidróxido de alumínio, compostos de MDP, tais como thur-MDP e nor-MDP, CGP (MTP-PE), lípido A e monofosforil-lípido A (MPL). RIBI, que contém três componentes extraídos a partir de bactérias, MPL, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS) numa emulsão de Tween 80/esqualeno a 2% está também contemplada. MF-59, Novasomes®, antigénios de MHC também podem ser utilizados.
Numa forma de realização, o adjuvante é uma vesícula lipídica paucilamelar que possui cerca de 2-10 bicamadas dispostas sob a forma de conchas sensivelmente esféricas separadas por camadas aquosas que rodeiam uma grande cavidade central amorfa livre de bicamadas lipídicas. As vesículas lipídicas paucilamelares podem atuar de modo a estimular a resposta imunitária de várias maneiras, como estimuladores não específicos, como portadores para o antigénio, como portadores de adjuvantes adicionais, e combinações dos mesmos. As vesículas lipídicas paucilamelares agem como estimuladores imunitários não específicos quando, por exemplo, a vacina é preparada misturando por o antigénio com as vesículas pré-formadas de modo que o antigénio permanece extracelular em relação às vesículas. Ao encapsular um antigénio no interior da cavidade central da vesícula, a vesícula atua como um estimulador imunitário e como um portador para o antigénio. Noutra forma de realização, as vesículas são feitos principalmente de vesículas não fosfolipídicas. Noutra forma de realização, as vesículas são Novasomes. As Novasomes® são vesículas paucilamelares não fosfolipídicas que variam entre cerca de 100 nm até cerca de 500 nm. Elas compreendem Brij 72, colesterol, ácido oleico e esqualeno. As Novasomes foram demonstradas como sendo um adjuvante eficaz para antigénios de gripe (vejam-se, os documentos de Patente U.S. 5.629.021, 6.387.373 e 4.911.928.
Um outro método de indução de uma resposta imunitária pode ser conseguido por formulação das VLPs da presente invenção com "estimuladores imunitários". Estes são os próprios mensageiros químicos do corpo (citocinas) para aumentar a resposta do sistema imunitário. Estimuladores imunitários incluem, mas não se limitam a, várias citocinas, linfocinas e quimiocinas com atividades imunoestimulatórias, imunopotenciadoras e pró-inflamatórias, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL- 12, IL-13); fatores de crescimento (por exemplo, fator de estimulação de colónias (CSF) de granulócitos-macrófagos (GM)); e outras moléculas imunoestimulantes, tais como fator inflamatório de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. As moléculas imunoestimulantes podem ser administradas na mesma formulação que as VLPs de RSV, ou podem ser administradas separadamente. Tanto a proteína como um vetor de expressão que codifica a proteína pode ser administrada para produzir um efeito imunoestimulante. Deste modo, numa forma de realização, o pedido descreve formulações vacinais e antigénicas que compreendem um adjuvante e/ou um estimulador imunitário.
Deste modo, descreve-se no presente documento uma formulação que compreende uma VLP quimérica compreendendo um Ml aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária (ou pelo menos uma proteína de um agente infecioso) e adjuvante e/ou um estimulador imunitário. Noutra forma de realização, o dito adjuvante são Novasomes. Noutra forma de realização, a dita formulação é adequada para administração a seres humanos. Noutra forma de realização, a formulação é administrada a um vertebrado por via oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea. Noutra forma de realização, diferentes VLPs quiméricas são misturadas em conjunto para criar uma formulação multivalente. Estas VLPs podem compreender VLPs HA e/ou NA de diferentes estirpes do vírus da gripe (por exemplo, gripe A e/ou gripe B) ou proteína de diferentes agentes infeciosos (por exemplo, RSV, coronavírus ou VIH).
Embora a estimulação de imunidade com uma única dose seja preferida, dosagens adicionais podem ser administradas pela mesma ou diferente via para atingir o efeito desejado. Em recém-nascidos e lactentes, por exemplo, administrações múltiplas podem ser necessárias para desencadear níveis suficientes de imunidade. A administração pode continuar em intervalos ao longo da infância, conforme necessário para manter níveis suficientes de proteção contra as infeções. De forma semelhante, os adultos que são particularmente suscetíveis a infeções repetidas ou graves, tais como, por exemplo, profissionais de saúde, trabalhadores de creches, familiares de crianças pequenas, idosos e indivíduos com função cardiopulmonar comprometida podem exigir imunizações múltiplas para estabelecer e/ou manter respostas imunitárias protetoras. Os níveis de imunidade induzida podem ser monitorizados, por exemplo, pela medição das quantidades de anticorpos neutralizantes secretores e do soro, e dosagens ajustadas ou vacinações repetidas, conforme necessário para induzir e manter níveis desejados de proteção. Métodos de estimulação de uma resposta imunitária
Conforme mencionado acima, as VLP produzidas pela presente invenção são úteis para a preparação de composições que estimulam uma resposta imunitária que confere imunidade a agentes infeciosos. Tanto a imunidade celular como da mucosa podem contribuir para a imunidade a agentes infeciosos e doenças. Os anticorpos secretados localmente no trato respiratório superior são um fator importante na resistência à infeção natural. A imunoglobulina A secretora (slgA) está envolvida na proteção do trato respiratório superior e a IgG sérica na proteção do trato respiratório inferior. A resposta imunitária induzida por uma infeção protege contra reinfeção com o mesmo vírus ou com uma estirpe virai antigenicamente semelhante. Por exemplo, a gripe sofre alterações frequentes e imprevisíveis; portanto, após a infeção natural, o período efetivo de proteção fornecido pela imunidade do hospedeiro pode ser de apenas alguns anos contra as novas estirpes do vírus que circulam na comunidade.
As VLP s produzidas pela invenção podem induzir a imunidade num vertebrado (por exemplo, um ser humano), quando administradas ao dito vertebrado. Os resultados de imunidade de uma resposta imunitária contra VLPs da invenção que protege ou atenua a infeção, ou pelo menos, reduz um sintoma da infeção no dito vertebrado. Em alguns casos, se o dito vertebrado está infetado, a dita infeção será assintomática. A resposta pode não ser uma resposta de proteção integral. Neste caso, se o dito vertebrado é infetado com um agente infecioso, o vertebrado apresentará sintomas reduzidos ou uma menor duração dos sintomas em comparação com um animal vertebrado não imunizado. 0 presente pedido descreve um método de indução da imunidade num vertebrado que compreende administrar ao dito vertebrado uma VLP que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização, a dita resposta imunitária é uma resposta imunitária humoral. Noutra forma de realização, a dita resposta imunitária é uma resposta imunitária celular. Noutra forma de realização, a dita proteína de gripe não aviária é HA e/ou NA a partir de um vírus de gripe não aviária. Noutra forma de realização, a dita proteína de gripe não aviária é uma proteína de gripe sazonal. Noutra forma de realização, a dita HA ou NA tem atividade de hemaglutinina ou neuraminidase, respetivamente. Numa forma de realização, as ditas HA e/ou NA são proteínas quiméricas. Noutra forma de realização, as ditas proteínas quiméricas compreendem domínios externos de sequências de proteínas HA e/ou NA de gripe não aviária fundidas com os domínios terminais citoplasmáticos e/ou transmembranares da região citoplasmática de HA e/ou NA aviária. Noutra forma de realização, as ditas HA e/ou NA de gripe não aviária são a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005 e os ditos domínios terminais transmembranares e/ou citoplasmáticos de HA e/ou NA de gripe aviária são a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita Ml é a partir da estirpe de gripe A/Indonesia/5/05. Noutra forma de realização, a dita HA e/ou NA é a partir da estirpe de gripe A/Wisconsin/67/2005.
Conforme utilizado no presente documento, um "anticorpo" é uma proteína que compreende um ou mais polipéptidos substancialmente ou parcialmente codificados por genes de imunoglobulina ou fragmentos de genes de imunoglobulinas. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes de região constante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem uma miríade de genes de região variável de imunoglobulina. As cadeias leves são classificadas como kappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como γ, μ, α, δ, ou ε, que por sua vez definem as classes de imunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respetivamente. Uma unidade estrutural de imunoglobulina (anticorpo) típica compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipéptidos, tendo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD) . O terminal N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento de antigénio. Os anticorpos existem como imunoglobulinas intactas ou como um número de fragmentos bem caracterizados produzidos por digestão com várias peptidases.
Noutra forma de realização, o pedido descreve um método de indução de uma resposta celular protetora contra uma infeção ou pelo menos contra um sintoma da mesma num sujeito, compreendendo administrar pelo menos uma dose eficaz de VLPs da invenção, em que as ditas VLPs compreendem uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. A imunidade mediada por células também desempenha um papel na recuperação da infeção e pode prevenir complicações adicionais e contribuir para a imunidade a longo prazo.
Conforme mencionado acima, as VLPs produzidas pela invenção podem prevenir ou reduzir pelo menos um sintoma de uma infeção num sujeito quando administradas ao dito sujeito. A maioria dos sintomas da maioria das infeções são é bem conhecida na técnica. Assim, o método compreende a prevenção ou redução de pelo menos um sintoma associado com uma infeção. A redução num sintoma pode ser determinada subjetiva ou objetivamente, por exemplo, por autoavaliação por um sujeito, pela avaliação de um clínico ou através da realização de um ensaio ou medição apropriada (por exemplo, da temperatura corporal), incluindo, por exemplo, uma avaliação da qualidade de vida, uma progressão retardada de uma infeção ou sintomas adicionais, a gravidade reduzida dos sintomas ou ensaios adequados (por exemplo, título de anticorpos e/ou ensaio de ativação de células T). A avaliação objetiva compreende avaliações tanto de seres humanos como animais. 0 presente pedido descreve um método de prevenção e/ou redução de uma infeção ou de um sintoma da mesma, que compreende administrar ao dito vertebrado uma VLP quimérica que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária. Numa forma de realização a dita infeção é uma infeção virai. Noutra forma de realização, a dita infeção virai é uma infeção por gripe.
Uma estratégia para o controlo de doenças infeciosas durante um surto, por exemplo, de gripe, é a vacinação universal de indivíduos saudáveis, incluindo crianças. Por exemplo, a vacinação com vacinas da gripe atuais de cerca de 80% dos alunos numa comunidade diminuiu as doenças respiratórias em adultos e excesso de mortes em idosos (Reichert et al. , 2001) . Este conceito é conhecido como imunidade de comunidade ou "imunidade de rebanho" e pensa-se que desenvolve um papel importante na proteção da comunidade contra doenças. Uma vez que as pessoas vacinadas apresentam anticorpos que neutralizam um agente infecioso, por exemplo, vírus da gripe, elas têm muito menos probabilidade de transmitir o dito agente a outras pessoas. Assim, mesmo as pessoas que não tenham sido vacinadas (e aquelas cujos vacinações se tornaram enfraquecidas ou cujas vacinas não são totalmente eficazes) podem, muitas vezes, ser protegidas pela imunidade de rebanho, porque as pessoas vacinadas ao seu redor não ficam doentes. A imunidade de rebanho é mais eficaz à medida que a percentagem de pessoas vacinadas aumenta. Acredita-se que aproximadamente 95% das pessoas da comunidade devem ser protegidas por uma vacina para conseguir imunidade de rebanho. As pessoas que não estão imunizados aumentam a probabilidade de que elas e outros contraiam a doença.
Assim, também é descrito no presente documento um método de redução da gravidade de uma doença infeciosa numa população, que compreende a administração de uma VLP que compreende uma proteína Ml de gripe aviária e pelo menos uma proteína de gripe não aviária a suficientes indivíduos na dita população, de modo a evitar ou diminuir a probabilidade de transmissão a outro indivíduo na dita população. Numa forma de realização, a dita doença infeciosa é causada pelo vírus da gripe. 0 pedido também descreve um método de indução de imunidade contra um agente infecioso numa população ou uma comunidade, de modo de reduzir a incidência de infeções entre indivíduos imunocomprometidos ou não vacinados através da administração de VLPs da invenção a uma população de uma comunidade. Numa forma de realização, a maioria das crianças em idade escolar são imunizadas por administração das VLPs da invenção. Noutra forma de realização, os indivíduos mais saudáveis numa comunidade são imunizados por administração das VLPs da invenção. Noutra forma de realização, as VLPs da presente invenção são parte de uma estratégia de "vacinação dinâmica". A vacinação dinâmica consiste na produção estável de uma vacina de baixa eficácia que está relacionada com uma estirpe de pandemia emergente, mas que devido a uma deriva antigénica pode não conferir uma proteção completa num mamífero (ver Germann et al., 2006) . A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos seguintes que não devem ser interpretados como limitativos. EXEMPLOS Exemplo 1
Expressão de VLPs aviárias e sazonais a partir de dois vetores de baculovirus
Proteínas Ml e HA de gripe aviária e sazonal foram clonadas e expressas num sistema de expressão de baculovirus. Neste exemplo, A/Indonesia/5/05 foi clonada num baculovirus e a HA e/ou NA foi clonada noutro vetor de baculovirus. Ambos os vírus foram co-infetados em células de inseto Sf9 e cultivados sob condições que permitem a formação de VLP. As células que compreendem HA e Ml sazonal, HA e Ml aviária ou uma combinação de HA e Ml sazonal e aviária foram cultivadas sob condições que permitem a formação de VLPs. As estirpes de gripe sazonal utilizadas para estas experiências foram A/Fujian/411/2002 e A/Wisconsin/67/2005 e a estirpe de gripe aviária utilizada foi A/Indonesia/5 /05.
Em seguida, as VLPs foram colhidas e isoladas do sobrenadante por centrifugação e por um gradiente em passos de sacarose descontínuo. A fração que compreende as VLPs foi recolhida a partir do topo do gradiente. As VLPs isoladas a partir do gradiente de sacarose foram analisadas por SDS-PAGE e Western blot. Estes dados são ilustrados na Figura 1 e 2. A Figura 1 representa um gel de SDS-PAGE corado. As pistas no gel compreendem o seguinte: 1 a 5, Ml de A/Fujian com 4 HAs diferentes ou isolada; 6 a 10, A/Indo/Ml com 4 HAs diferentes ou isolada; 11 a 14, vários controlos.
Comparando as bandas no gel, as pistas que compreendem VLPs compreendendo Ml aviária têm bandas mais fortes de Ml e HA nas mesmas pistas, enquanto as pistas que compreendem a gripe sazonal não. Bandas de Ml e HA na mesma pista são indicativas da associação de HA com Ml. Esta associação é indicativa da formação de VLP compreendendo HA e Ml. Estes dados fornecem evidências de que proteínas da gripe aviária formam VLPs de forma mais eficiente do que a Ml de gripe sazonal com envelopes homólogos ou heterólogos. Estes dados também mostram que a Ml de gripe aviária é fortemente expressa e estável quando comparada com a Ml de gripe sazonal. A Figura 2 é um Western blot que mostra a expressão de Ml. Esta transferência mostra que a Ml de gripe aviária é fortemente expressa quando comparada com a Ml sazonal Ml. A intensidade das bandas indica que existe mais Ml, e portanto, mais VLPs.
Exemplo 2
Expressão de VLPs aviárias e sazonais a partir de um vetor de baculovirus
Proteínas Ml e HA de gripe aviária e sazonal foram clonadas e expressas num sistema de expressão de baculovirus. Neste exemplo, Ml de A/Indonesia/5/05 e HA e NA de A/Fujian/411/2002 foram clonadas num vetor de baculovirus. 0 vírus recombinante foi infetado em células de inseto Sf9 e cultivado sob condições que permitem a formação de VLP. As células que compreendem HA e Ml sazonal, HA e Ml aviária ou uma combinação de HA e Ml sazonal e aviária foram cultivadas sob condições que permitem a formação de VLPs. As estirpes de gripe sazonal utilizadas para estas experiências foram A/Fujian/411/2002 e A/Wisconsin/67/2005 e a estirpe de gripe aviária utilizada foi A/Indonesia/5/05.
Em seguida, as VLPs foram colhidas e isoladas do sobrenadante por centrifugação e por um gradiente em passos de sacarose descontínuo. A fração que compreende as VLPs foi recolhida a partir do topo do gradiente. As VLPs isoladas a partir do gradiente de sacarose foram analisadas por SDS-PAGE e Western immunoblot. Estes dados são ilustrados na Figura 3 e 4. A Figura 3 é um gel de SDS-PAGE corado. As pistas no gel compreendem o seguinte: 1 e 2 é VLPs de A/Fujian (Ml, HA e NA) e a pista 3 compreende A/Indo/ Ml com HA e NA de A/Fujian.
Comparando as bandas no gel, a pista que compreende VLPs de A/Indo/ Ml têm bandas mais fortes de Ml e HA nas mesmas pistas, enquanto as pistas que compreendem A/Fujian não. Bandas de Ml, HA e NA na mesma pista são indicativas da associação de HA e NA com Ml. Esta associação é indicativa da formação de VLP compreendendo HA, NA e Ml. Estes dados fornecem evidências de que proteínas da gripe aviária formam VLPs com maior eficiência do que VLPs baseadas na Ml de gripe sazonal. Estes dados também mostram que a Ml da gripe aviária é fortemente expressa e estável em comparação com a Ml de gripe sazonal. A Figura 4 é um Western blot que mostra a expressão de Ml. Esta transferência mostra que VLPs compreendendo endo A/Indo/Ml e HA, NA de A/Fujian são mais fortemente expressas em comparação com VLPs de A/Fujian. A intensidade das bandas indica que existe mais Ml, HA e NA nas pistas com VLPs de Ml aviária, e portanto, mais VLPs.
Exemplo 3
Expressão de construções de HA e NA de gripe B quiméricas utilizando proteína de matriz de A/Indonesia/5/05 comum para montagem de VLPs
As sequências abaixo descrevem as sequências terminais e transmembranares derivadas a partir de HA e NA de A/Indonesia/5/05 (sublinhado). As sequências terminais e transmembranares de moléculas de HA e NA podem ser determinadas utilizando software de predição GCG/Accelrys ou um software semelhante, bem como por outros métodos. A localização exata de junções para as sequências de Indonesia/5/05 podem variar.
As sequências abaixo são exemplos de uma HA de estirpe B quimérica com uma extremidade de HA de A/Indonesia/5/05, bem como uma NA de estirpe B quimérica com uma substituição de NA de A/Indo das regiões de endodominio e transmembranares. Estas sequências são co-expressas num sistema de expressão de baculovirus, com uma proteína Ml de gripe aviária para produzir VLPs quiméricas que expressam antigénios da gripe B sobre a superfície das VLPs.
Hemaglutinina, HA, a partir de vírus da Gripe B (B/Hong Kong/557/2000) ABL76892 (SEQ ID NO. 1) 1 mkaiivllmv vtsnadrict gítssnspliv vktatqgevn vtgviplttt ptkshfanlk 61 gtrtrgklcp dclnctdldv algrpmcvgt tpsakasílh evrpvtsgcf pimhdrtkir 121 qlpnllrgye nirlstqnvi daekapggpy rlgtsgscpn atsksgffat mawavpkdnn 181 knatnpltve vpyvcteged qitvwgfhsd nktqniknlyg dsnpqkftss angvtthyvs 241 qiggfpdqte dgglpqsgri wdymvqkpg ktgtivyqrg vllpqkvwca sgrskvikgs 301 lpligeadcl hekygglnks kpyytgehak aigncpiwvk tplklangtk yrppakllke 361 rgffgaiagf leggwegmia gwhgytshga hgvavaadlk stqeainkit knlnslsele 421 vknlqrlsga mdelhneile ldekvddlra dtissqiela vllsnegiin sedehllale 481 rklkkmlgps avdigngcfe tkhkcnqccl driaagtfna gefslptfds lnitaaslnd 541 dqldntlt-QIL SIYSTVASSL ÃL&IMMAGLS LWMCSNGSLQ CRIC1
Neuraminidase, NA, a partir de Gripe B/Shanghai/361/02 ISDN129538 (SEQ ID NO. 2) ΜΝΡΜΰΚΙΙΤΙ68Ι0ΜνΐΟΐν5.ί?Μ,010ΜΜΙβ8ΡΙίίΚΡ8ΤΤΕΙΤΑΡΤΜΡίΡΰ&ΜΑ3Μν0Α.νΝΚ3ΑΤΚ(ϊνΤίυ.ΡΕΡΕ
WTYPRLSCPGSTFQKALLISPHRFGETKGNSAPLIIREPFIACGPKECKHFALTHYAAQPGGYYKGTREDRNKLRHL I3VKLGKIPTVENSIFHMAAWSGSACHDGKEWTYIGVDGPDSNALLKIKYGEAYTDTYHSYANNILRTQESACKCIG GHCYLMITDGSASGISECRFLKIREGRIIKEIFPTGRVKHTEECTCGFASHKTIECACRDNSYTAKRPFVKLNVETD TAEIRLMCTETYLDTPRPDDGSITGPCESNGNKGSGGIKGGFVHQRMASKIGRWY3RTMSKTKRMGMGLYVKYDGDP WIDSDALALSGVMVSMEEPGWYSFGFEIKDKK.CDVPCIGIEMVHDGGKETWHSAATAIYCLMGSGQLLWDTVTGVDM AL
Ml a partir de A/Indonesia (SEQ ID NO. 3)
MSLLTEVETY VLSIIPSGPL KAEIAQKLED VFAGKNTDLE ALMEWLKTRP ILSPLTKGIL GFVFTLTVPS ERGLQRRRFV QNALNGNGDP NNMDRAVKLY KKLKREITFH GAKEVSLSYS TGALASCMGL IYNRMGTVTT EVAFGLVCAT CEQIADSQHR SHRQMATITN PLIRHEKRMV LASTTAKAME QMAGSSEQAA
EAMEVANQAR QMVQAMRTIG THPNSSAGLR DNLLENLQAY QKRMGVQMQR FK
Exemplo 4
Fabrico de VLPs quiméricas com proteína S de coronavírus
Materiais e métodos Células de inseto Sf9 de Spodoptera frugiperda foram (ATCC CRL-1711) foram mantidas na forma de suspensão em meio isento de soro de inseto HyQ-SFX (Hyclone, Logan, UT), a 28 °C. Um sistema de expressão de baculovirus Bac-to-Bac (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado com um vetor de transferência pFastBac 1 em células de E. coli DHlOBac para a geração de vetores de baculovirus recombinantes expressando os genes de S de SARS e Ml de gripe. A sequência de aminoácidos da proteína spike (S) da estirpe Urbani de coronavírus de SARS (SARS-CoV) foi obtida a partir do número de acesso do NCBI AAP13441. A sequência de aminoácidos da hemaglutinina de virus da gripe A (A/Indonesia/5/5(H5N1)) foi obtida a partir do número de acesso do NCBI ABP51969. Para a construção da proteína quimérica S de SARS, o domínio transmembranar e de carboxilo terminal (TM/CT) da proteína S (aa 1196-1255) foi removido, e o TM/CT de HA de Indonesia H5N1 (aa 531 -568) foi adicionado depois do aminoácido 1195 da proteína S. A sequência de aminoácidos da proteína quimérica S-HA é apresentada na Figura 5 (SEQ ID NO. 10) . A sequência de aminoácidos da proteína de matriz 1 (Ml) de Indonesia H5N1 de gripe foi obtida a partir do número de acesso do NCBI ABW06359 (Figura 6).
As sequências de ADN otimizadas por codões de Ml e S quiméricas para expressão em células de inseto foram sintetizadas em Geneart (Alemanha) e subclonadas nos sítios BamHI e HindIII de pFastBac 1 individualmente. O fragmento SnaBI/PuvI contendo a sequência codificante de pFastBacl-Ml foi excisado e inserido no fragmento Hpal/Pvul contendo a sequência codificante de S de pFastBacl-S. O vetor em tandem produzido que expressa duas proteínas é apresentado na Figura 7. Este vetor foi usado para transformar DHlOBac para obter o bacmídeo que foi transfectado em células Sf9 para obter o baculovirus recombinante.
Expressão, purificação e caracterização de VLPs Células de inseto Sf9 foram infetadas durante 64 horas, a uma densidade celular de 2 x 106 células/ml, com baculovirus recombinantes expressando tanto S de SARS e Ml de Indo quiméricas numa MOI = 1. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos por centrifugação a 4000 g. Os sobrenadantes livres de células foram concentrados por ultrafiltração (UF) com um filtro de fibra oca MWCO de 500 kDa (GE Healthcare). O material retido foi permutado com tampão com diafiltração (DF) até TrisCl a 25 mM, pH 8,0, NaCl a 300 mM. O material retido de UF/DF foi carregado numa coluna de permuta iónica (Fractogel TMAE, EMD) em equilíbrio no mesmo tampão. As VLPs passaram através da coluna, enquanto o ADN e baculovirus se ligaram à coluna. As frações de fluxo através que contendo VLPs são adicionalmente concentradas com ultrafiltração antes de carregamento numa coluna de exclusão por tamanho Sephacryl S500 (GE Healthcare). O agrupamento do pico de VLPs a partir da coluna de exclusão por tamanho foi analisado com SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris NuPage, Invitrogen) e densitometria para a pureza. As VLPs foram também analisadas com um analisador de tamanho de partículas (Malvern Zetasizer NanoSeries NanoZS) e microscopia eletrónica. Os anticorpos utilizados neste estudo procederam dos seguintes fornecedores: anti-S de SARS de coelho e normal anti-IgG de coelho (IMGNEX), anti-S de SARS de coelho (Abgent), anti-Ml de gripe de ratinho (Serotec).
Resultados VLPs quiméricas de Ml de Indo/S de SARS foram analisadas por SDS-PAGE, densitometria e Western blot (Figura 8). A pureza para a proteína S de SARS foi de 13,7% e a pureza para a proteína Ml de Indo foi de 67,6%. A pureza combinada para S e Ml é de 81,3%. O Western blot confirmou a identidade de S e Ml (Figura 8, pista 2).
Baculovirus recombinantes que expressaram as proteínas spike (S), de membrana (M) e de envelope (E) de SARS de uma forma em tandem também foram expressos. Expressaram-se e purificaram-se as VLPs de SARS de tipo selvagem com o mesmo protocolo que foi utilizado para purificar VLPs quiméricas. A pureza das VLPs de SARS de tipo selvagem (proteínas não de gripe) foi analisada por SDS-PAGE e Western blot (Figura 9). As proteínas S e M dificilmente podem ser vistas no gel corado com Coomassie e as proteínas contaminantes foram muito mais proeminentes. Os dados indicam que as VLPs de SARS de tipo selvagem são insuficientes para formar o sistema de expressão de células de inseto de baculovírus enquanto as VLPs quiméricas de Ml de Indo/S de SARS aumentaram grandemente o rendimento e pureza das VLPs produzidas.
Em seguida, analisou-se o tamanho médio de partícula de VLPs quiméricas purificadas como sendo de 159,2 nm (Figura 10) . Foram obtidas imagens das VLPs quiméricas com coloração negativa de microscopia eletrónica (ME) (Figura 11) . O tamanho e morfologia das VLPs quiméricas são muito semelhantes às imagens de ME publicadas de coronavírus de SARS (Figura 12) . Têm cerca de 100 nm de diâmetro com uma estrutura de coroa no bordo exterior. A ME com imuno-ouro com anticorpo anti-S de SARS confirmou que as proteínas S de SARS se localizavam na superfície de VLPs quiméricas (Figura 12).
Os inventores conceberam uma VLP quimérica compreendendo o gene principal de spike (S) do coronavírus (CoV) que provoca a SARS. Uma glicoproteína de envelope quimérica S de CoV foi produzida através da substituição dos domínios transmembranares e de C-terminal (endodomínio) com sequências análogas a partir de HA de gripe aviária (estirpe A/Indonesia/5/05 H5N1). Níveis inesperadamente elevados de VLPs de SARS foram produzidos em células de inseto Sf9 infetadas com um baculovírus que expressa a glicoproteína S de SARS e a proteína de matriz Ml aviária. As VLPs quiméricas que compreendem a proteína S têm uma morfologia que é praticamente idêntica à do CoV de tipo selvagem com a proteína spike S quimérica recombinante formando uma coroa num envelope lipídico sobre partículas esféricas com o núcleo de uma Ml de gripe aviária. Estas VLPs de gripe aviária-SARS quiméricas recombinantes são eficazmente produzidas em células de inseto e foram purificadas conforme descrito anteriormente.
Estes dados fornecem um exemplo excelente de que a Ml aviária, por exemplo, proteína Ml de Indonesia H5N1, pode formar VLPs quiméricas com o antigénio de superfície de outros vírus tais como o SARS-CoV. As VLPs quiméricas com proteína de gripe aviária como uma cadeia principal podem ser purificadas através de um procedimento de fabrico que requer apenas duas etapas de cromatografia. 0 tamanho e morfologia das VLPs quiméricas são semelhantes aos dos vírus de tipo selvagem que carregam o mesmo antigénio de superfície.
Exemplo 5
VLPs quiméricas de gripe B 0 antigénio do vírus da gripe B é um componente importante das vacinas contra a gripe sazonal. Os níveis de expressão do antigénio de gripe B são criticamente importantes para assegurar uma distribuição atempada de um número suficiente de doses de vacinas contra a gripe, de outra forma, podem ocorrer uma escassez de vacinas. As VLPs de gripe B para B/Florida/4/06 consistem em três proteínas, HA (SEQ ID NO 8), NA (SEQ ID NO. 9), e Ml (matriz), que são montadas numa estrutura de VLP. Genes de HA e NA foram obtidos por RT-PCR a partir do vírus de gripe B/Florida/4/06. De modo a melhorar os níveis de expressão das VLPs de gripe B, VLPs utilizando três proteínas Ml diferentes foram produzidas. Uma proteína Ml é derivada a partir do vírus B/Florida/4/06. 0 segundo gene de Ml é derivado a partir de uma estirpe de gripe B/Ann
Arbor/1/1986, que é normalmente utilizada para a preparação de vírus de gripe B recombinados vivos na indústria atual das vacinas contra a gripe. A terceira Ml é derivada a partir do vírus de gripe aviária A/Indonesia/5/05 (H5N1).
Assim, três tipos de VLPs de gripe B/Florida/4/06 foram produzidos em células Sf9, e os níveis de expressão foram comparados. Métodos. Os baculovírus foram manipulados para expressar genes de HA, NA, e Ml de comprimento completo de gripe. Genes de HA e NA foram obtidos por RT-PCR a partir do vírus de gripe B/Florida/4/06. 0 gene de Ml também foi gerado por RT-PCR a partir do vírus de gripe B/Florida/4/0 6. Alternativamente, o gene de Ml de B/Ann Arbor/1/1986 foi sintetizado (GeneArt, Alemanha) e gene de Ml de gripe A/Indonesia/5/05 (H5N1) também foi sintetizado (GeneArt, Alemanha). Cada gene foi clonado num vetor pFastBacl sob o controlo se um promotor de poliedrina de baculovírus (Invitrogen). Posteriormente, os genes de HA, NA, e Ml foram combinados em vetores em tandem conforme mostrado na Figura 13. Posteriormente, as construções de genes em tandem foram transferidas para vetores de Bacmideo de baculovírus AcMNPV, os ADNs de Bacmideo foram purificados e utilizados para transfetar células de inseto Sf9. Os baculovírus recombinantes resultantes foram purificados em placas e reservas de vírus foram preparadas em células Sf9.
Cerca de 30 ml de células Sf9, a cerca de 2xl06 células/ml em frascos de agitação de 125 ml, foram infetadas com baculovírus recombinantes que expressam os genes HA, NA, e Ml numa multiplicidade de infeção (MOI) de 1-3 partículas infeciosas por ml (ufp), incubadas a 27 °C com agitação constante, depois colhidas a 66 - 72 horas após infeção. O meio foi removido através de centrifugação de baixa velocidade. Posteriormente, os meios foram clarificados utilizando filtração através de filtros de 0,45 μΜ e os meios foram submetidos a ultracentrifugação durante 1 hora a 2 6.000 rpm através de uma camada de sacarose a 30%. Os sedimentos foram ressuspendidos em 200 ml de PBS e analisados por SDS-PAGE e Western blot (Figura 14) . Os sedimentos ressuspendidos foram também analisados em relação à capacidade para aglutinar glóbulos vermelhos de porquinho-da-índia in vitro. Os dados são apresentados na Figura 14. Os sedimentos ressuspendidos foram também analisados através de microscopia eletrónica de transmissão de coloração negativa.
Resultados. Ml derivada a partir de gripe A/Indonesia/5/05 (H5N1) apresentou níveis de expressão significativamente mais elevados através da coloração de gel de Coomassie (Figura 14, pista 3) em comparação com VLPs produzidas utilizando Ml de B/Florida/4/06 ou Ml de B/Ann Arbor/1/1986. Também, os títulos de HA de VLPs contendo Ml de A/Indonesia/5/05 (H5N1), foram 4-8 vezes mais elevados em comparação com os outros dois tipos de VLP. A microscopia eletrónica de VLPs que contêm a Ml de gripe A/Indonesia/5/05 (H5N1) tiveram uma concentração mais elevada de VLP e uma forma esférica mais regular em comparação com as outras duas VLPs (Figura 15).
Exemplo 6
Fabrico de VLPs quiméricas com proteína Fl de RSV
Células de inseto Sf9 de Spodoptera frugiperda são mantidas e cultivadas conforme essencialmente descrito acima. As sequências de ADN otimizadas por codões de Ml de gripe (SEQ ID NO: 3) e Fl de RSV quiméricas (HA TM/CY (SEQ ID NO: 12)) para a expressão em células de inseto são sintetizadas e subclonadas em pFastBac 1. O vetor resultante expressa ambas as proteínas. Este vetor é utilizado para transformar DHIOBac para obter o bacmideo que é transfectado em células Sf9 para obter o baculovírus recombinante. Células de inseto Sf9 foram infetadas durante 64 horas, a uma densidade celular de 2 x 106 células/ml, com baculovírus recombinantes expressando tanto Fl de RSV e Ml de Indo quiméricas (SEQ ID NO: 3) numa MOI = 1. Os sobrenadantes da cultura foram colhidos por centrifugação a 4000 g. Os sobrenadantes livres de células foram concentrados por ultrafiltração (UF) com um filtro de fibra oca MWCO de 500 kDa (GE Healthcare). O material retido foi permutado com tampão com diafiltração (DF) até TrisCl a 25 mM, pH 8,0, NaCl a 300 mM. O material retido de UF/DF foi carregado numa coluna de permuta iónica (Fractogel TMAE, EMD) . As VLPs passam através da coluna, enquanto o ADN e baculovírus se ligam à coluna. As frações de fluxo através contendo VLPs são adicionalmente concentradas com ultrafiltração antes de carregamento numa coluna de exclusão por tamanho Sephacryl S500 (GE Healthcare). O agrupamento do pico de VLPs a partir da coluna de exclusão por tamanho é analisado com SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris NuPage, Invitrogen) e densitometria para a pureza. As VLPs foram também analisadas com um analisador de tamanho de partículas (Malvern Zetasizer NanoSeries NanoZS) , SDS-PAGE e análise de Western blot e microscopia eletrónica.
Todas as patentes, publicações e pedidos de patente no presente documento são incorporados por referência na mesma extensão como se cada patente, publicação ou pedido de patente individual citado fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporado por referência. A descrição detalhada anterior foi fornecida apenas para clareza de compreensão e nenhumas limitações desnecessárias devem ser dela depreendidas já que modificações serão óbvias para os peritos na especialidade. Não constitui uma admissão que qualquer uma das informações fornecidas no presente documento seja técnica anterior ou relevante para as invenções presentemente reivindicadas, ou que qualquer publicação, especificamente ou implicitamente referenciada seja técnica anterior. A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado que aquele normalmente entendido por um perito na técnica à qual esta invenção pertence.
DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 20050118191 A [0058] • US 4877611 A [0099] • US 5629021 A [0101] • US 6387373 B [0101] • US 4911928 A [0101]
Documentos de não patente citados na descrição • Vaccine Production. FURMINGER et al. Textbook of Influenza. 324-332 [0003] • roduction of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation. MERTEN et al. Novel Strategies in Design and Production of Vaccines. 1996, 141-151 [0003] • SCHIRMBECK et al. Eur. J. Immunol., 1996, vol. 26, 2812- 2822 [0004] • ALI et al. J. Virol., 2000, vol. 74, 8709-19 [0034] • BERGER; KIMMEL. Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology. Academic Press, Inc, vol. 152 [0054] • SAMBROOK et al. Molecular Cloning--A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 2000, vol. 1-3 [0054] • Current Protocols in Molecular Biology. Current Protocols [0054] • VOGEL et al. A Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients [0099]
Lisboa, 14 de Julho de 2015

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para aumentar a eficiência da produção de partículas idênticas a vírus (VLP) numa célula hospedeira que compreende expressar uma proteína de matriz (Ml) de gripe aviária e proteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA) de gripe humana sazonal numa célula hospedeira, em que a proteína Ml de gripe aviária é uma proteína Ml de gripe A/Indonesia/5/05, e em que a dita eficiência aumentada da produção de VLP é relativa a uma célula hospedeira que expressa as ditas proteínas HA e NA com uma proteína Ml de gripe sazonal.
  2. 2. 0 método da reivindicação 1, em que a proteína HA de gripe tem atividade de hemaglutinina.
  3. 3. 0 método da reivindicação 1, em que a proteína NA de gripe tem atividade de neuraminidase.
  4. 4. 0 método da reivindicação 1, em que a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em: uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula de anfíbio, uma célula de ave e uma célula de mamífero.
  5. 5. 0 método da reivindicação 4 em que a célula hospedeira é uma célula de inseto selecionada a partir do grupo que consiste em: uma célula Sf9, uma célula Sf21, e uma célula de Trichoplusia ni.
  6. 6. 0 método da reivindicação 5, em que a célula de inseto é uma célula Sf9. Lisboa, 14 de Julho de 2015
PT121857122T 2007-07-19 2008-07-21 Vlps quiméricas de gripe aviária PT2540312E (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95070707P 2007-07-19 2007-07-19
US97059207P 2007-09-07 2007-09-07
US7183508P 2008-05-20 2008-05-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2540312E true PT2540312E (pt) 2015-08-31

Family

ID=40260107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT121857122T PT2540312E (pt) 2007-07-19 2008-07-21 Vlps quiméricas de gripe aviária

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20110008838A1 (pt)
EP (3) EP2175883A4 (pt)
JP (1) JP2010533737A (pt)
CN (1) CN101801411A (pt)
CA (1) CA2693899A1 (pt)
CY (1) CY1116583T1 (pt)
DK (1) DK2540312T3 (pt)
ES (1) ES2542644T3 (pt)
HR (1) HRP20150758T1 (pt)
HU (1) HUE025702T2 (pt)
PL (1) PL2540312T3 (pt)
PT (1) PT2540312E (pt)
SI (1) SI2540312T1 (pt)
WO (2) WO2009012489A1 (pt)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3718566B1 (en) 2008-12-09 2024-06-12 Novavax, Inc. Modified rsv f proteins and methods of their use
US11446374B2 (en) 2008-12-09 2022-09-20 Novavax, Inc. Modified RSV F proteins and methods of their use
KR20120018783A (ko) * 2009-05-01 2012-03-05 레드바이오텍 아게 다중 유전자 벡터에 의해 암호화된 재조합 바이러스-유사 입자
PL222497B1 (pl) 2009-06-26 2016-08-31 Inst Biochemii I Biofizyki Pan Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej
WO2011003100A2 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
EP2640405A4 (en) 2010-09-21 2015-04-15 Massachusetts Inst Technology TREATMENT AND / OR CHARACTERIZATION OF INFLUENZA; POLYPEPTIDES HA ADAPTED TO MAN
US10226527B2 (en) 2010-10-04 2019-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto
TWI526539B (zh) * 2010-12-22 2016-03-21 苜蓿股份有限公司 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp
JP6099573B2 (ja) * 2011-01-31 2017-03-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 新規なヘルペス抗原をコードする核酸分子、それを含むワクチン及びその使用方法
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
EP2760469A4 (en) * 2011-09-30 2015-03-18 Novavax Inc RECOMBINANT RSV-F NANOPARTICLE VACCINE AGAINST RESPIRATORY SYNZYTIAL VIRUS
CA3128591A1 (en) 2012-01-24 2013-08-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Parainfluenza virus 5 based vaccines
AU2013362935B2 (en) 2012-12-18 2018-10-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CN105101992A (zh) * 2013-02-11 2015-11-25 诺瓦瓦克斯股份有限公司 用于呼吸道合胞体病毒和流感的组合疫苗
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
US10426829B2 (en) 2015-09-03 2019-10-01 Novavax, Inc. Vaccine compositions having improved stability and immunogenicity
WO2017218624A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
KR20210004959A (ko) 2018-03-19 2021-01-13 노바백스, 인코포레이티드 다가 인플루엔자 나노입자 백신
CN110237248A (zh) * 2019-07-01 2019-09-17 大连民族大学 一种带状疱疹疫苗的制备方法
JP2023530445A (ja) * 2020-06-17 2023-07-18 メイッサ ヴァクシーン，インコーポレイテッド キメラｒｓｖおよびコロナウイルスタンパク質、免疫原性組成物、ならびに使用方法
GB202017649D0 (en) * 2020-11-09 2020-12-23 Autolus Ltd Polypeptide
CN116284455A (zh) * 2023-04-17 2023-06-23 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 一种带状疱疹病毒疫苗的嵌合抗原及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US4911928A (en) 1987-03-13 1990-03-27 Micro-Pak, Inc. Paucilamellar lipid vesicles
US6387373B1 (en) 1993-01-15 2002-05-14 Novavax, Inc. Vaccines containing paucilsmellar lipid vesicles as immunological adjuvants
US5629021A (en) 1995-01-31 1997-05-13 Novavax, Inc. Micellar nanoparticles
WO2003068933A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Novavax, Inc. Optimization of gene sequences of virus-like particles for expression in insect cells
US8592197B2 (en) * 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
MXPA04010902A (es) * 2004-11-03 2006-05-08 Alvaro Raul Lara Rodriguez Vacuna recombinante a partir de las proteinas ge, gi y gb del virus de varicela zoster como tratamiento y prevencion de esclerosis multiple.
US7951384B2 (en) * 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
SI1937301T1 (sl) * 2005-10-18 2015-08-31 Novavax, Inc. Funkcionalni influenčnemu virusu podobni delci (VLP)

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009012487A3 (en) 2009-12-30
EP2540312B1 (en) 2015-04-15
HUE025702T2 (en) 2016-04-28
HRP20150758T1 (hr) 2015-08-14
EP2175883A4 (en) 2011-11-30
CY1116583T1 (el) 2017-03-15
CA2693899A1 (en) 2009-01-22
JP2010533737A (ja) 2010-10-28
WO2009012487A2 (en) 2009-01-22
US20110008838A1 (en) 2011-01-13
CN101801411A (zh) 2010-08-11
DK2540312T3 (en) 2015-07-20
EP2175883A2 (en) 2010-04-21
EP2176427A1 (en) 2010-04-21
PL2540312T3 (pl) 2015-10-30
ES2542644T3 (es) 2015-08-07
EP2176427A4 (en) 2011-10-05
EP2540312A1 (en) 2013-01-02
WO2009012489A1 (en) 2009-01-22
SI2540312T1 (sl) 2015-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2542644T3 (es) VLPS quiméricas de la gripe aviar
US20230293667A1 (en) Modified rsv f proteins and methods of their use
US8551756B2 (en) Avian influenza chimeric VLPS
US9381239B2 (en) VLPS derived from cells that do not express a viral matrix or core protein
TWI488968B (zh) 功能性流行性感冒類病毒顆粒（ＶＬＰｓ）
US10544399B2 (en) Highly efficient influenza matrix (M1) proteins
WO2008061243A2 (en) Respiratory syncytial virus-virus like particle (vlps)
US20100330122A1 (en) VARICELLA ZOSTER VIRUS VIRUS-LIKE PARTICLES (VLPs) AND ANTIGENS
US20100247574A1 (en) CHIMERIC NEWCASTLE DISEASE VIRUS VLPs
WO2010077712A1 (en) Bovine respiratory syncytial virus virus-like particle (vlps)
US11446374B2 (en) Modified RSV F proteins and methods of their use
WO2010148386A1 (en) Swine-origin influenza a (h1n1) virus-like particles and methods of use thereof