JP2014513932A - ワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝子セグメントA(通常は3097塩基)は、pVP2−VP4−VP3の順で含む106kDaの前駆体ポリタンパク質をコードし、及び感染細胞のみに見られる15kDa非−構造VP5タンパク質をコードする。セグメントB(通常は2777塩基)は、マイナー内部ポリタンパク質VP1(94kDa)をコードし、これはビリオン−関連RNA−依存RNAポリメラーゼ(RdRp)である。
−前記幼魚をRTG−2細胞での再単離による測定でウイルス陽性とし:
−前記幼魚を免疫組織化学による測定でウイルス陰性とし:
−前記幼魚に、非感染幼魚と比較してIPNV病に対する保護を与え;及び
−前記幼魚に、IPN病の兆候を発現させない。
既に開示されたように、IPNVは通常は2つの構造タンパク質を持ち、これらはIPNVカプシドを形成する。IPNVのウイルスタンパク質(VP2)は、これらの2つの構造タンパク質の1つであり、型特異的モノクローナル抗体の産生に寄与することが示されている。これまで、VP2タンパク質の配列が、前記ウイルスが病原性又は非病原性かどうかを決定することが示唆されてきたが、後者の場合には、ここで、VP2タンパク質のあるアミノ酸が、前記非病原性ウイルスが病原性ウイルスへ戻るかを決定するために重要であることが示された。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基217が、Proであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221が、Thrであり;前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基2319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217はProであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
前記非病原性IPNVは配列番号1のアミノ酸残基200−319で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%同一性を持つアミノ酸配列を含むVP2タンパク質をコードする核酸を含み;
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217が、Proであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221が、Thrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217はProであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217が、Proであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221が、Thrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217はProであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217が、Proであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221が、Thrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217はProであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217が、Proであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221が、Thrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−好ましくは前記残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−好ましくは前記残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−好ましくは前記残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び/又は
−好ましくは前記残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−好ましくは前記残基217はProであり;及び/又は
−好ましくは前記残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;最も好ましくはAsnである;
−残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;最も好ましくはSerである;
−残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;最も好ましくはAspである;及び
−残基221がThrである。
−残基252が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはAsn又はGlnであり、最も好ましくはAsnである;及び/又は
−残基281が、Ser、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;より好ましくはSer又はCysであり、最も好ましくはSerである;及び/又は
−残基282が、Gln、Asp及びGluからなる群から選択され;より好ましくはAspである;及び/又は
−残基319が、Glu及びAspからなる群から選択され;最も好ましくはGluである;及び/又は
−残基217はProであり;及び/又は
−残基221はThrであり;
前記タンパク質が好ましくは、前記非病原性ウイルスを、IPNVに感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後でも病原性ウイルスへ戻さない。
−前記幼魚を、RTG−2細胞で再分離することで測定してウイルス陽性とし;
−前記幼魚を、免疫組織化学により測定してウイルス陰性とし;
−前記幼魚を、好ましくは非感染幼魚に比較して、IPN病に対して保護を与え;及び
−前記幼魚にIPN病の兆候を全く起こさせることがない。
−前記幼魚を、RTG−2細胞で再分離することで測定してウイルス陽性とし;
−前記幼魚を、免疫組織化学により測定してウイルス陰性とし;
−前記幼魚を、好ましくは本発明の第1の側面の前記生非病原性IPNVに暴露されていない幼魚に比較して、IPN病に対して保護を与え;及び
−前記幼魚にIPN病の兆候を全く起こさせることがない。
IPN−ワクチンの効果
ワクチン株
前記ワクチン株は、ここではG700株と参照され、海の中の一歳魚から収集されたIPNVの現場単離物であった。前記ウイルスが単離された魚は臨床的に健康であり、IPNに罹患していなかった。前記ワクチン株は、RTG−2細胞内で増殖させ、CHSE−214細胞で増量させた(力価:2.0x108TCID50/ml、1つのタンクにつき投与量:2.0ml、L−15媒体を用いて10mlに希釈)。
IPNVの感染株は、病原性V−1244株であった。この株をRTG−2細胞中で増殖させ、CHSE細胞で増量させた(力価:9.8x106TCID50/ml、1タンク当たりの投与量:20ml)。
使用された魚は野生サケ幼魚であり、合計約1560匹であり、Rauma川由来であった。卵は、10年以上の間、生遺伝子バンクHaukvik、S−Trondelagに保存されている繁殖用魚からのものであった。卵はVESOVikan孵化場で孵化させ、給餌開示に合わせて研究所に移動された。魚はS−2002により給餌された。
水質:淡水
温度:12±1℃
酸素濃度:出口で最小8mg/L
流量:十分なpO2を確保するための濃度に維持される(1分間に1タンク当たり0.1L)。
結果、細胞培地によるウイルスの再単離及びRT−PCR
免疫群1A−D及び2A−Dと同様に非免疫群(3A−E)を実験14日での感染の前にサンプリングした。前記免疫群は、RTG−2細胞での再単離後にIPNVについて陽性となった。これは陽性RTPCR結果で確認された。非免疫群は、細胞培地及びTR−PCRで陰性であった(表1)。
死亡率は、毎日記録され、死亡した魚(ある場合には)を毎日タンクから除いた。結果は図1及び図2に示される。
病原性及び遺伝子的安定性
ワクチン株のプラーク精製
IPNVのプラークは、固体支持体としてアガロースゲル(SeaPlaque)を用いてCHSE−214細胞中でG700株の段階希釈播種により得られた。3つのプラークが同定され、増殖させ、精製してクローン化した。これらの2つを、さらに前記VP2遺伝子の配列決定により特徴付けた。
幼魚の感染は、既存の規制(生ウイルスワクチンの文章化のための一般ヨーロッパ薬局方モノグラフに基づく)の要求に合致する公認実験施設であるVeso−Vikanで行われた。IPNVに感受性であることが知られるAquaGen繁殖種の大西洋サケが用いられた。幼魚は、給餌開始の時点でウイルス溶液に暴露された(感染)。最初の目的は、前記幼魚を6回前記ウイルスを継代させることであったが、幼魚の利用可能性の季節により3回の継代のみが実施できた。研究は、非連続的実験ブロックとして、次々に実験作業(次の実験に使用するためにウイルス再単離及び増殖)を行った。それぞれの実験は、それぞれの容器に100幼魚の3つの平行実験を含む。100幼魚を含む第4容器はまた、バックグラウンド死亡率に対するコントロールとして含まれた。ウイルス投与量は、約2x105TCID50/mlであり、給餌開始後約6日で浸漬により投与された。第1のサンプリングは、ウイルス暴露に続く21日で行われた。サンプリング後、第1及び第3の実験ブロックで、幼魚をストレスの対象とした(10分間容器内回りのネトペン(netpen)の動きと組み合わせて容器内の水量を低下させ;これを毎日1週間続ける)。これらの幼魚は、最終サンプリングまで28日以上観察された。死亡率は毎日記録された。
病原性及び遺伝子的不安定
細胞及びウイルス
Chinockサケ胚(細胞(CHSE−214;ATCC CCL−1681)を、20℃で、5%ウシ胎児血清(FBS、Medprobe)、2mLのL−グルタミン(Sigma−Aldrich)及び50μgm−1ゲンタマイシン(Sigma−Aldrich)を含むL−15培地(Signma−Aldrich)中に維持された。ニジマス生殖細胞(RTG−2;ATCC CCL−55)を、10%ウシ胎児血清、2mMのL−グルタミン及び50μgm−1ゲンタマイシンを含むL−15培地中で増殖された。
NVI−015RNAセグメントA及びBの全コード及び非−コード領域の全長cDNAクローンの生成は、Ya0及びVakhariaにより記載される手順に従って実施した(1998.Generation of infectious pancreatic necrosis virus from cloned cDNA.J.Virol.72:8913−8920)。組み換えIPNV Sp単離物rNVI−15PA(又はrNVI15VP2とされる)をSongらに記載されたように生成した((2005 Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation.Journal of Virology 79:10289−10299)。この組み換え単離物は、rNVI−115TA(又はrNVI15とされる)及びSp103の5’末端から由来する。これは、親の単離物Sp103Pro217Ala247に類似する病原性モチーフを持つウイルス子孫の回復という結果を与えた(2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation.Journal of Virology 79:10289−10299)。Sp103は、IPNの流行現場から得られたIPNV単離物であり、中程度から程度の死亡率の原因となる(2005. Infectious pancreatic necrosis virus induces apoptosis in vitro and in vivo independent of VP5 expression. Virology 342:13−25;2004.Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31−40)。組み換えrNVT15PAウイルスは、CHSE−214細胞で2回プラーク精製を行い、次にTRG−2細胞で増殖させて保存物を得た。前記ウイルスの核酸は、完全に配列決定され、細胞適用により注目すべき突然変異が起こっていなことを保証する。
VP2の残基221で前記最終突然変異ウイルスを生成するために、我々は、得られたProAlaAla組み換えウイルスを、10回(継代)CHSE−214細胞で継代させた((2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell culture adaptation. Journal of Virology 79:10289−10299)。次に前記単離物を、細胞培地上澄みの10倍希釈(10−3から10−8)で6ウェルプレートでTRG−2単層に接種することで精製した。室温で1時間後、前記接種物を除去し、細胞を0.8%SeaPalque Agarose(BioWhittaker)で、5%のFBSと1%のL−グルタミンを含む2xL−15培地(Sigma)中に折り重ねた。細胞を15℃で4日間インキュベーションし、細胞変性効果(CPE)で形成されたプラークを、3mmパンチ生検(Miltex)を前記プラークへ前記アガーを貫通させて集めた。前記プラークは続いてRTG−2単層上に接種し、15℃で完全にCPEが観察されるまでインキュベーションした。次に上澄みを回収して、2500xgで10分間遠心分離して滅菌ろ過した(0.22μl)。RNAを、製造者の指示書の従い、QIAampウイルスRNAミニキットを用いて抽出した。それぞれのウイルスのセグメントA及びBの完全配列が前記説明したように決定された。クロマトグラフを検査して、Thr221をコードする「クリーン」ATTが前記研究で使用されたことを保証した。rNVT15PAに比較して前記ウイルスの全遺伝子で他の突然変異は見出されなかった。感染の前に、前記単離物をRTG−2細胞で1回継代することで増殖させた。
前記感染は、Norway、NamsosのVESO Vikan研究施設で行われた。これは、VESO Vikan孵化施設で孵化させたAquqGen株の合計1020大西洋サケ「Salmo salar L)幼魚を含む大規模研究の一部であり、これら幼魚は本実験に含まれる。前記幼魚は最近給餌開始され(Micro 015、Ewos)、平均体重は0.2グラム(n=20)であった。幼魚を4つの容器に分け、それぞれ250匹幼魚を含む。1週間の訓化期間後、感染先立ち幼魚を一日飢餓状態とした。
保存料なしで−70℃で保存された幼魚をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1:5、重量/体積)に加えてストマッカーでホモジナイズした。100μlのこのホモジネートを、2−メルカプトエタノール(RNeasy Mini kit、Qiagen)を含む600μlRLT緩衝液へ移した。ホモジネートの残りを1:2で、2mMのL−グルタミン及び50μgml−1ゲンタマイシンを含むL−15培地に希釈した。2500xgで10分間短く遠心分離した後、24ウェルプレート中で成長させたTRG−2細胞に、最終希釈1%及び0.1%で摂取し、15℃で1週間インキュベーションした。第1継代からの細胞培地を新たな単層を感染させるために使用した。前記サンプルは、CPEが、前記第2継代の1週間インキュベーション後に見られない場合に陰性と考えた。RNAを、細胞培地上の全ての陰性サンプルについての魚ホモジネートから、RNeasy Mini kit(Qiagen)を製造者の指示書に従い使用して、単離し、及びSantiらの記載の方法に少し修正して従い、RT−PCRを実施して、224−bpIPNV−特異的DNA断片を増幅した(2004 Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322:31−40)。前記PCR増幅物をアファロースゲル電気泳動により分離し、SYBR(登録商標)Safe DNAゲル染色(Invitorogen)で染色して可視化した。
RNAは、ホモジネーション後−70℃で保存された2−メルカプトエタノールを含むRLT緩衝液に保存されたホモジネートから単離された(RNeasy Mini kit、Qiagen)。RT−PCRは、Qiagen OneStep RT−PCR kitを用いて、製造者の指示書に従い、0.5μgRNA及びそれぞれ15pmolのプライマーA−Sp500F及びA−Sp1689R(2004 Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus.Virology 322:31−40)を用いて、合計反応容積25μlとなるようにして、400−bpIPNV特異的DNA断片を増幅した。サイクル条件は、50℃で30分、90℃で15分、次いで94℃45秒、57℃45秒、72℃で2分、最後に72℃で10分を40サイクルであった。PCR増幅物はアガロースゲル電気泳動で分離し、SYBR(登録商標)Safe DNAゲル染色で染色して分析した。
位置217及び221での塩基の異なる混合を持つ4つのサンプルがクローニング及び配列決定のために選ばれた。配列決定ステップからのTaqポリメラーゼ増幅PCR生成物を、TOPO(登録商標)Vector内に、TOPO TA Cloning(登録商標)内に、製造者の指示書に従い、クローニングした。前記OneShot(登録商標)Chemically Competent E.coli細胞を前記手順に従い移し、50μlを、白青選択のためのジメチルホルムアミド中40μl40mg X−gal(Invitorogen)を含む、50μg/mlアンピシリン含有の前加熱アガープレート上に広げ、37℃で30分間プレインキュベーションした。80−96の白色コロニーをそれぞれのペトリ皿から選択し、それを150mgアンピシリン(GATC Biotech)を含む96ウェルアガープレートのそれぞれのウェルに入れた。プラスミドを分離し、市販の配列決定会社、GATC Biotech社により配列決定された。拝謁データは、Vector NTIソフトウェアを用いて分析された。
低病原性IPNV株ウイルスの構築
感染のために使用した単離物は、位置217、221及び247;ProThrAlaのアミノ酸組み合わせを持っていた。位置252,281、282及び319のアミノ酸はValThrAlaであった。
この研究で使用された感染投与量は、標準感染研究(2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus.Virology 322:31−40)で使用されるものよりも低いが、これは幼魚の持続的感染と高い生存魚数(>95)を保持するためによる。実験の間全てのサンプリングされた魚の94%が持続的に感染された。
前記魚が感染し、持続的に感染していることを記録するために、感染後1−6月から30日ごとに幼魚を回収した。その都度10匹の魚を細胞培地及びRT−PCRを用いて試験した。全体のIPNVは培地から再単離され、前記3つの群の94%でRT−PCRで検出された。ウイルス再分離又はRT−PCRのいづれかで、全ての魚が感染後6月でも陽性であった。
Claims (21)
- 生非病原性IPNVであり、IPNVに感受性であることを知られている宿主で少なくとも3継代後で病原性ウイルスへ戻らない、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、淡水中で、12℃で、大西洋サケ幼魚に、力価2x105TCID50/mlで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、RTG−2細胞で再単離により測定してウイルス陽性とする、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、淡水中で、12℃で、大西洋サケ幼魚に、力価2x105TCID50/mlで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、非感染幼魚と比較してIPN秒に対する保護を与える、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、淡水中で、12℃で、大西洋サケ幼魚に、力価2x105TCID50/mlで、浸漬することで投与されると、前記幼魚に、IPN病の兆候を発現させない、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、前記ウイルスがVP2タンパク質をコードする核酸を含み、前記VP2タンパク質の位置252でアミノ酸はValではない、非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の非病原性IPNVであり、前記ウイルスがVP2タンパク質をコードする核酸を含み、前記VP2タンパク質の252位置でのアミノ酸残基が、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;好ましくはAsn及びGlnからなる群から選択され;及び最も好ましくは252位置のアミノ酸残基がAsnである、非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の非病原性IPNVであり、前記ウイルスが、配列番号1の1−442残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列(ただし、252位のアミノ酸残基はValではない)を含むタンパク質をコードする核酸を含む、非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、前記ウイルスが、配列番号1の1−442残基で表されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を持つアミノ酸配列(ただし、252位のアミノ酸残基は、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr及びCysからなる群から選択され;好ましくはAsn及びGlnからなる群から選択され;及び最も好ましくは252位のアミノ酸残基はAsnである)を含むタンパク質をコードする核酸を含む、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至8のいずれか一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質の281、282及び319位のアミノ酸残基は、それぞれThr、Asn及びAlaではない、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至9もいずれ一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質の281、282及び319位のアミノ酸残基は、それぞれSer、Asp及びGluである、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至10のいずれ一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質の252、281、282及び319位のアミノ酸残基は、それぞれAsn、Ser、Asp及びGluである、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至11のいずれ一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質の221位のアミノ酸残基は、Thrである、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至12のいずれ一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質の217位のアミノ酸残基は、Proある、生非病原性IPNV。
- 請求項5乃至13のいずれ一項に記載の生非病原性IPNVであり、前記タンパク質は、前記非病原性ウイルスが、IPNV感受性であることが知られている宿主で少なくとも3継代後に病原性ウイルスへ戻らない、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、IPNV−G700として帰属される(寄託番号:ECACC−No.11041201)、又はこれと緊密に関連する、生非病原性IPNV。
- 請求項15に記載の生非病原性IPNVであり、前記緊密に関連する株は、好ましくは、前記寄託された株と遺伝子型及び/又は形質的特徴が類似するものである、生非病原性IPNV。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVであり、力価2x105TCID50/mlで、淡水中に保持した大西洋サケ幼魚を12℃で浸漬することで接種すると、
−前記幼魚をRTG−2細胞での再単離による測定でウイルス陽性とし:
−前記幼魚を免疫組織化学による測定でウイルス陰性とし:
−前記幼魚に、非感染幼魚と比較してIPNV病に対する保護を与え;及び
−前記幼魚に、IPN病の兆候を発現させない、生非病原性IPNV。 - 請求項1に記載の生非病原性IPNVを含むワクチン。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNVの、ワクチンとしての使用。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNV又は請求項18に記載のワクチンの、幼魚のIPN病に対するワクチンとしての使用。
- 請求項1に記載の生非病原性IPNV又は請求項18に記載のワクチンの幼魚のIPN病に対するワクチンとしての使用であって、接種が浸漬又は経口投与による使用。
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