CN103333242A - scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。本发明提供的scFv抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列1第1-124位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质；轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列1第140-244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的蛋白质。本发明提供的scFv抗体，具有特异性强、治疗效果好等优点，将在IBDV的防治史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。
Description
技术领域
本发明涉及一种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
背景技术
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV）引起的一种急性、高度接触性鸡传染病，具有传播速度快、传染性强、感染率及死亡率均高的特点。该病目前已遍布全球各地，是养禽业最重要疾病之一，给养鸡企业带来巨大经济损失。
IBDV可在雏鸡法氏囊中的淋巴细胞，尤其是B淋巴细胞中迅速繁殖，促使B淋巴细胞凋亡，法氏囊极度萎缩，最终导致免疫抑制。抗体药物目前是有效的治疗药物，高免血清和卵黄抗体在发病早期均可起到良好的效果，但是由于工业化生产可控性差和存在水平传播疾病等原因而受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用。
本发明提供了一种单链抗体，命名为scFv抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-124位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列1自N末端第140-244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
所述单链抗体具体可为如下（e）或（f）：（e）由序列表中序列1所示的蛋白质；（f）将（e）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
编码所述单链抗体的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）或（2）或（3）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-372位核苷酸所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4）或（5）或（6）：（4）序列表的序列2自5’末端第418-732位核苷酸所示的DNA分子；（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6）与（4）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
所述基因具体可为如下（7）或（8）或（9）或（10）：（7）序列表的序列2自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（8）序列表的序列2所示的DNA分子；（9）在严格条件下与（7）或（8）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10）与（7）或（8）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。
含有以上任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
基于所述单链抗体的其它形式的抗体也属于本发明的保护范围。所述其它形式的抗体可为Fab形式的抗体、IgG形式的抗体等。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
含有所述单链抗体或所述其它形式的抗体的产品也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
本发明还保护所述单链抗体或所述其它形式的抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。所述应用为非疾病诊断方法。
本发明提供了一种单链抗体（即scFv抗体），scFv抗体具有与VP2蛋白及多种IBDV毒株特异性结合的能力，可阻断IBDV对鸡胚成纤维细胞产生CPE，可保护IBDV感染的鸡。免疫血清和卵黄抗体在使用过程中存在制备繁琐、生产成本高、效果不稳定、工业化生产质量难以控制及引发水平传播疾病等弊端。本发明提供的scFv抗体可以克服上述弊端，具有特异性强、治疗效果好，工业化生产质量可控，避免了卵黄抗体引起的水平传播疾病等优点，将在IBDV的防治史上，乃至整个动物病毒病的防治史上开辟了一个新的局面。
附图说明
图1为scFv抗体溶液的SDS-PAGE图谱。
图2为scFv抗体溶液的SEC-HPLC图谱。
图3为ELISA检测scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力的结果。
图4为ELISA检测scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pET-27b(+)载体：购自Novagen公司，Cat.No.69337-3。大肠杆菌Rosetta：购自Novagen公司，Cat.No.71403-4。DF1细胞（鸡成纤维细胞）：购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，Cat.No.3131C0001000400030。SPF雏鸡：购自哈尔滨兽医研究所。鸡新城疫灭活疫苗（La Sota株），购买自哈兽研维科生物公司，编号080012008。
鸡传染性法氏囊病活疫苗（Gt株）：哈兽研维科生物公司，编号080012122。鸡传染性法氏囊病中等毒力活疫苗（NF8株）：扬州威克生物工程有限公司，编号101042056。鸡传染性法氏囊病活疫苗（1-65株）：Shafit InterGumboro，编号S20651010A。鸡传染性法氏囊病活疫苗（BJ836株）：上海海利生物药品有限公司，编号090202026。鸡传染性法氏囊病活疫苗（MB株）：ABIC，编号20621150B。鸡传染性法氏囊病活疫苗（B87株）：湖南省中岸生物药业有限公司，编号180022026。
质粒pHisSUMO：参考文献：姜媛媛,尹成凯,李晋南,任桂萍,张薇,李德山.利用SUMO融合系统高效表达可溶性重组蛋白的研究.东北农业大学学报,2008,39(10):57-62；李璐,尹成凯,李德山.高效表达可溶性重组蛋白表达载体——pHisSUMO.生物技术,2009,19(3):11-14.。
包被液（pH9.6）：取Na2CO30.15g、NaHCO30.293g，溶于水并用水定容至100mL。
PBS缓冲液：取NaCl8g、KCl0.2g、Na2HPO4.12H2O3.58g、KH2PO40.24g，溶于1L水。
实施例1、scFv抗体（单链抗体）及其编码基因的发现
1、抗体库的构建
取IBDV免疫后的鸡脾脏，提取RNA后反转录成cDNA。根据GenBank上的抗体序列，设计出克隆抗体可变区的基因引物，以cDNA为模板，使用PCR的方法克隆抗体可变区。将VH与VL片段分别插入到pTlinker载体的Linker的上游和下游，构建出scFv抗体库。将scFv抗体库进行酶切并与细菌展示载体pBSD进行连接，构建抗IBDV抗体的细菌表面展示文库。VH约380bp、VL约320bp，VH-Tlinker-VL约740bp。
2、抗体库的筛选
收集转化后全部克隆，经IPTG（0.25mmol/L）诱导4h，经EDTA-MgCl2处理，与FITC标记的VP2蛋白孵育1h，PBS洗涤后利用流式细胞仪对其进行筛选。
经三轮筛选后，得到一个与FITC标记的VP2蛋白具有结合能力的单克隆抗体，将其命名为scFv抗体。
scFv抗体（为单链抗体，又称scFv蛋白）如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。
实施例2、scFv抗体的制备
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F1：5'–CATGCCATGGGCCGTGACGTTGGACGAG-3'；
R1：5'–CCCAAGCTTTTAACCTAGGACGGTCAGGG-3'。
3、用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切pET-27b(+)载体，回收约5367bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：在pET-27b(+)载体的NcoI和HindIII酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
6、将步骤5得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
7、将步骤6得到的重组菌接种至含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm=0.35；加入IPTG并使其浓度为0.25mmol/L，37℃、100r/min振荡培养4h。
8、取25L完成步骤7的培养体系，4℃、4000r/min离心30min并收集菌体沉淀。
9、取步骤8得到的菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集沉淀。
10、使用AKTA Purifier100蛋白层析系统(购自GE公司)纯化目的蛋白
取步骤9得到的沉淀，用100毫升溶解缓冲液(8mol/L尿素水溶液，pH8.0)充分溶解，然后上样于HiLoad16/60Superdex75pg柱子(购自GE公司)，然后用500毫升复性缓冲液（2mol/L尿素水溶液，pH8.0）洗脱并收集过柱后的洗脱液，然后在PBS缓冲液中透析过夜，得到溶液即为scFv抗体溶液。所有步骤均在4℃环境下。scFv抗体溶液的SDS-PAGE图谱见图1，显示约为28KD的条带，与预期相符。
11、取步骤10得到的scFv抗体溶液，进行SEC-HPLC分析
硅胶填充物，型号为G-3000swxl；将scFv抗体溶液上样后，用流速为0.5ml/min的洗脱液（pH8.0，溶剂为水，含50mM Na3PO4和150mM NaCl）进行洗脱。SEC-HPLC图谱见图2，目的蛋白的纯度可达90%。
实施例3、VP2蛋白的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
2、以步骤合成的双链DNA分子为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
F2：5’-GAAGACTTAGGT ACAAACCTGCAAGATCAA-3’；
R2：5’-GGATCCTTA TGCTCCTGCAATCTTCAG-3’。
3、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶BbsⅠ和BamHI双酶切质粒pHisSUMO，回收约5700bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。重组质粒中，VP2蛋白的编码基因和载体骨架上的分子伴侣SUMO的编码序列、以及载体骨架上的His标签的编码序列（位于SUMO的编码序列的上游，由6个组氨酸残基组成）融合，形成融合基因，表达融合蛋白（融合蛋白自N端至C端依次为His标签、分子伴侣SUMO和VP2蛋白）。
二、VP2蛋白的制备和纯化
1、将步骤一得到的重组质粒导入大肠杆菌Rosetta，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、100r/min振荡培养至OD600nm=0.35；加入IPTG并使其终浓度为0.4mmol/L，25℃、65r/min振荡培养10h。
3、取完成步骤2的培养体系，4℃、4000r/min离心30min，并收集菌体沉淀。
4、取步骤3得到的菌体沉淀，用Binding buffer重悬，加入溶菌酶溶液（购自Amresco）并使溶菌酶的浓度为1mg/ml，4℃放置1h，然后进行超声破碎（25瓦的功率，3min），4℃、10000g离心30min，收集上清液。
5、取步骤4得到的上清液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为10ml。
洗脱过程：先用5倍柱体积的杂蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：40mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱以去除杂蛋白，流速为1ml/min；然后用3倍柱体积的目的蛋白洗脱液（溶剂为水，含有如下浓度的各个溶质：500mmol/L咪唑、500mmol/L NaCl和50mmol/L Na3PO4；pH7.4）洗脱，流速为1ml/min，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于80mAU的峰），即为融合蛋白溶液。
6、采用HiPrepTM26/10Desalting将步骤5得到的融合蛋白溶液进行脱盐。
7、取步骤6得到的溶液，用SUMO蛋白酶I（SUMO蛋白酶I与融合蛋白的摩尔比为1:50）和终浓度为2mmol/L的DTT4℃切割过夜。
8、取步骤7得到的溶液，进行HisTrapTM FF crude colum亲和层析。
柱子型号为：柱长0.7cm，柱高2.5cm。
上样量为15ml，280nm波长监测，收集目标峰（即峰值高于30mAU的峰），即为VP2蛋白溶液。将VP2蛋白溶液进行聚丙烯凝胶电泳，显示分子量约为42KDa的单一蛋白条带，回收蛋白条带并测序，N端前15个氨基酸残基如序列表的序列3自N末端第1至15位氨基酸残基所示。
实施例4、ELISA检测scFv抗体的亲和力和特异性
一、ELISA检测scFv抗体对VP2蛋白的特异性和亲和力
1、分别用蛋白浓度为300μg/ml、60μg/ml、12μg/ml、2.4μg/ml的scFv抗体溶液（即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
2、每孔加入100μl蛋白浓度为40μg/ml的VP2蛋白溶液（即实施例3制备的VP2蛋白溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
3、加入血清抗体（B87株免疫鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体（Cat.No.11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv抗体溶液、步骤2中的VP2蛋白溶液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。步骤1中用蛋白浓度为300μg/ml的scFv抗体溶液包被酶标板时：设置步骤2中不加入VP2蛋白溶液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中不加入VP2蛋白溶液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积且等蛋白浓度的BSA溶液代替VP2蛋白溶液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图3。ELISA结果表明，scFv抗体可以与VP2蛋白特异性结合。
二、ELISA检测scFv抗体对不同IBDV病毒的特异性和亲和力
1、用蛋白浓度为300μg/ml的scFv抗体溶液（即实施例2制备的scFv抗体溶液，用包被液调整蛋白浓度）包被酶标板，4℃过夜，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
2、每孔加入100μl IBDV病毒液（病毒剂量为105.0TCID50），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
3、加入血清抗体（B87株免疫鸡得到的，工作浓度为1:200倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
4、加入HRP标记的兔抗鸡抗体（Cat.No.11-7018购自eBioscience公司，工作浓度为1:7500倍稀释），37℃孵育1h，然后用PBST缓冲液洗涤3次，每次2min。
5、加入TMB底物显色液，37℃避光显色5min。
6、每孔加入50μl2mol/L的H2SO4水溶液，用酶标仪于波长450nm下检测OD值。
分别采用如下IBDV的毒株进行上述实验：Gt株、NF8株、1-65株、BJ836株、MB株、B87株。
设置用等体积的PBS缓冲液代替步骤1中的scFv抗体溶液、步骤2中的IBDV病毒液和步骤3中的卵黄抗体的PBS组。设置步骤2中不加入IBDV病毒液的对照组1，步骤3中不加入卵黄抗体的对照组2，步骤2中不加入IBDV病毒液且步骤3中不加入卵黄抗体的对照组3，用等体积等滴度的新城疫病毒液代替IBDV病毒液的对照组4。
每个处理设置3个复孔。
结果见图4。ELISA结果表明，scFv抗体可以与不同IBDV毒株特异性结合，对不同的IBDV毒株具有不同的亲和力。
实施例5、scFv抗体的中和活性
一、IBDV滴度的测定
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基101至1011梯度稀释的IBDV病毒液（B87株）接种到单层细胞中（每孔100μl），每一稀释度接种8个细胞孔；设置不加入IBDV病毒液的对照组。将细胞培养板放到细胞培养箱中，37℃、5%CO2培养，连续观察7天，每天记录细胞生长状态。计算病毒滴度，第7天结果见表1。
表1IBDV滴度的测定的结果
| 稀释度 | 出现CPE的细胞孔的数目 | 未出现CPE的细胞孔的数目 | CPE百分比 |
| 1O1 | 8 | 0 | 100% |
| 102 | 8 | 0 | 100% |
| 103 | 8 | 0 | 100% |
| 104 | 8 | 0 | 100% |
| 105 | 8 | 0 | 100% |
| 106 | 4 | 4 | 50% |
| 107 | 3 | 5 | 37.5% |
| 108 | 0 | 8 | 0% |
| 109 | 0 | 8 | 0% |
| 1010 | 0 | 8 | 0% |
| 1011 | 0 | 8 | 0% |
| 1012 | 0 | 8 | 0% |
按照Reed-Muench两氏法计算TCID50=10-6.8/0.1ml。
二、scFv抗体的中和活性
将处于对数生长期的DF1细胞接种于96孔细胞培养板，将用DMEM培养基梯度稀释后的scFv抗体溶液（即实施例2制备的scFv抗体溶液）和100TCID50的IBDV病毒液（B87株）等体积混合并37℃孵育1h，然后接种到单层细胞中，每一梯度接种8个细胞孔；设置不加入抗体溶液且不加入病毒液的正常对照，设置只不加入抗体溶液只加入病毒液的病毒对照。将细胞培养板放到细培养箱中，37℃，5%CO2培养连续观察7天，每天记录细胞生长状态。第7天结果见表2。
表2scFv抗体的中和活性的测定的结果
| 梯度稀释后的scFv抗体溶液中的蛋白浓度(ug/ml) | CPE百分比(%) |
| 300 | 0 |
| 150 | 0 |
| 75 | 0 |
| 37.5 | 0 |
| 18.75 | 0 |
| 9.375 | 0 |
| 4.688 | 0 |
| 2.344 | 0 |
| 1.172 | 100 |
| 0.586 | 100 |
结果表明，scFv抗体具有中和活性，阻断或抑制CPE的最小蛋白浓度为2.344μg/ml。
实施例6、scFv抗体对IBDV感染鸡的保护作用
传染性法氏囊病病毒HB/11株：参考文献：黄显明张小飞丁美娟尹秀凤许秀梅王伟靳宇田，传染性法氏囊病病毒强毒株HB/11的分离与鉴定，《中国动物传染病学报》2012年第5期，8-11页。
一、安全性检测
取10只13日龄SPF雏鸡，分别胸肌注射蛋白浓度为2mg/ml的scFv抗体溶液（即实施例2制备的scFv抗体溶液，用PBS缓冲液调整蛋白浓度），每只1ml，观察14天。无注射局部及全身不良反应。
二、IBDV半致死率的测定
取9日龄的鸡胚，分成9组，每组10只，第1组至第8组，分别注射200μL用PBS缓冲液稀释后的稀释梯度为101-108的传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液，第9组为生理盐水的对照组（每胚注射200μl生理盐水）。观察3-6天，记录鸡胚存活情况。
6天后的鸡胚半数感染量EID50为107.5/0.1ml
三、抗体效力试验
13日龄SPF鸡分为五组，每组10只。
第一组：每只胸肌注射0.2ml PBS缓冲液；
第二组：接种B87株疫苗，每只胸肌注射0.2ml；
第三组：每只胸肌注射scFv抗体溶液（1mg蛋白/kg体重），每只注射0.2ml；
第四组：每只胸肌注射scFv抗体溶液（0.5mg蛋白/kg体重），每只注射0.2ml；
第五组：每只胸肌注射scFv抗体溶液（0.1mg蛋白/kg体重），每只注射0.2ml。
免疫21天后检测中和抗体效价并接种传染性法氏囊病病毒HB/11株病毒液（每只胸肌注射0.2ml，接种剂量为4×104EID50）进行攻毒。
中和抗体效价的测定方法（微量滴定法）：（1）取血清，56℃水浴灭活30min，自然冷却，用Hank’s液将血清作2倍系列稀释（从1：2稀释到1：16384），每种稀释液加入等体积病毒悬液（100TCID50/0.1ml）充分震荡混合，37℃培养1h；将（2）鸡成纤维细胞接种于细胞培养板，每孔100微升，每孔加入100微升步骤（1）得到的混合液；设置正常对照、阴性血清对照、阳性对照及病毒对照；37℃，5%CO2培养，连续观察3-5天，若抗体有中和活性，则DF1细胞不会出现病变，计算第7天的抗体效价（即能抑制DF1细胞发生病变的最大稀释度）。结果见表3。
攻毒72h后，统计每组中死亡鸡的只数。结果见表3。
表3抗体效价结果和每组的死亡鸡数
| 浓度 | 中和抗体效价 | 死亡鸡数 |
| 第一组 | 1:23 | 6/10 |
| 第二组 | 1:212 | 0/10 |
| 第三组 | 1:210 | 1/10 |
| 第四组 | 1:29 | 1/10 |
| 第五组 | 1:28 | 2/10 |
Claims (10)
1.一种单链抗体，包括由重链可变区、轻链可变区以及它们之间的连接区组成；
所述重链可变区为如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1自N末端第1-124位氨基酸残基组成的蛋白质；（b）将（a）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质；
所述轻链可变区为如下（c）或（d）：（c）由序列表中序列1自N末端第140-244位氨基酸残基组成的蛋白质；（d）将（c）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体为如下（e）或（f）：（e）由序列表中序列1所示的蛋白质；（f）将（e）经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的蛋白质。
3.编码权利要求1或2所述单链抗体的基因。
4.如权利要求3所述的基因，其特征在于：
所述基因中，编码所述重链可变区的DNA分子为如下（1）或（2）或（3）：（1）序列表的序列2自5’末端第1-372位核苷酸所示的DNA分子；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3）与（1）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；
所述基因中，编码所述轻链可变区的DNA分子为如下（4）或（5）或（6）：（4）序列表的序列2自5’末端第418-732位核苷酸所示的DNA分子；（5）在严格条件下与（4）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6）与（4）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于：
所述基因为如下（7）或（8）或（9）或（10）：（7）序列表的序列2自5’末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（8）序列表的序列2所示的DNA分子；（9）在严格条件下与（7）或（8）限定的DNA序列杂交且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10）与（7）或（8）限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且编码具有相同活性的蛋白的DNA分子。
6.含有权利要求3至5中任一所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
7.基于权利要求1或2所述单链抗体的其它形式的抗体。
8.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
9.含有权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体的产品；所述产品的功能为如下（Ⅰ）、（Ⅱ）或（Ⅲ）或（Ⅳ）：（Ⅰ）检测鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅱ）辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒；（Ⅲ）预防和/或治疗鸡传染性法氏囊病；（Ⅳ）预防和/或治疗由鸡传染性法氏囊病病毒诱发的疾病。
10.权利要求1所述单链抗体、权利要求2所述单链抗体或权利要求7所述抗体在辅助鉴定鸡传染性法氏囊病病毒中的应用。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| S. I. SAPATS ET AL.: "Generation of chicken single chain antibody variable fragments (scFv) that differentiate and neutralize infectious bursal disease virus (IBDV)", 《ARCH VIROL》 * |
| 曲栗 等: "利用SUMO表达系统高效可溶性表达鸡传染性法氏囊病病毒VP3基因", 《中国预防兽医学报》 * |
| 李德山 等: "鸡传染性法氏囊病超强毒毒株的分离和初步鉴定", 《中国畜禽传染病》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104761639A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-07-08 | 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 | scFv抗体、其编码基因及其在制备治疗或预防乙肝制剂中的应用 |
| CN105384815A (zh) * | 2015-12-03 | 2016-03-09 | 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 | 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 |
| CN105384815B (zh) * | 2015-12-03 | 2019-03-01 | 江苏康缘瑞翱生物医药科技有限公司 | 一种scFv抗体在治疗或预防鸡传染性法氏囊病制剂中的应用 |
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