KR100682171B1

KR100682171B1 - 바쿨로바이러스 벡터 발현계에서의 단백질 발현방법

Info

Publication number: KR100682171B1
Application number: KR1020057022071A
Authority: KR
Inventors: 디에트마르 크레츠던; 딕 프랜시스쿠스 마리누스 반 데 웰; 아브라함 요하네스 데 스미트; 로버투스 야코부스 마리아 무어맨; 에릭 키스 하만
Original assignee: 바이엘 악티엔게젤샤프트; 스티칭 인스티튜트 부르 디에르후데리지 엔 디에르게존드헤이드
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2007-02-12
Also published as: JP4220126B2; CA2315248C; AU750514B2; CN1295620A; KR100699609B1; ES2267203T3; US6919085B2; DK1049788T3; EP1049788B1; IL181468A; KR100796871B1; DE69834346D1; JP2003533964A; ZA9811434B; JP2007254482A; EP1049788A2; ATE324456T1; HK1037670A1; US6555346B1; EP0924298A1

Abstract

본 발명은 바쿨로 벡터 바이러스 발현계에서 단백질 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 곤충-세포 배양물에서 재조합 단백질의 제조방법을 제공하며, 이 방법은 상기 단백질을 발현하는 재조합 바쿨로바이러스를 선택하는 단계, 적어도 2 리터의 충분한 용량을 갖는 배양관에 배양배지에서 곤충 세포를 배양하는 단계 및 세포를 <0.01의 m.o.i.를 갖는 1×10⁵ 내지 5×10⁶세포/ml의 세포 밀도로 적어도 하나의 바쿨로바이러스 접종으로 감염시키는 단계로 이루어진다. 본 발명은 또한 배양배지에서 하기 단백질(단편들)의 최종농도에 의해 특징될때 적어도 100㎍/ml의 수확양으로 곤충 세포 배양물에서 재조합 페스티바이러스 E2 또는 E^rns 단백질 및 그것의 단편을 제조하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 재조합 여포 자극 호르몬, 그것의 α-유니트 및/또는 β-유니트 및 복합체 및 단편을 배양배지에서 적어도 15μ/ml의 수확의 농도로 제조하는 방법을 제공한다.

바쿨로바이러스, 돼지열, 곤충 세포, 백신

Description

바쿨로바이러스 벡터 발현계에서의 단백질 발현방법{PROTEIN EXPRESSION IN BACULOVIRUS VECTOR EXPRESSION SYSTEMS}

도1은 장기 배양 실험에서 E2 안정성의 데이타를 도시한다.

도2a 내지 도2c는 배양 실험에서 E2 안정성의 그래프를 도시한다.

도3a 내지 도3c는 MOI 실험 데이타를 도시한다.

도4a 내지 도4g는 MOI 실험의 그래프를 도시한다.

본 발명은 바쿨로바이러스 벡터 발현계에서 단백질 또는 폴리펩티드 발현을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 재조합 DNA 기술이 개발되었을 때에, 유전학적으로 변형된 박테리아를 사용해서 단백질을 대규모로 생산하는 것에 관하여 기대가 높았었다. 그러나, 상업적으로 매력있는 단백질의 대부분은 이들이 생물학적으로 활성인 단백질로 되기 전에 반드시 후-번역 변형을 겪는다. 그러므로, 현재 동물 세포가 재조합 단백질을 제조하는데 더욱 빈번하게 사용된다.

동물세포 중에서, 곤충세포가 재조합 단백질 생산에 그 중요성이 커지고 있다. 곤충세포를 사용하는 편리하고 다재다능한 바쿨로바이러스 벡터계가 개발되었 다. 그러나, 곤충세포의 생리학에 관한 정보는 오히려 부족해서, 바쿨로바이러스 재조합 기술을 통해서 생산한 백신이 일반적으로 양호하게 받아들여진다. 그 예는 임상시험에서 가능한 AIDS 백신으로서 인간 면역결핍 바이러스 타입 I의 바쿨로바이러스 발현 gp160 외피(envelope) 단백질을 사용하는 것이다.

이제까지, 곤충세포 중에서 바쿨로바이러스 발현 단백질의 대규모 생산은 최대로 약 10 리터의 생물반응기(bioreactors)로 제한되었다. 대형화(scale-up)를 위해, 현탁 배양물이 최상의 가능성을 제공해준다. 대규모 생산(Tramper et al., Rec. Adv. Biotech., 1992, 263-284; Power and Nielsen, Cytotechnology 20: 209-219, 1996)에 있어서, 세포증식과 바이러스 생산에 영향을 미치는 요인들이 특별히 강조되어야 한다. 이러한 요인들의 변화는 재조합 단백질 생산의 최종 수준에 크게 영향을 미친다.

바쿨로바이러스는 로드형 바이러스 입자에 의해서 특정되어지며, 이 입자는 일반적으로 교합체(occlusion bodies, 또한 폴리헤드라(polyhedra)로 칭함) 중에서 교합된다. 바쿨로비리대 과는 2개의 아과, 즉 2개 속의 교합 바이러스, 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(NPV) 및 그래뉼로시스 바이러스(GV)로 이루어지는 유바쿨로비리대 및 비교합 바이러스로 이루어지는 누도바쿨로비리내 아과로 나누어질 수 있다. 오토그라파캘리포니카(Ac)NPV의 세포 및 분자 생물학이 더욱 구체적으로 연구되었다.

많은 단백질이 이 단백질을 코드화하는 재조합 바쿨로바이러스로 감염된 곤충세포에서 발현되었다. 코드화는 바이러스에 이종 단백질을 코드화하는 핵산서열 을 제공하고, 흔히 프로모터와 같은 조절 핵산서열을 더욱 제공하는 것을 의미한다. 이종 유전자를 발현하기 위하여 폴리헤드린 프로모터가 흔히 사용되지만, P¹⁰ 프로모터가 동등하게 적합하며, 또한 사용된다.

재조합 바쿨로바이러스로 감염시키는데 몇 개의 세포계가 유용하다. 세포계 SF-21은 가을 거염벌레(Spodoptera frugiperda)의 난소조직에서 유래되었다. American Type Culture Collection에서 입수할 수 있는 클로날 단리물, SF-9(CRL 1711)은 재조합 바이러스의 시험관 내 생산용 표준 세포계이고, 재조합 바이러스 생산에 있어서 우수하다고 말할 수 있다. 기타 세포계로는 Hi-Five세포계, 양배추 자벌레(Trichoplusiani)에서 얻은 Tn-368 및 Tn-368A 세포계가 있다. 곤충세포가 증식하는데 있어서 가장 널리 사용하는 배지는 TNM-FH, BML-TC/10, 및 IPL-41이다. 이들 배지는 통상으로 다소 한정된 성분들, 예를 들면 포유류 혈청, 특히 태아 송아지 혈청으로 보충한다. 혈청 대체물이 또한 곤충세포 배양에 사용되며, Ex-cell 400^TM 및 sf900 등의 혈청없는 배지가 시판되고 있다.

곤충세포는 일반적으로 현탁액 중에서뿐 아니라 고체 지지체상에서 증식하지만, 고체 지지체상에서 증식할 때에 더 높은 수율로 바이러스를 생산하는 것으로 보고되어 있다. 감염은 세포가 대수기에서 감염될 때에 가장 효과적이지만, 세포당 생산된 폴리헤드라 및 바이러스의 양은 세포 사이클에서 상이한 단계 도중 감염된 세포 사이에서는 현저하게 변하지 않는다. 세포 밀도는 바이러스 생산에 대하에 크게 영향을 미친다. 곤충세포는 더 높은 세포밀도에서 감소된 바이러스 생산을 유도 하는 접촉억제의 형태를 나타낼 수 있다.

세포당 감염 바이러스의 수효인 초기 감염 다중도(m.o.i.: multiplicity of infection)는 일반적으로 감염 말기에 감염 세포의 단편(fraction)과 세포당 폴리헤드라의 수 모두에 영향을 미친다. 바이러스 생산의 최적 m.o.i.는 일반적으로 약 20-30 정도로 여겨진다. 재조합 바쿨로바이러스 발현 β-갈락토시다제의 연구(Licari and Bailey, Biotech, Bioeng., 37:238-246, 1991)에 있어서, sf-9 세포를 m.o.i.치 0∼100으로 감염시켰다. m.o.i.치가 증가할수록 β-갈락토시다제 수율은 증가했고, 세포 밀도는 감소했다. m.o.i.치의 증가 또는 감소는 감염 세포당 재조합 단백질의 얻을 수 있는 최대 수율에 대해서 단지 한정된 효과만을 갖는 것으로 일반적으로 생각되어진다. 그러나, 낮은 m.o.i.를 선택하면 감염에 필요한 바이러스 균주를 감소시켜주고, 바쿨로바이러스의 결함있는 간섭 입자들의 발생의 위험을 최소화시켜준다. 곤충세포의 배치(batch) 배양물이 높은 m.o.i.(〉5)에서 감염되면, 그 결과 생기는 감염과정은 본질적으로 동시성이고, 즉 세포 모두가 동시에 감염사이클을 통과하게 된다. 세포를 배치 배양물 중에서 m.o.i. 1-5에서 감염시키면 배양물은 더 이상 동시성이 없게된다. 세포가 모두 감염되어 목적하는 단백질의 생산이 끝날 때 까지, 배양물은 초기에는 각 감염사이클의 상이한 지점에서 비감염 세포와 감염 세포로 구성될 것이다. 일반적으로, 이와 같은 배양물에서, 생산 수준은 훨씬 낮다. 배양 행동은, 생산에 있어서 각각 다른 상 중에 있으며, 부차적 최적 생산 수준을 설명하는 개별 세포의 연합행동이다. 연속 배양에 있어서, 비감염 세포를 계속해서 첨가하고, 배양물은 명백히 비동시적으로 감염될 것이다.

수학적인 모델을 설계함으로써, 세포를 낮은 m.o.i.에서 감염시키거나, 또는 바이러스를 연속배양계 중에서 번식시킬 때에 관찰된 것들과 같은 복잡한 행동을 예측할 수 있는 것으로 여겨진다. 동일한 현상의 순수한 실험적 분석은 불가능하지는 않더라도 매우 어려운 것으로 여겨진다. 현재, 세가지의 모델, 즉 the Licari & Bailey, the de Gooijer 및 the Power & Nielsen 모델이 알려져 있다. 이들 모델은 모두 이들의 복잡성과 이들을 개발하는데 들어간 노력에도 불구하고, 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 발현된 모델 재조합 단백질(β-갈락토시다제)을 발현시키는 바쿨로바이러스의 작용을 요구하는 1세대 모델이다. 블랙 박스 시스템으로 보았을 때에, 이들은 우리의 바쿨로바이러스와 곤충세포 사이의 상호작용의 정량적인 이해를 대부분 DNA 및 RNA 축적과 감염 사이클을 무시하여 요약한다. 결합 및 초기 감염과정은 여전히 정량적으로 이해가 부족하며, 이 분야에 있어서 추가 연구가 많이 요구된다.

바쿨로바이러스 발현계는 재조합 단백질 생산에 대해서 강력한 도구를 제공해 준다. 대규모 생산에 몇 개의 세포-배양물 배열이 사용될 수 있다. 그러나, 이들 계는 이들의 잠재적인 이점을 완전히 얻기위해 추가 최적화를 필요로 한다. 상업적 적용을 위하여, 대규모 및 저비용 생산이 중요하다. 대규모 세포 배양물에 보고된 폴리헤드라 생산계는 가격경쟁력이 있는 제품에 대해서 상업적 요구를 충족시키기 위하여 현저하게 개량되어야 한다.

본 발명은 바쿨로바이러스 발현계를 사용해서 재조합 단백질을 대규모로 제 조하는 방법을 제공해주며, 이 방법에 의해서 목적하는 단백질의 수율을 증가시키거나 또는 향상시킨다. 본 발명은 곤충세포 배양물에서 재조합 단백질을 생산하고, 재조합 단백질의 수율을 향상시키는 방법을 제공해 주며, 이 방법은 상기 단백질을 코드화하는 재조합 바쿨로바이러스를 선택하고, 배양기 중의 증식 배지 중에서 곤충세포를 증식하고, 이 세포를 <0.01의 감염 다중도로 감염시키는 단계로 이루어진다.

적합한 구현예에서, 본 발명은 곤충세포 배양에서 생산된 재조합 단백질의 수율을 증가시키는 방법을 제공해주며, 이 방법은 상기 단백질을 코드화하는 재조합 바쿨로바이러스를 선택하고, 배양기 중의 증식 배지 중에서 곤충세포를 증식하고, 이 세포를 <0.01의 감염 다중도로 적어도 하나의 바쿨로바이러스의 접종물로 감염시키는 단계로 이루어진다. 수율을 증가시키는 것은 몇 개의 연구군의 주제였다. 예를 들면, 첸(Chen) 등은 공-감염 접근에 대한 MOI를 최적화시키는 가능성을 연구해서 두 개의 다른 바쿨로바이러스로 발현시킨 단백질을 곤충세포 배양에서 생산했다(Drug metabolism and Disposition : 24 P399-405, 1997). 이 방법에 기재된 결과와 반대로, 이들은 약 0.015 내지 0.03에서 가장 좋은 MOI를 갖는 두 개의 단백질을 발견했다. MOI가〈0.01로 감소하면 첸 등의 공-감염계의 수율은 감소했다. 공-감염계 연구에 의해 방해되지 않는 라드포드 등(Cytotechnology 24, 73-81, 1997)은 MOI's〉1이 최종 공정 수율을 최대화 하는데 항시 사용된다는 것을 명백히 나타내고 있으며, 이것은 본 발명의 발견과는 반대된다. 이들은 낮은 MOI를 사용해 서 세포당 단백질과 바이러스를 더 많은 양으로 생산하는 것이 불가능하다고 말하고 있으며, 그 대신에 감염시간(TOI: time of infection)을 조정하는 것을 제안하고 있다.

기타, 예를 들면 구옌(Nguyen) 등 (J. Biotech. 31, 205-217, 1993)은 MOI 변경에서 해결방법을 발견하지 못하고, 단지 페드-배치 배양 (fed-batch cultures)을 사용해서 수율을 증가시키거나, 또는 바이러스가 증식하는 온도를 변경시키고 (Wu et al., Cytotechnology, 9, 141-147, 1992, King et al., Biotechnol. Bioeng, 38, 1091-1099, 1991), MOI〈0.01 에서 바이러스를 증식시키는 것을 회피하는 것에 목적을 두고 있다.

이들 조기 결과들은 본 명세서에 제공된 것들(예, 도 1참조)과 명백히 다른데, 여기서 MOI〈0.01 (예, 0.003, 0.001 또는 심지어 0.0001)로 감염시킨 배양은 MOI 0.01 또는 0.1에서 감염시킨 것들보다 높은 수율에 도달했다.

본 발명의 바람직한 구현예는 단층 배양에서 증식하지 않는 곤충세포 배양에서 재조합 단백질을 제조하는 방법 및 재조합 단백질의 수율을 향상시키는 방법을 제공해 준다. 바쿨로바이러스 발현 벡터계에서 단백질을 소량으로 생산하는 종래의 실험실 방법은 배양 플라스크에서 곤충세포의 단층 배양을 사용한다. 이들 정지 배양물은 통상으로 동시감염을 보장하기 위하여 높은 MOI로 감염시킨다. 단층이 융합되기 전에 세포가 모두 감염되는 것이 중요한데, 그 이유는 접촉억제가 세포중에서 최종 생성물 수율에 영향을 미칠 수 있는 대사성 변화를 유도하기 때문이다. 단층 배양에서 세포 밀도를 정확히 설정하는 것은 어려우므로, MOI 실험을 수행하는 것 이 불가능하다. 배양물을 감염시키기 위하여 낮은 MOI(〈0.01)를 사용하는 것은 더욱 쓸모 없다. 감염시기에 세포 밀도의 과대평가 및 과소평가는 모두 상당히 최적 이하의 단백질 수율을 가져올 것이다. 일상적으로, 전체 세포 집단의 동시감염을 보장하는 높은 MOI를 사용한다. 이것은 최적 수율을 달성하기 위하여 단일층 배양물을 감염시키는데 다량의 바이러스 균주가 필요한 것을 의미한다.

단층 배양물을 사용해서 단백질 생산을 대형화하는 것은 더 많은 조직 배양 플라스크를 사용하는 것을 의미한다. 단층 배양물을 사용해서 단백질을 대량으로 생산하는 것은 매우 노동 집약적이다. 또한, 용해된 산소농도 및 pH와 같은 중요한 배양변수를 조정 및/또는 모니터하는 것이 불가하다.

본 발명은 모든 곤충세포 배양물에 적합한 방법을 제공해 주며, 또한, 낮은 MOI가 단층 배양물과 다른 곤충 배양물에서 수율을 최적화시키는데 유익하다는 관점을 제공해 준다.

단층 배양의 경우와 다르게 곤충세포를 배양하기 위해서 다른 유형의 배양기를 사용할 수 있다. 모든 발효기 설계의 목적은 충분한 통기와 높은 세포 밀도를 성취하고, 전단력을 가능한 한 낮게 유지하는 것이다(Tramper et al., In: Recent advantages in biotechnology(eds. Vardar-Sukan and Sukan) 1992). 문헌에 기재된 대부분의 경우에, 가스 스파거(gas sparger)를 장치한 교반탱크 생물반응기를 사용한다. 이러한 유형의 용기에서, 동질성은 임펠러를 사용해서 달성한다. 이러한 유형의 발효기는 다른 방법으로 작동시킬 수 있다. 무엇보다도 배치법으로 작동시킬 수 있다. 이것은 가장 똑바르고 간단한 방법이다. 세포를 배양시키고, 바이러스를 첨가하고, 생성물을 감염 말기에 모은다. 더욱 복잡한 방법은 페드-배치 배양이다. 영양물의 농축 혼합물을 배양기에 첨가해서 보다 높은 세포 밀도와 더 큰 용적 생성물 수율을 성취한다(Nguyen et al., 1993. Journal of Biotechnology vol. 31, p 205-217). 이것은 어떤 것이 제한 영양물인지가 항시 분명하지 아니하므로 더욱 복잡하다. 이 기질을 첨가해서 하나의 영양물 제한을 제거함으로써 다른 기질 제한을 직접 가져올 수 있으며, 따라서 반드시 보다 높은 생성물 수율을 가져오지 못한다.

다른 혼합방법은 공기를 제거한 생물 반응기 중에서 사용했다(Wu et al., 1992 Cytotechnology vol. 9P, 141-147). 이러한 유형의 용기는 2개의 실린더로 구성되어 있다. 가장 작은 직경(draft tube)을 갖는 실린더를 보다 큰 직경 (downcommer)을 갖는 실린더 내부에 설치했다. 중앙 실린더에서 공기 또는 다른 가스를 살포(sparging)해서 상류흐름을 만들었다. 발효기의 정부에서, 가스는 유체를 떠나고, 유체는 중앙 실린더 밖으로 흘러내린다. 이 방법으로, 드래프트 튜브와 다운캄머에서 밀도 차이에 기인해서, 가스만 살포해서 통기와 동질성 모두를 성취했다. 이 방법은 전단력을 감소시킬 수 있다. 그러나, 적당한 혼합을 달성하기 위해서 연속적인 통풍이 필요하다.

발효기 중에서 살아있는 세포 밀도를 높이기 위한 다른 방법은 스핀 필터 또는 다른 세포유지장치를 보유하는 것이다. 이것을 관류(Perfusion)라고 칭한다. 이것은 세포를 발효기에 보유하면서 발효기에서 폐 배지를 제거하고 새로운 배지를 첨가하는 것이다. 이 방법은 많은 추가 장비와 더욱 어려운 발효기 조작을 초래한다(Caron et al., 1994. Biotechnology and Bioengineering vol. 43, p.881-891). 또한, 겔 매트릭스 중에서 거대 다공성 베드 및 고정(immobilisation)과 같은 방법이 보고되어 있다. 이러한 유형의 방법은 매트릭스 위에서 또는 내부에서 세포의 고정에 의존하여, 세포 배양물을 희석시키지 않고 폐 배지를 제거하고, 새로운 배지를 첨가할 수 있게 해준다. 만약 단층 배양물의 세포 밀도, 접촉 억제 및 기타 관련 문제를 관리할 수 있다면, 본 발명에 의한 방법은 상기 각종 배양계에 적용될 수 있을 뿐 아니라 단층 배양에도 적용할 수 있다.

예를 들면, 본 발명의 바람직한 구현예는 곤충세포 배양물 중에서 재조합 단백질을 제조하고, 이 재조합 단백질의 수율을 향상시키는 방법을 제공해 주며, 이 방법은 상기 단백질을 코드화하는 재조합 바쿨로바이러스를 선택하고, 곤충세포를 2리터 이상의 충분한 용적을 갖는 배양기 중의 증식배지 중에서 증식시키고, 곤충세포를 상기 바쿨로바이러스/세포의 m.o.i.〈0.01 PFU를 갖는 적어도 하나의 바쿨로바이러스의 접종물로 감염시키는 단계로 이루어진다. 본 발명은 감염 다중도를 비동시적으로 감염된 배양물을 제공하는 m.o.i. 1-5 보다 상당히 낮은 것으로 사용하는 방법을 제공한다. 곤충배양물을 본 발명에 의해서 제공되는 m.o.i.를 사용하는 바쿨로바이러스로 감염시킴으로써, 바이러스의 복제속도에 관하여 세포들의 복제속도 사이에서 최적 균형을 이루게 함으로써 목적하는 단백질의 최적 발현을 얻게된다. 본 발명에 의해 제공된 방법은 m.o.i.를 조정함으로써 세포밀도를 보다 높게 또는 낮게 용이하게 조절할 수 있으며, 여기서 여러가지 상의 복제에서 세포를 감염시키는데 이용할 수 있는 바이러스 입자의 상대 비율은 본 발명에 의해 제공된 다중도 및 밀도에 의해서 유지된다. 본 발명에 의한 방법의 바람직한 구현예는 적 어도 10리터, 더욱 바람직하기로는 적어도 20리터, 가장 바람직하기로는 적어도 50리터 또는 250리터의 증식배지를 담기에 충분한 용적을 갖는 배양기 중에서 세포를 증식시켜서 바쿨로바이러스 배양물 발현 이종 단백질의 비율을 증가시키는 공정으로 이루어진다. 예를 들면, 존재하는 증식배지의 용적에 대해서 필요한 것보다 큰 용적을 갖는 배양기를 사용할 수 있으며, 예를 들면 세포 배양물 20-70리터를 배양시키기 위하여 100ℓ용 배양기를 사용할 수 있다. 본 발명에 의한 방법의 바람직한 구현예는 세포를 세포밀도 1×10⁵-5×10⁶ 세포/㎖, 더욱 바람직하기로는 5×10⁵-1.5×10⁶ 세포/㎖에서 감염시켜서 바이러스 접종물의 실제용적을 용이하게 관리할 수 있는 한계 이내로 유지하는 것이다. 본 발명에 의한 방법의 또 다른 구현예는 세포를 m.o.i.≤0.005, 예를 들면 0.003, 0.001, 0.0005 또는 0.00025로 감염시켜서 접종물을 가능한 작게 유지하는 것이다. 본 발명에 의한 방법의 바람직한 구현예는 목적하는 단백질을 p10 프로모터 조절하에 발현시키는 재조합 바쿨로스바이러스를 선택하는 것이다. p10 프로모터는 세포용해에 역할을 하는 것이고, p10 단백질의 부재는 감염세포를 그대로(intact) 유지하고, 감염세포로부터 폴리헤드라의 방출을 방지해주므로 감염도 자체는 아니나 재감염율을 감소시켜준다. 바이러스 감염의 전 과정은, 폴리헤드린 유전자와 폴리헤드라가 여전히 존재하는 사실 때문에, 육안으로 검사될 수 있다. 바이러스 감염은 세포핵에 축적하는 조밀한 단백질 입자로서 관찰될 수 있다. 본 발명에 의한 방법의 다른 구현예는 배치계 중에서 곤충세포를 증식해서, 아직까지 감염되지 않는 세포의 감염 및 복제를 절충할 수 있는, 결함있 는 간섭 바쿨로바이러스 입자의 축적을 최소화해주는 것이다. 본 발명에 의해 제공된 방법 중 다른 구현예는, 곤충세포를 적당하게 교반할 수 있는 발효기 등의 배양기에서 현탁액 중에서 증식시키는 것이다. (교반)현탁 배양물을 사용하면, 특히 목적하는 단백질을, 바이러스 증식을 육안으로 검사하기 위하여 p10 프로모터의 조절하에 둔(그러나, 폴리헤드린 프로모터를 사용하는 경우에 CPE를 관찰하는 것과 같은 기타 검사방법도 또한 유용함) 재조합 바쿨로바이러스를 사용해서 혼합시키는 경우 배양물을 보다 좋게 조절해 준다.

현탁액을 적당히 교반시키면 기질 그래디언트가 전혀 증강되지 않고, 세포가 너무 높은 전단력으로 처리되지 않는 균일한 배양물을 보장해준다. 또한, 교반은 감염된 세포에서 감염되지 않는 세포로 바이러스의 효과적인 이동을 초래하여 세포의 바이러스 감염 효율을 높여준다. 초기에는 세포 중 약 0.1∼0.3%만 감염되어 있으므로, 세포의 나머지 99.7-99.9%는 증식해서 번식하게 된다.

본 발명은 다양한 기원의 재조합 단백질을 발현 및 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 한 예는 페스티바이러스 유도 단백질을 수확시에 100, 120 또는 150 ㎍/ml 이상, 더욱 바람직하기는 200 이상 또는 300 ㎍/ml의 농도로 생산하는 것이다. 원하는 단백질은 또한 예를 들면, 백신 또는 진단 테스트에 혼합시켜서, 수의학 또는 의약용의 항원성 물질을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 원하는 단백질은, 예를 들면, 백신의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명에 의해 제공된 예는 페스티바이러스 E2 단백질 또는 그의 단편이며, 이것은 예를 들면, 돼지에서 전형적인 돼지열(swine fever) 등의 페스티바이러스 감염에 대한 백신을 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 면역친화성 정제되지 않고, 바람직하기는 일회 용량으로 단일 백신접종 후에 PD95 수준에서 페스티바이러스 감염에 대해서 보호해주는 것을 특징으로 하는 재조합 페티스바이러스 E2 또는 E^rns 단백질 또는 그의 단편으로 구성되는 백신을 제공한다. 이것은 특히 CSFV 백신접종에 적절하다. 적용시, CSFV 백신접종은 일반적으로 CSFV의 발생이 일어난 지역에서 대규모 캠페인 동안 행해진다. 이것은 비교적 짧은 기간 중에 많은 수의 동물의 빠른 백신접종을 요구한다. 이러한 대규모의 캠페인에서는, 적당한 보호수준(야생형의 바이러스 감염에 대해 보호된 돼지의 수)을 신속하게 성취하는 것이 중요하다. 월등한 보호를 위한 이차 백신 접종을 위해 일차 백신 접종 후 몇주동안 기다리는 것은 질병의 억제를 방해하고, 연장시킨다. E2(단편)가 바쿨로바이러스에서 발현될 때에도 재조합적으로 발현된 E2 단백질을 생산하기 위한 다양한 방법들간에 차이가 존재한다. 초기에 보고된 E2 단백질 생산 배양물에서, E2 단백질(단편)은 20-90 ㎍/ml 사이에서 다양하게 변하며 (Hulst et al, J. Virol. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20: 271-279, 1996), 또한, 단일 쇼트 백신 접종을 위해 필요 적절한 E2 항원매스를 얻기 위해 모노크로날 항체로 면역친화성 정제를 필요로 한다. 추가의 면역친화성 정제없이 곤충 세포의 상징액으로부터 얻은 E2를 사용하는 또다른 방법(유럽특허 제 0389034호에 기재된 E2의 단편을 사용함)은 만족스러운(보호된) 면역 반응을 얻기 전에 두 차례 주사된 E2 기초 백신을 생산한다. 현재는 E2 항원으로 구성되는 백신(Porcilis®Pesti)이 등록되었을지라도, 이 백신은 2회 사용되는 것이 필요하므로, 원하는 면역 반응을 제공하기 위해서, 4주 간격으로 2회 이상의 백신접종을 갖기 때문에, 이 백신을 사용한 종래의 돼지열 감염에 대한 백신화의 유용성은 심각하게 방해된다.

*그 중에서도 특히, (본 발명에 의해 해결된)이러한 문제들은 저농도의 적절한 항원물질 (이 경우에 있어서, 원료 재료중 E2 단백질(단편), 예를 들면 그로부터 백신이 제조되는 세포 상징액)에 관계된다. 이론적으로, 이 기술에 알려진 정제 및 농축 방법으로 항원성 매스를 좀 더 축적시킬 수 있으나. 이것은 투여량 당 높은 비용이 들므로 상업적으로 매력적인 백신을 생산하지 못하게 한다. 또다른 실시예는 백신 또는 진단 시험, 또는 기타(치료성) 물질로 또한 사용될 수 있는, 페스티바이러스 E^rns 단백질이다.

예를 들면, 루길리(Ruggli)(Virus Genes 10: 115-126, 1995) 등은 단지 5-10㎍/10⁶세포 이하의 최고 수율로 단층 곤충 세포 배양에서 E2를 발현하는 바쿨로바이러스를 증식시켰다. 더 나아가, 모세르(Moser)(Vet. Microbiol. 51: 41-53) 등은 5개의 MOI를 사용한 단층 곤충 세포 배양에서 루길리 등의 E2를 증식시켰고, ELISA 목적을 위한 비농축된 형태 중에서 충분한 항원을 생산하지 않았다. 그들의 경험에서, 단백질의 니켈-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의한 추가 정제는 간단한 취 급 및 ELASA 질의 향상의 필요조건이다. 이와 같이 제조된 E2 단백질을 사용한 백신 제조는 없었다.

백신접종이 연구의 목적일 때, 어느 정도 보호를 성취하기 위해 면역정제된 E2 단백질을 사용하여 백신접종을 2회 실시할 필요가 있음을 발견하였다. 예를 들면, 헐스트(Hulst) 등(J. Virol. 67: 5435-5442, 1993), WO95/35380, 및 반 리진(van Rijn)등 (J. Gen. Virol. 77: 2737-2745, 1996)에서, E2는 단층에서 생산되었고, 면역친화적으로 정제하여 예방용 백신을 얻었다.

본 발명에 의해 제공된 예는 재조합 CSFV E2 단백질(단편)로 이루어지는 백신이며, 충분한 양으로 생산할 수 있고, 동물이 일회 용량으로 1회 백신접종을 받은 후 2 내지 3주 내에 종래의 돼지열 바이러스 감염에 대한 예방(95%의 예방 용량 수준에서)을 제공하는 백신에 병합되기 전에 더 이상 면역친화적 정제를 필요로 하지 않는다. 본 발명에 의해 제공되는 방법은 일회 용량으로 1회 백신접종 후에 페스티바이러스 감염에 대한 예방을 가져오는 반면, 단백질(단편들)이 면역친화성에 의해 정제되지 않는, 재조합 페스티바이러스 E2 또는 E^rns단백질 또는 그의 단편들로 구성되는 백신을 제공한다. 본 발명은 본 발명에 의해 제공되는 단백질과 또한 보조제로 이루어지는 백신을 제공한다. 적당한 보조제는 당업자에게 잘 알려져 있으며 예를 들면, 프로인트 보조제(Freund adjuvant), 또는 산화알루미늄, 또는 수중유(oil in water) 또는 이중(double) 수중유 또는 유중수 에멀젼 등의 에멀젼이다. 원하는 단백질은 또한 예를 들면, 수의학 또는 의약용의 기타 물질을 재조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 또 다른 실시예는 여포자극호르몬(FSH, α-단위 및/또는 β-단위 및 복합체 및 그의 단편들) 등의 호르몬과 같은 물질이며, 이는 예를 들면, 배양물 중에서 α-유니트를 발현하는 바쿨로바이러스 및/또는 β-유니트를 발현하는 또 다른 바쿨로바이러스로 곤충 세포 배양물을 감염시켜 생산할 수 있다. 본 발명에 의한 방법은 또한 생물학적 살충제로서 (재조합) 바쿨로바이러스의 대규모 및 저비용 생산을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 구현예는 곤충들은 일반적으로 폴리헤드라 유전자가 결핍된 바쿨로바이러스에 의해 덜 감염되기 때문에, 생물학적-살충제의 생산시 외래 유전자 발현을 위한 p10 프로모터를 이용한 재조합 바이러스를 사용하는 것이다. 본 발명에 의한 방법을 사용한 기타 재조합 단백질을 발현하는 기타의 재조합 바쿨로바이러스의 배양 및 생산 및/또는 살충, 의약, 치료 및/또는 항원성 물질 또는 생성물과의 병합을 위한 이러한 바이러스 단백질의 사용은 당업자의 기술로 가능한 것이다.

본 발명은 실험 부분에서 좀더 설명되나, 그것에 한정되지는 않는다.

실시예

실험 부분

기존의 플라비비리대 과의 페스티바이러스 속은 통상적으로 전형적인 돼지열 바이러스(CSFV), 보더병(border disease) 바이러스(BDV), 및 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV)로 이루어진다. 여러가지 BVDV 및 CSFV 균주의 게놈은 서열화되었다 (레나드(Renard) 등, 1987, 유럽특허출원 제 0208672호; 콜레트(Collete) 등, 1988, Virology 165, 191-199; 뎅(Deng) 및 브로크(Brock), 1992, Virology 1991, 865-679; 메이어(Meyer) 등, 1989, Virology 171, 555-567; 무어만(Moormann) 등, 1990, Virology 177, 184-188). BDV에 대해서, 단지 불완전한 게놈 뉴클레오티드 서열만이 아직은 유용하다. 페스티바이러스 게놈은 하나의 커다란 열린 리딩 프레임을 함유하는 약 12.5 kb의 양성 가닥 RNA 분자이다. 열린 리딩 프레임은 약 4,000 아미노산의 가상의 폴리프로테인으로 번역되며, 이는 바이러스- 및 세포-코드화 단백분해효소에 의해 처리된다. 열린 리딩 프레임은 게놈의 복제와 관련된 두개의 크게 보존된 작은 비번역 부분과 접하고 있다. 5'-비코드화 부분은 또한 번역 개시에 역할할 수 있다.

세포성 및 바이러스성 단백분해효소에 의해 동시- 또는 후번역으로 진행되는 폴리프로테인은 바이러스성 구조 및 비구조의 단백질 모두를 함유한다. (씨. 엠. 라이스(C.M. Rice); In Fields Virology, 3판, 1996, Flaviviridae: The Viruses and their Replication: 30장, 931-959쪽 참조). E^rns, E1 및 E2 단백질로 둘러싸인 바이러스성 구조 단백질은 폴리프로테인의 N-말단 부분에 위치한다. 세린 단백분해효소 NS3 및 NS5A 및 NS5B의 RNA 복제효소 복합체 사이의 비결정성 단백질은 폴리프로테인의 C-말단에 위치한다.

페스티바이러스에 감염된 동물은 E^rns, E2, 및 NS3에 대한 항체를 발달시킨다. 그러나, 단지 E2에 대한 직접적인 항체만이 강하게 바이러스를 중화한다. 때문에, E^rns 및 NS3에 직접적으로 대항하는 것들은 단지 낮은 바이러스 중화능을 갖거나 또는 전혀 갖지 않는다. 이 지식은 CSF 서브유니트 마커 백신으로서의 E2의 적 합성을 측정하도록 우리를 자극시켰다. 이 구성에서, E^rns 및/또는 NS3는 E2 마커 백신을 사용한 진단 시험에 사용할 수 있다.

*지금까지, BDV 및 BVDV는 다른 종으로 부터 분리될 수 있으나, CSFV은 돼지에 제한되는 것으로 보인다. 페스티바이러스는 구조 및 항원적으로 밀접하게 관련되어 있다. 외투 당단백 E2는 페스티바이러스의 가장 면역원성이며, 가장 가변성의 단백질이다. 우리는 사슴 및 기린의 페스티바이러스를 포함하는, 여러 다른 페스티바이러스 균주의 E2 유전자를 클론화했다. 일시적으로 발현한 E2 유전자를 단클론항체로 특징지우고, 서열화하고, 비교했다 (피.에이. 반 리진(P.A. van Rijn) 등, 1997, Virology, 237: 337-348). 이러한 자료에 기초해서, 우리는 페스티바이러스 속의 여섯개의 주요 군을 묘사할 수 있었다. 네개의 군은 정의된 유전자형에 대응하나, 반면에 두개의 다른 군은 페스티바이러스 속의 새로운 유전자형이다. 첫번째 군은 돼지로부터 분리된 CSFV 균주로 이루어진다. 두번째 군은 양으로부터 분리한 BDV 균주 Moredun, L83 및 X818, 및 돼지로부터의 F 균주로 구성된다. 세번째 군은 양의 BD78 균주, 돼지의 5250 균주, 소의 178003 균주를 포함한다. E2를 기본으로했을 때, 이러한 바이러스는 소의 바이러스성 설사의 급성 열성과 관련된, 소위 유형 2 BVDV인 BVDB 균주와 매우 유사하다. 네번째 군은 소에서 우세하게 기원하는 BVDV 균주로 구성된다. 이 BVDV 군은 BVDV-1a 및 1b의 두가지의 아형 또는 아군으로 나뉘어질 수 있다: BVDV-1a는 NADL 및 오레곤(Oregon) 같은 미국의 바이러스 및 150022 및 1138 같은 유럽의 몇가지 기타 바이러스를 포함한다. BVDV-1b 아군은 오스로스 균주 및 여러개의 네덜란드 분리체를 포함한다. 다섯번째 및 여섯번째 "군"은 두개의 신규의 유전자형으로서 제안될 수 있고, 사슴 및 기린 균주를 각각 포함한다. 수의학용 마커 백신의 발달은 가축의 경제적으로 중요한 바이러스성 질병의 억제 및 박멸을 위한 새로운 개념을 가져온다. 마커 백신의 사용으로 백신접종된 동물과 야생-바이러스로 감염된 동물 사이의 혈청학적 식별 및 이에 의한 바이러스의 억제적 제거가 가능해진다. 예를 들면, 아제스즈키 질병(AD)에 대한 EU 백신접종을 하는 대부분의 나라에서는 오직 gE-음성 백신만을 허용한다. AD 야생 바이러스에 감염된 동물은 gE에 대한 항체를 발달시킨다. 이러한 항체를 검출하는 ELISA 시험은 가축무리로부터 계속적으로 재거될 수 있는 감염된 동물의 검출 및 (지연된)백신접종 캠페인 동안에 가축무리 중의 야생 바이러스 감염을 감시하기 위해 사용할 수 있다. 결국, 목표는 가축무리의 야생 바이러스 제거 상태에 도달하는 것이다. 그 다음, 백신접종은 중단될 수 있고, 이 상태를 안내하는 혈청학적 감시 프로그램이 실시되어야한다. 그러므로, 마커 백신을 사용한 백신접종은 개개의 감염 동물 대신에, 감염된 무리의 근절에 의존하는 박멸 캠페인의 비용을 감소시킬 수 있고, 만약 결과적으로 충분히 넓은 지역에서 충분히 긴 기간 동안 수행된다면, 근절보다 돼지군의 야생 바이러스 제거 상태에 도달하는 더 빠른 방법일 수 있다.

현재 및 이후에, AD와 같은 현재의 부종성 질병을 박멸할때, 예를 들면, 집단에서 박멸되는 질병의 발병을 억제하고, 더 이상의 정기적인 백신접종이 존재하지 않는 마커 백신이 여전히 사용된다. 이런 경우에서, 동물 집단이 혈청학적으로 순수한 곳에서, 전염성이 큰 질병은 폭발적으로 전파될 수 있으며, 막대한 경제적 손실을 야기할 수 있다.

많은 실시예들은 바클로바이러스계가 이종 단백질을 높은 수준으로 발현시킨다는 것을 보인다. 높은 수준의 발현은, 사멸 소단위 백신은 대량의 항원을 적용시킬때 일반적으로 오직 예방적 면역 반응을 도출할 수 있으므로 크게 이롭다. 우리의 첫번째 접근에서, 하나는 TME(BacE2[+])을 갖는 E2를 발현하고, 다른 하나는 TMR(BacE2[-])가 없는 E2를 발현하는 두개의 재조합 바쿨로바이러스를 제조했다 (Hulst 등, 1993, J. Virol. 67: 5435-5442). 이 간행물 및 기타 유사한 간행물에서, E2는 여전히 이것의 옛이름인 E1으로 기재되어있다. TMR을 갖는 E2와는 달리, TMR을 갖지 않는 E2는 세포 배양 배지로 분비된다. 더 나아가, 두개의 E2 모두는 E2에 있는 4개의 항원성 부분의 각각을 나타내는 모노클로날 항체와 동일하게 반응한다. 이것은 세포-결합된 E2와 분비된 E2의 항원성 성질이 동일함을 제안하며, 분비된 E2는 세포-결합된 E2보다 훨씬 많은 수준(10배 높음)으로 생산되기 때문에, 돼지의 백신접종 시도에서 분비된 면역친화성 정제된 E2를 시험하는 것이 결정되었다. 이중 물-오일 보조제 중에 20 ㎍ E2/ml 및 100 ㎍ E2/ml을 함유하는 두개의 백신 조성물을 제조했다. 2 SPF 돼지의 네개군에서, 두개는 E2 20㎍으로, 및 두개는 E2 100㎍으로 IM 백신접종했다. 28일 후, E2 20㎍으로 백신접종한 1군 및 E2 100㎍으로 백신접종한 1군을 동일량의 E2로 재접종했다. 42일째, 모든 동물에게 병원성 CSFV 균주, 브레스시아(Brescia)를 비강내로 투여했다. 백신의 적용 용량을 고려하지 않고, 28일째, 다른 수준으로 접종 돼지에 중화 항체를 투여했다. 적용후 42일 이 될 때까지, 항체의 역가를 그것이 상승되거나 또는 그렇지거나 모든 동물 중에서 높은 수준으로 올려 유지했다. 그러므로, 면역친화적으로 정제된 E2 20㎍으로 단지 한차례 백신접종된 동물에서 조차 CSF에 대해 이미 완전히 예방되었다는 것은 놀라운 것이 아니다.(헐스트(Hulst) 등, 1993, J. Virol. 67: 5435-5442)

페스티바이러스에 감염된 동물은 이차 바이러스성 외투 당단백인 E^rns(강 (Kwang) 등, 1992, Vet.Microbiol. 32: 281-292)에 대한 항체를 일정하게 발달시키기 때문에, 이것은 E2와 결합된 진단 시험을 발달시키기에 가장 적합한 바이러스성 단백질의 하나이다. 그러나, E^rns가 CSF에 대한 돼지의 예방을 위한 중요한 항원일 수 있다고 제안하는 하나의 보고서가 있다.(코니그(Konig) 등, 1995, J. Virol. 69: 6479-6486). 이러한 연구에서, E^rns는 살아있는 바이러스 백시니아 벡터를 사용해 발현시켰다. 주입 위치마다 바쿠니아-E^rns 재조합 바이러스의 5 x 10⁷으로 3개의 다른 경로에 의해 계속적으로 백신접종된 동물들은 백신접종 5주 후에, CSFV 균주의 치사량의 IN 시도로, CSF의 어떠한 증후도 보이지 않으면서 생존했다.

사멸 소단위 백신으로서 Erns의 적합성을 계산하기 위해, 브레스시아 균주의 Erns을 발현한 바쿨로바이러스(헐스트(Hulst) 등, 1994, Virology, 200: 558-565)를 돼지에서 시험했다. 6 SPF 돼지군을 일단, 각각, Erns 5.0 및 20㎍을 사용해 IM으로 백신접종시켰다 (무어만(Moormann) 등, 1996, Proc. 14판 Intern. Pig. Vet. Society Congress, 25-29 쪽, Bologna, 이탈리아). 4 비-백신접종된 SPF 돼지의 세번째 군을 대조예로서 제공했다. 백신접종 3주 후에, 모든 동물을 베링(Behring) 균주 105 TCID50을 갖는 IM으로 접종시켰다. 접종후 5일 이내에, 모든 동물들을 저용량의 Erns으로 백신접종시켜 CSF의 심한 증후를 발달시켰다. 접종후 14일 이내에, 2마리의 동물이 죽었고, 3마리는 죽음 직전에 사살했으며, 1마리는 외관상 회복했다. 회복된 한마리를 포함한, 이들 동물 다섯 마리는 IFT에 양성이었다. 접종후, 고용량의 Erns로 백신접종된 모든 동물은 CSF의 비슷한 정도의 증후 및 수일 동안 고열을 보였으나, 14일 이내에 6마리 중 4마리가 회복되었고, 한마리는 죽었으며, 다른 한마리는 죽음 직전에 사살했다. 4마리의 생존 동물의 경우에서는, 단지 한마리만이 IFT에 양성을 나타냈다. 반면, 모든 대조 동물들은 접종후 5일 이내에 CSF의 심각한 증후를 보였고, 접종 후 14일 이내에 죽었으며, IFT에 양성이었다 (무어만(Moormann) 등, 1996, Proc. 14판 Intern. Pig. Vet. Society Congress, 25-29 쪽, Bologna, 이탈리아).

E^rns를 발현하는 바쿨로바이러스는, 비록 바쿨로바이러스로 발현시킨 E2 용량보다는 훨씬 낮은 효능을 갖기는 하지만, 이종구조의 CSFV을 접종한 돼지를 예방할수 있다고 결론지었다.

여포자극 호르몬(FSH)는 뇌하수체(황체형성 호르몬, LH; 갑상선 자극 호르몬, TSH) 또는 태반(인간 융모막 생식선자극 호르몬, hCG; 임신한 암컷 혈청 생식선자극 호르몬, PMSG)에서 생산되는 당단백 호르몬과에 속한다. 종내에서, 이러한 호르몬 각각은 호르몬 특이적인 베타 소단위와 비공유적으로 결합된 보통의 알파 소단위로 구성된다. 단독 또는 LH와 결합해 투여되는 정제된 FSH는 소를 포함하는 많은 종에서 과배란 반응을 유도하기 위해 널리 사용되었다.

소에서의 문제점은 소(bovine) FSH를 소 뇌하수체로부터의 상당한 양으로 정제하는 것이 어렵다는 것이다. 이런 이유로, 양(oFSH), 돼지(pFSH) 또는 말(eFSH, PMSG) 기원의 FSH는 보통 소의 과배란 치료를 위해 사용된다. 그러나, 소에서 소 해면질판 뇌질환(BSE) 및 인간에서의 크로이츠펠트-야곱병의 변종을 야기시킬 수 있는, 단백질인 프리온(prion)의 존재 가능성으로 인해, 재료로서의 뇌 조직의 적용은 위험이 제거되지 않았다. 더 나아가, 특정적 항체 주사에 의해 그것의 중화를 필요로 하는 태반 유래 재료의 사용은 매우 긴 생물학적 반감기의 불이익을 갖는다. 최종적으로, 현재 사용되는 모든 FSH 제조물은 최소한 이 부분에서는, 과배란 결과물 중에서 관찰되는 커다란 변동을 초래하는 것으로 고려되는 동일한 LH 활성을 포함한다.

이러한 이유에 의해, 소의 과배란 치료는 곤충 세포(바쿨로바이러스 발현 계) 등의 비포유류 세포 중에서 생산되는 재조합 소 FSH(rbFSH)의 적용으로 부터 이익을 얻을 수 있다.

재료 및 방법

1. SF21 세포의 생산 세포 배양(PCS) 제조의 실시예

SF21 작업 세포 종자(WCS)(세포 총 수는 4-10 x 10⁶세포/ml) 1.5 ml이 든 냉동 바이알을 20-30℃에서 녹였다. 녹인 후, 바이알의 내용물을 혈청제거 배지 SF900II 8.5 ml을 함유하는 15 ml 플라콘 튜브로 옮기고, 부유시켰다. 부유 후, 플라콘 튜브의 내용물을 100-200 xg로 10분 동안 원심분리하여, 세포를 침전시켰다. 배지를 따라버리고, 침전물을 SF900II 4-6 ml 중에 부유시켰다. 부유 세포를 SF900II 100ml을 함유하는 100 ml 진탕 플라스크로 옮겼다. 세포를 3-7일 동안, 26-30℃에서 오비탈 진탕 플래트폼에 플리스크를 놓고 40-80 rpm으로 배양했다. 세포 생장 및 세포 생존율은 표본을 진행시켜 감시했다. 세포 밀도가 1.0-6.6 x 10⁶ 세포/ml일 때, 세포를 SF900II 100 ml을 함유하는 두개의 500 ml 진탕 플라스크로 옮겼다. 이것은 세포를 10배 희석한 것에 상응한다. 또다시, 세포를 3-7일 동안 26-30℃에서 오비탈 진탕 플래트폼에 플라스크를 놓고, 40-80 rpm으로 배양했다. 세포 생장 및 세포 생존율은 진행중 조절로 계속 감시 했다. 세포 밀도가 1.0-6.6x10⁶ 세포/ml 일때, 이 경우에는, 세포를 SF900II 100 ml를 각각 함유하는 6-11개의 500 ml 진탕 플라스크로 옮겨 심겼다. 이 경우에도 또한, 10 배 희석이 성취되었다. 세포를 3-7일 동안 26-30 ℃에서 오비탈 진탕 플래트폼에 플라스크를 놓고 40-80 rpm으로 배양 했다. 세포 생장 및 세포 생존율은 진행중 조절로 계속적으로 감시했다. 세포 밀도가 1.0-6.6 x 10⁶세포/ml 일 때, 세포를 함유하는 부유액 500 ml 또는 1000 ml 를 각각, SF900II를 4.5 리터 또는 9 리터 함유하는 5 리터 또는 10 리터 발효기에 옮겨 심었다. 이것은 세포의 10배 희석에 상응한다. 세포를 3-7일 동안 26-30 ℃에서 배양했다. 부유액을 계속적으로 교반(50-100rpm)했다. 세포 생장 및 세포 생존율은 진행중 조절로 계속적으로 감시했다. 세포 밀도가 1.0-6.6 x 10⁶ 세포/ml일 때, 5 리터 발효기의 내용물을 SF900II 약 40 리터를 함유하는 50 리터 발효기로 옮겼다. 26-30 ℃에서 ±5-15 x 10⁵세포/ml의 밀도가 될때까지 배양했다. 부유액을 계속적으로 교반(50 -100 rpm)했다.

2. E2 항원 생산의 예

상기의 세포 현탁액에 ±10⁷TCID₅₀/ml 를 함유하는 작업 종자 바이러스(WNS) (BacE2[-]) 1-2 ml를 첨가했다. 현탁액을 세포의 70 ~ 100가 세포변성 효과(CPE)를 나타낼때 까지 3-8일 동안 28℃에서 배양했다. 배양 중에, 진행 중 조절을 위해 표본(sample)을 취했다. 그 후, 현탁액을 미세 필터를 통해 세포를 제거함으로써 맑게 하였다. 필터된 결과물(즉, 항원 용액)을 모으고, 불활성화 단계(3.3)를 시작할때 까지 -20℃ 이하에서 보관하였다. 진행 중 조절을 위해 표본을 취하였다. 항원 함량을 결정하기 위해, 표본을, 예를 들면 항원 질량을 결정하기 위한 효소-연결 면역 분석 또는 수용성 단백질의 부피당 실중량을 결정하기 위한 단백질 분석으로, 또는 이런 방법을 조합하여 시험하였다.

3. 바이러스 불활성화의 예

바이러스는 2-브로모에틸 암모늄브로마이드(BEA)를 10 mmol/l의 농도로 첨가함에 의해 불활성화된다. pH를 8.2~ 8.7로 조절하고, 온도를 34 ~ 37 ℃에 맞춤으로써, BEA는 2-브로모에틸-이민브로마이드(BEI)로 전환되는데, 이것은 바이러스를 불활성화하는 활성 성분이다. 바이러스 사멸은 진행 중 조절을 위해 표본을 취함으 로 확인할 수 있다. 불활성화는 24 ~ 72 시간이 걸린다. 불활성화 후, 10000 리터 당 1 미만의 전염성 입자가 존재할 수 있다. 바이러스 불활성화 후, BEI는 농도 5 ~ 25 mmol/l까지 티오황산나트륨을 첨가하고, pH를 5.7 ~ 6.3으로 맞춤으로써 중화된다. 표본은 진행 중 조절을 위해 취해진다. 불활성화 및 중화된 항원 용액은 1 및/또는 5 리터 백으로 옮기고 -20 ℃이하에서 저장된다.

4. 제제화의 예

냉동된 항원 용액은 22 ~ 28℃에서 해동되고 SF900II 또는 PBS로 희석되어 50 ㎍/ml의 항원용액으로 된다. 항-미생물제로서 티오메르살을 100 ㎍/ml까지 첨가한다. 표본을 진행 중 조절을 위해 취한다. 이 용액(즉, 첫번째 수층)을 2 ~ 8℃에서 3일 미만으로 보관한다. 한편, 오일층은 마르콜(52)과 몬타나이드(80)의 혼합 (9:1)하여 제조하였다. 또한 이 용액을 2 ~ 8 ℃에서 3일 미만으로 보관한다. 오일층은 0.22 ㎛ 무균 필터를 통해 무균 여과한다. 표본을 진행 중 조절을 위해 취한다. 최종적으로, 두번째 수층을 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 SF900II 배지를 몬타녹스(80)와 혼합(98:2)하여 제조하고, 티오메르살을 최종 농도 100 ㎍/ml까지 첨가한다. 이 용액을 2 ~8 ℃에서 사용할 때까지(3일 미만) 보관한다. 사용하기 전, 첫번째 수층을 무균 여과한다. 진행 중 조절을 위해 표본을 취한다. 첫번째 에멀젼을 첫번째 수층과 오일 층을 혼합하여(1:1.1) 제조한다. 이 에멀젼은 2 ~8 ℃에서 3일 미만으로 보관될 것이다. 표본을 진행중 조절을 위해 취한다. 이중 유중수 에멀젼을 첫번째 에멀젼과 두번째 수층을 유화하여(2.1:1) 제조한다. 이중 에멀젼은 2 ~ 8℃에서 약병에 충전 때까지 격리 저장실에서 보관한다. 표본을 진행 중 조 절을 위해 취한다.

5. 충전 및 밀봉의 예

이중 에멀젼 용액을 청정실 중 클래스 A 지역에서 무균상태로 채운다. 충전 부피는 50, 100 또는 250 ml 약병에 각각 51, 102 또는 255 ml이다. 충전 부피는 충전된 부피의 중량을 확인함으로써 계속 감시한다. 충전 직후, 약병을 마개를 덮고 밀봉한다. 최종적으로, 약병을 2 ~8 ℃에서 격리 저장실에서 보관하고 품질관리를 시작한다.

50 리터 발효기 스케일 E2 소 단위 백신의 도해예

SF 21 생산 세포 배양의 제조(PCS)

6. E2 안정화 실험의 예

목적

정상 조건에서 연장 배양 후 감염된 세포 배양(MOI*0.0001)에서 E2 단백질의 안정성을 조사하기 위한 것이다. 세포 배양물 중 바쿨로바이러스의 감염 과정의 용해 특성 때문에 단백질 분해효소가 감염 사이클 중에서 후반에 배지로 방출될 수 있다. 이것이 E2 단백질을 열화시키고, 그러므로 E2 단백질의 부피 수준이 감소하는지 여부가 이 실험의 주제이다.

물질 및 방법

배지 또는 SF900II를 언급할 때는, 0.2 % 플루로닉 F68을 갖는 SF900II 배지를 의미한다.

SF 21 세포를 갖는 바이알을 해동한 후, 오비탈 쉐이커 플래트폼 위에서 배양기 안의 100 ml 진탕 플라스크 중에 SF900II 10 ml 중에서 배양한다. 세포 배양이 원하는 세포 밀도에 도달했을때, 세포를 500 ml 진탕플라스크 중에서 100 ml로 10배 희석한다. 이 세포 배양이 원하는 세포 밀도에 도달하면, 다시 100 ml로 10배 희석하였다. 초과된 세포 물질은 버렸다. 이 세포 배양이 원하는 세포 밀도에 도달하면, 3개의 500ml 진탕플라스크에 각각 100 ml 부피 씩 10배 희석하였다. 초과된 물질은 버렸다. 진탕플라스크를 IKS 오비탈 쉐이커 플래트폼 위에 놓고 28 ℃의 배양기에서 70 rpm으로 교반하였다.

세포 밀도가 0.612*105 세포/ml이면, 100배 희석된 바이러스 현탁액 63 ㎕를 2번 및 3번 플라스크에 첨가하였다. 1번 진탕플라스크는 오염되지 않은 블랭크로서 남겨 두었다. 감염된 배양물의 MOI는 (0.063*0.01*0.8*107)/(100*0.612*105)= 0.00008 이다.

사용된 100배 희석 바이러스 현탁액은 아래와 같이 제조되었다. MSV 바이알 253을 QC로 해동하고 TC100 배지에서 100배 희석하고, 10% FBS(롯트 번호 97QC0139)를 보충하고, 0.5 ml의 분율들로 -70 ℃에서 보관되었다.

*세포 배양의 조건을 결정하기 위해, 감염된 진탕플라스크 배양물과 감염되지 않은 진탕플라스크 배양물 모두로부터 규칙적으로 표본을 취하였다. 표본화는 아래에 간단히 설명한 것과 같이 실시하였다.

세포 매스 약 1.1 ml를 1000 rpm에서 6 분 동안 IEC Centra GP8R 원심분리기에서 15 ml 팔콘 튜브에서 회전시켰다. 이어서 상징액은 Gelman acrodisc 주사기 필터로 0.45 ㎛ 여과하여 존재하는 세포를 제거하였다. 표본 0.4 ml를 나중의 분석을 위해 날젠(Nalgene) 냉동 바이알 중에 저장하였다.

결과 및 결론

도 1의 데이타와 도 2의 그래프에서 볼 수 있듯이, 플라스크 2 및 3의 세포 증식 곡선은 얼마간 유사하게 전개된다. 191 hpi 후에, 더 이상의 세포를 셀 수 없었다. 사실상 모든 세포가 죽고 오염되었기 때문이다. 플라스크 2의 139 hip 표본은 그래프를 벗어났다. 이 표본의 세포의 총 수는 이전과 다음의 표본보다 훨씬 높다. 이것은 표본화 전 또는 후에 약간의 침전이 발생하여 그 결과 트리판 블루 용액과 혼합된 부정확한 표본이 된다. 이 가정은 생존성과 감염 백분율이 예상한 결과에 따른다는 사실로 확인된다. 이것은 감염된 배양 자체에 특정한 것이 생긴다는 것을 의미한다. 이러한 부정확한 표본화는 표본의 E2 농도에는 영향을 미치지 않는데 이것은 E2가 배지에 존재하고 세포내에는 존재하지 않기 때문이다.

2번 플라스크 내의 E2농도는 약 139 hpi에서 최대 190 ㎍/ml 초과까지 상당히 빠르게 증가하고 215 hip에서 170㎍/ml까지 느리게 감소한다. 그 후 E2-함량은 306.5 hip에서 100 ㎍/ml미만의 최종 수준까지 더 빠르게 떨어진다.

플라스크 3의 프로필은 거의 같다. 최대 E2 단백질 함량은 약 139 hip에서 도달하지만 플라스크 2보다는 약간 높다. E2농도는 15 hip에서 141㎍/ml로 빠르게 농도가 감소하기 전에 139hip에서 233 ㎍/ml로부터 191 hip에서 212 ㎍/ml로 느리게 감소한다. 플라스크 2 및 3은 우수한 관련을 나타낸다.

t=44.25 hip에서 진탕플라스크 1(블랭크)의 숫자를 세었다. 살아있는 세포 밀도는 2.435*106 세포/ml였고 죽은 세포 밀도는 0.190*106 세포/ml로서 생존률은 92.8% 였다. 살아있는 세포 밀도는 플라스크 2 및 3보다 상당히 높았는데 감염에 의해 세포 증식이 천천히 감소된다는 것을 나타낸다. 이 블랭크 배양은 계속 되었다.

다음의 표는 플라스크 2의 표본을 선택하여 실행한 면역 오염 측정의 결과를 보여준다.

표본(hip)	V3	열화된 V3	V8	열화된 V8
0 44 115 139 164.5 191 288 306.5	- - + + + + + +	- - - - - + + +	- - - + + + + +	- - - - - - + -

'-'는 검출 불가능을 의미하며 '+'는 검출 가능을 의미함

*이 표에서 볼 수 있듯이 항원요소 V3 및 V8은 0과 44 hip 표본에서는 검출 불가능 했다. 이것은 E2-ELISA의 결과와 잘 연관된다. 115 hip에서부터 표본에서는 완전한 E2가 검출되었는데 V3와 V8 모두는 E2 밴드에서 검출되기 때문이다.

191 hip에서부터, 두번째 밴드를 작은 단백질로부터 겔에서 볼 수 있다. 두개의 분리된 오염에서 V3와 V8의 면역 오염은 열화된 단백질은 V3 항원요소를 함유하지만 V8 항원요소는 함유하지 않는다는 것을 보여준다. 오염 이외의 어느 곳에서도 V8이 검출되지 않았으나 완전한 E2 밴드에서는 검출되었다. 이 분석은 E2 단백질의 열화가 단백 분해효소의 존재 때문에 발생한다는 것을 명백히 보여준다. 사실상, 이것은 거대 E2 항원 용액의 미세여과 단계 동안 관찰되는 E2 단백질 함량의 급락에 책임을 가질 것이다. 이 다운스트림 과정 단계에서, 세포는 바이러스 불활성화가 시작되기 전에 제거된다.

그러므로, 단백 분해 효소의 존재가 E2 단백질의 열화를 일으킨다고 생각된다.

7. MOI 실험의 예

목적

MOI(multiplicity of infection, number of viruses per cell)와 최대 세포 밀도 및 용적 E2-함량 사이의 상관관계를 더 조사하기 위한 것이다. 한편으로는, 완전한 세포군의 감염은 배지가 소모되기 전 완료되어야 하지만, 다른 한면으로는 낮은 세포 농도에서 총 오염의 감염은 단백질 수득률을 부분적으로 최적화 한다.

물질 및 방법

배지를 언급할 때는 SF900II를 의미한다.

1000 ml 병에서 세포 현탁액 76 ml를 44 ml의 SF900II로 희석하고 부드럽게 혼합하였다. 배양을 희석하기 바로 전 살아있는 세포 밀도는 0.190*106 이었고 생존률은 94.8 %였다. 희석 후 세포 밀도는 ±5 *105 세포/ml이어야 한다.

그 밖에, 젠타마이신을 최종 농도 10 ㎍/ml까지 첨가 하였다. 세포 현탁액을 250 ml 진탕플라스크에 50 ml 씩 9 개로 나누었고 과량의 세포 매스는 버렸다. 첫번째 50 ml를 1번 플라스크로 옮기고, 마지막 50 ml는 5번 플라스크로 옮겼다. 번호 1과 6은 MOI=0(블랭크)를 위해 사용,

번호 2과 7은 MOI=0.000001을 위해 사용,

번호 3과 8은 MOI=0.00001을 위해 사용,

번호 4과 9은 MOI=0.0001을 위해 사용,

번호 5는 MOI=0.001을 위해 사용.

바이러스 원료는 다음과 같이 제조 되었다. 희석 범위는 100배 희석된 바이러스 현탁액을 갖는 약병으로 만들었다 (약병은 ml당 0.8 *105 플라크 형성 단위(pfu)를 함유한다). 100배 희석된 바이러스 원료 용액은 다음과 같이 제조되었다.

주 종자 바이러스를 해동하고 TC100 배지에서 100배 희석한 후, 10 % FBS로 보충하고 0.5 ml씩 -70 ℃에서 보관하였다.

100 배 희석된 바이러스 용액 0.4 ml를 SF900II 배지 3.6 ml로 희석하였고 결과의 희석 인자는 10^-1 이었다. 이 용액 1 ml를 배지 9 ml에 첨가하여 희석인자 10^-2로 희석하고, 이 용액 1 ml를 배지 9 ml에 첨가하여 희석인자 10^-3로 희석한 후, 이 용액 1 ml를 배지 9 ml에 첨가하여 희석인자 10^-4로 희석하였다. 배지 3.1 ml를 세포 배양물을 함유하는 1번과 6번 진탕플라스크(블랭크)에 넣었다. 10^-2, 10^-3및 10^-4 바이러스 희석물 3.1 ml를 각각 4번과 9번, 3번과 8번 및 2번과 7번 진탕플라스크에 넣었다. 이들 진탕플라스크들은 이미 세포 배양물을 함유하는 것이다.

10^-2 바이러스 희석용액 3.1ml에는 3.1*10^-2*0.8*10⁵ = 2.5*10³ pfu가 존재한다. 세포 현탁액 50 ml를 갖는 진탕플라스크 중에는 0.5*10⁶*50 = 2.5*10⁷ 세포가 존재한다. 그러므로, 세포 현탁액 50 ml에 10^-2 희석 용액 3.1 ml를 첨가하면, 그 결과의 MOI는 2.5*10³/2.5*10⁷ = 0.0001 이다.

*제조

다른 바이러스 희석물의 계산과 비교할 수 있는, 50 ml 세포 배양에 10^-3 및 10^-4의 바이러스 희석액 0.00001 과 0.000001의 MOI 를 얻었다. 최종적으로, 10^-1 희석액 2.85 ml를 5번 진탕플라스크에 첨가 하였고 그 결과의 MOI는 0.001 대신 0.00092였다. 바이러스를 첨가한 직후 각 진탕플라스크에서 3.1 ml의 표본을 취했다. 표본 중의 세포를 15 ml 팔콘 튜브 중에서 IEC Centra GP8R 원심분리기에서 회전 시켰다(1000 rpm, 10 분). 높은 MOI를 갖는 오염된 세포 현탁액에서 낮은 MOI를 갖는 오염된 세포 현탁액으로 바이러스가 전달되는 것을 막기 위해, 낮은 MOI로부터 높은 MOI까지 표본화를 실시한다. 원심분리 후에, 표본을(상청액 중에 여전히 존재할 수 있는 세포를 제거하기 위해) 0.45㎛ 필터로 여과하고 3 날젠 냉동 바이알에 걸쳐 나누어 나중의 테스트를 위해 -70 ℃에서 보관한다.

바이러스를 첨가한 직 후, 1번과 5번 진탕플라스크의 세포 밀도를 결정하였다. 첫번째와 마지막 플라스크에 세포를 접종하였다. 세포 밀도는 거의 동일하기 때문에 모든 플라스크는 양쪽 세포 숫자의 평균값과 동일한 세포 밀도를 갖는다고 예상하였다. 초기 생존 세포 밀도는 0.423*10⁶ 세포/ml 인 반면, 죽은 세포 밀도는 0.012*10⁶이며 생존률은 97.3%였다.

모든 플라스크를 Labotech 300 orbital shaker platform 위에 놓고 28 ℃ 방에서 약 75 rpm으로 교반하였다.

23, 95, 125, 144, 173 및 194 hpi(hours post infection)에서, 모든 플라스크를 표본화하였다. 세포 밀도가 결정된 표본은 3.3 ml의 부피를 가졌고, 0.2 ml는 세포 밀도를 결정하는데 사용되었다. 나머지 3.1 ml는 상기와 같이 t = 0 표본을 위해 처리하였다. 숫자를 세지 않은 배양의 표본은 부피가 3.1 ml였다. 194 hpi에서 세포 밀도를 결정하였고 실험을 끝냈다. 남아있는 세포 현탁액(약 30 ml)는 날젠 냉동 바이알에 1 ml씩 넣어 3 부분으로 보관하고 15 ml이 팔콘 튜브에 약 6 ml씩 4 부분으로 보관하였다.

*결과

MOI와 최적세포밀도사이, 더욱 중요하게, MOI와 E2 단백질 수득량 사이에 양 호한 상관관계가 있음을 밝혔다. 이것은 MOI 0.001로 감염된 배양물의 최대 용적 E2 단백질 수득량은 100%로 정해진 그래프에서 볼 수 있다. 용적E2 단백질 수득량은 MOI가 감소함에 따라서 증가하는 것으로 보여졌다. 최대 수득세포밀도에 도달하기 전에, 세포밀도는 최대 0.0001 MOI로 감염된다. 0.00001 또는 더 적은 MOI를 사용하면, 배양물의 감염이 완료되기 전에, 배지가 소모되는 감염이 일어나고, 부분 최적화 단백질 수득률이 된다.

따라서, 단, 감염과정 및 E2 생성이 종료되기 전에 배지가 소모되지 않는 경우에, MOI를 적게 사용하면 할수록, E2 단백질 수득률은 높아지는 결론을 이끌어 낼 수 있다.

재조합 바쿨로바이러스 발현 bFSHa 및/또는 bHSFβ

전이벡터인 pDW-Alpha-9.1 및 pDW-Beta-3.1을 생성하였다. sf21세포는 pDW-Alpha-9.1 및 pDW-Beta-3.1로 코트랜스펙트되었고, 야생(wt) AcNPV/M021 DNA는 세포밖 바이러스 입자와 분리시켰다(국제특허 Wo96/25696). β-갈락토시다제를 발현하는 폴리헤드린-양성 플라크를 분리하여, 배양배지의 ELISA로 bFSHa 또는 bFSHβ의 발현에 대해 분석하였다. 플라크-정제 bFSHa 바이러스(AcNPVa3.4)와 플라크-정제 bFSHβ(AcNPVβ1.4)는 각각 약 10⁷ 및 10⁸의 TCID50으로 바이러스 원료를 제조하는데 사용되었다. FSH는 상기에 기재한 방법에 따라서 생성되고, 17-33㎍/ml의 범위의 생성 수준이 된다.

PD ₉₅ 시험

독성 CSFV 균주 브레시아(Brescia)의 100 LD₅₀인 감염에 대하여 95%의 백신처리된 돼지를 보호(PD₉₅)하기 위해 필요한 1회 백신접종 후의 E2 단백질 용량(ug)의 측정.

동물

6-7주된, 26마리 특이-병원균이 없는(SPF) 돼지를 8마리(A-C)씩의 3군과 2마리의 1군으로 무작위로 분배하였다. 동물은 ID-DLO의 좋은 보호시설안에 B18, B19, B20 및 B21 우리에 수용되었다. 동물을 3일동안 순화되도록 방치하였다. 동물은 1일 1회 구유에 펠렛(Hope Farms)으로 먹이를 주었고, 파이프를 통해 물을 마실 수 있었다.

백신 및 감염량

이중 유중수 보조 백신의 3종류 제제물을 상기에 기재한 바와 같이 제조하였다. 각각의 E2 항원의 농도는 32.0, 8.0 및 2.0 ug/용량으로 달랐다. 돼지들의 왼쪽 귀 뒤 2cm에 1 용량씩 근육주사를 접종하였다(A: 2 ug E2, B:8 ug E2, C: 32 ug E2, D:0 ug E2). D 대조군은 DOE 보조제만으로 접종되고, 센티넬 돼지는 전혀 주사하지 않았다. 백신 3주후, 센티넬를 제외한 각 동물은 CSFV 균주 브레시카 456610의 50% 치사량(=100 Va LD50) 100으로 코로 흡입시겨 감염되었다. 흡입시키기 전에, 센티넬은 군으로부터 분리시키고, 24시간 후에 되돌려보냈다. 접종재료의 바이러스의 함량은 우리로부터 돌아온 후 얻은 표본을 적정하여 결정하였다.

임상관찰

돼지는 동물 연구자가 매일 검사하여, 비정상적인 발견을 기록하고, 필요에 따라 감독 수의사가 요청되었다. 각 군은 1일 적어도 15분 동안 식사시간 및 우리 청소시간 전/및/동안 관찰되었다.

군에서 또는 개개 동물에서 먹이량의 감소는 기록되었다.

체온(직장)은 백신후 9일 동안 및 감염후 20일 동안 기록되었다.

감염후 혈액분석

EDTA-혈액 표본이 감염 후 0, 2, 4, 7, 10 및 14일째에 수집되었고, 백혈구와 트롬보사이트의 수의 변화를 관찰하였다. 혈액중 백혈구와 트롬보사이트 수의 감소는 CSF의 전형적인 징후 중 하나이다. 보통 돼지에서 백혈구와 트롬보사이트의 정상 세포수는 각각 11-23 ×10⁹/1 및 320-720 ×10⁹/1 의 범위이다. SPF 돼지에서, 이 값은 조금 낮아 6-12 ×10⁹/1 및 300-700 ×10⁹/1이다. 기재한 범위는 각 돼지에 따라 변한다. 혈액세포 분석은 Medonic® CA 570 Coulter Counter로 행하였다. 백혈구와 트롬보사이트의 감소증은 앞에서 언급한 최소 수(바람직하기는 1일 이상동안) 보다 상당히 적은 세포/혈소판 수로서 정의되었다.

바이러스 전파/배설, 및 바이러스 검출

체온, 백혈구와 트롬보사이트 및 센티넬의 세로콘버젼(seroconversion)은 접종된 동물에서 이 동물로의 바이러스 전파를 검출하는 매개변수이다. 사체부검에서, 조직표본은 편도선, 췌장, 신장 및 회장에서 모았고, 바이러스 항원 존재 여부를 직접 면역형광법으로 시험하였다. 이 조직 표본의 저온조 부분을 고정하고 폴리 클로날 돼지 항-페스티바이러스 FITC-콘쥬게이트 혈청으로 배양시켰다. 세척후, 이 부분을 형광분석기로 판독하였다. 결과는 양성(=형광) 또는 음성(=비형광)으로 나타내었다.

혈청학상 반응

모든 돼지의 혈청은 백신 후 0, 2, 3주째 및 사후 수집되었다. 표본은 -20℃에서 저장되었고, 바이러스 중화 시험기 및 CSF 특이 항체를 검출하는 ELISA인 Ceditest로 분석하였다. 혈청에서 CSFV 중화 항체 역가는 미크로역가시스템에서 결정하였다. 혈청 연속 이배 희석액은 30-300 TCID₅₀을 포함하고 있는 동일한 용적의 CSFV(균주 브레시카) 현탁액으로 혼합하였다. 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 웰(well)당 약 25.000 PK 세포를 첨가하였다. 4일 후, 미크로역가 플레이트를 상기 기재한 바와 같이 처리하고, 현미경으로 판독하였다. CSFV 중화역가는 모든 바이러스를 중화한 최고 희석액의 역수로서 나타내었다.

통계학적 평가

95% 예방 용량의 결정은 50 이상의 CSFV 중화 항체의 역가가 완전한 예방을 나타냈다는 사실에 기초를 두었다.

결과

동물번호에서, 이 부분은 표 1 또는 표 2에 해당한다.

백신 후 임상관찰

백신은 돼지에 어떤 악영향을 나타내지 않았고, 먹이 섭취량 및 체온은 정상 이었다. 그룹 A 및 C 중에서, 경미한 설사, 식욕감퇴, 및 우울증이 백신후 3일째에 관찰되었다. 그룹 A의 한마리 돼지(448)는 전체 기간동안 정기적으로 구토하였고, 증식이 지연되었다. 그룹 B의 돼지(438)은 한번 토하였다. 돼지(434) (그룹 C, 센티넬)의 체온은 조금 상승하였고, 오른쪽 뒷다리에 절름발이 증상이 나타났다. 먹이 섭취량은 그룹/일 당 3~6 kg으로 백신과 감염 사이의 기간동안 증가하였다.

감염 후 임상관찰

백신처리되지 않은 대조 동물은 감염 후 3일째(번호 59) 및 6일째(번호 60)에서 CSF 증상을 나타났다. 발열, 난동, 전율, 식욕감퇴 및 우울증이 보였고, 감염 10일 후 죽었다. 더우기, 동물은 청색증, 후부 부전마비, 설사 및 심한 구토를 나타내었다. 두 동물 모두 발병후 도살되었다.

2ug의 E2로 백신처리한 모든 돼지(그룹 A)는 감염 2-3일 후 주로 발열, 난동, 우울증, 식욕감퇴 등의 질병 증상을 나타내었다. 발열은 2-10일후 부터 지속되었고, 최고 온도(T_MAX)는 40.7-42.2℃로 변하였다. 7일 후부터, 돼지(443-446)의 발열은 사라졌고, 먹이 섭취량은 감염전의 양으로 증가하였다. 그러나, 448 돼지는 9일째에 죽었고, 447 돼지는 급성 CSF(경련, 후부 부전마비)를 발병하여 도살되었다. 두 마리 센티넬은 감염 후 7-9일까지 정상상태였고, 그후 급성 CSF를 발병하고 발병 20일째 도살되었다.

그룹 B 및 C의 동물에서, 임상 증상 및 발병 기간은 E2 항원의 양을 증가시킴에 따라 경미해졌다.

그룹 B에서, 발열(435-439)은 27일까지 지속되었고, T_MAX는 40.2에서 41.7℃였다. 436번 돼지는 경미한 임상 증상으로 감염에 저항력을 나타내었다. 440번 돼지는 18일 후 급성 CSF로 발병후 도살되었다. 그룹B에서 남아있는 5마리의 돼지는 회복되었다. 두마리의 센티넬은 감염 11-12후까지 정상상태였고, 그후 급성 CSF를 발병시켜서 20일후 도살되었다.

그룹 C에서, 경미한 발열은 6마리의 돼지 중 두마리(430, 431)에서 4-6일 후부터 나타났고, T_MAX는 40.5-41.2 였다. 감염 6일 후 가벼운 우울 증상 이외의 임상 증상은 나타나지 않았다. 감염 전, 430번 돼지는 구토하였다.

두마리의 센티넬은 실험 끝까지 정상상태였다.

감염후 혈액 분석

그룹 A에서, 한마리(450)의 돼지인, 센티넬이 백혈구감소증과 트롬보사이트감소증을 나타내었다. 445번, 445번 돼지는 감염 7일째와 10일째에 트롬보사이트 감소증을 나타내었고, 449번 돼지는 10일째와 14일째에 나타내었다. 그룹 B에서, 한마리 돼지(440)가 백혈구 감소증과 트롬보사이트 감소증을 나타내었고, 나머지는 정상상태였다. 센티넬은 14일째에 트롬보사이트 감소증이 나타났다. 백혈구 감소증과 트롬보사이트 감소증은 센티넬을 포함하고 있는 그룹C에서는 관찰되지 않았다.

대조동물(59,및 60)은 7일후부터 트롬보사이트 감소증을 나타내었다.

감염후 바이러스 전파 및 바이러스 항원

우리에서 되돌아온 후, 접종을 역적정하여 바이러스 역가를 2.55TCID 50/ml 로 하였다. CSFV 바이러스 항원(표 1)은 대조군의 모든 조직 표본과 그룹 A와 B의 센티넬에서 검출되었다. 6마리의 접종 동물중에서 한마리는 그룹 A 및 B에서 양성이었다. 센티넬을 포함한 그룹C에서는 양성이 아니었다.

혈청학상 반응

CSFV의 세로 콘버젼은 VNT에서 역가 25이상으로 정의되었다. VNT에서 사용되는 브레시카의 양을 적정하기 위한 역적정 결과는 41 TCID50/웰이었다.

대조동물(D) 또는 센티넬동물 모두 실험기간 동안 혈청전환되지 않았다(표 2). 그룹 A에서 6마리의 동물중 2마리는 3주후 혈청전환 되었다. 6마리의 동물중 4마리는 감염후 부스터했다(표 2). 그룹B와 C는 백신후 21일째에 혈청전환시켰고, 모든 동물은 감염후 부스터했다. 후자는 동물에서 감염한 바이러스의 성공적인 복제를 의미한다.

결론

동물 당 PD₉₅용량은 1회 DOE 보조제 2ml중에서 32ug의 E2로 결정하였다. 이 용량으로, 매우 독성이 강한 CSFV 균주를 감염시킨 후, 질병의 임상증상이 최소화되었고, 바이러스가 접촉한 동물에게 전파되지 않았다. 결론으로, 6마리의 돼지중 4군(A-D)는 2 ml 보조제(DOE) 당, 각각 32(A), 8(B), 2(C), 및 0 ug Ed(D)으로 근육주사하여 백신처리하였다. 2마리의 백신처리하지 않은 돼지는 각 그룹(A-C)에 두고, 접촉 감염을 유발하는 바이러스 배설물을 검출하였다(센티넬). 3주후, 동물은 매우 독성이 강한 CSFV 균주 브레시카 100 LD₅₀으로 코로 흡입시켜 감염시켰다. 임 상적, 바이러스적, 혈청학적인 변수는 E2 SUB-UNIT 백신의 효과를 평가하기 위하여 측정하였다. 예상한 바와 같이, 그룹 C의 동물들은 다른 그룹의 동물들 보다 감염에 저항성을 나타내었다. 바이러스 항원이 최고 용량의 E2(32ug)로 접종된 동물 조직 표본에서 검출되지 않았고, 이 그룹에서는 질병도 나타나지 않았다. PD₉₅용량은 50이상의 NPLA 역가(백신 후 21일째)가 완전한 예방(바이러스 전파 없음)을 한다는 가정을 유도하였다. 이 결과는 32 ug/동물의 PD₉₅ 용량이다.

백신후 2-3주에, 독성 CSFV 100 LD₅₀으로 감염시킨 것에 대한 예방 수준을 평가하기 위하여, 6마리의 돼지 중 두개의 그룹(A-B)는 32ug의 E2로 근육주사로 백신처리 하였다. 2 마리의 백신처리하지 않은 돼지는 각 그룹(A-B)에 두었고, 접촉 감염을 유발하는 백신처리된 돼지의 바이러스 배설물을 검출하였다. 2주 (A) 및 3주(B)후, 백신처리된 동물과 대조동물을 매우 독성이 강한 CSFV 균주 브레시카 100 LD₅₀으로 코로 흡입시켜 감염시켰다. 임상적, 바이러스적, 혈청학적인 변수는 백신후 2-3주에 E2 아단위 백신의 효과를 평가하기 위하여 측정하였다. 예상한 바와 같이, 그룹 B의 동물들은 그룹A의 동물들 보다 임상징후가 적었고, 감염에 저항성을 나타내었다. 바이러스가 센티넬로 전파된 것은 그룹 A에서만 관찰되었고, 두 그룹 동물의 류코프랙션에서 검출되었다. 그룹 B에서 한마리(414)가 백신후 14일째에 혈청전환되었다. 같은 그룹에서, 21일 후 혈청전환되지 않고 예방되었던 한마리는 단 이틀동안 발열증상이 있고, 감염후 11일 동안에 혈청전환되었다. 대조동물과 센티넬(그룹A) 중 한마리는 백혈구 감소증과 트롬보사이트 감소증을 나타내었다. 바이 러스 항원은 그룹 A 및 B의 동물 조직 표본에서 검출되지 않았다. 결론적으로, 모든 동물은 1회 용량으로 백신후 2주 및 3주째 감염에 대하여 예방되었다.

추가로, 백신후 3개월 및 6개월째 독성의 CSFV 100 LD₅₀의 감염에 대한 예방 수준을 평가하기 위하여, 6마리의 돼지 중 두개의 그룹(A-B)는 32ug의 E2로 근육주사로 백신처리 하였다. 2 마리의 백신처리하지 않은 돼지는 각 그룹(A-B)에 두었고, 접촉 감염을 유발하는 백신처리된 돼지의 바이러스 배설물을 검출하였다. 3개월 (A) 및 6개월(B)후, 백신처리된 동물과 대조동물을 매우 독성이 강한 CSFV 균주 브레시카 100 LD₅₀으로 코로 흡입시켜 감염시켰다. 임상적, 바이러스적, 혈청학적인 변수는 이 기간후, E2 아단위 백신의 효과를 평가하기 위하여 측정하였다. 그룹 A와 B의 모든 동물들은 가벼운 임상징후를 보이며 감염에 저항성을 나타내었다. 단, 대조동물은 백혈구 감소증과 트롬보사이트 감소증이 나타났다. 바이러스가 센티넬로 전파되지는 않았다. 바이러스는 두 그룹에서 취한 어느 류코프랙션에서도 검출되지 않았다. 그룹 B에서 단 한마리(1983)가 백신후 28일째에 혈청전환되었다. 바이러스 항원은 그룹 A, B 동물 및 센티넬의 조직 표본 중 어느 것에서 검출되지 않았다. 결론적으로, 모든 동물은 1회량 백신 후 3개월 및 6개월 뒤에 감염에 대하여 예방되었고, 바이러스 전파도 없었다.

BVDV 균주 4800, 150022 및 178003은 실험실용 E2 아단위 백신을 생성하는데 사용하였다. 이들 균주의 E2 유전자는 바쿨로바이러스 발현계에서 발현되었다 (Hulst et al., 1993, J.Virol. 67:5435-5442) (P.A.van Rijn et al., 1996, I. Gen. Virol., 77:2737-2745). 스포도프테라 프루기페르다 세포주, SF21은 재조합 바쿨로바이러스의 증식 및 E2 단백질 생성에 사용되었다. SF21 세포는 28℃에서 혈청이 없는 SF900 배지에서 증식하였다(GIBCO BRL). 합쳐진 단층의 SF21세포는 세포당 5 TCID₅₀(50% 조직 배양 감염용량)의 복수개 감염으로 재조합 바쿠바이러스로 감염되었다. 4-5일 후, 배양물은 80-90%의 세포병리학적 효과를 나타내었다. 세포는 10분동안 1500*g에서 원심분리하였고, 바쿨로바이러스와 E2를 포함하고 있는 상징액은 수집하여 -20℃에서 저장하였다. 활성이 없는 바쿨로바이러스에, 표준 방법에 따라, 2-브로모에틸-이민브로마이드(BEI)처리를 하였다. 간단히, 600ul BEI 및 600ul 1M NaOH를 교반하였다. 20℃에서 30분 후, 150ml 상징액을 첨가하고, 20℃에서 24시간 동안 휘저었다. 이어서, 25%의 치오설페이트 20ml를 첨가하였다. 바쿨로바이러스를 불활성화 시키는 것은 SF21세포에서 상징액을 적정하여 확인하였다.

실험용 BVDV 백신은 이중 수중유 에멀젼에서 E2를 포함하고 있는 상징액으로 이루어진다. 오일은 90% 마르콜 52(Esso)와 10% 몬타나이드(montanide) 80(Seppic)을 포함하고 있다. 수층 분획은(PBS+) 98% 인산염 완충 식염수, 2% 몬타녹스 80(Seppic)및 100ppm 티오메르살을 포함하고 있다. 상징액, 오일 및 PBS+는 10:11:10의 비율로 사용되었다. 첫번째 상징액과 오일은 유화시키고, 이어서 PBS+를 첨가하고 유화시켰다. 대조 백신은 마찬가지로 야생 바쿨로바이러스로 감염된 SF21 세포의 상징액으로 제조되었다. 제조후, 백신은 멸균되었다.

3종류 백신의 항원의 양이 유사할 것이라는 본 발명자들의 예비 가설은 발현 되는 단백질의 양립성 때문에 맞지 않았다. 항원의 양의 차이는 곤충 세포에서 발현의 차이에 주로 기인한다. 백신 150022는 용량 당 55 ug의 E2를 포함하고 있고, 2번 백신(0일, 21일) 후 태아를 예방하였다(Brusche et al. 1997, Vaccine in press). 백신 4800 및 백신 178003은 각각 용량 당 12 ug과 17ug 의 E2를 포함하고 있지만, 태아를 예방하지는 못했다. 이 결과는 E2 단백질의 양과 태아 예방 사이의 상관관계를 나타낸다. E2 글리코프로테인의 면역원성과 태반 감염균주의 무능력의 차이는, 감염의 상이한 결과 때문이다. 어떤 백신도 이종의 BVDV 감염에 대해 예방할 수 없다.

태아 예방이 외막 글리코프로테인 E2로 백신처리하여 이루어질 수 있으므로, 본 연구의 결과는 BVDV 아단위 백신의 계속적인 개발을 약속하고 있다. 더우기, 백신처리된 동물과 바이러스 균주로 감염된 동물 사이의 차이를 보이는 것은 표시 백신이다. 미래 BVDV 박멸 프로그램의 견지에서 이것은 바람직하다.

토론

이 개발된 제조방법은 곤충 세포내의 바쿨로바이러스로 삽입된 유전자에 의해 코드화된 이종 단백질의 최적 생산을 달성하는 것을 목표로 한다. 바쿨로바이러스 발현 벡터계(BEVS)는 올바른 단백질 폴딩 및 정확한 번역후 프로세싱이 동물 및 인간 적용을 위한 생물학적으로 활성인 단백질을 야기하므로, 다른 재조합 단백질을 제조하기에 매우 적합하다. 바쿨로바이러스는 매우 강력한 프로모터, p10 및 폴리헤드린 프로모터로부터 전사되는 2 비-필수 유전자을 함유한다. p10 프로모터 의 결실 돌연변이는 그것이 세포 배양물에서 바이러스 복제에 필수적이지 않음을 보여 주었다. 그러나, p10은 세포 용해(lysis)에 역활을 한다. p10 단백질의 부재는 감염된 세포를 그대로(intact) 남아있게 하고 감염된 세포로부터 폴리헤드라의 방출을 저지함으로써 감염성 그 자체는 아니나 재감염율을 감소시킨다. 유전자의 생성물 (p10 (또는 피브릴린) 및 폴리헤드린)은 감염기 후기에 발현된다. 요구되는 단백질의 유전자에 의해 이들 유전자를 대치하는 것은 (폴리헤드린 프로모터의 경우에) 이론적으로, 배양물에서 리터당 1그람 폴리헤드린 단백질을 넘는 발현 수준을 초래하는, 곤충세포 배양물의 총 단백질 생산의 50%까지의 수율을 야기한다 (Maiorella et al., (1998) Large-scale insect cell culture for recombinant protein production. Bio/technology, 6, 1406-1410).

감염 다중도 (MOI, ml당 바이러스 밀도와 ml당 세포 밀도의 비)는 단백질 생산의 최적화에 대한 중요한 파라미터이다. 낮은 감염 다중도를 갖는 감염에 대한 명백한 이유는 가능한 작은 바이러스 접종을 유지하는 것이다. 감염이 50L 발효기에서 0.1의 MOI로 ml당 2백만 세포의 밀도로 이루어지려면, 1×10¹⁰ 바이러스가 요구된다. 이것은 1리터 가량의 접종을 필요로 한다. 게다가, 여분의 생산 단계가 이와같은 접종을 하기위해 요구된다.

첨부한 배양의 두가지 주요한 결점은 비효율적인 배지 사용 및 산소의 제한이다. 수용액에서 산소의 용해도가 비교적 불량하다는 사실때문에, 산소는 단층 배양에서 세포에 대한 제한물질이 될 것이다. 정적 배양에서 최대 세포 밀도를 위한 결정인자는 이용가능한 표면이다. 일단 표면이 세포의 단층으로 덮여있다면, 세포 증식은 정지기가 될 것이다. 이것은 약 1×10⁶세포/ml배지의 세포밀도를 초래한다. 현탁 배양액에서는 산소의 제한이 없으며 다른 물질들의 이용가능성이 세포 밀도에 대한 제한 인자이다. 이 제한은 산소 제한보다 더 높은 세포 밀도에서 발생하며, 그러므로 세포 밀도는 정적인 배양에서 보다 더 높게 된다. 산소 제한은 용존산소 농도를 모니터하는 산소 전극을 이용함에 의해 방지된다. 일단 그것이 특정치 아래로 떨어지면, 산소는 발효기의 헤드 공간을 통해 살포에 의해 또는 첨가에 의해 현탁액으로 자동적으로 첨가된다. 현탁액의 적절한 교반(stirring)은 기질성분이 쌓이지 않고 세포가 너무 높은 전단력을 받지않는 균질 배양을 보장한다. 게다가, 교반은 감염된 세포로부터 감염되지 않은 세포로 바이러스의 효율적인 전달을 야기하여 세포의 바이러스 감염의 고효율을 달성하게 한다.

초기에는 단지 세포의 약 0.1-1.3%만이 감염되기 때문에, 잔존하는 세포의 99.7-99.9%는 증식하고 번식한다. 감염된 세포에서 생산되는 바이러스 입자는 감염후 12-20시간 방출된다 (Dee, K.U. and Shuler, M.L. 1997. Biotechnology Progress, 13, 14-24). 세포당 방출된 바이러스 입자의 수는 100-200인데, 이는 세로운 사이클에서 지금까지 비-감염된 세포를 감염시킬 수 있다. 배양액에 존재하는 모든 세포를 감시키기에 충분한 바이러스 입자가 생산되기 전에 여러 사이클이 취해질 것이다. 목표는 배지가 고갈되고 모든 대사 과정이 정지하기 전에 최종 계대 감염의 단백질 생산을 마치는 것이다. 또한 그리고나서 배지가 이종성 단백질의 낮 은 용량측정의 수율을 초래하는, 효율적으로 사용지 않는 부차적인 세포 밀도로 완전한 감염을 달성하는 것은 바람직하지 않다.

바이러스 감염의 전 과정은 폴리헤드린 유전자가 여전이 존재한다는 사실때문에 눈으로 감지될 수 있다. 바이러스 감염은 세포 핵에 축적되는 밀집한 단백질 입자로서 관찰될 수 있다. 세포의 전단 손상을 방지하기 위하여, Pluronic F-68이 0.2%의 최종 농도로 배지에 첨가된다. 게다가, 필요하다면, 안티폼 A가 세포의 사멸을 초래하는 과다한 거품을 제거하기 위해 첨가된다. 50L 배양액에 첨가된 안티폼 A의 총량은 평균 20ml이다.

세포를 감염시키기 위한 최적 바이러스 밀도가 계산될 수 있다. 이 밀도는 세포의 증식률, 새로운 바이러스 입자가 방출되는 감염 후의 시간, 및 감염된 세포당 생산되는 새로운 바이러스 입자 수에 의존한다.

본 발명에 의해 제공되는 방법의 실례는 페스티바이러스 E2 단백질의 제조이다. 비록 이 단백질이 유력한 항원으로서 알려졌으나, 백신 또는 진단 테스트를 위한 E2 (단편) 생산은 항상 성공적인 것은 아니다. 2㎍만큼의 낮은 PD50 (특히 면역원 E2 단편을 사용할때)에 불구하고, 문제는 어떻게 동물당 하나의 단일 예방접종에 의해 많은 그룹의 동물들의 예방접종을 가능케 하는 상업적으로 매력적인 충분한 항원 집단을 갖는 충분한 양의 백신 용량을 생성하는가 하는 것이다. 이것은 특히 CSFV 예방접종에 관련이 있다. 적용될때, CSFV 예방접종은 일반적으로 CSFV가 창궐하는 지역에서 대량 캠페인 동안 수행된다. 이것은 비교적 단시간에 많은 수의 동물의 신속한 예방접종을 요구한다. 그러한 대량 캠페인에서 적절한 수준 (야생형 바이러스 감염에 대해 예방된 돼지의 수)이 신속히 달성되는 것이 절박하게 중요하다. 예방을 달성하기 위해 제2 예방 접종을 위한 제1 예방 접종후의 몇주일의 기다림은 질병의 조절을 매우 방해하고 지연시킨다. 재조합적으로 발현된 E2 단백질을 제조하는 다양한 방법간에 차이가, 심지어 바쿨로바이러스에서 발현된 E2 (단편)을 비교할때 존재한다. 초기에 보고된 E2 단백질 생산 배양물에서, E2 단백질 (단편) 수율은, 단일의 단기 예방접종을 위해 필요한 그리고 관련된 E2 항원성 집단을 얻기 위해 모노클로날 항체로 면역친화성-정제를 더 요구하게 하는, 20-90 ㎍/ml 사이로 다양했다 (Hulst et al., J. Vir. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20:271-279, 1996).

추가의 면역친화성 정제 없이 곤충 세포의 상징액으로부터 수확된 E2를 이용하는 또다른 방법 (EP 0389034에 기재된 E2 단편을 사용하는)은 만족스러운 (예방적인) 면역 반응을 얻기 전에 두번 주입되는 E2 기재 백신을 야기한다. 다른 것들중 이들 문제는 관련된 항원성 물질, 이건에서는 출발물질 예를들면, 백신이 제조되는 세포 배양물 상징액에서 E2 단백질의 낮은 농도이다. 이론상, 공지의 정제 및 농축법에 의해 항원성 매스(mass)를 더 축적할 수 있으나, 이것은 상업적으로 매력적인 백신 제조를 유도하지 않고 용량당 높은 비용을 야기한다.

본 발명에 의해 제공된 방법을 사용하여 50L 발효기에서 생산 가동은 통상적으로, 이론적으로 배양액당 100,000 동물을 예방접종하기 충분한, 200-300㎍/ml 가량의 CSFV E2 단백질 수율을 야기한다.

세포는 대략 10⁷ TCID₅₀/ml를 함유하는 1 내지 10ml 바이러스 접종물을 갖는 0.5 내지 1.5×10⁶세포/ml의 밀도로 감염된다. 배양물은 바람직하게는 세포의 >50-80%가 CPE를 보일때 수확된다. 이것은 감염후 약 100-150 시간이다. 초기 E2 단백질 생산 배양물에서, 세포는 본 발명에 의해 제공된 것 보다 세배 더 낮은 단백질 수율을 야기하는 MOI>1로 (동시에) 감염되었다. 본 발명에 의해 제공된 방법에서, 50L 발효기는 5L 발효기에서 증식된 세포 현탁액의 5L 또는 10L 발효기에서 증식된 모든 현탁액의 10L로 접종된다. 초기 세포 밀도는 3×10⁵세포/ml 가량이다. 세포는 바이러스가 현탁액에 첨가되기 전에 계산된 세포 밀도로 증식시킨다.

다운스트림 처리는 미세여과에 의해 세포 및 폴리헤드라의 제거로 시작된다. 공동(hollow) 섬유 미세여과 장치는 발효기에 연결되어 있고 재료는 0.22㎛의 구멍 크기를 갖는 여과 모듈을 통하여 펌프된다. 채류 흐름은 발효기로 재순환되고 통과 흐름은 100L 관에 수집된다. 여과가 끝났을 때, 이제 세포는 없으나 여전히 감염성 바쿨로바이러스를 함유하는 항원 용액은 100L 관에서 불활성화된다. 일반적으로, 2-브로모에틸-암모늄브로마이드 (BEA)가 8-12mM의 최종 농도로 현탁액에 첨가된다. pH는 2M NaOH를 첨가함에 의해 5.8 내지 8.2-8.7로 된다. 이 pH-이동(shift)은 BEA를 BEI (2-브로모에틸-이민브로마이드)로 전환한다. 이것은 DNA-불활성화제 이다. pH는 주의깊게 모니터되고 6-10으로 조절되고 그리고 온도는 34-39로 유지된다. 불활성화의 6시간 후에, 항원 용액은 제2의 불활성화관으로 이동된다. 이것은 관안의 모든 재료를 BEI와 접촉하게 하여 불활성화되게 한다. BEI를 함유하는 것이 아니라 바이러스를 함유하는 액제 방울들은 제1 관에는 존재할 수 있으나 제2 관에는 존재할 수 없다.

10⁴-10⁷pfu/ml의 농도로 존재하는 바쿨로바이러스는 <10^-7 pfu/ml (10m³당 <1 바이러스 입자)값으로 분해된다. 이것은 숙주 동물 (FMD와 같은)을 감염시킬 수 있는 바이러스에 기초한 바이러스 백신에 대해 사용된 바와 같은 기준이다. 돼지는 바쿨로바이러스를 위한 숙주는 아니다. 불활성화된 항원 벌크는 그것이 물-오일-물로 형식화될 때까지 ≤-20℃에서 저장된다. 32㎍ E2 (용량 2ml)를 함유하는 단일 용량은 예방접종후 2주 내지 적어도 6개월까지, 전형적인 돼지열에 대한 예방 (>PD95)을 부여하기에 충분하다.

생산 방법은 이와 같은 방식으로 디자인되고, 이 방법의 대형화(scaling-up)는 간단하고(straightforward), 250L 또는 심지어 더 큰 발효기의 사용이 가능하다. 정적인 배양물 생산의 대형화는 또한 간단하다; 단지 조직 배양 플라스크를 더 사용한다. 그러나, 50L 발효기에서 통상적으로 달성되는 총 단백질 생산은 대략 7000 T175 조직 배양 플라스크를 소요한다.

세포 증식 및 감염은 산소 및 pH-전극이 존재하기 때문에 발효기에서 더 잘 모니터되고 조절된다. 조직 배양 플라스크에서, 플라스크-대-플라스크 변화의 존재가 가능하나 양적으로 측정될 수는 없다. 불활성화는 정적인 배양 생산물에서 행해졌기 때문에 관에서 훨씬 더 정확하게 모니터되고 조절된다. BEVS (우리 기관내의) 에서 발현된 다른 단백질의 용량측정의 생산은 또한, 만약 세포가 본 발명에 의해 제공되는 방법으로 증식된다면, 상당히 향상된다. 예를들면, 소 FSH의 수율은 10L 발효기를 사용하여 3-4 인자에 의해 증가했다.

*세포는 1.1×10⁶세포/ml의 세포 밀도로 2 재조합체 바쿨로바이러스의 각각 0.003의 MOI로 공-감염되었다. 진탕 플라스크에 현탁액 배양물에서 BVDV의 다른 E2 단백질 및 E^rns 단백질 또는 BVDV 및/또는 CSFV의 수율은 세배 증가했다. 이 방법은 또한 다른 재조합 단백질에 응용가능하다.

Claims

재조합 여포 자극 호르몬, 또는 그것의 α-유니트, β-유니트, 또는 이들의 혼합물을 수확시 증식 배지에서 15㎍/ml 이상의 농도로 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 배양기 내 증식 배지에서 곤충 세포를 증식시키고, 그리고 상기 α-유니트를 발현하는 하나 이상의 바쿨로바이러스 또는 상기 β-유니트를 발현하는 하나 이상의 바쿨로바이러스의 접종물로, 상기 세포를 0.01 내지 0.0001의 감염 다중도로 감염시키는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 농도가 25㎍/ml 이상인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 곤충 세포 배양물을, 배양물 내에서 α-유니트를 발현하는 하나의 바쿨로바이러스와 β-유니트를 발현하는 다른 바쿨로바이러스로 감염시키는 단계를 포함하는 방법.