JPS59184133A - ＩｇＭの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ＩｇＭとこれに混在するカリクレイン様活性
物質を分離する方法に関し、その目的とするところは、
静注用１ｇＭ靜剤に使用しうる純粋なＩｇＭを提供する
ことにある。

人免疫グロブリン（Ｉｇ）のうち、特にＩｇＧが各種疾
病の予防及び治療に汎用され、著しい予防及び治療効果
をもたらしていることは衆知のことである。ところで免
疫グロブ１１ンの生物活性はその種類によって互に異っ
ており、ＩｇＭは中　生体に対する抗原刺激によりＩｇ
Ｇより先に生成される。

（１１）分子構造上５重合体で、抗原との結合値は１０
　（ＩｇＧは２）であり、そのため細菌、特にダラム陰
性菌に対して強い凝集活性を有す。

（曲　溶菌活性、及びオプソニン活性はＩｇＧのそれよ
りも強い、等の特質を有している。これらの特質により
、ＩｇＭは細菌感染症の治療には、　ＩｇＧよりむしろ
適しているのではないかとも言われている。このような
ことからＩｇＭ（ｒｉｃｈ　）製剤が注目され開発検討
がなされ、静注化の試みもなされているが、末だ副作用
の点で十分とは云えない。静注用１ｇＧ製剤中に、プレ
カリクレインアクチベーター （Ｐｒｅｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ（
ＰＫＡ）　）、プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ　）、カリ
クレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ　）等の酵素蛋白の混
在が認められ、実験動物における血圧降下即ち、静注時
の副作用との関係で、静注用１ｇＧ製剤中に混在するこ
れらの物質の有するカリクレイン様活性、又はプロテオ
リティク（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　　）あるいはアミ
トリティク（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　　）活性は大きい
問題・となっている。かかる点から靜注用ＩｇＭ製剤の
開発においても、静注時の補体の急激な活性化によりア
ナフィラキシ−機側作用を誘因すると考えられる抗補体
面の低減化とは別に、静注時の副作用のもう一方の大き
な要因と考えられるカリクレイン様活性物質を含まない
ＩｇＭの調製が必要とされている。

しかしながら、コーンのＦｒＩ［ｌからの硫安塩析法と
ゲル濾過法を組み合わせた通常の調製ＩｇＭ分画には、
かなり強度のカリクレイン様活性物質が検出される。し
かもこの調製ＩｇＭ分画に混在するカリクレイン様活性
物質はＤＦ、ＡＥ　−５ｅｐｈａｃｅｌ　ＩＣよるイオ
ン交換りａ−ｉト、あるいはＣｏｎＡ　−５ｅｐｈａｒ
ｏａｅによるアフィニティークロストによる分離によっ
ても分離不可能である。

本発明者らは、かかる問題を解決すべく鋭意研究した結
果、特定条件下での分画により、ＩｇＭとこれに混在す
るカリクレイン様活性物質を明確に分離しうろことを見
い出し、本発明に到達した。

即ち、本発明は、ＩｇＭを主成分とする血漿画分を、弱
アルカリ条件下でポリエチレングリコール分画すること
により、ＩｇＭとこれに混在するカリクレイン様活性物
質分離することを特徴とするＩｇＭの調製法である。

本発明におけるＩｇＭを主成分とする血漿画分とは、血
漿のアルコール分画、硫安分画又はポリエチレングリコ
−ル分画等により得られる粗ＩｇＭを主成分とする血漿
画分、及びかかる粗ＩｇＭ画分を、更に塩析、ポリエチ
レングリコール分画（中性又は弱酸性下）、イオン交換
、ゲル濾過等によりある程度精製して得られたＩｇＭ画
分を意味する。これらの画分に含まれるＩｇＭＫは、い
ずれも多かれ少なかれカリクレイン様活性物質が混在し
ており、そのままでは静注用製剤として用いるのに不適
当である。

カリクレインとは膵臓、顎下腺、唾液、血清などに含ま
れ、化学的本態は不明であ・るが、非透過性蛋白質様物
質であり、末梢血管拡張。

心拍、６幅の増大、冠状動脈拡張作用等を有する。本発
明における力Ｉ】フレイン様活性物質とは、１ｇＭ中に
混在し上記の様な作用を有する物質を総称するものであ
り、これらはＩｇＭ製剤の静注忙際しては、例えば、血
圧降下の如き副作用を惹起するものである。

本発明においては、前記の如きＩｇＭを主成分とする血
漿画分を、弱アルカリ条件下でポリエチレングリコール
分画しＩｇＭからカリクレイン様活性物質を分離する。

分画に際してのＩｇＭ溶液の蛋白濃度は何ら限定される
ものでないが、極めて高い蛋白濃度ではポリエチレング
リコールによる分画沈澱が起り、分離効率が悪くなるこ
とが考えられるので、３重量％以下の蛋白濃度が適して
いる。分画時のｐＨは、弱アルカリ性、即ち７．０＜ｐ
Ｈ≦９．５の範囲であればよいが、好ましくは７．５か
ら８．５の範囲である。ｐ　Ｈ１０以上においては、Ｉ
ｇＭの変性が考えられるので好ましくない。

具体的には、リン酸塩緩衝液等により弱アルカリ条件下
にしたＩｇＭ溶液に、ポリエチレングリコールを４〜１
０　ｗ／ｖ　％の濃度に加え、グロブリンの変性が起ら
ない様にゆるやかに攪拌する。用いるポリエチレングリ
コールは一分子量４，０００〜６．０００のものが適し
ている。

分画は通常、５０℃以下で実施されるがＩｇＭの安定性
の為、０〜１０℃が好適である。析出した白色沈澱を一
般的な分離方法、例えば遠心分離法等で得る。この時の
上清中にカリクレイン様活性物質が含まれる。得られた
白　゛色沈澱を、例えば、ｏ　、　５．ｗ／ｖ　％ポリ
エチレングリコールを含む生理食塩水に再溶解すること
Ｋよりカリクレイン様活性物質を殆んど含まないＩｇＭ
分画が“得られろ。

なお、本発明において、カリクレイン様活性の測定は、
カビ（ｋａｂｉ　）社より市販されているＳ−２３０２
の合成基質（ジニトロベンゼンの結合したベプタイド）
を用いて、以下の如き方法で行なったものである。

塩化ナトリウムが０．１５Ｍとなりかつ牛血清アルブミ
ンが０　、１　ｎ１ｇ　７ｍｌの濃度になる様に、０．
０５　Ｍ、　　ＰＨ８，０のトリス塩酸緩衝液中に両者
を溶かした（アルブミン含有緩衝液）。これに上記の合
成基質Ｓ−２３０２を１ｍＭ濃度になる様に溶解した。

７ミドリテイク活性を有するＩｇＭ溶液０．１ｒｎ６’
、上記の基質溶液０．１ｍｊ＋。

更に上記のアルブミン含有緩衝液０．８ｍｌを混合し、
各々の実験で５〜３０分間３７℃で反応させた（アミト
リティク活性によってジニトロベンゼンが遊離する）。

その後反応を停止する為に、５０係酢酸溶液を００１ｍ
１加え、反応液の吸光度（ジニトロベンゼン）を４０５
ｎｍで測定した。反応液の吸光度を（Ａｓ）、　　ブラ
ンクの吸光度を〔Ａｂ〕とし、アミトリティク活性は下
記の式で求めた。

以下、実施例により本発明を詳述する。

なお、実施例中のチはすべて重量基準である。

実施例１ コーンのＦｒ−１より硫安塩析とセファロース４Ｂゲル
濾過法により得た、純度９０チ以上蛋白濃度２％のＩｇ
Ｍの生理食塩溶液５０　ｍｌに、ｐＨ８，３の０．１Ｍ
ＩＩン酸塩緩衝液５０　ｍｊｌを加え、均−比重、ＰＨ
が８．３近辺であることを確認し、別途純水で調製した
５０ｑｂポリエチレングリコール４０００溶液を、３　
ｗ／ｖ　％　Ｋなる様にゆるやかに攪拌しながら滴下し
た。生じた白色沈澱を遠心分離法により集め０　、５　
ｗ／ｙφポリエチレングリフール４０００を含む生理食
塩水に溶解した。

同様の操作をポリエチレングリコール４０ｏＯの濃度が
５．６，７，８，９　ｖ／ｖ　％の下で繰り返し実施し
、各々の濃度で沈澱する蛋白画分を得た。各々の両分の
蛋白量とカリクレイン様活性を測定した。

その結果を第１図に示した。第１図からかかる様にポリ
エチレングリコール４０００５　Ｗ／Ｖ　％で分画する
ことより、殆んどカリクレイン様゛活性物質を含まない
ＩｇＭが得られた。

実施例２ コーンのＦ−ｎ［の抽出液を硫安塩析し、０．３〜０．
５飽和で沈澱する両分を得、これを生理食塩水に対し充
分透析して粗ＩｇＭを得た。この粗ＩｇＭ溶液に、０．
１　Ｍ、　ｐＨ８，３のリン酸塩緩衝液を加え、蛋白濃
度を２係に稀釈し、その蛋白溶液のＰＨが８．３近辺で
あることを確認して、これに５０係ポリエチレングリコ
ール４０００水溶液をゆるやかに攪拌下Ｖｃ６Ｗ／ｖ係
になる様に滴下し、生じた白色沈澱を遠心分離法によっ
て集めた。これを０．５ｗ／ｖポリエチレングリコール
４０００を含むリン酸緩衝化生理食塩水に溶解し１ｇＭ
溶液を得た。この１ｇＭ溶液のカリクレイン様活性は、
分画前の硫安塩析の粗１ｇＭの約１／８であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１のポリエチレングリコール分画によ
るＩｇＭとカリクレイン様活性物質の分離結果を示す図
である。 特許出願人　帝人株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ＩｇＭを主成分とする血漿画分を、弱アルカリ条件下で
   ポリエチレングリコール分画することにより、ＩｇＭと
   これに混在するカリクレイン様活性物質を分離すること
   を特徴とするＩｇＭの調製法＠