JPH07504202A - ロイキンフェロン製剤 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ロイキンフェロン製剤 日　の　術 本発明は新規サイトカイン組成物、その１１１５法、および細菌感染症、ウィル ス感染症および癌などの種々の疾患の免疫療法における本製剤の使用に関するも のである。 Ｌ見ｆｆｌ 免疫系は、細菌、ウィルス、カビおよび寄生虫などの感染源に対する生体防御と なる。ごく最近、免疫系の状態が特定のタイプの癌のかかりやすさと関連しうろ ことが示された。たとえば、特定の免疫不全状態、最も有名な後天性免疫不全症 候群（＾ＩＤ５）で、癌の発生率が大きく増加することが示されている。免疫療 法は種々の感染１こ対して、そして癌の治療においてさえも重要な療法になった 。免疫療法の部門の一つに免疫反応を調節、誘導または増強することが可能な免 疫１１節剤の使用がある。 広範な研究がなされてきた免疫調節剤の１グループは、サイトカインである。サ イトカインは免疫系の化学伝達物質で、　リンパ球および単球のような免疫細胞 によって産生される。インターフェロン（ＩＦＮ）と呼ばれるあるサイトカイノ は免疫系を誘導するばかりでな（、腫瘍にも直接作用して腸瘍細胞の増殖を阻害 することが示されている。インターフェロンは技術面ではよく知られている。 そのＩＡ創製法同様、その特Ｉこ関する詳細はメソノヅ・イン・工／ザイモロノ ー、＋１９１！”インターフェロン、　パートＣ”　１９８６年に記載されてい る。 インターフェロンのようなサイトカインでは精製製剤と同様非精製製剤も入手で きるが、これらの既知製剤に関して以下の問題点が挙げられる。非精製製剤は一 般にサイトカインを分解し、それによって製剤の安定性を低下させる蛋白分解酵 素を含んでいる。蛋白分解酵素阻害剤を用いることもできるが、これらは一般に 人に対して毒性または抗原性を有し、したがって治療応用の点から有用でない。 一方、精製インターフェロンは一般ニ蛋白分解酵素を含有しないが、今日知られ ているインターフェロンの精製法では、インターフェロンの収率が悪い。 さらに精製製剤の生物活性は、非精製インターフェロン製剤のそれよりも概して 低い。 ８０年代初期に、　インターフェロンの非精製製剤が同じロフトの未加工ＩＦＮ から調製した精１５１ＦＮよりも有効に、ヒトナチュラルキラー細胞（Ｎ【）を 活性化することが認められた。表＾に示すように、非精製ＩＦＮでは５０１Ｕ／ ｍｌの力価で、そして精製インターフェロンでは６２５１Ｕ／ｍｌの力価で最高 度のＭＷ活性化を連成することができる。これらの力価ではそれぞれ、Ｎ【細胞 を５５０％および６００％活性化した。このデータから、非精製ＩＦＮはより高 い免疫活性化能力を有し、これはなんらかの他のサイトカインがＩＦＮと共存し ていることによる可能性があるという結論が得られた。 後になって、　ドナーの白血球の混合培養により（ウィルス誘発および遺伝子型 の翼なる細胞の相互作用に反応して）＋　インターロイキン−１（ＩＬ−１）、 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、遊走阻止因子（ＡＩＩＰ）、白ｍ球遁走阻止因子（、 ＬＩＦ）がＩＦＮ−αとともに産生されることがわかった。これらのサイトカイ ンは免疫エフェクター細胞（主としてマクロファージ、Ｔ４−リンパ球、好中球 ）の活性化に関与し、免疫系による抗原認識および体内からのその抗原の除去に 関与することが知られている。これらの反応は、抗原との遭遇に反応したエフェ クター細胞によって発現される免疫反応の第一段階を表している。特異的な液性 反応およびメモリー細胞の発現といった免疫反応の増幅は後に起こる出来事で、 免疫反応の第一段階（非特異的）における有効な免疫反応に依存する。 ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＴＩＩＦ、　ＭＩＦおよびＬＩＦのようなサイトカインは物 理化学的性質が興なり、そのため活性のある組成を保持することは非常に難しく 、化学的な精製手順の後サイトカイン製剤の混合物として構成される。　さらに 、異物蛋白質（非経口投与で用いられる場合は特に）は感作を誘導することがで きるため、蛋白質の特性を有する医用製剤にとっては総蛋白質の量を制限するこ とが非常に重要である。しかし、蛋白質濃度を低下させれば活性因子の蛋白分解 に対する感度が増加する。結果的に、技術的な操作後にこのような製剤の活性は 低下し、薬物列形の保存に関する問題が生じる。 したがって上記のすべてを踏まえると、サイトカインの混合物を含み、はとんど 実質的に１自分解酵素を含有せず、　しかもよい生物活性を示すサイトカイン組 成物を産生ずることが望ましい。 Ｌ１旦１１ 本発明は新規サイトカイン組成物（ロイキンフェロンと命名されている）ととも にそのＷＲ復製法よび檀々の疾患の免疫療法での使用に関するものである。サイ トカイン組成物はウィルス誘発ドナー白血球によって産生される。サイトカイン 組成物は、初期の非特異的免疫反応相の他のサイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ％ 　ＭＩＦ、ＬＩＦ等）と共にヒト白血球インターフェロンＩＰＨ−ａの自然発生 比で構成され　る。 本発明による新規方法により、これまでの技術の欠点を避けたサイトカイン組成 物が得られる。サイトカイン組成物の一つの新しい成分は蛋白分解酵素阻害剤の 複合体（ＣＰＩ）であり、これは以前にドナー血漿より単離されたものである。 ＣＰＩはサイトカイン製剤における蛋白分解酵素反応を阻害する。さらに、ＣＰ Ｉは自然に存在し、ヒトから単離されたものであるため、ヒトに対して毒性を示 さない。 第二の成分は、　トランサルと命名された新規蛋白組成で、これも本発明ではサ イトカイン組成物の調製中に加えられている。　トランサルは、　ドナー血漿か ら単離された自然に存在する蛋白質のグループである。　トランサルおよびＣＰ Ｉを加えた後、サイトカインを含む培養培地をさらに処理してヒトウィルス、抗 原および抗生物質またはその他の低分子成分のような不純物を除去する。 よって、本発明は以下のステップから成るトランサル産生方法を提供する： り血漿をクロロホルムと混合する、 ｂ）最初の水相を回収する、 Ｃ）最初の水相からγグロブリンを沈澱させる：ｄ）第二水相を回収する； ｅ）第二水相をイオン交換カラムに通す、ｆ）カラムに結合した蛋白質を回収す る。 本発明はまた、　トランスフェリン、アルブミンおよび４０ｋＤａ蛋白質から成 るトランサル組成を規定する。 本発明はさらに、以下のステップから成る蛋白分解酵素阻害剤複合体の産生方法 を提供する：ａ）血漿をクロロホルムと混合スル、 ｂ）最初の水相を回収する、 Ｃ）最初の水相から７グロブリンを沈澱させる；ｄ）第二水相を回収する； ｅ）第二水相をイオン交換カラムに通す、ｆ）カラムを自由に通過した溶出液を 集める、冨）上記の溶出液をＣｕ“３キレートカラムにａｔ、ｈ）カラムに結合 した蛋白質を回収する。 本発明はさらに、　α、−マクログロブリン、１６０ｋＤａ蛋白質＋　８Ｏ−６ ０ｋＤａ蛋白質および２ＯｋＤ＆蛋白質から成る蛋白分解酵素阻害剤複合体を提 供する。 本発明はまた、以下のステップから成るサイトカイノ組成物の産生プロセスを提 供する； Ｓ）ウィルス誘発白血球を液体培養培地中でトラ／サルおよび蛋白分解酵素阻害 剤複合体と共に培養する：ｂ）　ｉｌｉ体から白血球を除去し、 ｅ）　０体を処理して不純物を除去する。 ロイキンフェロン組成は、特定のタイプの癌と同様細菌感染症、ウィルス感染症 のような種々の疾患の治療に有効であることが示されている。 Ｌ１ユ盈月 図１１！、）う７サル、ＣＰｌ、プラズマルおよびヒト血漿のポリアクリルアミ ドゲル分離を図示している。 ０．５Ｌのドナー血漿を新たに採取し、抗凝固剤を加えて血漿を６±２℃に冷却 する。クロロホルムを加えて（１０％容置／容量）、混合物を３０分間攪拌し、 さらに１０分から１５分放置して、上層の水相および下層のクロロホルム相を分 離させる。水層を除去し、６±２℃、２，０ＯＯＸ　ｇでＺＯ分間遠心分離する 。上清を除去し、０．０２１１１１ａ０１１でｐｌＩａ。 ５にＵＷする。続いて、３０％のポリエチレングリコール溶液を１１５容量（ｖ ／ｖ）加え、混合物を室温で２０分間放置する。　γグロブリン画分が沈澱し、 これは１０±２℃、２゜ｏｏｏｘ　ｇで１５分間の遠心作用を加えることにより 分離することができる。次に得られた上清を０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝５ｐｎ ｓ、ｓおよび０．０ＩＭ　ＮａＣ１で平衡にしたＤＥＡＥセルロースカラム（Ｄ ＥＡＥ−５２−セルＩ〈セル、セル／イ、ドイツ）Ｉこ通す。 カラムを自由に通過する画分を集め、これを用−Ａて後【こ詳細に記述する予定 の蛋白分解酵素阻害剤複合体（ＣＰＩ）を調製する。カラムを洗浄し、次にカラ ムに結合した画分（トランサルを含有する画分）をｐＨｌ１．５の０．ＯＩＭ） リス−塩酸緩衝液および０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出させる。　トランサルを含む 溶出液の容量は概して０．２ＳＬはどで、蛋白質濃度は５から１５■ｇ／■１で ある。溶出液のポリアクリルアミドゲル電気泳動を図ルーン２に示す。この図か られ力）るように、溶出液の主成分はアルブミンおよびトランスフェリンである 。分子量４０ｋＤｍの蛋白質も少量存在する。全溶出液をトラ／サルと命名する 。溶出液は実質的にまたは全くγグロブリンを含んでいない。したがってここで 用いる２　トランサル”という語は、　トランスフェリ／、　アルブミン、およ び４０ｋＤｉ蛋白貫の混合物からなる上述のプロセスによる産物を意味する。 溶出液を０．ＩＳＭ　ＮａＣＩ　（　ＰＢＳ）を用いてｐ［Ｉ７．　２の００１ Ｍ燐酸ナトリウムＩｌ衡液に対して透析するか、またはセファデックスＧ−４５ の”目の粗い”カラムによるゲル濾過によって脱塩し、０．２μの膜濾過によっ て滅菌する。 表１は、粗インターフェロン製剤中でのインターフェロン（　ＩＦＮ）産生に及 ぼすトランサル、プラズマｌしまたは未処理の血漿の効果を示す比較試験である 。プラズマルの表は、　トランサルでは、未処理の血漿と比較すると、同じ収率 のＩＦＮ活性を得るために使用する蛋白量が３．５倍、またはプラズマルと比較 すると２．８倍少ないことを示している。　したがってこの表は、　トランサル がサイトカイン組成物における非常に有効な成分であることを示している。 ２　蛋白　素阻　複ム　の 非精製すイトカイン製剤の大きな問題の一つは、蛋白分解酵素活性が一般に高く 、組成中のサイトカインの蛋白溶解を引き起こすことである。非精製インターフ ェロン組成中の多くの非特異的および特異的な蛋白分解酵素阻害剤を調べたとこ ろ、これらの組成が一般的にそのような阻害剤に対して抵抗性であることが示さ れた。特に、デキストラン、ポリグリシン、エチレンジアミノテトラ酢酸、アミ ノカプロン酸およびコントリカルのそれぞれは、アザカゼイン試験によってめた 蛋白溶解に対して０、１−１．０婁ｇ／■ｌの濃度で作用を示さなかった。大豆 トリプシン阻害剤は１　ｓｚ／閤ｌで蛋白溶解を半減させた。フェニルメチルス ル７オニドフルオライド（セルバ、　ドイツ）は非常に有効な阻害剤であること がわかった。しかしこれは非常に毒性が強く、このため医用組成には用いること ができない。 蛋白分解酵素は細胞外体液中に存在し、炎症の急性相での一般的なメディエータ −である。生体はまた、蛋白分解酵素によるＩ自分解を調節するために、蛋白分 解酵素阻害剤も持っている。　たとえば、　α１マクログロブリンのような不活 化のスペクトルの広い蛋白分解酵素阻害剤は、健常なドナーの血漿中にかなり大 量−３■ｇ／嘗１まで存在する。　したがって医用製剤に用いるには、そのよう な天然に存在する蛋白分解酵素阻害剤を単離することが望ましかった。 天然に存在する蛋白分解酵素阻害剤の複合体（ＣＰＩ）を、上記の１）のトラン サルの調製で述べたように、ＤＥＡＥセファロースカラムから容易に溶出する画 分から単離した。 溶出液を集めて０．０２Ｍ　１（ＣＩを用いてｐＨを６５に調整した。 次に溶出液をあらかじめ０．０２Ｍ燐酸緩衝液ｐＨｓ、　５および０８Ｍ　Ｎａ Ｃ１で平衡にしたｃ　ｕ０キレートセファロース４Ｂ（ファルマンア、　スウェ ーデン）カラムに載せた。カラムを０゜０８ＭにａＣｌを含む００２１酸緩衝ｉ １！ｐ１７．４で数回洗浄した。 阻害剤をＯ，ＳＭ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４，５で溶出させた 。この溶出液には２つのピークを有する蛋白質が含まれ、抗蛋白分解酵素活性は 主に最初のピークに存在した。最初のピークに相当する物質を０．ＩＳＭ　Ｎａ Ｃｌを含む００１Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ７，２に対して透析した。　もしくは、　セ フアゾ　ノ　り　スＧ−２５カ　ラム　（ファルマンア、　スウ　ェーデン）を 用いてＯ，ＩＭＥ酸緩衝液ｐＨ１，２を１．５Ｍ　ＩＩｃＩとともに溶出容量の １０分の１加えて脱塩してもよい。 ０．５Ｌのドナー血漿から始めると、およそ２６４±５６ｍ１、総蛋臼貫の平均 が１３２６±１．４４ｍ１の蛋白分解酵素含有画分を得ることが可能である。Ｃ ＰＩの組成を図ル−ン５に示したポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析 した。 ゲルはＣＰＩが４画分を含んでいることを示している。主要蛋白質はα１マクロ グロブリン標準物質に対応する。小さな両分の蛋白質は１６０．８０−６０およ び２０ｋＤａに相当する。 したがって、ここで用いた“蛋白分解酵素阻害剤複合体”（ＣＰＩ）　という語 は、　α、−マク　ログロプリ　ン、　＋６０．　８０−６０、および２０ｋＤ ａ蛋白質の混合物から成る上述のプロセスの産物を指す。 蛋白分解酵素活性に対するＣＰＩの作用を表２に示す。蛋白分解酵素活性の濃度 を０．０２５％トリブ／ン溶液と比較する。この表かられかるように、ブラスマ ルのみを含む調製物は、榎準物質と比較すると２７％もの蛋白分解酵素活性を持 っている。しかし＋　ＣＰＩ　（Ｓｏｎｇ／■ｌ）とともにトランサル（６％） を含む調製物を用いると、蛋白分解酵素活性は認められない。 ３　ロイキンフェロノのＷ４製 デキストラン、　またはポリビニルアルコールのような赤血球沈澱剤を用い、そ の後溶血させて、白血球を健常なドナーから集めた軟層より単離し、これをイン ン二す７、ヒ）血１、　ヘパリノ、　および１００ＩＵ／ｓｌのヒトＩＦＮαを 含む培養培地中３７．５°Ｃで培養する。２時間のインキュベーノヲノの後、誘 導ウイルスー二二−手ャノスル病ウィルス−を加えてさらに２０分間インキュベ ー７ｇンを続ける。誘導された白血球を６±２℃、６００Ｘｇで２０分遠心して 果め、１９９培地または燐酸を含まないイーグルス最少培地に６００万個／■１ の濃度で懸濁する。１５■ｇ／ｍ　ｌのＣＰＩおよび０．０５Ｍ琥珀酸ナトリウ ムと共にトランサルの６％Ｖハ溶液を細胞に加え、　これをさらに３７，５℃で １０から１４時間培養する。次に細胞を６±２℃、６００Ｘ　ｇで２０分遠心し て分離する。得られた上清をさらにロイキンフエロンの調製に用いる。 上清を処理して、抗生物質および培養培地のその他の低分子量組成と共に、　ヒ トウィルス、　ウィルスイノデューサーの抗原およびニワトリ尿膜液のような不 純物を除去する。たとえば抗原は、これらの抗原で先に免疫した動物の血清から 得られ、中性の担体で非動化した抗体への負の免疫吸収によって除去してもよい 。　ヒトウィルスは、クロロホルム溶液中で過酸化水素で処理することによって 化学的に不活化することができる。抗生物質およヒ他の低分子成分はセフアゾ１ クスＧ−２５によるゲル濾過、または１０山以下の排除限界を有する膜による限 外濾過によって除去してもよい。 好ましい一例を具体的にあげると、上述の不純物は以下のように除去してもよい 。上清のｐＨを８０に調整しく００１Ｍ　Ｎａ０Ｈ）、）ｌａｃｌを最終濃度が ０５１こなるように固体で加える。過酸化水素を０５％（ｖ／ｖ）になるように 加え、非精製組成を６±２℃で少なくとも２日間保存する。ウィルスおよび尿膜 液抗原に対する抗体８０ｍＬ含み、　セファＱ−７，４８ｋに非動化したカラム （１５０ｘ　２６ｓ閤）を用いて・Ｑ、　ＩＬ／ｈｒの速度で２０±０．　ＩＬ の非精製すイトカイノ組成物を精製する。 カラムを用いる前に、　これを１０μｇ／μＩｃＰＩの００１Ｍ燐酸緩衝液溶液 ｐＨ８，０および０．５Ｍ　ＮａＣｌで洗浄する。ＣＰＩもまた、最終ａ度５０ μｇ／鳳１となるように非精製組成中に加える。 次に、非精！２Ｍｉ成を１００ｍ１／ｈｒまでの速度でカラムを通すＯ免疫吸収 プロセスでは、粗調製物の活性成分はカラムを自由に通過するが、抗原性を有す る不純物は抗体に結合し、カラムに捕らえられる。この方法（負の免疫吸収と呼 ばれる）により、すべての活性画分の組成は不変のままである。 カラムを通過する画分を集めてクロロホルムで処理してウィルスを不活化する。 クロロホルムは１０％（Ｖ／Ｖ）濃度になるように加える。混合物を攪拌しなが ら室温で３０分間放置する。攪拌を１０分間中止し、上層を集めて６±２°Ｃ１ ６ＱＯＯＸ　ｇで２０分間遠心する。クロロホルム抽出物の下層および沈澱物を 捨てる。遠心後の上清を１．１ｋｇのセファデックスＧ−２５”粗目″　（ファ ルマンア、　スウェーデン）を含むカラム（６０Ｘ　２８００）で、Ｏ，ＳＬ／ ｂｒまでの速度でのクロマトグラフィーによって脱塩する。 蛋白質画分を集めてＯ，ＯＩＭ　ＰＢＳ、　０．１５Ｍ　ＮａＣｌおよび１禦ｇ ／曹ｌマノニ１トに対して透析する。次に上清を０．２μの膜濾過によって滅菌 し、アンプルに注入して保存用として凍結乾燥する。 Ｌ１ヱニュ ロイキノフェロ／は無数のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ臨床常に有意 な免疫１Ｉｉ１１活性を有することが示されて（する。 ＩＦＮ−＋１１はｉｎ　ＶｌｌｒｏでのｌｌｌＩＣ発現に対して１孟とんど作用 を示さないこともまた知られている。 ドナー血液の単球上でヒト白血球関連抗原（ＨＬ＾−ＤＲ）のＭＩＩＣ発現に対 するクイキンフエロンの作用を、　γ−インロンは４４倍の指押を示した。 ンフエロノは５　Ｕ／ｍｌという低Ｌｌ　＋＃度でＭ丁４ｉＢ胞の１１１１１１ こよる感染を培養の７日後でも抑ｉｌｌ　した。 た疾缶のいくつかを表５に要約する。 臨床試験の結果を特異な４例、すなわち敗血症、卵管卵巣炎、Ｂ皇肝炎および乳 １こついて詳細に記述する。 １ニニ亙１１ グラム陰性細菌によって引き起こされた１８人の幼い敗血症の子供に、抗生物質 、鎮痛剤といった基本療法と併せてロイキンフェロノを１日おきに４−６回筋肉 内投与した。治＃ＪＦ後、免疫機能の種々のパラメータを定量した。 結果を表６に示す。この表かられかるように、ロイキンフェロンを基本療法と共 に投与すると、循環中の免疫複合体の数が減少し、負負性好中球の数と同様、好 中球の殺菌機能が回復した（　ＮＣＴ試験によって測定した）。摂取した細菌の 数としてａｔ算すると、貧食指標もまた増加した。貧食の完全性も同様に増加し た。 これらの結果は、　ロイ牛ンフェロンの投与により免疫系の有用性が増強するこ とを示している。臨床改善もまたロイキンフェロンで治療した群では早かった。 例２−卵管卵巣； 卵管卵巣炎は、大Ｖ＆菌、クレブンエラ、カンジダ等の混合線ｍ感染によって引 き起こされる卵管の炎症である。 この保缶により一般に不妊となる。３０人の卵管卵巣炎の女性に、ロイ牛ンフェ ロンの１７／プルを１日２回３日間、ついで１日ｌアンプルを２日間筋肉内投与 した。血液サンプルを治療前と治療後５から７日に採取した。女性の血液細胞に 対するロイキノフェロンの作用の結果を表７に示す。　この表かられかるように 、　ロイキンフェロノ療法は、　免疫グロブリンＭまたはＧの濃度に対して、　 または循環中の補体のＣ３−Ｃ４成分の濃度に対して作用を示さなかった。分化 ８９２８球の数は増加したが、有意ではなかった。　しか１丁９７１球はＰＲＡ およびＥ−ＲＦＣに対するＲＢＴｌ、から示されたように、機能的活性の増大と 共にその数は有意に増加した。 治療後の回復率は６０％で、受胎機能の完全な回復が４１％の女性に認められた 。 Ｌよ二１遣 ロイキ／フェロンを第■段階の乳癌の女性にｊ！ＩＭ免疫療法によって投与した 。女性の白血球を細胞泳動によって集め、ロイキノフェロノとインキ二ベートし 、これを患者に輸血１５て戻した。これらの単核球集団を処置の後定賃した。結 果を表８に示す。この表かられかるように、ロイキンフェロン療法の結果ＭＭＣ を発現している細胞数が増加し、ヘルパーＴ細胞、Ｎに、およびＣＤ４、ＣＤ１ １ａｂおよびＣＤ３ｇの７−カーを有するその他の殺細胞産業■が増加した。　 しかし、サプレッサー１９２８球（ＣＤ８、ＣＤ２２およびＣＤ５８）の量は変 化せず、結果的に７４／Ｔ８細胞の比が増加した。血液循環中の単球−骨髄細胞 （ＣＤｌ５＞濃度はわずか女性を２年間観察したが、平均では癌はほぼ３倍減少 ４−急性Ｂ型片： ロイキノフェロンを急性Ｂ型肝炎患者に投与した。この試験の結果は、　ロイキ ンフェロンが感染の主な臨床症状を速やかに消散させ、肝機能で特徴づけられる 臨床検査データを著しく正常化した。肝炎ウィルスの体内での復製はほとんどの 患者において完全に抑制された。ロイ牛ンフェロンの免疫刺激活性も、１９７１ 球数の増加、ナチュラルキラー細胞の活性化、表面の漿膜転換の開度およびウィ ルスの内部抗原の増加として杖察された。６力月後、ロイキンフェロンで治療し た患者のウィルスの表面抗原は、プラセボ投与のを者で３０％存在していたのに 対し、完全に消失しているように思われた。 要約すると、上記の例はロイキンフェロンがここに図示するように、そして文献 にも広範に示されているように、一般的に免疫系がどうかして抑制された疾患に かかっている患者の予後が良くなるような、または感染症または疾患に対して有 効に闘うのに必要な免疫系に対する正の作用を有することを示している。 治療プロトコールの 例１−４は４つの特異な疾もについて行われた臨床試験の結果を示しているが、 先に述べたようにロイキンフェａンを、種々のタイプの癌と共に幅広い種類の細 菌およびウィルス感染症について試験した。治ｍ法は疾患または病気によって異 なるが、種々の異なる状況でのインターフェロンの使用に関するいくつかのガイ トライノを下に述べる。 細ｍダ染症のための治療過程　出 り豆 ＬＰは機能的免疫不全症の手術患者における細菌合併症の予防に非常に有効であ る。この目的のためにＬＰを用いてもよいが、その場合は筋肉内注射（［１）で 手術前は１日おきに１−２回、手術翌日およびその後１日おきに２−３回注射す る。このような投与法は術後の合併症の頻度を減少させることができ、傷の治癒 過程を促進する。 女性の出産後の産後感染の予防には、ＬＰを分娩当日およびその後は１日おきに １−２回筋肉内注射することができる。適応は胎盤の炎症状態、腎孟腎炎および 他の細菌疾患である。 重篤な状況で、医学的手助けが容易に得られない場合は、細菌感染症を予防する ために患者にＬＰを毎日または１日おきに１Ｍ投与してもよい。 」ユ 急性の細菌感染症では、免疫状聾が安定化した証拠が得られ、臨床症状が消失す るまで、療法開始時にＬＰを毎日または１日おきに（注射５回まで）、その後週 に２回ＩＭ投与してもよい。 肺疾もの療法では、５−ＩＣ−１に溶解したＬＦＩ−２アンプルのエアロノル吸 入を週に１−２回、１Ｍ注射と併用してもよい。 骨盤腹膜炎を含む化膿性腹膜炎患者では、ＬＰを１日おきに３回注射、その後週 に２回注射してもよい。このような患者では、腹腔の治療のために抗生物質と共 に５０１１の生理食塩液に溶解したＬＦ２アンプルの局所投与と１Ｍ注射の併用 が有効な併用投与となる。 腎孟腎炎患者には１日おきにＬＦを２−３回、その後ｌ−３週間は週に２回ＩＭ ｉ１４−射してもよい。 ウィルス感染症 急性Ｂ型肝炎の療法では、肝機能の安定な正常化および抗原血症の抑制が起こる まで、ＬＰを最初の１−３日間は１日に１−３回（強さは中毒症状の重さによる ）、その後１日おきまたは３日ごとに注射してもよい。 慢性Ｂ型肝炎書者ではＬＰを週に２−３回注射してもよい。 インフルエンザまたは他の急性呼吸器ウィルス感染症患者では、各投与経路につ いて３日間ＬＰを１アンプルの吸入と併用して１Ｍ注射してもよい。 帯状庖疹および水痘患者では、ＬＰを３日間毎日、その後１日おきに用いること を勧める。口腔を洗浄しながらＬＦを局所投与することは有効である（ｌアンプ ルを５−１０１の生理食塩液に溶解する）。同じ方法はウィルス性口内炎の治療 にも有効である。 」且１ 基底細胞癌患者では、ＬＰを病変部との境界にある健常な皮膚に１日２回ＳＣ投 与してもよい。 乳癌および肉腫の去者では治癒過程を加速し、転移の発生を遅らせるために、Ｌ Ｐを術前に１−３回、および術後は１日おきに１−３回、その後は週に２回ＩＭ 注射してもよい。 療法の抗腫瘍効果を改善するために、ヒト白血球インターフェロンＩ　Ｘ　ＩＯ ’ｌｌｌの週１−２回注射とＬＦの併用を勧め　る。 」」 同じロフトの白血球から調製した非精製および精製インターフェロンによるヒＩ Ｋのｉ　性化 製剤　４Ｎ−ｙ、ｏン活性　ＮＫ活性化゛非精製ＩＦＮ−α　１０　４３０　％ 精製ＩＦＮ−α　２５　２２０％ Ｘ−フィコール−ベロゲラフィン溶液（Ｄ−１，０７７）の沈澱による軟層から リンパ球を単離した。標的細胞−に５６２−を１０％仔牛血清、グルタミンおよ び抗生物質を含むＲＰＭＩ−１６４０培地で単層培養した。使用前に標的細胞を 細胞７　ｗｉｎあたり５０μＣＩＤ　Ｎｉ”Ｃ’ｒＯｔとともにインキュベート した。 １６時間の殺細胞試験において培養液中の放射活性を測定し　た。 対照１−非銹導細胞の培養後の培地 ｔ４＠２−ヒト白血球インターフェロンについて知られて（する方法によるブラ セボから精製した蛋白質画分轟−１ １ＦＮ−１Ｆ活性に対する種々の蛋白質製剤の作用真Ｎ！地に加えた　生合成後 の　簿られたＩＦＮ−αｌ０質成分　総蛋白質　の活性（ＩＸ　１０”濃度　白 血球について （ｍｇ／膳］）　のｌ１ｌ） ドナー血　漿　（４％）　３．０　±　０．３　２．６フブラスマｉ（４蔦）　 ２．４　±　ｆｌ、　４　２．６７トラノ量＆（６％）　０８５　±　０．１３ 　２．６７３−３つの実験からのデータ ＩＲ剤　蛋白質　蛋白分解酵素の活性“。 （＋＋ｇ／ｍｌ）　３６６ｎｍで　の　標　準　トリフ゛リン溶　液吸光度　へ の％換算 トリフ°ノン標　準　液 ０．０２５％　０．４　１００ ７°１２７ｋ　２ｉ　ｆ　Ｏ，４０，１１ｆ　Ｏ，０１２フトラン４＆＋ＣＰＩ 　Ｏ，６７ｆ　Ｏ，＋０　０　０１−３つの実験からのデータ １−蛋白分解酵素の活性はアザカゼイン試験によりめた。 第二１ ドナー血液の単核球のＩＩＬＡ−ＤＲ発現に及ぼす興なるＩＦＮ製剤製剤　濃度 （ＩＩＩ／ｍｌ）　指標の増幅ＩＦＮ−α　ｔｏｏ　３．　ｌ±　１．０１１１ （４７７エ０７　１００　４．４　±　２．０ＩＦＮ−ご（遺伝子 組み替え型）　ｔｏｏ　１．４±　０．５Ｌユ Ｉ　ＭＴ４細胞をＩＩＩＶとともにインキユベートした２　ＭＴ４細胞のみ ３実施していない 轟−１ ０イキノフエロンを用いて実施された臨床試験の条件のリスト Ａ　細ｓ′＠染　： 予−直 術後または出産後の感染合併症 ｉユ 化膿性−敗血症感染症 急性および慢性気管支炎 急性および慢性肺炎 レジオテリ病 肺結核 サルモネラ症 急性および慢性腎孟腎炎 腹膜炎 卵管卵巣炎 Ｂ　ウィルス感染症 急性および慢性ウィルス肝炎 インフルエンザおよび他のウィルス呼吸器感染症帯状庖疹 水痘 基底細胞癌 乳癌 衣−１ 敗血症の幼い子供の種々の免疫パラメータに及ぼすロイ牛ンフェロン療法の効果 群　免疫パラメータ ＩＲＬ　ＣＩＣ自発　装置性　素置　寅食作（ｕ／ｍ１Ｈｕ／ｍｌ）　ＮＣＴ− 好中球　指標　用の完試験　（翼）　（細胞／全件 （％）　りンへ°球　）　（ｉ） 基本　３０±　２２１±　８５±　３１４４±　３９±　３８．４擦法　０３１ ４　０．９　４．９　０．７＋ロイ４ノ アＩロア　２５．２±　７０±　２７．７±　６２８±　７．２±　８８．５ニ ーＬ ロイ牛ノフェロン治療後の卵管卵果炎患者の種々の免疫パラメータに関する研究 （患者３０人）免疫Ａ’　５１−９　治療前　治療後　信軌性ＩｇＭ（ｇ／１１ 　１．３±０．１　１．３±ｆ１．Ｉ　なしＩｇＧ（ｇ／口　８．Ｑ±（１，５ ９，４±０３　なしＴ総数　６２４±３２　９３８±３ｉ　ｐ＜０．００１Ｐｌ ｆＡに対する ＲＢＴＬ（％）　２４．２土１，７　２９．１ｆ：　１．？　ｐ＜０．００１Ｅ −１ｉＦｃ（Ｘン　２３４土　１．８　３［１，０±　１．５　ｐ＜０．００１ Ｂ総数　４９６±３８　５５８±２０　なし循環中の Ｃ４（ｇ／ｌ）　０．２４　０．２４　なし老−１ 乳癌も者の単核球並集団の動態に対するロイキ７フェロンの影響 亜ｊｌ団　分化関連抗原 へｋＡ’−Ｔ、Ｎｆおよび　（ＣＤ４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３Ｊ）他 の殺細胞並集団 ＭＢＣ抗原を発現しｆ　Ｌｌ　ル（ＢＬＡ−Ａ％Ｂ％ＣおヨヒＢＬＡ−ＤＲ）活 性化単核球の濃度 変化なしまたは減少： 号７°しｑ＋−Ｔ　（ＣＤ８、　ＣＤ５Ｒ２ＣＤ２２）減少： 単球−骨髄法細胞の　（ＣＤＩＳ） 濃度 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８／１６　 ＡＤＹ Ｃ０７Ｋ　１／１８　８３１８−４Ｈ ８３１４−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＦＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，Ｎ Ｅ、ＳＮ。 ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。 ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、 Ｒ○。 ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮＩ Ａ６１Ｋ　３７１０４　ＡＤＤ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トランサル組成物の産生において以下のステップから成る方法： ａ）血漿をクロロホルムと混合する、 ｂ）最初の水相を回収する、 ｃ）最初の水相からγグロブリンを沈澱きせる；ｄ）第二水相を回収する； ｅ）第二水相をイオン交換カラムに通す、ｆ）カラムに結合した蛋白質を回収す る。 ２．その中のステップｂ）において最初の水相のｐＨをおよそ８．５に調整し、 ステップｅ）でイオン交換カラムが陰イオン交換カラムである請求項１に記載の 方法。 ３．第二水相をカラムに通過させる前に０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８． ５および０．０１ＭＮａＣｌで平衡にし、その中のステップ（ｆ）において０． ０１Ｍのトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．５および０．５Ｍ　ＮａＣｌをカラムに通 してカラムに結合した蛋白質を溶出させる請求項２に記載の方法。 ４．ユテッブｃ）において、ポリエチレングリコールでγグロブリンを沈澱させ る請求項１に記載の方法。 ５．請求項１、２、３または４に従って調製するとき常にトランスフェリン、ア ルブミンおよび４０ｋＤａ蛋白質より成るトランサル組成物。 ６．トランスフェリン、アルブミンおよび４０ｋＤａ蛋白質から成るトランサル 組成物。 ７．蛋白分解酵素阻害剤組放物複合体の産生において以下のステップから成る方 法： ａ）血漿をクロロホルムと混合する、 ｂ）最初の水相を回収する、 ｃ）最初の水相からγグロブリンを沈澱させる；ｄ）第二水相を回収すろ； ｅ）第二水相をイオン交換カラムに通す、ｆ）カラムを自由に通過する溶出液を 集めるｇ）上述の溶出液をＣｕ＋＋キレートイオン交換カサムに通す、 ｈ）カラムに結合した蛋白質を回収する。 ８．ステップｂ）で最初の水相のｐＨをおよそ８．５に調整し、そしてステップ ｅ）で、イオン交換カラムが陰イオン交換カラムである請求項７に記載の方法。 ９．第二水相をカラムに通過させる前に０．０１Ｍトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８． ５および０．０１Ｍ　ＮａＣｌで平衝にする請求項８に記載の方法。 １０．ステップｃ）において、ポリエチレングリコールでγグロブリンを沈澱さ せる請求項７に記載の方法。 １１．請求項７に従った方法において、ステップｇ）においてＣｕ＋＋キレート イオン交換カラムが陰イオン交換カラムであり、ステップｇ）においてカラムを 通過させる前に溶出液をｐＨ６．５に調整する請求項７に記載の方法。 １２．溶出液をカラムに通過させる前にＣＵ＋＋キレート陰イオン交換カラムを ０．０２Ｍ燐酸緩衝液ｐＨ６．５および０．８ＭＮａＣｌで平衡にし、ステップ ｈ）において０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．５および０．５Ｍ　ＮａＣｌをカラム に通してカラムに結合した蛋白質を溶出させる請求項１１に記載の方法。 １３．請求項７−１２のいずれかに従って調製すればいっでも、α２−マクログ ロブリン、１６０ｋＤａ蛋白質、８０−６０ｋＤａ蛋白質および２０ｋＤａ蛋白 質で構成される蛋白分解酵素阻害剤組成物の複合体。 １４．α■−マクログロブリン、１６０ｋＤａ蛋白質、８０−６０８ｋＤａ蛋白 質および２０ｋＤａ蛋白質から成る蛋白分解酵素阻害剤組成物複合体。 １５．サイトカイン組成物の産生において、以下のステッブから成る方法： ａ）請求項６の記載に従いトランサル組成物と共にウイルス誘発白血球を培養し 、請求項１４の記載に従って蛋白分解酵素阻害剤組成物複合体を液体培地中で培 養する；ｂ）液体を回収する。 ｃ）液体から不純物を除去する。 １６．サイトカイン組成物を以下のステップにより産生する方法； ａ）ウイルス誘発白血球をトランサルおよび蛋白分解酵素阻害剤複合体を液体培 地中で培養する；ｂ）液体から白血球を除去する ｃ）液体を処理して不純物を除去する。 １７．請求項１５または１６に従った方法において、ステップａ）においてはト ランサルを最終濃度６％ｖ／ｖになろように、また蛋白分解酵素阻害剤複合体を 最終濃度１５ｍｇ／ｍｌになるように加える請求項１５または１６に記載の方法 。 １８．ステップａ）を約３７．５℃で約１０−１４時間実施する請求項１７に記 載の方法。 １９．ステップｂ）において白血球を遠心分離によって除去する請求項１５また は１５に記載の方法。 ２０．不純物がヒトウイルス、異物抗原および抗生物質から成る請求項１５また は１５に記載の方法。 ２１．請求項２０に記載する方法においてａ）ヒトウイルスは過酸化水素および クロロホルムによる化学的不活化で除去する； ｂ）抗生物質はゲル濾過によって除去する；およびｃ）異物抗原は抗原に特異的 な抗体を含むカラム上で負の免疫吸収によって除去する。 ２２．請求項１５、１６、１８または２１に記載の方法により調整したサイトカ イン組成物。 ２３．トランサルと混合物したサイトカイン、蛋白分解酸素阻害剤複合体から成 る組成および適当な希釈剤または担体で、実質的に不純物を含まない組成物。 ２４．免疫調整剤として使用する請求項２３に記載のロイキンフェロン組成物。 ２５．免疫療法において使用する請求項２３に記載のロイキンフェロン組成物。