NL8200509A - Geneesmiddel voor allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren; werkwijze voor het behandelen van patienten die hieraan lijden. - Google Patents

Description

ΐ 4 i VO 303¼ . Geneesmiddel voor allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren; werkwijze voor het behandelen van patiënten die hieraan lijden.

Allergiekwalen worden geïnduceerd door een antigeen-antilichaam-reactie. Wanneer een individu immunologisch geïnjecteerd of gesensibiliseerd is, kan verder contact met antigeen niet alleen tot secundaire stimulatie van de inmuunre spons ie leiden maar ook reacties die het 5 weefsel beschadigen veroorzaken, d.w.z. allergiekwalen. Het mechanisme van pathogenese van allergiekwalen is, naar men momenteel gelooft, als volgt:

Een individu produceert antilichamen na blootstelling aan patho-geen antigeen. Secundaire blootstelling aan antigeen veroorzaakt anti-10 geen-antilichaamreacties en de gevormde antigeen-antilichaamcomplexen zetten zich af op de weefsels en er komen chemische bemiddelaars vrij uit gesensibiliseerde cellen. Daarna beschadigen deze bemiddelaars en/of de afgezette antigeen-antilichaamcomplexen de weefsels.

Pathogene antigenen zijn xenogene antigenen (geïnhaleerd aller-15 geen, allergeen in de voeding, geneesmiddelen enz.), allogene antigenen en autologe antigenen die gedenatureerde autologe componenten van weefsels of organen zijn en zich gedragen alsof ze vreemde stoffen zijn.

Zogenaamde allergiekwalen kunnen in vier typen worden onderver- 20 deeld: (1) type I allergie (anafylactische type), waarbij het antigeen reageert met een specifieke klasse aan mestcellen of circulerende baso-fielen gebonden antilichamen door middel van een gespecialiseerd gebied van de antilichamen. Dit leidt tot degranulatie'van de cellen en 25 het vrijkomen van vasoactieve bemiddelaars.

(2) Type II allergie (cytotoxisch type), waarbij de antilichamen op het celoppervlak zich binden aan een antigeen en verschillende reac- · ties veroorzaken zoals opsonische of immune fagocytose van de cel, en cellyse door de werking van het complementsysteem.

8 2 0 0 5 0 9 ..............."........ ~............'........“..................

e.

- 2 - (3) Type III allergie (Arthus type; door immuuncomplex bemiddeld), waarbij een complex wordt gevormd tussen antigeen en humorale antilichamen en activering van het complementsysteem, plaatjesaggregatie, micro-thrombi-vorming enz. wordt veroorzaakt.

5 (k) Type IV allergie (door cellen bemiddeld of vertraagde type), waar bij thymus-afgeleide lymfocyten (T-cellen) met specifieke receptoren · gestimuleerd worden door antigenen en vrijgekomen bemiddelaars. In het geval van weefselafstoting treedt een transformatie van deze lymfocyten op waardoor bepaalde cellen met het histocompatibiliteitsantigeen 10 van het entmateriaal worden gedood.

Van de allergische reacties nemen typen I, III en IV allergieën deel in b.v. bronchiale asthma en elk van deze reacties wordt onafhankelijk of in combinatie daarmee geacht deze kwalen te veroorzaken. Het mechanisme van de inductie van allergiekwalen wordt geacht als 15 volgt te zijn: een antigeen dat een organisme binnentreedt, wordt behandeld door macrofagen en de immunologische informatie wordt doorgegeven aan het T-cel - B-cel systeem. De B-cellen die de informatie hebben gekregen, produceren antilichamen (igE-antilichamen worden voornamelijk in type I allergie geproduceerd en IgG-antilichamen in type II 20 of type III allergie). IgE-antilichamen binden zich aan circulerende basofielen of aan mestcellen in de weefsels, waardoor de gesensibiliseerde toestand wordt gecreëerd. Daarna bindt hetzelfde antigeen dat het gesensibiliseerde organisme binnentreedt, zich aan de antilichamen op deze cellen en komen chemische bemiddelaars zoals histamine of lang-25 zaam reagerende stoffen van anafylaxe (SRS-A) vrij. De aldus vrijgekomen chemische bemiddelaars induceren allergiesymptomen zoals erythema, oedeem, of verhoging van de kliersecretie, veroorzaakt door contractie van gladde spieren en verhoging van de capillaire permeabiliteit. Anderzijds binden IgG-antilichamen polymorfohucleaire leukocyten om 30 sensibilisatie te bereiken en treedt, naar men aanneèmt, secretie van SRS-A als chemische bemiddelaar op.

Middelen voor het behandelen van allergiekwalen kunnen hun therapeutische doel realiseren door een van de trappen in de bovenstaand vermelde processen te belemmeren. Zo worden b.v. xanthinederivaten, 35 /3-adrenergstimulantia (/3-stimulantia) of corticosteroiden gebruikt 82 0 0 5 0 9 '.......................... ........

-V- o * in de therapie voor bronchiale asthma. Vaak zijn echter ongewenste nadelige reacties bij deze geneesmiddelen waargenomen. B.v. worden hartkloppingen en tachycardie gemeld bij patiënten die xanthinederivaten en /3-stimulantia hebben gekregen. Verder veroorzaken corticosterolden 5 nadelige reacties zoals maagzweren en complicaties van bacteriële infecties. Antihistaminemiddelen zijn voor bronchiale asthma niet werkzaam: deze middelen maken de asthma soms erger doordat ze het opgeven van luchtpijpsecreties moeilijk maken.

Immuuncomplexziekten, vertegenwoordigd door rheumatoide arthri-10 tis, systemische lupus erythematosus (SLE) en lupus nefritis, zijn, zoals de naam impliceert, ziekten die door complexen van antigenen met antilichamen, d.w.z. immuuncomplexen, worden geïnduceerd en behoren tot het type III allergie. Hoewel het mechanisme van het optreden van deze ziekten gecompliceerd is en nog vele niet opgehelderde pun-15 ten heeft, wordt algemeen aangenomen, dat dit de onderstaand beschre-v ven loop heeft.

Wanneer bacteriële of virale infecties weefsels beschadigen-, worden antilichamen geproduceerd tegen nieuw gevormde auto-antigenen of viraal geïnfecteerde cellen teneinde immuuncomplexen te vormen.

20 Omdat deze immuuncomplexen het complementsysteem en plaatjes activeren, komen vasoactieve stoffen zoals histamine en serotonine vrij en neemt de permeabiliteit van de bloedvaten toe. Daarna dringen de circulerende immuuncomplexen binnen in en zetten zich af langs het basale membraan van de vaatwand, waarvan de permeabiliteit is verhoogd. Waar 25 de immuuncomplexen zich hebben afgezet, worden polymorfonucleaire leu-kocyten verzameld door de werking van de leukocyten chemotaxis factoren die gevormd zijn door de werking van het complement van de afgezette immuuncomplexen. De polymorfonucleaire leukocyten die met de immuuncomplexen reageren, doen verschillende weefselbeschadigende 30 stoffen vrijkomen zoals cathepsines D en E, collagenase, elastase en permeabiliteitsfactoren, en deze stoffen beschadigen uiteindelijk het weefsel. Bij patiënten van immuuncomplexziekten zoals SLE, zijn de complementspiegels in het serum in het algemeen laag en is de verergering van de ziektetoestanden nauw verbonden met de afname van de 35 complementspiegel. Haar men aanneemt is deze daling te wijten aan een 82 0 0 5 0 9 .............. .........................- - k - overvloedig verbruik van het complement op de plaats waar de reactie ·-tussen antigenen en antilichamen plaats vindt zoals nieren en bloedvaten. Verder hebben de immuuncomplexen ook relatie met bloedcoagula-tiesystemen en men neemt aan dat de immuuncomplexen ernstige symptomen 5 door middel van diverse mechanismen veroorzaken, b.v. door versnelling van fibrinoïde-afzetting op de beschadigde weefsels.

Momenteel bestaan verschillende soorten middelen voor de behandeling van immuuncomplexziekten; immunosuppressieve middelen zoals steroiden die het geactiveerde immuunsysteem onderdrukken, anti-inflam-10 matoire middelen die lokale ontstekingen en pijnen verminderen, of anticoagulatieve middelen en antiplaatjesmiddelen die ertoe dienen om abnormaliteiten van het coagulatie-fibrinolysesysteem in de bloedvaten te verbeteren. Deze middelen zijn echter niet bevredigend werkzaam en zijn verbonden met sterke nadelige reacties. Er bestaat derhalve een 15 sterke behoefte aan de ontwikkeling van een geneesmiddel dat veilig, is en zeer werkzaam is in de behandeling van deze ziekten.

Anderzijds zijn vele middelen ontwikkeld voor de behandeling van kwaadaardige tumoren.

De antitumormiddelen worden ruwweg in twee typen onderverdeeld. 20 Het eerste type zijn de zogenaamde cytotoxische geneesmiddelen die direct de groei van tumoren onderdrukken. Het tweede type zijn de geneesmiddelen die indirect de groei van tumoren regelen door de immunologische beschermingsfuncties van de gastheer te activeren. Eerstgenoemd type vertoont echter niet een voldoende selectieve cytotoxiciteit te-25 gen de tumorcellen en is ook toxisch- ten opzichte van de normale cellen, waardoor de totale hoeveelheid van het middel die gebruikt kan worden, sterk.beperkt is. Anderzijds wordt het laatste type, d.w.z. im-munopotentiatoren, in het algemeen veilig toegepast, waarbij minder vaak ongewenste nadelige reacties .optreden dan bij het eerstgenoemde 30 type. Tumoren ontstaan echter uit de normale cellen van de patiënt, zodat mogelijk is dat de tumor niet voldoende als een vreemde stof wordt herkend. Daarom hebben sommige immunopotentiatoren een essentieel probleem doordat ze niet voldoende antitumorwerking oproepen.

De uitvinding verschaft nu een middel voor de behandeling van 35 allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, dat als actieve ingre- 82 0 0 5 0 9 - - -...................- « - 5 - dient menselijke urinezuur protease bevat.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een geneesmiddel voor allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren welk geneesmiddel geen nadelige reacties heeft.

5 Verder wordt door de uitvinding een werkwijze verschaft voor het behandelen van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren, waarbij menselijke urinezuur protease wordt gebruikt.

Fig. 1 toont de resultaten van experiment 1. De fig. 2 en 3 tonen de resultaten van experiment 7. Fig. 4 toont de resultaten van de 10 meting van het urineprotelnegehalte in experiment 8. Het urine- proteïnegehalte werd uitgedrukt in een schaal van 0-4 naargelang de mate van kleuring van in de handel verkrijgbaar protexnetestpapier, en het gemiddelde proteïnegehalte voor elke groep werd berekend.

Onder de bovengenoemde achtergrond is door de onderhavige uit-15 vinders intensief gezocht naar de ontwikkeling van een doelmatig geneesmiddel voor de behandeling van allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren. Als resultaat hebben de uitvinders gevonden dat een zuur protease, dat uit menselijke urine geïsoleerd en gezuiverd is, een sterke anti-allergiewerking vertoont, verschillende immuun-20 complexziekten opmerkelijk onderdrukt, en ook een uitstekende anti- tumorwerking vertoont. De onderhavige uitvinding is op de bovenstaande vondsten gebaseerd.

Het zuur protease dat de actieve ingrediënt van de middelen volgens de uitvinding vormt, is een bekend enzym (Mirsky et al, Journal 25 of Clinical Investigation 27, 818 - 824, 1948) dat nooit als geneesmiddel voor allergiekwalen, immuuncomplexziekten en tumoren was toegepast. Het-zuur protease kan uit menselijke urine worden verkregen door gewone methoden voor het isoleren van proteïne zoals uitzouten, adsorptiechromatografie aan anorganische adsorbentia, ionenuitwisse-30 lingschromatografie aan een ionenuitwisselingshars of gelchromato-grafie met behulp van een moleculaire zeef op geschikte wijze te combineren.

Menselijke urine wordt bijvoorbeeld geleid door een DEAE-cellulosekolom, in evenwicht gebracht met 0,1 M acetaatbufferoplossing DTODT0 9 “.............

- 6 - (pH 5,3) volgens de methode van Seijffers et al. (American Journal of Physiology, 206, 1106, 1964) teneinde het zuur protease op de kolom te adsorberen. Het protease wordt daarna geëlueerd met dezelfde buffer-oplossing, welke 0,3 M natriumchloride bevat. Het eluaat wordt gecon-5 centreerd, daarna verder gezuiverd met behulp van gelchromatografie waarin Sephadex G-100 wordt gebruikt, en aan een zuurbehandeling onderworpen. De zuurbehandeling kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd door de pH-waarde van de fractie met zoutzuur beneden 5 in te stellen, gevolgd , door incubatie gedurende een geschikte tijdsperiode. Aldus wordt het 10 zuur protease volgens de uitvinding verkregen.

Het met de bovenstaande methode verkregen zuur protease blijkt een molecuulgewicht van 32.000 - 38.000 te bezitten volgens gelchromatografie over Sephadex G-100.Eten isoëlektrisch punt in het gebied van pH 1 - 3 is gevonden door isoëlektrisch focusseren op Ampholine.

15 Het heeft een maximum absorptie bij 278 nm, toont een positieve reactie met ninhydrine en lost gemakkelijk op in water en is onoplosbaar in ether en chloroform.

Het zuur protease vertoont een uitstekende hydrolytische werkzaamheid in een zuur gebied met een pH-waarde beneden 7, wanneer haemo-20 globine als substraat wordt toegepast.

. Het zuur protease wordt door pepstatine gelnhibeerd. De activi teit van het zuur protease blijft stabiel in een zuur gebied met een pH-waarde beneden 7, terwijl het zuur protease zijn activiteit verliest in basisch gebied met een pH-waarde boven 8.

25 Thans volgt een voorbeeld van de procedure voor het isoleren en zuiveren van het zuur protease volgens de uitvinding. Vanzelfsprekend dient dit voorbeeld echter slechts ter illustratie van de procedure voor het isoleren en zuiveren van het zuur protease; er wordt dus niet beoogd om tot deze methode te beperken.

30 Voorbeeld van de procedure voor het isoleren en zuiveren:

Men concentreerde 100 liter menselijke urine tot ongeveer éénduizend-ste van het oorspronkelijke volume met behulp van een drukultrafiltra-tieïnstrument (Pellicon, merkprodukt van Millipore Co. en Diaflo, merkprodukt van Amicon Co.) met een eindpunt van 1000Daltons. Men 35 bracht 100· ml van de geconcentreerde urine op een DEAE-cellulose 8200509

~£ V

- 7 - (Whattman Col kolom (2,5 x 20 cm), die met 0,1 M.acetaatbuffer (pH 6,0) in evenwichtstoestand was gebracht en met dezelfde buffer, die 0,3 M natriumchloride bevatte, werd geilueerd. Het eluaat werd tot ongeveer 100 ml geconcentreerd door ultrafiltratie en aan dialyse 5 onderworpen. De gedialyseerde oplossing werd daarna aangebracht op een DEAE-sepharose (Pharmacia Co.) kolom (2,5 x 20 cm) in dezelfde toestand als boven beschreven. De geëlueerde fractie werd geconcentreerd tot ongeveer 10 ml, en aangebracht op een Sephadex G-100 gel-filtratiekolom (2,5 x 90 cm) voor verdere zuivering en gelijktijdige 10 verwijdering van pyrogenen. Ongeveer 80 ml van de aldus verkregen oplossing werd met zoutzuur op een pH van 2 ingesteld, gevolgd door 10 minuten incubatie bij 37°C. Daarna werd de oplossing gelyofili-seerd, waarbij ongeveer 20 mg van het zuur protease werd verkregen.

Thans zal de farmacologische werking en toxiciteit van dit 15 zuur protease aan de hand van de onderstaande typerende experimenten worden beschreven.

Experiment 1 - Suppressieve werking op de vorming van anti-ovalbumine IgE-antilichamen.

2Q Men gebruikte een groep van tien mannelijke Wistar-ratten met een gewicht van ongeveer 180 - 200 g. Intraperitoneaal werden 0,1 mg ovalbumine en 20 mg aluminiumhydroxydegel geïnjecteerd. Vanaf de volgende dag werd zuur protease intraveneus geïnjecteerd en wel eenmaal per dag gedurende 14 dagen. De sera werden 7, 10 en 14 dagen na 25 de injectie van ovalbumine verzameld en de anti-ovalbumine IgE-anti-lichamen in het serum werden bepaald door de homologe PCA-reactie vein de rat (H. Maruyama, et al., Folia Pharmacologica Japonica, 74, 179, 1978). De resultaten worden in fig. 1 getoond.

De vorming van anti-ovalbumine IgE-antilichamen werd signifi-30 cant onderdrukt.

Experiment 2 - Suppressieve werking op bronchiale asthma.

Men gebruikte een groep van tien mannelijke Wistar-ratten met een gewicht van ongeveer 180 200 g. Intraperitoneaal werd 0,1 mg ovalbumine en 20 mg aluminiumhydroxydegel geïnjecteerd. Vanaf de vol- 8200509 - 8 - gende dag werd eenmaal per dag gedurende 14 dagen intraveneus zuur protease geïnjecteerd. Op de 14e dag werd 25 mg/kg ovalbumine intraveneus geïnjecteerd om bronchiale asthma te induceren. De aldus geïnduceerde luchtpijpcontractie werd gemeten met de methode van 5 Konzett en Roessler (Arch. Exptl. Path. Pharmacol. 195, 71, 1940).

De contractiegraad van de luchtpijp werd berekend door de contractie-waarde van.de controlegroep op 100 te stellen. De resultaten staan in tabel A.

Tabel A

10 Contractiegraad van de luchtpijp_(%)_

Controle 100

Zuur protease 0,05 mg/kg 72 0,5 mg/kg 47 15 5 24

De luchtpijpcontractie werd door toediening van het zuur protease significant onderdrukt.

Experiment 3 - Hydrolyse van immuuncomplex.

Men loste 15 mg van een oplosbaar immuuncomplex (menselijk 20 IgG-konijnen anti-menselijk IgG-antilichamen) en 3 mg van elk van het 3 zuur protease, trypsine, α-chymotrypsine of piasmine op in 1 cm fosfaatbufferoplossing (0,06 M, pH 6,0) en incubeerde gedurende 60 minuten op 37°C. De reactie werd beëindigd door de toevoeging van 3 1 cm 20%'s waterige oplossing van perchloorzuur. De bovendrijvende 25 vloeistof werd gemeten op absorbantie bij 280 nm om de hydrolysegraad . te berekenen. Dezelfde procedure werd herhaald onder toepassing van het menselijk IgG in plaats van het immuuncomplex. De verhouding van de verkregen hydrolysegraad van het immuuncomplex ten opzichte van die van menselijk IgG werd berekend. De resultaten staan in tabel B.

30 Vergeleken met andere proteasen, hydrolyseerde het zuur protease het oplosbare immuuncomplex meer selectief dan het normale menselijke IgG.

8200509 - 9 -

Tabel B

Relatieve hydrolysegraad Hydrolyseverhouding menselijk IgG immmmcom- <i-umcomplem/men- plek selljk le<3) 5 zuur protease 100 380 3,8 trypsine 130 169 1,3 «C-chymotrypsine 22 26 1,2 plas nine 26 29 1,1

Experiment k - Hydrolyse van immuuncomplex.

10 Men loste 15 mg van een oplosbaar immuuncomplex (menselijk IgG- konijnenanti-menselijk IgG antilichamen) en 0,3 mg van het zuur prote-

O

ase of trypsine op in 1 cm fosfaatbufferoplossing (0,0β M, pH 6,0) en voegde 250 ƒ11 van hetzij ratteserum hetzij dezelfde fosfaatbuf-feroplossing aan het mengsel toe. Daarna werd het mengsel gedurende 60 15 minuten op 37°C gexncubeerd. Ia voltooiing van de reactie werd het resterende menselijk IgG gemeten met behulp van de enkelvoudige radiale im-munodiffusiemethode onder toepassing van konijnen anti-menselijk IgG serum teneinde de verhouding van het gehydrolyseerde immuuncomplex tot het oorspronkelijk geïncubeerde immuuncomplex te bepalen. De resulta-20 ten staan in tabel C.

Gevonden werd, dat de hydrolytische werkzaamheid van het zuur protease op het immuuncomplex niet aangetast werd door de toevoeging van serum. Daarentegen werd de hydrolytische werkzaamheid van trypsine door de toevoeging van serum aanzienlijk verminderd.

25 Tabel C

Hydrolyseverhouding {%) serum afwezig serum aanwezig zuur protease 35 35 trypsine 19 2 30 Experiment 5 - Suppressieve werking op thyroiditis.

De suppressieve werking van het zuur protease op thyroiditis werd onderzocht volgens de methode van Kotani et al. (Clinical Immunology, _£, 635a 1977)* Een groep van 10 mannelijke BFU/HDK-ratten (6 weken oud) werd aan thymectomie onderworpen en elke 2 weken aan vier her-35 haalde röntgenbestralingen van elk 200 rad blootgesteld. 1^· weken na 82 0 0 5 0 9 - ..............— ---------------------- -10- * *- de thymectomie -werden deze ratten gedood. De thyroïdeklier van elke rat -werd verwijderd en in een paraffineblok ingebed, daarna bevlekt met hematoxyline-eosine of met azaan, en onderzocht op de mate van infiltratie van mononucleaire cellen, afbraak van het endoplasmische 5 reticulum en klierfibrose teneinde de ernst te schatten van de thyroiditis volgens de schaalverdeling van 0 - k. Het zuur protease werd intraveneus eenmaal per dag toegediend. Als controle werd het zuur protease geïnactiveerd en toegediend. De resultaten staan in tabel D.

Vergeleken met de controle, werd gevonden dat het zuur protease 10 zowel het optreden als de ernst van de thyroiditis op een dosis-afhan-kelijke wijze verminderde.

Tabel D

Ontreden (%) Ernst_ controle 90 3,^- + 0,3 15 zuur protease 1 mg/kg 80 2,8+0,^

3 mg/kg 60 2,0 + 0,1X

10 mg/kg b0x 1,3 + O,!** X p < 0,05; ** p < 0,01 20 Experiment 6 - Suppressieve werking op immuuncomplex-neftitis.

Aan een groep van 10 mannelijke C57BL muizen, werd 200 mg/kg menselijk IgG-konijnen anti-menselijk IgG-antilichameneomplex intraveneus geïnjecteerd driemaal per dag met een interval van 8 uren gedurende 3 dagen. Op de Ue dag werden de dieren gedood en werden de nie-25 ren verwijderd. Afzetting van het immuuncomplex in de glomeruli werd waargenomen met behulp van de fluorescente antilichamentechniek onder toepassing van géiten anti-konijnen IgG-antilichamen, gemerkt met fluoresceïne-isothiocyanaat. Verder werd het gehalte van het immuuncomplex in het serum gemeten met behulp van de Clq-bindingsanalyseme-30 thode. Urineproteïne werd gemeten met in de handel verkrijgbaar test-papier voor de 3^ muizen waarvan voor het doden de urine was verzameld. Het zuur protease werd intraveneus toegediend driemaal per dag waarbij .onmiddellijk na de injectie van het immuuncomplex werd begonnen. Als controle werd geïnactiveerd zuur protease toegediend. De resultaten 35 staan in tabel E.

82 0 0 5 0 9 ........- — -.......... .......-___________________-................—- ti - 11 -

Het gehalte aan immuuncomplex in serum daalde en het optreden van proteinuria en afgezet immuuncomplex in glomeruli nam af doof de toediening van het zuur protease.

Tabel E

5 Immuuncom- Proteinuria Afzetting van immuun- plexgehalte (aantal po- complex op glomerulus in serum sitieve mui- (aantal positieve mui- (ug/cm.3) zen ^/totaal zen/totaal aantal ge- / aantal getes- bruikte muizen) tesnmnizen) 10 controle 156 + 18 7/8 10 / 10 zuur protease 0,3 mg/kg 128 + 9 5 / T 8/10 1.0 mg/kg 88 + 12(x) k / 10 5 / 10(x) 3.0 mg/kg 53 + 7(xx) 3 / 9(x) 2 / 10(xx) 15 a) muizen die proteinuriagraad 3 of h vertoonden (x) p < 0,05, (xx) p < 0,01

Experiment 7 - Suppressieve werking op Masugi-nefritis.

Met de methode van Suzuki et al. (Folia Pharmacologica Japonica,. 68, 572, 1972) werd konijnen anti4rat nierenserum intraveneus toege-20' diend aan een groep van 10 mannelijke Wistar-ratten in een dosis van

O

5 cur/kg. Het zuur protease werd intraveneus eenmaal per dag toege-diend na de toediening van het anti-nierenserum. Het immuuncomplex-gehalte in het serum en het protelnegehalte in de urine werden wekelijks gemeten. Als controle werd geïnactiveerde zuur protease toege-25 diend. De resultaten worden getoond in de fig.2 en 3.

In de met het zuur protease behandelde groep werden een daling ; van het protelnegehalte in urine en een daling van het immuuncomplex- gehalte in het serum waargenomen.

Experiment 8 - Suppressieve werking op spontane lupus nefritis in mui-30 zen.

De methode van Abe et al. (The Ryumachi, ik, i+3, 197*0 werd toegepast.

Aan een groep van 16 vrouwtjesmuizen (NZB x NZW)F^ van l6 weken oud werd het zuur protease intraveneus geinjeetèerd in een dosis van 35 10 mg/kg en wel eenmaal per dag. Als controle werd geïnactiveerd 82 0 0 5 0 9 —............-................---------------------------------- - 12 - zuur protease toegediend. Met intervallen van ^ weken werd 'het prote-inegehalte in de urine getest met in de handel verkrijgbaar testpapier voor indeling op een schaal van 0 - U. De resultaten worden in fig.3 getooiid.

5 Zes muizen uit elke groep werden gedood bij het bereiken·van de leeftijd van 32 weken om de celinfiltratie in de nierglomeruli te observeren.

De toediening van het zuur protease werd voortgezet in de resterende muizen van elke groep om de overlevingsgraad op de leeftijd 10 van 50 weken vast te stellen. De resultaten staan in tabel F.

Door de toediening van het zuur protease werd de toename in het urineproteïne significant onderdrukt, werd de celinfiltratie verlaagd en werd de overlevingsgraad verhoogd. Deze resultaten laten zien dat het zuur protease de lupus nefritis in muizen onderdrukt.

15 Tabel F

Controlegroep Met het zuur protease behan delde groep cel-infiltratie hevige infiltratie . lichte infiltratie rond de van kleine lymfocy- vaatwand ' . . ten en plasmacellen ^ overlevingsgraad 20$ 80$ (x) (x) p <0,05

Experiment 9 - Suppressieve werking op chronische actieve hepatitis.

Volgens de methode van Mayer et al. (British Journal of 25 Experimental Pathology, j>5, ^98, 197*0 werd menselijke lever LSP (lever specifiek membraan lipoproteïne) repeterend geïnjecteerd tezamen met Freund’s compleet adjuvans aan een groep van 10 konijnen om chronische actieve hepatitis te induceren. Het zuur protease werd intraveneus aan de konijnen toegediend eenmaal per dag gedurende 2 weken.

30 2 weken na de inductie van de hepatitis werden de serum ‘GOT en GPT

activiteiten gemeten. Als controle werd geïnactiveerd zuur protease toegediend. De resultaten staan in tabel G.

Het zuur protease onderdrukte de toename' van de serum GOT, GPT activiteiten op een dosisafhankelijke wijze.

.......8 2 0 0 5 0Ύ.................. ..............................................................

- 13 -

Tabel G

GOT activiteit GPT activiteit (eenheid/cm^) (eenheid/cm^) controle 337,5+3^,5 395,1+^0,5 5 zuur protease 1 mg/kg 311,5 + 21,k 351,2 + 37,8 3 mg/kg 256,2 + la,l 301,5 + 29,7 10 mg/kg 193,3 + 3β,3(χχ) 2^5,7 + 31,Mxx) (xx) p < 0,01 10 Experiment 10 - Suppressieve werking op arthritis.

Met de methode van Tsukada et al. (The Ryumachi, l6, 255, 1976) werd ^ cur* van een oplosbaar runderserumalbumine (BSA)-konijnen anti-BSA antilichamencomplex, dat 2 mg antilichamen-stikstof bevatte, geïnjecteerd in bilaterale konijnen kniegewrichten (10 dieren per groep) 15 en wel eenmaal per dag gedurende 6 dagen om allergische arthritis te induceren. Het zuur protease werd intra-articulair toegediend en wel eenmaal per dag vanaf de 1e dag van de toediening van het BSA-anti-BSA-antilichamencomplex. 10 dagen na de eerste toediening van het complex werden de konijnen gedood. De kniegewrichten werden met formaline 20 gefixeerd, met hernatoxyline-eosine bevlekt en microscopisch onderzocht. Als controle werd geïnactiveerd zuur protease toegediend. De resultaten staan in tabel H.

In de controlegroep werden hyperplasie van synoviale bekledings-cellen, pannusvorming en celinfiltratie van lymfoïde follikels zonder 25 kiemcentrum waargenomen. Daarentegen werden in de behandelde groep de pannusvorming en de celinfiltratie van lymfoïde follikels significant . verminderd.

Tabel H

Pathohistologische observatie 30 Hyperplasie Pannus- Celinfiltratie van van’synoviale vorming lymfoïde follikels bekledings- c ellen_ _ _

Controle 10/10 9/10 8/10 zuur protease 35 1 mg/kg 10/10 5/10 U/10 8200509 - 14 - 3 mg/kg 10/10 VlO(x) 2/10(x) 10 mg/kg 10/10 3/lO(xx) 2/10(xx)

Uitgedrukt als aantal positieve dieren/aantal gebruikte dieren (x) p < 0,05 (acx) p < 0,01 5 Experiment 11 - Hydrolyse van menselijk immuuncomplex.

Sera werden verzameld van patiënten met rheumatoïde arthritis, systemische lupus erthematosus (SLE) en hepatitis, welke immuuncomplex 3 bevatten. 1 cm van de sera werd gemcubeerd met 10, 30 en 100 yg van het zuur protease gedurende 60 minuten bij 37°C. Daarna werd het immuun-10 complexgehalte bepaald met behulp van de hemolytische reactie van schapen rode bloedcellen onder toepassing van guinese biggetjescomplement waarbij mens.elijk geaggregeerd IgG als de standaard werd gebruikt, en wel volgens de methode van Pust et al. (Atherosclerosis, 29, l8l, 1978). Bovendien werden de sera van patiënten met rheumatoïde 15 arthritis geanalyseerd op de rheumatoïde factor (RA-factor) door de hemagglutinatiereactie (RAHA-test) volgens de methode van Azuma et al. (The Ryumachi, 12, 330, 1972). De resultaten staan in de tabellen I en J.

Het zuur protease verlaagde het immuuncomplexgehalte in het se-20 rum van deze patiënten op een dosisafhankelijke wijze. Het zuur protease verlaagde ook het RA-factorgehalte van de patiënten met rheumato-ide arthritis.

Tabel I

Hydrolyse van menselijk immuuncomplex 25 Ziekte Serum Toegevoegde hoeveel- Immuuncomplexgehalte

No; ' heid zuur protease (ug/cuP) (yg/cm3) '

Rheumatoïde 1 0 75 arthritis 10 63 30 30 ' 52 100 < 50 2 0 23k 10 180 30 151 35 100 120 ....... 8 2 0 0 5 0 9...............-......-.........—---------------------------------------------------- _ 15 _

Tabel I (vervolg) 3 0 103 10 84 30 63 5 100 < 50 Systemische lupus erythematosus 1 0 42 6 10 384 30 203 100 150 10 2 0 120 10 ?4 30· :56 100 < 50 15 3 0 153 10 108 30 63 100 , 50

Hepatitis -1 0 63 ' 20 10 ' 59 30 < 50 100 " <50 2 0 ' 72 10 68 - 25 30 59 100 52

Tabel J

Effect op de RA-factor 30 Serum Toegevoegde hoeveelheid zuur Maximum verdunning om een po-No. protease (ug/cm^) sitieve reactie met RAHA te ' tonen 1 82 0 0 5 0 9 ~.........‘............... ........ .....

0 2048 10 1024 35 30 256 100 32 - 16 - ' . Tabel J (vervólg) 2 O 512 10 128 30 6h 5 100 èk 3 O 102¼ 10 512 30 128 100 6k 10 k O 256 10 128 30 6h 100 16

Experiment 12 - Effect op de groei van gekweekte menselijke borstkan-' 15 kercellen MX-1 en muis leukemiecellen L1210

Menselijke borstkankercellen MX-1 en muis leukemiecellen L12T0 5 3 werden resp. gesuspendeerd met een celconcentratie van 10 /cm in Eagle's medium dat 10# kalfserum en teststoffen bevatte. De cellen werden bij 37°C gekweekt gedurende U8 uren onder 5# 00^. Daarna werd 20 het aantal levenskrachtige cellen geteld na bevlekking met Tripanblauw. De groei-inhibitiegraad werd berekend volgens de volgende vergelijking en de resultaten staan in tabel K.

aantal levenskrachtige cellen ........ . in de behandelde groep s

Groei-inhlbltiegraad - (1 - aantal levenalo-achtigi VeïiS) x 100 25 in de controle ...

Tabel K

Concentratie van toege- Groei-inhibitiegraad (%) voegd materiaal (yg/cm^) Μχ_1 L1210 zuur protease 30 15 6 30 100 33 21 300 55 30

Mitomycine C 100 ^7 62

Het zuur protease belemmerde zelfs bij een lage concentratie de groei van tumorcellen.

35 Experiment 13 - Effect op menselijke borstkankercellen MX-1 dragende nude muizen.

82 0 0 5 0 9 .......................- —- 2 - 17 -

Een 2 mm stukje menselijke borstkanker MX-1 werd subcutaan getransplanteerd in een groep van vijf naakte muizen (BALB/C, nu/nu). 2 weken na de transplantatie werd het zuur protease intraveneus tweemaal per dag gedurende 18 dagen geïnjecteerd. De tumor werd 32 dagen na de 5 transplantatie van de tumor gewogen. De resultaten staan in tabel L.

Tabel L

Dosis Tumorgewicht (mg/kg) (g) controle 1,32 _+ 0,09 10 zuur protease 0,3 0,79 + 0,2(x) 3,0 0,65 + 0,15(x) (x) p < 0,05.

Het zuur protease vertoonde een significante anti-tumorwerking. Experiment lU - Effect op leukemiecellen P388 dragende muizen.

15 Men transplanteerde 10^ leukemiecellen Ρ3δ8 intraperitoneaal in een groep van vijf BDF1 mannetjesmuizen.

Het zuur protease werd intraveneus in de muizen geïnjecteerd tweemaal per dag, waarbij op de volgende dag werd begonnen totdat de dieren stierven. De gemiddelde levensduur werd berekend en uitgedrukt 20 als percentage verandering van de controle. De resultaten staat in tabel M.

gemiddeld aantal overlevings- „ ., , . tet\ _ dagen van de behandelde groep ,ηΛ

Gemiddelde levensduur {%) = Μ°·ν .. . x 100 gemiddeld aantal overlevings-

dagen van de controlegroep 25 Tabel M

(mg^è|) Gemiddelde levensduur (%)

Controle 100 + 5 zuur protease 0,3 110 + 5 30 1,0 121 + 9 3,0 123 + 9(x) mitomycine C 0,5 136 + 17 (x) p < 0,05

Het zuur protease verhoogde duidelijk de gemiddelde levensduur.

8 2 0 0 5 0 9 “ r..................................................

- 18 -

Experiment 15 - Acute toxiciteit.

Het zuur protease, opgelost in fysiologische zoutoplossing, werd intraveneus of intraperitoneaal toegediend aan een groep van tien ddY mannetjesmuizen met een gewicht van 20 _+ 1 g in een dosis van 5 2 g/kg. De muizen werden onder dagelijkse observatie gehouden voor eventuele toxicologische symptomen en wel gedurende een week. Gedurende deze periode werden geen tekenen van enigerlei toxiciteit waargenomen.

10 Zoals in de bovenstaande experimenten is beschreven, onderdruk- » te het zuur protease dat de actieve ingrediënt van het geneesmiddel volgens de uitvinding vormt, de produktie van IgE-antilichamen en vertoonde het een duidelijke therapeutische werking op bronchiale asthma. Verder onderdrukte het duidelijk het ontstaan en de ontwikkeling van 15 een aantal ziekten die, naar men aanneemt, door immuuncompiexen worden geïnduceerd, b.v. thyroiditis en nefritis. Bovendien vertoonde het zuur protease een sterke anti-tumorwerking.

De hoeveelheid zuur protease die vereist is om deze werkingen te verkrijgen, ligt binnen een voldoende veilig gebied gezien het re-20 sultaat van het acute toxiciteitsonderzoek. Omdat het zuur protease een proteïne van menselijke oorsprong is, wordt aangenomen dat de kans dat dit ernstige nadelige reacties zou induceren zoals anafylactische shock, als gevolg van zijn antigene karakter, buitengewoon klein is. Daarom wordt gemeend dat dit een zeer bruikbaar geneesmiddel vormt voor 25 allergiekwalen zoals bronchiale asthma, urticaria, hooikoorts, contact-dermatitis, voedselallergie, geneesmiddel-allergie, allergische rhinitis , hypersensibiliteit pneumonitis, verschillende immuuncornplexziek-ten zoals systemische lupus erythematosus, glomerulonefritis met immuun complex, periarteritis nodosa, rheumatoïde arthritis, immuuncomplex 30 hepatitis, thyrioditis, serumziekten, myasthenia gravis, verschillende tumoren zoals.maagkanker, longkanker, leverkanker, dikke darm kanker, borstkanker, baarmoederkanker, blaaskanker, leukemie, esofagale kanker, lymphomas.

Hoewel het middel volgens de onderhavige uitvinding in het al-35 gemeen bereid wordt in de vorm van een oplossing voor intraveneuze, 52 0 0 5 0 9..................'.................. ......." ' *.....................

- 19 - subcutane, intramusculaire of intra-articulaire injectie, kan het in de vorm van een oraal middel, inhaleerpreparaat of rectaal suppositori-um worden toegepast. Hoewel de dagelijkse dosis van het zuur protease voor een volwassene in het gebied van 1 - 1000 mg ligt, bij voorkeur 5 van 50 - 500 mg, kan deze geschikt worden vergroot of verkleind afhankelijk van de symptomen en de toepassingsmethode.

Injectiepreparaten kunnen gelyofiliseerde preparaten omvatten die onmiddellijk voor de toediening worden opgelost, alsook vloeibare preparaten. Orale preparaten kunnen capsules, tabletten, granules en 10 poeders, en vloeibare orale preparaten omvatten. Inhalatiepreparaten kunnen een gelyofiliseerd preparaat omvatten. Voor rectale toediening wordt geschikt de zetpil vorm gebruikt.

Het zuur protease volgens de uitvinding kan met farmaceutisch aanvaardbare dragers of excipiëntia volgens elke bekende methode tot 15 een geneesmiddel worden verwerkt. Voorbeelden van vaste dragers en excipiëntia waarvan het gebruik hier voordelig is, omvatten gewone excipiëntia zoals lactose, mannitol, maïszetmeel en aardappelzetmeel, bindmiddelen zoals kristallijne cellulose, cellulosederivaten, arabi-sche gom, maïszetmeel en gelatine; desintegratiemiddelen zoals maiszet-20 meel, aardappelzetmeel en calciumcarbohydroxymethylcellulose;·en smeermiddelen zoals talk en magnesiumstearaat. Voorbeelden van vloeibare dragers waarvan het gebruik hier voordelig is, omvatten gedestilleerd water voor injectie, fysiologische zoutoplossing, plantaardige oliën voor injectie en glycolen zoals propyleenglycol en polyethyleenglycol. 25 Thans zullen typerende samenstellingen van de geneesmiddelen volgens de uitvinding onderstaand worden getoond..

Samenstelling 1: 3 ,

In 10 cm fysiologische zoutoplossing werd 100 mg van het zuur protease opgelost. Deze oplossing werd door filtreren door een mem-. . 3 30 braanfilter gesteriliseerd. 1 cm van het filtraat werd gebracht m een glazen houder die vooraf gesteriliseerd was, en daarna gelyofiliseerd. De houder werd daarna afgesloten waardoor gelyofiliseerde poedervormige preparaten werden verkregen.

Samenstelling 2: 35 100 g gelyofiliseerd zuur protease, 97 g lactose en 3 g magne- 82 0 0 5 0 9 -------------------------------------------------— - - — -20- siumstearaat werden afgewogen en gemengd totdat homogeniteit was bereikt . Er werd telkens 200 mg van het verkregen mengsel in een No. 2 gelatinecapsule gebracht en de capsule werd bekleed met een enterische bekleding waardoor een enterische capsule werd verkregen.

82 0 0 5 0 9.......................................-..................-------------

Claims (20)

1. Geneesmiddel voor allergiekwalen, immuuncomplex-zlekten en tumoren, met het kenmerk, dat het als actieve ingrediënt menselijke urinezuur protease bevat.

2. Geneesmiddel volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het 5 zuur protease de volgende eigenschappen heeft: a) een molgewicht in het gebied van 32.000 tot 38.000, wanneer bepaald door gel chromatografie over Sephadex G-100 (merkprodukt); b) een isoëlektrisch punt in het gebied van pH 1 tot pH 3, bepaald door isoëlektrisch focusseren op Ampholine (merkprodukt); 10 c) een maximum absorptie bij 278 nm; d) uitstekende hydrolytische werkzaamheid in een zuur gebied, pH-waarde kleiner dan 7, wanneer haemoglobine als substraat wordt gebruikt; e) positieve reactie met ninhydrine; 15 f) oplosbaarheid in water en onoplosbaarheid in ether en in chloroform; g) wordt geïnhibeerd door pepstatine; en h) stabiel in zuur gebied, pH-waarde kleiner dan 7, en instabiel in basisch gebied, pH-waarde groter dan 8.

3. Geneesmiddel volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het de actieve ingrediënt tezamen met vehicula en/of excipiëntia bevat.

4. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de indicatie van het geneesmiddel allergiekwalen is.

5. Geneesmiddel volgens .conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, 25 dat de indicatie van het geneesmiddel immuuncomplex-ziekten is.

6. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de indicatie van het geneesmiddel tumoren is.

7. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het gebruikt wordt in de vorm van een oplossing voor injectie.

8. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het gebruikt wordt in de vorm van een oraal preparaat.

9. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het gebruikt wordt in de vorm van een rectaal suppositorium.. “STtrOTUT”':-----------------------------------------------------— - 22 -

10. Geneesmiddel volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat het gebruikt wordt in de vorm van een inhaleerpreparaat.

11. Werkwijze voor het behandelen van patiënten die lijden aan allergiekwalen, immuuncomplex-ziekten en tumoren, met het kenmerk, 5 dat een zuur protease wordt toegediend dat uit menselijke urine geïsoleerd en gezuiverd is.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de dagelijkse toedieningsdosis van het zuur protease voor een volwassene in het gebied van 1 - 1000 mg ligt.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat de dage lijkse toedieningsdosis in het gebied van 50 - 500 mg ligt.

14. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat de . indicatie van het geneesmiddel allergiekwalen is.

15. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat de 15 · indicatie van het geneesmiddel immuuncomplex-ziekten is.

16. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat de indicatie van het geneesmiddel tumoren is.

17. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat het geneesmiddel wordt toegepast in de vorm van een oplossing voor injec- 20 tie.

18. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat het geneesmiddel wordt toegepast in de vorm van een oraal preparaat.

19. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat het geneesmiddel wordt toegepast in de vorm van een rectaal suppositorium.

20. Werkwijze volgens conclusies 11-13, met het kenmerk, dat het geneesmiddel wordt toegepast in de vorm van een inhaleerpreparaat. ---8 2 OU'3 0 9--------------------- " —