FI80597B - Foerfarande foer framstaellning av en plasminogenaktivator. - Google Patents

Description

1 80597

Menetelmä plasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi

Tekniikan ala: 5 Tämä keksintö koskee ihmiskudoksesta, esim. ihmisen mu nuaisista tai verisuonista saatavaa plasminogeeniaktivaat-toria, sen valmistusmenetelmää ja sitä aktiivisena aineosa- na sisältävää trombolyyttistä agenssia.

10 Tausta:

Plasminogeeniaktivaattorit voidaan luokitella niiden alkuperän mukaan kudosaktivaattoreihin, suoniaktivaattorei-hin, veriaktivaattoreihin, urokinaasiin ja sen kaltaisiin. -· Plasminogeeniaktivaattorit näyttelevät tärkeää osaa fibri-15 nolyyttisissä (fibriiniä hajottavissa) aktiivisuuksissa ja niitä löytyy imettäväisten eläinten monista elimistä. Toisaalta on tehty paljon työtä äskettäin plasminogeeniakti-vaattorien saamiseksi viljellyistä soluista. Yllä mainitussa työssä käytettiin viljeltyinä soluina, esimerkiksi 20 pahanlaatuisia tuumorisoluja, verisolujen endoteeliä, sti muloituja makrofaageja, rakeisia tärkkelyssoluja, joita oli stimuloitu folliikkelia stimuloivalla hormonilla ja sen kaltaisia. On myös tehty selkoa humoraalisista kudoshomo-genaateista, viljellyistä soluista ja viljelyväliaineesta 25 eristettyjen plasminogeeniaktivaattoreiden biokemiallisista ja immunologisista ominaisuuksista.

Kuitenkin ihmiskudoksen plasminogeeniaktivaattorin puhdistusta on suoritettu harvoin. Tämän syynä näyttää olevan vaikeus saada lähtöainetta riittävässä määrin, ja 30 lisäksi lähtöaineen sisältämien entsyymien hydrofobinen ominaisuus ja sellaisten entsyymien epästabiilisuus puskurissa ja joissain tapauksissa tuntemattoman proteaasin esiintyminen sen puhdistuksen aikana. Näissä olosuhteissa Rijken et ai. eristivät ihmisen kohdun plasminogeeniakti-35 vaattorin, jonka molekyylipaino on 69,000 ja totesivat, , että aktivaattori on sekä immunologisesti että biokemialli-sesti samanlainen ihmisen suoniplasminogeeniaktivaattorin 2 80597 kanssa. Lisäksi on eristetty ja identifioitu toinen ihmisen suoniplasminogeeniaktivaattori, jolla on erilainen mo-lekyylipaino kuin yllä mainitulla ihmisen kohdun plasmino-geeniaktivaattorilla.

5 Kwaan et ai. suorittivat ihmisen munuaiskudoksesta pe räisin olevalla plasminogeeniaktivaattorilla tutkimuksen ja totesivat, että aktivaattoria on läsnä etupäässä verisuonten endoteelillä erityisesti laskimoiden endoteelillä [Fed. Prcc. 24, 387 ( 1965)"]. Kucinski et ai [J. Clin. Invest. 4_7, 10 1238-1253 (1968)], Bernik et ai [j. Clin. Invest. 48, 1740- 1753 ( 1969)], Barlow et ai. [Thromb. Res. 1, 201-208 (1972 )], Ästed et ai. Experiment ia 3_3, 589-590 (1978)] ja Lewis [Thromb. Haemostas. _42, 895-890 (1979)] ovat ilmoittaneet, että ihmisen munuaiskudoksen viljelystä saatu plas-15 minogeeniaktivaattori on immunologisesti ja fysikokemialli-sesti identtinen urckinaasin kanssa.

Urokinaasia, joka on virtsasta tai viljellyistä munu-aisscluista eristetty plasminogeeniaktivaattori ja strepto-kinaasia, joka on streptokokeista kerätty plasminogeeniak-20 tivaattori, on heti käytetty trombolyyttisenä agenssina verisuonitukoksen hoidossa. Kuitenkin sekä urokinaasi että : streptokinaasi eroavat verestä kerätystä normaalista plas- minogeeniaktivaattorista. Näillä plasminogeeniaktivaatto-reilla ei ole spesifistä affiniteettia fibriiniin. Siten 25 tulokset, jotka saavutettiin käyttämällä urokinaasia ja streptokinaasia verisuonitukoksien hoidossa, eivät olleet täysin tyydyttäviä joka suhteessa. Toivottujen vaikutusten : saavuttamiseksi on välttämätöntä annostella niitä suhteel lisen suuria määriä. Kuitenkin raskas annostus aiheuttaa 30 sellaisia vaarallisia sivuvaikutuksia kuten fibrinogeenin hajaantumista ja sisäistä verenvuotoa. Näin ollen on olemassa huomattava tarve kehittää lääke, jota voidaan valmis-taa suhteellisen suuressa mittakaavassa, jolla on vähän sivuvaikutuksia ja jolla on korkea verisuonitukoksia hajotta-35 va aktiivisuus.

Tuloksena intensiivisestä tutkimuksesta, joka on köh ii.:·: urut ihmisen munuaisista ja ihmisen verisuonista eris- 3 80597 tettyyn ja puhdistettuun kudosplasminogeeniaktivaattoriin, tämän keksinnön keksijät ovat yllättäen löytäneet plasmino-geeniaktivaattorin, jolla on merkittävästi erilaiset ominaisuudet kuin ihmisen munuaisista tai verisuonista peräi-^ sin olevalla urokinaasilla, vaikkakin on uskottu, että uro-kinaasi on ainoa pääasiallinen ihmisen munuaisista ja verisuonista saatavissa oleva plasminogeeniaktivaattori. Suori-, tettaessa lisätutkimuksia plasminogeeniaktivaattorille eri näkökohdista, on myös ilmennyt, että plasminogeeniaktivaat-10 torilla on voimakas verisuonitukoksia hajottava vaikutus, mikä johti tämän keksinnön täydentymiseen.

Keksinnön kuvaus: Tämän keksinnön tarkoitus on tarjota uusi menetelmä ^ uuden plasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi. Keksinnön tarkoituksen saavuttamiseksi tarvittavat keinot on esitetty patenttivaatimuksessa 1.

Keksinnön mukaisesti valmistetulla plasminogeeniakti- * vaattorilla on seuraavat tunnusomaiset ominaisuudet: 20 (1) Pääproteiinijuovalla mitattuna natriumdodekyyli-sulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla on mole-kyylipaino noin 70,000 ± 5,000; (2) Pääjuovalla on isoelektrisessä piste-elektrofo- 25 reesissa pl-arvo välillä 7_9; (3) Plasminogeeniaktivaattorilla 'on immunologinen ominaisuus olla adsorboitumatta anti-urokinaasi IgG-Sepharose af f initeettikromatografiässä; j a (4) Plasminogeeniaktivaattori hydrolysoi H-D-valyyli- 3Q L-leusyyli-L-lysiini-p-nitroanilididihydrokloridia ja H-D- isoleusyyli-L-propyyli-L-arginiini-p-nitroanilididihydro-kloridia; mutta ei hydrolysoi Boc-L-valyyli-L-propyyli-L-arginiini-^-metyylikumaryyli-7-amidia, karbobentsoksi-L-fenyylialanyyli-L-arginiini-i»-metyylikumaryyli-7-amidia, 4 80597 L-propyyli-L-fenyylialanyyli-L-arginiini-M-metyylikumaryy-li-7~amidia ja glutamyyli-glysyyli-L-arginiini-4-metyyli-kumaryyli-7-amidia.

Yllä mainitulla plasminogeeniaktivaattorilla on edul-5 lisesti seuraavat eri ominaisuudet: (1) uutettavissa tai perfusoitavissa kudoksesta 1-2 moolisella NH^SCN-liuoksella (pH 7.4) ja ' puhdistettavissa 0,1 % Tween 80 tai sen kaltaisen läsnäollessa; 10 (2) adsorboituu käytännöllisesti kokonaisuudessaan fibriini-Sepharose -pylvääseen ja eluoituu 2-moolisella NH^SCN-liuoksella; ja (3) pysyvä jopa 2 viikon ajan säilytettäessä H°C:ssa pH 7 Λ puskurissa.

15 Keksinnön mukaista uutta plasminogeeniaktivaattoria voidaan valmistaa poistamalla ihmisen munuaisesta verihyytymät, sidekudos, lipidit ja sen kaltaiset alalla sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti ja saattamalla saatu munuaiskudos uuttokäsittelyyn puskurilla tai antamalla NH^SCN 20 -liuoksen perfusoitua verisuonen lävitse verisuonen uuttä-miseksi; ja johtamalla sitten näin saatu uute pylvään lävitse, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu ioninvaihto-materiaalilla pakatusta pylväästä, metallikelaattipylvääs-tä, L-arginiinilla tai kantajaan sidotulla arginiinijoh-25 dannaisella pakatusta pylväästä, kantajalle sidotulta he-; magglutiniinilla pakatusta pylväästä ja molekyyliseula- : ominaisuuksia omaavalla kantajalla pakatusta pylväästä tai sellaisten pylväiden yhdistelmästä, jotka on valittu sen puhdistukseen.

30 Esillä olevan keksinnön mukainen uusi plasminogeeniak- tivaattori kykenee täydentämään immunologiset haittapuolet, jotka on todettu urokinaasilla, jota on jo esitelty verisuonitukoksia hajottavaa aktiivisuutta omaavana lääkkeenä, ja sitä voidaan siten käyttää suuren trombolyyttisen vaiku-35 tuksen omaavan trombolyyttisen agenssin aktiivisena aineosana.

5 80597

Lyhyt selostus piirustuksista:

Piirus tuksissa: kuva 1 on esimerkin l-(3) mukaisesti saadun plasmino-geeniaktivaattorin sinkkikelaatti-Sepharose kromatogrammi; 5 kuva 2 on esimerkin l-(4) mukaisesti saadun plasmino- geeniaktivaattorin concanavalin A-Sepharose kromatogrammi; kuva 3 on esimerkin l-(5) mukaisesti saadun plasmino-geeniaktivaattorin CM-Sepharose kromatogrammi; kuva 4 osoittaa tulokset, jotka saatiin esimerkin 13 l-(6) mukaisesti saadun plasminogeeniaktivaattorin

Sephacryl 3-200 geelisuodatuksesta; kuva 3 valaisee tämän keksinnön mukaisesti saadun plasminogeeniaktivaattorin SDS-polyakryyliamidigeelielek-troforeesia, joka plasminogeeniaktivaattori en eristetty 15 munuaisista. Kirjaimet A, B, C ja D vastaavat kukin munuaisista uutettua ja sitten puhdistettua aktivaattoria, suonenseinämistä uutettua ja sitten puhdistettua aktivaattoria, viljellyistä normaaleista ihmisen diploideista, erittynyttä aktivaattoria, ja kaupallisesti saatavaa uroki-20 naasinäytettä; kuva 6 esittää identifioimistulokset, jotka saatiin keksinnön mukaisilla plasminogeeniaktivaattoreilla, joille oli etukäteen suoritettu SDS-polyakryyliamidigeelielektro-foreesi. Kirjaimet A ja B vastaavat esimerkeissä l-(6) 25 saatua puhdistettua plasminogeeniaktivaattoria, kun taas kirjaimet C ja D vastaavat esimerkeissä l-(3) saatua raaka-uutetta. Polyakryyliamidigeeliä käytettiin plasminogeeni-aktivaattoreiden A ja C saamiseksi, kun taas plasminogeeni-aktivaattoreiden B ja D saamiseksi käytettiin fibriiniagar-30 oosigeeliä; kuva 7 esittää urokinaasin ja munuaisesta peräisin olevan tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin, affiniteettikromatogrammeja, molemmat saatiin käyttämällä antiurokinaasi IgG-Sepharose pylväitä; 35 kuva S osoittaa eluutiokäyrät, jotka kukin saatiin eluoimallu plasminogeeniaktivaattori, tämän keksinnön mukaisen tr-rr.bclyyttisen agenssin aineosa, esimerkissä 5 ku- 6 80597 vatun menetelmän mukaisesti; kuva 9 on diagramma, jossa tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin trombolyyttistä aktiivisuutta on verrattu urokinaasin vastaavaan aktiivisuuteen. Käyrä (a) 5 vastaa tämän keksinnön mukaista trombolyyttistä agenssia, käyrä (b) vastaa urokinaasia ja käyrä (e) vastaa urokinaa-sia, johon tämän keksinnön mukainen trombolyyttinen agenssi lisättiin 10 tuntia myöhemmin; ja kuva 10 esittää kuvaannollisesti trombolyyttisiä vai-10 kutuksia, jotka havaittiin tämän keksinnön mukaisella trom-bolyyttisellä agenssilla ihmisen ja eri eläinten verisuoni-tukoksissa. Käyrät (a), (b), (c) ja (e) vastaavat kukin ihmistä, apinaa, kaniinia, koiraa ja rottaa.

15 Paras tapa keksinnön toteuttamiseksi: Tämän keksinnön menetelmä ja menetelmän mukaisesti saadun uuden aktivaattorin ominaisuudet tullaan kuvaamaan tämän jälkeen yksityiskohtaisesti. Ellei erityisesti toisin mainita, kaikki toimenpiteet suoritettiin 4°C:ssa.

i- 20

Esimerkki 1:

Munuaisesta saadun plasminogeeniaktivaattorin puhdistus: (1) Plasminogeeniaktivaattorin uuttaminen:

Sen jälkeen, kun verihyytymät, sidekudos ja lipidit oli 25 poistettu mekaanisesti ihmisen munuaisesta, joka oli vapaa kaikista tartunnan oireista (jota oli säilytetty -70°C:ssa), lisättiin asetonia -15°C:ssa ja hienonnettiin sitten homo-genisaattorissa. Suspensiota sekoitettiin -15°C:ssa 30 mi-: : nuuttia ja annettiin seistä -20°C:ssa. Pinnalla kelluva • -f 30 osa poistettiin dekantoimalla ja rasvanpoisto toistettiin asetonilla -15°C:ssa. Muodostunut suspensio suodatettiin sitten. Suodatuskakku pestiin asetonilla -20°C:ssa ja kui-vattiin sitten. Sen jälkeen 100 g näin rasvattomaksi tehtyä jauhetta suspendoitiin 1 l:aan 1-molaarista NH^SCN-35 liuosta, joka oli puskuroitu 0.02-molaarisella Tris-HCl -liuoksella, jonka pH oli 7.0-7.H. Saatua suspensiota se-Koitettiin. Suspensio erotettiin uutteeksi ja saostumaksi 7 80S97 sentrifugoimalla. Saostuma uutettiin uudelleen samalla 1 1:11a 1-molaarista NH^SCN-liuosta. Uutteet yhdistettiin raakauutteen saamiseksi.

5 (2) DEAE-Sepharose kromatografia:

Yllä mainitussa menettelyssä (1) saatu raakauute laimennettiin samalla määrällä 0.02-molaarista Tris-HCl-liuos-ta, jonka pH oli 7.0-7·4. Näin valmistettu näyte vietiin DEAE-Sepharose -pylvään lävitse, joka oli tasapainotettu ]_q 0.02 7:11a liuoksella ei-ionista pinta-aktiivista ainetta, esim. Tween 30 ja 0.02-molaarisella Tris-HCl -liuoksella, joka sisälsi 0.25 moolia NH^SCN. Pylväästä saadut effluen-tit yhdistettiin, johon lisättiin NaCL:a saattamaan loppu-konsentraatio arvoon 1.0 moolia. Sen pH säädettiin arvoon 15 7 Λ lN-HCl:n avulla.

(3) Sinkkikelaatti-Sepharose kromatografia:

Yllä mainitussa menetelmässä (2) saadut effluentit vietiin sinkkikelaatti-Sepharose -pylvään lävitse, joka oli 20 tasapainotettu 0.002-molaarisella Tris-HCl -liuoksella, jonka pH oli 7.0 ja sisälsi 1.0 moolia NaCl, 0.25 moolia NHjjSCN ja 0.02 moolia Tween 80. Pylvään pesemisen jälkeen yllä mainitulla tasapainottavalla liuoksella kunnes prote-iinikonsentraatio oli alentunut 0.01 mg/ml. Sen jälkeen 25 pylväs pestiin edelleen puskurilla, jonka koostumus oli identtinen yllä mainitun tasapainottavan liuoksen kanssa paitsi, että puskuri ei sisältänyt NH^SCN, mutta sisälsi 0.15 moolia NaCl. Pylväs pestiin sitten 0.05-molaarisella imidatsoliliuoksella, siten eluoimalla kudosaktivaattori 30 pesuvesiin. Saadun kromatogrämmin profiili on esitetty kuvassa 1.

(4) Concanavalin A-Sepharose kromatografia: Kudosaktivaattorin fraktiot, jotka fraktiot oli saatu 35 yllä mainitussa menetelmässä (3), vietiin concanavalin A-

Sepharose pylvään läpi. Pylväs oli etukäteen tasapainotettu ·). '2-molaarisella tris-HCl-liuoksella, jonka pH oli 7·^ 8 80597 ja sisälsi 0.15 moolia NaCl ja 0.02 % Tween 80. Sen jälkeen, kun pylvästä oli pesty yhä uudelleen tasapainottavalla liuoksella, kunnes proteiinien konsentraatio eluaatissa saavutti perustason, kudosaktivaattori eluoitiin tasapai-5 nottavalla liuoksella, joka sisälsi 0.5 moolia a-D-metyyli-mannosidia. Aktivaattoria sisältävät fraktiot yhdistettiin ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon 4.5 etikkahapolla. Saadun kromatogrammin profiili on osoitettu kuvassa 2. Rijken et ai. selostivat, että α-D-metyylimannosidin (0-0.6 10 -molaarinen) lineaarinen gradienttieluentti on vaikuttava, kun plasminogeeniaktivaattori on eristetty ihmisen kohdusta [Sicchim Siophys. Acta: 580 , 140-153 (1979)]. Käytettäessä α-D-metyylimannosidin lineaarista gradienttieluenttia akti-vaattoriaktiivisuuden eluutioprofiili on yhdenmukainen pro-15 teiinien kanssa. Melkein kaikki plasminogeeniaktivaattorin eluutiopisteet olivat lähellä 0.35-molaarisen a-D-metyyli-mannosidiliuoksen eluutiopisteitä ja siten vähän korkeampia kuin Rijken et ai. raportoimat.

20 (5) CM-Sepharose kromatografia:

Yllä mainitussa menetelmässä (4) saadut kudosaktivaat-toria sisältävät fraktiot vietiin CM-Sepharose pylvään läpi. Pylväs oli etukäteen tasapainotettu 0.02-M etikkahap-popuskurilla, jonka pH oli 4.5 ja joka sisälsi 0.15 moolia 25 NaCl ja 0.02 % Tween 80.

Sen jälkeen, kun pylväs oli kaikkein ensimmäiseksi pesty tasapainottavalla liuoksella, pylväs kehitettiin samalla tasapainottavalla liuoksella paitsi, että NaCl-konsentraa-tio kasvoi lineaarisesti 0.15 moolista 1.0 mooliin. Kudos-30 aktivaattori eluoitui lähellä NaCl-konsentraatiota 0.45 moolia. Eluutioprofiili on esitetty kuvassa 3· Kudosakti-vaattori adsorboitiin CM-Sepharose·en tasapainottavassa liuoksessa ja noin 50-60 % kuormatuista proteiineista annettiin kulkea pylvään läpi. Kudosaktivaattori eluoitiin 35 lähellä NaCl-konsentraatiota 0.45 moolia. Tämä vastaa käytettyjen proteiinien noin 40 $:sta eluoitumista. Spesifinen aktiivisuus kasvoi noin 2.4-kertaiseksi. Aktivaattoria 9 80597 sisältävät fraktiot yhdistettiin ja ultrasuodatettiin Diaflo-membraanin PM 10 (Amicon Corporationin tuote) lävitse konsentrcintia varten. Aktivaattorinäytteen vaihtaminen puskurin kanssa suoritettiin Sephadex G-25 pylväässä 5 (Pharmacia AB:n tuote). Pylväs oli tasapainotettu etukäteen 0.02-molaarisella Tris-HCl-liuoksella , jonka pH oli 7-4 ja joka sisälsi 1.0 moolia NH^SCN. Pylväs kehitettiin puskurilla, joka oli identtinen tasapainottavan liuoksen kanssa. Fraktiot, jotka sisälsivät näin eluoidut proteii-10 nit, yhdistettiin ja ultrasuodatettiin sitten Diaflo-mem-braanin PM 10 lävitse konsentroimistarkoituksessa.

(6) Sephacryl S-200 geelisuodatus:

Kudosaktivaattorin konsentroitu näyte vietiin Sephacryl 15 S-200 pylvään (Pharmacia AB:n tuote) lävitse, joka pylväs oli etukäteen tasapainotettu 0.02-molaarisella Tris-HCl-liuoksella, jonka pH oli 7*4 ja joka sisälsi 1.0 moolia NH^SCN.

Effluentit, jotka olivat kudosaktivaattorin fraktioita, 20 säilytettiin -70°C:ssa. Eluutioprofiili on esitetty kuvassa 4.

Esimerkki 2:

Verisuonesta peräisin olevan plasminogeeniaktivaattorin 25 puhdistaminen: i

Sen jälkeen, kun alaraajan verisuoni oli pesty puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (pH 7.4), plasmino-geeniaktivaattori uutettiin suonen seinämästä 1.0-molaari-sella MH^SCN-liuoksella. Sen jälkeen, kun uute oli suolat-30 tu ulos 50 % ammoniumsulfaattiliuoksella, saadulle liuok selle suoritettiin arginiini-Sepharose -kromatografia. Plasminogeeniaktivaattori osoitti voimakasta affiniteettia arginiini-Sepharoseen ja eluoitui 0.5-molaarisella arginii-niliuoksella. Sen spesifinen aktiivisuus lisääntyi noin 6- 35 kertaiseksi yllä mainitulla tavalla.

Käyttäen hyväksi plasminogeeniaktivaattorin hydrofobista ominaisuutta eluaatille suoritettiin fenyyli-Sepharose 10 80597 kromatografia. Näin adsorboitunut plasminogeeniaktivaatto-ri eluoitiin 50 % etyleeniglykoliliuoksella tai ei-ionisen pinta-aktiivisen aineen, nimittäin Triton X-100 1 % liuoksella. Plasminogeeniaktivaattorin spesifinen aktiivisuus 5 lisääntyi 3-kertaiseksi yllä mainitulla tavalla.

Useimmat proteiineista eluoituivat varhaisemmissa ef-fluenteissa Sephacryl S-200 geelikromatografiässä. Plasmi-nogeeniaktivaautori eluoitui fraktioissa, jotka vastasivat molekyylipainoa noin 70,000. Tässä vaiheessa spesifinen 10 aktiivisuus oli kasvanut 2.2-kertaiseksi.

Lopuksi plasminogeeniaktivaattorilie suoritettiin fib-riniini-Sepharose -kromatografia. Ihmisen verisuonista saadulla plasminogeeniaktivaattorilla oli voimakas affiniteetti fibriini-Sepharoseen ja sen spesifinen aktiivisuus 15 lisääntyi 1.3-kertaiseksi.

Kussakin eri vaiheessa yllä mainitulla tavalla saavutettu spesifinen aktiivisuus, puhdistuminen ja prosentuaalinen saanto on esitetty taulukossa 1.

: : Taulukko 1. Kudosplasminogeeniaktivaattorin puhdistus verisuo- nista

Kokonais- Spesifinen Puhdistus- Prosentuaali-

Puhdistusvaihe aktiivisuus aktiivisuus aste nen saanto _ (UKIU)__(UKIU/mg)___(%) 1. Perfusointi 73,900 5.4 1 100 2. Ulos-suolaus am- 75 400 400 74 102 moniumsulfaatiI La 3. Arginuni- 72,400 2,300 426 96

Sepharose * |4. Fenyyli-Sepharose 48,800 19,300 3,574 66 l j5. Sephacryl S-200 31,000 42,000 7,796 42 j 6. Fibriini-Sepharose 28,000 57,400 10,630 38 11 80597

Lopullisen plasminogeeniaktivaattorin spesifinen aktiivisuus oli noin 45,000-80,000 IU/mg proteiineja ja sen prosentuaalinen saanto vaihtelee noin 20 %:sta 40 58:iin.

Puhdistetun suoniplasminogeeniaktivaattorin todennäköi-5 nen molekyylipaino oli noin 70,000 määritettynä SDS-polyak-ryyliamidigeelielektroforeesilla. Sen proteiinijuova oli positiivinen PAS-värjäystä kohtaan ja plasminogeeniakti-vaattorin on pohjimmiltaan uskottu olevan yhdestä ketjusta koostuva glykoproteiini. Geeli pilkottiin SDS-polyakryyli-10 amidigeeiielektroforeesin jälkeen plasminogeeniaktivaatto- rin aktiivisuuden jakautumisen tutkimiseksi. Tuloksena todettiin, että plasminogeeniaktivaattorin aktiivisuus oli täysin yhdenmukainen proteiinijuovan kanssa.

Tämän keksinnön mukaisen suoniplasminogeeniaktivaatto-15 rin pääjuovan isoelektrinen piste (pl) oli 7-8.

Käyttäen anti-urokinaasi IgGrtä tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin antigeenisyyttä verrattiin urokinaasin antigeenisyyteen. Suoniplasminogeeniaktivaat-torin aktiivisuus ei inhiboitunut lainkaan anti-urokinaasi 20 IgG:n vaikutuksesta eikä osoittanut affiniteettia anti-uro kinaasi IgG-Sepharoseen.

Anti-suoniplasminogeeniaktivaattori, joka oli saatu käyttäen puhdistettua suoniplasminogeeniaktivaattoria antigeeninä, inhiboi suoniplasminogeeniaktivaattorin aktiivi-25 suutta, mutta ei inhiboinut urokinaasin aktiivisuutta.

Käyttämällä anti-suoniplasminogeeniaktivaattoria ja anti-urokinaasiseerumia tutkittiin molempien aktivaattorien antigeenisuutta kaksoisimmunodiffuusio-menetelmän mukaan. Tuloksena sekä urokinaasi- että suoniplasminogeeniaktivaatto-30 ri kehittivät yksittäin yhden saostuskaaren itsensä ja vastaavan anti-urokinaasi- ja anti-suoniplasminogeeniaktivaat-toriseerumin välille. Kuitenkaan mitään ristiliittymistä ei havaittu saostuskaarien välillä.

Yllä mainituista tuloksista on ymmärretty, että tämän 55 keksinnön mukainen suoniplasminogeeniaktivaattori eroaa immunologisesta urokinaasista.

i2 80597

Kun anti-suoniplasminogeeniaktivaattori IgG lisättiin fibriinimembraaniin Todd'in fibrinolyysiautografiassa, plasminogeeniaktivaattorin aktiivisuus, joka havaittiin laskimon sisä- ja ulkomembraanien vegetatiivisissa verisuo-5 nissa, oli alentunut. Suoniplasminogeeniaktivaattorin aktiivisuuden alentumista tutkittiin käyttäen erilaisia inhibiittoreina. Tuloksena havaittiin 98 %:n ja 20 %:n inhibi-tiot aktiivisuudessa di-isopyylifluorifosfaatilla (5 mM) ja vastaavasti L-arginiinilla (0.1 M). Mitään muutoksia ei 10 havaittu Trasylolilla (50 KIU/ml), jodiasetamidilla (10 mM) ja soijapapu-trypsiini-inhibiittorilla (50 ug/ml). Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukainen suoniplasminogeeni-aktivaattori kuuluu, samoin kuin urokinaasi, seriiniprote-aaseihin.

15

Esimerkki 3·

Kudosplasminogeeniaktivaattorin analysointi ja tulokset: (1) Ellei toisin erityisesti mainita, kukin plasminogeeni-20 aktivaattori analysoitiin fibriini-agarlevymenetelmällä, ’’ joka on esitetty julkaisussa Immunochemistry 9, 709-723 : (1972). Kudosaktivaattorin fibrinolyyttistä aktiivisuutta verrattiin urokinaasin vastaavaan aktiivisuuteen ja ilmaistiin kansainvälisenä yksikkönä (UKIU). Standardikäyrät, 25 jotka osoittavat tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin ja urokinaasin sarjalaimennoksien aktiivisuu-den, olivat suoraviivaisia 70-240 mm :n suuruisella lyytti-sellä alueella. Kuitenkin kudosaktivaattorin standardikäy-: rän gradientti ei ollut täysin yhtäpitävä urokinaasin vas- 30 taavan gradientin kanssa. Kudosaktivaattorin aktiivisuus määritettiin mittaamalla laimennettujen näytteiden lyytti- 2 set pinta-alat alueella 120-200 mm . 10 ui tai 1 IU/ml 2 j urokinaasin lyyttinen pinta-ala oli 156 mm . Fibriini- agarlevymenetelmän toistettavuus oli ±6 %. Kudosaktivaat-35 torin entsymaattinen aktiivisuus oli standardisoitu urokinaasin entsymaattisen aktiivisuuden avulla ja kudosakti-vaattorin prosentuaalinen saanto ja sen spesifinen aktiivi- i3 80597 suus UKIU/ml:n suhteen määritettiin kunkin erillisen puh-distusvaiheen jälkeen.

Ei-spesifinen fibriiniä hajottava aktiivisuus määritettiin fibriini-agarlevyllä, joka oli vapaa plasminogeenistä. 5 Joissakin tapauksissa määritys suoritettiin menetelmän mukaan, jossa käytettiin selluloosanitraattilevyyn ("Selectgun" Tyyppi-BA; huokosten halkaisija: 0,2 μπι) kiinnitettyä ibriinimonomeeriä [Progress in Chemical

Fibrinolysis and Thrombolysis, Voi. 3, 539-546 (1978) , 10 Raven Press, New York]. Fibrinogeeniä, joka ei sisältänyt ihmisen plasminogeeniä, säteilytettiin menetelmän, jonka ovat esittäneet Hawker et ai. Qj. Clin. Pathol. 2£, 495-501 (1976)], mukaisesti. Leimatun substraatin spesifinen aktiivisuus oli 0.018 mCi/mg fibrinogeeniä. Näyteseosta in- 15 kuboitiin 37°C:ssa ja 50 yl:n osa otettiin näytteeksi joka 12R ...

1. ja 7· tunti. Vapautunut J1 määritettiin automaattisella fammalaskimella. Kudosaktivaattorin ja urokinaasin kunkin laimennoksen aktiivisuus ilmaistiin prosentteina va- 125 . . ...

pautunutta I suhteessa kokonaisradioaktuvisuuteen vä- 125 20 hentämällä vapautunut I.

(2) Affiniteettikromatografia anti-urokinaasi IgG-Sepharose -pylväässä:

Urokinaasi-antiseerumi saatiin vuohesta, joka oli immu-25 nisoitu antamalla ihonalaisesti 1 mg erittäin puhdasta ihmisen urokinaasia (m.p. 33,000; spesifinen aktiivisuus: 202,400 IU/mg). Yllä mainittu käytetty urokinaasinäyte oli sama kuin edellä SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla analysoitu näyte.

30 Anti-urokinaasiseerumi osoitti ainoastaan yhden saos- tuskäyrän tutkittaessa kaksoisimmunodiffuusioanalyysin avulla. Anti-urokinaasi vuohiseerumin ja immunisoimattoman vuohiseerumin IgG-fraktiot valmistettiin saostamalla kyllästetyllä 33 % ammoniumsulfaattiliuoksella. Ne puhdistet-35 tiin edelleen DEAE-Sepharose -kromatografiän avulla.

Anti-urokinaasi IgG (50 yg/ml), joka oli lisätty fib-riiailevylie, inhiboi täydellisesti kaupallisen urokinaasi- ^ 80597 näytteen, jota käytettiin antigeeninä (5,000 IU/ml), aktiivisuuden. Nämä IgG-näytteet (20 mg/ml) kehittivät yksitellen yhden ainoan saostuskäyrän immunoelektroforeesissa käytettäessä anti-vuohiseerumia ja kaniiniseerumia.

5 50 mg anti-urokinaasia tai normaalia IgG-näytettä yh distettiin 15 ml:n kanssa syanogeenibromidi-aktivoitua Sepharose CL-4B -menetelmän mukaan, jonka on esittänyt Cuatrecasas [j. Biol. Chem. 2äjj, 3059-3065 (1970)]. Geeli pestiin 0.02-molaarisella Tris-HCl-liuoksella, jonka pH oli 10 7.4 ja joka sisälsi 1.0 moolia NaCl, tilavuusmäärällä, joka oli ainakin 20 kertaa geelin tilavuus. Kudosaktivaattorin ja urokinaasin kromatogrammit on esitetty kuvassa 7· (3) Kudosaktivaattorin ja urokinaasin adsorptio fibriini-15 Sepharoseen:

Edellä mainitun Cuatrecasas1 in menetelmän mukaisesti 200 mg fibrinogeeniä, joka oli vapaa ihmisen plasminogee-·. : nista, yhdistettiin pH-arvossa 8.3 20 g:n kanssa syanogee nibromidi-aktivoitua Sepharose CL 4B. Näin yhdistetty fib-20 rinogeeni aktivoitiin sitten lisäämällä trombiinia (1 yk-sikkö/ml) menetelmän mukaisesti, jonka esittivät Reeme et ai. [Thromb. Res. 2, 137-1^3 (1973)]. Sen jälkeen se pestiin 0.02-molaarisella Tris-HCl-liuoksella, jonka pH oli 7.H ja joka sisälsi 0.15 moolia NaCl, 0.1 % Triton X-100 ja 25 1 mikromoolia Aprotiniinia (Beyer AG:n tuote). Geeli, joka oli pakattu pylvääseen, pestiin 2 moolilla NH^SCNria, joka oli liuotettu puskuriin, mitä seurasi urokinaasi- tai ku-dosaktivaattorinäytteen (joka oli saatu esimerkin 1 vai-' : heesta (6)) lisääminen puskurissa pylvääseen. Pylvään pe- 30 semisen jälkeen pylväs eluoitiin 2-molaarisella NH^SCN- liuoksella. Plasminogeeniaktivaattorin aktiivisuus määritettiin menetelmän mukaisesti, jossa käytettiin proteiinien konsentraatiota eluaatissa ja kromogeenista substraattia S-2288.

35 i5 80597 (4) Muita menetelmiä:

Proteiinien kvantitatiiviset analyysit suoritettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat esittäneet Lowry et ai., joka menetelmä käytti härän seerumialbumiinia standardi-5 proteiinina [j. Biol. Chem. 193, 265-275 ( 1951)]. Tween 80 -liuoksessa olevat solubiliscidut proteiinit analysoitiin kvantitatiivisesti Shiu et al'n esittämällä menetelmällä [j. Biol. Chem. 249, 7902-7911 ( 1974)] sen jälkeen, kur. sedimentti oli poistettu keskipakoerotuksella. Joissakin 10 tapauksissa käytettiin vähän tarkempaa menetelmää, jossa käytettiin fiuorescamiinia [Arch. Biochem. Biophys. 155, 213-220 (1973)]. Sephacryl S-200 kromatografiän jälkeen saatuja eluaatteja tarkkailtiin käyttäen LKB Jviicord II detektoria ja piirturia, joka detektori oli varustettu 15 Hitachi Spektrofotometrillä malli 200-200.

SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin Weber et alfn [j. Biol. Chem. 244 , 4406-4412 ( 1972 )] esittämän menetelmän mukaisesti. Kutakin proteiininäytettä in-kuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan 1.0 % 20 SDS-liuoksessa ja sitten suoritettiin elektroforeesi 5 % polyakryyliamidigeelissä. Joissakin tapauksissa proteiineja vähennettiin 1 % 2-merkaptoetanoli-liuoksessa. Geelissä värjäytyi proteiini Coomassie Brilliant Blue'11a tai glyko-proteiini perjodihappo-Schiff'n reagenssilla. Plasminogee-25 niaktivaattorin aktiivisuuden määrittämiseksi SDS-polyak- ryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin 5 % polyakryyli-amidigeelissä levygeelijärjestelmän mukaisesti. Elektroforeesin suorittamisen jälkeen levygeeliä pestiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia 0.01-molaarisella fosforihappopusku-30 rilla, jonka pH oli 7-4 ja joka sisälsi 0.5 moolia NaCl ja 2 % Tween 80. Geeli yhdistettiin sitten 1 % agaroosigeelin kanssa, joka sisälsi 0.2 % ihmisen fibrinogeeniä (sisältäen joko runsaasti tai ei lainkaan plasminogeeniä) ja 0.5 yksikköä trombiinia. Sisällyksiä inkuboitiin sitten 1-7 tun- o 3c tia 37 C:ssa vakiokosteuden omaavassa kammiossa ja agaroo- si- ja polyakryyliamidigeeli värjättiin Coomassie Brilliant

Blue'l^n. proteiinin todennäköinen mclekyylipaino määri- i6 80597 tettiin vertaamalla sen liikkuvuutta standardiproteiinin liikkuvuuteen aikaisemmin mainitun menetelmän mukaisesti, jonka ovat esittäneet Weber et ai.

Näin puhdistetun kudosaktivaattorin isoelektrisen pis-5 teen määrittäminen suoritettiin 7-5 % polyakryyliamidigee-lissä, joka sisälsi 8 moolia ureaa ja 1 % amfolyyttiä menetelmän mukaan, jonka ovat esittäneet Mertz et ai. [Biochem. Biophys. Res. Commun. 49, 84-91 (1972)]]. Näyte solubili-soitiin 8-molaariseen urealiuokseen, joka sisälsi 2 mi lii -10 moolia EDTA:a ja 1 % amfolyyttiä. Sen pH määritettiin menetelmällä, jonka on esittänyt Finlayson et ai. [Anal. Biochem. 40, 292-311 (1971)].

Näin puhdistettu kudosaktivaattori testattiin erilaisilla fluoresoivilla substraateilla sen jälkeen, kun oli 15 lisätty 50 μΐ kudosaktivaattorinäytettä 0.02-molaariseen Tris-HCl-liuokseen, jonka pH oli 8.0 ja joka sisälsi 0.1 moolia NaCl ja 0.02 % Tween 80 ja 2.0 ml substraattia samassa puskurissa. Seuraavia aineita käytettiin fluoresoivina substraatteina: 20 Boc-L-Valyyli-L-prolyyli-L-arginiini-4-metyylikuma- ryy li-7-amidi ·,

Karbobentsoksi-L-fenyylialanyyli-L-arginiini-4-metyyli-kumaryyli-7-amidi; L-Prolyyli-L-fenyylialanyyli-L-arginiini-4-metyyli-25 kumaryyli-7-amidi; ja

Glutaryyli-glysyyli-L-arginiini-4-metyy likumaryyli-7- : amidi.

7-amino-4-metyylikumariinin (AMC) alkuvapautuminen määri-: tettiin fluorometrillä 37°C:ssa Shimadzu Fluorospektrofoto- 30 metrillä malli RF-520. Fluorometri oli säädetty sillä tavoin, että 380 nm valon säteilytys sallisi 460 nm:n virit-tyneen fluoresoivan valon säteilyn. Fluorometri oli sää-*: detty myös siten, että 0.2-molaarinen AMC-liuos 0.1 $ DMSO- liuoksessa antoi 1.0 suhteellista fluoresoivaa yksikköä.

35 Puhdistetun kudosaktivaattorin hydrolyyttinen aktiivisuus määritettiin kromogeenisella substraatilla sen jälkeen, kun eli lisätty 200 ui kudosaktivaattorinäytettä, 200 μΐ 0.1- 17 80S97 molaarista Tris-HCl-liuosta, jonka pH oli 3.0 ja joka sisälsi 0.1 moolia NaCl ja 0.02 % Tween 80, ja 200 ui 3-mil-limolaarista S-2251 -liuosta ja l-millimolaarista S-2288-liuosta. P-nitroaniliinin alkuvapautuminen mitattiin 5 spektrofotometrillä 405 nm:ssä ja 37°C:ssa lasikennossa.

Hydrolyytoisen aktiivisuuden alkunopeus ilmoitettiin yksiköllä AmA/min kromogeeniselle substraatille ja Δ/5/min fluoresoivalle substraatille. Kudosaktivaattorin inhibiittori-vaikutukset käsiteltäessä vastaavasti di-isopropyylifluoro-10 fosfaatilla, jodiasetamidilla, soijapaputrypsiini-inhibiit-torilla ja L-arginiiniaprotiniinilla testattiin kromogee-nisella substraatilla S-2288. Puhdistettuja kudosaktivaat-torinäytteitä inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunnin ajan inhibiittorin lisäämisen jälkeen. Otettiin 200 ui annos kustakin 15 seoksesta, mitä seurasi 200 ui puskuria ja 1 millimoolin substraattia lisääminen. Vertaamalla ΔΑ/min-arvoja toisiinsa määritettiin kunkin reagenssin inhibiittorivaikutus.

(5) Näytteet oli puhdistettu esimerkin 1 mukaisella mene-20 telmällä ja analysoitiin sitten esimerkissä 2 kuvatun analyyttisen menetelmän mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2. Munuaisista saadun kudosplasminogeeniaktivaattorin puhdistus

Kokonais- Spesifinen Puhdistus- Prosentuaali-

Puhdistusvaihe aktiivisuus aktiivisuus aste nen saanto __(UKIU)__(UKIU/mg)___(Z) 1. NH4SCN uutto 8,600 0.8 1 100 2. DEAE-Sepharose 7,800 2.0 2.4 90 3- Sepharose~ *.30° S.M° 5. CM-Sepharose 3,500 12,300 14,600 41 |6. Sephacry 1 S-200 2,700 25,700 30,600 31 ie 80597

Esimerkki '4: Tämän keksinnön mukaisen kudosplasminogeeniaktivaatto-rin ominaisuudet: 5 (1) Molekyylipaino:

Esimerkeissä l-(6) saadun puhdistetun kudosaktivaatto-rin molekyylipaino määritettiin SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesiila. Tuloksena saatiin munuaisperäisen akti-vaattorin ja suoniaktivaattorin molekyylipainoksi 72,000 ja 10 vastaavasti 70,000. Nämä kudosaktivaattorit olivat positiivisia perjodi-happo-Schiff'in reagenssin suhteen, viitaten näin sokeriketjujen läsnäoloon. Munuaisperäisen akti-vaattorin tapauksessa esimerkiksi, puhdistetun kudosakti-vaattorin pääjuovan liikkuvuus määritettynä elektroforeesin 15 avulla oli identtinen raakauutteen sisältämän hajonneen fibriinin pääjuovan liikkuvuuden kanssa, kun raakauute ja puhdistettu kudosaktivaattori oli analysoitu vastaavasti SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja saadut geelit kehitettiin vastaavasti fibriini-agar-levyillä. Tämä osoit-20 taa, että todennäköinen.molekyylipaino oli 70,000 (katso kuvaa 6). Hajonneen fibriinin juovan katsottiin aiheutuvan plasminogeenin läsnäolosta fibriini-agar-levyllä.

Yllämainitun havainnon perusteella on ymmärretty, että ihmisen munuaiskudoksesta saatu raakauute sisältää plasmi-25 nogeeniaktivaattorin ja plasminogeeniaktivaattori koostuu pääasiallisesti tästä, jonka todennäköinen molekyylipaino on noin 70,000. Samanlainen koe suoritettiin myös käyttäen ; verisuonesta saatua aktivaattoria. Sen molekyylipainon ar vioitiin olevan noin 70,000.

*: 30 (2) Isoelektriset pisteet:

Puhdistettujen aktivaattoreiden isoelektrisinä pisteinä pääpiikit esiintyivät arvossa 8.2 munuaisperäisen aktivaat-torin tapauksessa ja arvossa 7.8 verisuonesta saadun akti-35 vaattorin tapauksessa. Isoelektrisen pisteen määrittämisen jälkeen sen aktiivisuus määritettiin fibriini-agar-levyllä, joka oli chut-kalvogeelin muodossa (paksuus: 1.5 nm). Akti- 19 80597 vaattoreiien aktiivisuus havaittiin vastaavasti lähellä niiden iseelektrisiä pisteitä, s.o. pH 3.2 ja 7.8.

(3) Immunologiset eroavuudet kudosaktivaattcreiden ja uro-5 kinaasin välillä:

Tarkoituksella tutkia, omaavatko munuaiskudoksesta ja vastaavasti verisuonesta saadut aktivaattorit saman anti-geenisyyden kuin urokinaasi, verrattiin sellaisten proteiinien eluusioprofiilia, jotka oli saatu suorittamalla anti-10 urokinaasi IgG-Sepharose affiniteettikromatografia esimei'-kin 1—(6) mukaiselle puhdistetulle aktivaattorille ja esimerkin l-(3) aktivaattorille ja aktivaattorin aktiiviselle aineosalle, urokinaasin eluutioprofiiliin. Tulokset on esitetty kuvassa 7· Kuten kuvasta 7 nähdään, urokinaasi 15 adsorboitui vahvasti pylvääseen ja melkein koko kuormattu aktiivisuus eluoitui 0.1-molaarisella glysiini-HCl-liuok-sella, joka sisälsi 0.15 moolia NaCl ja 0.1 % Triton X-100. Effluenttien sisältämä proteiini oli seerumialbumiinia, joka oli sisällytetty tässä kokeessa käytettyyn kaupalliseen 20 urokinaasiin. Toisaalta, puhdistettu aktivaattori kulkeutui pylvään lävitse. Se ei kuitenkaan adsorboitunut ja mitään proteiinia eikä aktiivisuutta eluoitunut glysiiniliuok-sella, jonka pH oli 2.4. Kun esimerkissä l-(3) saatu osaksi puhdistettu näyte vietiin samaan pylvääseen noin 15 % 25 viedystä aktiivisuudesta adsorboitui pylvääseen ja eluoitui glysiiniliuoksella, jonka pH oli 2.4. Näiden havaintojen perusteella on otaksuttu, että tämän keksinnön mukainen plasminogeeniaktivaattori on kudosaktivaattori, joka on im-munologisesti erilainen kuin urokinaasi ja munuaisten si-30 säilöstä saatu raakauute, vähäisimpänä aineosana, urokinaasi tai urokinaasin kaltainen aktivaattori. Toisaalta verisuonen seinämästä saatu anti-seerumiaktivaattoria vastaan koki ristiliittymisreaktion, viitaten näin siihen, että ne ovat samanlaisia myös immunologiselta kannalta katsottuna.

35 20 8 0 5 9 7 (4) Kudosaktivaattorien affiniteetti fibriini-Sepharoseen: Urokinaasin ja kudosaktivaattorin affiniteettia liukenemattomaksi tehtyyn fibriinimoncmeeriin tutkittiin käyttäen fibriini-Sepharose -pylväitä.

5 Tämän keksinnön mukainen kudosaktivaattori [esimerkki 1- (6)3 adsorboitui kokonaisuudessaan fibriini-Sepharose -pylvääseen. Se eluoitiin sitten 2-molaarisella NH^SCN-liuokselia ja ainakin 90 % viedystä aktiivisuudesta saatiin takaisin. Toisaalta, urokinaasin melkein koko aktiivinen 10 aines oli annettu kulkea pylvään läpi. Aktivaattorin aktiivisuutta ei löydetty eluaatista, joka saatiin pylväästä 2- molaarisella NH^SCN-liuoksella. Kuten on mainittu yllä, tämän keksinnön mukaisella kudosaktivaattorilla, joka oli saatu ihmisen munuaisista, on voimakas affiniteetti fibrii- 15 ni-Sepharoseen.

(5) Synteettisten substraattien spesifisyys kudosaktivaat-toreihin:

Tutkittiin tiettyjen synteettisten substraattien spesi-20 fisyyttä esimerkissä 1—(6) saatuun aktivaattoriin. Käytettiin seuraavia substraatteja.

Plasmiinille, H-D-valyyli-L-leusyyli-L-lysiini-p-nitro-anilidi dihydrokloridi (S-2251);

Luonnon trombiinille, Boc-L-valyyli-L-propyyli-L-argi-25 niini-it-metyylikumaryyli-7-amidi (3093-V);

Plasmalle, karbobentsoksi-L-fenyylialanyyli-L-arginii-ni-^-metyylikumaryyli-7-amidi (3095-V);

Virtsan kallikreiinille, L-propyyli-L-fenyylialanyyli-L-arginiini-4-metyylikumaryyli-7-amidi (3096-V); 30 Urokinaasille, glutamyyli-glysyyli-L-arginiini-4-metyy- likumeryyli-7-amidi (3097-V);

Kudosplasminogeeniaktivaattorilie, H-D-isoleusyyli-L-\ propyyli-L-arginiini-p-nitroanilidi dihydrokloridi (S-2288).

Tämän keksinnön mukainen kudosaktivaattori ei osoitta-35 nut hydrolyytcistä aktiivisuutta mitään muita substraatteja kuin S-2251 ja 3-22:8 kohtaan. Tämän keksinnön mukaisen kudcsaktivaatt :rin aktiivisuus (100 LKIV/ml) oli 8; ArA/min 2i 80597 S-2251:ä kohtaan ja 70 AmA/min S-2288:a kohtaan.

Tämän keksinnön mukainen aktivaattc-ri osoitti joitakin tunnusomaisia ominaisuuksia käsiteltäessä tietyillä inhibiittoreilla. Tämän keksinnön mukaisen aktivaattorin ami-5 dia hajottava aktiivisuus S-2288:a kohtaan ei inhiboitunut käytettäessä inhibiittorina 50 KIU/ml Aprotiniinia, 10 mil-limoolia tai jodiasetamidia tai 50 ug/ml soijapaputrypsii-niä. Kuitenkin se inhiboitui aina 2b %:iin asti 100 milli-moolilla L-arginiinia ja 5 millimocli11a di-isopropyyli -10 fluorifosfaattia.

(6) Stabiilisuus: Tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin tapauksessa ei aktiivisuuden vähenemistä ollut havaittavissa 15 lainkaan jopa kahden viikon kuluttua säilytettäessä 4°C:ssa puskurissa, jonka pH oli 7.4. Sama tulos saatiin myös, kun 1 mooli NH^SCN, 0.02 % Tween 80 tai 0.1 moolia NaCl oli lisätty puskuriin.

Tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin 20 stabiilisuutta tutkittiin 4°C:ssa 24 tunnin ajan puskuris sa, jonka pH oli välillä 1-10 ja joka sisälsi 0.5 moolia NaCl ja 0.02 % Tween 80. Tuloksena havaittiin, että tämän keksinnön mukainen plasminogeeniaktivaattori oli pysyvä pH-alueella 2-10, mutta 70 % aktiivisuuden väheneminen tapah-25 tui pH-arvossa 1.0.

Kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti, tämän keksinnön mukainen aktivaattori on uusi plasminogeeniaktivaattori, joka on erilainen kuin urokinaasi ja näyttelee tärkeää osaa kudoksen paranemisen valvonnassa käsittäen fibriinisakkojen 50 hajottamisen suonenseinämien sisä- ja ulkopuolella vaurioi tuneessa osassa.

On tarpeetonta sanoa, että tämän keksinnön mukainen uusi plasminogeeniaktivaattori voidaan eristää imettäväisten eläinten eri elimistä. Kaikki plasminogeeniaktivaattorit 35 on luettava kuuluviksi tämän keksinnön piiriin ottamatta huomioon niiden alkuperää, niin kauan kuin niillä on tämän keksinnön mukaisen plasminogeeniaktivaattorin tunnusomaiset 22 80597 omir.aisuudet.

Yllä kuvatun aktivaattorin valmistusmenetelmän mukaisesti, johon tämä keksintö myös kohdistuu, kudosaktivaatto-ri voidaan eristää erittäin puhdistetussa muodossa. Kudos-5 akcivaattori osoittaa spesifistä aktiivisuutta, joka on niin paljon kuin 30,000 - 45,000 kertaa asetonilla kuivatun ihmisen munuaisen spesifinen aktiivisuus.

Tämän keksinnön mukainen trombolyyttinen agenssi tulee luonnollisesti ilmeiseksi seuraavista esimerkeistä. On kui-10 tenkin pidettävä mielessä, että plasmincgeeniaktivaattori, jota oli käytetty aineosana, oli saatu normaaleista soluista. Pahanlaatuisen kasvaimen soluista peräisin olevalla plasminogeeniaktivaattorilla tiedetään olevan trombolyyt-tistä aktiivisuutta. Kuitenkin, tämän keksinnön mukaisen 15 trombolyyttisen agenssin turvallisuuden uskotaan jo olevan varma johtuen sen alkuperästä, kun sen antamistapaan ihmiselle annosteltavaksi tarkoitettuna lääkkeenä nähden otetaan huomioon erilaiset mahdolliset vaarat annettaessa sitä pitkän ajanjakson ajan tai suurena annoksena.

20 Koska tämän keksinnön mukaisella plasminogeeniaktivaat torilla trombolyyttisen agenssin aineosana on spesifinen affiniteetti fibriiniin, joka on erilainen kuin urokinaa-silla, mutta samanlainen kuin verestä saadulla normaalilla plasminogeeniaktivaattorilla, trombolyyttinen agenssi voi 25 saada aikaan täysin tyydyttäviä tuloksia käytettäessä verisuonitukoksen hoitoon. Lisäksi, tämä keksinnön mukainen trombolyyttinen agenssi on vapaa sellaisista sivuvaikutuksista kuin sisäinen verenvuoto ja herkistymäjärkytys. Siten tämän keksinnön mukainen verisuonitukoksen hajottaja on ·· 30 erittäin tehokas terapeuttinen lääke.

Tämän keksinnön mukaista trombolyyttistä agenssia voidaan antaa sopivina annostasoina potilaille ja sillä on vaikutus, johon liittyy vähän tai ei lainkaan sivuvaikutuksia ja sillä on vaikuttava trombolyyttinen aktiivisuus. Tä-35 män keksinnön mukaista trombolyyttistä agenssia voidaan antaa hyvin paljon samalla tavoin kuin yleisesti käytettyjä samantyyppisiä muita lääkkeitä. Esimerkiksi plasminogeeni- -’3 80597 aktivaattori, joka on aktiivinen aineosa, voidaan liuottaa fysiologiseen suolaliuokseen, joka sisältää 5 1 ihmisen seerumialbumiinia ja voidaan sitten antaa ruiskeena. Tässä pidetään parempana rajoittaa kukin annos 10,000 IU:n (noin 5 100 yg) määritettynä urokinaasin suhteen.

Tämän keksinnön mukaista trombolyyttistä agenssia voidaan käyttää erilaisten verisuonipatjojen akuuttien ja kroonisten verisuonitukosten, joita esiintyy syvinä laskimotukoksina, keuhkoveritulppina, sydänlihaksen vaurioina, 10 valtimotukoksina, ruumiinulkopuolisessa verenkierrossa ja valtimon-laskimon välisinä tukoksina, hoitoon.

Tämän keksinnön mukaista trombolyyttistä agenssia kuvataan tämän jälkeen erityisesti seuraavissa esimerkeissä.

15 Esimerkki 5-

Plasminogeeniaktivaattorin, joka muodostaa tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin aktiivisen aineosan, eristäminen ja puhdistus: 100 g:aan rasvattomaksi tehtyä jauhetta, joka oli val-20 mistettu ihmisen munuaisista asetonilla, lisättiin 500 ml 2-molaarista ammoniumtiosyanaattiliuosta, joka liuos oli puskuroitu 0.02-molaarisella Tris-HCl:lla pHrssa 7·^· Muodostunutta liuosta sekoitettiin ä°C:ssa 10 tunnin ajan ja sitten suoritettiin keskipakoerotus (x 13,000 g; 30 minuut-25 tia) seoksen erottamiseksi uutteeksi ja sakaksi.

Uutteen pH säädettiin arvoon 3.0 lN-HCl:lla ja muodostunut saostuma otettiin talteen keskipakoerotuksella (x 13,000 g; 30 minuuttia). Saostuma liuotettiin 500 ml:aan natriumfosfaattipuskuria (puskuri A), joka sisälsi 30 1 millimoolia EDTA, 0.03 moolia NaCl, 10 KIU/ml Aprotinii- nia, 5 millimoolia ε-aminokapronihappoa ja 0.01 % Tween 80. Sen jälkeen lisättiin 100 ml fibriiniseliittiä puskuriin ja muodostunutta seosta sekoitettiin 4°C:ssa 30 minuuttia. Seokselle suoritettiin keskipakoerotus (x 3,000 g; 10 mi-35 nuuttia). Saostuma suspendoitiin taas 100 ml:aan puskuria A ja näin valmistettu liuos kaadettiin 4 x 10 cm:n pylvääseen. Pylväs pestiin 500 ml:11a puskuria A. Sen jälkeen 2" 80597 plasminogeeniaktivaattori eluoitiin puskurilla A, joka sisälsi 0.4 moolia arginiinia. Eluaatit koottiin 10 ml:n fraktioina. Tulokset on esitetty kuvassa 8 ja taulukossa 3. Yllä esitetty puhdistusmenetelmä antoi niin korkean 5 prosentuaalisen saannon kuin 30 %. Puhdistusmenetelmä käyttää hyväksi plasminogeeniaktivaattorin, joka on aine osana tämän keksinnön mukaisessa trombolyyttisessä agens-sissa, voimakasta affiniteettia fibriiniin.

10 Taulukko 3-

Proteiini- Kokonais-

Puhdistusvaihe määrä (mg) aktiivisuus __;__(%)

Uutto ammoniumtio- ^ <-qq 5 syanaattiliuoksella *

Saostus hapolla 2,800 62

Puhdistus fibriiniseliitillä 21 29 20

Esimerkki 6: Tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin trom-bolyyttisen aktiivisuuden vertaaminen urokinaasiin: 25 Plasminogeeniaktivaattorin, joka on tämän keksinnön mu kaisen trombolyyttisen agenssin aineosa, trombolyyttistä aktiivisuutta verrattiin urokinaasin vastaavaan aktiivisuuteen Chandler'in silmukkamenetelmän mukaan. Koe suoritettiin käyttäen terveestä miespuolisesta vapaaehtoisesta luo-30 vuttajasta kerättyä verta. Kerättiin täsmällisesti 5 ml:n verinäyte, johon lisättiin 0.5 ml 3.1 % natriumsitraatti-liuosta verenkoaguloitumisen estämiseksi. Sitten lisättiin :.· 50 μΐ JI-merkittyä fibrinogeemä. Sen jälkeen, kun niitä oli sekoitettu hyvin, otettiin 1.5 ml:n osia seoksesta ja 35 pantiin tygon-putkeen, jonka pituus oli 28 cm ja sisäläpi-mitti 0.36 cm, mitä seurasi 20 millimoolin kalsiumkloridin lisääminen. Sitten putken kumpikin pää yhdistettiin toi- 25 80597 siinsa renkaan muodostamiseksi. Rengasmainen kiertoputki kiinnitettiin kääntöpöydälle, joka eli Kallistettu 23° kulmaan ja pyöritettiin 17 rpm:n nopeudella. Kun veren oli annettu hyytyä huoneen lämpötilassa (24-25°C) ja 1-2¾ tun-5 nin ajan, putki avattiin ja otettiin 10-ul:n näyte. Sen radioaktiivisuus mitattiin sitten. Sen jälkeen lisättiin plasminogeeniaktivaattori putkeen ja putki yhdistettiin kummastakin päästään. Sitä pyöritettiin taas kääntöpöydäl-lä. Ennalta määrätyn ajan kuluttua otettiin 10-yl:n veri-10 näyte ja mitattiin radioaktiivisuus. Plasminogeer.iakti- vaattorin aktiivisuus ilmoitettiin verihyytymästä vapautu- 123 neena ja verinäytteessä läsnäolevana I-mäaränä.

12 R

Näin lisätty I-fibrinogeeni liittyi hyytymäpolymee-riin 95_93 %\n tehokkuudella. Ristiliittyminen oli erilai-15 nen 1 tunnin kuluttua kuin 2¾ tunnin kuluttua. Nimittäin, osaksi ristiliittynyt (PXL) hyytymä saatiin 1 tunnin kuluttua ja täydellisesti ristiliittynyt (TXL) hyytymä saatiin 2H tunnin kuluttua. Kuva 9 esittää PXL-hyytymän hajoamis-astetta plasminogeeniaktivaattorilla, joka muodostaa tämän 20 keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin aktiivisen aineosan, tai urokinaasilla. Kuvassa 9 käyrä (a) vastaa plasminogeeniaktivaattoria, kun taas käyrä (b) vastaa uro-kinaasia. Nämä käyrät osoittavat, että plasminogeeniaktivaattori, joka muodostaa tämän keksinnön mukaisen trombo-25 lyyttisen agenssin aktiivisen aineosan, aiheuttaa erittäin tehokkaan hajoamisen verrattuna urokinaasiin. Kun plasmi-nogeeniaktivaattoria, joka muodostaa tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin aktiivisen aineosan, lisättiin sama määrä kuin käytettiin käyrän (a) järjestelmässä käyrän 30 (b) järjestelmään 10 tunnissa, saavutettiin melkein täydel linen hajoaminen (katso kuva 9 (c)]. Kuvassa 9 kukin piste edustaa kolmen määrityksen keskiarvoa. Kun aktivaattorin -9 konsentraatio säädettiin 1 x 10 mooliksi, aktivaattori, joka oli tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin 35 aineosa, hajotti PXL-hyytymän melkein täydellisesti 20 tunnissa. Vastakohtana plasminogeeniaktivaattorille urokinaa-zi oluoitui vain noin 40 $:sti. Kun plasminogeeniaktiviat- 26 80597 toria, joka muodostaa tämän keksinnön mukaisen trombolyyt- tisen agenssin aktiivisen aineosan, lisättiin 10 tuntia myöhemmin yllä olevaan järjestelmään, tapahtui melkein täy-125 .

dellinen I:n vapautuminen, osoittaen täten, että akti-5 vaattorilla on voimakas trombolyyttinen aktiivisuus. Kokeessa, jossa käytettiin TXL-hyytymää, urokinaasi osoitti ainoastaan 35 i hajoamista vielä 20 tuntia myöhemmin, mutta plasminogeeniaktivaattori, joka muodostaa tämän keksinnön trombolyyttisen agenssin erään aineosan, osoitti 90 % ha- 10 joaniista. Tarkistuksen vuoksi suoritettiin lisäkoe lisää- 125 mättä lainkaan plasminogeemaktivaattoria. I:n vapautu mista ei havaittu lainkaan. Näin on osoitettu, että veri-hyytymän hajoaminen riippui aktivaattorista.

15 Esimerkki 7· Tämän keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin vaikutukset verisuonitukoksiin eri eläimillä.

Kerättiin verta eri eläimiltä samalla lailla kuin esimerkissä 6 ja annettiin sen hyytyä 1 tunnin ajan. Tämän 20 keksinnön mukaisen trombolyyttisen agenssin muodostavan plasminogeeniaktivaattorin annettiin vaikuttaa osittain ristiliitettyihin (PXL) hyytymiin kunkin eläimen plasmassa plasminogeeniaktivaattorin trombolyyttisen aktiivisuuden tutkimiseksi. Kussakin kokeessa säädettiin plasminogeeni- 25 aktivaattorin konsentraatio 20 IU/ml:ksi ja hyytymän hajoa- . . . . 125 misaste mitattiin hyytymistä vapautuneena I:na aina 10 tuntia reaktion alusta lähtien. Tässä järjestelmässä tausta oli pääasiallisesti yhdenmukainen sen kanssa, joka saa- * tiin lisäämättä plasminogeeniaktivaattoria ja vain 2-3 % * 125 30 I:sta havaittiin vielä 10 tuntia myöhemmin. Vastakohta- ·. na noin 96 % hyytymästä oli hajonnut ihmisjärjestelmässä.

Kuva 10 esittää tulokset, jotka saatiin arvioimalla hajoa-misaste käyttäen ihmisen ja eri eläinten verta. Kuvassa 10 ** käyrät (a), (b), (c), (d) ja (e) osoittavat ihmisen, api- 35 nan, kaniinin, koiran ja rotan verellä saadut tulokset. Ku ten esitettiin kuvassa 10, hajoamisaste vaihteli eläinlajien mukaan. Plasminogeeniaktivaattori toimii hyvin apinan

II

27 80597 tapauksessa samalla lailla kuin ihmisen tapauksessa. Hajottava vaikutus oli heikko rotan tapauksessa. Tämä osoittaa, että tämän keksinnön mukainen trombolyyttinen agenssi on entsyymispesifinen ihmiselle ja apinalle.

Claims (2)

28 80597

1. Menetelmä ihmisen munuaisista peräisin olevan plas-minogeeniaktivaattorin, jolla on seuraavat tunnusomaiset ominaisuudet, valmistamiseksi: 5 (1) Pääproteiinijuovalla, joka on saatu natriumdodekyy- lisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, on todennäköinen molekyylipaino noin 70,000 ± 5,000; (2) Pääjuovalla, joka on saatu isoelektrisellä piste-elektroforeesilla, on pl välillä 7-9; 10 (3) Plasminogeeniaktivaattorilla on immunologinen omi naisuus olla adsorboitumatta anti-urokinaasi IgG-Sepharose affiniteettikromatografiässä; (4) Plasminogeeniaktivaattori hydrolysoi H-D-valyyli-L-leusyyli-L-lysiini-p-nitroanilidi dihydrokloridia ja H-D-15 isoleusyyli-L-propyyli-L-arginiini-p-nitroanilidi dihydrokloridia; mutta ei hydrolysoi Boc-L-valyyli-L-propyyli-L-arginiini-4-metyylikumaryyli-7-amidia, karbobentsoksyyliin-f enyyl ia lanyy li-L-arginiini-4-metyylikumaryy li-7-amidia , L-propyyli-fenyylialanyyli-L-arginiini-4-metyylikumaryyli-7-20 amidia ja glutamyyli-glysyyli-L-arginiini-4-metyylikumaryy-li-7-amidia, joka menetelä on tunnettu siitä, että uutetaan ihmisen munuaista ammoniumtiosyanaattiliuoksel-la; ja sitten johdetaan muodostunut uute pylvään läpi, joka on valit-25 tu ryhmästä, joka koostuu ioninvaihtomateriaalilla pakatusta pylväästä, metallikelaattipylväästä, L-arginiinilla tai kantajalle sidotulla arginiinijohdannaisella pakatusta pylväästä, kantajalle sidotulla hemagglutiniinilla pakatusta pylväästä ja pylväästä, joka on pakattu molekyyliseulavai-30 kutuksen omaavalla kantajalla, tai pylväiden yhdistelmästä, joka on valittu yllä olevasta ryhmästä, sen puhdistamiseksi .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa ihmisen munuaista uutetaan ammoniumtiosyanaattiliuoksella, 35 joka on puskuroitu Tris-HCl:lla pH-arvossa välillä 7.0 - 7.4. 29 80597