DE69432592T2

DE69432592T2 - Mutanten der pro-urokinase

Info

Publication number: DE69432592T2
Application number: DE69432592T
Authority: DE
Inventors: Jian-Ning Liu; Victor Gurewich
Original assignee: Gurewich Victor Cambridge; Liu Jian-Ning Brighton
Current assignee: Gurewich Victor Cambridge; Liu Jian-Ning Brighton
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-06-28
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2014-06-29
Also published as: ES2197165T3; CN1130402A; JP2004337172A; NZ269061A; US5472692A; ATE239084T1; EP0714435A1; EP0714435A4; WO1995001427A1; EP1361276A1; PT714435E; DE69432592D1; CA2165977A1; EP0714435B1; JPH08511953A; CN1115412C

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Formen von Pro-Urokinase, die nützlich zur thrombolytischen Therapie sind.
Pro-Urokinase (Pro-UK) ist eine Einzelkettenform eines Serin-Protease-Vorläufers, der durch Plasmin aktiviert wird, um Zweiketten-Urokinasa (UK) zu bilden. Sowohl Pro-UK als auch UK aktivieren oder konvertieren das Zymogenplasminogen in das aktive Enzymplasmin, das eine Reihe von Plasmaproteinen abbaut, die in Fibringerinnseln enthalten sind. Infolgedessen wurden sowohl Pro-UK und UK in der Behandlung von Thromboembolie verwendet.
Es gibt bestimmte unerwünschte Nebenwirkungen, die durch eine solche Behandlung ausgelöst werden können. Sowohl Pro-UK als auch UK können unspezifische Plasminogenaktivierung verursachen, die zum Abbau von Fibrin, Fibrinogen (Fibrinogenolyse) und bestimmten Teilen der Plättchen und Blutgefäßwände und Hämorrhagischer Diathese führen. Pro-UK ist selektiver, d. h. spezifisch, in ihrer Plasminogenaktivierung bei geringen Dosen als UK, da sie nur Fibrin-gebundenes Plasminogen aktiviert, wohingegen UK jedes Plasminogen aktiviert. Jedoch kann die Pro-UK-Spezifität bei geringen Dosen verloren gehen, wenn sie in den hohen Dosen verabreicht wird, die für thrombolytische Wirksamkeit erforderlich sind.
Pro-UK hat bestimmte Eigenschaften, die es sowohl einem "inaktiven" Zymogen als auch einem "aktiven" Enzym ähneln lassen. Einerseits schließen die zymogenen Eigenschaften der Pro-UK ihr träges Verhalten in Plasma, ihre fehlende Fähigkeit, natriumdodecylsuifatstabile Inhibitorkomplexe zu bilden und ihre jeweilige Resistenz gegen Inhibierung durch Diisopropylfluorophosphat (DFP) oder durch Glu-Gly-Arg-Chlormethylketon, die starke chemische Inhibitoren der UK sind, ein. Pro-UK besitzt auch eine 200-fach geringere Plasminogen-aktivierende Aktivität als UK.
Andererseits schließen die enzymatischen Eigenschaften der Pro-UK ihre messbare intrinsische Aktivität gegen sowohl synthetische Substrate als auch Plasminogen ein, die 10^4,0–4,3-fach höher ist als andere Serin-Protease-Zymogene, wie Trypsinogen und Chymotrypsin.
Pro-UK hat auch eine geringere Michaelis-Konstante (K_M) als UK gegen Plasminogen und in der Anwesenheit von Fibrinfragment E₂ wurde gezeigt, dass Pro-UK vollständig aktiv gegen Plasminogen ist, ohne zur UK-Form aktiviert zu werden.
Trotz ihrer potentiellen Verwendung als ein thrombolytisches Mittel initiiert die hohe intrinsische Aktivität der Pro-UK die unerwünschte, oben erwähnte, nichtspezifische systemische Plasminogenaktivierung, wenn sie in therapeutischen Dosen gegeben wird. Als ein Ergebnis kann thrombolytische Therapie mit Pro-UK immer noch mit schädlichen Nebenwirkungen verbunden sein.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass mutierte Formen der Pro-UK konstruiert werden können, die eine Abschwächung der unerwünschten intrinsischen, unspezifischen enzymatischen Aktivität der natürlich vorkommenden, nativen Pro-UK zeigen, jedoch mindestens genauso wirksam sind wie native Pro-UK in ihrer Fähigkeit, durch Fibrin (Fragment Y oder E₂) gefördert (aktiviert) zu werden, Plasminogen in Plasmin zu konvertieren und nach Konversion in Zweiketten-UK thrombolytisch aktiv zu bleiben. Als ein Ergebnis verursachen diese Pro-UK-Mutanten geringere nichtspezifische Plasminogenaktivierung und Blutungskomplikationen als native Pro-UK, wenn sie einem Patienten verabreicht werden.
Diese Pro-UK-Mutanten sind bessere thrombolytische Mittel, im Vergleich zu nativer Pro-UK, da sie durch Fibrin in gleichem Maß gefördert werden, wie native Pro-UK und deshalb die gleiche fibrinolytische Wirksamkeit besitzen, jedoch eine weit größere Spezifität für Fibringebundenes Plasminogen haben, als native Pro-UK, da sie in der Tat im Plasma inert sind. Als Ergebnis von diesem inerten Verhalten können diese Pro-UK-Mutanten einem Patienten in höheren, wirksameren Dosierungen verabreicht werden, als native Pro-UK.
Entsprechend bietet die Erfindung eine thrombolytisch aktive Pro-UK-Mutante, die die Aminosäuresequenz von nativer Pro-UK besitzt, wobei die Sequenz eine Mutation einschließt, die die Pro-UK-Mutante veranlasst, weniger Fibrinogenolyse und nicht-spezifische Plasminogenaktivierung auszulösen als native Pro-UK, wenn sie einem Patienten verabreicht wird. Die Mutation ist vorzugsweise eine Substitution einer neuen Aminosäure für eine native Aminosäure, die normalerweise in der Aminosäuresequenz der nativen Pro-UK vorkommt, was zur Folge hat, dass die Pro-UK-Mutante wenigstens eine 10-fach geringere intrinsische Aktivität besitzt als native Pro-UK und im Wesentlichen die gleiche Fibrinförderung und throm bolytische Aktivität nach Plasmin-Aktivierung besitzt, verglichen mit nativer Pro-UK, wenn sie einem Patienten verabreicht wird.
Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "nativ" eine natürlich vorkommende oder Wild-typ-Form eines Proteins oder eine Aminosäure in einem natürlich vorkommenden Protein. Eine "neue" Aminosäure ist eine, die normalerweise nicht an einer gegebenen Position in einem nativen Protein lokalisiert ist. Wie hier verwendet, schließt der Ausdruck "Mutation" die Substitution einer einzelnen neuen Aminosäure für eine native Aminosäure oder die Substitution von zwei oder mehr neuen Aminosäuren für zwei oder mehr native Aminosäuren ein.
Insbesondere kann die Mutation eine Substitution einer neuen Aminosäure für eine native Aminosäure, die normalerweise in der flexiblen Schleife (Aminosäuren 297 bis 313) der nativen Pro-UK vorkommt, sein. Zum Beispiel kann die neue Aminosäure substituiert werden für Lys³⁰⁰ Gly²⁹⁹ und/oder Glu³⁰¹, z. B. mit Alanin oder Histidin. Zusätzlich kann die neue Aminosäure substituiert werden für Lys³¹³, z. B. mit Alanin oder Histidin oder für Tyr³⁰⁶ z. B. mit Glycin.
Zusätzlich kann die Mutation eine Substitution einer neuen Aminosäure für Ala¹⁷⁵ und eine zweite neue Aminosäure für Tyr¹⁸⁷ sein, um eine Zymogentriade in der Pro-UK-Mutante zu bilden. Zum Beispiel kann die neue Aminosäure Serin sein und die zweite neue Aminosäure kann Histidin sein. Die Erfindung bietet auch Kombinationsmutanten, wie die Einführung von zwei Mutationen, um die Zymogentriade zu bilden und schließt weiterhin die Substitution einer dritten neuen Aminosäure für Lys³⁰⁰ und eine vierte neue Aminosäure für Gly³⁰¹ ein. Solch eine Mutante würde zum Beispiel Serin als neue Aminosäure, Histidin als zweite neue Aminosäure, Alanin oder Histidin als dritte neue Aminosäure und Alanin als die vierte neue Aminosäure besitzen.
Die Erfindung bietet weiterhin ein DNA-Molekül, z. B. ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine der Pro-UK-Mutanten, die hier beschrieben sind, kodiert. Solche Mutanten können Einzel-, Doppel- oder multiple Substitutionen einschließen. Die Erfindung schließt auch eine Zelle, z. B. eine Säuger-, bakterielle oder Hefezelle, transformiert mit solch einem DNA-Molekül, ein. Die Erfindung bietet auch ein Verfahren zur Herstellung der hier beschriebenen Pro-UK-Mutanten durch Transformation einer Zelle mit einem DNA-Molekül, das eine Pro-UK-Mutante kodiert, die Kultivierung der Zelle, um die Mutante zu exprimieren und die Isolierung der Mutante.
Zusätzlich bietet die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Thromboembolie in einem Patienten, umfassend, Verabreichen einer thrombolytischen Menge einer der hier beschriebenen Pro-UK-Mutanten an den Patienten. Wie hier verwendet, ist der Ausdruck "thrombolytische Menge" die Menge einer Pro-UK-Mutante, die Fibringerinnsel in dem Patienten lysiert, ohne systemische Blutung zu induzieren.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und aus den Ansprüchen ersichtlich.
Detaillierte Beschreibung
Die Zeichnungen werden zunächst kurz beschrieben.
Zeichnungen
1 ist ein Schema der Aminosäurestruktur der Pro-UK, das die flexible Schleife und verschiedene spezifische Aminosäuren zeigt.
3 ist ein Schema, das das sog. "Charge Relay-System" (Ladungsweitergabesystem) einschließlich Ser³⁵⁸ His²⁰⁴ und Asp²⁵⁵ und eine "Salzbrücke" zwischen Asp³⁵⁵ und Ile¹⁵⁹ zeigt.
4 ist eine schematische Darstellung einer Form der Oligonukleotid-gerichteten Mutagenese, die geeignet ist, um die Pro-UK-Mutanten der Erfindung zu erzeugen.
5 ist eine schematische Karte des dicistronischen mRNA-Expressionsvektors pED, der zur Expression der Pro-UK-Mutanten in Säugerzellen geeignet ist.
Entwicklung von Pro-UK-Mutanten
Die dreidimensionalen ("3D")-Strukturen von UK und Pro-UK wurden noch nicht bestimmt. Jedoch ist bekannt, dass die B-Kette der Pro-UK/UK (die die Proteasedomäne ist) signifikant homolog mit Trypsin und Chymotrypsin und ihren jeweiligen Vorläufern Trypsinogen und Chymotrypsinogen ist, deren 3D-Strukturen durch Röntgenkristallographie gutbekannt sind. Da diese Homologien größer als 30% sind, ist der Rückrad-Abgleich von Pro-UK/UK mit diesen Molekülen in etwa 1,0 Å oder weniger für die Kernreste. Somit ist die vorhergesagte Struktur von Pro-UK/UK verlässlich.
"Homologie" für Aminosäuresequenzen bezieht sich auf die Ähnlichkeit oder Prozentidentität zwischen zwei oder mehr Aminosäuresequenzen. Die Homologie von zwei gegebenen Proteinen kann zum Beispiel durch Verwendung von Sequenzanalysesoftware (z. B. das Sequenzanalyse-Softwarepaket der Genetics Computer-Gruppe, Universität Wisconsin, Madison, WI) bestimmt werden. Homologie-Prozent-Werte sind exakten Gegenstücken zugewiesen, genauso wie Sequenzen mit konservativen Aminosäuresubstitutionen, z. B. das Austauschen von einer Aminosäure durch eine andere, ähnliche Aminosäure, was in geringer oder keiner Veränderung in den Eigenschaften und der Aktivität des resultierenden Proteins resultiert.
Pro-UK-Mutanten wurden konstruiert, basierend auf der strukturellen Homologie von Pro-UK/UK mit Trypsin(ogen) und Chymotrypsin(ogen) und der Entdeckung, dass die Fibrinspezifität der Pro-UKs durch ihre selektive Förderung durch Fibrinfragment E₂ vermittelt wird, Liu & Gurewich, Biochemistry, 31: 6311–6317 (1992), was eine besondere Konformationsänderung in Glu-Plasminogen induziert. Um Pro-UK-Mutanten zu konstruieren, entwickelten die Anmelder ein Computermodell der 3D-Struktur der Proteasedomäne (die B-Kette) von Pro-UK/UK, basierend auf den räumlichen Koordinaten für das Polypeptidrückgrat von jeweils Chymotrypsinogen und Chymotrypsin, ergänzt mit den Strukturen von Elastase und Trypsin(ogen). Die Anmelder verwendeten auch zwei molekulare Modelling-Programme, CHARMM, ein Programm für makromolekulare Energieminimierung und Dynamikberechnungen, was in dem Fachbereich Chemie der Harvard-Universität entwickelt wurde und beschrieben ist in Brooks et al., J. Comp. Chem., 4: 187–217 (1983) und QUANTA^®, was von Silicon Graphics, Inc. (San Francisco, CA, USA) entwickelt wurde.
Wie in 1, 2a und 2b gezeigt, spiegelt dieses Modell eindeutig die dreidimensionale Struktur der Pro-UK-B-Kette (Proteasedomäne) wider. Das Modell ist aufgebaut aus zwei Unterdomänen, die β-Barrel-Strukturen sind, ähnlich der Struktur von Chymotrypsin(ogen) und hat die folgenden Eigenschaften. Die räumliche Koordinate von jedem Atom in dieser B-Kette ist genau definiert. Ile¹⁵⁹, das an der Oberfläche des Moleküls ist, ist kovalent verbunden mit dem Peptid 130–158 der A-Kette. Die "Aktivierungsdomäne" der Pro-UK umfasst drei Sequenzen (Aminosäureorte 297–313, 344–353 und 376–383). Die Sequenz 297–313 bildet die
ale Position, in der das Ser³⁵⁶-Hydroxyl in der am vielversprechendsten Position für Interaktion in dem Charge Relay-System ist, was die anderen zwei hauptaktiven Seitenreste einschließt: Ein Histidin und eine Asparaginsäure (rot in 2a und 2b). Das Lys³¹³ (gelb
interagiert auch mit Asp³⁵⁵ aus einer anderen Richtung. Somit werden die aktive Stelle und Substratbindetasche von Pro-UK-Proteasedomäne für diesen Moment vornehmlich gebildet, ohne Konversion in die Zweiketten-Form. Da jedoch die Wahrscheinlichkeit dieser "aktiven Konformation" nur 0,5% ist, besitzt die ungeschnittene Einzelketten-Pro-UK nur etwa 0,5% der Aktivität der aktiven Zweiketten-Form.
Zusätzlich schließt das Pro-UK-Modell nicht die sog. "Zymogentriade" von Chymotrypsinogen (ein Wasserstoff-Bindungsnetzwerk, gebildet von Asp¹⁹⁴, His⁴⁰ und Ser³²) ein, da diese Triade nicht in der nativen Pro-UK anwesend ist. His⁴⁰ und Ser³² der Chymotrypsinogentriade sind in Pro-UK jeweils durch Tyr¹⁸⁷ und Ala¹⁷⁵ ersetzt. Die "Zymogentriade" ist wichtig für die Stabilisierung der inaktiven Konformation einer Region der aktiven Stelle (dem Oxyanionloch) des Chymotrypsinogens.
Unter Verwendung dieses Modells wählten und modellierten die Anmeldet spezifische Aminosäuresubstitutionen in der Proteasedomäne von Pro-UK und UK, um spezifische Pro-UK-Mutanten zu entwerfen und konstruierten, exprimierten und charakterisierten bestimmte dieser Mutanten dann. Vier Klassen von Mutationen, die die gewünschten Ziele der verringerten unspezifischen Plasminogenaktivierung erfüllten und vollständig thrombolytische Aktivität beibehielten, sind nachstehend beschrieben.
Ortsspezifische Mutationen von Lys³⁰⁰ der Pro-UK
Untersuchungen unter Verwendung von Röntgenkristallographie haben geholfen zu erklären, warum die Einzelkettenzymogenform der meisten Proteasen "keine" Aktivität besitzt und wie die Spaltung einer einzelnen Bindung die Bildung eines vollständig aktiven Enzyms induziert. Jedoch besitzt Pro-UK mehr intrinsische Aktivität als die meisten anderen Zymogene, jedoch weniger als Einzelketten-Gewebeplasminogenaktivator (SC-t-PA). Insbesondere Trypsinogen und Chymotrypsinogen besitzen nur etwa 10^–6 der Aktivität von ihren jeweiligen aktivierten Zweiketten-Enzymformen. Sc-t-PA besitzt etwa 10^–1,5 der Aktivität der Zweiketten-t-PA. Pro-UK besitzt etwa 10^–2,3 der Aktivität ihres Zweiketten-Derivats, UK.
Der Hauptaspekt der Aktivierung eines Serinproteasezymogens zu dem aktiven Enzym ist die Bewegung von der Neo-amino-terminalen α-Aminogruppe des Zymogens in eine Oberflächentasche des Zymogens, wo es eine sog. "Salzbrücke" mit einer Asparaginsäure bilden kann, die benachbart in der Aminosäuresequenz zu einem Serin in der aktiven Stelle des Proteins ist. Diese Abfolge der Ereignisse ist schematisch in 3 gezeigt. Die Salzbrücke ist eine Ionenbindung oder elektrostatische Interaktion, die zwischen der positiv geladenen α-Aminogruppe des Neo-aminoterminus der Zweiketten-UK (Ile¹⁵⁹) oder einem Surrogat in Pro-UK und der negativ geladenen Carboxylgruppe der Seitenkette des Asparaginsäurerestes (Asp³⁵⁵) gebildet wird.
Die Salzbrückenbildung resultiert in Torquierung der Serinhydroxyls in eine neue Position, die am vielversprechendsten für Interaktion in dem Charge Relay- oder Protonenübertragungssystem ist, was der Schlüssel der Katalyse ist und wird von drei hauptaktiven Stellen-Testen gebildet: His, Asp und Ser (2a–2c (rot
und 3). Die Salzbrückenbildung stabilisiert auch, was als "Aktivierungsdomäne der Pro-UK" bezeichnet wurde, umfassend drei Sequenzen (297–313, 344–353 und 376–383).
In dem inaktiven zymogenen Trypsinogen und Chymotrypsinogen sind diese Aktivierungsdomänen in Röntgenkristallogrammen nicht abgebildet, was dem Umstand zugeschrieben wurde, dass sie nicht im Raum fixiert sind, sondern eher wacklig sind. Diese Domänen umgeben die Substratbindetasche, was die Nichtbindung von Zymogenen an Substrate erklären kann. In den aktivierten Enzymen Trypsin und Chymotrypsin sind diese Domänen fixiert und klar in Röntgenkristallogrammen sichtbar gemacht, wie beschrieben in Huber et al., Acct. Chem. Res., 11: 114–122 (1978).
In dem SC-t-PA scheint die ε-Amino-positive Ladung von Lys⁴¹⁶ (t-PA-Nummerierung) eine Ersatzsalzbrückenwirkung zu Asp"" (t-PA-Nummerierung) zur Verfügung zu stellen, um die aktive Stelle Ser⁴⁷⁸ (t-PA-Nummerierung) fast in die ideale Position zu bringen, wie beschrieben in Heckel et al., J. Comp. Aided Mol. Des., 2: 7–14 (1988) und Peterson et al., Biochem. 29: 3451–57 (1990). In der Pro-UK ist ein Lys³⁰⁰ (Pro-UK-Nummerierung) an der gleichen Position wie das Lys⁴¹⁶ in dem SC-t-PA. Es wird postuliert, dass die ε-Amino-positiv geladene Gruppe von der Pro-UK Lys³⁰⁰ ein Ersatz der neo-terminalen α-Aminogruppe Ile¹⁵⁹ der UK ist. Es gibt jedoch ein angrenzendes Glu³⁰¹, das seinen Einfluss abzuschwächen scheint. Es gibt auch eine Glycosylierungsstelle an dem Asn³⁰²-Rest, genauso wie eine Phosphorylierungssielle, nahegelegen dem Ser³⁰³-Rest. Diese Anordnung kann die teilweise (im Verhältnis zu SC-t-PA) Zur-Verfügung-Stellung einer hohen (im Verhältnis zu Chymotrypsinogen) intrinsischen Aktivität von Pro-UK erklären.
Basierend auf diesen Überlegungen haben die Anmeldet eine Gruppe von Mutanten klassifiziert, in denen der Rest Lys³⁰⁰ und/oder seine umgebenden Reste mutiert sind, in verschiedene unterschiedliche Typen von Aminosäureresten, um die elektronische interaktion zwischen dieser Position und Asp³⁵⁵ (Pro-UK-Nummerierung) einzustellen, die die intrinsische Aktivität soweit wie möglich verringert, jedoch die Fibrin-fördernde Fähigkeit und Zweikettenform-Aktivität von nativer Pro-UK aufrecht erhält. Diese Gruppe von Mutanten wird durch die folgenden Pro-UK-Mutanten, nummeriert 1 bis 5, veranschaulicht. Diese Mutanten wurden durch die Techniken der ortsspezifischen Mutagenese und Genexpression, die nachstehend beschrieben sind, erzeugt.
Mutante 1: Lys³⁰⁰ → Ala
Die neutrale Aminosäure Alanin (Ala) wurde für Lys³⁰⁰ in Pro-UK substituiert, was nicht die Faltung des Moleküls beeinflusste, jedoch, konstruiert war, um die Salzbrücke zwischen Position 300 und Asp³⁵⁵ zu eliminieren, um die intrinsische Aktivität zu reduzieren. Erst einmal in dem Computermodell konstruiert, wurde diese Mutante erzeugt und getestet, wie nachstehend beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Mutante fast keine messbare intrinsische Aktivität hatte und konsequenterweise extrem stabil im Plasma war, sie induzierte keine Fibrinogendegradation bei einer Konzentration von mehr als 10 mg/ml, wenn sie für über 24 Stunden inkubiert wurde. Diese Stabilität ist wenigstens 10-fach größer als eine Konzentration, bei der die native Pro-UK eine 50 %-ige Degradation von Plasmafibrinogen in vitro induzierte. Diese Zweikettenform-Aktivität (nach Plasmin-Aktivierung) der Mutante wurde abgeschwächt (33% der UK), genauso wurde ihre Förderung durch Fibrinfragment E₂ (40% der von Pro-UK) abgeschwächt.
Mutante 2: Lys³⁰⁰ → His
Als eine zweite Alternative wurde Histidin für Lys³⁰⁰ in dem Pro-UK-Modell substituiert. Histidin ist in der Lage, sich ein Wasserstoffion anzueignen und bei einem pH von weniger als 6,5 positiv geladen zu sein, aber es ist nicht genauso stark wie die ε-Aminoladung in Lysin. In dem Pro-UK-Modell ist die Imidazolgruppe von His³⁰⁰ in dem Molekül bei einem geringeren Energiestatus als außerhalb gepackt, da die Imidazolgruppe eher hydrophob ist. Dies ermöglicht es der Imidazolgruppe, eine positive Ladung zu haben, da es Asp³⁵⁵ gegenüberliegt, was die lokale Umgebung sauer macht. Somit existiert eine schwache Salzbrücke zwischen Asp³⁵⁵ und His³⁰⁰, was das His³⁰⁰ sich verhalten lässt wie ein schwaches Lys³⁰⁰. Da die elektrostatische Ladung von His abhängig von der lokalen Umgebung ist und das His³⁰⁰ in der flexiblen Schleifenregion (297–313) lokalisiert ist, wie nachstehend beschrieben, reguliert der Modulator (Fragment E₂) immer noch die intrinsische Aktivität von Pro-UK. Basierend auf den Lys³⁰⁰ → Ala-Daten und den Eigenschaften von His, verglichen mit Lys, sollte die intrinsische Aktivität der Mutante 2 auch 10-fach geringer sein als die der nativen Pro-UK, jedoch mehr als die der Mutante 1. Jedoch sollte sowohl die Zweikettenform-Aktivität als auch die Fibrin-fördernde Fähigkeit beibehalten werden und sollte mehr als die der Mutante 1 sein, jedoch weniger als die der nativen Pro-UK.
Mutante 3: Gly²⁹⁹ → His/Lys³⁰⁰ → Ala
In dem Pro-UK-Modell bildet der Sauerstoff der Carbonylgruppe Gly²⁹⁹ in der Hauptkette der Pro-UK-Formen eine Wasserstoffbrücke mit Asp³⁵⁵. Eine solche Brückenbildung existiert auch in Chymotrypsinogen und Trypsinogen. Wenn Gly²⁹⁹ durch His in dem Modell ersetzt wird, bildet sich eine Salzbrücke zwischen His²⁹⁹ und Asp³⁵⁵ die stärker ist, als die Brücke, die zwischen His³⁰⁰ und Asp³⁵⁵ gebildet wird und deshalb die Bildung dieser Salzbrücke verhindert. Auch wird die lokale Umgebung von His²⁹⁹ weniger durch irgendwelche Konformationsänderungen in der flexiblen Schleife von Pro-UK beeinflusst als durch Veränderungen an der aktiven Stelle, Substratbindetasche oder anderen Innenräumen. Im Gegensatz dazu sollte die His³⁰⁰-Mutante (Mutante 2) das gegenteilige Verhalten haben, d. h. es sollte mehr durch Konformationsänderungen in dem Schleifenbereich reguliert werden. Basierend auf den Eigenschaften von His, verglichen mit Gly, sollte die intrinsische Aktivität und Zweikettenform-Aktivität der Mutante 3 2-fach größer sein als die der Mutante 2. Jedoch sollte ihre Fibrin-fördernde Fähigkeit mehr als 20-fach geringer sein, als die der Mutante 2, jedoch höher, als die der Mutante 1.
Mutante 4: Lys³⁰⁰ → Ala/Glu³⁰¹ → Ala
Wenn das positiv geladene Lys³⁰⁰ durch ein neutrales Alanin ersetzt wird, wird die negative Ladung von Glu³⁰¹ zu stark, um die α-Aminogruppe von Ile¹⁵⁹ von ihrer Interaktion mit Asp³⁵⁵ anzuziehen. Dies resultiert in einer Reduktion der thrombolytischen Aktivität in der aktivierten Zweikettenform (UK) der Mutante 1. Deshalb wurde eine Doppelmutante konstruiert, um dieses Problem zu lösen, durch Ersetzen sowohl des Lys³⁰⁰ als auch des Glu³⁰¹ mit neutralem Alanin. Basierend auf dem Modell und den Eigenschaften von neutralem Ala, verglichen mit Lys und Glu, sollte die Mutante 4 Eigenschaften besitzen, die fast identisch zu denen der Mutante 1 sind, jedoch sollte sie eine 2-fach höhere Zweikettenform-Aktivität als Mutante 1 haben.
Mutante 5: Lys³⁰⁰ → His/Glu³⁰¹ → Ala
Diese Mutante ist eine Kombination aus Mutanten 2 und 4. Basierend auf den Eigenschaften von Ala³⁰⁰ Pro-UK-Mutante 1 ist der positiv geladene Rest (300) wichtig, um sowohl die Einzelketten-intrinsische Aktivität als auch die Zweikettenform-Aktivität zu fördern. Deshalb sollte diese Doppelmutante, Mutante 5, Mutante 2 in der intrinsischen Aktivität und der Fibrinfördernden Fähigkeit ähnlich sein, jedoch sollte sie eine höhere Zweikettenform-Aktivität haben.
Die Mutanten 1 bis 5 zeigen, wie die intrinsische Aktivität, Zweikettenform-Aktivität und Fibrin-fördernde Aktivität, verglichen zur nativen Pro-UK, eingestellt werden können. Diese Einstellungen werden in aktuellen Pro-UK-Mutanten durch die kombinierten Techniken der ortsspezifischen Mutagenese und Strukturmodelling erreicht. Diese Mutanten erreichen im Wesentlichen die drei Ziele von (1) reduzierter Fibrinogen-Degradation (geringe intrinsische Aktivität), (2) unveränderte Fibrinförderung (beibehaltene Fibrin-fördernde Fähigkeit) und (3) gleiche Aktivität nach Plasminaktivierung, verglichen mit nativer Pro-UK (Zweikettenform-Aktivität). Deshalb werden diese Mutanten hohen therapeutischen Nutzen haben.
Ortsspezifische Mutationen der flexiblen Schleife der Pro-UK Eine weitere Struktur der Pro-UK, die kritisch für die intrinsische Aktivität ist, ist die sog. "flexible Schleife", gebildet durch Aminosäuren 297–313 (1, 2a und 2b (blau
)), was der am meisten gestörte oder wacklige Bereich in allen Serinproteasen und ihrer Zymogene ist. Diese Region kann einen Mechanismus für bestimmte Modulationen der Enzym/Zymogenfunktion zur Verfügung stellen.
Diese Schleife ist in Chymotrypsin geschnitten, jedoch in t-PA und Pro-UK ist eine Lysa^416/300-Mutante in die intrinsischen Aktivitäten involviert. Basierend auf dem Pro-UK/UK-Modell wurde eine bestimmte "aktive" Konformation von dieser Schleife identifiziert (blau
in 2b), die in nativer Pro-UK in einem dynamischen Gleichgewicht mit anderen verschiedenen "inaktiven" Konformationen ist. In der "aktiven" Konformation ist der einzige positiv geladene Rest der Schleife, Lys³⁰⁰ positioniert, um der Innenseite des Moleküls gegenüber zu
Die beobachtete Aktivität der Pro-UK zeigt an, dass das Gleichgewicht die inaktiven Konformationen bevorzugt, mit nur 0,5% in der aktiven Konformation, was mit den Prozenten der intrinsischen Aktivität von Pro-UK im Verhältnis zu ihrer aktiven, Zweikettenform (UK) übereinstimmt.
Anfängliche Studien zeigten, dass in der flexiblen Schleife die Seitenketten von drei negativ geladenen Resten (Glu³⁰¹, Asp³⁰⁵ und Glu³¹⁰) immer auf der Seite der Schleife gegenüber von Lys³⁰⁰ lokalisiert sind. Wenn die Seitenketten der negativ geladenen Reste außerhalb des Moleküls gehalten werden, wird die ε-Aminogruppe von Lys³⁰⁰ eine hohe Wahrscheinlichkeit haben, eine Salzbrücke mit Asp³⁵⁵ zu bilden. In anderen Worten, die aktive Konformation ist bevorzugt, wenn drei negativ geladene Reste außerhalb des Moleküls gehalten werden.
Wenn Pro-UK mit Fragment E₂-gebundenem Glu-Plasminogen interagiert, stabilisieren externe elektrostatische Kräfte von dem Fragment E₂-Glu-Plasminogenkomplex die aktive Konformation um durch Ziehen dieser drei negativ geladenen Seitenketten (Glu³⁰¹, Asp³⁰⁵ und Glu³¹⁰) aus dem Molekül. Deshalb ist Lys³⁰⁰ gegenüber der Innenseite des Moleküls positioniert und bildet eine Salzbrücke mit Asp³⁵⁵. Als ein Ergebnis wird Pro-UK vollständig aktiv, ohne in die Zweikettenform zu konvertieren.
Eine ortsspezifische Mutation der flexiblen Schleife, die die Flexibilität der Schleife weiterhin verstärken kann, wird die Wahrscheinlichkeit der "aktiven" Konformation auf weniger als 0,5% verringern. Wenn diese Mutante eine ähnliche Zweikettenform-Aktivität nach Konversion in die Zweikettenform beibehält und eine ähnliche Fibrin-fördernde Fähigkeit, verglichen mit nativer Pro-UK, beibehält, wird sie ein überlegener Aktivator sein, der die drei gesetzten Ziele erreicht. Solch eine Mutante würde eine geringere intrinsische Aktivität im Plasma besitzen, jedoch würde sie vollaktiv in der Anwesenheit von Fibrin (Fragment E₂) und in der Zweikettenform sein.
Basierend auf diesen Überlegungen haben die Anmelden eine zweite Gruppe von Mutanten klassifiziert, die die Wahrscheinlichkeit der "aktiven" Konformation reduzieren, jedoch die Induzierbarkeit der "aktiven" Konformation durch den Fragment E₂-Glu-Plasminogenkomplex beibehalten, genauso wie die Zweikettenform-Aktivität. Diese Gruppe von Mutanten wird durch die folgende Pro-UK-Mutante, nummeriert mit 6, erläutert.
Mutante 6: Tyr³⁰⁶ → GlY
Basierend auf dem Konzept, dass die intrinsische Aktivität der Pro-UK eine Funktion des Gleichgewichts zwischen den "aktiven" und "inaktiven" Konformationen ist, sollte ein Anstieg in der Schleifenflexibilität die intrinsische Aktivität verringern. Deshalb wurde eine Tyr³⁰⁶ → Gly-Mutante konstruiert, in der die β-Kurvenstruktur der Schleife gebrochen ist, um ihre Flexibilität zu steigern. Als ein Ergebnis sollte diese Mutante eine reduzierte intrinsische Aktivität haben, jedoch die Fragment E₂-Förderung, die Zweikettenaktivität und Plasmin-Aktivierung sollte bewahrt bleiben. Deshalb würde Mutante 6 einen guten therapeutischen Nutzen haben.
Ortsgerichtete Mutation von Lys³¹³ aus Pro-UK
Lys³¹³ der Pro-UK ist ein weiterer Ersatz für die neo-terminate α-Aminogruppe von UK. Wie
Pro-UK resultieren sollte. Die Interaktion von Lys³¹³ mit Asp³⁵⁵ wird durch die Bewegung der flexiblen Schleife reguliert. Deshalb wird die Eliminierung dieser Interaktion weiterhin die intrinsische Aktivität der Pro-UK reduzieren. Basierend auf diesen Überlegungen haben die Anmelder die folgenden Mutanten 7 und 8 konstruiert.
Mutante 7: Lys³¹³ → Ala
Ähnlich wie bei Lys³⁰⁰ wirkt ihre positive ε-Amino Ladung als ein Ersatz der neo-terminalen α-Aminogruppe in UK, um eine Salzbrücke mit Asp³⁵⁵ aus einer Richtung gegenüber der von Lys³⁰⁰ zu bilden. Vorteilhafterweise beeinflusst diese Mutante nicht die Aktivität der Zweiketten-UK, da die Salzbrücke aufgebrochen wird, wenn die neo-terminale Aminogruppe (Ile¹⁵⁹) erzeugt wurde, um kompetitiv eine andere Salzbrücke mit Asp³⁵⁵ in der Zweiketten-UK zu bilden.
Im Gegensatz dazu beeinflusst Lys³⁰⁰ die Zweikettenform-Aktivität, da die Ladungsinteraktion zwischen Lys³⁰⁰ und Asp³⁵⁵ in der Zweikettenform existiert und zu der Zweikettenform-Aktivität beiträgt. Ebenso gibt es auch einen Lys-Rest in der vergleichbaren Aminosäureposition der SC-t-PA, von dem gezeigt wurde, dass er in ihre hohe intrinsische Aktivität involviert ist.
Mutante 8: Lys³¹³ → His
In dieser Mutante wird His, das eine geringere positive Ladung besitzt als Lys, verwendet, um Lys³¹³ zu ersetzen. Diese Mutante ist als eine Anpassung von Mutante 7 konstruiert, basierend auf einem Grundprinzip, ähnlich dem, in Hinblick auf Mutante 2 vorstehend beschriebenen.
Beide Mutanten 7 und 8 sollten eine geringere intrinsische Aktivität besitzen als die der nativen Pro-UK, da sie die Bildung der Salzbrücke mit Lys³¹³ verhindern, jedoch eine höhere als die der Mutanten 1 oder 2. Die Zweikettenform-Aktivitäten sollten im Wesentlichen die gleichen sein, wie die der nativen UK (Zweikettenform). Ihre Fibrin-fördernde Fähigkeit sollte auch beibehalten werden und nahe der der nativen Pro-UK sein. Deshalb würden auch diese Mutanten klinisch von Nutzen sein.
Ortsgerichtete Mutation um eine "Zymogentriade" in Pro-UK zu bilden Röntgenstrukturen von Chymotrypsin und Chymotrypsinogen zeigen, dass die Bildung eines Wasserstoffbindungsnetzwerks durch eine "Zymogentriade" (bestehend aus Asp¹⁹⁴, His⁴⁰ und Ser³², Chymotrypsin-Nummerierung) wichtig ist, um eine inaktive Konformation eines Bereichs der aktiven Stelle (das Oxyanionenloch im Boom IX. um) von Chymotrypsinogen zu stabilisieren. Die Anmelden fanden jedoch, dass diese Zymogentriade nicht in Pro-UK oder t-PA auftritt. His⁴⁰ und Ser³² der Chymotrypsinogentriade sind durch jeweils Tyr¹⁸⁷ und Ala¹⁷⁵ in Pro-UK repräsentiert. Diese fehlende Triade kann auch zu höherer intrinsischer Aktivität der Pro-UK oder t-PA beitragen.
Als ein alternativer Ansatz, um eine Pro-UK-Mutante mit den gewünschten Eigenschaften zu konstruieren, kann eine "Zymogentriade" in nativer Pro-UK erzeugt werden, um ihre intrinsische Aktivität zu reduzieren, ohne die anderen Funktionen, die notwendig für die fibrinolytische Aktivität sind, zu beeinflussen.
Mutante 9: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His
Diese Doppelmutante wurde konstruiert, um eine "Zymogentriade", ähnlich der, die in Chymotrypsinogen gefunden wird, in Pro-UK einzuführen. Diese Mutation sollte die intrinsische Aktivität der Pro-UK reduzieren, jedoch nicht die Förderung durch Fragment E₂ und die Aktivität der Zweikettenform beeinflussen. Deshalb sollte diese Mutante auch die oben genannten drei Ziele erreichen und als ein thrombolytisches Mittel nützlich sein.
Kombinationsmutationen
Die Anmelder haben erkannt, dass die intrinsische Aktivität der Pro-UK von verschiedenen intramolekularen Interaktionen abhängt, die einschließen 1) Lys³⁰⁰ oder Lys³¹³ als ein Ersatz der neoterminalen α-Aminogruppe der UK in der Einzelkettenform; 2) das Fehlen einer "Zymogentriade"; und 3) die geringere Flexibilität und höhere Wahrscheinlichkeit der aktiven Konformation der flexiblen Schleife (297–313). Konsequenterweise wird eine Mutation, die nur auf einem Aspekt basiert, nicht maximal die intrinsische Aktivität eliminieren, die schädlich ist, ohne die Zweikettenform-Aktivität und Fibrin in-fördernde Aktivität zu vermindern, die für thrombolytische Aktivität erforderlich sind. Jedoch kann eine Multimutation, die zwei oder mehr dieser molekularen Interaktionen beeinflusst, eine optimale Pro-UK-Mutante erreichen. Basierend auf diesen Überlegungen haben die Anmelder eine Gruppe von Kombinationsmutanten konstruiert, was durch die folgenden Mutanten 10 bis 17 erläutert wird.
Alle Mutanten 10 bis 17 haben eine künstliche Zymogentriade, die intrinsische Aktivität verringert und die meisten haben das Lys³¹³ neutralisiert oder weniger positiv gemacht, um die Bildung Salzbrückenbildung zu verhindern oder zu schwächen, was auch die intrinsische Aktivität verringert. In ähnlicher Weise wurde das Lys³⁰⁰ in einigen dieser Kombinationsmutanten neutralisiert oder weniger positiv gemacht. Tyr³⁰⁶ → Gly-Mutationen reduzieren die Wahrscheinlichkeit der aktiven Konformation der flexiblen Schleife durch Zur-Verfügung-Stellen von mehr Flexibilität und Glu³⁰¹ → Ala-Mutationen unterbrechen die Interaktion zwischen Ile¹⁵⁹ und Asp³⁵⁵ und halten somit die Zweikettenformaktivität aufrecht.
Mutante 10: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³¹³ → Ala
Mutante 11: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Tyr³⁰⁶ → Gly
Mutante 12: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³¹³ → Gly
Mutante 13: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Tyr³⁰⁶ → Gly/Lys³¹³ → Ala
Mutante 14: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³⁰⁰ → Ala/Glu³⁰¹ → Ala/Lys³¹³ → Ala
Mutante 15: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³⁰⁰ → His/Glu³⁰¹ → Ala/Lys³¹³ → Ala
Mutante 16: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³⁰⁰ → Ala/Glu³⁰¹ → Ala/Lys³¹³ → His
Mutante 17: Ala¹⁷⁵ → Ser/Tyr¹⁸⁷ → His/Lys³⁰⁰ → His/Glu³⁰¹ → Ala/Lys³¹³ → His
All diese Mutanten sollten optimal die drei gesetzten im Ziele der (1) geringen intrinsischen Aktivität und hohen Stabilität im Plasma, (2) unveränderten Fibrinförderungsfähigkeit und bemerkenswert hohen Fibrinspezifität und (3) gleichen Zweikettenform-Aktivität nach Plasminaktivierung, verglichen mit nativer Pro-UK erreichen. Deshalb sollten diese Mutanten effizient thrombotische Blutgerinnsel bei einer höheren Dosis als native Pro-UK lösen, ohne Blutungskomplikationen zu induzieren. Vielmehr sollten sie nützlich als Medikamente sein, um die Bildung von okklusiven Fibrinthromben zu verhindern, da sie sehr inert im Plasma ohne Fibrin sind und deshalb extrem sicher. Konsequenterweise haben diese Mutanten einen hohen therapeutischen Nutzen.
Herstellung von Pro-UK-Mutanten
Oligonukieotid-gerichtete Mutagenese
Ein Typ von ortsspezifischer Mutagenese, die geeignet ist, die hier beschriebenen Pro-UK-Mutanten herzustellen, ist Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese, die die spezifische Veränderung einer existierenden DNA-Sequenz erlaubt, z. B. von nativer Pro-UK. Das Gen, das native Pro-UK kodiert, ist gut charakterisiert und ist erhältlich, z. B. von Dr. David Dichek (NIH) und Dr. Paolo Sarmientos (Primm, Mailand, Italien). Die ATCC-Nr. ist DNA 57329 oder Bact/Phage 57328. Die Sequenz ist auch erhältlich von der NIH-Computerdatenbank Protein Identitätsquelle unter dem Namen UKHU. Die Aminosäuresequenz der Pro-UK ist in 1 gezeigt.
Oligonukleotid-gerichtete Mutagenese wird erreicht durch Synthetisieren eines Oligonukleotidprimers, dessen Sequenz die Mutation von Interesse enthält, Hybridisieren des Primers an ein Template, enthaltend die native Sequenz, und Verlängern der Sequenz mit T4 DNA-Polymerase. Das resultierende Produkt ist ein Heteroduplexmolekül, das eine Fehlpaarung aufgrund der Mutation in dem Oligonukleotid enthält. Die Mutation ist "fixiert" aufgrund der Reparatur der Fehlpaarung in z. B. E. coli-Zellen. Die Details dieses Verfahrens sind beschrieben in z. B. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 8.1 (Greene Publishing Associates 1989, Anhang 13), was hier durch Referenz eingeschlossen ist.
Die Grundlage dieses ortsspezifischen Mutageneseverfahrens ist die Verwendung eines DNA-Templates, das eine geringe Anzahl von Uracilresten anstelle von Thymin enthält (4). Diese Uracil-enthaltende DNA wird in einem E. coli dut ung Stamm hergestellt. In dieser kombinierten dut^– ung -Mutante ist Desoxyuridin in die DNA anstelle von Thymidin eingebaut und wird nicht entfernt. Somit können Vektoren, die die Sequenz, die geändert werden soll, enthalten, in einem dut ung^– -Wirt gezüchtet werden, um Uracil-enthaltende DNA-Templates für die ortsspezifische Mutageneve herzustellen. Wie in 4 gezeigt, wird der mutierte Oligonukleotidprimer an das DNA-Template angelagert und mit T4 DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase behandelt, um ein doppelsträngiges zirkuläres Molekül herzustellen.
Der Oligonukleotidprimer sollte von hoher Qualität sein; d. h. gereinigt von Niedermolekulargewichts-Kontaminanten, die von unvollständiger DNA-Synthese herrühren. In einigen Fällen, besonders für Oligonukleotide, die größer als 40 Nucleotide sind, kann Reinigung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese notwendig sein.
Für die typischen in vitro Reaktionen der ortsspezifischen Mutagenesevorschriften sind Uracil enthaltende DNA-Templates nicht von normalen Templates zu unterscheiden. Da dUMP in dem Template das gleiche Kodierungspotential wie TMP hat, ist das Uracil nicht mutagen. Weiterhin ist die Anwesenheit von Uracil in dem Template nicht-inhibitorisch für in vitro DNA-Synthese. Somit kann diese DNA verwendet werden als Template für die Herstellung eines komplementären Strangs, der die gewünschte DNA-Sequenzveränderung enthält, jedoch nur TMP und keine dUMP-Reste enthält.
Nach Vervollständig der in vitro Reaktionen wird Uracil aus dem Templatestrang, z. B. durch Wirkung von Uracil-N-glycosylase entfernt oder durch Einführung der unfraktionierten Produkte der in vitro Reaktion in Wildtyp (dut⁺ ung⁺) E. coli-Zellen. Behandlung mit der Glycosylase entlässt Uracil, produziert lethale Apyrimidin (AP)-Stellen in dem Templatestrang. Somit wird der Templatestrang biologisch inaktiviert und die Mehrheit der Nachkommen stammt von dem infektiösen komplementären Strang, der die gewünschte Veränderung enthält. Dies resultiert in einer hocheffizienten Mutanten-DNA-Produktion (typischerweise 50%) und ermöglicht es Mutanten-DNA durch DNA-Sequenzanalyse zu screenen.
Verschiedene Variationen der in vitro Mutagenese durch Primerextension, die Mutanten mit hoher Effizienz hervorbringen, wurden entwickelt, wie beschrieben in Smith, Ann. Rev. Genet., 19: 423–463 (1986). Das hier beschriebene Verfahren ist ein einfaches ortsspezifisches Mutageneseprotokoll, angewendet auf ein Template, das ein spezifisches Uracil enthält, das die schnelle und effiziente Gewinnung von Mutanten-DNAs erlaubt, wie ursprünglich beschrieben in Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 488–492 (1985) und Kunkel et al., Meth. Enzymol., 154: 367–382 (1987), die hier alle durch Referenz eingeschlossen sind. Prinzipiell kann dieses gleiche Template auf die meisten anderen Protokolle angewendet werden.
Mutante 1 wurde erzeugt durch Legieren des Pro-UK-Gens in die HindIII/Xbal-Stelle von Plasmid M13mp18, Transformieren dieses Plasmids in E. coli, Isolierung von ssDNA und Durchführen von Oligonukieotid-gerichteter Mutagenese, wie vorstehend beschrieben.
Expression von Pro-UK-Mutanten-DNA
Sobald die Pro-UK-DNA mit der gewünschten Mutation erhalten wird, muss sie in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden. Dieser Vektor muss dann in eine Zelllinie, z. B. eine bakterielle, Säuger- oder Hefe-, gebracht werden, um die Pro-UK-Mutante zu exprimieren, die aus dem Kulturmedium geerntet wird oder von den Hefezellen und dann gereinigt wird. Diese Techniken sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie gutbekannt und sind im Detail beschrieben in z. B. Ausubel et al. (Hrsg.), Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 9 und 16, oben; und Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning, (2. Ausgabe), Kapitel 16 (Cold Spring Harbor Laboraton Press, 1989), die hier durch Referenz eingeschlossen sind.
Es gibt verschiedene Wege, auf denen das Mutanten-Pro-UK-Gen in Säugerzelllinien eingeführt werden kann. Ein Verfahren schließt die Transfektion eines Vektors in Chinesische Hamsterovarien ("CHO")-Zellen ein. In diesem Verfahren wird das Pro-UK-Gen co-transfiziert mit einem auswählbaren Marken, wird stabil in die Wirtszellchromosomen integriert und nachfolgend amplifiziert. Das CHO-Zeltsystem ist bevorzugt, da es die Produktion von großen Mengen Mutanten-Pro-UK über einen langen Zeitraum erlaubt. Zelllinien wie CHO DXB11 oder CHO DG44 sind von Lawrence Chasin, Columbia Universität, erhältlich. Zelllinie CHO GRA ist erhältlich von Randall Koufman, Genetik Institute.
Ein anderes Expressionsverfahren schließt die Transfektion eines Vektors, der die Mutanten-DNA enthält, in ein PET-19B E. coli Expressionssystem ein (Novagen, Madison, WI) ein. Nach ortsspezifischer Mutagenese wurde zum Beispiel die DNA, die Mutante 1 (Lys³⁰⁰ → Ala) kodiert, sequenziert, um sicherzustellen, dass die Mutation aufgetreten ist und wurde dann in die NdeI/XhaI-Stelle von PET-19B ligiert, ein hocheffizientes E. coli Genexpressionssystem (Novagen, Madison, WI) und transformiert in E. coli. Die transformierten E. coli wurden kultiviert und induziert, um Pro-UK-Mutante zu exprimieren, durch Zusatz von dem Induktor IPTG in der Logphase.
Wenn ein Vektor in eine Säugerzelllinie eingeführt ist, ist es auch wünschenswert, die Expression von dem gewünschten Protein zu steigern, z. B. die Mutanten Pro-UK, durch Auswählen für gesteigerte Kopienzahlen der transfizierten DNA in dem Wirtschromosom. Coamplifizieren transfizierter DNA resultiert in einem 100- bis 1000-fachen Anstieg in der Expression des Proteins, das durch die transfizierte DNA kodiert wird. Es gibt mehr als 20 auswählbare und amplifizierbare Gene, die in der Literatur beschrieben wurden, jedoch die meiste Erfahrung und der meiste Erfolg wurde mit Methotrexatselektion und Amplifikation von transfizierten Dihydrofolatreductasegenen erzielt. Zum Beispiel können Dihydrofolatreductase-defiziente CHO-Zellen verwendet werden, um hohe Expressionsspiegel von Mutanten-Pro-UK-Genen durch Co-Amplifikation durch Selektion auf Methotrexat-Resistenz zu erhalten.
Amplifikation unter Verwendung von CHO-Zellexpressionsvektoren Die pED-Serie von dicistronischen Vektoren kann verwendet werden, um Expression eines Zielgens in stabil transfizierten Zellen, auf höchster Ebene zu erreichen (5). Diese Vektoren tragen eine Klonierungssequenz für die Insertion eines Zielgens, z. B. das Mutanten-Pro-UK-Gen, gefolgt von einem auswählbaren und amplifizierbaren Markergen, Dihydrofolatreductase ("DHFR"). DHFR-defiziente CHO-Zellen, transformiert mit dem geeigneten Vektor, werden durch ihre Fähigkeit, in Nukleosid-freiem Medium zu wachsen, ausgewählt. Nachfolgendes selektives Cycling in Anwesenheit von gesteigerten Konzentrationen von Methotrexat, welches ein potenter Inhibitor der DHFR-Funktion ist, resultiert in Amplifikation der integrierten DNA und steigert die Expression des gewünschten Genprodukts. Die pED-Vektoren, gezeigt in 5, sind beschrieben in Kaufman et al., Nucl. Acids. Res., 19: 4485–4490 (1991), hier durch Referenz eingeschlossen.
Die CHO-Zellen können mit den Mutanten-Pro-UK- und DHFR-Genen in einen geeigneten Vektor transfiziert werden, z. B. pED, unter Verwendung von entweder Elektroporation, Cal ciumphosphat oder Liposom-vermittelten Techniken, die im Detail beschrieben sind in Current Protocols in Molecular Biology. Die Calciumphosphatbehandlung, gefolgt von Glycerinschock, ist für CHO DXB11-Zellen bevorzugt. Die transfizierten Zellen werden dann in ein selektives Medium gebracht und nach verschiedenen Tagen des Wachstums werden große gesunde Kolonien mit etwa 500 Zellen für die Amplifikation gepickt. Die ausgewählten Kolonien werden auf getrennten Platten vor der Amplifikation wachsen gelassen.
Bevor die stabilen Transfektanten amplifiziert werden, sollte die zelluläre DNA durch Southern-Analyse untersucht werden oder die RNA sollte analysiert werden unter Verwendung eines funktionellen Assays für die Mutanten-Pro-UK, um sicherzustellen, dass die Zellen das gewünschten Mutanten-Pro-UK-Gen integriert haben. Die ausgewählten Zellen werden dann in Methotrexatlösung gebracht, die das Niveau der Selektion steigert, da Methotrexat ein potenter Inhibitor von DHFR ist. Durch Aufteilen der Zellen in dieses Medium selektiert man auf Zellen, die gesteigerte Spiegel von DHFR herstellen. Dies wird generell erreicht durch Steigern der Kopienanzahl des transfizierten DHFR-Gens. Zur gleichen Zeit wird das Mutanten-Pro-UK-Gen, das co-im transfiziert wurde mit dem DHFR-Gen, auch in der Kopienanzahl gesteigert. Höhere und höhere Spiegel von Methotrexat werden verwendet, um die Zellen auszuselektieren, die die höchste Kopienanzahl des DHFR-Gens haben und somit des Mutanten-Pro-UK-Gens. Wenn die Zeilen in 20 bis 80 μM Methotrexat wachsen, sollten die Zellen 500 bis 2000 Kopien des transfizierten Mutanten-Pro-UK-Gens enthalten.
Extrahieren und Reinigen von Pro-UK-Mutanten
Nachdem die Mutanten-Pro-UK exprimiert wurde, z. B. durch eine Säuger- oder bakterielle Zelllinie, musste sie aus dem Kulturmedium extrahiert und gereinigt werden. Im Fall von Hefezellkulturen müssen die Hefezellen zunächst zerstört werden, z. B, durch mechanische Zerstörung mit Glaskügelchen, um einen Zellextrakt herzustellen, der die Mutanten-Pro-UK enthält. Reinigung von aktiven Mutanten-Pro-UK aus Kulturmedium aus Zellextrakten schließt generell die Schritte von 1) Flüssig/Flüssig-Phasenextraktion oder einen anfänglicher Filterschritt, 2) hydrophobe Affinitätschromatographie, 3) Antikörperaffinitätschromatographie und 4) Gelfiltrationschromatographie ein. Die Schritte sind dem Fachmann auf denn Gebiet der Molekularbiologie gut bekannt und im Detail beschrieben in Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 10.
Die E. coli Zellen, die die Pro-UK-Mutante 1 enthielten, wurden durch Ultraschall lysiert und das Lysat wurde auf eine Nickelaffinitätschromatographiesäule gegeben, da Poly-His vor dem N-Terminus der Pro-UK mit einer Enterokinase-Spaltstelle (DDDDK) eingeführt ist. Die gereinigte Pro-UK-Mutante wurde inkubiert mit immobilisierter Enterokinase, um die N-termi nalen Poly-His mit einer Re-chromatographie auf einer Nickelaffinitätssäule zu entfernen. Die Probe wurde weiterhin gereinigt durch Chromatographien durch S-Sepharose, Hydroxyapatit, Sephacryl S-200 und Benzamidinsäulen, nach Rückfaltung, wie beschrieben in Winkler & Blaber, Biochemisty, 25: 4041–4045 (1986) und Orsinie et al., Eur. J. Biochem., 195: 691–697 (1991). Jede kleine Menge von kontaminierender UK wurde entfernt durch Behandlung mit Diisopropylfluorphosphat (DFP).
Analyse von Pro-UK-Mutanten
Die Eigenschaften von den Pro-UK-Mutanten können verglichen werden mit rec-Pro-UK, hergestellt durch E. coli, wie es für Mutante 1 durchgeführt wurde. Die intrinsische Aktivität, Fragment E₂-Förderung von Glu-Plasminogenaktivierung zu frühen Zeitpunkten und die Anfälligkeit gegen Plasminaktivierung und Blutgerinnsel-Lyse in einem Plasmamilieu werden getestet, um ein Assayprofil zu bestimmen, das mit geringen Mengen von Pro-UK-Mutanten erhalten werden kann und das vorhersagt, wie die Mutante als thrombolytisches Mittel in vivo wirken wird.
Intrinsische Aktivitätsassays
Diese Assays basieren auf einer genetischen Analyse der Hydrolyse von S2444, einem synthetischen Substrat von UK und der Aktivierung von Glu-Plasminogen.
S2444-Hydrolyse: 4,0 nM von UK oder 1,0 μM einer Pro-UK-Mutante 1 wurde inkubiert, mit einer Reihe von Konzentrationen (0,03, 0,06, 0,12, 0,18, 0,24, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8 und 2,4 mM) von S2444 in 0,05 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 0,2% BSA und 0,01% Tween 80 (pH 7,8) bei Raumtemperatur. Die Reaktionsrate wurde gemessen durch den linearen OD-Anstieg mit der Zeit bei 410 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 490 nm (410/490 nm) auf einem Mikrotiterplattenlesegerät. Mutante 1 zeigte fast keine S2444-Hydrolyseaktivität.
Glu-Plasminogenaktivierung: Zeitabsorptionskurven von Glu-Plasminogenaktivierung wurden erhalten durch Messen des OD-Anstiegs eines Reaktionsgemisches mit der Zeit, bei der ausgewählten Wellenlänge 410 nm und Referenzwellenlänge 490 nm (410/490 nm) auf einem Mikrotiterplattenlesegerät (Dynatech MR 5000). Das Reaktionsgemisch enthielt S2251 (1,5 mM), Glu-Plasminogen (1,0, 1,5, 2,5, 3,5, 4,5, 5,5, 7,5 und 10,0 μM) und UK (0,2 nM). oder Pro-UK-Mutante 1 (5,0 nM). Die Reaktanten wurden in 0,05 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 0,2% BSA, 0,01% Tween-80, pH 7,8 gebracht und bei Raumtemperatur inkubiert. Mutante 1 zeigte eine Plasminogenaktivierungsaktivität von etwa 4 IU/mg, was nur 1% der nativen Pro-UK ist, die eine Aktivität von etwa IU/mg hat.
Assay durch Plasminogenaktivierung durch Fibrinfragment E-2
Glu-Plasminogenaktivierung durch Pro-UK-Mutante 1 in der Anwesenheit von Fragment E₂ wurde bestimmt, durch Messen des OD-Anstiegs mit der Zeit in einem Reaktionsgemisch bei 410 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 490 nm (410/490 nm) in einem Mikrotiterplattenlesegerät. Das Reaktionsgemisch enthielt 1,5 mM S2251, ein synthetisches Substrat für Plasmin, Glu-Plasminogen (1,0, 2,0, 4,0 und 8,0 μM), 5,0 μM Fragment E-2 und 1,0 nM Pro-UK-Mutante 1 in 0,05 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, 0,2% BSA, 0,01% Tween 80, pH 7,8 bei Raumtemperatur. Plasminogenaktivierung durch Mutante 1 in Anwesenheit von Fibrinfragment E-2 war nur bei 40% der von nativer Pro-UK. Native Pro-UK-Plasminogen-Aktivierung ist 250-fach größer in der Anwesenheit von Fibrinfragment E-2, als in der Abwesenheit von Fibrinförderung.
Plasmin-Empfindlichkeits-Assay
Der Plasmin-Empfindlichkeits-Assay ist eine kinetische Untersuchung von Pro-UK-Mutantenaktivierung durch Lys-Plasmin. Ein Bereich von Konzentrationen der Pro-UK-Mutante 1 (0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 2,5, 3,5 & 5,0 μM) wurde inkubiert mit Lys-Plasmin (0,1 nM) in der Anwesenheit von 1,2 mM S2444 in 0,05 M Tris HCl, 0,15 M NaCl, 0,01 M CaCl₂ und 0,01% Tween 80, pH 7,4 bei Raumtemperatur über die Zeit. Der gleiche Bereich von Konzentrationen der Pro-UK-Mutante ohne Plasmin wurde inkubiert mit S2444 als eine Kontrolle. Das 0,1 nM Plasmin hatte keine direkte Wirkung auf S2444-Hydrolyse unter Kontrollbedingungen. Die Menge von UK, erzeugt aus Pro-UK-Mutante 1, wurde gemessen durch den OD-Anstieg mit der Zeit bei 410 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 490 nm (410/490 nm) auf einem Mikrotiterplattenlesegerät (MR 5000; Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA). Man fand, dass Mutante 1 eine Plasminempfindlichkeit, vergleichbar mit der von nativer Pro-UK, hatte, die einen K_M von 2,44 μM und einen k_cat von 3,04 nanoM/Min. hat.
Plasma- Fibrinogenolytischer Aktivitätsassay
Die Pro-UK-Mutante 1 (0–100 μg/ml) oder Pro-UK (0–10 μg/ml) wurden in 1,0 ml vereinigtem Bankplasma bei 37°C für 6, 16 oder 24 Stunden inkubiert, danach wurden 0,2 ml Aprotinin (10.000 KlU/ml) zugefügt und übriges Plasmafibrinogen wurde nach einer gegebenen Zeit gemessen durch das Thrombin-Gerinnungsverfahren. Mutante 1 hatte eine plasmafibrinogenolytische Aktivität, die etwa 100-fach geringer war als die von nativer Pro-UK, d. h. während 1,0 μg/ml nativer Pro-UK 50% von 9,0 μg/ml Fibrinogen innerhalb von 6 Stunden lysieren wird, brauchte es 100 μg/ml der Mutante 1, um die gleiche Wirkung zu erreichen.
Fibrin-Gerinnsel-Lyse-Assay
I¹²⁵-markierte Gerinnsel, hergestellt aus 0,25 ml Plasma, wurden hergestellt wie beschrieben in Gurewich et al., Clin. Invest., 73: 1731 (1980). Gerinnsellysierungsexperimente wurden durchgeführt in 3 ml Plasma mit einem Bereich von Konzentrationen der Pro-UK-Mutante 1 (10, 20, 30, 40, 70 und 80 μg/ml) oder t-PA (5, 10, 30, 50, 75, 100 und 150 ng/ml) und bestimmte Kombinationen von t-PA und Pro-UK-Mutanten. Die Lyse wurde durch das Entlassen von Radioaktivität quantifiziert und ausgedrückt als Prozent des Wertes bei vollständiger Lyse gegen die Zeit. Mutante 1-Fibrinogengerinnsel-ILyseaktivität war 50% der von nativer Pro-UK, d. h. während 200 U/ml native Pro-UK ein Gerinnsel (1 cm³) in 6 Stunden lysieren wird, dauerte es 12 Stunden der gleichen Menge von Mutante 1, um die gleiche Wirkung zu erreichen.
Therapeutische Verwendung von Pro-UK-Mutanten
Die Pro-UK-Mutanten werden verwendet und verabreicht als thrombolytische Mittel auf dem gleichen Weg wie Pro-UK und UK. Die mutanten Pro-UKs werden mit pharmazeutisch verträglichen Trägern gemischt (z. B. Saline) und verabreicht durch intervaskuläre, z. B. intravenöse oder interarterielle oder subkutane Injektion. Die Pro-UK-Mutanten werden als ein Bolus von etwa 20 bis 60 mg injiziert oder können intravenös bei einer Rate von 40 bis 80 mg/Stunde infusiert werden. Da die Pro-UK-Mutanten eine weit größere Plasmastabilität und eine weit geringere Wahrscheinlichkeit haben, unspezifische Plasminogenaktivierung zu induzieren als native Pro-UK, können höhere Dosierungen, z. B. Infusionen bis zu 200 mg/Stunde auch verwendet werden.
SEQUENZPROTOKOLL
Andere Ausführungsformen
Andere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen.

Claims

Thrombolytisch aktive Mutante der Pro-Urokinase (pro-UK), bestehend im Wesentlichen aus der Aminosäuresequenz der nativen pro-UK, wobei die Aminosäuresequenz der nativen pro-UK eine flexible Schleife (Aminosäuren 297 bis 313) einschließt, und wobei die Mutante eine Substitution einer Aminosäure, die für die flexible Schleife gewöhnlich ist, durch eine neue Aminosäure umfasst, wobei die Mutation die pro-UK-Mutante veranlasst, eine geringere Fibrinogenolyse und nicht spezifische Plasminogen--Aktivierung zu induzieren und eine mindestens 10-fach geringere intrinsische Aktivität als native pro-UK zu haben, und eine im Wesentlichen gleiche Fibrin-Förderung und thrombolytische Aktivität nach der Plasmin-Aktivierung verglichen mit nativer pro-UK bei Verabreichung an einen Patienten zu haben.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 1, wobei Lys³⁰⁰ durch die neue Aminosäure substituiert ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 2, wobei die neue Aminosäure Alanin oder Histidin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 2, wobei Gly²⁹⁹ durch eine zweite neue Aminosäure substituiert ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 4, wobei die neue Aminosäure Alanin oder Histidin ist und die zweite neue Aminosäure Histidin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 2, wobei Glu³⁰¹ durch eine zweite neue Aminosäure substituiert ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 6, wobei die neue Aminosäure Alanin oder Histidin ist und die zweite neue Aminosäure Alanin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 1, wobei Lys³¹³ durch die neue Aminosäure substituiert ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 8, wobei die neue Aminosäure Alanin oder Histidin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 1, wobei Tyr³⁰⁶ durch die neue Aminosäure substituiert ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 10, wobei die neue Aminosäure Glycin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 1, wobei die Mutation eine Substitution von Ala¹⁷⁵ durch eine neue Aminosäure und Tyr¹⁸⁷ durch eine zweite neue Aminosäure ist, um eine Zymogen-Triade in der Pro-UK-Mutante zu bilden.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 12, wobei die neue Aminosäure Serin ist und die zweite neue Aminosäure Histidin ist.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 12, wobei die Mutation weiter eine Substitution von Lys³⁰⁰ durch eine dritte neue Aminosäure und von Glu³⁰¹ durch eine vierte neue Aminosäure umfasst.
Pro-UK-Mutante nach Anspruch 14, wobei die neue Aminosäure Serin ist, die zweite neue Aminosäure Histidin ist, die dritte neue Aminosäure Alanin oder Histidin ist und die vierte neue Aminosäure Alanin ist.
DNA-Molekül, das für die pro-UK-Mutante nach Anspruch 1 kodiert.
Zelle, die mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 16 transformiert ist.