JPH04504655A - 妊娠に特異的なタンパク質の利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 妊娠に、　的なタンパク　の＊ 聚匪旦！見 本発明は一般にタンパク質に関し、詳細には、妊娠特異的β−１グリコプロテイ ン様タンパク質類、それらをコードする遺伝子およびそれらを使用する方法に関 する。

本願はＷａｉ−Ｙｅｅ　Ｃｈａｎによる１９８９年１月１８日出願の米国特許出 願第０７７２９８６３８号、表題「妊娠特異的タンパク質」の一部継続出願であ る。

妊娠特異的β−１グリコプロテイン（ＳＰＩ）は妊娠中の婦人の血清中に存在し 、ＴａｔａｒｉｎｏｖおよびＭａｓｙｕｋｅｖｉｃｈらにより報告（動■上」五 Ｌ」土ｄ工蜘世工６９．６６−６８（１９７０））されたように、純粋な形で単 離されている。このタンパク質は、Ｂｏｈｎの、　Ｐｌａｃｅｎｔａｌ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ　ｐｐ、７１−８８．Ａ、Ｋ］ｏｐｐｅｒおよびＴ、　Ｃｈａｒｄ編 、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ１９７９）の研究のように、胎盤の 合胞体栄養細胞層で合成され、母方の血清中に分泌され、Ｔａｔａｒｉｎｏｖお よびＭａｓｙｕｋｅｖｉｃｈの、　ＢＬＩＩｌ、　ＥＸ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅ ｄ、　６９．６６−６８　（１９７０）ならびにＬｉｎら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、 　Ｉｎｖｅｓｔ、　５４．５７６−５８２　（１９７４）に報告されたように、 妊娠初期の２週間から３週間の間に検圧可能となり、妊娠期間中増加して約２０ ０〜４００μｇ／ｍｌのレベルに達する。

ヒトＳＰＩが胎盤由来であることは良く確立されているが、ラジオイムノアッセ イによれば正常の男性および女性の血清中にこのタンパク質が低レベル検出され 得る。ヒトのＳＰＩの胎盤外の起源は確認されていない。培養ヒト皮膚線維芽細 胞および正常脳細胞によるＳＰＩの胎盤性産生がＨｅｉｋｉｎｈｅｉｍｏらの、 Ｊ。

Ｃ１１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｍｅｔａｂ、　５１．１４３２（４３６（１９８ ０）　：Ｒｏｓｅｎの、ヒ」シ徂吐Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　ｐｐ２２３−２３４（ １９８２）　；およびＣｈｏｕの、０ｎｃｏｄｅｖｅｌｏ　、Ｂｉｏｌ］μｍ、 　４．３１９−３２６（１９８３）に報告されているが、原因は不明である。

Ｂｏｈｎが、Ｂｌｕｔ　２４，２９２−３０２（１９７２）で最初に報告したよ うに、胎盤から単離されたＳＰＩはＮ末端にヒスチジンを有する単一ポリペプチ ド鎖からなり、９０．０００の分子量を有し、その３０％は炭水化物である。幾 つかの続く研究から、この「タンパク質」ハ実際は、いくつかの成分の不均一な 混合物であることが示された。ヒト胎盤ＳＰ１の分子量についての報告には、広 い食い違いがある。ゲル濾過、限外濾過および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより決定され た値は、それぞれ１１０．０００から４２，３００の範囲で異なっている。炭水 化物は２８〜３２％の範囲で異なっている。Ｂｔｓｃｈｏｆの、ｑｏｎｔｒｉ、 Ｇ　ｎｅｃｏｌ、ｏｂｓｔｅｔ、１２．６−９２（１９８４）の総説によれば、 電気泳動の移動度はα、βからγまでの範囲である。ＳＰＩの遺伝的変異体もま た、正常および異常の両方の妊娠、および腫瘍にあることが報告されている。こ れらの変異体には、タンパク質の大きさまたは配列の変更があることが示されて いる。

３′末端に多少の相違を有する胎盤特異的ＳＰＩをコードするｃ　ＤＮＡ配列は 、ＷａｔａｎａｂｅおよびＣｈｏｕの、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ３゜２０４９−２０５６　ｉｎ　１９８８．　ならびに５ｔｅｙｄｉｏらのＢｉ ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１５４（Ｌ）、　１３０−１３７（１９８８）によって 報告されている。ヒトＳＰＩに対するモノクローナル抗体もまた、抗原決定基が 同一または異なるタンパク質上にあるかどうかは未知であるが、種々の独特の特 異性および親和性を有することが報告されている。

ＳＰＩの機能は未だ未知であるが、ＳＰｌの測定は臨床応用に大きな可能性を有 する。多くの状態下でのＳＰｌの医学的関連性が広（調査されてきた。Ｂ１５ｃ ｈｏｆ　（１９８４）の総説のように、ＳＰＩの最も重要な用途は、妊娠中の正 常状態および病的状態の両者を含む種々の状態をモニターすることである。さら に、５ｏｒｅｎｓｅｎの、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　１２１，１９９−２ ０８（１９８４）の記載のように、ＳＰＩの測定は、栄養膜性腫瘍および幾つか の非栄養膜性腫瘍を診断しモニターする見込みが示された。

これらの可能性にもかかわらず、ＳＰＩは臨床医学にあまり使用されなかった。

信頼できる定量法がなかったためである。

現在、ＳＰＩアッセイの大多数が抗原抗体相互反応によるものであり、ＳＰ１分 子の性質および使用される抗体の特異性に依存する。ＳＰ１分子の不均一性はこ れらのイムノアッセイの信頼性を減少させる。

従って本発明の目的は、幾つかのＳＰＩタンパク質の一群の構造およびそのヌク レオチド配列を提供することである。

本発明のさらなる目的は、医薬用途のためのきわめて純粋なＳＰＩタンパク質を 製造する方法および手段を提供することである。

本発明の他の目的は、様々な種類のＳＰＩを定量するためのモノクローナル抗体 を製造する方法および手段、ならびに非胎盤組織中のＳＰｌ様タンパク質との架 橋を除（ことによりＣＥＡアッセイを改善する方法および手段を提供することで ある。

本発明の目的はさらに、妊娠アッセイに使用され、ならびに栄養膜性腫瘍および いくつかの非栄養膜性腫瘍の検出とモニターに使用される方法および手段を提供 することである。

さらに本発明の他の目的は、胎児拒絶反応を防止するために、治療過程において その胎児の拒絶反応をおこすために、および免疫グロブリンの胎児への移行を改 善するために使用される薬剤を提供することである。

及豆Δ斐ｌ 一般に妊娠特異的タンパク質（ＳＰＩ）として同定され、妊娠特異的β糖タンパ ク質（Ｐ　Ｓ　Ｂ　Ｇ）としても知られているタンパク質をコードする遺伝子が 、少なくとも７つ同定された。これらの遺伝子は、ヒト胎盤ＳＰＩの標識された ｃＤＮＡを、ヒト、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびラットを含む様々な 哺乳類、ならびに魚および鳥を含む非哺乳類に使用することにより見いだされた 。これらの遺伝子はヒト胎盤に、腸細胞に、胎盤由来と精巣由来の両細胞に、精 巣由来の組織に、およびＨｅＬａ細胞に特異的に見いだされるものとして分類さ れ得る。このうちヒト胎盤に見いだされるものは、特異的な制限酵素部位および 疎水性領域の存在または非存在により、少なくとも３つの群に分けられる。

第１群の胎盤特異的ＳＰｌ様タンパク質のクローンの例はｈＰｓ１２である。胎 盤に特異的に見いだされ、膜結合を示す疎水性Ｃ末端領域を有することがわかっ てきたＳＰｌ様タンパク質をコードするクローンは、ｈＰＳ２である。胎盤に見 いだされる配列を有し、ＷａｔａｎａｂｅおよびＣｈｏｕの、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 。

Ｃｈｅｍ、　２６３（４）、　２０４９−２０５６（１９８８）のクローンＰＳ Ｇ１６および５ｔｒｅｙｄｉｏらの、Ｂｉｏｃｈｅｍ、ユｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ 、Ｃｏｍｍ、１５４（１）、１３０−１３７　（１９８Ｂ＞のクローンＦ’５Ｂ ＧＣおよびＰＳ　ＢＧＤに非常に密接に関連するクローンは、ｈＰＳ　１１であ る。腸ライブラリーから単離されたクローンには、ｈＩｓｌ、ｈｌｓ２、および ｈＨＳ３が包含される。胎盤と精巣の両方に共通するクローンはｈＰＳ３である 。精巣のｃ　ＤＮＡライブラリーから単離されたクローンには、ｈＴＳ　１、ｈ ＴＳ　２およびｈＴＳ３が包含される。ＨｅＬａ細胞ライブラリーから単離され たクローンには、ｈＨＳ　１、ｈＨＳ　２、ｈＨＳ　８、ｈＨＳ　１１、ｈＨＳ ４、ｈＨＳ　３、ｈＨＳ６、ｈＨＳ９、ｈＨＳ　１２およびｈＨ３１４が包含さ れる。これらのｃＤＮＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような免疫グロブリン遺 伝子スー７＜−ファミリーの一員の幾つかと、少なくとも６５％相同である。腸 細胞自来のｃＤＮＡにフードされるタンノ（り質は、他のＳＰ１タンパク質より もＣＥＡタンノくり質に密接に関連して（洩ることがわかる。

ＤＮＡ配列、タンパク質およびタンノくり質に対する抗体を製造し使用する方法 もまた本願に記載されており、特に妊娠アッセイに用いる薬剤を製造し精製する 時に、栄養膜性および幾つかの非栄養膜性腫瘍の検出とモニタ一時に、ならび（ こＳＰＩアッセイおよびＣＥＡアッセイに使用される薬剤の精製時の様な、診断 行為のための方法が記載されている。

免疫抑制活性および成長促進活性は、それぞれリンパ球の分化増殖の抑制および 巨核球生産の誘導によって示された。

ＥＩＴＬ旦１垂呈笠皿 図１は、ＳＰＩ遺伝子、ＣＥＡおよび免疫グロブリン遺伝子のスーパーファミリ ーの間の関係の要約である。

図２は、ｈＰＳ　１１のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列である 。アミノ酸番号を配列の上部に、ヌクレオチド番号を配列の下部に示す。グリコ ジル化可能部位には下線が引かれている。精製タンパク質のトリプシン断片と同 一の推定アミノ酸配列は四角で囲まれている。は精製ｓＰ１のアミノ末端分析か ら決定されたものと異なるアミノ酸残基を示し、マはシスティン残基を、★★★ は終止コドンを示す。各サブドメインの境界をＲｌｎ、Ｒ２ｎおよびＲ２ｃで示 す。

図３は、ｈＰＳ２のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列である。ヌ クレオチド番号が示されている。グリコジル化可能部位には下線が引かれている 。白の逆三角はＣｙｓ残基を示す。黒の四角はポリアデニル化部位を示す。★は 終止コドンを示す。各ドメインの境界は、ＮはＮ末端ドメインを、Ｒｎは反復ユ ニット（ドメインの）のｎサブドメインを、Ｒｃは反復ユニット（ドメインの） のＣサブドメインを、ＣはＣ末端ドメインをそれぞれ示す。

図４は、ｈＰｓ９０に由来する５′伸伸長列およびｈＰＳ１２のヌクレオチド配 列および推定アミノ酸配列である。ヌクレオチド番号が示されている。グリコジ ル化可能部位には下線が引かれている。白道三角は保存されたＣｙｓ残基を示す 。黒画角はポリアデニル化部位を示す。★は終止コドンを示す。各ドメインの境 界は、ＮはＮ末端ドメインを、Ｒｎは反復ユニット（ドメインの）のｎサブドメ インを、Ｒｃは反復ユニット（ドメインの）のＣサブドメインを、ＣはＣ末端ド メインをそれぞれ示す。

図５は、ｈＰＳ３のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列である。ヌクレオ チド番号を配列の下部に示す。グリコジル化可能部位には下線が引かれている。

タンパク質の配列決定により決定されたアミノ酸配列は四角で囲まれている（ペ プチドＣ）。

図６は、ｈＴｓｌ　（ｈＴｓＩＬ）の３’　ＥｃｏＲＩ断片とｆｉＰｓｌｌとの ヌクレオチド配列の比較である。

図７は、ｈＴＳ　１６のヌクレオチド配列である。番号はヌクレオチド塩基番号 である。エクソンにコードされたアミノ酸が示されている。ポリアデニル化シグ ナル配列が破線で印付されている。グリコジル化可能部位には下線が引かれてあ り、保存システィン残基は四角で囲まれている。大きな白三角は欠損を示す。エ クソン／イントロンの境界およびドメイン領域の境界が示されている。ＩＶＳは 介在配列を、ＮはＮ末端領域を、Ｒｎはｎサブドメインを、ＲｃはＣサブドメイ ンを、ＣはＣ末端ドメインをそれぞれ示す。

図８は、ｈＨＳ２のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列である。ヌ クレオチド番号が示されている。グリコジル化可能部位を下線で示す。システィ ン残基を四角で囲んで示す。各ドメインの境界は、Ｎ−Ｔｅｒｍ（Ｎ末端ドメイ ン）、Ｒｌｎ（反復１のｎサブドメイン）、Ｒ２ｎ（反復２のｎサブドロイン） で示されている。

図９はｈＩｓｌのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列である。ヌク レオチド番号が示されている。グリコジル化可能部位を下線で示す。システィン 残基を四角で囲んで示す。各ドメインの境界は、Ｎ−Ｔｅｒｍ（Ｎ末端ドメイン ）、Ｒｌｎ（反復１のｎサブドメイン）、Ｒｌｃ（反復１のＣサブドメイン）で 示されている。マは可能なシグナルペプチド開裂地点を示す。

図１０はｈＰＳ　１１、ｈＩｓｌおよびＣＥＡのドメイン構造の比較である。以 下の凡例が用いられているニー　Ｎ−束殊キ！１八 １　１　ｃ−−ｖｒイ°ビトイン 閣璽冒 膳謳履　１和水性　Ｃ−來鳩儒１に 図１１は、ヒト胎盤ＳＰＩのｃＤＮＡにコードされるコンセンサスなアミノ酸配 列と、ヒトＣＥＡおよびＮＣＡのｃＤＮＡにコードされるアミノ酸配列を並列し て比較している。

グリコジル化可能部位を下線で示す。魚道三角は保存Ｃｙｓ残基を示す。アミノ 酸には各ドメインまたはサブドメインの開始点を示す番号が付けられている。Ｓ ＰＩ　ＮＣｏｎは、ＳＰＩ　ｃＤＮＡのＮ末端ドメインのコンセンサス配列；５ ＰＩＲ１ｎＣｏｎはＳＰＩ　ｃＤＮＡのＲ１ｎサブドメインのコンセンサス配列 ；　５ＰＩＲ２ｃＣｏｎは、ＳＰＩ　ｃＤＮＡのＲ２ｃサブドメインのコンセン サス配列である。ＣＥＡおよびはＮＣＡのドメインの呼名は刊行物の参考文献と 同図１２はヒト胎盤ＳＰＩの免疫抑制活性のグラフであり、ＳＰＩ　（μｇ／ｍ 　ｌ　）に対する混合リンパ球反応の阻害％がプロットされている。

図１３はヒト胎盤ＳＰＩの増殖促進活性を示すグラフであり、５ＰＩ（μｇ／ｍ ｌ）に対するネズミ巨核球アセチルコリンエステラーゼ活性の対コントロール％ がプロットされている。

發Ｊ目と１劇ｌＩえ咀 ＳＰＩタンパク質について、成長因子活性および免疫抑制活性を含む幾つかの新 しい活性が、米国特許出願第０７／２９ｇ６３８号に開示されたｃＤＮＡクロー ンの構造と配列に基づき新しく示され、インビトロで確かめられた。さらに、多 くの哺乳類および非哺乳類において、これらの遺伝子の保存が示され、このこと から、これらのタンパク質の根本的な重要性が示唆され、幾つかの動物種をさら なる研究のためのモデルとして使用することが確立された。

米国特許出願第０７／２９８６３８号には、幾つかの別々であるが、非常に密接 に関連しあうタンパク質をコードするｃＤＮＡクローンの、単離および特徴付け が記載されている。

ヒト胎盤に特異的に見いだされるタンパク質をコードする遺伝子（この遺伝子は 、特異的制限酵素部位および疎水性領域の存在または非存在により、少なくとも ３つの群に分けられる）、腸細胞に見いだされる遺伝子、胎盤由来および精巣由 来の両細胞に見いだされる遺伝子、精巣由来の組織のみに見いだされる遺伝子、 およびＨｅＬａ細胞に見いだされる遺伝子の、少なくとも７つの遺伝子゛が確認 された。胎盤に特異的なＳＰｌ様タンパク質の第１群のクローンの例は、ｈＰｓ １２である。胎盤で特異的に発現され、膜結合性を示唆する疎水性Ｃ末端領域を 有するとみられるＳＰｌ様タンパク質をコードするクローンは、ｈＰＳ２である 。胎盤で発現される配列を有するもう一つのクローンは、ｈＰｓｌｌであり、こ のクローンは、ＷａｔａｎａｂｅおよびＣｈｏｕの、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　２６３（４）、　２０４９−２０５６（１９８Ｂ）のクローンＰＳＧ１６およ び５ｔｒｅｙｄｉｏら。

肛匹加１」圧並■ｓ、　Ｒｅｓエエ坦ｍ、１５４（１）、　１３０−１３７　（ １９８８）のクローンＰＳＢＧＣおよびＰＳＢＧＤと非常に密接に関連している 。腸ライブラリーから単離されたクローンには、ｈＩＳｌ、ｈＨＳ２、およびｈ ＨＳ３が包含される。胎盤と精巣の両方に共通するクローンはｈＰＳ３である。

精巣のｃＤＮＡライブラリーから単離されたクローンには、ｈＴＳ　１、ｈＴＳ ２およびｈＴＳ３が包含される。ＨｅＬａ細胞ライブラリーから単離されたクロ ーンには、ｈＨＳ　１、ｈＨＳ　２、ｈＨＳ８、ｈＨ３１１、ｈＨＳ　４、ｈＨ Ｓ３、ｈＨＳ６、ｈＨＳ９、ｈＨ３１２およびｈＨＳ　１４が包含される。これ らのｃＤＮＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のような免疫グロブリン遺伝子スーパ ーファミリーの一員の幾つかと、少なくとも６５％の相同性を有する。これらの タンｔｆり質の重要な特徴は、βシートと反復ドメイン構造の存在、および反復 ドメイン内の保存されたグリコジル化部位とシスティン残基の類似性であり、こ れらは全て遺伝子重複またはエクソンのシャ・ノフリングによって同一の始原遺 伝子から進化したこと力（示唆される。ＣＥＡファミリーは、高度にグリコジル 化されて℃）る点でＳＰＩファミリーと異なる。腸細胞由来のｃ　ＤＮＡにコー ドされるタンパク質は、他のＳＰＩタン／ｆり質よりもＣＥＡタンパク質に密接 に関連しているように見える。

ＤＮＡ配列、タンパク質およびそのタンノｆり質に対する抗体の幾つかの使用も また、米国特許出願第０７７２９８６３８号に記載され、特にＣＥＡの検出に使 用される薬剤の精製のような診断行為について記載されている。

ＳＰＩタンパク質の幾つかのｃＤＮＡクローンが単離され特徴付けられた。幾つ かは既に報告されたＳＰＩタンパク質のｃＤＮＡに類似する。本発明のＳＰＩ遺 伝子には、図および実施例に記載されたｃＤＮＡ配列、任意の天然に存在するゲ ノムから単離されるこれらに相同な配列、ならびにそれらの類似体が含まれる。

上記類似体ではその配列のヌクレオチドが置換、欠失、または付加されているが 、コードされるペプチドの特異的生物学的活性または特有の構造の少なくとも一 部を有するタンパク質をコードする。本発明にはさらに、図および実施例に記載 された、または記載されたｃＤＮＡから発現される、実質的に純粋なペプチドま たはタンパク質と、配列のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているが、ペ プチドの特異的な生物学的活性または構造の少な（とも一部を維持している、そ れらのアナログと、任意の上記ペプチドまたはアナログの結合体とが含まれる。

意味を明確にするため、ｃＤＮＡクローンの表現には以下の命名法が用いられる 。

クローニングベクター：λはえファージ；ｐはプラスミド；ｍはＭ１３ファージ ｃ　ＤＮＡの由来する種を示す小文字：ｈはヒト：　ｒはう・ノド；ｂはウシ ｃＤＮＡの由来である組織を示す大文字：Ｐは胎盤；　Ｉは腸；ＨはＨｅＬａ細 胞；Ｔは精巣 タンパク質ファミリーを示す大文字は、ここではＳはＳＰｌタンパク質ファミリ ーを示す クローン番号 サブクローン番号 幾つかの場合には、クローンは既に文献中で異なる参照番号を付けられている。

例えばｈＰＳ　１１はｈＰｓＰｌｌと呼ばれている。ｈＨ３２はｈＨ３Ｐ２と呼 ばれている。ｈＰＳｌｌは、ＷａｔａｎａｂｅおよびＣｈｏｕの、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２６３（４）、２０４９（１９８８）に記載のクローンＰＳＧＩ　 ６および５ｔｒｅｙｄｉｏらの。

Ｌ匹崩Ｌ」山上団し」」工仝二ｍ、１５４（１）、１３０−１３７　（１９８８ ）に記載のクローンＰＳＢＧＣおよびＰＳ　ＢＧＤの類似体である。

ｈＰｓｌｌは、本発明のクローンの例の一つであり、胎盤および精巣で検出され るＳＰＩ様タンパク質をコードする。

ｈＰｓｌｌのＮ末端の１４３個のアミノ酸は、特徴的な二次構造を有するほか、 ７つのグリコジル化部位の内３つを含有するタンパク質の特異的ドメインを構成 するようである。タンパク質の残りの部分には反復ユニット（ドメインの）が含 まれる。ＲｌｎおよびＲ２ｎの２つの内部反復が存在する。

この反復の各々は２７９ｂｐであり、９３アミノ酸をコードし、これらのヌクレ オチドの７３％およびアミノ酸の４８％が同一である。反復のグリコジル化部位 は保存されていない。

第２の反復は第一の反復よりも親水性である。内部反復の後には、終止コドンＴ ＧＡの前に９０個のアミノ酸配列が存在し、Ｒ２ｃと名付けられている。この領 域にはグリコジル化部位がない。

ＳＰＩファミリーは始原遺伝子の重複により形成されたと考えられる。この始原 遺伝子はＳＰＩ遺伝子、癌胎児性抗原遺伝子、および免疫グロブリン遺伝子に進 化した。これらの関連性を図１に示す。ＳＰＩ遺伝子ファミリーの一員の特徴の 一つは、クローン化されたｃＤＮＡの幾つかで第１の反復ユニット（ドメインの ）のＣサブドメイン（Ｒｌｃ）が欠失していることである。このことは、ｈＰｓ ｌｌ、ｈＰｓ１２、ｐｓＧｌ　６およびｈＨ８２が全て、２つの反復ユニット（ ドメインの）を有し、１つのＣサブドメインが欠失している１つの祖先に由来し ていることを示唆している。ｈＩｓｌは、ＳＰＩプローブとのハイブリダイゼー ションにより発見されたにもかかわらず、ＳＰＩファミリーよりもＣＥＡファミ リーに近く、従って２つの遺伝子ファミリーの間の中間体であり得る。

免疫抑制機能を有するほか、ＣＥＡは細胞間相互作用および成長因子様活性に関 与すると考えられている。ｓＰ１タンパク質、特に腸遺伝子ライブラリーから単 離された群に属するものは、類似の機能を有することが期待される。

ＳＰＩ遺伝子および免疫グロブリン遺伝子は、全般に類似したドメイン構造およ び保存されたジスルフィド架橋とβシート構造を有しており、これらのヌクレオ チド配列の幾つがの部分で約６５％の相同性を有する。このような関連性は、Ｓ ＰＩタンパク質の機能を推定する上で非常に重要である。

多くの免疫グロブリン遺伝子ファミリーのメンバーは、レセプターまたは細胞認 識機能を有し、このことは、ＳＰＩが同様の生理的役割を有するかもしれないこ とを示す。ＭＨＣ抗原と、胎盤に特異的な膜結合型ＳＰＩ　（ｈＰＳ２）との間 の構造類似性は、キラーＴ細胞に対して胎児抗原が提示される際にＳＰＩがＭＭ Ｃ抗原と拮抗するかもしれないことを示す。

もしもそうであるならば、ＳＰＩは、ＭＨＣ抗原およびキラーＴ細胞の作用をブ ロックし、そして着床した胚に局所的な免疫を提供することにより、胎児の同種 移植片拒絶を防止し得る。ポリ１ｇレセプターと細胞質型ＳＰＩ　（ｈＰｓｌｌ およびｈＰｓ１２）との構造の類似性は、ＳＰＩがＩｇレセプターと類似の機能 、即ち、母親から胎児への免疫グロブリンの細胞内外輸送の機能を有するかもし れないことが示唆される。

ＳＰｌ様タンパク質の各群の遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンは、以下の限 定されない実施例に記載のように単離され特徴付けられている。特異的なｃＤＮ Ａ配列は、本発明のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の範囲ならびにそれらの使 用方法から離れることなく例えば標識化、調節配列との融合、発現ベクターへの 挿入、および特定のアミノ酸をコードするヌクレオチドの置換または欠失により 、当業者に改変され得ることが理解される。

また、本発明の方法および組成物には、以下に記載の方法および薬剤が使用され 、これらは以下の限定されない実施例に示されている。

実施例で使用されており、本発明で使用されるのに好適なベクターライブラリー は、カリフォルニアのＣ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａ１ｏ 　Ａｌｔｏから市販され、または＋Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄＳｃｒｅ ｅｎｉｎｇ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｉｎ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｏ　 ａｎｄ　ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ”、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ 、ＤＮＡ　ＣＩｏｎｉｎ　（［ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ。

Ｅｎｇｌａｎｄ、　１９８５）Ｖｏｌ、　１．　ｐｐ、　４９−７９に記載のよ うに周知の方法に従い調製され得る。Ｍ、Ｄ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｈｏ５ｐｉｔ ａｌ　ａｎｄ　Ｔｕｍｏｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅから入手したλｇｔｌｌヒト胎 盤発現ライブラリーが、本発明の実施例において使用された。このライブラリー は、λｇｔｌ　１フアージのＥｃｏＲＩ部位にクローンされた５００塩基対（ｂ ｐ）にわたる二本鎖ｃＤＮＡを含む。

このライブラリーから単離された遺伝子は、ヒト胎盤λｇｔｌｌライブラリーか らの２Ｘ１０’のファージを、Ｅ、ｃ。

Ｌ土　Ｙ１０９０に、１５０ｍｍのし寒天プレート当り５×１０５プラークの密 度で蒔き、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加 して発現を誘導させることにより、発現させ得る。Ｅ、ｃｏｌｔ　Ｙ１０９０は 、次のものを歯色する：培地にＩ　ＰＴＧを添加することにより抑制が解けるま でＩａＣＺに制御される遺伝子の発現を防止するｌａｃリブレ、サー；組換え融 合タンパク質の安定性を起こすファージの突然変異を抑制するための１１１旦。

特定の組換え体が産生ずる、宿主に有害な融合タンパク質が、ライブラリーの特 定のメンバーの増殖を阻害しないようにするため、プラークの形成は！ａｃＺ遺 伝子プロモーターからの発現なしに開始される。プラークを取り巻く感染細胞の 数がピンサイズになった後、１ａｃＺに制御される遺伝子の発現が、ＩＰＴＧの 添加により開始される。プラークからのタンパク質の産生は、ＩＰＴＧの存在下 で４２℃で一晩インキユベートすることにより誘導される。

ライブラリーに見いだされる配列群を均整に発現させるため、配列を有するベク ターは、必要な数のみがプレートされるのが好ましい。このことは、Ｇｅｎｅ旦 Ｌカニし至■ＥＬＥＬ、　Ｖｏｌ　、　１　（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９１Ｎ）の方法に従い達成される。

目的のタンパク質を検出するため、寒天プレート中の発現されたタンパク質にフ ィルターを接触させ、タンパク質がフィルターに付着するようにする。フィルタ ーはプレハイブリダイズして、フィルターに抗体が非特異的に結合しないように する。次にフィルターを、標識抗体溶液中でインキュベートし、そしてオートラ ジオグラムを行う。抗体と複合体を作るタンパク質をコードするＤＮＡは、マー クされたオートラジオグラムを寒天プレート上に載せることにより同定される。

ＳＰＩタンパク質に対する抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ　ｏｆ　Ｓａｎ　Ｄｉｅ ｇｏ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから市販されている。この抗体はウサギで作成され、他の 胎盤性タンパク質を用いて吸着させ、およびアフィニティーで精製される。抗体 （１００〜１５０μｇ）は、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ、 Ｃｏ、社のヨードゲン（１゜３、　４．　６−テトラクロロ−３α、６α−ジフ エニルグリコウリル）およびＩＭトリスＨＣＩ、ｐＨ８，０の存在下に、１　ｍ 　Ｃｉの１２５１で標識される。

ＳＰＩタンパク質抗体は、ＳＰＩタンパク質から選択されるメンバーまたはメン バーの断片であるタンパク質に結合し得る。抗体タンパク質複合体は、標識され た抗体の放射活性を検出するオートラジオグラフィーにより確認される。次にオ ートラジオグラムを、初めにタンパク質の付着を行ったフィルターの位置と同じ 位置の寒天プレート上に配置する。このようにして、マークされたタンパク質を 産生ずる挿入片を含むファージが確認され得る。

適当なファージが確認されたら、これらのファージを含むＥ、ｃｏｌｉのコロニ ーを寒天から切り出し、０．５ｍｌのし一ブロスの入ったミクロフユージ管に入 れる。懸濁液をポルテックスで攪拌して寒天を粉砕し、ファージをＥ、ｃｏｌ± コロニーから遊離させる。ファージを含むＬ−ブロスの上清部分を、１５０ｍｍ のし寒天プレート当り５Ｘ１０’プラークの密度でＥ、ｃｏｌｉ　Ｙ１０９０に 再び蒔く。ファージを分散し、ファージ内に含有されるＤＮＡにより発現される タンパク質を抗体により処理し、および目的のＤＮＡ断片を有するファージを確 認する上記の方法を、寒天プレート中の全てのファージが、抗体と反応するタン パク質を発現するＤＮＡを含むようになるまで、繰り返す。２０ｍＭの塩化マグ ネシウムを含有する１０ｍＭのトリスＨＣＩ溶液、ｐＨ７゜５を寒天プレートに 加え、２時間ファージを寒天から溶液中に拡散させる。次にファージを含有する 溶液を、寒天プレートから取り出す。

ｃＤＮＡのスクリーニング法は、ＤＮＡハイブリグイゼーションを促進する条件 下で、オートラジオグラムを放射標識されたＤＮＡプローブに曝すことにより行 われる。ＤＮＡプローブは、ＳＰＩファミリーの関連タンパク質から選択される メンバーをコードするヌクレオチド配列の、少な（とも一部に相補的なヌクレオ チド配列により特徴付けられる。

酵素および化学薬品： Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポソメラーゼｌおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼは、 Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄ ｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮから購入した。ＤＮＡ５ｅｌはＰｈａｒｍａｃｉａ 、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪから購入した。全ての制限酵素は、Ｂｅｔｈ ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ、ＭＤまたはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ　ｌａｂ、　Ｂｅｖｅｒ　 ｌｙ、　ＭＡから購入した。ラムダソルブファージ吸着剤はＰｒｏｍｅｇａ　Ｂ ｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｆから購入した。ファージラムダマ、ノピング クインクキットはＣｏｌ　１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｉｎｃ 、　。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡから購入した。ライブラリーのスクリーニングのための ナイロンフィルター、およびα、γ３２ｐデオキシヌクレオチドを含む放射性化 学物質はＡｍｅｒｓｈａｍ、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬから購 入した。ニトロセルロースフィルターは５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ ｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨから購入した。高度に精製されたヒト胎盤ゲノムＤＮＡ はＳｉｇｍａ、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。他の全ての化学薬品は、 試薬または分子生物学的グレードのものである。　（以下余白） 実施例１：細胞質形態の胎盤ＳＰ１をコードするｃＤＮＡの単離および特徴付け Ｈｕｍａｎ　Ｒｅ　ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　３（５）、　６７７−６８５　（１９ ８８）においてＣｈａｎらが記載するように、ＳＰ１タンパク質をコードするｃ ＤＮＡのクローンは、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを初めにＳＰＩタンパク質 抗体、次いで部分的ＳＰＩ　ｃＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすること によって得られた１５個の陽性クローンの群から単離した。

ｃＤＮＡ挿入を、ＥｃｏＲ［による完全および部分的消化によってλｇｔ１１ベ クターから取り出し、Ｍ１３ｍｐｌＢおよびＭ１３ｍｐ１９にサブクローン化し た。１．　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ−ＤＯｗら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　Ｓ、７ ５４−７６５　（１９８７）に記載の５０°Ｃでクレノー断片または３７０Ｃで オノ＼イオ州クレーブランドのＵＳＢから得られたシクエナーゼを使用して、ジ デオキシ鎖終結法の変法によってＤＮＡ配列を決定した。Ｍ１３普遍配列決定プ ライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓ ｅｙ）および合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して配列決定反応をプラ イムした。全ての配列を、３つ以上のＭ１３サブクローンから３回以上決定した 。Ｊ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｌ０ ＩＣ，ｐｐ、２０−７７、Ｒ，Ｗｕら編集（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８３）に記載のように、Ｃ−テストによって確認された 逆方向のサブクローンを配列決定し、最終的に配列が両ストランドから決定され るようにした。Ｈ，Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１ ２．３８７−３９５　（１９８４）に記載のように、ライスコンシン大学の遺伝 学コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃ ｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ）によって、ＤＮＡ配列を分析 した。

各クローンを、サザンプロット分析し、大きさを分類し、３つの群の１つに分類 した。ＤＮＡをＥｃｏＲｌで完全に消化した。

Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０９．１２３−１２９　（１９８０）にＳｍ １ｔｈが記載するように、この消化されたＤＮＡ断片を、Ｉ　Ｘ　ＴＡ緩衝液（ ４０ｍＭ）リス塩基、２０　ｍＭ酢酸ナトリウム、１８　ｍＭ塩化ナトリム、１ 　ｍＭ　ＥＤＴＡニナトリム、ｐＨ８，０）中の１％アガロース上で電気泳動法 によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移した。Ｂｉｏｃｈｅ扛■■２ １．３２３７−３２４４　（１９８３）に、Ｒｉｘｏｎらが記載のように、プロ ットを、ニックトランスレーションによって予め３２ｐで標識されたｃＤＮＡ挿 入を用いて分析した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、Ｋａｎ、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａ　７５、５６３１−５ ６３５　（１９７８）に記載の通りであった。ハイブリダイゼーションおよび洗 浄には、フィルターの製造業者によって推薦されるように、非常に緊縮な条件が 使用され、２　Ｘ　ＳＳＣを使用して６５’Ｃで１５分間を繰り返し、０．１％ ドデシル硫酸ナトリウムを含有する２　Ｘ　ＳＳＣを使用して６５０Ｃで３０分 間、および０゜１　ｘ　ＳＳＣを使用して６５’Ｃで１０分間で行った。これら の条件下では、相同性の高いｃＤＮＡのみが同定される。ニトロセルロースの代 わりにナイロンフィルターを使用した際には、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　 １９８５）によって推薦されるように、手法を変更した。ナイロンプロットを、 ２　Ｘ　ＳＳＣ（０，３Ｍクエン酸ナトリウム、０．３Ｍ塩化ナトリム）を使用 して６５’Ｃで１５分間を２回、０．１％ＳＤＳを含有する。、ｔ　ｘ　ｓｓｃ を使用しテロ５ｏＣテ３０分間を２回、０．１　ｘ　ＳＳＣを使用して６５’Ｃ で３０分間を１回で洗浄した。

ゲノムＤＮＡ分析のために、ＥｃｏＲＩ、シュＨ１およびも但旧／−ｄｌ１１で 予め消化されたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを、０ｎｃｏｒ、Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈ ｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤから購入した。１２マイクログラムの各タイプのＤＮＡ を、０．８％アガロースを通じて電気泳動法によって分離し、サザンプロットし た。

クローンを３つのグループに分けた。グループ１のクローンは、内部にＥｃｏＲ １部位を含有しないｃＤＮＡ挿入を有しており、その長さは、１７２０　ｂｐ　 （塩基対）よりも短かった。ｈＰｓ１２＋よ、その代表的なりローンである。グ ループ２のクローンζよ、内部にＥｃｏＲ１部位を１つ含有するｃＤＮＡ挿入を 有しており、その長さは、６２２および１３３６　ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を含め て１９５８　ｂｐより短かった。ｈＰｓｌｌは、その代表的なりローンである。

グループ３のクローンは、内部にＥｃｏＲ１部位を２つ含有するｃＤＮＡ挿入を 有しており、その長さは、４５０．６４５および１１２０　ｂｐのＬ遼Ｒ１断片 を含めて２２１５　ｂｐより短い。ｈＰＳ２が、その代表的なりローンである。

内部にＥｃｏＲ１部位を有さないクローンは、全長より短しＸため、それらの制 限酵素マ・ノブまたはヌクレオチド配列（二基づ（Ａて適切なグループに割りあ てた。非常に緊縮な条件下での、これら３つのすべてのグループのｃＤＮＡ挿入 とプローブとのハイブリダイゼーシコンは、これらのｃＤＮＡ挿入がＳＰＩプロ ーフ（二対して相同性が高いことを示した。

グループ２における６つのクローンのｃＤＮＡ挿大のヌクレオチド配列を、Ａｍ ｅｒｓｈａｍ　（１９８５）のクローニングおよび配列マニュアルに記載される ように、サンガーのジデオキシ鎖終結法によって決定した。ＤＮＡ配列を、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．６０５−６１４　（１９８４）に記 載されているコンピュータープログラムによって分析した。胎盤組織において発 現されるｈＰｓｌｌのヌクレオチド配列を、第２図中、下部の列に示す。ｈＰｓ ｌｌのペプチド配列は、第２図中、上部の列に示されており、ここで、各アミノ 酸残基は、それをコードするＤＮＡ塩基の配列のすぐ上部に置かれている。

Ｃｈａｎら、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅ　ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　３（５）、６７７−６８ ５　（１９８Ｂ）に従って調製された純粋なＳＰＩタンパク質の２つのトリプシ ン断片のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列は、ｈＰｓｌｌのコード配列におい て存在し、このｃＤＮＡと精製されたＳＰＩタンパク質との同一性を確立してい る。精製されたヒトＳＰ１タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）を、５０　ｍＭ重重炭酸 アンモニウム中ＴＰＣＫ　（Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロ メチルケトン）で処理したｉ＆終ｍＷ１０μｇ／ｍｌのトリプシンを用いて、ｐ ｎａ、３７°Ｃで１６時間インキュベートした。次いで、トリプシン断片を、逆 相Ｃ１８カラムを使用して、ＨＰＬＣによって分離し、０．０５％トリフルオロ 酢酸（ＴＦＡ）で平衡化した。ペプチドを、流ｆｉ１ｍｌ／分で８０分間、０か ら４０％のアセトニトリル勾配によってカラムから溶離した。１ｍｌの画分を収 集した。ペプチドピークを任意に選択し、同一カラム上でさらに精製するため濃 縮した。再クロマトグラフイーの手法は、次のようであった。流！１ｍｌ／分、 ０％のアセトニトリルで１０分間；流量１＋＋＋１７分、０％から２０％のアセ トニトリルで２０分間；流量０．５　ｍ１７分、２０％のアセトニトリルで６０ 分間。

任意に選択されたトリプシンペプチド”Ｂｏおよび“Ｃ”のアミノ酸配列を、Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　８２．３６１６−３６ ２０　（１９８５）に記載されるように気相シークエネーターにおいて、非タン パク質キャリアとしてポリブレンを使用して、Ｅｕｒ、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 １．８０−９１　（１９６７）にＥｄｍａｎおよびＢｅｇｇの記載する方法によ って決定した。約０．２から０．５　ｎｍｏｌのペプチドを、気相シークエネー ターにかけた。シークエネーターからのフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）誘 導体を、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１．１４３３５−１４３４１　（ １９８６）に記載されるように、Ｗａｔｅｒｓ　Ｎｏｖａ　Ｐａｋ　Ｃ１８カラ ムを使用してＨＰＬＣによって同定した。内部標準として、各サンプルにフルロ イシンを加えた。すべてのＰＴＩＩ誘導体を、２６５　ｎｍのセリンおよび３１ ３　ｎｍのトレオニンでそれぞれモニターした。これらの配列は、図２において 、四角で囲んでいる。

ｈＰｓｌｌ　ｃＤＮＡは、７３　ｂｐの５°非コ一ド配列、および４７．２　ｋ Ｄａの算出分子量を有する４１９個のアミノ酸タンパク質をコードするオープン リーディングフレームを含んで１９５８　ｂｐである。上流停止コドンは確認さ れ得ないが、推定翻訳開始コドンＡＣＣＡＴＧＧ周辺の配列は、Ｍ、　Ｋｏｚａ ｃｋ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１５：　８１２５−８１４８　（１９ ８７）によって示唆されるを推動物における翻訳開始のためのフンセンサス配列 と一致する。純粋なＳＰＩタンパク質のアミン末端分析は、Ｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−１ １ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ７Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｔ−Ｇ ｌｕの配列を示し、これは、Ｇ　１　ｕ−４１およびＴｈｒ−４３を除いてｈＰ ｓｌｌの３７番目から４７番目の推定アミノ酸に対応する。これらの相違の理由 は、大多数のＳＰ１タンパク質がブロック化されたＮ末端を有するため、この手 法では、Ｎ末端がブロック化されない少数のｓｐｔｇ製物のＮ末端配列が提供さ れるだけであることであり得る。配列分析ソフトウェアパッケージのＰＥＰＰＬ ＯＴコンピュータープログラムを用いた分析は、Ｇ、　Ｂｌｏｂｅｌら、らみて ３４から３５番目のアミノ酸が、疎水性コア、ヘリックスブレーカ−（Ｐｒｏ） および開裂部位の小さな不変アミノ酸（Ａｌａ）を有する推定シグナルペプチド の特徴を表すことを示した。

推定アミノ酸配列中にはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ構造をもつ７つの可能なＮ グリコジル化部位があり、図２において下線が付けられている。すべての可能な グリコジル化部位は、Ｎ末端からみてタンパク質の４分の３以内に存在する。Ｂ 、　Ａ、　Ｊａｍａｓｏｎら、ｑ１士狙４：１８１−１８６　（１９８ｇ）のコ ンピューターアルゴリズムによる予想される二次構造の分析は、αヘワックス形 態であるＮ末端付近の２つの小領域（３５から５０番目のアミノ酸および１６０ から１７０７０番目ミノ酸）を除いて、タンパク質がβシート形態であることを 示す。ＰＥＰＰＬＯＴフンピユータ−プログラムによると、アミノ末端からみて １０個のアミノ酸を除いて、タンパク質の大半が疎水性であると判定することが できる。

アミン末端からみて１４３個のアミノ酸は、特徴的な二次構造を有すると同時に 、７つのグリコジル化部位のうちの３つの部位を含むタンパク質の特異的ドメイ ンを構成しているようである。ＲＥＰＥＡＴプログラムによる分析は、残りのタ ンパク質が、反復ユニットから構成されることを示す。２つの内部反復があり、 それぞれ２７９　ｂｐで、９３個のアミノ酸をコードしている。Ｒｌｎは、５０ ３０３番目クレオチド（Ｌｅｕ−１４４）から始まり、７８１８１番目Ｌｅｕ− ２３６）まで続＜ｏ　Ｒ２ｎは、７８２８２番目クレオチド（Ｐｒｏ−２３７） から始まり、１，０６０６０番目Ｌｅｕ−３２９）まで続く。

これらの２つの反復は、７３％のヌクレオチドおよび４８％のアミノ酸について 同一である。３つのグリコジル化部位を有する第２反復に対して、第１反復には １つの可能なグリコジル化部位しか存在しない。これらの反復のグリコジル化部 位は、保存されていない。反復における２つのシスティン残基は保存され、これ らは、各々のドメイン中でアミノ酸４７個だけへだてられている。ＰＥＰＰＬＯ Ｔプログラムによる推定アミノ酸配列の分析を行うと、第２反復は、第１反復よ りも親水性が高いことが示される。

内部反復の後、停止コドンＴＧＡの前に９０個のアミノ酸が存在する。Ｒ２ｃと 名付けられたこの領域は、１，０６１６１番目クレオチド（Ｔｙｒ−３３０）か ら始まり、１．３１５１５番目ｅｒ−４１４）まで連続し、グリコジル化部位を 有さない。３９個のアミノ酸だけへたたった２つのシスティン残基が存在する。

停止コドンに次いで６５５　ｂｐの３°非コ一ド配列がある。

実施例２：見かけ上、膜結合型の胎盤特異的ＳＰＬをコードするｃ　ＤＮＡの単 離および特徴付は 胎盤中のみで発現され、２つの内部のＥｃｏＲ１部位を含むクローンｈＰＳ２を 、実施例１に記載のように、配列決定し、特徴付けた。このクローンは、５′コ 一ド配列が不完全な、部分ｃＤＮＡを示した。さらに５゛配列を得るために、ｈ ＰＳ２の最も５°側のヒｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をプローブとして使用して、同 一のｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングした。さらに５′配列は発見され なかった。

ｈＰＳ２のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を図３に示す。

これは、３５１個のアミノ酸をコードする１、０５３　ｂｐのオーブンリーディ ングフレームと、停止コドンＴＧＡと、および２９　ｂｐのポリ（Ａ）尾部から １４　ｂｐ上流のポリアデニル化シグナルＡＴＴＡＡＡを含む６５９　ｂｐの３ °非コ一ド配列とを含めて１，７４４　ｂｐを有している。

ｈＰｓ２によってコードされるペプチドは、ｈＰｓｌｌおよびｈＰｓ１２と比較 して、ヌクレオチドレベルで９１．２％相同でアミノ酸レベルで８２．２％相同 な、９２個のアミノ酸を含むＮ末端ドメインの部分を含む。３つのグリコジル化 部位のうち２つもまた、保存されている（コードされたタンパク質中に全部で５ つの可能なグリコジル化部位が確認され得る）。９３個のアミノ酸を含むＲ１ｎ サブドメインは、ヌクレオチドレベルで９１．３％相同であり、アミノ酸レベル で８２．３％相同である。ｈＰｓＬｌのＲｌｎと比較すると、グリコジル化部位 とシスティン残基の位置が両方とも保存されている。Ｃサブドメインは、８１個 のアミノ酸を有する。

ｎサブドメインにおけるように、ヌクレオチドレベルで９１．３％の相同性があ り、アミノ酸レベルで９２．３％の相同性がある。グリコジル化部位は保存され ないが、システィン残基は保存されている。しかし、Ｃサブドメイン以降には相 同性は見られない。

ｈＰｓｌｌおよびｈＰＳ２の２つのｃＤＮＡＱ間の重要な相違点は、それらのＣ 末端領域の疎水性である。ｈＰｓｌｌのコードされたタン７　＜り質の二次構造 は、ＰＥＰＰＬＯＴプログラムによって予想されるように、タンパク質の大半が 親水性であることを示し、このことは、このフードされたタンパク質が膜タンノ くり質ではないことを意味する。唯一の疎水部分は、シグナルペプチドに対応す る、Ｎ末端からみて３４から３５番目のアミノ酸である。ｈＰＳ２の疎水性Ｃ末 端領域は、ＣＥＡおよびいくつかの免疫グロブリンを含む多数の膜結合タンパク 質の膜アンカー領域に匹敵する。

遺伝学コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージとして入手可 能なプログラムを使用した、二次構造の予想はまた、タンパク質が主としてβシ ートの形態であることを示す。

実施例３：第３タイプの胎盤特異的ＳＰＩをコードするｃＤＮＡの単離および特 徴付け。

図４は、ｈＰＳ１２のヌクレオチド配列、およびコードされたアミノ酸配列であ る。このクローンは、内部のＥｃｏＲ１部位を含まないことによって特徴付けら れる、胎盤特異的ＳＰｌ様タン１＜り質の「グループｌ」の代表として実施例１ に記載されるクローンである。オープンリーディングフレームは、３９５個のア ミノ酸をコードし、停止コドンおよび２５２　ｂｐの３°非コ一ド配列を有する 。ｈＰＳ１２は、胎盤においてのみ検出された。

このクローンはまた、５°コ一ド配列が不完全な、部分ｃＤＮＡのみを示した。

さらに５°配列を得るために、ｈＰＳ１２の最も５゛側のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片をプローブとして使用して、ｃＤＮＡライブラリーを再スクリーニングし た。ｈＰＳ１２よりも５゛側の配列を有する２つのクローン、ｈＰＳ８９および ｈＰＳ９０を同定した。複合されたｃＤＮＡは、４５　ｂｐの５°非コ一ド配列 、４７．５ｋＤの算出分子量を有する４２４個のアミノ酸をコードする１２７２ 　ｂｐのオープンリーディングフレーム、停止コドンＴＡＡおよび２５３　ｂｐ の３°非コ一ド配列を含めて、１５７３　ｂｐを有する。上流の停止コドンは確 認され得ないが、推定翻訳開始コドンＡＣＣＡＴＧＧ周辺の配列は、Ｋｏｚａｋ 、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１５．８１２５−８１４８　（１９ ８７）によって示唆されるように、を推動物中の翻訳開始のためのコンセンサス 配列と一致する。配列決定されたｈＰｓ１２クローンのいずれにも、ポリ（Ａ） 尾部は発見されなかった。２つがＡｓｎ−Ｘ−５ｅｔおよび６つがＡｓｎ−Ｘ− Ｔｈｒである、８つの可能なグリコジル化部位が存在する。コードされたタンパ ク質は、ｈＰＳ２以外の報告されたすべてのＳＰ１タンパク質の特徴であるよう に、Ｎ末端ドメイン、２つのｎサブドメインおよび１つのＣドメインを含み、各 々は、２つの保存されたＣｙｓ残基およびＣ末端ドメインを含む。

遺伝学コンピューターグループの配列分析ソフトウェアパッケージによる二次構 造の予想は、ｈＰＳ１２によってコードされたタンパク質が、主としてβシート の形態であることを示す。

ＰＥＰＰＬＯＴプログラム（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏ　 ｈ　ｓ、Ｃｈｅｍ。

１５、３２１−３５３　（１９８６））およびＰＬＯＴＳＴＲＵＣＴＵＲＥプロ グラム（Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ、　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、４７．　１４５−１４７　（ １９７８））は両方とも、ｈＰＳ１２が、Ｎ末端アミノ酸を除いて大部分親水性 であることを示した。Ｎ末端から３４から３５番目のアミノ酸は、ｈＰｓＬＩＧ こお（Ｘて観察されたように、推定シグナルペプチドの特性を有する。

ｈＰＳ２におけるようにｈＰＳ１２のＮ末端ドメインは、疎水性である。

ｈＰＳ１２、ｈＰＳ　１１およびｈＰＳ２のドメイン構造の比較（よ、ｈＰＳ１ ２力（、ｈＰｓｌｌに非常に類似していることを示す。５ＰｓＬ２とｈＰｓｌｌ の問答こは、アミノ酸レベルで９０．６％の相同性、ヌクレオチドレベルで９３ ．７％の相同性がある。システィン残基およびグリコシルイヒ部位の大半は、保 存されている。ｈＰＳ１２およびｈＰｓ１１ζ家両方とも、余分なｎサブドメイ ンを有し、疎水性Ｃ末端ドメインを有さないことで、ｈＰＳ２とは異なる。

実施例１から３は、少なくとも１つの膜結合タンノくり質および１つの細胞質ま たは分泌タンノくり質を含む、多種類の３μ常に相同性の高いＳＰｌ様タンノく り質がヒト胎盤中（こ存在することを示す。

実施例４：精巣および胎盤起源の細胞で発現されるＳＰＬ様タンパク質ヲコード するｃＤＮＡの単離および特徴付Ｉｆヒト精巣中のＳＰＩの存在を、抗胎盤ＳＰ Ｉ抗体を用（Ｘた精巣ホモジェネートのウエスタッフ゛ロット（こよって示した 。ヒト月台盤抽出物に観察されるように、？２　ｋＤａおよび６１．５ｋＤａに 対応する２つの主なハイブリダイゼーシゴンバンドの代わりに、精巣ホモジェネ ートは、４７　ｋＤａに対応する１つの弱（ハイブリダイズするバンドしか示さ ない。精巣中のＳＰＬの存在を、プローブとして標識された胎盤ＳＰＩ　ＣＮＡ を用いてノーザンブロ、。

ト分析によってさらに確認した。プローブとして胎盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡを用いヒ ト精巣ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすると、制限酵素地図に従って４ つのグループに分割され得る１７個の陽性クローンが得られた。

手法は、次のようであった。ＳＰＩの部分ｃＤＮＡクローンであるλｈＰＳ３を 、ヒト胎盤ライブラリーから単離した。ヌクレオチド配列を図５に示す。λｈＰ Ｓ３　ｃＤＮＡは、５°非翻訳配列およびヒト５Ｐ１ＯＮ末端の４８個のアミノ 酸を含む。Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ： 　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｐｐ、　１６７、１７３−１７７ ゜１８４　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。

ｒ、　ＮＹ　１９８２）の方法に従って、Ｍ１３ｍｐ１８にサブクローン化され たこのｃＤＮＡ挿入を、ＥｃｏＲＩを用いて組換え体ファージから取り出し、３ ．５％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動法によって分画し、電気溶離法に よって回収した。Ｍ、　Ｗ、　Ｒｉｘｏｎら、旦比堕」山匹■２２．３２３７− ３２４４　（１９８３）の方法に従って、それぞれ、１５μｃｉの（ａ−３２Ｐ ）の存在下で、ＤＮａｓｅ　ｌおよびＤＮＡポリメラーゼ１を用い、ニックトラ ンスレーションで標識した。

ニックトランスレーションされたプローブは、ＡｃＡ　５４カラムを通して脱塩 し、使用前に変性した。

グループ１は、λｈＴＳ２およびλｈＴＳ３の２つのクローンを含む。ポリアク リルアミドゲル電気泳動およびヌクレオチド配列分析によりｃＤＮＡ挿入の大き さを調べると、両方のクローン共に約ｓｓｏ　ｂｐであり、図２に示される、胎 盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡ　ｈＰｓｌｌの、４３３から９１０番目までのヌクレオチド 塩基と同一である。

これらのクローンは、内部のＥｃｏＲ１部位を含まない。

グループ２は、ｈＴｓｌ、ｈＴＳ７およびｈＴｓｌ３の３つのクローンからなる 。このグループのｃＤＮＡ挿入は、内部ＥｅｏＲ１部位を含む。

３゛７５０　ｂｐの最も長いｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片である、ｈＴｓｌの配列 を分析すると、ｈＰｓｌｌの１３３２から１９３０番目までのヌクレオチド塩基 と９５．９％の相同性を有することが示される。ｈＴｓｌ　（ｈＴｓＩＬ）の３ ’　ＥｃｏＲｌｌｒ片のヌクレオチド配列を、ｈＰｓｌｌのヌクレオチド配列と 比較して、図６に示す。５’ＥｃｏＲＩ断片は、グループ１およびグループ２の クローンが、対立遺伝子産物であることを示しているようである。

グループ３は、ｈＴＳ５．　ｈＴＳ６およびｈＴＳ９の３つのクローンからなる 。これらのクローンの配列を分析すると、Ｒｏｏｎｅｙら、Ｇｅｎｅ　７１．４ ３９−４４９　（１９８８）によって報告された胎盤ＳＰＬ　ｃＤＮＡの１つで ある、ｐｓＰｌ−ｉと同一であることが示される。

グループ４は、９つのクローンからなる。このグループの５つのｃＤＮＡ配列を 決定した。それらのヌクレオチド配列は、同一である。最も長いクローンである 、ｈＴｓｌ６のヌクレオチド配列を、可能なグリコジル化部位、保存されたシス ティン残基およびエクソン／イントロンとドメイン領域の境界と共に、図７に示 す。ｈＴｓｌ６は、１９５７　ｂｐを有し、ＳＰ１遺伝子の不完全にスプライシ ングされた生産物のようである。ＩＶＳＩおよびｌＶＳ２としてマークされた配 列は、既知のＳＰＩ　ｃＤＮＡ配列とは相同性をもたず、スプライシングされな かったイントロンのようである。コード配列内（１，３１４１４番目、３１５１ ５番目ヌクレオチド塩基の間）にはまた、１６１　ｂｐの欠失がある。ｈＴｓｌ ６の推定イントロンおよび欠失は、異なるドメインの境界間で発生する。

これは、０ｉｋａｖａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｔ 　１５６．　６Ｂ−７７（１９８８）によって異なるＳＰ１遺伝子中のイントロ ンの位置に関して観察されたものと同様である。Ｎ、　Ｒｌｎ、　Ｒ２ｎ、　Ｒ ２ｃおよびＣでマークされた配列の断片および停止コドン以降の配列は、グルー プ３のクローンの配列と同一であり、ｐｓＰｌ−ｉと同一のタンパク質をコード する。

実施例５　：　ＨｅＬａ細胞および造血細胞中で発現されたＳＰｌ様タンパク質 をコードするｃＤＮＡの単離および特徴付けｈＰＳ３プローブを使用したＨｅＬ ａ細胞ライブラリーのスクリーニングにより、ポリアクリルアミド電気泳動法に よって示されるように、大きさが６３０から９５０　ｂｐの範囲であるｃＤＮＡ 挿入を有する１０個の陽性クローンが得られる。サザンプロット分析は、ＨｅＬ ａ細胞クローンが、胎盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡに対して相同性が高いことを示す。Ｈ ｅＬａ細胞ｃＤＮＡクローンの１つである、ｈＨＳ２のヌクレオチド配列を決定 した。

図８は、ｈＨｓ２のヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸を示す。ｈｌ （Ｓ２は、２４８個のアミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含 めて７５６　ｂｐ有する。ヌクレオチドレベルおよびタンパク質レベルで各ドメ インについて、ｈＰｓｌｌおよびｈ）ｌｓ２を並べると、ｈＨＳ２　ｃＤＮＡが 、ｈＰｓｌｌのＮ末端ドメイン、第１内部反復および第２反復の部分を含むこと が示される。ｈＰｓｌｌにおける対応ドメインに対する相同率は、ヌクレオチド レベルにおいて、それぞれ、９２．５．９５．０および９２．７であり、アミノ 酸レベルにおいて、それぞれ８７．１．８８．２および９４である。システィン および可能なグリコジル化部位の位置は、ｈＰｓｌｌおよびｈＨｓ２中で保存さ れる。

ＳＰＩ　ｍＲＮＡは、異なる造血細胞においてもまた同定された。

異なるＳＰＩ遺伝子の発現は、系列特異的のようである。培養物細胞を、１０　 ｎｇ／ｍｌのフォルボール１２−ミソステート１３−アセテート（ＰＭＡ）　（ Ｐ）、５μｇ／ｍｌのりポポリサッカリド（ＬＰＳ）（Ｌ）、１００　Ｕ／ｍｌ のインターフｘｏンー７　（ＩＦＮ−７）　（７）またはＬＰＳとＩＦＮ−γ（ Ｌ、γ）との組合せによって、４時間刺激した。ノーインプロット分析により、 刺激されていない細胞（Ｃ）中にハイブリダイズするｍＲＮＡの存在が示され、 ＫＧ−１系（骨髄単球性）中の２．４ｋｂのバンドおよびＨＥＬ系（白血球系） 中の３４ｋｂのバンドがハイブリダイズした。ＬＰＳおよびＩＦＮ−γによる刺 激は、４時間にわたるＫＧ−１中のＳＰＩ　ｍＲＮＡ発現にほとんど影響しない 。しかし、ＬＰＳとＩＦＮ−γを組み合わせると、Ｉ（ＥＬ中でのＳＰＩ　ｍＲ ＮＡ発現を数倍に増加させる。この結果は、造血細胞でＳＰＩ遺伝子の発現する こととＳＰＩ遺伝子の状況によって変わる発現との両方を、初めて示す。

実施例６：腸起源の細胞で発現されるＳＰｌ様タンパク質をコードするｃＤＮＡ の単離および特徴付は 実施例５に記載の手法を使用して、ヒト腸ｃＤＮＡライブラリーをｈＰｓ３でス クリーニングした。２１個の陽性クローンを同定した。制限酵素による分析は、 これらのクローンが４つの主要グループに分割され得ることを示した。これら４ つのクローンは、１つの内部の除土Ｒ１部位を有する。ポリアクリルアミドゲル 電気泳動法は、このグループの中で最も長いクローンである旧Ｓ１が、ＥｃｏＲ Ｉによって消化されると、１．１ｋｂおよび１．３ｋｂの２つの挿入断片を提供 することを示した。１７個のクローンは、内部にＥｃｏＲ１部位を有さないが、 内部にＸｂａ１部位を１つ含む。このグループの中で最も長いクローンは、１． ｓ　ｋｂのＣＤＮＡ挿入を有するｈｌｓ３である。他の３つのグループは、内部 Ｘｂａｒ部位を含まず、胎盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡの３つのグループと同様の制限酵 素地図を含む。第１グループのクローンｈｌｓｌおよびｈｌｓｌのより小さなＥ ｃｏＲＩ断片を配列決定した。これら２つのクローンのｃＤＮＡ挿入は、同一で ある。

図９は、ｈｌｓｌのヌクレオチド配列およびコードされたアミノ酸を示す。ｈｌ ｓｌは、６１　ｂｐの５゛非翻訳配列と、９６３　ｂｐのオープンリーディング フレームを含めて１，０２４　ｂｐを有する。このオープンリーディングフレー ムは３４個のアミノ酸の可能なシグナルペプチド、１０７個のアミノ酸のＮ末端 ドメインおよび９３個のアミノ酸のｎサブドメインおよび８５個のアミノ酸のＣ サブドメインからなる完全な反復ユニットをコードする。ｈｌｓｌおよびｈＰｓ ｌｌの対応するドメインの比較は、２つのｃＤＮＡ間の相同性％が約７４．５で あり、ｎサブドメイン間で最も相同性が高く　（７９，３％）およびＣサブドメ イン間で最も相同性が低い（６８４％）、ことを示す。２つのｃＤＮＡのコード されたアミノ酸配列の相同性％は、約５７．４であり、ｎサブドメイン間で高く 、Ｃサブドメイン間で低い。

実施例７：妊娠特異的β−１糖タンパク質（５ＰＩ）のメンバーの比較 実施例１から３に記載のように、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、 クローンを同定し、制限地図を作った。

部分制限地図を構築すると、特定のゲノムクローンに少なくとも７つのグループ の存在することが示され、このことから複数の遺伝子がＳＰＩをコードすること が示唆された。染色体ＤＮＡドツトプロットでさらに分析すると、Ｘ染色体およ び常染色体６の相同な配列の存在が示された。

標識されたｈＰＳ２およびｈＰＳ３　ｃＤＮＡの混合物を使用してＳＰＩ遺伝子 の位置を決めるのに使用される方法および材料は、匠、１（ｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、 　４３．１５２−１５９　（１９８８）においてＣｈａｎらによって報告される 通りであった。

すべてのＳＰＩ　ｃＤＮＡのコードされたアミノ酸配列を比較し、これを使用し て、図１１に示されるコンセンサス配列を得た。

アミリコード領域のコンセンサス配列を得る時に、ｈＰｓｌｌ、ＰＳＧｌＢ、Ｐ ＳＢＧＣおよびＰＳＢＧＤは、コード配列がほぼ同一であり、これらが同一遺伝 子からつくられる可能性から、１つの二ニットであると見なした。アミノ酸また はヌクレオチドは、もしそれが、クローンｈＰｓ１２．　ｈＰＳ２．　ＰＳＢＧ Ｅ、　ｐｓＯｌ−ｉおよびｈＰＳ　１１／ＰＳＧ１６／ＰＳＢＧＣ−Ｄのうちで 少なくとも３回発生するならばコンセンサスであると見なす。すべてのｃＤＮＡ は、比較領域において高い相同性を示した。コンセンサスアミノ酸配列との相同 性％は、わずか８５．９′％の相同性しか示さないｈＰＳ２のＮ末端ドメインを 除き、Ｎ末端ドメインおよびｎサブドメインにおいて９２．５から１００％の範 囲であった。Ｃサブドメインの間の相同性のレベルは、他のドメインよりもわず かに低く、８５．９から９７．６％の範囲である。Ｎ末端ならびにｎとＣサブド メインのヌクレオチド配列相同性は、アミノ酸配列に類似であり、９０から９９ ％の範囲である。これに対して、これらのｃＤＮＡのＣ末端ドメインのアミノ酸 配列およびヌクレオチド配列は、次の２つを例外としてほとんど配列相同性を共 有しない：　ｈＰｓＩＬとＰＳＢＧＤのＣ末端ドメインは同一であり、ＰＳＧｌ Ｂの３°非コ一ド配列は、コード領域の３°末端付近の８６　ｂｐの欠失を除い てｈＰＳ　１１の配列と同一である。

すべてのｃＤＮＡのｎおよびＣサブドメイン中のシスティン残基の位置は保存さ れている。Ｎ末端ドメインおよびＲ１ｎサブドメインにおける可能なグリコジル 化部位の位置もまた保存されている。

ヒト胎盤ＳＰＩ　ＤＮＡによってコードされた配列アミノ酸配列の比較により、 ｈＰＳ１２は、Ｎ末端ドメイン中の！、１ｅ−９０をコードする３つのヌクレオ チドを欠失していることで、他のＳＰＩ　ｃＤＮＡとは異なることが示される。

この比較はまた、ｈＰＳ１２とｐＳＰｌ−１は互いに異なると共に、他のＳＰＩ 　ｃＤＮＡとも異なることを明確にする。再び、ｈＰｓｌｌおよびＰＳＢＧＤは 同一である。ＰＳＧｌＢは、コード領域における４つの位置を除いてｈＰｓｌｌ と同一であり、その結果、３つのアミノ酸の変化、３′非コ一ド配列におけるＧ からＣの突然変異およびコード領域の３°末端付近の８６　ｂｐの欠失が生じる 。ＰＳＢＧはまた、Ｃ末端ドメインを除いてｈＰｓｌｌおよびＰＳＢＧＤと同一 である。

ｈＰＳ２およびＰＳＢＧＥは両者共、他のＳＰＩ　ｃＤＮＡと比較するとｎサブ ドメインが１つ少ない。ｈＰＳ２およびＰＳＢＧＥのｎサブドメインは、Ｒ２ｎ サブドメインよりもＲ１ｎサブドメインに類似する。ｈｐＳ２およびＰＳＢＧＥ について、Ｒ１ｎサブドメインコンセンサス配列に対する相同性％は、それぞれ ９３．５および９２．５であり、Ｒ２ｎサブドメインに対する相同性％は、５２ ．７および４８．４である。ｈＰＳ２およびＰＳＢＧＥのＣサブドメインは、他 のＳＰＩ　ｃＤＮＡのＣサブドメインよりも、コンセンサス配列に対して相同性 が低く、それぞれ８７．１％および８５．９％であり、他のすべてのｃＤＮＡは 、９０％よりも高い相同性を示す。ｈＰＳ２と他のＳＰＩとの最も重要な相違は 、他のすべてのＳＰｌが比較的短い（１４個以下のアミノ酸）親水性Ｃ末端しか 含まないのに対して、８１個のアミノ酸の疎水性Ｃ末端が存在することである。

いくつかのＳＰＩ　ｃＤＮＡの５°非コ一ド配列を比較すると、すべてのＳＰＩ 配列のうちで９１％より高い類似性が示される。３”非コード配列を比較すると 、より多様性が示される。ｈＰＳ２の３゛非コ一ド配列は、報告されたＳＰＩ　 ｃＤＮＡのいずれともほとんど相同性を有さない。一方、ｈＰＳ１２の３°非コ −−ド配列は、ＰＳＢＧＥおよびｐｓＰｌ−ｉの配列と非常に相同である。ｈＰ Ｓ１２、ＰＳＢＧＥおよびｐｓＰｌ−ｉのこの領域の５°末端における２７　ｂ ｐ、　３０　ｂｐおよび３９　ｂｐをそれぞれ除（と、３つのｃＤＮＡの中で９ ５％の相同性が存在する。ｈＰｓ１１’、　ＰＳＧｌＢおよびＰＳＢＧＤの３′ 非コ一ド配列は、ｈＰｓｌｌと比較した時のＰＳＧｌＢにおける停止コドン以降 のＴｏ　ｂｐの欠失と、ＰＳＧｌＢおよびＰＳＢＧＤの両方における１つのミス マツチとを除いて、はとんど同一である。

報告されたすべてのＳＰＩ　ｃＤＮＡは、１ｇ遺伝子スーパーファミリーに含有 されるために必要な特徴を示す。すなわち、配列の相同性、特徴的ドメイン構造 、ドメイン内で保存されたジスルフィド結合およびβシート構造である。

実施例１から６に示される事実は、ヒト胎盤中に多種類の相同性の高いＳＰＩタ ンパク質が存在し、ＳＰＩタンパク質が同義遺伝子群によってコードされること を示唆する。

実施例１から３に示される結果は、ヒト胎盤中のＳＰＩタンパク質が、３個以上 の遺伝子の生産物からなるという議論を裏付ける。２つの報告された胎盤ＳＰＩ 　ｃＤＮＡであるｈＰｓｌｌおよびＰＳＢＧＤは同一である。ＰＳＧｌＢおよび 他の部分的に配列決定されたｃＤＮＡ　ＰＳＧ９３は、４つの塩基においてのみ 、これら２つのｃＤＮＡと異なり、この相違は冬型性に相当し得る。はとんど同 一のタンパク質コード配列に基づくと、ｈＰｓｌｌ、ＰＳＧｌＢ、ＰＳＢＧ９３ 、ＰＳＢＧＣおよびＰＳＢＧＤは、Ｃ末端および３゛非コ一ド配列をコードする エクソンが、差別的にスプライシングされた、同一の遺伝子の生産物のようであ る。他の３つのｃＤＮＡである、ｈＰｓ１２、ＰＳＢＧＥおよびｐｓＰｌ−ｉは 、３′非コ一ド配列中に２２１　ｂｐを有し、これらは相同性が高い（９５％） 。このことが非コード領域において観察され、３つのクローンが、２つの異なる ライブラリーから誘導されることを考慮すると、はとんど違わない相違が個々の 多重性であると思われる。これら３つのｃＤＮＡは、異なるアミノ酸をコードす るエクソンを、３°非コ一ド配列を含む１つの共通エクソンにスプライシングし た生成物である。ｈＰＳ１２のＮ末端ドメインをコードするエクソンは、他のｃ ＤＮＡと比較すると、３　ｂｐが欠失しているので固有のものである。ＰＳＢＧ Ｅは、異なるスプライシングに起因し得る、１つのｎサブドメインの欠除によっ て、ｈＰｓ１２およびｐｓＰｌ−ｉとは異なる。ｈＰｓ１２／ＰＳＢＧＥ／ｐｓ Ｐ１−ｉをコードする遺伝子は、ｈＰｓ１１／ＰＳＧ１６／ＰＳＧ９３／ＰＳＢ ＧＣ−Ｄをコードする遺伝子とは異なり得る。他のＳＰＩ　ｃＤＮＡであるｈＰ Ｓ２は、独特のものである。これは、報告されたＳＰＩ　ｃＤＮＡのいずれとも あまり相同性を有さない。

ヒト胎盤における３つの異なる種類のｍＲＮＡの存在が、ノーインプロット分析 によって確認された。ｈＰｓｌｌの３°ＥｃｏＲＩ断片は、３°非コ一ド配列全 体を含み、このｃＤＮＡに対して特異性を有スル。ｈＰｓ１２のＮｃｏｌ−Ｅｃ ｏＲＩ断片は、Ｃ末端から２４　ｂｐのコード配列および３°非コ一ド配列を含 み、このグループのｃＤＮＡに対して特有のものである。ｈＰＳ２のプローブは 、分子の特有の疎水性Ｃ末端ドメインをコードする断片である。これらの３つの プローブは、ｃＤＮＡに特異性を有する。従って、これらのプローブとノーイン プロットとのハイブリダイゼーシヨンは、特異性のあるｍＲＮＡ種の存在を示す 。ｈＰＳ２特異的プローブは、■。

６５Ｋｂおよび２．２５　Ｋｂの両方のｍＲＮＡバンドとハイブリダイズし、こ のことは、各ｍＲＮＡバンドが１種類より多くのｍＲＮＡを含むことを示唆する 。現在のところ、疎水性Ｃ末端をコードする配列を有する、１つの胎盤ＳＰＩ　 ｃＤＮＡＬか発見されていない。ノーインプロットの結果は、ヒト胎盤中に１種 類より多（の膜結合ＳＰ１が存在し得ることを示唆する。

ＣＥＡ遺伝子ファミリーについても、複数のｍＲＮＡが報告されている。これま で報告されたすべてのＳＰＩ　ｃＤＮＡが１つの非常に大きな遺伝子由来のもの であり、これから差別的なスプライシングによって上記の３つのグループの生産 物を生じるという可能性はあるが、ＳＰＩ遺伝子は、ＣＥＡ遺伝子ファミリーの ように、染色体６およびＸ染色体上のクラスター中に位置するようである。

他のＳＰＩ　ｃＤＮＡと異なって、ｈＰＳ２およびＰＳＢＧＥは両者共、１つの ｎサブドメインしか含まない。これらのｃＤＮＡは、ｎサブドメインおよびＣサ ブドメインを含む１つの完全な反復ユニットを含ませることによって（すなわち 、ｈＰＳ２におけるｎサブドメインはＲ２ｎサブドメインである）、または１つ の反復ユニットのれサブドメインを他の反復ユニットのＣサブドメインでスプラ イシングすることによって（すなわち、ｈＰＳ２におけるｎサブドメインは、Ｒ １ｎサブドメインである）形成され得る。ＳＰＩ　ｃＤＮＡのＲｌｎおよびＲ２ ｎサブドメインのコンセンサス配列と比較すると、ｈＰＳ２のｎサブドメインは 、Ｒ２反復ユニットではな（、Ｒ１反復ユニット由来のようである。同様の結論 が、ＰＳＢＧＨについても得られる。　ｈＰＳ２に特有の特徴である、８１個の アミノ酸の疎水性Ｃ末端の存在は、ＣＥＡ、　ＴＭ−ＣＥＡおよびＮＣＡにおい て観察されるものと非常に同様である。バイトロバシープロット分析は、ｈＰＳ ２のこのＣ末端ドメインが、非常に疎水性であることを示し、分子の膜アンカー 領域を表すという推論を裏付ける。

これらの結果は、ヒト胎盤中に２つのタイプのＳＰＩ、細胞質または可溶性ＳＰ Ｉおよび膜結合ＳＰ１が存在するという理論を裏付ける。類似の現象が、ＣＥＡ ファミリージーパク質において報告されている。

ＳＰＩタンパク質およびＣＥＡは、多数の共通の特性を共有しているようである が、ＳＰＩには、それらをＣＥＡ遺伝子サブファミリーのメンバーとして分類す る代わりに１ｇ遺伝子スーパーファミリーから分かれるサブファミリーとしての 資格を与えるのに十分な特有の特徴を有する。例えば、ＳＰＩは、ＣＥＡおよび ＮＣＡに非常に類似しているが、異なるＳＰＩファミリーのメンバーにおける相 同性の方がより高（、−貫してヌクレオチドレベルで９０％よりも高く、アミノ 酸レベルで８５％よりも高い。ＳＰ１タンパク質もまた、あまりグリコジル化さ れていない。可能なグリコジル化部位の数は、ｐｓＰｌ−ｉにおける４個からＰ ＳＢＧＣにおける８個の範囲であり、大多数は６から７個を有している。

これらの部位の大半もまた保存されている。ＣＥＡおよびＮＣＡは両方ともより 多くグリコジル化され、ＮＣＡにおいて２７個の可能部位があり、ＮＣＡにおい て１２個の可能部位がある。これらの部位の数は、ＣＥＡとＳＰＩとの開ではな く、ＣＥＡとＮＣＡとの開で保存されてる。

ＳＰＬおよびＣＥＡ遺伝子の内部反復におけるヌクレオチドおよびアミノ酸の強 度の保存は、これらの遺伝子ファミリーが両方とも、始原遺伝子の重複によって 最近進化したものであることを示唆している。ＳＰＩのＲ１ｎサブドメインとＲ ２ｎサブドメインとの間のアミノ酸レベルにおける相同性％は、５２．７であり 、これは、ＳＰＩのＲ１ｎサブドメイン、およびＣＥＡ（ＩＡで６２．４、ＩＩ Ａで５７．０、およびＩＩＡで５９．１）とＮＣＡ　（６２，４）のｎサブドメ イン０間の相同性よりも非常に低い。この相同性は、Ｒ２ｎサブドメインと、Ｃ ＥＡおよびＮＣＡのｎサブドメインとの間の類似性％に匹敵する。ヌクレオチド 相同性を比較すると同様の結果が得られ、このことは、Ｒ１反復ユニットからＲ ２反復ユニットへの重複が、ＳＰＩとＣＥＡの分岐前に発生し、２つの遺伝子の 分岐がＲ［ｆｆｌユニットのみの重複に関与したことを示唆している。

実施例８　：　ＣＥＡとＳＰＩタンパク質との比較およびＣＥＡアッセイからの 交差反応タンパク質の除去 上記のように、７つの、明かに異なるが非常に関連深い、ＳＰ１タンパク質遺伝 子のｃＤＮＡクローンを単離した。１つのグループのクローンは、胎盤特異的Ｓ ＰＩタンパク質をコードするようである。このグループのクローンは、内部にＥ ｃｏｌ？１部位を含まないことによって特徴づけられる。その例は、ｈＰｓ１２ である。

のクローンにはｈＰｓｌｌが含まれ、１つの内部除土Ｒ［部位を有しており、ｈ ＰｓＬｌが正常の精巣から血流に分泌されるかどうかは知られていないが、胎盤 から、および精巣を含む非胎盤起源から単離された。類似はするが、ｈ、ＰｓＬ ｌは、４１．４３および３１９番目のアミノ酸およびコード領域の３”末端付近 の８６個のヌクレオチドにおいて、ｌ＃ａｔａｎａｂｅおよびＣｈｏｕ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ。Ｃｈｅｍ、　２６３　（４）、　２０４９−２０５４　（１９８８ ）の報告するるβ５Ｇ１６とは異なる。

第３グループのクローンを胎盤からのみ単離され、これらのクローンは２つの内 部ＥｃｏＲ＋部位を有する。第３グループの例は、ｈＰＳ２である。

また、クローンを、ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡライブラリー、精巣ｃＤＮＡライブラ リーおよび腸ｃＤＮＡライブラリーから単離した。これらは胎盤ＳＦ’Ｌ　ｃＤ ＮＡに対して相同性が高い。

ｈｌｓｌは胎盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡよりも、ＣＥＡファミリーのメンバーである通 常交差抗原（Ｎｏｒｍａｌ　Ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｎｇ　Ａｎｔｉｇｅｎ；　 ＮＣＡ）に対して高い相同性を示す。図１０は、ｈＰｓｌｌ、　ｈｌｓｌおよび ＣＥＡのドメイン構造を比較する。ｈｌｓｌは、ＣＥＡに対してヌクレオチドレ ベルで９３％相同であり、アミノ酸レベルで６７％相同でアル。

ｈｌｓｌおよびＣＥＡのＮ末端ドメインは、ｈＰｓｌｌのＮ末端ドメインよりも 短いアミノ酸が２つ短い。ドメイン構造および可能なグリコジル化部位の数は、 ｈｌｓｌとｈＰｓｌｌとの間よりもｈｌｓｌとＣＥＡとの間でより類似性が高い 。

すべてのクローン化されたＳＰＩ　ｃＤＮＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と非常 に相同な構造を有している。ＣＥＡは、消化道上皮の内皮由来のアデノカルンノ ーマおよび胎児結腸に大量に存在する大きな膜糖タンパク質である。ＣＥＡに免 疫上、密接に関連した分子が多数存在する。これらの分子は、非常に類似してい るが、異なるアミン末端アミノ酸配列を有しており、Ｓｈｉ　ｖｅｌｙおよびＢ ｅａｔｔｙ　（１９８５）による異なる遺伝子によってコードされると仮定され ている。上記の実施例に示されるように、ＳＰＩ遺伝子は、構造的および化学的 にＣＥＡに類似するタンパク質をコードし、ＣＥＡが発現される組織において少 なくとも部分的に発現される。胎盤ＳＰＩ　ｃＤＮＡのうち、ｈＰＳ２およびＰ ＳＢＧＥは、ＣＥＡとＮＣＡに最も近いドメイン構造を有している。ＮＣＡと同 様に、ｈＰＳ２およびＰＳＢＧＥは、１つの完全な反復ユニット、すなわち、１ つのｎ−サブドメインおよび１つのＣサブドメインしかもっていないのに対して 、ＣＥＡは、３つの完全な反復ユニットをもっている。他のすべてのＳＰＩ　ｃ ＤＮＡは、１つの完全な反復ユニットと、さらに追加のｎサブユニットをもって いる。ＳＰＩ　ｃＤＮＡの異なるドメインのコンセンサスアミノ酸配列とそれに 対応するＣＥＡおよびＮＣＡ中のドメインとを比較すると、ＳＰＩに対するＣＥ ＡとＮＣＡの相同性％は、比較したすべてのドメインにおいて非常に類似してい ることが示され、その範囲は、アミノ酸レベルで５３．８％から６２．４％であ る。ＳＰＩ、　ＣＥＡおよびＮＣＡの異なるドメインのヌクレオチド配列の比較 は、アミノ酸を比較した場合と同様の結果を示した。従って、ＳＰＩ様タンパク 質のヌクレオチドおよびタンパク質配列を使用して、ＣＥＡを検出するのに使用 される試薬をスクリーニングし、それによってＣＥＡではな（てＳｌ’１様タン パク質を検出することによって生じる偽りの陽性の数を減少させるすることが可 能である。この使用は、胃腸の腫瘍をモニターし検出することを含むが、それら に限定されない様々な臨床環境において行われる。

実施例８：免疫抑制剤としての精製ＳＰＩタンノくり質の使用免疫学的研究から 、１０μｇ／ｍｌの低濃度の純粋なヒト胎盤５Ｐｉ（同一抗体と反応し得る胎盤 中に存在するすべての種類のＳＰ１タンパク質を含む）が、混合リンパ球アツセ イにおいて、リンパ球の増殖をかなり抑制（５０％）することが示されている。

その抑制は、３０　μｇ／ｍｌで８５％であり、１００　μｇ／ｍｌで１００％ である。２つの個別の研究結果を第１２図に示す。フィトヘマグルチニン（Ｐ） ＩＡ）によって刺激されたリンパ球は、同等量のＳＰＩによって影響されないた め、このＳＰＩの免疫抑制効力は、特異的なもののようである。この結果は、胎 盤ＳＰ１タンｉ＜り質が、免疫的役割を果たしていることを示す構造上の証拠を 確認する。

実施例９二成長因子としての精製ＳＰ１タンパク質の使用胎盤ＳＰＩの成長促進 活性を、無血清マウス軟骨培養物に純粋ヒト胎盤ＳＰ１ｇ製物を、量を変化させ ながら加えることによって試験した。ＳＰＩの効果を、巨核球の数と大きさを測 定すると共にアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）活性を測定することによ って調べた。マウス軟骨培養物にＳＰＩを加えると、巨核球の直径が増大した。

巨核球生成を誘発するＳＰＩの能力は、巨核球の株化成長因子であるインターロ イキン６の能力に匹敵する。ＳＰｌのマウス巨核球ＡｅｈＥに対する効力を図１ ３に示す。１０ｎｇ／ｍｌ程度の濃度のＳＰＩは、巨核球のＡｃｈＥ活性を４５ ％増加させた。

これらの結果は、ＳＰｌが成長促進活性を有していることを示す。

実施例１０：妊娠特異的タンパク質と核酸配列の医薬としての使用 ｈＰｓｌｌ、　ｈＰＳ２およびｈＰｓ１２のコードするタンノｆり質を含む少な くとも３つのタンパク質があり、これらは胎盤組織において発現するようである 。ｈＰＳ２およびｈＰｓ１２は、胎盤組織においてのみ発見されている。胎盤組 織は、妊娠している個体においてのみ存在するため、ｈＰｓｌｌ、　ｈＰＳ２お よびｈＰｓ１２タンノ〈り質のレベルは、ヒトあるいはラット、ウシまたはブタ 等の非ヒト哺乳類のいずれの雌性が妊娠しているかの指針として機能し得る。従 って、本発明は、被検体からの生物的サンプルを使用して、胎盤特異的ペプチド の１つのレベルをアツセイし、通常レベル以上であればこれを妊娠に関連付ける 、通常以下のレベルであれば妊娠していないことまたは妊娠異常と関連付ける、 妊娠テストの方法および試薬を含む。

本発明の妊娠テスト方法の１つの実施態様において、雌性から生物的サンプルを 得、図２に記載のタンパク質に対するモノクローナル抗体で処理する。抗体−タ ン１＜り質反応のレベルを、当業者に既知の方法（すなわち、ラジオ標識、ＥＬ ＩＳＡ等）を使用して測定し、サンプル中のタン１＜り質レベルを決定する。

本発明はまた、有効量のタンパク質またはペプチドを雌性に投与する、図２に記 載のタンパク質のような胎盤特異的タンパク質の１つを欠いている雌性の受胎能 を促進する方法および組成物を含む。

好ましくは、ペプチドは、下記のように医薬上受は入れられる担体と組み合わせ て投与される。ペプチドの好適な投与量は、タンパク質の通常レベルに基づいて おり、好ましくは、当業者によって決定される。一般に、体重１　ｋｇ当り０． １から５０　ｍｇの間である。無菌水および無菌通常生理食塩水中の５％デクト ロースのように、タンパク質の生物的活性を維持する医薬上受は入れられる担体 であれば、いずれのものも選択され得る。

本発明はさらに、有効量の妊娠特異的ペプチドまたは図２に示されるようなタン パク質を、母親または胎児に投与して胎児の生存率を向上させる方法および組成 物を含む。母親がＳＰｌ様タンパク質の不適切なレベルを有するならば、自然流 産が起こり得る。従って、上記組成物の投与は、ＳＰＩタンパク質を胎児の生存 を維持するために必要なレベルに上昇させることができる。上記のように、好ま しくは、ペプチドは、医薬上受は入れられる担体と組み合わせて投与される。

本願に記載のＳＰＩタンパク質は、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、ラ ットならびにチンパンジー、カニクイザル、モンキー、ヒヒおよびヒトを含む霊 長類に存在する。これに基づいて、タンパク質がすべての胎盤哺乳類に存在し、 従って上記の方法がすべての胎盤哺乳類に使用され得ることが予想される。

本発明の、ＳＰＩタンパク質ファミリーのメンバーをコードするヌクレオチド配 列から発現されるタンパク質、このタンパク質と配列に対する抗体とハイブリダ イゼーションプローブ、およびそれを使用する方法の改変および変更は、上記の 本発明の詳細な説明から当業者に既知である。このような改変および変更は、添 付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。

（以下余白） ｏ　ｏ　口　ｏ　ｏ　ｏ　ロ　０ＯＱ Ｏへ　ＣＯＷ　ロ　ψ　へ　ｃｏ　寸　ロ　−１　−　−　へ　ｒ”ｌ　Ｍ　９ 　寸　い　リ　Ｑｏ　ｏ　Ｏｏ　ロ　ロ　。　ｏ　。

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［５ｐｉｌ　Ｉ　ｕｇ　／ｍ＋） ＳＰｌ　（ｕｇ　／ｒｎｌ） 補正書の写しく！８１訳文）提出書く特許法第１８４条の８）平成３年７月１８ 日

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. １．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に少なくとも７０％のホモロジーを有する妊娠特異 的β−１糖タンパク質様タンパク質（ＳＰ１様タンパク質）をコードする、遺伝 子工学的に設計された核酸配列。
2. ２．前記配列が胎盤で特異的に発現され、前記タンパク質がクローンｈＰＳ１２ のヌクレオチド配列に少なくとも一部コードされている、請求項１に記載の核酸 配列。
3. ３．前記配列が胎盤で発現され、前記タンパク質がクローンｈＰＳ１１のヌクレ オチド配列に少なくとも一部コードされている、請求項１に記載の核酸配列。
4. ４．前記配列が胎盤に特異的に発現され、さらに、前記タンパク質が疎水性Ｃ末 端領域を含有し、クローンｈＰＳ２のヌクレオチド配列に少なくとも一部コード されている、請求項１に記載の核酸配列。
5. ５．前記配列が腸組織で発現され、さらに、前記タンパク質が、ＳＰ１様タンパ ク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする腸遺伝子ライブラリー由来のＤ ＮＡに少なくとも一部コードされている、請求項１に記載の核酸配列。
6. ６．前記配列がｈＩＳ１およびｈＩＳ３からなる群から選択される、請求項５に 記載の核酸配列。
7. ７．前記配列が腸および胎盤の両組織で発現され、さらに、前記タンパク質が、 クローンｈＰＳ３およびｈＰＳ１１からなる群から選択される配列に少なくとも 一部コードされている、請求項１に記載の核酸配列。
8. ８．前記配列が腸で発現され、さらに、前記タンパク質が、クローンｈＴＳ２お よびｈＴＳ３からなる群から選択される配列に少なくとも一部コードされている 、請求項１に記載の核酸配列。
9. ９．前記配列がＨｅＬａ細胞で発現され、さらに、前記タンパク質が、ｈＨＳ２ からなる群から選択されるクローンの配列に少なくとも一部コードされている、 請求項１に記載の核酸配列。
10. １０．妊娠特異的β−１糖タンパク質様タンパク質（ＳＰ１様タンパク質）の少 なくとも一部を形成する実質的に純粋で均一なタンパク質の配列であって、癌胎 児性抗原（ＣＥＡ）に少なくとも７０％のホモロジーを有しており、クローンｈ ＰＳ１２、ｈＰＳ１１、ｈＰＳ２、ｈＩＳ１、ｈＩＳ３、ｈＰＳ３、ｈＴＳ１、 ｈＴＳ２、ｈＴＳ３、ｈＴＳ１６、ｈＨＳ２およびそれらの部分からなる群から 選択される遺伝子工学的手法で設計された核酸配列から発現される、タンパク質 の配列。
11. １１．癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に少なくとも７０％のホモロジーを有しており、 クローンｈＰＳ２、ｈＩＳ１、ｈＩＳ３、ｈＰＳ３、ｈＴＳ１、ｈＴＳ２、ｈＴ Ｓ３、ｈＴＳ１６、ｈＨＳ２およびそれらの部分からなる群から選択される核酸 配列から発現される、妊娠特異的β−１糖タンパク質様タンパク質（ＳＰ１様タ ンパク質）に対する抗体であって、ＣＥＡを認識しない抗体。
12. １２．実質的に純粋な膜結合性ＳＰ１様タンパク質。
13. １３．胎盤で発現される請求項１２に記載のタンパク質。
14. １４．少なくとも一部がｈＰＳ２にコードされている請求項１３に記載のタンパ ク質。
15. １５．膜結合性ＳＰ１様タンパク質に対する抗体。
16. １６．雌性の妊娠の試験方法であって、ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１ からなる群から選択されるクローンに相同であり胎盤で発現される核酸配列に、 コードされるペプチドのレベルを、雌性由来の生物学的試料についてアッセイす る工程、および 該レベルを妊娠に関連付ける工程、 を包含する、方法。
17. １７．ＳＰ１様タンパク質に欠陥のある雌性の受胎能を促進する方法であって、 ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１からなる群から選択されるクローンに相 同であり胎盤で発現される核酸配列にコードされるペプチドの有効量を、雌性に 投与する工程を包含する、方法。
18. １８．ＳＰ１様タンパク質に欠陥のある雌性の被験体が有する胎児の生存率を向 上させる方法であって、ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１からなる群から 選択されるクローンに相同であり胎盤で発現される核酸配列にコードされるペプ チドの有効量を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
19. １９．胎児の拒絶を誘導する方法であって、ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ １１からなる群から選択されるクローンに相同であり胎盤で発現される核酸配列 にコードされるペプチドに対する抗体または阻害剤の有効量を、該胎児の母親に 投与する工程を包含する、方法。
20. ２０．雌性の受胎能を促進する組成物であって、医薬的に許容され得る担体、お よび ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１からなる群から選択されるクローンに祖 同であり胎盤で発現される核酸配列にコードされるペプチド を含有する組成物。
21. ２１．胎児の拒絶を誘導し、またはＳＰ１様タンパク質に欠陥のある雌性の有す る胎児の生存率を向上させる組成物であって、 医薬的に許容され得る担体、および ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１からなる群から選択されるクローンに相 同であり胎盤で発現される核酸配列にコードされるペプチド を含有する組成物。
22. ２２．ＣＥＡをスクリーニングする方法であって、ＣＥＡとは反応するが、癌胎 児性抗原（ＣＥＡ）に少なくとも７０％のホモロジーを有しており、クローンｈ ＰＳ２、ｈＰＳ１１、ｈＰＳ１２、ｈＩＳ１、ｈＩＳ３、ｈＰＳ３、ｈＴＳ２、 ｈＴＳ３およびｈＨＳ２からなる群から選択される核酸配列から発現される、妊 娠特異的β−１糖タンパク質様タンパク質（ＳＰ１様タンパク質）とは反応しな い抗体を提供する工程を包含する方法。
23. ２３．ＣＥＡとは反応するが、妊娠特異的β−１糖タンパク質様タンパク質（Ｓ Ｐ１様タンパク質）とは反応しない抗体であって、該タンパク質が、癌胎児性抗 原（ＣＥＡ）に少なくとも７０％のホモロジーを有しており、クローンｈＰＳ２ 、ｈＰＳ１１、ｈＰＳ１２、ｈＩＳ１、ｈＩＳ３、ｈＰＳ３、ｈＴＳ２、ｈＴＳ ３およびｈＨＳ２からなる群から選択される核酸配列から発現される、抗体。
24. ２４．前記ＳＰ１様タンパク質がＸ染色体および染色体６に存在する配列から発 現される、請求項２２に記載のアッセイ。
25. ２５．前記ＳＰ１様タンパク質が胎盤以外の組織で転写される配列から発現され る請求項２２に記載のアッセイ。
26. ２６．免疫グロブリンおよび免疫グロブリン様分子が胎児に移行するのを促進す る方法であって、ｈＰＳ２、ｈＰＳ１２およびｈＰＳ１１からなる群から選択さ れるクローンと相同な、胎盤で発現される核酸配列によってコードされる、ＳＰ １様タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
27. ２７．胎児の拒絶を誘導する方法であって、妊娠特異的β−１糖タンパク質（Ｓ Ｐ１様タンパク質）に対する抗体の有効量を被験体に投与する工程を包含する、 方法。
28. ２８．妊娠特異的β−１糖タンパク質様タンパク質（ＳＰ１様タンパク質）の有 効量を投与する工程を包含する、リンパ球の増殖を阻害する方法。
29. ２９．前記タンパク質が胎盤起源である、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記タンパク質がＳＰ１タンパク質に対する抗体の結合によって単離され る、請求項２８に記載の方法。
31. ３１．細胞の成長および増殖を刺激する方法であって、妊娠特異的β−１糖タン パク質様タンパク質（ＳＰ１様タンパク質）の有効量を細胞に投与する工程を包 含する、方法。
32. ３２．前記タンパク質が胎盤起源である、請求項３１に記載の方法。
33. ３３．前記タンパク質が、ＳＰ１タンパク質に対する抗体の結合によって単離さ れる、請求項３２に記載の方法。