ES2305273T3 - Fragmentos del receptor huerfano relacionado con el acido retinoico (ror) que comprenden el dominio de union al ligando (lbd), la estructura cristalina del lbd de ror-beta y sus aplicaciones. - Google Patents
Fragmentos del receptor huerfano relacionado con el acido retinoico (ror) que comprenden el dominio de union al ligando (lbd), la estructura cristalina del lbd de ror-beta y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptidos del receptor huérfano relacionado con ácido retinoico (ROR) en mamíferos, caracterizados porque son fragmentos de RORbeta, alfa o gamma de rata, ser humano o ratón, delimitados en su extremo N-terminal por el aminoácido situado en una de las posiciones 201 a 209 de las secuencias de ROR representadas en la figura 3, y en su extremo Cterminal por el aminoácido situado en una de las posiciones 451 ó 452, de las secuencias de ROR representadas en la figura 3.
Description
Fragmentos del receptor huérfano relacionado con
el ácido retinoico (ROR) que comprenden el dominio de unión al
ligando (LBD), la estructura cristalina del LBD de
ROR-\beta y sus aplicaciones.
Un aspecto de esta invención consiste en obtener
la estructura cristalina de receptores huérfanos mediante la
utilización de un sistema de expresión heterólogo, que no sólo
producirá una alta cantidad de la proteína deseada, sino que
también proporcionará un seudoligando. La presencia de esta molécula
fortuita es importante para estabilizar una conformación de
agonista activa mediante la adición de manera concomitante de un
péptido coactivador. Estos dos elementos eluden cualquier otra
conformación alternativa no activa.
Este procedimiento se ilustra mediante cristales
del dominio de unión a ligando del receptor huérfano relacionado
con ácido retinoico específico de cerebro
(ROR\beta-LBD) en complejo con un péptido
coactivador y un ligando de ácido graso fortuito. Esta invención se
refiere asimismo a procedimientos de utilización de una secuencia
de ADN o construcciones derivadas para producir proteínas con el fin
de, o bien averiguar el ligando fisiológico o bien seleccionar
análogos sintéticos. Esta invención también se refiere a
procedimientos para diseñar y seleccionar ligandos que se unen a
ROR\beta y a procedimientos de utilización de tales ligandos.
También se refiere a la utilización de secuencias de ADN de
ROR\beta o secuencias derivadas de la misma con el fin de
identificar otras proteínas que interaccionan con ROR\beta.
Obviamente, el objetivo de esta invención también es la utilización
de la estructura de proteínas o complejos de proteínas similares u
homólogos, particularmente todas estas reivindicaciones se aplican
a los dos isotipos ROR\beta y \gamma.
El receptor huérfano relacionado con ácido
retinoico huérfano \beta (ROR\beta), también denominado receptor
Z retinoide \beta (RZR\beta) (NR1F2) pertenece a la
superfamilia de receptores nucleares (NR) y se expresa en zonas del
sistema nervioso central. La actividad dependiente de ligando de los
receptores nucleares hace de ellos dianas obvias para el diseño de
fármacos en muchas áreas terapéuticas. Sin embargo, en el caso de
los receptores huérfanos, se desconoce el ligando y ni siquiera se
ha demostrado la existencia de un ligando. Nunca se ha demostrado
que ROR\beta se una al ácido retinoico. ROR\beta regula genes
cuyos productos desempeñan un papel en el contexto de la
integración de la entrada sensorial así como en el contexto del
reloj biológico. Se observó un fenotipo de comportamiento de
ratones ROR\beta-/- y parece que es similar al fenotipo descrito
hace > 40 años para una mutación espontánea en ratón denominada
vacillans (Sirlin, 1956). Estos ratones muestran un modo de
andar similar al de un pato, incapacidad masculina transitoria para
reproducirse sexualmente y una retina gravemente desorganizada que
adolece de degeneración tras el parto.
Otros dos receptores nucleares estrechamente
relacionados son ROR\alpha y ROR\gamma. ROR\alpha presenta un
61% de identidad y un 74% de similitud con ROR\beta. ROR\alpha
se expresa de manera bastante ubicua (Becker-André
et al., 1993) y se ha demostrado que desempeña papeles
importantes en el desarrollo del cerebelo y en la respuesta
inmunitaria (Matysiak-Scholze y Nehls, 1997;
Koibuchi y Chin., 1998). Se encontró que los ratones
Staggerer portan una deleción dentro del gen de ROR\alpha
que evita la traducción del dominio de unión a ligando. Presentan
una grave ataxia cerebelar relacionada con un defecto en el
desarrollo de las células de Purkinje. También están afectadas
ciertas funciones del sistema inmunitario (Hamilton et al.,
1996).
También están afectadas ciertas funciones del
sistema inmunitario (Hamilton et al., 1996). ROR\alpha
también se expresa constitutivamente durante la miogénesis (Lau
et al., 1999).
La expresión de ROR\gamma se encuentra
principalmente en el músculo esquelético (Hirose et al.,
1994) y está inducida en el estadio medio de diferenciación de los
adipocitos (Kurebayashi S., y Hirose T, 1998).
Al igual que con los otros miembros de la
familia de receptores nucleares, ROR\beta tiene varios dominios
funcionales que incluyen un dominio de unión a ADN (DBD), y un
dominio de unión a ligando (LBD) de 250 residuos que contiene el
sitio de unión al ligando y es responsable del cambio en la función
de unión al ligando.
Sería ventajoso concebir procedimientos y
composiciones para reducir el tiempo requerido para descubrir
ligandos para el ROR\beta, sintetizar tales compuestos y
administrar tales compuestos a organismos para modular los procesos
fisiológicos regulados por el receptor ROR\beta o cualquiera de
sus isotipos \alpha o \beta.
Hasta ahora no se ha informado de la existencia
de cristales de ningún receptor huérfano en la conformación de
unión al agonista. Recientemente se ha publicado la estructura de
USP, el ortólogo de insecto de RXR. Aunque los RXR se unen a
9c-RA, USP no se une a este ligando y todavía debe
considerase como un receptor huérfano. Se ha propuesto que las
hormonas juveniles son ligandos naturales de USP pero esta cuestión
todavía es controvertida. No obstante, la estructura del LBD de USP
está en una conformación de tipo antagonista. Se informa de que ya
se ha descubierto la primera estructura cristalina del dominio de
unión a ligando de receptor huérfano
(ROR\beta-LBD) en la conformación unida al
agonista, que representa la forma activa tras la transcripción del
receptor nuclear.
En la presente memoria pueden mencionarse los
polipéptidos derivados del receptor huérfano relacionado con ácido
retinoico (ROR) en mamíferos, caracterizados porque comprenden por
lo menos la secuencia de aminoácidos delimitada en su extremo
N-terminal por el primer aminoácido de la hélice H1,
y en su extremo C-terminal por el último aminoácido
de la hélice H12.
También pueden mencionarse en la presente
memoria los polipéptidos derivados del receptor huérfano relacionado
con ácido retinoico (ROR) en mamíferos, caracterizados porque están
delimitados en su extremo N-terminal por un
aminoácido situado entre las posiciones 1 a 209 del ROR\beta,
\alpha o \gamma de rata, ser humano o ratón, tal como se
representa en la figura 3, o por un aminoácido situado en posiciones
correspondientes en el receptor nuclear ROR de otros subtipos
distintos a \alpha, \beta y \gamma, y/o de otros mamíferos, y
en su extremo C-terminal por un aminoácido situado
entre las posiciones 450 a 452 del ROR\beta, \alpha o \gamma
de rata, ser humano o ratón, tal como se representa en la figura 3,
o por un aminoácido situado en posiciones correspondientes en el
receptor nuclear ROR de otros subtipos distintos a \alpha, \beta
y \gamma, y/o de otros mamíferos.
Algunos polipéptidos derivados del receptor
huérfano relacionado con ácido retinoico (ROR) en mamíferos se
caracterizan porque están delimitados en su extremo
N-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 1 a 209 del receptor nuclear ROR\beta de ser humano o
rata, tal como se representa en la figura 3, o por un aminoácido
situado en posiciones correspondientes en el receptor nuclear ROR de
otros subtipos, tal como ROR\alpha y ROR\gamma, tal como se
representa en la figura 3, y/o de otros mamíferos, y en su extremo
C-terminal por un aminoácido situado entre las
posiciones 450 a 452 del receptor nuclear ROR\beta de ser humano
o rata, tal como se representa en la figura 3, o por un aminoácido
situado en posiciones correspondientes en el receptor nuclear ROR
de otros subtipos, tal como ROR\alpha y ROR\gamma, y/o de otros
mamíferos.
Otros polipéptidos derivados del receptor
huérfano relacionado con ácido retinoico (ROR) en mamíferos se
caracterizan porque están delimitados en su extremo
N-terminal por la metionina en la posición 209 del
receptor nuclear ROR\beta de ser humano o rata, tal como se
representa en la figura 3, o por la metionina u otro aminoácido tal
como leucina situado en una posición correspondiente en el receptor
nuclear ROR de otros subtipos, tal como ROR\alpha y ROR\gamma,
y/o de otros mamíferos, y en su extremo C-terminal
por la fenilalanina en la posición 450 del receptor nuclear
ROR\beta de ser humano o rata, tal como se representa en la figura
3, o por la fenilalanina u otro aminoácido situado en una posición
correspondiente en el receptor nuclear ROR de otros subtipos, tal
como ROR\alpha y ROR\gamma, y/o de otros
mamíferos.
mamíferos.
Ventajosamente, los polipéptidos tal como se
definió anteriormente se caracterizan porque por lo menos los
aproximadamente 100 a 200 primeros aminoácidos de la parte
N-terminal de la secuencia de dicho receptor están
delecionados.
Los polipéptidos definidos anteriormente se
caracterizan más particularmente porque son polipéptidos derivados
del receptor nuclear ROR, en el que se mantienen las propiedades de
unión del dominio de unión a ligando, o LBD, de dicho receptor.
Los polipéptidos particulares derivados del
receptor nuclear ROR\beta, de mamíferos, tal como de ser humano o
rata, comprenden un polipéptido tal como se definió anteriormente,
tal como los polipéptidos delimitados por los aminoácidos situados
en las posiciones 201 a 459 de la secuencias de ROR\beta de rata o
ser humano representadas en la figura 3, caracterizándose dichos
polipéptidos porque por lo menos una de la cisteína en la posición
454 o en la posición 458 de la secuencia de aminoácidos de dicho
receptor nuclear ROR\beta, tal como se representa en la figura 3,
está delecionada o sustituida por otro aminoácido, natural o no, tal
como alanina o serina.
Los polipéptidos tal como se definieron
anteriormente se caracterizan más particularmente porque:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La invención se refiere a polipéptidos del
receptor huérfano relacionado con ácido retinoico (ROR) en mamíferos
caracterizados porque son fragmentos de ROR\beta, \alpha o
\gamma de rata, ser humano o ratón, delimitados en su extremo
N-terminal por el aminoácido situado en una de las
posiciones 201 a 209 de las secuencias de ROR representadas en la
figura 3, y en su extremo C-terminal por el
aminoácido situado en una de las posiciones 451 ó 452, de las
secuencias de ROR representadas en la figura 3.
\newpage
La invención se refiere más particularmente a
polipéptidos tal como se definieron anteriormente, seleccionados de
entre:
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
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-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
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\vtcortauna
- -
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\vtcortauna
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\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
Los polipéptidos tal como se definieron
anteriormente según la invención, se caracterizan más
particularmente por las características siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La invención también se refiere a complejos
moleculares que comprenden un polipéptido tal como se definió
anteriormente, estando dicho polipéptido en asociación con:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La invención también se refiere a una secuencia
de nucleótidos que codifica para un polipéptido tal como se definió
anteriormente.
La invención también se refiere a una secuencia
de nucleótidos tal como se definió anteriormente, asociada a los
elementos necesarios para la transcripción de esta secuencia,
particularmente un promotor y un terminador de la
transcripción.
La invención también se refiere a un vector,
particularmente un plásmido, que comprende una secuencia de
nucleótidos tal como se definió anteriormente.
La invención también se refiere a células
huésped, tales como E. coli, transformadas con un vector tal
como se definió anteriormente.
La invención también se refiere a un
procedimiento para obtener un polipéptido, o un complejo molecular,
tal como se definió anteriormente, caracterizado porque
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
\newpage
- -
-
\vtcortauna
La invención también se refiere a un cristal que
comprende un polipéptido según, o un complejo molecular, tal como
se definió anteriormente.
Ventajosamente, un cristal tal como se definió
anteriormente, se caracteriza porque difracta a una resolución de
por lo menos 3 angstrom y tiene una estabilidad de cristal dentro
del 5% de sus dimensiones de la célula unitaria.
El cristal preferido tal como se definió
anteriormente, es de manera que el ROR-LBD tiene las
siguientes dimensiones de la célula unitaria en angstroms: a =
52,302 \ring{A}, b = 58,490 \ring{A} y c = 106,036 \ring{A},
\alpha = \beta = \chi = 90º, y un grupo de espacio
ortorrómbico P212121.
La invención también se refiere a un cristal tal
como se definió anteriormente, tal como se obtiene llevando a cabo
un procedimiento mencionado anteriormente, y que comprende una etapa
de cristalización en disolventes acuosos de los polipéptidos, o los
complejos moleculares, tal como se definió anteriormente,
especialmente a 4ºC mediante el procedimiento de difusión de vapor
en gota pendiente.
La invención también se refiere a la utilización
de los polipéptidos, o de los complejos moleculares, o de los
cristales, tal como se definió anteriormente, para llevar a
cabo:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La invención se refiere más particularmente a la
utilización mencionada anteriormente, para la selección de
compuestos que actúan como agonistas o antagonistas de ROR, siendo
útiles dichos compuestos en el marco del tratamiento de patologías
relacionadas con el sistema nervioso central, la organización
retiniana, la integración de la señal sensorial, la motricidad y la
esterilidad.
La invención también se refiere a un
procedimiento para la selección de un ligando de
ROR-LBD que es un agonista, o un antagonista de
dicho receptor, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La invención también se refiere a un
procedimiento para el análisis de la estructura tridimensional de
los complejos formados con un polipéptido, o un complejo molecular,
o un cristal, tal como se definió anteriormente, y a un compuesto
particular susceptible de ser un ligando de ROR-LBD,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
La presente invención proporciona cristales de
un ROR\beta-LBD unido a un ligando y a un péptido
coactivador, es decir, un complejo
ROR\beta-LBD/ligando/péptido. El ligando es el
ácido esteárico.
El cristal difracta a una resolución de 1,9
\ring{A}. El cristal de ROR\beta-LBD tiene
preferentemente por lo menos 243 aminoácidos y comprende
preferentemente la secuencia de aminoácidos de 208 a 451 del
ROR\beta de rata. La presente invención también proporciona las
coordenadas estructurales del complejo
ROR\beta-LBD/ligando/péptido. Las coordenadas
completas se representan en la tabla A.
Las coordenadas completas de los cristales de un
ROR\beta-LBD unido a un ligando y a un péptido
coactivador, es decir, un complejo
ROR\beta-LBD/ligando/péptido, en el que el ligando
es el ácido retinoico se representan en la tabla B.
La presente invención también proporciona un
procedimiento para determinar por lo menos una parte de la
estructura tridimensional de moléculas o complejos moleculares que
contienen por lo menos algunas características estructuralmente
similares al ROR\beta-LBD. Se prefiere que estas
moléculas o complejos moleculares comprendan por lo menos una parte
del sitio de unión al ligando definido por las coordenadas
estructurales de los aminoácidos de ROR\beta-LBD,
Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269,
L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321,
M329, F330, L333, L338, 1339, A342, F343, V419, C420, H423 y Y446
según la tabla A o un mutante u homólogo del mismo.
La presente invención también proporciona un
ordenador que comprende una forma legible en el ordenador para las
coordenadas contenidas en la tabla A.
La presente invención proporciona además un
sitio de unión en ROR\beta-LBD para un ligando
agonista o antagonista de ROR\beta-LBD, así como
procedimientos para diseñar o seleccionar agonistas, antagonistas
y/o un modulador selectivo del receptor ROR\beta (SRORM) de ROR
utilizando la información sobre las estructuras cristalinas dada a
conocer en la presente memoria.
La presente invención también proporciona un
procedimiento con el fin de cristalizar receptores huérfanos, que
permite la determinación del hueco de unión a ligando, importante
para el descubrimiento de agonistas y antagonistas.
Figura 1 - Estearato
Figura 2 - Secuencias de nucleótidos y
polipéptidos del LBD de ROR\beta de rata.
Figura 3 - Secuencia del LBD de ROR\beta de
rata tal como se clonó, con los elementos estructurales secundarios
recuadrados (hélices \alpha) o señalados con una flecha (hebras
\beta). También se facilitan las secuencias del LBD de ROR\beta
de ser humano, del LBD de ROR\alpha de ratón, del LBD de
ROR\alpha de ser humano, del LBD de ROR\gamma de ratón y del
LBD de ROR\gamma de ser humano.
Para comparación se facilita la secuencia
alineada del LBD de RAR\gamma de ser humano, que se utilizó con
el fin de resolver la estructura cristalográfica. Los residuos
implicados en la unión al estearato en el caso de ROR\beta en el
ácido trans-retinoico en el caso de la unión a RAR\gamma
están en negrita. Los residuos dentro de un punto de corte de 4
\ring{A} están rodeados por un círculo.
Figura 4 - Dibujo a estilo de cintas del LBD de
ROR\beta y el péptido coactivador. El estearato de ligando se
muestra como una figura de bolas y varillas.
Figura 5 - Diferencia (2Fo-Fc)
de densidad eléctrica (1\sigma).
Figura 6: Detalle de la red de puentes de
hidrógeno formada con el grupo carboxilato de ATRA.
Figura 7: Superposición de estearato y ATRA en
el hueco del LBD de ROR\beta.
Figura 8: Ensayos de unión y transactivación
para el ácido todo-trans retinoico.
Se ha determinado la primera estructura
cristalina del dominio de unión a ligando de ROR\beta
(ROR\beta-LBD) para una resolución de 1,9
\ring{A}. Se hicieron crecer cristales de
ROR\beta-LBD de rata en disoluciones de
cristalización que contenían Tris HCl 0,1 M pH = 8,0 y PEG 6000 al
15%. Los patrones de difracción de rayos X de los cristales tienen
la simetría y las ausencias sistemáticas del grupo de espacio
ortorrómbico P212121 con dimensiones de la célula unitaria a =
52,302 \ring{A}, b = 58,490 \ring{A} y c = 106,036 \ring{A} y
una molécula por unidad asimétrica (volumen de Mathews = 2,57
\ring{A}^{3}Da^{-1}). Se determinó la estructura mediante el
procedimiento de reemplazo molecular utilizando la estructura del
ácido retinoico (RAR\gamma-LBD) como el modelo de
búsqueda.
El complejo de ROR\beta-LBD
con el estearato y el péptido coactivador muestra el modo de unión
del ligando al receptor huérfano en la conformación del
agonista.
A lo largo de la presente solicitud se utilizan
las siguientes abreviaturas:
A = Ala = Alanina
V = Val = Valina
L = Leu = Leucina
I = Ile = Isoleucina
P = Pro = Prolina
F = Phe = Fenilalanina
W = Trp = Triptófano
M = Met = Metionina
G = Gly = Glicina
S = Ser = Serina
T = Thr = Treonina
C = Cys = Cisteína
Y = Tyr = Tirosina
N = Asn = Asparagina
Q = Gln = Glutamina
D = Asp = Ácido aspártico
E = Glu = Ácido glutámico
K = Lys = Lisina
R = Arg = Arginina
H = His = Histidina
"Tipo de átomo" se refiere al elemento
cuyas coordenadas se han determinado. Los elementos se definen por
la primera letra de la columna.
"X, Y, Z" definen cristalográficamente la
posición atómica determinada por cada átomo.
"B" es un factor térmico que mide el
movimiento del átomo alrededor de su centro atómico.
"Occ" es un factor de ocupación que se
refiere a la fracción de las moléculas en la que cada átomo ocupa la
posición especificada por las coordenadas. Un valor de "1"
indica que cada átomo tiene la misma conformación, es decir, la
misma posición, en todas las moléculas del cristal.
Las definiciones adicionales se explican en la
memoria descriptiva cuando es necesario.
El receptor ROR\beta descrito en la presente
memoria pretende incluir cualquier polipéptido que tenga la
actividad del ROR\beta que se produce naturalmente. El ROR\beta
y ROR\beta-LBD contemplados en la presente
memoria incluyen todas las formas de vertebrados y mamíferos tales
como rata, ratón, cerdo, cabra, caballo, cobaya, conejo, mono,
orangután y ser humano. Tales términos incluyen polipéptidos que
difieren de las formas que se producen naturalmente de ROR\beta y
ROR\beta-LBD porque tienen deleciones,
sustituciones y adiciones de aminoácidos, pero que conservan la
actividad de ROR\beta y ROR\beta-LBD,
respectivamente. La estructura cristalina de la invención contiene
preferentemente por lo menos el 25%, más preferentemente por lo
menos el 50%, más preferentemente por lo menos el 75%, más
preferentemente por lo menos el 90%, más preferentemente por lo
menos el 95%, más preferentemente por lo menos el 99% y más
preferentemente todas las coordenadas enumeradas en la tabla A. El
cristal del
ROR\beta-LBD/ROR\beta-LBD-ligando/ROR\beta-LBD-ligando-péptido
de la invención preferentemente tiene las siguientes dimensiones de
la célula unitaria en angstroms: a = 52,302 \ring{A}, b = 58,490
\ring{A} y c = 106,036 \ring{A} y un grupo de espacio
ortorrómbico P212121.
Esto incluye tanto agonistas o activadores como
antagonista o inhibidores de ROR\beta-LBD.
Los péptidos a los que se hace referencia en la
presente memoria (por ejemplo, ROR\beta,
ROR\beta-LBD, y similares) pueden producirse
mediante cualquier procedimiento bien conocido, incluyendo el
procedimiento sintético, tal como síntesis en fase sólida, fase
líquida y combinación de fase sólida/líquida; procedimientos de ADN
recombinante, incluyendo clonación de ADNc, combinados opcionalmente
con mutagénesis dirigida al sitio; y/o purificación de los
productos naturales, combinada opcionalmente con procedimientos de
escisión enzimática para producir fragmentos de proteínas que se
producen naturalmente.
Ventajosamente, las composiciones cristalizables
proporcionadas por esta invención pueden someterse a cristalografía
de rayos X. Por tanto, esta invención también proporciona la
estructura tridimensional del complejo
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD/péptido, particularmente el complejo
de ROR\beta-LBD de rata con ácido esteárico.
La estructura tridimensional del complejo
ROR\beta-LBD/ligando de esta invención se define
mediante un conjunto de coordenadas estructurales tal como se
muestra en la tabla A. La expresión "coordenadas estructurales"
se refiere a coordenadas cartesianas derivadas de ecuaciones
matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos en la
difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos
(centros de dispersión) de un complejo ROR\beta/estearato/péptido
en forma cristalina. Los datos de difracción se utilizan para
calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad de
repetición del cristal. Los mapas de densidad de electrones se
utilizan entonces para establecer las posiciones de los átomos
individuales del complejo.
Los expertos en la materia apreciarán que un
conjunto de coordenadas estructurales para un receptor o
receptor/ligando, o complejo receptor/ligando/péptido o una parte
de los mismos, es un conjunto relativo de puntos que definen una
forma en tres dimensiones. Por tanto, es posible que un conjunto
completamente diferente de coordenadas pueda definir una forma
similar o idéntica. Además, ligeras variaciones en las coordenadas
individuales tendrán poco efecto en la forma global.
Las variaciones en las coordenadas dadas a
conocer anteriormente pueden generarse debido a las manipulaciones
matemáticas de las coordenadas estructurales. Por ejemplo, las
coordenadas estructurales mostradas en la tabla A podrían
manipularse mediante permutaciones cristalográficas de las
coordenadas estructurales, fraccionalización de las coordenadas
estructurales; adiciones o sustracciones de números enteros a los
conjuntos de las coordenadas estructurales, inversión de las
coordenadas estructurales o cualquier combinación de los
anteriores.
Alternativamente, las modificaciones en la
estructura cristalina debidas a mutaciones, adiciones, sustituciones
y/o deleciones de aminoácidos, u otros cambios en cualquiera de los
componentes que constituyen el cristal también podrían representar
variaciones en las coordenadas estructurales. Si tales variaciones
están dentro de un error estándar aceptable en comparación con las
coordenadas originales, se considera que la forma tridimensional
resultante es igual.
Por tanto, son necesarios diversos análisis
computacionales para determinar si una molécula o complejo molecular
o una parte de los mismos es suficientemente similar a todo o parte
del receptor ROR\beta/estearato descrito anteriormente como para
considerarse igual. Tales análisis pueden llevarse a cabo en
aplicaciones de software actuales, tales como la aplicación de
Molecular Similarity de Quanta (Molecular Simulations Inc., San
Diego, CA) versión 4.1, y tal como se describe en la guía de
usuario adjunta.
La aplicación de Molecular Similarity permite
comparaciones entre estructuras diferentes, conformaciones
diferentes de la misma estructura y partes diferentes de la misma
estructura. El procedimiento utilizado en Molecular Similarity para
comparar estructuras se divide en cuatro etapas: 1) cargar las
estructuras que van a compararse; 2) definir las equivalencias
atómicas en estas estructuras; 3) realizar una operación de ajuste;
y 4) analizar los resultados.
Cada estructura se identifica por un nombre. Una
estructura se identifica como el objetivo (es decir, la estructura
fija); todas las estructuras restantes son estructuras de trabajo
(es decir, estructuras móviles). Dado que la equivalencia atómica
dentro de QUANTA está definida por la entrada del usuario, para el
fin de esta invención se definirán los átomos equivalentes como
átomos de la estructura principal de la proteína (N, C\alpha, C y
O) para todos los residuos conservados entre las dos estructuras que
se están comparando. También se considerarán únicamente las
operaciones de ajuste rígido.
Cuando se utiliza un procedimiento de ajuste
rígido, la estructura de trabajo se traslada y se gira para obtener
un ajuste óptimo con la estructura objetivo. La operación de ajuste
utiliza un algoritmo que calcula el traslado y la rotación óptimos
que deben aplicarse para la estructura móvil, tal como la diferencia
de la media cuadrática del ajuste con respecto a los pares
especificados del átomo equivalente es un mínimo absoluto. QUANTA
notifica este número, dado en angstroms.
En el contexto de la presente invención,
cualquier molécula o complejo molecular que tenga una desviación
cuadrática media de los átomos de la estructura principal residuales
conservados (N, C\alpha, C, O) inferior a 1,5 \ring{A} cuando
se superponen a los átomos de la estructura principal relevantes
descritos por las coordenadas estructurales enumeradas en la tabla
A se considera idéntico. Más preferentemente, la desviación
cuadrática media es inferior a 1 \ring{A}. En una forma de
realización preferida de la presente invención, la molécula o el
complejo molecular comprende por lo menos una parte del sitio de
unión a ligando definido por las coordenadas estructurales de los
aminoácidos de ROR\beta-LBD, Q228, Y229, L234,
W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304,
R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333,
L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 y Y446 según la tabla A, o
un mutante u homólogo de dicha molécula o complejo molecular. En el
contexto de la presente invención, por "por lo menos una parte de
él" se quiere decir todo o cualquier parte del sitio de unión a
ligando definido por estas coordenadas estructurales. Se prefieren
más las moléculas o los complejos moleculares que comprenden todo o
cualquier parte del sitio de unión a ligando definido por las
coordenadas estructurales de los aminoácidos de
ROR\beta-LBD, Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262,
A263, Q265, 1266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309,
A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338,I339, A342,
F343, V419, C420, H423 y Y446 según la tabla A, o un mutante u
homólogo de dicha molécula o complejo molecular. Por mutante u
homólogo de la molécula o complejo molecular se quiere decir una
molécula o un complejo molecular que tiene un hueco de unión que
tiene una desviación cuadrática media con respecto a los átomos de
la estructura principal de dichos aminoácidos de
ROR\beta-LBD no superior a 1,5 angstroms.
La expresión "desviación cuadrática media"
significa la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados
de las desviaciones con respecto a la media. Es una forma para
expresar la desviación o la variación con respecto a una tendencia
u objeto. Para los fines de esta invención, la "desviación
cuadrática media" define la variación en la estructura principal
de una proteína o un complejo de proteínas con respecto a la parte
relevante de la estructura principal de la parte de ROR\beta del
complejo tal como se define por las coordenadas estructurales
descritas en la presente memoria. Una vez que se han determinado las
coordenadas estructurales de un cristal de proteína, son útiles
para resolver las estructuras de otros cristales o para modelar
mediante homología otras proteínas, particularmente los dos
isotipos ROR\alpha y \gamma.
Por tanto, según la presente invención, las
coordenadas estructurales de un complejo
ROR\beta/estearato/péptido, y en particular un complejo y partes
del mismo se almacenan en un medio de almacenamiento legible por
máquina. Dichos datos pueden utilizarse para una variedad de fines,
tales como el descubrimiento de fármacos y el análisis
cristalográfico por rayos X o cristal de proteína.
En consecuencia, en una forma de realización de
esta invención se proporciona un medio de almacenamiento de datos
legibles por máquina que comprende un material de almacenamiento de
datos codificado con las coordenadas estructurales mostradas en la
tabla A.
Por primera vez, la presente invención permite
la utilización de técnicas de diseño de fármacos racionales o
basadas en la estructura para diseñar, seleccionar y sintetizar
entidades químicas, incluyendo compuestos inhibidores y
estimuladores que pueden unirse a ROR\beta-LBD, o
a cualquier parte del mismo.
Una técnica de diseño de fármacos
particularmente útil posibilitada por esta invención es el diseño de
fármacos iterativo. El diseño de fármacos iterativo es un
procedimiento para optimizar asociaciones entre una proteína y un
compuesto mediante la determinación y la evaluación de las
estructuras tridimensionales de conjuntos sucesivos de complejos de
proteína/compuesto.
Los expertos en la materia aperciarán que la
asociación de ligandos o sustratos naturales con los huecos de
unión de sus receptores o enzimas correspondientes es la base de
muchos mecanismos biológicos de acción. La expresión "hueco de
unión" tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a
una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado
de su forma se asocia favorablemente con otra entidad o compuesto
químico. De manera similar, muchos fármacos ejercen sus efectos
biológicos a través de la asociación con los huecos de unión de
receptores y enzimas. Tales asociaciones pueden producirse con todo
o cualquier parte de los huecos de unión. Una comprensión de tales
asociaciones ayudarán a conducir al diseño de fármacos que tiene
asociaciones más favorables con su receptor diana, y por tanto,
efectos biológicos mejorados. Por tanto, esta información es
valiosa en el diseño de ligandos o inhibidores potenciales de
receptores, tales como inhibidores de ROR\beta.
La expresión "en asociación con" se refiere
a un estado de proximidad entre entidades o compuestos químicos, o
partes de los mismos. La asociación puede ser no covalente, en la
que la yuxtaposición está favorecida energéticamente mediante
puentes de hidrógeno o interacciones de van der Waals o
electrostáticas, o puede ser covalente.
En el diseño de fármacos iterativo, se obtienen
cristales de una serie de complejos de proteína/compuesto y luego
se resuelven las estructuras tridimensionales de cada complejo. Un
enfoque de este tipo facilita la comprensión de la asociación entre
las proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se lleva a
cabo seleccionando compuestos con actividad inhibidora, obteniendo
cristales de este nuevo complejo de proteína/compuesto, resolviendo
la estructura tridimensional del complejo y comparando las
asociaciones entre el nuevo complejo de proteína/compuesto y los
complejos de proteína/compuesto resueltos anteriormente. Mediante la
observación de cómo los cambios en el compuesto afectaban a las
asociaciones de proteína/compuesto, pueden optimizarse estas
asociaciones.
En algunos casos, el diseño de fármacos
iterativo se lleva a cabo formando sucesivos complejos de
proteína/com-
puesto y luego cristalizando cada nuevo complejo. Alternativamente, un cristal de proteína preformado se sumerge en presencia de un inhibidor, formando así un complejo de proteína/compuesto y obviando la necesidad de cristalizar cada complejo individual de proteína/compuesto.
puesto y luego cristalizando cada nuevo complejo. Alternativamente, un cristal de proteína preformado se sumerge en presencia de un inhibidor, formando así un complejo de proteína/compuesto y obviando la necesidad de cristalizar cada complejo individual de proteína/compuesto.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "sumergido" se refiere a un procedimiento en el que el
cristal se transfiere a una disolución que contiene el compuesto de
interés.
Las coordenadas estructurales mostradas en la
tabla A también pueden utilizarse para ayudar a obtener información
estructural sobre otra molécula o complejo molecular cristalizados.
Esto puede lograrse mediante cualquiera de varias técnica bien
conocidas, incluyendo el reemplazo molecular.
Las coordenadas estructurales mostradas en la
tabla A también pueden utilizarse para determinar por lo menos una
parte de la estructura tridimensional de moléculas o complejos
moleculares que contienen por lo menos algunas características
estructuralmente similares a ROR\beta. En particular, puede
obtenerse información estructural sobre otra molécula o complejo
molecular cristalizados. Esto puede lograrse mediante cualquiera de
varias técnicas bien conocidas, incluyendo el reemplazo
molecular.
Por tanto, en otra realización esta invención
proporciona un procedimiento de utilizar el reemplazo molecular
para obtener información estructural sobre una molécula o complejo
molecular cristalizados cuya estructura se desconoce, que comprende
las etapas de:
- a)
- generar un patrón de difracción de rayos X a partir de dicha molécula o complejo molecular crista- lizados,
- b)
- aplicar por lo menos una parte de las coordenadas estructurales mostradas en la tabla A al patrón de difracción de rayos X para generar un mapa de densidad de electrones tridimensional de la molécula o complejo molecular cuya estructura se desconoce; y
- c)
- utilizar todas o una parte de las coordenadas estructurales mostradas en la tabla A para generar modelos de homología de ROR\beta-LBD o cualquier otro dominio de unión a ligando de receptor hormonal o huérfano nuclear.
Mediante la utilización del reemplazo molecular,
todas o parte de las coordenadas estructurales del complejo
ROR\beta-LBD/ROR\beta-LBD-ligando/ROR\beta-LBD-ligando-péptido
proporcionado por esta invención o del complejo molecular cuya
estructura se desconoce más rápida y eficazmente que intentando
determinar tal información
ab initio.
ab initio.
El reemplazo molecular proporciona una
estimación precisa de las fases de una estructura desconocida. Las
fases son factores en ecuaciones utilizadas para resolver
estructuras cristalinas que no pueden determinarse directamente. La
obtención de valores precisos para las fases, mediante
procedimientos distintos al reemplazo molecular, es un
procedimiento que lleva mucho tiempo que implica ciclos iterativos
de aproximaciones y perfeccionamientos y dificulta enormemente la
solución de las estructuras cristalinas. Sin embargo, cuando se ha
resuelto la estructura cristalina de una proteína que contiene por
lo menos una parte homóloga, las fases de la estructura conocida
proporcionan una estimación satisfactoria de las fases para la
estructura desconocida.
Por tanto, este procedimiento supone generar un
modelo preliminar de una molécula o complejo molecular cuyas
coordenadas estructurales se desconocen, mediante la orientación y
colocación de la parte relevante del complejo
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD según la tabla A dentro de la célula
unitaria del cristal de la molécula o complejo molecular
desconocidos de manera que se explique mejor el patrón de difracción
de rayos X observado del cristal de la molécula o complejo
molecular cuya estructura se desconoce. Las fases pueden calcularse
entonces a partir de este modelo y combinarse con las amplitudes del
patrón de difracción de rayos X observado para generar un mapa de
densidad de electrones la estructura cuyas coordenadas se
desconocen. A su vez, esto puede someterse a cualquier técnica de
perfeccionamiento de estructura y de construcción de modelo bien
conocida para proporcionar una estructura precisa de la molécula o
complejo molecular cristalizados desconocidos [E. Lattman, "Use
of the Rotation and Translation Functions", en Meth. Enzymol.,
115, págs. 55-77 (1985); M. G. Rossmann, ed.,
"The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Set., No 13,
Gordon & Breach, Nueva York (1972)].
Mediante este procedimiento puede resolverse la
estructura de cualquier parte de cualquier molécula o complejo
molecular cristalizados que es suficientemente homóloga a cualquier
parte del complejo ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD.
Las coordenadas estructurales también son
particularmente útiles para resolver la estructura de cristales de
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD o
ROR\beta-LBD-ligando-péptido
que forman cocomplejos con una variedad de entidades químicas. Este
enfoque permite la determinación de los sitios óptimos para la
interacción entre entidades químicas, incluyendo la interacción de
inhibidores candidatos de ROR\beta con el complejo. Por ejemplo,
los datos de la difracción de rayos X de alta resolución recogidos
de cristales expuestos a diferentes tipos de disolvente permiten la
determinación de dónde reside cada tipo de molécula de disolvente.
Pueden diseñarse entonces moléculas pequeñas que se unen
fuertemente a estos sitios, y sintetizarse y someterse a prueba para
determinar su actividad de inhibición de
ROR\beta.
ROR\beta.
Todos los complejos a los que se ha hecho
referencia anteriormente pueden estudiarse utilizando técnicas de
difracción de rayos X bien conocidas y pueden perfeccionarse frente
datos de rayos X de resolución de 1,5-3 \ring{A}
hasta un valor de R de aproximadamente 0,20 o inferior utilizando
software informático, tal como X-PLOR [Yale
University, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.;
véanse, por ejemplo, Blundell & Johnson, citado anteriormente;
Meth. Enzymol., vol. 114 & 115, H. W. Wyckoff et al.,
eds., Academic Press (1985)]. Esta información puede utilizarse por
tanto para optimizar agonistas/antagonistas de ROR\beta conocidos
y, lo que es más importante, para diseñar agonistas/antagonistas de
ROR\beta nuevos.
En consecuencia, la presente invención también
se refiere a un sitio de unión en un ligando agonista o antagonista
de ROR\beta-LBD en el que una parte de ligando de
ROR\beta-LBD está en contacto de van der Waals o
en contacto de puentes de hidrógeno con por lo menos uno de los
residuos siguientes: Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263,
Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310,
V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, I339, A342, F343,
V419, C420, H423 y Y446 de ROR\beta-LBD. Para los
fines de esta invención, mediante el sitio de unión de
ROR\beta-LBD también se pretende incluir mutantes
u homólogos del mismo. En una forma de realización preferida, los
mutantes u homólogos tienen por lo menos un 25% de identidad, más
preferentemente un 50% de identidad, más preferentemente un 75% de
identidad y lo más preferentemente un 95% de identidad con los
residuos Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268,
A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320,
E321, M329, F330, L333, L338, 1339, A342, F343, V419, C420, H423 y
Y446 de los sitios de unión de ROR\beta-LBD.
La presente invención también se refiere a un
medio de almacenamiento de datos legibles por máquina, que comprende
un material de almacenamiento de datos codificado con datos
legibles por máquina, en el que los datos se definen mediante las
coordenadas estructurales de un
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD según la tabla A o un homólogo de
dicho complejo, en el que dicho homólogo comprende átomos de
estructura principal átomo que tienen una desviación cuadrática
media con respecto a los átomos de la estructura principal del
complejo no superior a 3,0 \ring{A}. Preferentemente, el medio de
almacenamiento de datos legibles por máquina, según la invención,
es en el que dicha molécula o complejo molecular se definen por el
conjunto de coordenadas estructurales para
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD según la tabla A, o un homólogo de
dicha molécula o complejo molecular, teniendo homólogo una
desviación cuadrática media con respecto a los átomos de la
estructura principal de dichos aminoácidos no superior a 2,0
\ring{A}. En una forma de realización preferida el medio de
almacenamiento de datos legibles por máquina comprende un medio de
almacenamiento de datos que comprende un material de almacenamiento
de datos codificado con un primer conjunto de datos legibles por
máquina que comprende una transformada de Fourier de por lo menos
una parte de las coordenadas estructurales para un
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD/ROR\beta-LBD-ligando-péptido
según la tabla A; que, cuando se combinan con un segundo conjunto
de datos legibles por máquina que comprende un patrón de difracción
de rayos X de una molécula o complejo molecular de estructura
desconocida, utilizando una máquina programada con instrucciones
para utilizar dicho primer conjunto de datos y dicho segundo
conjunto de datos, puede determinar por lo menos una parte de las
coordenadas estructurales correspondientes al segundo conjunto de
datos legibles por máquina, dicho primer conjunto de datos y dicho
segundo conjunto de datos.
La presente invención también proporciona
procedimientos computacionales utilizando modelos tridimensionales
del receptor ROR\beta que se basan en los cristales del complejo
ROR\beta-LBD/ligando de
ROR\beta-LBD. Generalmente, el procedimiento
computacional de diseño de un ligando de ROR\beta determina que el
aminoácido o los aminoácidos de ROR\beta-LBD
interacciona(n) con un resto químico (por lo menos uno) del
ligando utilizando un modelo tridimensional de un proteína
cristalizada que comprende ROR\beta-LBD con un
ligando unido, y seleccionando una modificación química (por lo
menos una) del resto químico para producir un segundo resto químico
con una estructura que o bien disminuye o bien aumenta una
interacción entre el aminoácido que interacciona y el segundo resto
químico en comparación con la interacción entre el aminoácido que
interacciona y el resto químico correspondiente en la hormona
natural.
Los procedimientos computacionales de la
presente invención son para el diseño de ligandos sintéticos de
ROR\beta utilizando tal información estructural de cristal y
tridimensional para generar ligandos sintéticos que modulan los
cambios conformacionales de ROR\beta-LBD. Estos
procedimientos computacionales son particularmente útiles en el
diseño de un antagonista o un agonista parcial del ROR\beta, en el
que el antagonista o el agonista parcial tiene un resto extendido
que evita uno cualquiera de varios acontecimientos moleculares
inducidos por ligando que alteran la influencia del receptor en la
regulación de la expresión génica, tal como evitar la coordinación
normal del dominio de activación observada para un ligando que se
produce naturalmente u otros ligandos que imitan al ligando que se
produce naturalmente, tal como un agonista. Tal como se describe en
la presente memoria, los ligandos sintéticos del receptor ROR\beta
serán útiles en la modulación de la actividad de ROR\beta en una
variedad de estados médicos. Se sabe que ROR\beta comprende
diversos dominios tal como sigue:
- 1)
- un dominio amino-terminal variable;
- 2)
- un dominio de unión a ADN (DBD) altamente conservado; y
- 3)
- un dominio de unión a ligando (LBD) carboxilo terminpor lo menos conservado.
Esta modularidad permite que diferentes dominios
de cada proteína lleven a cabo por separado diferentes funciones,
aunque los dominios pueden influir entre sí. La función separada de
un dominio normalmente se conserva cuando se aísla un dominio
particular del resto de la proteína. Utilizando técnicas de química
de proteínas convencionales a veces puede separarse un dominio
modular de la proteína original. Utilizando técnicas de biología
molecular convencionales normalmente puede expresarse por separado
cada dominio con su función original intacta o pueden construirse
quimeras de dos receptores nucleares diferentes, en las que las
quimeras conservan las propiedades de los dominios funcionales
individuales de los receptores nucleares respectivos a partir de los
cuales se generan las quimeras.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El dominio amino-terminal es el
menos conservado de los tres dominios. Este dominio está implicado
en la activación de la transcripción y en algunos casos su
singularidad puede dictar la unión selectiva
receptor-ADN y la activación de genes diana
mediante isoformas de receptores específicas. Este dominio puede
desempeñar interacciones sinérgicas y antagonistas con los dominios
del LBD. Por ejemplo, estudios con receptores mutados y/o
delecionados muestran la cooperación positiva de los dominios amino
y carboxilo-terminales.
En algunos casos, la deleción de cualquiera de
estos dominios suprimirá las funciones de activación de la
transcripción del receptor.
El DBD es el dominio más conservado. El DBD
contiene dos hélices \alpha orientadas perpendicularmente que se
extienden desde la base de los dedos de cinc primero y segundo. Los
dos dedos de cinc funcionan conjuntamente con residuos distintos a
dedos de cinc para dirigir a los receptores nucleares hacia sitios
diana específicos en el ADN y para alinear el homodímero de
receptor con superficies de contacto de heterodímero. Diversos
aminoácidos en DBD influyen en la separación entre dos mitades del
sitio para la unión de dímero de receptor.
El LBD es el segundo dominio más altamente
conservado. Aunque la integridad de varios subdominios diferentes
de LBD es importante para la unión del ligando, las moléculas
truncadas que sólo contienen el LBD conservan la actividad normal
de unión a ligando. Esto dominio también participa en otras
funciones, incluyendo la dimerización, la translocación nuclear y
la activación de la transcripción. Lo que es más importante, este
dominio se une al ligando y experimenta cambios conformacionales
inducidos por el ligando tal como se detalla en la presente
memoria.
Tal como se describe en la presente memoria, el
LBD de ROR\beta puede expresarse, cristalizarse, determinarse su
estructura tridimensional con un ligando unido (o bien usando los
datos del cristal para el mismo receptor o bien un receptor
diferente o una combinación de los mismos), y utilizarse
procedimientos computacionales para diseñar ligandos para su LBD,
particularmente ligandos que contienen un resto de extensión que
coordina el dominio de activación de ROR\beta.
Una vez que se sintetiza un ligando diseñado
computacionalmente (CDL), puede someterse a prueba utilizando
ensayos para establecer su actividad como agonista, agonista parcial
o antagonista, y su afinidad, tal como se describe en la presente
memoria. Tras tales pruebas, los CDL pueden perfeccionarse
adicionalmente generando cristales de LBD con un CDL unido al LBD.
La estructura del CDL puede perfeccionarse adicionalmente entonces
utilizando los procedimientos de modificación química descritos en
la presente memoria para los modelos tridimensionales para mejorar
la actividad o la afinidad del CDL y obtener una segunda generación
de CDL con propiedades mejoradas, tales como las de un
super-agonista o antagonista.
Normalmente se purifica
ROR\beta-LBD hasta la homogeneidad para la
cristalización. La pureza de ROR\beta-LBD se mide
con SDS-PAGE y espectrometría de masas. El
ROR\beta purificado para su cristalización debe ser puro en por
lo menos el 7,5% o puro en el 97,5%, preferentemente puro en por lo
menos el 99,0% o puro en el 99,0%, más preferentemente puro en por
lo menos el 99,5% o puro en el 99,5%.
Inicialmente, puede obtenerse la purificación
del receptor mediante técnicas convencionales, tales como
cromatografía de afinidad y cromatografía de filtración en el.
Para lograr una purificación superior para
obtener cristales mejorados de ROR\beta, será deseable realizar
una purificación mediante cambio de ligando del receptor nuclear
utilizando una columna que separa el receptor según la carga, tal
como una columna de interacción hidrófoba o de intercambio iónico, y
después unir el receptor eluido con un ligando, especialmente un
agonista. El ligando induce un cambio en la carga de superficie del
receptor tal que cuando vuelve a someterse a cromatografía en la
misma columna, el receptor eluye entonces en la posición del
receptor unido al ligando y se extrae de la columna original en la
que se ha utilizado el receptor sin el ligando unido. Normalmente
se usan concentraciones saturantes de ligando en la columna y la
proteína puede preincubarse con el ligando antes de hacerse pasar
sobre la columna.
Algunos procedimientos desarrollados implican la
obtención mediante ingeniería genética de una "cola" tal como
con histidina situada al final de la proteína, tal como en el
extremo amino terminal, y luego la utilización de una columna de
quelación con cobalto para la purificación, Chaga, G., Biotech.
Appl. Biochem. 29: 13811-13814 (1991) incorporado
como referencia.
Para determinar la estructura tridimensional de
un ROR\beta-LBD, es deseable cocristalizar el LBD
con un ligando de LBD correspondiente.
Se equilibra ROR\beta-LBD
purificado normalmente a una concentración saturante de ligando a
una temperatura que preserva la integridad de la proteína. La
equilibración del ligando puede establecerse entre 2 y 37ºC, aunque
el receptor tiende a ser más estable en el intervalo de
2-20ºC.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Sin embargo, si se desconoce el ligando es
posible cocristalizar el ROR\beta-LBD con un
ligando fortuito que procede del sistema de expresión heterólogo es
decir Escherichia coli y añadiendo concomitantemente un
péptido
coactivador.
coactivador.
Preferentemente se preparan cristales con los
procedimientos de gota pendiente. Es deseable un control de
temperatura regulado para mejorar la estabilidad y la calidad de los
cristales. Generalmente se utilizan temperaturas de entre 4 y 25ºC
y a menudo es preferible someter a prueba la cristalización a lo
largo de un intervalo de temperaturas. Es preferible utilizar
temperaturas de cristalización de desde 18ºC hasta 25ºC, más
preferentemente de 20 a 23ºC y lo más preferentemente de 22ºC.
Los ligandos que interaccionan con ROR\beta
pueden actuar como agonistas, antagonistas y agonistas parciales
basándose en qué cambios conformacionales inducidos por ligando
tienen lugar.
Los agonistas inducen cambios en receptores que
los sitúan en una conformación activa que les permite influir en la
transcripción, ya sea positiva o negativamente. Puede haber varios
cambios diferentes inducidos por ligando en la conformación del
receptor.
Los antagonistas se unen a los receptores, pero
no logran inducir cambios conformacionales que conducen a la forma
transcripcionalmente activa del receptor o a conformaciones
fisiológicamente relevantes. La unión de un antagonista también
puede bloquear la unión y por tanto las acciones de un agonista.
Los agonistas parciales se unen a los receptores
e inducen sólo parte de los cambios en los receptores que se
inducen por los agonistas. Las diferencias pueden ser cualitativas o
cuantitativas. Por tanto, un agonista parcial puede inducir algunos
de los cambios de conformación inducidos por agonistas, pero no
otros, o puede inducir sólo ciertos cambios en un grado
limitado.
Tal como se describe en la presente memoria, el
receptor sin ligando está en una configuración que o bien es
inactiva, tiene algo de actividad o bien tiene actividad represora.
La unión de ligandos agonistas induce cambios conformacionales en
el receptor de tal manera que el receptor se vuelve más activo, o
bien para estimular o bien para reprimir la expresión de los genes.
Los receptores también pueden tener acciones no genómicas, algunos
de los tipos conocidos de cambios y/o las secuencias de los mismos
se enumeran en la presente memoria.
La unión al ligando por el receptor es un
proceso dinámico, que regula la función del receptor induciendo una
conformación alterada.
La estructura tridimensional del receptor
ROR\beta unido al ligando ayudará enormemente al desarrollo de
nuevos ligandos sintéticos de ROR\beta. Además, ROR\beta está en
general bien adaptado a los procedimientos modernos incluyendo el
esclarecimiento de la estructura tridimensional y química
combinatoria tal como los dados a conocer en el documento EP 335
628, la patente US nº 5.463.564, que se incorporan a la presente
memoria como referencia. Los programas informáticos que utilizan
datos cristalográficos para poner en práctica la presente invención
permitirán el diseño racional de ligandos para ROR\beta.
Pueden utilizarse programas tales como RASMOL
con las coordenadas atómicas de cristales generados poniendo en
práctica la invención o pueden utilizarse para poner en práctica la
invención generando modelos tridimensionales y/o determinando las
estructuras implicadas en la unión al ligando. Programas
informáticos tales como INSIGHT y GRASP permiten una manipulación
adicional y la capacidad para introducir nuevas estructuras. Además,
pueden idearse ensayos de bioactividad y de unión de alto
rendimiento utilizando ensayos de transcripción de genes
indicadores modernos y proteína recombinante purificada descritos en
la presente memoria y conocidos en la materia con el fin de
perfeccionar la actividad de un CDL.
Generalmente, el procedimiento computacional de
diseño de un ligando sintético de ROR\beta comprende dos
etapas:
- 1)
- determinar qué aminoácido o aminoácidos de ROR\beta-LBD interacciona(n) con un primer resto químico (por lo menos uno) del ligando utilizando un modelo tridimensional de una proteína cristalizada que comprende un ROR\beta-LBD con un ligando unido; y
- 2)
- seleccionar una modificación química (por lo menos una) del primer resto químico para producir un segundo resto químico con una estructura para o bien aumentar o bien disminuir una interacción entre el aminoácido que interacciona y el segundo resto químico en comparación con la interacción entre el aminoácido que interacciona y el primer resto químico.
Preferentemente se lleva a cabo el procedimiento
en el que dicho modelo tridimensional se genera comparando
derivados de ligandos isomorfos para producir una determinación de
fases mejorada. También se prefiere en el que dicha selección
utiliza dicho primer resto químico que interacciona con por lo menos
uno de los aminoácidos que interaccionan Q228, Y229, L234, W259,
Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304, R306,
M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333,
L338,1339, A342, F343, V419, C420, H423 o Y446.
Tal como se muestra en la presente memoria, los
aminoácidos que interaccionan forman contactos con el ligando y el
centro de los átomos de los aminoácidos que interaccionan está
habitualmente a de 2 a 4 angstroms de distancia del centro de los
átomos del ligando. Generalmente estas distancias se determinan por
ordenador tal como se trata en la presente memoria y en Mc Ree
1993, sin embargo, las distancias pueden determinarse manualmente
una vez realizado el modelo tridimensional. Véase también Renaud
et al., Nature 378, 681-689 (1995) para
figuras estereoquímicas de modelos tridimensionales.
Más comúnmente, los átomos del ligando y los
átomos de aminoácidos que interaccionan están separados en de 3 a 4
angstroms. La invención puede ponerse en práctica repitiendo la
etapa 1 y 2 para perfeccionar el ajuste del ligando al LBD y para
determinar un ligando mejor, tal como un agonista. El modelo
tridimensional de ROR\beta puede representarse en dos dimensiones
para determinar qué aminoácidos entran en contacto con el ligando y
para seleccionar una posición en el ligando para la modificación
química y el cambio de la interacción con un aminoácido particular
en comparación con la de antes de la modificación química. La
modificación química puede realizarse utilizando un ordenador,
utilizando manualmente una representación bidimensional del modelo
tridimensional o sintetizando químicamente el ligando. El ligando
también puede interaccionar con aminoácidos distantes tras al
modificación química del ligando para crear un nuevo ligando. Los
aminoácidos distantes no entran generalmente en contacto con el
ligando antes de la modificación química. Una modificación química
puede cambiar la estructura del ligando para preparar un nuevo
ligando que interacciona con un aminoácido distante habitualmente
por lo menos a 4,5 angstroms de distancia del ligando,
preferentemente en el que dicho primer resto químico está a de 6 a
12 angstroms de distancia de un aminoácido distante. A menudo los
aminoácidos distantes no recubrirán la superficie de la actividad
de unión para el ligando, están demasiado alejados del ligando para
ser parte de un hueco o cavidad de unión. La interacción entre un
aminoácido de LBD y un átomo de un ligando LBD puede realizarse
mediante cualquier fuerza o atracción descrita en la naturaleza.
Habitualmente la interacción entre el átomo del aminoácido y el
ligando será el resultado de una interacción de puentes de
hidrógeno, interacción de carga, interacción hidrófoba, interacción
de van der Waals o interacción de dipolos. En el caso de la
interacción hidrófoba se reconoce que no es una interacción en sí
misma entre el aminoácido y el ligando, sino más bien el resultado
habitual, en parte, de la repulsión de agua u otro grupo hidrófilo
de una superficie hidrófoba. Puede medirse la reducción o
potenciación de la interacción del LBD y un ligando calculando o
sometiendo a prueba energías de unión, computacionalmente o
utilizando procedimientos termodinámicos o cinéticos tal como se
conocen en la materia.
Las modificaciones químicas a menudo potenciarán
o reducirán las interacciones de un átomo de un aminoácido de
aminoácido del LBD y un átomo de un ligando del LBD. El impedimento
estérico será un medio común de cambio de la interacción de la
actividad de LBD con el dominio de activación.
La presente invención también proporciona
procedimientos para identificar compuestos que modulan la actividad
de ROR\beta. Pueden utilizarse diversos procedimientos o
combinaciones de los mismos para identificar estos compuestos. Por
ejemplo, pueden modelarse compuestos de prueba que se ajusten
espacialmente en el ROR\beta-LBD tal como se
define mediante coordenadas estructurales según la tabla A, o
utilizando un modelo estructural tridimensional de
ROR\beta-LBD, ROR\beta-LBD
mutante u homólogo de ROR\beta-LBD o parte de los
mismos. Las coordenadas estructurales del sitio de unión a ligando,
en particular aminoácidos los Q228, Y229, L234, W259, Q261, C262,
A263, Q265, 1266, H268, A269, L299, V303, L304, R306, M307, R309,
A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333, L338, 1339, A342,
F343, V419, C420, H423 o Y446 también pueden utilizarse para
identificar características estructurales y químicas. Las
características estructurales o químicas identificadas pueden
emplearse entonces para diseñar o seleccionar compuestos como
moduladores potenciales de ROR\beta. Se pretende que las
características estructurales y químicas incluyan, pero no se
limiten a, interacciones de van der Waals, interacciones de puentes
de hidrógeno, interacción de carga, interacción de enlaces
hidrófobos, interacción de carga, interacción hidrófoba e
interacción de dipolos. Alternativamente, o además, puede emplearse
el modelo estructural tridimensional o el sitio de unión a ligando
para diseñar o seleccionar compuestos como moduladores potenciales
de ROR\beta. Después pueden sintetizarse compuestos identificados
como moduladores potenciales de ROR\beta y seleccionarse en un
ensayos caracterizado por la unión de un compuesto de prueba a
ROR\beta-LBD. Ejemplos de ensayos útiles en la
selección de moduladores potenciales de ROR incluyen, pero no se
limitan a, selección in silico, ensayos in vitro y
ensayos de alto rendimiento. Finalmente, estos procedimientos
también pueden implicar modificar o reemplazar uno o más aminoácidos
de ROR\beta-LBD tales como Q228, Y229, L234,
W259, Q261, C262, A263, Q265, I266, H268, A269, L299, V303, L304,
R306, M307, R309, A310, V318, L319, F320, E321, M329, F330, L333,
L338, I339, A342, F343, V419, C420, H423 o Y446 de
ROR\beta-LBD según la tabla A.
Un procedimiento preferido de la invención puede
describirse como un procedimiento computacional de diseño de un
antagonista de ROR a partir de un agonista del receptor ROR que
comprende:
- 1)
- determinar una estructura de un dominio de reconocimiento molecular de dicho agonista utilizando un modelo tridimensional de una proteína cristalizada que comprende un ROR-LBD, y
- 2)
- seleccionar por lo menos una modificación química de dicho agonista que proporciona una estructura de ligando que se extiende más allá de un sitio de unión para dicho agonista y en la dirección de por lo menos un dominio de proteína importante en la función biológica de ROR\beta.
\newpage
Otro procedimiento preferido de la invención
puede describirse como un procedimiento computacional de diseño de
un modulador selectivo del receptor ROR\beta tal como un
superagonista o antagonista del receptor ROR que comprende:
- 1)
- determinar por lo menos un aminoácido que interacciona de un ROR\beta-LBD que interacciona con por lo menos un primer resto químico de dicho ligando utilizando un modelo tridimensional de una proteína cristalizada que comprende ROR\beta-LBD con un ligando unido, y
- 2)
- seleccionar por lo menos una modificación química de dicho primer resto químico para producir un segundo resto químico con una estructura para reducir o potenciar una interacción entre dicho aminoácido que interacciona y dicho segundo resto químico en comparación con dicha interacción entre dicho aminoácido que interacciona y dicho primer resto químico.
Sin embargo, tal como apreciarán los expertos en
la materia tras esta exposición, pueden utilizarse otros
procedimientos de diseño basados en la estructura. Se han dado a
conocer varios procedimientos computacionales de diseño basados en
la estructura en la materia.
Por ejemplo, existen varios sistemas de
modelización informáticos disponibles en los que puede introducirse
la secuencia de la ROR\beta-LBD y la estructura de
ROR\beta-LBD (es decir, coordenadas atómicas de
ROR\beta-LBD y/o las coordenadas atómicas del
sitio de unión a ligando, el enlace y los ángulos de dihedro, y las
distancias entre átomos en el sitio activo tal como se proporcionan
en la tabla A). Entonces este sistema informático genera los
detalles estructurales del sitio en el que un modulador potencial de
ROR\beta se une de manera que pueden determinarse detalles
estructurales complementarios de los moduladores potenciales. El
diseño en estos sistemas de modelización se basa generalmente en
que el compuesto puede asociarse física y estructuralmente con
ROR\beta-LBD. Además, el compuesto debe poder
asumir una conformación que le permite asociarse con
ROR\beta-LBD. Algunos sistemas de modelización
estiman el efecto inhibidor o de unión potencial de un modulador
potencial de ROR antes de la síntesis y pruebas reales.
Son asimismo bien conocidos los procedimientos
para seleccionar entidades químicas o fragmentos para determinar su
capacidad para asociarse con ROR\beta-LBD. A
menudo estos procedimientos comienzan mediante inspección visual
del sitio activo en la pantalla del ordenador. Entonces se sitúan
los fragmentos o las entidades químicas seleccionadas con el
ROR\beta-LBD. Se logra el acoplamiento utilizando
software tal como QUANTA y SYBYL, seguido por minimización de la
energía y dinámica molecular con campos de fuerza mecánica molecular
convencionales tales como CHARMM y AMBER. Ejemplos de programas
informáticos que pueden ayudar en la selección de fragmento químico
o entidades químicas útiles en la presente invención incluyen, pero
no se limitan a, GRID (Goodford, P. J.J. Med. Chem. 1985 28:
849-857), AUTODOCK (Goodsell, D.S. y Olsen, A.J.
Proteins, Structure, Functions, and Genetics 1990 8:
195-202), y DOCK (Kunts et al. J. Mol. Biol.
1982 161:269-288).
Tras la selección de fragmentos o entidades
químicas preferidas, puede visualizarse su relación entre sí y con
ROR\beta-LBD y después montarse en un modulador de
potencial único. Programas útiles para montar las entidades
químicas individuales incluyen, pero no se limitan a, CAVEAT
(Bartlett et al. Molecular Recognition in Chemical and
Biological Problems Special Publication, Royal Chem. Soc. 78, 00.
182-196 (1989) y sistemas de bases de datos en 3D
(Martin, Y.C. J. Med.Chem. 1992 35:2145-2154).
Alternativamente, pueden diseñarse compuestos de
cero utilizando o bien un sitio activo vacío o bien opcionalmente
incluyendo alguna parte de un inhibidor conocido. Procedimientos de
este tipo de diseño incluyen, pero no se limitan a, LUDI (Bohm
H-J, J. Comp. Aid. Molec. Design 1992
6:61-78) y LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis
MO).
La presente invención también se refiere a un
modulador de ROR\beta selectivo para
ROR\beta-LBD (SRORM), en particular un agonista o
antagonista, identificado mediante un procedimiento computacional de
la invención. La presente invención se refiere además a un método
para tratar una enfermedad relacionada con ROR que comprende
administrar una cantidad eficaz de un antagonista identificado
mediante un procedimiento computacional de la invención.
La presente invención también se refiere a un
método para tratar una enfermedad relacionada con ROR que comprende
administrar una cantidad eficaz de un agonista identificado mediante
un procedimiento computacional de la invención.
Los compuestos identificados como agonistas,
antagonistas o SRORM mediante los procedimientos dados a conocer en
la presente memoria que son activos cuando se administran por vía
oral pueden formularse como líquidos, por ejemplo jarabes,
suspensiones o emulsiones, comprimidos, cápsulas o pastillas para
chupar. Una composición líquida consistirá generalmente en una
suspensión o disolución del compuesto en un(os)
vehículo(s) líquido(s) adecuado(s), por
ejemplo, etanol, glicerina, sorbitol, disolvente no acuoso tal como
polietilenglicol, aceites o agua, con un agente de suspensión,
conservante, tensioactivo, agente humectante, aromatizante o agente
colorante.
Alternativamente, una formulación líquida puede
prepararse a partir de un polvo reconstituible. Por ejemplo, puede
reconstituirse un polvo que contiene principio activo, agente de
suspensión, sacarosa y un edulcorante con agua para formar una
suspensión; puede prepararse un jarabe a partir de un polvo que
contiene principio activo, sacarosa y un edulcorante. Puede
prepararse una composición en forma de un comprimido a partir de un
polvo que contiene principio activo, sacarosa y un edulcorante.
Puede prepararse una composición en forma de un comprimido
utilizando cualquier vehículo(s) farmacéutico(s)
adecuado(s) utilizado(s) de manera rutinaria para
preparar composiciones sólidas. Ejemplos de tales vehículos incluyen
estearato de magnesio, almidón, lactosa, sacarosa, celulosa
microcristalina, aglutinantes, por ejemplo polivinilpirrolidona. El
comprimido también puede dotarse de un recubrimiento con película
de color, o incluirse el color como parte del/de los
vehículo(s). Además, puede formularse principio activo en una
forma farmacéutica de liberación controlada tal como un comprimido
que comprende una matriz hidrófila o hidrófoba. Puede prepararse una
composición en forma de una cápsula utilizando procedimientos de
encapsulación rutinarios, por ejemplo mediante incorporación de
principio activo y excipientes en una cápsula de gelatina dura.
Alternativamente, puede prepararse una matriz semisólida de
principio activo y polietilenglicol de alto peso molecular y
llenarse en una cápsula de gelatina dura; o puede prepararse una
disolución de principio activo en polietilenglicol o una suspensión
en aceite comestible, por ejemplo parafina líquida o aceite de coco
fraccionado y llenarse en una cápsula de gelatina blanda. Los
compuestos identificados mediante los procedimientos descritos en la
presente memoria que son activos cuando se administran por vía
parenteral pueden formularse para su administración intramuscular o
intravenosa. Una composición típica para la administración
intramuscular consistirá en una suspensión o disolución de
principio activo en un aceite, por ejemplo aceite de cacahuete o
aceite de sésamo. Una composición típica para la administración
intravenosa consistirá en una disolución acuosa isotónica estéril
que contiene, por ejemplo principio activo, dextrosa, cloruro de
sodio, un codisolvente, por ejemplo polietilenglicol y,
opcionalmente, un agente quelante, por ejemplo, metabisulfito de
sodio.
Alternativamente, puede liofilizarse la
disolución y después reconstituirse con un disolvente adecuado justo
antes de la administración. Los compuestos identificados que son
activos con la administración rectal pueden formularse como
supositorios. Una formulación de supositorio típica consistirá
generalmente en principio activo con un agente aglutinante y/o
lubricante tal como una gelatina o manteca de cacao u otra grasa o
cera sintética o vegetal con bajo punto de fusión. Los compuestos
identificados que son activos con la administración tópica pueden
formularse como composiciones transdérmicas. Tales composiciones
incluyen, por ejemplo, un refuerzo, depósito de principio activo,
una membrana de control, recubrimiento y adhesivo de contacto. La
dosis diaria típica de un varía según las necesidades individuales,
el estado que va a tratarse y la vía de administración. Las dosis
adecuadas están en el intervalo general de 0,001 a 10 mg/kg de peso
corporal del destinatario al día.
Los ejemplos siguientes se proporcionan a título
ilustrativo y no limitativo de la invención.
Se construyó un ADNc para la expresión del
dominio de unión a ligando del ROR\beta-LBD de
rata (ROR\beta-LBD) utilizando el vector pet15b
(Novagen) para incluir una cola de polihistidina
N-terminal y un sitio de escisión de trombina. Se
hicieron crecer células E. coli BL21 (DE3) en LBM a 37ºC
hasta una DO de 0,6 y se indujeron con IPTG 0,8 mM. Se mantuvo la
incubación a 16ºC durante la noche. Se recogieron las células y se
almacenaron a -20ºC. Se aisló un total de 6-9 mg de
ROR\beta-LBD recombinante de un aglomerado celular
de 6 gramos tras sonicación y cromatografía sobre una resina
quelada con cobalto. ROR\beta-LBD con la cola de
polihistidina con aproximadamente el 90% de pureza eluyó en un
gradiente de imidazol de 0 a 1 M. Se realizó la filtración en gel
con un Superdex S- 200 Hiload 16:60 de Pharmacia. Se concentró
rROR\beta-LBD con la cola de polihistidina con
más del 95% de pureza y homogeneidad tal como se comprobó mediante
SDS-PAGE hasta 5,8 mg/ml en Tris HCl 20 mM, pH =
8,5, DTT 5 mM, Chaps 2 mM y NaCl 100 mM.
Se cristalizó el complejo
ROR\beta-LBD-estearato a 22ºC
mediante difusión en fase de vapor en el modo de gota pendiente. En
los ensayos de cristalización, se utilizó la proteína sin
purificación adicional y se cocristalizó con un exceso de 3 molar
de secuencia coactivadora de péptido que interacciona con NR
SRC-1^{686-700} (RHKILHRLLQEGSPS).
La adición del péptido fue crucial para obtener los cristales. En
el ensayo inicial para obtener condiciones de cristalización, se
realizó una detección de cristalización de matriz poco densa con una
detección propia. Para cada ensayo de cristalización, se preparó
una gota de 4 \mul mezclando 2 \mul de proteína purificada (5,8
mg/ml) con un volumen igual de disolución de reserva. La disolución
de reserva contenía 500 \mul de la disolución de precipitación.
Un cristal que medía 110 x 60 x 30 mm a 22ºC en PEG 6000 al 15% y
Tris HCl 100 mM a pH = 8,0 creció en el plazo de aproximadamente 2
semanas. Se utilizó este cristal en una primera serie de recogida
de datos (tal como se describe a continuación).
Se crioprotegieron los cristales mediante la
equilibración en PEG 6000 al 15% a pH 8,0 que contenía glicerol al
15% y luego se congelaron rápidamente en etano líquido a temperatura
de nitrógeno líquido. Se recogieron los datos de difracción por
rayos X a temperatura de nitrógeno líquido a partir de un único
cristal congelado en la línea de haz ID 14-3 en el
ESRF Grenoble, Francia. Los cristales difractaron rayos X hasta un
límite de resolución de 1,9 \ring{A}. Se integraron todos los
datos y se trazaron a escala utilizando DENZO y SCALEPACK
(Otwinowski y Minor, 1997). El conjunto de datos entre 30 y 3,4
\ring{A} muestra una completitud de resolución del 88,9% con un
Rsym (I) de 2,5. La completitud en alta resolución (entre 3,4 y 1,9)
fue del 99,8% con un Rsym (I) de 3,3. Los parámetros de la célula
unitaria fueron a = 52,302 \ring{A}, b = 58,490 \ring{A} y c =
106,036 \ring{A}, a = b = c = 90º. El cristal estaba compuesto por
un monómero por unidad asimétrica, presentaba un contenido en
disolvente del 52%, y una molécula por unidad asimétrica (volumen de
Mathews = 2,57 \ring{A}^{3} Da^{-1}). El factor B estimado
mediante diagrama de Wilson es 29. La inspección de ausencias
asimétricas a lo largo de cada eje indicó que el grupo de espacio
era ortorrómbico P212121.
En la recogida de datos, los valores de la
última cuba se presentan entre paréntesis.
Se resolvió la estructura del complejo mediante
reemplazo molecular utilizando el programa AmoRe (Navaza, 1994) y
el RAR\gammaholo-LBD (número de registro del
Protein Data Bank, 21bd) como un modelo de búsqueda. La primera
solución presentaba un coeficiente de correlación de 27,8 (la
siguiente solución más alta 26,2) y un factor R de 52,7 tras
perfeccionamiento de cuerpo rígido AMoRe. Se pudo encontrar también
una solución con RAR anta como un modelo de búsqueda según los
siguientes valores: coeficiente de correlación de 21,4 (la
siguiente solución más alta 19,8) y un factor R de 55,9.
Se utilizó el modelo de construcción automático
Arp/wARP (Perrakis A. et al., 1999) combinado con
perfeccionamiento de estructura iterativa y permitió obtener 3
cadenas construidas que corresponden a 243 residuos y un índice de
conectividad de 0,98. Los mapas de densidad de electrones calculados
3Fo-2Fc dieron Rcrist= 0,2703 y Rlibre = 0,2644. Se
construyó un modelo parcial del monómero utilizando el programa de
gráfico O (Jones et al., 1991) y se sometió a series
alternas de perfeccionamiento de cuerpo rígido con
X-PLOR (Brünger, 1996) y construcción manual. Las
etapas finales, utilizando ciclos de perfeccionamiento posicional,
reconstrucción manual, el procedimiento de enfriamiento lento con
torsión del programa X-PLOR, y el perfeccionamiento
del factor B isotrópico individual dio Rcrist = 0,2238 y Rlibre =
0,2494. El modelo final perfeccionado a 1,9 \ring{A}, comprende
244 residuos, un ligando, un péptido de 10 residuos de aminoácidos
y 146 moléculas de agua. Según Procheck (Laskowski et al.,
1993) el 93,2% de todos los residuos en el modelo estás en regiones
de Ramachandran de ángulos de torsión de cadena principal más
favorecidas, el 5,9% en regiones permitidas adicionales, el 0,4% en
regiones permitidas generosamente y el 0,4% están en regiones no
permitidas. Estos últimos porcentajes corresponden a dos residuos
(D403 y E404) que se sitúan en el bucle 9-10, que no
presenta una densidad bien definida.
\vskip1.000000\baselineskip
Se completa la estructura de
ROR\beta-LBD desde los residuos 208 hasta 451.
El análisis de la estructura con el programa
Procheck mostró sólo excepciones menores a la geometría permitida.
En la estructura, los primeros siete residuos de la cadena
(201-207) no se observan en el mapa de densidad de
electrones y probablemente están desordenados. Esto deja sólo un
residuo antes del residuo inicial de la primera
\alpha-hélice (H1) en la estructura tipo natural.
En el extremo C-terminal, sólo el ultimo residuo
(452) no se muestra en el mapa de densidad de electrones. El bucle
entre las hélices H9 y H10 (residuos N399 y E405) no está bien
definido.
Tal como se esperaba, el
ROR\beta-LBD tiene la misma estructura
tridimensional global que las de los LDB de receptores de hormonas
nucleares. Se pliega la molécula en una "intercalación
helicoidal" que consiste en 10 hélices \alpha. Hay dos
fragmentos pequeños de cadena beta, que forman una lámina beta corta
situada en el núcleo de la molécula entre las hélices 5 y 6
próximas al sitio de unión a ligando. Se pliega la hélice 12 hacia
el núcleo de dominio de unión a ligando. Su último giro entra en
contacto próximo a H4, H11 y el péptido coactivador. Una superficie
de interacción que comprende los residuos de la región
H3-H4 y H12 permite que se una el péptido
coactivador. Se observa la siguiente secuencia del péptido en la
estructura del cristal: HKILHRLLQE. El motivo LXXLL denominado
también caja NR se incluye en una hélice \alpha anfipática que
interacciona con una hendidura hidrófoba en la superficie del LBD.
En particular, las cadenas laterales de Leu 693 y Leu 694 forman
parte de un grupo hidrófobo compuesto también por Val 274 (H3), Ile
292 (H4) y Leu 295 (H4).
El \gamma carboxilato de E448 (H12) forma
puentes de hidrógeno con las amidas de la estructura principal de
Leu 697 y Leu 698, los residuos del giro en
N-terminal de la hélice peptídica. Ya se ha descrito
esta interacción de ocupación en N (Nolte et al., 1998,
Shiau et al., 1998). Se conoce este residuo de glutamato
altamente conservado por ser importante para la transactivación.
Otro puente de hidrógeno requiere Gin 288 (H4) OE2 con NE2 de His
695. La cadena lateral de Glu 700 forma un puente de hidrógeno
mediado por agua al carbonilo del residuo Arg 696.
El volumen del hueco de unión a ligando es 758
\ring{A}^{3}, que es próximo al de VDR (660 \ring{A}3)
(Rochel et al., 2000). Se encontró un ligando fortuito, el
ácido esteárico, en el hueco de unión a ligando, que se caracterizó
previamente por espectrometría de masas. Por tanto, parece que el
ácido esteárico endógeno de E. coli se copurificó y se
cocristalizó con el ROR\beta-LBD expresado de
manera heteróloga. Se oculta el ácido graso (FA) en un hueco
predominantemente hidrófobo formado por los residuos situados en H3
(Gin 265, Ile 266, Ala269), H5 (Leu 300, Val 303, Leu 97), el bucle
H5-H6 (Phe 113), H6 (Phe 320) y H7 (Leu 131, Val
338). La mayoría de estos residuos realizan interacciones de van der
Waals con la cadena alifática del FA (figura 3a). La cavidad
contiene también 11 moléculas de agua ordenadas. Un átomo de oxígeno
del grupo carboxilato forma un puente de hidrógeno con NE2 de Gln
265. Este residuo varía entre ROR\alpha y \beta. El otro átomo
de oxígeno del grupo carboxilato forma un puente de hidrógeno con
dos moléculas de agua ordenadas. Estas dos moléculas forman parte
de una red de puentes de hidrógeno, que conecta el carboxilato a
otros residuos conservados entre ROR\alpha y \beta del LBD
concretamente Gln 228 y Arg 306. El estearato adopta una
conformación en forma de U tras la unión.
Tal como se mencionó anteriormente, el
constructo ROR\beta-LBD en el que se han eliminado
las dos cisteínas expuestas a disolvente
C-terminales mediante truncamiento de un segmento
C-terminal de 7 residuos ha demostrado ser una
herramienta valiosa para conseguir otras estructuras de cristal de
ROR\beta-LBD en complejo con otros ligandos. Esto
se ilustra a continuación con la descripción de la cristalización y
la determinación de la estructura del complejo
ROR\beta-LBD/ATRA (ácido todo-trans
retinoico). Esta nueva estructura revela otro modo de unión para el
ligando y sugiere que retinoides naturales y sintéticos son ligando
candidatos para ROR\beta. Por tanto puede someterse a prueba esta
familia de compuestos para determinar su unión al
ROR\beta-LBD, por ejemplo mediante espectrometría
de masas, y puede intentarse la cristalización en los casos
positivos. A partir de las estructuras obtenidas, pueden diseñarse,
sintetizarse, someterse a prueba in vivo, in vitro,
así como para determinar su cristalización, ligandos con alta
afinidad. Incluso sin la estructura del cristal de otros complejos,
puede lograrse la filtración para la selección de ligandos y/o
diseño de mejores ligandos a través de estudios de acoplamiento
in computo.
Se cristalizó el complejo
ROR\beta-LBD/ATRA mediante difusión en fase de
vapor en gota pendiente. Se cocristalizó la proteína (el
ROR\beta-LBD que contiene ácido esteárico,
purificado tal como anteriormente) con un exceso de ATRA y un
exceso de SRC-1 (residuos 686-700)
en condiciones similares a las del complejo
ROR\beta-LBD/STE (ácido esteárico). Se preparó
una gota de 4 \mul mezclando 2 \mul de proteína purificada (5,8
mg/ml) con un volumen igual de disolución de reserva. La disolución
de reserva (500 \mul) contenía PEG 6000 al 18% y Tris HCl 100 mM
pH = 8,0. Un cristal que medía 300 x 160 x 100 \mum creció en el
plazo de 2 semanas a 22ºC.
Se crioprotegieron los cristales con una
película de aceite de parafina viscoso y luego se congelaron
rápidamente en etano líquido a temperatura de nitrógeno líquido. Se
recogieron los datos de difracción por rayos X a temperatura de
nitrógeno líquido a partir de un único cristal congelado en la línea
de haz BM14-CRG en el ESRF Grenoble, Francia. Los
cristales difractaron rayos X hasta un límite de resolución de 2,1
\ring{A}. Se integraron todos los datos y se trazaron a escala
utilizando DENZO y SCALEPACK (tabla 5). El conjunto de datos entre
20,0 y 2,1 \ring{A} muestra completitud del 100% con un Rsym (I)
del 4,5%. La completitud en la cuba de resolución más alta
(2,17-2,10 \ring{A}) fue el 100% con un Rsym (I)
del 17,5%. Los parámetros de la célula unitaria fueron a = 52,199
\ring{A}, b = 58,125 \ring{A} y c = 106,039 \ring{A}, a = b =
c = 90º. El cristal contiene un monómero por unidad asimétrica y un
contenido en disolvente del 52%, y una molécula por unidad
asimétrica. El factor B estimado mediante diagrama de Wilson es 32.
La inspección de ausencias asimétricas a lo largo de cada eje
indicó que el grupo de espacio era P212121.
Se resolvió la estructura del complejo mediante
reemplazo molecular utilizando el complejo
ROR\beta-LBD/STE como modelo de partida. Se
construyó el ácido todo-trans retinoico utilizando Quanta
(MSI). El modelo final (Rcrist = 0,2180 y Rlibre =0,2549),
perfeccionado a 2,1 \ring{A} (tabla 5), comprende 244 residuos
del ROR\beta-LBD, 10 residuos del péptido, un
ligando y 139 moléculas de agua. Según Procheck, el 91,2% de todos
los residuos en el modelo estás en las regiones Ramachandran de
ángulos de torsión de cadena principal más favorables, el 5,9% en
regiones permitidas adicionales, el 2,1% en regiones permitidas
generosamente y el 0,0% en regiones no permitidas.
En la tabla 6 se enumeran los contactos
proteína-ligando en 3,5 \ring{A}. La presente
estructura revela el sitio de unión para el grupo carboxilato de
ATRA, que está unido por hidrógeno a Arg 306 y Arg 309 a través de
una molécula de agua en cada caso (figura 6). El modo de unión es
diferente del estearato (figura 7), que está unido por hidrógeno a
Gln 265 directamente y a Gln 228 a través de una molécula de agua.
Por otro lado, el estearato hace más contactos de Van der Waals con
residuos de hueco gracias a su cadena flexible que toma una forma
de U probablemente con el fin de maximizar el número de tales
contactos. ATRA es más rígido, permitiendo menos contactos de Van
der Waals. Por tanto, parece haber un equilibrio delicado entre la
unión del ligando mediante contactos de Van der Waals y puentes de
hidrógenos al ROR\beta-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron HT22 en medio de Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM). Se suplementó el medio con suero bovino fetal
sin lípidos al 5%, penicilina, estreptomicina y glutamina. Se
llevaron a cabo ensayos de transfección transitoria en placas de 24
pocillos (0,5 x 10^{5} células por pocillo) mediante lipofección
(Roche Molecular Biochemicals)
N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamoniometilsulfato
(DOTAP) según el protocolo del fabricante. Se sometió a ensayo la
actividad de luciferasa tal como se recomienda por el fabricante
(Promega) en un luminómetro de microplacas (EG & G Berthold).
Se normalizaron las unidades luminosas relativas según (Muller
et al., 2002) y se determinó la concentración de proteína
utilizando el ensayo de colorante de Bradford
(Bio-Rad). Se repitieron todos los experimentos por
lo menos cinco veces.
Ligandos. Los ligandos adquiridos
incluyen los siguientes: ácido
todo-trans-[20-metil-3H]-retinoico
(65 Ci/mmol) (NEN); ácido todo-trans retinoico (Sigma)
Plásmidos recombinantes. Plásmidos
indicadores. G5E1BTataLuc
Vectores de expresión.
CMX-Gal,
CMX-Gal-ROR\beta201-459,
pGEX-ROR\beta201-459 descritos en
(Greiner et al., 1996)
Ensayos de unión a ligando. Se realizaron
los ensayos de proximidad por centelleo con
ROR\beta-LBD expresado en bacterias purificado
(Stehlin et al 2001) (250 ng por pocillo) y ácido
todo-trans-[20-metil-3H]-retinoico
(60 Ci/mMol, NEN) en placas de 96 pocillos rápidas NiNTA (NEN) en
un volumen total de 100 \mul. Tampón de unión: HEPES 40 mM pH
7,6, KCl 40 mM, CHAPS al 0,2%, 0,1 mg/ml de BSA. Se llevó a cabo la
unión durante 1 hora a 4ºC en 100 \mul de tampón de unión. Se
diluyó el radioligando en tampón de unión hasta una concentración
final de 5 nM. Se diluyeron en serie los ligandos competitivos no
marcados en tampón de unión y se añadieron a concentraciones
finales que oscilaban desde 1 nM hasta 10 \muM. Se agitaron las
placas a 25ºC durante 2 horas. Luego se midió la radiactividad con
un Packard Topcount a 2 min por pocillo. Se sometieron a ensayo
todas las concentraciones por triplicado y se calcularon los
promedios de los resultados. Los valores de pocillo en ausencia de
competidor representaron el 100% de unión. Los experimentos de unión
por saturación utilizaron las concentraciones de ligando indicadas
en la figura. Se determinó la unión no específica incluyendo ácido
retinoico no marcado a 10^{-4} M y se restó de la unión total. Se
realizaron los análisis de regresión no lineal para las curvas de
competición, unión por saturación y análisis de Scratchard para
determinar Kd utilizando GRAPHPAD PRISM.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDOS DERIVADOS DEL RECEPTOR
HUÉRFANO RELACIONADO CON EL ÁCIDO RETINOICO (ROR), Y SUS
APLICACIONES
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> IOB 01 CNR RORB
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 732
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(732)
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\beta humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma de ratón
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha de ratón
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\beta humano
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma humano
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<212> PRT
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma de ratón
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Artificial: fragmento de ROR\alpha humano
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<213> Secuencia Artificial
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ROR\beta de rata
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha de ratón
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<400> 19
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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<400> 20
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<211> 243
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\beta humano
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<400> 21
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma humano
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<400> 22
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<210> 23
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<211> 241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma de ratón
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha humano
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha de ratón
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha\beta humano
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma de ratón
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha humano
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha de ratón
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de nucleótidos que codifica un fragmento de
ROR\beta de rata
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<212> PRT
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\beta humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma humano
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<212> PRT
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\gamma de ratón
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Artificial: fragmento de ROR\alpha humano
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: fragmento de ROR\alpha de ratón
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<400> 37
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Claims (17)
1. Polipéptidos del receptor huérfano
relacionado con ácido retinoico (ROR) en mamíferos,
caracterizados porque son fragmentos de ROR\beta, \alpha
o \gamma de rata, ser humano o ratón, delimitados en su extremo
N-terminal por el aminoácido situado en una de las
posiciones 201 a 209 de las secuencias de ROR representadas en la
figura 3, y en su extremo C-terminal por el
aminoácido situado en una de las posiciones 451 ó 452, de las
secuencias de ROR representadas en la figura 3.
2. Polipéptidos según la reivindicación 1,
seleccionados de entre:
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\newpage
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
3. Polipéptidos según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizados porque presentan las características
siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
4. Complejos moleculares que comprenden un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando
dicho polipéptido en asociación con:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
5. Secuencia de nucleótidos que codifica para un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
6. Secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 5, asociada a los elementos necesarios para la
transcripción de esta secuencia, particularmente un promotor y un
terminador de la transcripción.
7. Vector, particularmente un plásmido, que
comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 5 ó
6.
8. Células huésped, tales como E. coli,
transformadas con un vector según la reivindicación 7.
9. Procedimiento para obtener un polipéptido
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un complejo
molecular según la reivindicación 4, caracterizado porque
comprende:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
10. Cristal que comprende un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un complejo molecular
según la reivindicación 4.
11. Cristal según la reivindicación 10,
caracterizado porque dicho cristal difracta a una resolución
de por lo menos 3 angstroms y presenta una estabilidad de cristal
dentro del 5% de sus dimensiones de la célula unitaria.
12. Cristal según la reivindicación 10 u 11, en
el que el ROR-LBD tiene las dimensiones de la célula
unitaria siguientes en angstroms: a = 52,302 \ring{A}, b = 58,490
\ring{A} y c = 106,036 \ring{A}, \alpha = \beta = \chi =
90º, y un grupo de espacio ortorrómbico P212121.
13. Cristal según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, tal como se obtiene llevando a cabo un
procedimiento según la reivindicación 9, y que comprende una etapa
de cristalización en disolventes acuosos de los polipéptidos
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o los complejos
moleculares según la reivindicación 4, especialmente a 4ºC mediante
el procedimiento de difusión de vapor en gota pendiente.
14. Utilización de los polipéptidos según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de los complejos
moleculares según la reivindicación 4, o de los cristales según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para llevar a cabo:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
15. Utilización según la reivindicación 14, para
el cribado de compuestos que actúan como agonistas o antagonistas
de ROR, resultando útiles dichos compuestos en el marco del
tratamiento de patologías relacionadas con el sistema nervioso
central, la organización retiniana, la integración de la señal
sensorial, la motricidad y la esterilidad.
16. Procedimiento para el cribado de un ligando
de ROR-LBD que es un agonista, o un antagonista de
dicho receptor, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
17. Procedimiento para el análisis de la
estructura tridimensional de los complejos formados con un
polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un
complejo molecular según la reivindicación 4, o un cristal según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, y un compuesto
particular susceptible de ser un ligando de
ROR-LBD, comprendiendo dicho procedimiento las
etapas siguientes:
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
- -
-
\vtcortauna
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