ES2326516T3 - Cristal. - Google Patents
Cristal. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2326516T3 ES2326516T3 ES01923873T ES01923873T ES2326516T3 ES 2326516 T3 ES2326516 T3 ES 2326516T3 ES 01923873 T ES01923873 T ES 01923873T ES 01923873 T ES01923873 T ES 01923873T ES 2326516 T3 ES2326516 T3 ES 2326516T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- lbd
- ligand
- har
- hpr
- lbp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
- C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Cristal que consiste en un dominio de unión de ligando del receptor de andrógenos (AR-LBD), en el que dicho AR-LBD comprende un bolsillo de unión de ligando (LBP) y un ligando unido al LBP, en el que el ligando es metribolona (R1881), y en el que dicho cristal presenta las coordenadas estructurales proporcionadas en la Tabla 4 (figura 6).
Description
Cristal.
La presente invención se refiere a una
estructura cristalina.
En particular, la presente invención se refiere
a una estructura cristalina para un dominio de unión de ligando
(LBD).
En particular, la presente invención se refiere
a una estructura cristalina para un dominio de unión de ligando
(LBD) que tiene opcionalmente un ligando que está asociado al
mismo.
En particular, la presente invención se refiere
a una estructura cristalina para un LBD de un receptor.
Más en particular, la presente invención se
refiere a una estructura cristalina para un LBD de un receptor de
andrógeno (AR-LBD), y también a una estructura
cristalina para un complejo de
AR-LBD-ligando.
La estructura se puede usar para determinar
homólogos del receptor de andrógenos e información sobre estructuras
secundarias y terciarias de polipéptidos que todavía no están
estructuralmente caracterizados. La estructura también se puede
usar para identificar ligandos que son capaces de unirse al receptor
de andrógenos. Tales ligandos pueden ser capaces de actuar como
moduladores de la actividad del receptor de andrógenos.
La estructura cristalina de
AR-LBD permite producir un modelo para determinar la
actividad del receptor de andrógenos. De este modo, la presente
invención proporciona un modelo que se puede usar para comprender
las implicaciones estructurales del mecanismo de unión.
El receptor de andrógenos (AR) es un miembro de
la superfamilia de receptores nucleares que incluye, entre otros,
los receptores de esteroides así como los receptores de la vitamina
D, del tiroides, del ácido retinoico, y los receptores denominados
huérfanos. Además, el AR es un miembro de un grupo de cuatro
receptores de esteroides estrechamente relacionados que incluyen
los receptores de progesterona (PR), el receptor de
mineralocorticoide y el receptor de glucocorticoide, todos los
cuales reconocen el mismo elemento de respuesta hormonal. En
general, los receptores de esteroides comprenden cinco a seis
dominios que actúan como factores de transcripción, activados por
ligandos, que controlan la expresión de genes específicos. La región
de unión de ligando está localizada en el dominio C terminal, y se
denomina el dominio de unión de ligando (LBD). La unión de un
ligando (tal como una hormona esteroidea) al LBD induce cambios en
la conformación del recepto que controla la activación y represión
transcripcional y también regula la
homo-heterodimerización. En ausencia de ligando,
estos receptores reprimen la expresión génica basal, probablemente
mediante la expresión de proteínas
co-represoras.
Las hormonas androgénicas y sus receptores
desempeñan un papel importante en la fisiología y patología
masculina. El receptor de andrógenos se une a esteroides del sexo
masculino, dihidrotestosterona (DHT) y testosterona [Teutsch,
1994], y regula genes para la diferenciación y desarrollo
masculinos. En consecuencia, las mutaciones constitucionales en el
gen del receptor de andrógenos pueden conducir a varios estados
mórbidos. Algunos ejemplos de estos estados mórbidos incluyen
cáncer de próstata (PC) y el síndrome de insensibilidad a andrógenos
(AIS), que son capaces de alterar en diversos grados la
diferenciación sexual masculina dependiente de andrógenos. Además,
el síndrome de insensibilidad completa a andrógenos (CAIS) conduce a
un fenotipo femenino inequívocamente externo. Por el contrario, el
síndrome de insensibilidad parcial o incompleta a andrógenos (PAIS)
comprende un amplio espectro de fenotipos clínicos, mientras que el
síndrome de insensibilidad leve a andrógenos (MAIS) está relacionad
con formas de subvirilización [Bellis, 1992]. Se encontró que
aproximadamente el 50% de los restos mutados dados a conocer en el
dominio de unión de ligando del receptor de andrógenos humano
(hAR-LBD) hasta la fecha están implicados en el
cáncer de próstata (PC) y en AIS [Gottlieb, 1998]. Estas mutaciones
se han documentado bien en la Androgen Receptor Gene Mutations
Database de la Lady Davis Institute for Medical Research [Gottlieb,
1998].
Hasta la fecha, hay un total de 20 restos de
aminoácidos conocidos en el AR LBD que están implicados en la
interacción de ligandos. De estos 20 restos de aminoácidos, hasta la
fecha, se han dado a conocer mutaciones en 14 de los 20 restos de
aminoácidos. Estas mutaciones están principalmente en el bolsillo de
unión de ligando (LBP), que es parte del AR-LBD. A
título de ejemplo, las tres mutaciones en el LBP del hAR, que se han
descrito para CAIS, siendo éstas N705S [Bellis, 1992; Pinsky,
1992], L707R [Lumbroso, 1996] y M749V [Bellis, 1992; Jakubicza,
1992], están reconocidas como sustituciones que cambian
considerablemente el tamaño y las propiedades de carga de las
cadenas laterales de los aminoácidos respectivos. Sin embargo,
aunque se sabe que estas sustituciones de aminoácidos dan como
resultado un cambio considerable en el tamaño de las cadenas
laterales de los aminoácidos respectivos, no se conoce cómo éste
cambio de tamaño altera el AR-LBD de forma que se
perturbe la estructura local y las interacciones con el ligando.
Además, debido a que no se han determinado ni las implicaciones
estructurales ni los efectos de estas mutaciones conocidas, no están
disponibles datos de unión de ligandos para muchas de las
mutaciones publicadas en el AR-LBD.
Con el fin de desarrollar una comprensión de las
implicaciones estructurales de mutaciones que dan como resultado
sustituciones de aminoácidos en el AR-LBD, se han
hecho intentos para determinar las estructuras primarias,
secundarias y terciarias del AR-LBD. A este
respecto, se han analizados los LBD de las diferentes familias de
receptores nucleares, y se ha mostrado que comparten un plegamiento
similar a pesar de su baja (aproximadamente 20%) homología de
secuencias. A este respecto, se ha mostrado que el plegamiento del
receptor comprende aproximadamente 12 hélices y varias láminas
\beta pequeñas dispuestas en un denominado "sándwich
\alpha-helicoidal". Hasta ahora, este tipo de
plegamiento sólo se ha observado para los LBD de receptores
nucleares. Sin embargo, también se ha mostrado que, dependiendo de
la naturaleza del ligando unido, que puede ser un agonista o un
antagonista, la hélice carboxiterminal H12 se puede encontrar en
una de dos orientaciones. En la conformación unida al agonista, la
hélice H12 sirve como una "tapa" para cerrar el bolsillo de
unión de ligando (LBP), que contiene el LBD, mientras que, en la
conformación unida al antagonista, la hélice H12 está situada en una
orientación diferente, abriendo así la entrada al LBP.
A pesar de la disponibilidad de información con
respecto al papel de la región de la hélice H12 en la unión del
ligando, hay muy poca información experimental disponible sobre la
estructura o el papel de las otras regiones helicoidales (tales
como las hélices H1 a H11) con respecto a la unión del ligando. A
título de ejemplo, se ha sugerido que las hélices H4 y H5 pueden
ser regiones implicadas en la unión del ligando. Sin embargo, no
hay información experimental con respecto a estas hélices en el
AR-LBD. Además, aunque se piensa que, mientras que
aproximadamente el 50% de los restos mutados dados a conocer en el
hAR LBD están implicados en el cáncer de próstata (PC) y en AIS
[Gottlieb, 1998], no se sabe experimentalmente si las mutaciones se
encuentran predominantemente en el interior de la proteína del
receptor o en la superficie de la proteína del receptor.
Estructuralmente, se sabe que los receptores
nucleares, tales como el receptor de andrógenos, se pueden organizar
en módulos funcionales que comprenden un dominio de activación
transcripcional N-terminal, un dominio de unión de
ADN (DBD) central y un dominio de unión de ligando (LBD)
C-terminal. Durante estos últimos años, se han
publicado estructuras de rayos X para dos de los dominios, el
dominio de unión de ADN así como para un número de dominios de
unión de ligando (LBD), incluyendo complejos de
LBD-ligando de receptores tales como el receptor de
estrógenos \alpha y \beta, el receptor de progesterona (PR), el
receptor de la vitamina D, los receptores del ácido retinoico (X:
RXR, ácido: RAR), el receptor de la hormona tiroidea y los
receptores activados por el proliferador peroxisómico [Moras, 1998;
Brzozowski, 1997; Tannenbaum, 1998; Shiau, 1998; Bourguet, 1995;
Renaud, 1995; Wagner, 1995; Ribeiro, 1998; Williams, 1998; Nolte,
1998; Uppenberg, 1998; Klaholz, 1998; Rochel, 1999].
Hasta la fecha, no se han publicado estructuras
de rayos X para el AR-LBD solo o en combinación con
un ligando. Aunque se ha desarrollado una estructura modelo del
AR-LBD por Yong et al (1998), este modelo se
basa en la estructura cristalina del LBD de RAR\alpha [Bourguet,
1995] y no en el AR-LBD o en un receptor más
estrechamente relacionado, tal como un PR-LBD.
Además, no hay ninguna estructura tridimensional (3D)
experimentalmente determinada para un receptor de andrógenos
completo, ya sea solo o en combinación con un ligando. Además,
aunque la estructura cristalina del LBD del receptor de progesterona
(PR) en el complejo con progesterona se publicó en 1998 por
Williams y Sigler, no se han llevado a cabo análisis experimentales
comparativos entre receptores de esteroides estrechamente
relacionados, tales como un LBD del receptor de andrógenos y el
receptor de progesterona, ya sea solos o complejados con ligandos
con el fin de identificar especificidades de ligandos y/o restos
específicos de ligandos.
En un aspecto amplio, la presente invención se
refiere a estructuras cristalinas de dominios de unión de ligando
de un receptor, incluyendo sus usos.
Según un primer aspecto de la invención, se
proporciona una estructura cristalina que comprende un
AR-LBD.
En una forma de realización preferida, la
estructura cristalina es una estructura cristalina para un
AR-LBD.
La estructura de un AR-LBD
cristalino se ha resuelto y se expone en la Tabla 4.
En un segundo aspecto, la presente invención
proporciona una estructura cristalina que comprende un complejo de
AR-LBD-ligando.
En un tercer aspecto, la presenta invención
proporciona una estructura cristalina que comprende un
AR-LBP.
Según un cuarto aspecto de la invención, se
proporciona un modelo de por lo menos parte de un
AR-LBD obtenido usando o que comprende o
representando un estructura cristalina según uno cualquiera de los
aspectos primero, segundo y tercero de la invención. La estructura
cristalina del aspecto primero, segundo y tercero de la invención,
y el modelo del cuarto aspecto de la invención, se pueden
proporcionar en forma de un medio legible por ordenador.
Los cristales y modelos de los aspectos
anteriores de la invención pueden proporcionar información sobre los
contactos atómicos implicados en la interacción entre el receptor y
un ligando conocido, que se puede usar para cribar ligandos
desconocidos.
Según un quinto aspecto de la invención, se
proporciona un método de cribado para un ligando capaz de unirse a
un dominio de unión del receptor de andrógenos, que comprende el uso
de una estructura cristalina según una cualquiera de los aspectos
primero, segundo o tercero de la invención, o un modelo según el
cuarto aspecto de la invención. Por ejemplo, el método puede
comprender la etapa de poner en contacto el AR-LBD
con un compuesto de ensayo, y determinar si dicho compuesto de
ensayo se une a dicho dominio de unión de ligando. El método puede
ser un método in vitro y/o un método in silica y/o un
método in vivo.
En un sexto aspecto, la presente invención
proporciona un ligando identificado mediante un método de cribado
del quinto aspecto de la invención. Preferentemente, ligando es
capaz de modular la actividad de un AR-LBD. Como se
mencionó anteriormente, los ligandos que son capaces de modular la
actividad de los AR-LBD tienen un potencial
terapéutico y profiláctico considerable.
En un séptimo aspecto, la presente invención
proporciona el uso de un ligando según el sexto aspecto de la
invención, en la fabricación de un medicamento para tratar y/o
prevenir una enfermedad en un paciente mamífero. También se
proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho
ligando, y un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que
comprende la etapa de administrar dicho ligando o una composición
farmacéutica a un paciente mamífero.
Las estructuras cristalinas y modelos descritos
anteriormente también proporcionan información sobre la estructura
secundaria y terciaria de los AR-LBD. Esto se puede
usar para recoger información estructural sobre otros polipéptidos
previamente no caracterizados. De este modo, según un octavo aspecto
de la invención, se proporciona un método para determinar las
estructuras secundarias y/o terciarias de polipéptidos con
estructura desconocida (o sólo parcialmente conocida), que
comprende la etapa de usar dicho cristal o modelo. El polipéptido
bajo investigación está preferentemente relacionado estructural o
funcionalmente con el dominio de unión de ligando del receptor de
andrógeno. Por ejemplo, el polipéptido puede mostrar un grado de
homología a lo largo de parte o de toda la secuencia de aminoácidos
primaria. Como alternativa, el polipéptido puede realizar una
función análoga, o se puede sospechar que muestra un mecanismo de
unión similar al AR-LBD.
La presente invención demuestra que la
estructura cristalina de hAR-LBD se puede usar para
analizar y explicar las implicaciones estructurales de 14
mutaciones conocidas en el LBP del hAR LBD que están asociadas con
cáncer de próstata (PC), el síndrome de insensibilidad parcial del
receptor de andrógenos (PAIS), el síndrome de insensibilidad leve
del receptor de andrógenos (MAIS) o el síndrome de insensibilidad
completa del receptor de andrógenos
(CAIS).
(CAIS).
La presente invención demuestra asimismo que se
puede usar una estructura cristalina de un AR-LBD
para identificar ligandos (tales como agonistas/antagonistas) con
especificidad de unión por el AR LBD. De esta manera, los
compuestos se pueden seleccionar, mejorar o modificar para mejorar
esta interacción de unión de ligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención proporciona asimismo la
estructura cristalina del hAR LBD humano en complejo con el ligando
metribolona (R1881) y la estructura cristalina del hPR LBD humano en
complejo con el ligando metribolona (R1881). La provisión, por
primera vez, de estas dos estructuras cristalinas tridimensionales
(3D) determinadas experimentalmente ha facilitado que se extraiga
una comparación entre la estructura cristalinas de ambos receptores
en complejo con el mismo ligando. Hasta ahora, se ha conocido de
estudios sobre receptores modelos que el AR-LBD y
el PR-LBD tienen un número de similitudes por
cuánto:
- (i)
- pertenecen a la misma subfamilia de receptores de esteroides;
- (ii)
- comparten aproximadamente 54% de identidad de secuencia de LBD (figura 1); y
- (iii)
- hay un número de diferentes ligandos con afinidades similares para ambos receptores [Teutsch, 1994].
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención destaca una similitud
adicional entre los complejos de hAR-LBD y
hPR-LBD con el ligando por cuánto las estructuras
tridimensionales del hAR LBD así como el hPR LBD demuestran el
plegamiento típico de receptores nucleares.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención demuestra asimismo algunas
diferencias hasta ahora desconocidas, pero importante, entre los
dos receptores. Éstas incluyen:
- (i)
- la identificación de un cambio de dos restos de aminoácidos en el bolsillo de unión de ligando (LBP) del AR-LBD que es el sitio más probable para la unión específica del ligando R1881 al hAR-LBD. Los restos de aminoácidos de AR-LBD son Leu 880 y Thr 877. Los restos de aminoácidos de PR-LBD correspondientes son Thr 894 y Cys 891. Además, hay otros tres cambios de aminoácidos que pueden estar implicados en la unión de ligandos distintos de R1881. Los restos de aminoácidos de AR son Gln 783, Met 749 y Phe 876. Los restos de aminoácidos de PR son Leu 797, Leu 763 y Tyr 890.
- (ii)
- la demostración de que el complejo de hPR LBD-R1881 cristaliza como un dímero en la unidad asimétrica, mientras que el complejo de hAR LBD-R1881 cristaliza como una unidad monomérica.
- (iii)
- la demostración de que las dos moléculas independientes en la estructura cristalina de hPR LBD-R1881 muestran diferentes modos de unión de ligando. Una orientación de R1881 en un monómero se parece a la de R1881 en el complejo de hAR LBD, mientras que en el segundo monómero R1 881 está orientado de forma similar a la progesterona en el complejo de hPR LBD-progesterona.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención demuestra los hallazgos
sorprendentes e inesperados de que:
- (i)
- la hélice H6 en el AR-LBD es una hélice \alpha. Por el contrario, sorprendentemente, no se encontró la hélice \alpha en el modelo hAR-LBD en esta área o en el complejo de hPR-LBD-progesterona (Molécula A) (véase la figura 4), mientras que se observa una hélice \alpha en el complejo de hPR-LBD-progesterona (Molécula B).
- (ii)
- las hélices H4 y H5, y las hélices H10 y H11, son preferentemente hélices contiguas. Esto es, estas hélices H4 y H5, y H10 y H11, están conectadas entre sí para formar 2 hélices continuas en lugar de 4 hélices separadas. En consecuencia, la estructura de sandwich helicoidal de tipo \alpha para el AR-LBD comprende preferentemente 9 regiones \alpha-helicoidales en lugar de preferentemente 11 \alpha-hélices. Esta observación no se dio en el PR-LBD con el ligando (Williams, 1998), que comprende 10 hélices \alpha, y en el que sólo las hélices H10 y H11 son secuencias contiguas.
- (iii)
- en el complejo de hAR-LBD-R1881, la hélice H12 se divide en dos segmentos helicoidales más cortos, con 9 y 5 restos de aminoácidos respectivamente. Esta observación no se observó en la estructura del complejo de hPR LBD-R1881, aunque también se observó una flexión de la hélice H12. Puesto que se sabe que la hélice H12 puede influir la unión de antagonistas y agonistas, éste hallazgo puede tener implicaciones importantes para la unión de ligandos.
- (iv)
- la demostración de que las dos moléculas independientes en la estructura cristalina de hPR LBD-R1881 muestra diferentes modos de unión de ligando. Una orientación de R1881 en un monómero se parece a la de R1881 en el complejo de hAR LBD, y en el segundo monómero R1881 está orientado de forma similar a la progesterona en el complejo hPR LBD-progesterona.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención es ventajosa puesto que la
determinación de la estructura 3D del AR-LBD permite
que se cartografíe el AR-LBD.
El uso de la estructura cristalina en conjunción
con este mapa permite una comprensión mejor de las especificidades
de ligandos por el AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
En particular, la estructura cristalina de la
presente invención permite observar ahora:
- (i)
- no sólo cómo un ligando se une al AR-LBD, sino también,
- (ii)
- las razones estructurales de porqué un ligando se une a un AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Usando la estructura cristalina, estos efectos
no sólo se pueden comprender sino también se pueden predecir. Esta
comprensión mejorada del AR-LBD facilita la
identificación y modificación de ligandos que son capaces de
interactuar específica y/o preferentemente con el
AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención también es ventajosa ya
que facilita:
- (i)
- la identificación y caracterización de los restos clave dentro del AR-LBD, y una comparación con los asociados con el PR-LBD. A este respecto, la presente invención demuestra un nuevo hallazgo importante en relación con el complejo de PR-LBD-progesterona. A este respecto, se ha mostrado que Asn 705 en el AR-LBD, y Asn 719 en el PR-LBD, son capaces de actuar como parejas de enlaces de hidrógeno para ligandos, que tienen, por ejemplo, un grupo hidroxilo unido a la posición 17 o a un sustituyente unido a la posición 17 en un ligando esteroideo.
- (ii)
- la identificación y caracterización de la interacción de ligandos con los sitios de AR-LBD.
- (iii)
- la identificación de ligandos con propiedades mejoradas capaces de interactuar con uno o más restos del LBD. Estas propiedades mejoradas incluyen, pero no se limitan a: (a) mayor afinidad, (b) selectividad mejorada por el AR, y/o (c) un grado designado de eficacia (agonismo frente a agonismo parcial frente a antagonismo frente a antagonismo parcial).
- (iv)
- el diseño de uno o más ligandos que se pueden unir específicamente a un AR-LBD pero no a un PR-LBD (es decir, un ligando selectivo).
- (v)
- la determinación de los efectos estructurales asociados con una mutación. (A este respecto, aunque se conocen muchos de los rasgos fenotípicos asociados con las mutaciones caracterizadas en el gen del receptor de andrógenos, no se han determinado las implicaciones estructurales de tales mutaciones).
- (vi)
- la identificación de ligandos capaces de superar la mutación/perturbación estructural en el AR-LBD y/o LBP que comprende el AR-LBD.
- (vii)
- la determinación de datos de unión de ligandos (constantes de afinidad, etc.) que no han estado disponibles para muchos de los receptores mutantes publicados.
- (viii)
- la implementación de un diseño de fármacos iterativo y/o para "la manipulación mediante ingeniería inversa" o "diseño de novo" de compuestos y/o "diseño de fármacos basándose en la estructura".
- (ix)
- una comprensión detallada de la estructura de los receptores de LBD, tales como el AR y PR que permite explicar y comprender los datos de unión de ligandos in vitro.
- (x)
- una reducción en la duración de tiempo requerido para descubrir compuestos dirigidos contra el AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Otros aspectos de la presente invención se
presentan en las reivindicaciones adjuntas y la siguiente
descripción y dibujos. Estos aspectos se presentan en encabezados
de sección separados. Sin embargo, se entenderá que las enseñanzas
en cada una de las secciones no están necesariamente limitadas a ese
encabezamiento de sección particular.
Excepto que se indique de otro modo, todos los
términos usados en la presente memoria tienen los mismos
significados que los que tendrían para el experto en la materia de
la presente invención. Los practicantes podrán remitirse a Current
Protocols in Molecular Biology (Ansubel) para definición y términos
de la técnica.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una estructura cristalina que comprende un dominio de
unión de ligando de un receptor de andrógenos
(AR-LBD).
Preferentemente, el AR-LBD es un
AR-LBD humano.
En un aspecto preferido de la presente
invención, se proporciona una estructura cristalina que comprende un
dominio de unión de ligando (LBD) en el que el LBD está dispuesto
en un sándwich \alpha-helicoidal que comprende
preferentemente las \alpha-hélices H1, H3, H4, H5,
H6, H7, H8, H9, H10, H11 y H12; preferentemente dos hélices
3_{10}; y preferentemente 4 hebras \beta cortas (S1, S2, S3 y
S4) asociadas en dos láminas \beta antiparalelas; en el que las
hélices H4, H5, H10 y H11 son hélices preferentemente contiguas; y
en el que la hélice H_{6} es preferentemente una hélice \alpha,
y/o la hélice H12 comprende preferentemente dos segmentos
helicoidales de preferentemente 9 restos de aminoácidos y
preferentemente 5 restos de aminoácidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "cristal" significa una estructura (tal como un
agregado sólido tridimensional (3D)) en la que las caras de los
planos se cortan en ángulos definidos, y en la que hay una
estructura regular (tal como una estructura interna) de la especie
química constituyente. De este modo, el término "cristal",
puede incluir uno cualquiera de: una forma cristalina física sólida,
tal como un cristal preparado experimentalmente, un modelo 3D
basado en la estructura cristalina, una representación de la misma,
tal como una representación esquemática de la misma, o una
representación diagramática de la misma, un conjunto de datos de la
misma para un ordenador.
Los cristales de la presente invención se pueden
preparar expresando una secuencia nucleotídica que codifica el
AR-LBD y PR-LBD mediante el uso de
una célula hospedante adecuada, y cristalizando entonces la proteína
receptora purificada.
La invención se refiere asimismo a un método
para crear estructuras de AR-LBD cristalinas
descritas en la presente memoria. El método puede utilizar un
polipéptido que comprende un AR-LBD descrito en la
presente memoria, para formar un cristal. Un polipéptido usado en
el método se puede sintetizar químicamente en todo o en parte
usando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Como
alternativa, el experto conoce bien métodos para construir vectores
de expresión que contienen la secuencia codificante nativa o mutada
de AR-LBD y señales de control
transcripcional/traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen
técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas,
y recombinación in vivo/recombinación genética. Véase, por
ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda Edition, Cold
Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros libros de texto de
laboratorio. (Véase también Sarker et al, Glycoconjugate J.
7:380, 1990; Sarker et al, Proc. Natl. Acad, Sci. USA
88:234-238, 1991, Sarker et al,
Glycoconjugate J. 11: 204-209, 1994; Hull et
al, Biochem Biophys Res Commun 176:608, 1991 y Pownall et
al, Genomics 12:699-704, 1992).
Los cristales se hacen crecer en una disolución
acuosa que contiene el polipéptido de AR-LBD
purificado, mediante una variedad de procedimientos convencionales.
Estos procedimientos incluyen métodos por lotes, líquidos, de
puente, mediante diálisis, difusión de vapor, y de gota colgante.
(Véase, por ejemplo, McPherson, 1982 John Wiley, New York;
McPherson, 1990, Eur. J. Biochem. 189: 1-23; Webber.
1991, Adv. Protein Chem. 41:1-36). Generalmente,
los cristales nativos de la invención se hacen crecer añadiendo
precipitantes a la disolución concentrada del polipéptido de
AR-LBD. Los precipitantes se añaden a una
concentración justo por debajo de la necesaria para precipitar la
proteína. El agua se elimina mediante evaporación controlada para
producir condiciones precipitantes, que se mantienen hasta que cesa
el crecimiento de los cristales.
Se pueden obtener cristales derivados de la
invención sumergiendo cristales nativos en una disolución que
contiene sales de átomos de metales pesados. Se puede obtener un
complejo de la invención sumergiendo un cristal nativo en una
disolución que contiene un compuesto que se une al
AR-LBD, o se pueden obtener cocristalizando el
polipéptido de AR-LBD en presencia de uno o más
compuestos que se unen al AR-LBD.
Una vez que el cristal ha crecido, se puede
colocar en un tubo capilar de vidrio y se puede montar en un
dispositivo de sujeción conectado a un generador de rayos X y un
dispositivo de detección de rayos X. La recogida de patrones de
difracción de rayos X está bien documentada por los expertos en la
materia (Véase, por ejemplo, Ducruix y Geige, 1992, IRL Press,
Oxford, Inglaterra). Un haz de rayos X entra en el cristal y se
difracta desde el cristal. Se puede utilizar un dispositivo de
detección de rayos X para registrar los patrones de difracción que
proceden del cristal. Los dispositivos adecuados incluyen el sistema
detector de placas formador de imágenes Marr 345, con un generador
de ánodo giratorio RU200.
Los métodos para obtener la estructura
tridimensional de la forma cristalina de una molécula o complejo se
describen en la presente memoria y son conocidos por los expertos en
la materia (Véanse Ducruix y Geige). Generalmente, la estructura
cristalina mediante rayos x se da a través de los patrones de
difracción. Cada reflexión del patrón de difracción se caracteriza
como un vector, y los datos recogidos en esta etapa determinan la
amplitud de cada vector. Las fases de los vectores se pueden
determinar mediante el método de sustitución isomorfa en el que se
usan átomos pesados embebidos en el cristal como puntos de
referencia en el análisis mediante rayos X (Véase, por ejemplo,
Otwinowski, 1991, Daresbury, Reino Unido, 80-86).
Las fases de los vectores también se pueden determinar mediante
sustitución molecular (Véase, por ejemplo, Naraza, 1994, Proteins
11:281-296). Las amplitudes y fases de vectores de
la forma cristalina de un AR-LBD determinada según
estos métodos se pueden usar para analizar otros
AR-LBD cristalinos.
Las dimensiones y simetría de la celdilla
unidad, y la información de la amplitud y fase del vector se pueden
usar en una función de transformada de Fourier para calcular la
densidad electrónica en la celda unidad, es decir, para generar un
mapa de densidad electrónica experimental. Esto se puede lograr
usando el paquete PHASES (Furey, 1990). Las estructuras de las
secuencias de aminoácidos se ajustan al mapa de densidad electrónica
experimental (es decir, construyendo un modelo) usando programas de
ordenador (por ejemplo Jones, TA. et al, Acta Crystallogr
A47, 100-119, 1991). Esta estructura también se
puede usar para calcular un mapa de densidad electrónica teórico.
Los mapas de densidad electrónica teórico y experimental se pueden
comparar, y la concordancia entre los mapas se puede describir
mediante un parámetro denominado como factor R. Un grado elevado de
solapamiento en los mapas se representa mediante un valor bajo del
factor R. El factor R se puede minimizar usando programas de
ordenador que refinan la estructura para lograr una concordancia
entre el mapa de densidad electrónica teórico y el observado. Por
ejemplo, para el refinamiento del modelo, se puede usar el programa
XPLOR, desarrollado por Brunger (1992, Nature
355:472-475).
Una estructura tridimensional de la molécula o
complejo se puede describir mediante átomos que se ajustan a la
densidad electrónica teórica caracterizada por un valor mínimo de R.
Se pueden crear archivos para la estructura que definen cada átomo
mediante coordenadas en tres dimensiones.
Las proteínas que comprenden el
AR-LBD y PR-LBD se pueden producir
mediante una célula recombinante hospedante, se pueden segregar o
pueden estar contenidas intracelularmente dependiendo de la
secuencia nucleotídica y/o el vector usado. Como entenderán los
expertos en la materia, se pueden diseñar vectores de expresión que
contienen las secuencias nucleotídicas que codifican AR y PR con
secuencias señales que dirigen la secreción de las secuencias que
codifican AR y PR a través de una membrana de célula procariota o
eucariota particular. Otras construcciones recombinantes pueden
unir la secuencia codificante de AR o PR a la secuencia nucleotídica
que codifica un dominio polipeptídico que facilitará la
purificación de proteínas solubles (Kroll DJ et al (1993)
DNA Cell Biol 12:441-53). Tales dominios que
facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos
quelantes de metales, tales como los módulos de
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados (Porath J (1992) Protein Expr Purif 3 -.
26328 1), dominios de proteína A que permiten la purificación sobre
inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema
de purificación por extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp,
Seattle, WA). La inclusión de una secuencia ligadora extendible,
tal como el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA),
entre el dominio de purificación y el AR y PR, es útil para
facilitar la purificación.
Se puede emplear una amplia variedad de células
hospedantes para la expresión de las secuencias nucleotídicas que
codifican las proteínas de AR y PR de la presente invención. Estas
células pueden ser células hospedantes tanto procariotas como
eucariotas. Las células hospedantes adecuadas incluyen bacterias
tales como E. coli, levaduras, hongos filamentosos, células
de insectos, células de mamíferos, típicamente inmovilizadas, por
ejemplo, de ratón, CHO, estirpes celulares humanas y de monos, y sus
derivados. Las células hospedantes preferidas son capaces de
procesar los productos de expresión para producir un polipéptido
maduro apropiado. El procesamiento incluye, pero no se limita a,
glucosilación, ubiquitinación, formación de enlaces de disulfuro, y
modificación post-traduccional general.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "secuencia nucleotídica" se refiere a secuencias
nucleotídicas, secuencias oligonucleotídicas, secuencias
polinucleotídicas y variantes, homólogos, fragmentos y derivados de
las mismas (tales como porciones de las mismas) que comprenden las
secuencias nucleotídicas que codifican el AR-LBD y
PR-LBD. La secuencia nucleotídica puede ser ADN o
ARN de origen genómico o sintético o recombinante, que puede ser
bicatenario o monocatenario, que representa la hebra de sentido o
antisentido, o sus combinaciones. Preferentemente, la expresión
secuencia nucleotídica se prepara mediante uso de técnicas de ADN
recombinante (por ejemplo, ADN recombinante). La secuencia
nucleotídica puede incluir en ella nucleótidos sintéticos o
modificados. En la técnica se conoce un número de diferentes tipos
de modificación para oligonucleótidos. Éstas incluyen cadenas
principales de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de
acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula.
Para los fines de la presente invención, se entenderá que las
secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria se pueden
modificar mediante cualquier método disponible en la técnica. Tales
modificaciones se pueden llevar a cabo con el fin de mejorar la
actividad in vitro o duración de las secuencias
nucleotídicas de la invención.
Preferentemente, la expresión "secuencia
nucleotídica" significa ADNc.
Las proteínas de AR y PR, que comprenden el
AR-LBD y PR-LBD de la presente
invención, también se pueden producir como proteínas de fusión, por
ejemplo para ayudar en la extracción y purificación. Los ejemplos de
parejas de proteínas de fusión incluyen
glutationa-S-transferasa (GST),
6xHis, GAL4 (dominios de unión de ADN y/o de activación
transcripcional) y \beta-galactosidasa. También
puede ser conveniente incluir un sitio de escisión proteolítico
entre la pareja de la proteína de fusión y la secuencia proteínica
de interés, para permitir la eliminación de las secuencias de las
proteínas de fusión.
Preferentemente, la proteína de fusión no
impedirá la actividad de unión de ligando del AR-LBD
y PR-LBD que comprende las secuencias de
aminoácidos (SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3, respectivamente) de la
presente invención.
Preferentemente, AR-LBD
comprende por lo menos la SEC ID nº 1, o un homólogo o mutante de la
misma.
Preferentemente, el PR-LBD
comprende por lo menos la SEC ID nº 3, o un homólogo o mutante de la
misma.
Después de la escisión de la proteína de fusión,
el AR-LBD y PR-LBD se pueden separar
de los productos de escisión mediante métodos cromatográficos. La
concentración se puede realizar con la ayuda de un sistema de
filtración, y el concentrado proteínico se puede usar inmediatamente
con fines de cristalización. El concentrado proteínico se puede
cristalizar usando, por ejemplo, el método de difusión de vapor a
una temperatura desde aproximadamente 1ºC hasta aproximadamente
30ºC, preferentemente desde aproximadamente 4ºC hasta
aproximadamente 20ºC. La temperatura de cristalización depende de
los aditivos presentes en la disolución proteínica.
Típicamente, los cristales que comprenden el
AR-LBD se purifican hasta homogeneidad para la
cristalización. La pureza de los AR-LBD may se
puede medir mediante técnicas típicas tales como
SDS-PAGE, espectrometría de masas y HPLC
hidrófoba.
Preferentemente, el cristal comprende el
AR-LBD o un homólogo o mutante del mismo.
Preferentemente, el cristal comprende el
PR-LBD o un homólogo o mutante del mismo.
Preferentemente, el valor se utiliza en técnicas
de cristalografía mediante rayos X. Preferentemente, los cristales
usados pueden soportar una exposición a haces de rayos X usados para
producir datos de patrones de difracción necesarios para resolver
la estructura cristalográfica mediante rayos X.
Preferentemente, el cristal tiene una resolución
determinada mediante cristalografía de rayos X desde aproximadamente
1,5 \ring{A} hasta aproximadamente 3,5 \ring{A}, preferentemente
aproximadamente 1,5 \ring{A}.
Preferentemente, el cristal tiene una resolución
determinada mediante cristalografía por rayos X desde
aproximadamente 1,5 \ring{A} hasta aproximadamente 3,0
\ring{A}.
Preferentemente, el cristal que comprende el
AR-LBD tiene la estructura secundaria presentada
como SEC ID nº 2, o un homólogo o mutante de la misma.
El cristal se puede formar a partir de una
disolución acuosa que comprende un polipéptido purificado que
comprende un AR-LBD.
El término "purificado", con referencia a
un polipéptido, no requiere pureza absoluta tal como una preparación
homogénea, sino que representa una indicación de que el polipéptido
es relativamente más puro que en el entorno natural. Generalmente,
un polipéptido purificado está sustancialmente libre de otras
proteínas, lípidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los
que está asociado de forma natural, preferentemente a un nivel
funcionalmente significativo, por ejemplo por lo menos 97,5% puro,
más preferentemente por lo menos 99%, lo más preferentemente por lo
menos 99,5% puro. El experto puede purificar un polipéptido que
comprende un AR-LBD usando técnicas estándar para
la purificación de proteínas. Un polipéptido sustancialmente puro
que comprende un AR-LBD producirá una única banda
principal en un gel de poliacrilamida no reductor. La pureza del
AR-LBD también se puede determinar mediante
análisis de secuencias de aminoácidos aminoterminales.
El término "asociado", "asociación", o
"asociante" se refiere a una condición de proximidad entre un
resto (es decir, entidad química o compuesto o porciones o
fragmentos del mismo), y un AR-LBD, o partes o
fragmentos del mismo (por ejemplo sitios o dominios de unión). La
asociación puede ser no covalente, es decir, cuando la
yuxtaposición está energéticamente favorecida, por ejemplo, mediante
enlace de hidrógeno, van der Waals, o interacciones electrostáticas
o hidrófobas, o puede ser covalente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "andrógeno" se refiere a cualquier sustancia, natural
o sintética, que es capaz de estimular el desarrollo de
características sexuales masculinas. Los andrógenos de origen
natural están representados mediante las hormonas esteroides
C_{19}. Se producen especialmente por los testículos (tales como
la testosterona), y también por la corteza suprarrenal, los ovarios
y la placenta. Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "andrógeno" se refiere a los esteroides del sexo
masculino, dihidrotestosterona (DHT) y testosterona [Teutsch, 1994]
que se unen al AR-LBD y que regulan los genes para
la diferenciación y desarrollo masculinos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "receptor de andrógenos (AR)" significa cualquiera
de las proteínas nucleares de unión a andrógenos que median los
efectos de andrógenos regulando la expresión génica. Las proteínas
de receptores de andrógenos son proteínas discretas de dedos de
zinc, que se unen a secuencias de ADN discretas, localizadas en
dirección 5' de los sitios de comienzo transcripcional, cuando se
forma un complejo de AR-ligando. El dominio de unión
del receptor de andrógenos (AR), también conocido como el dominio
de unión de ligando del receptor de andrógenos
(AR-LBD), o el dominio de unión de hormonas (HBD),
está en la región C terminal. En seres humanos, se conoce un número
de variantes que están asociadas con anormalidades, incluyendo
cáncer de próstata (PC), síndrome de feminización testicular,
síndrome de insensibilidad completa a andrógenos (CAIS) y/o
síndrome de insensibilidad parcial a andrógenos (PAIS) y/o síndrome
de insensibilidad leve a andrógenos (MAIS), que conducen a
genitales externos que varían entre la hembra y el macho casi
normal.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "receptor de andrógenos" significa el receptor de
andrógenos de tipo natural, o un receptor de andrógenos mutante.
La expresión "tipo natural" se refiere al
fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una
especie de origen natural, y que contrasta con el fenotipo de una
especie mutante. Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "receptor de andrógenos de tipo natural" se refiere a
un receptor de andrógenos que comprender la secuencia de
aminoácidos presentada como SEC ID nº 1. En particular, la expresión
"receptor de andrógenos de tipo natural" se refiere al
receptor de andrógenos que comprende un bolsillo de unión de
ligando (LBP) en el que el LBP se define mediante las coordenadas
estructurales de los restos de aminoácidos de
AR-LBD L701; L704; N705; L707; Q711; M742; L744;
M745; M749; R752; F764; Q783; M787; F876; T877; L880; F891; M895 o
un homólogo de los mismos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "mutante" se refiere a cualquier organismo que ha
sufrido una mutación o que tiene un gen mutante que es expresado en
el fenotipo de ese organismo. Una mutación puede surgir debido a
una sustitución de un nucleótido por otro, o por una supresión de un
nucleótido o una inserción de un nucleótido con relación a una
secuencia de tipo natural de referencia. Estas variaciones
nucleotídicas individuales se denominan algunas veces como
polimorfismos nucleotídicos individuales (SNP). Algunos SNP pueden
producirse en secuencias que codifican proteínas, en cuyo caso, una
de las formas polimórficas puede dar lugar a la expresión de una
proteína defectuosa u otra proteína variante y, potencialmente, una
enfermedad genética. Otros SNP se pueden producir en regiones no
codificantes. Algunos de estos polimorfismos también pueden dar
como resultado la expresión de proteínas defectuosas (por ejemplo,
como resultado de un corte y empalme defectuoso). Otros SNP pueden
no tener efectos fenotípicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "mutante" se refiere a un receptor de andrógenos que
comprende uno cualquiera o más cambios en la secuencia (y/o las
coordenadas estructurales) y de los restos de aminoácidos en el
AR-LBD que interactúan con el ligando unido, en el
que los cambios de aminoácidos en el AR-LBD se
pueden seleccionar de entre uno cualquiera o más del grupo de
sustituciones de restos de aminoácidos de LBD que consisten en
L701H; M749I; T877A; T877S; L880Q; F891L; N705S; L707R; M749V;
G708A; G708V; M742V; M742I; M745T; V746M; R752Q; F764S; M787V. A
este respecto, la secuencia y los restos de aminoácidos (tal como
L701H) se describen usando el formato de una letra para el resto de
aminoácido (tal como L), seguido del número de la designación del
aminoácido que se refiere al resto del aminoácido en la secuencia de
tipo natural directamente por encima del último dígito, seguido del
resto de aminoácido mutante (en este caso, un resto de aminoácido
sustituido) que también se describe usando el formato de una letra
para el resto del aminoácido (en este caso H).
Para algunas formas de realización, el receptor
de andrógenos puede comprender dos o más restos de aminoácidos
mutados. Un ejemplo de dicha forma de realización es L701H y
T877A.
El término "mutante" no está limitado a las
mutaciones anteriores que se reflejan en las sustituciones de
aminoácidos de los restos de aminoácidos claves en el
AR-LBD, sino también puede incluir, y no está
limitado a, otras supresiones o inserciones de nucleótidos en la
secuencia de tipo natural que pueden dar como resultado cambios en
los restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos deducida
del AR-LBD. El término "mutante" también
incluye mutantes no caracterizados.
Preferentemente, el receptor de andrógenos
mutado comprende una o más de las mutaciones caracterizadas en el
LBP del AR-LBD como se expone en la Tabla 3.
Preferentemente, el resto o restos de
aminoácidos mutados se localiza en las hélices H4 y H5 del
AR-LBD.
Preferentemente, el resto o resto de aminoácidos
mutados está o están distribuidos uniformemente entre restos de
aminoácidos enterrados, medianamente accesibles y completamente
accesibles dentro del bolsillo de unión de ligando (LBP) que
comprende el AR-LBD.
Preferentemente, el resto o restos de
aminoácidos mutados se distribuye o distribuyen como se expone en la
figura 1.
En una forma de realización muy preferida, el
cristal tiene las coordenadas estructurales como se proporcionan en
la Tabla 4 (figura 6), que se pueden usar para la identificación de
un ligando capaz de unirse al AR-LBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "coordinadas estructurales" se refiere a un conjunto
de valores que definen la posición de uno o más restos de
aminoácidos con referencia a un sistema de ejes. La expresión se
refiere a un conjunto de datos que define la estructura
tridimensional de una molécula o moléculas (por ejemplo coordenadas
cartesianas, factores de temperatura y ocupaciones). Las coordenadas
estructurales se pueden modificar ligeramente y todavía producir
estructuras tridimensionales casi idénticas. Una medida de un
conjunto único de coordenadas estructurales es la desviación de la
raíz cuadrática media de la estructura resultante. Las coordinadas
estructurales que producen estructuras tridimensionales (en
particular una estructura tridimensional de un dominio de SGC) que
se desvían de otra en una desviación de raíz cuadrática media menor
que 5 \ring{A}, 4 \ring{A}, 3 \ring{A}, 2 \ring{A}, o 1,5
\ring{A} se pueden observar por una persona experta normal en la
técnica como muy similares.
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona un cristal que comprende un complejo entre un dominio
de unión de ligando del receptor de andrógenos y un ligando. En
otras palabras, el dominio de unión de ligando del receptor de
andrógenos se puede asociar con un ligando en el cristal. El ligando
puede ser cualquier compuesto que sea capaz de interactuar estable
y específicamente con el dominio de unión de ligando del receptor de
andrógenos. El ligando puede ser, por ejemplo, un inhibidor del
AR-LBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "dominio de unión de ligando (LBD)" significa la
región de unión de ligando C-terminal de un receptor
de esteroides que es responsable de la unión del ligando. La
expresión "dominio de unión de ligando (LBD)" también incluye
un homólogo del dominio de unión de ligando o una porción del
mismo. El LBD de la presente invención comprende un bolsillo de
unión de ligando (LBP). Con referencia al cristal de la presente
invención, los restos en el LBD se pueden definir por su proximidad
espacial al ligando en la estructura cristalina. La expresión
"dominio de unión de ligando (LBD)" también incluye un
homólogo del dominio de unión de ligando o una porción del
mismo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "porción del mismo" significa las coordenadas
estructurales que corresponden a un numero suficiente de
aminoácidos de AR-LBD (u homólogos de los mismos)
que son capaces de interactuar con un compuesto de ensayo capa de
unirse al LBD. Esta expresión incluye restos de aminoácidos del
dominio de unión de ligando del AR que tienen un resto de
aminoácidos desde aproximadamente 4\ring{A} hasta aproximadamente
5\ring{A} de un compuesto unido o un fragmento del mismo. De este
modo, por ejemplo, las coordenadas estructurales proporcionadas en
la estructura cristalina pueden contener un subconjunto de los
restos de aminoácidos en el LBD que pueden ser útiles en la
obtención de un modelo y diseño de compuestos que se unen al
LBD.
El dominio de unión de ligando se puede definir
por su asociación con el ligando.
Preferentemente, el dominio de unión de ligando
comprende uno o más restos de aminoácidos según se determina a
partir de la estructura cristalina o un homólogo de la misma. Los
ejemplos de tales restos de aminoácidos se presentan en la presente
memoria.
\vskip1.000000\baselineskip
Según un aspecto de la presente invención, se
proporciona una estructura cristalina que comprende un bolsillo de
unión de ligando (LBP), en la que el LBP se define mediante las
siguientes coordenadas estructurales de restos de aminoácidos:
L701; L704; N705; L707; Q711; M742; L744; M745; M749; R752; F764;
Q783; M787; F876; T877; L880; F891; M895; o un homólogo de los
mismos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "bolsillo de unión de ligando (LBP)" se refiere a la
cavidad o espacio hueco en una estructura - típicamente una
estructura tridimensional (3D) - en la que se une un ligando y en
la que está localizado el dominio de unión de ligando (LBD). El LBP
se denomina algunas veces como un "nicho de unión". En
particular, preferentemente la expresión AR-LBP se
refiere a los 18-20 restos de aminoácidos conocidos
en el hAR-LBD que se sabe que interactúan con el
ligando unido (ya sea R1881 o progesterona). Estos restos se
destacan en la figura 1 y se incluyen en la figura 4. La mayoría de
estos restos son hidrófobos e interactúan principalmente con la
estructura esteroidea, mientras que unos pocos son polares y pueden
formar enlaces de hidrógeno con los átomos polares en el
ligando.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "polar" incluye aminoácidos cargados positiva y
negativamente. A este respecto, los aminoácidos cargados
negativamente incluyen ácido aspártico (D) y ácido glutámico (E);
aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina (K) y arginina
(R); y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados,
que tienen valores de hidrofilia similares, incluyen leucina (L),
isoleucina (I), valina (V), glicina (G), alanina (A), asparagina
(N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), fenilalanina (F), y
tirosina (Y). La clasificación de estos restos de aminoácidos se
expone en la Tabla más abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "homólogo" se refiere a un AR-LBD o una
porción del mismo que puede tener supresiones, inserciones o
sustituciones de restos de aminoácidos en tanto que se retenga la
especificidad de unión del AR-LBD. A este respecto,
se pueden realizar sustituciones deliberadas de aminoácidos en base
a la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia,
hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los restos, en tanto que
se retenga la especificidad de unión del AR-LBD. En
este caso, una sustitución conservativa, que puede producir un
cambio silencioso que puede dar como resultado un
AR-LBD funcionalmente equivalente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "homólogo" también significa un homólogo de la
estructura cristalina del AR-LBD, en el que el
homólogo tiene una desviación de raíz cuadrática media (r.m.s.) de
los átomos de la cadena principal de restos de aminoácidos en
elementos estructurales secundarios menor que 3,0 \ring{A}.
Preferentemente, la desviación r.m.s de los átomos de la cadena
principal de restos de aminoácidos en los elementos estructurales
secundarios es menor que 2,0 \ring{A}.
Las abreviaturas para los restos de aminoácidos
son los códigos estándar de 3 letras y/o 1 letra usados en la
técnica para referirse a uno de los 20 L-aminoácidos
habituales.
El AR-LBD de la presente
invención está dispuesto en un sándwich
\alpha-helicoidal. El AR-LBD
comprende preferentemente once hélices \alpha (H1, H3, H4, H5,
H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12). No hay ninguna hélice H2. Debido a
que tanto las hélices H4 como H5 y las hélices H11 como H12 son
hélices contiguas, se considera que el sándwich
\alpha-helicoidal comprende 9 hélices \alpha y
no 11 hélices \alpha. En la figura 1 se encuentran las hélices
\alpha denominadas por la letra H. El número de la hélice (tal
como H1) está indicado en negro encima de la secuencia helicoidal
pertinente. El plegamiento de sándwich
\alpha-helicoidal puede comprender además
preferentemente hélices 3_{10} y preferentemente cuatro hebras
\beta cortas (S1, S2, S3 y S4) asociadas en dos láminas \beta
antiparalelas. Las hebras \beta se indican por la letra E en la
figura 1. El número de la hebra (tal como S1) se indica en negro
encima de la lámina \beta pertinente.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "hélice \alpha" significa una configuración
helicoidal o en espiral de una cadena polipeptídica en la que se
mantienen juntas vueltas sucesivas de la hélice mediante enlaces de
hidrógeno entre las uniones amídicas (peptídicas), estando el grupo
carbonilo de cualquier resto dado enlazado mediante hidrógeno al
grupo amino del tercer resto detrás de él en la cadena. Este es el
caso para todos los grupos carbonilo y amida de los enlaces
peptídicos de la cadena principal. Típicamente la hélice \alpha
tiene 3, 6 restos por vuelta, y la traslación o paso a lo largo del
eje helicoidal es 1,5 \ring{A} por resto y 5,4 \ring{A} por
vuelta. La hélice puede ser a izquierdas o a derechas, siendo ésta
última mucho más habitual. La hélice \alpha es una de los dos
elementos básicos de la estructura secundaria adoptada por la
cadena polipeptídica dentro del núcleo hidrófobo de una proteína
globular. El otro elemento básico es la hebra \beta.
El AR-LBD de la presente
invención comprende una hélice en la región de la hélice H6 que es
una hélice \alpha.
El AR-LBD de la presente
invención comprende hélices contiguas. A este respecto, las hélices
H4 y H5 y las hélices H10 y H11 son contiguas. Por el contrario, se
encontró que sólo las secuencias de H10 y H11 del receptor de
progesterona eran contiguas (véase Williams 1998).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "hélices contiguas" significa hélices que están
conectadas entre sí, tal como conectadas en línea entre sí.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "estructura de lámina beta (lámina \beta)"
significa una combinación de varias regiones de una cadena
polipeptídica. Por el contrario, la hélice \alpha se construye a
partir de una región contigua. Estas regiones, las hebras \beta,
tienen una longitud de habitualmente 5 a 10 restos, y están en una
conformación casi completamente extendida con ángulos \varphi,
\psi dentro de la región amplia estructuralmente permitida en el
cuadrante izquierdo superior de la gráfica de Ramachandran. Estas
hebras \beta están alineadas adyacentes entre sí de forma que los
enlaces de hidrógeno se pueden formar entre grupos CO de una hebra
\beta y los grupos NH en una hebra \beta adyacente, y viceversa.
Las láminas \beta que se forman a partir de varias de tales
hebras \beta están "plisadas" con átomos C_{\alpha}
sucesivamente un poco por encima y por debajo del plano de la lámina
\beta. Las cadenas laterales siguen este patrón, de forma que
dentro de una hebra \beta también apuntan alternativamente por
encima y por debajo de la lámina \beta.
Las hebras \beta pueden interactuar de dos
maneras para formar una lámina plisada. Los aminoácidos en las
hebras \beta alineadas pueden correr todos en la misma dirección
bioquímica, aminoterminal hacia carboxi terminal, en cuyo caso la
lámina se describe como paralela, o los aminoácidos en hebras
sucesivas pueden tener direcciones alternantes, amino terminal a
carboxi terminal, seguido de carboxi terminal a amino terminal,
seguido de amino terminal a carboxi terminal, etc., en cuyo caso la
lámina se denomina antiparalela. Cada una de las dos formas tiene
un patrón distinto de enlazamiento mediante hidrógeno. La lámina
\beta antiparalela tiene pares de enlaces de hidrógeno espaciados
de forma estrecha que se alternan con pares espaciados de forma
amplia. Las láminas \beta paralelas tienen enlaces de hidrógeno
espaciados uniformemente que atraviesan en ángulo entre las hebras
\beta. Dentro de ambos tipos de láminas \beta, se forman todos
los posibles enlaces de hidrógeno de la cadena principal, excepto
para las dos hebras de flanqueo de la lámina \beta, que sólo
tienen una hebra \beta fina.
El AR-LBD de la presente
invención comprende hebras beta (hebras \beta), denominadas por la
letra E, que están formadas por láminas. Estas hebras (S1, S2, S3 y
S4) están dispuestas en el orden en el que aparecen en la
estructura secundaria como se expone en la figura 1. Estas hebras
están dispuestas en dos láminas \beta.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "restos clave" se refiere a uno o más restos de
aminoácidos en un AR-LBD, capaces de modular la
unión del ligando. Los restos pueden ser uno cualquiera de los
restos clave dentro del AR-LBD como se describe en
la presente memoria, o sus mutantes, o pueden ser restos con
homología con los restos o sus mutantes. Los restos de aminoácidos
clave del AR-LBD pueden ser uno cualquiera o más de
los restos de aminoácidos seleccionados de entre el grupo
constituido por: L701; L704; N705; L707; Q711; M742; L744; M745;
M749; R752; F764; Q783; M787; F876; T877; L880; F891; M895 o un
homólogo o mutante de los
mismos.
mismos.
Preferentemente, la unión del ligando al
AR-LBD provoca cambios conformacionales en el
AR-LBD, inhibiendo de ese modo la unión posterior
al mismo.
Preferentemente, el ligando producido según la
invención rellena por lo menos el LBP del AR sin perturbar el resto
de la estructura de AR.
Preferentemente, el ligando interactúa con el
resto conformacionalmente restringido del
AR-LBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "resto conformacionalmente restringido" se refiere a
un resto tal como un resto de aminoácido, cuyas propiedades de unión
se pueden modular a través de una mutación en ese resto. La
mutación en el resto de aminoácido puede dar como resultado un
cambio en la conformación de ese resto. En particular, la mutación
puede dar como resultado una conformación restringida/constreñida,
que puede afectar a la interacción de un ligando con el
hAR-LBD.
Preferentemente, los ligandos de la presente
invención se unen más eficazmente al AR-LBD que al
andrógeno.
Preferentemente, los ligandos de la presente
invención se unen con una afinidad de unión doble del andrógeno.
Preferentemente, los ligandos de la presente
invención se unen con una afinidad de andrógeno de tres veces.
Preferentemente, los ligandos de la presente
invención se unen diez o más veces con la afinidad de andrógeno.
Preferentemente, las mejoras en la interacción
de un ligando con el AR-LBD se manifiestan como
incrementos en la afinidad de unión, pero también pueden incluir
incrementos en la selectividad por el receptor y/o modulación de la
eficacia.
Preferentemente, el ligando inhibe la acción de
andrógeno y miméticos de andrógenos uniéndose firmemente al
AR-LBD pero no aumentando la expresión génica del
receptor de andrógenos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un modelo.
La estructura cristalina de la presente
invención se puede usar para generar un modelo estructural, tal como
un modelo estructural tridimensional (3D) (o una representación del
mismo) que comprende un AR-LBD o una porción del
mismo. Como alternativa, la estructura cristalina se puede usar para
generar un modelo por ordenador para la estructura.
Preferentemente, el modelo cristalino que
comprende el AR-LBD se construye a partir de todo o
parte de los datos de difracción de rayos X presentados en la Tabla
1 y/o la estadística de refinamiento presentada en la Tabla 2.
Preferentemente, el modelo cristalino que
comprende el AR-LBD se construye a partir de todos o
parte de los datos de coordenadas del cristal como se muestra en la
Tabla 4 (véase la figura 6).
De este modo, por ejemplo, las coordenadas
estructurales proporcionadas en la estructura cristalina y/o
estructura modelo, pueden comprender los restos de aminoácidos del
AR-LBD, o una porción del AR-LBD o
un homólogo de los mismos útil en la obtención de un modelo y el
diseño de compuestos de ensayo capaces de unirse al
AR-LBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "obtención de un modelo" incluye el análisis
cuantitativo y cualitativo de la estructura molecular y/o función
basándose en la información estructural atómica y modelos de
interacción. La expresión "obtención de modelos" incluye
modelos de minimización de energía y dinámicos moleculares basados
en métodos numéricos convencionales, modelos gráficos por ordenador
interactivos, modelos mecánicos moleculares modificados, modelos de
geometría de distancia y otros modelos de restricción basados en la
estructura.
En otro aspecto de la presente invención, las
coordenadas estructurales que comprenden el AR-LBD o
una porción del mismo se pueden aplicar a un sistema de detección
de modelos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "sistema de detección de modelos" puede ser un
sistema de detección 3D o un sistema de detección computacional.
Usando este modelo, se pueden estudiar compuestos de ensayo como
modelos que se ajustan espacial y preferentemente en el
AR-LBD.
En un aspecto preferido, los compuestos de
ensayo se colocan en el AR-IBD a través de deducción
computacional.
En otro aspecto preferido, los compuestos de
ensayo se sitúan en el AR-BD mediante deducción
manual AR-IBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "se ajusta especialmente" significa que la estructura
tridimensional de un ligando se acomoda geométricamente en una
cavidad o bolsillo de un AR-IBD.
Preferentemente, la obtención de modelos se
lleva a cabo usando un ordenador, y se puede optimizar
adicionalmente usando métodos conocidos. Esto se denomina
optimización de la obtención del modelo. Para la optimización de la
obtención de modelos, también se pueden usar superposiciones
superposicionamientos con un modelo tridimensional del
AR-LBD y/o una porción del mismo.
El alineamiento y/o la obtención de modelos se
pueden usar como una guía para la colocación de mutaciones en la
superficie del AR-LBD, para caracterizar la
naturaleza del sitio en el contexto de una célula.
Las coordenadas estructurales de una estructura
de AR-LBD descrita en la presente memoria se pueden
usar como un modelo para determinar las estructuras secundarias o
tridimensionales de AR-LBD nativo o mutado adicional
con estructura desconocida, así como las estructuras de cocristales
de AR-LBD con compuestos tales como sustratos y
moduladores (por ejemplo, estimuladores o inhibidores). Las
coordenadas estructurales y los modelos de una estructura de
AR-LBD también se pueden usar las estructuras
basadas en disolución de AR-LBD nativo o
mutante.
La estructura secundaria o tridimensional se
puede determinar aplicando las coordenadas estructurales de una
estructura de AR-LBD a otros datos tales como una
secuencia de aminoácidos, datos de difracción cristalográfica
mediante rayos X, o datos de resonancia magnética nuclear (RMN). Los
modelos de homología, la sustitución molecular, y los métodos de
resonancia magnética nuclear que usan estos otros datos se describen
a continuación.
Los métodos de formación de modelos de homología
también conocidos como formación de modelos comparativos o de
modelos a base de conocimiento) desarrollan un modelo tridimensional
a partir de una secuencia polipeptídica basándose en las
estructuras de proteínas conocidas (por ejemplo,
AR-LBD natural o mutado). En la presente invención,
el método utiliza una representación por ordenador de una estructura
de AR-LBD o un complejo de la misma, una
representación por ordenador de la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido con una estructura desconocida (AR-LBD
natural o mutado adicional), y representaciones por ordenador
estándar de las estructuras de aminoácidos. El método en particular
comprende las etapas siguientes: (a) identificar regiones
estructuralmente conservadas y variables en la estructura conocida;
(b) alinear las secuencias de aminoácidos de la estructura conocida
y la estructura desconocida; (c) generar coordenadas de átomos de la
cadena principal y átomos de la cadena lateral en regiones
estructuralmente conservadas y variables de la estructura
desconocida basándose en las coordenadas de la estructura conocida,
obteniendo de ese modo un modelo de homología; y (d) refinar el
modelo de homología para obtener una estructura tridimensional para
la estructura desconocida. Este método es bien conocido por los
expertos en la materia (Greer, 1985, Science 228, 1055; Bundell
et al 1988, Eur. J. Biochem. 172, 513; Knighton et
al., 1992, Science 258:130-135,
http://biochem.vt.edu/courses/modeling/homology.htn). Los programas
de ordenador que se pueden usar en la obtención de modelos de
homología son Quanta y el módulo de homología en el paquete de
obtención de modelos Insight II distribuido por Molecular
Simulations Inc, o MOD-ELLER (Rockefeller
University,
www.iucr.ac:uk/sinris-top/logical/prg-modeller.html).
En la etapa (a) del método de obtención de un
modelo de homología, la estructura de AR-LBD
conocida se examina para identificar las regiones estructuralmente
conservadas (SCR), a partir de las cuales se puede construir una
estructura media, o armazón, para estas regiones de la proteína.
También se deben identificar las regiones variables (VR), en las
cuales las estructuras conocidas pueden diferir en conformación. Las
SCR generalmente corresponden a los elementos de estructura
secundaria, tales como las hélices alfa y láminas beta, y a sitios
de unión de ligandos y de sustrato (por ejemplo, sitios de unión de
aceptores y dadores). Las VR habitualmente se encuentran sobre la
superficie de las proteínas y forman los bucles en los que se gira
la cadena principal.
Hay disponibles muchos métodos para el
alineamiento de secuencias de estructuras conocidas y estructuras
desconocidas. Los alineamientos de secuencias generalmente se basan
en el algoritmo de programación dinámico de Needleman y Wunsch [J.
Mol. Biol. 48: 442-453, 1970]. Los métodos actuales
incluyen FASTA, Smith-Waterman, y BLASTP, siendo el
método BLASTP el que difiere de los otros dos por no permitir
saltos. La puntuación de los alineamientos implica típicamente la
construcción de una matriz de 20x20 en la que se pueden puntuar
aminoácidos idénticos y los de carácter similar (es decir,
sustituciones conservativas) con una puntuación mayor que los de
carácter diferente los esquemas de sustitución que se pueden usar
para puntuar los alineamientos incluyen las matrices de puntuación
PAM (Dayhoff et al., Meth. Enzymol. 91:
524-545, 1983), y BLOSUM (Henikoff y Henikoff, Proc.
Nat. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919, 1992), y las
matrices basadas en alineamientos derivados de estructuras
tridimensionales, incluyendo las de Johnson y Overington (matrices
de JO) (J. Mol. Biol. 233: 716-738, 1993).
Se puede usar el alineamiento basado únicamente
en la secuencia; sin embargo, también se pueden tener en cuenta
otras características estructurales. En Quanta, existen algoritmos
de alineamiento de secuencias múltiples que se pueden usar cuando
se alinea una secuencia de la estructura desconocida con la
estructura conocida. Existen cuatro sistemas de puntuación (es
decir, homología de secuencias, homología de estructura secundaria,
homología de accesibilidad del resto, homología de distancia
CA-CA), cada uno de los cuales se puede evaluar
durante un alineamiento de forma que se pueden asignar pesos
estadísticos relativos.
Cuando se generan coordinadas de la estructura
desconocida, es necesario formar un modelo de los átomos de la
cadena principal y los átomos de la cadena lateral, tanto en las SCR
como en las VR. Para asignar coordenadas a la estructura
desconocida, se puede usar una variedad de enfoques conocidos por
los expertos en la materia. En particular, las coordenadas de los
átomos de la cadena principal de las SCR se transferirán a la
estructura desconocida. Las VR corresponden muy a menudo a los
bucles sobre la superficie del polipéptido, y si un bucle en la
estructura conocida es un buen modelo para la desconocida, entonces
se pueden copiar las coordenadas de la cadena principal de la
estructura conocida. Las coordenadas de la cadena lateral de las SCR
y VR se copian si el tipo de resto en la estructura desconocida es
idéntico, o muy similar a aquél en la estructura conocida. Para
otras coordenadas de la cadena lateral, se puede usar una librería
de rotámeros de cadena lateral para definir las coordenadas de la
cadena lateral. Cuando no se puede encontrar un buen modelo para un
bucle, se pueden buscar bases de datos de fragmentos para bucles en
otras proteínas que pueden proporcionar un modelo adecuado para la
estructura desconocida. Si se desea, el bucle se puede someter
entonces a búsqueda conformacional para identificar, si se desea,
confórmeros de baja energía.
Una vez se ha generado un modelo de homología,
se analiza para determinar su corrección. Para ayudar en este
análisis, un programa de ordenador disponible es el módulo Protein
Health en Quanta, que proporciona una variedad de ensayos. Otros
programas que proporcionan análisis de estructuras junto con
resultados incluyen PROCHECK y 3D-Profiler [Luthy
R. et al, Nature 356: 83-85, 1992; and Bowie,
J.U. et al, Science 253: 164-170, 1991]. Una
vez se han resuelto las irregularidades, se puede refinar
posteriormente toda la estructura. El refinamiento puede consistir
en minimización de energía con restricciones, especialmente para las
SCR. Las restricciones se pueden eliminar gradualmente para
minimizaciones subsiguientes. También se puede aplicar dinámica
molecular junto con minimización de energía.
Usando las coordenadas estructurales de los
complejos cristalinos proporcionados por la presente invención, se
puede usar la sustitución molecular para determinar las coordenadas
estructurales de un mutante u homólogo cristalino de
AR-LBD o de una proteína relacionada.
La sustitución molecular implica aplicar una
estructura conocida para resolver el conjunto de datos
cristalográficos de rayos X de un polipéptido de estructura
desconocida (por ejemplo AR-LBD natural o mutado).
El método se puede usar para definir las fases que describen los
datos de difracción de rayos X de un polipéptido de estructura
desconocida cuando sólo se conocen las amplitudes. Los paquetes de
software de ordenador usados habitualmente para la sustitución
molecular son X-PLOR (Brunger 1992, Nature 355:
472-475), AMoRE (Navaza, 1994, Acta Crystallogr.
A50:157-163), el paquete CCP4 (Collaborative
Computational Project, Number 4, "The CCP4 Suite: Programs for
Protein Crystallography", Acta Cryst., Vol. D50, p.
760-763, 1994), y el paquete MERLOT (P.M.D.
Fitzgerald, J. Appl. Cryst., Vol. 21, p. 273-278,
1988). Se prefiere que la estructura resultante no muestre una
desviación de raíz cuadrática media de más de 3 \ring{A}.
Los programas de ordenador de sustitución
molecular generalmente implican las siguientes etapas: (1)
determinar el número de moléculas en la celda unidad y definir los
ángulos entre ellas (función de autorotación); (2) hacer girar la
estructura conocido (por ejemplo AR-LBD) frente a
datos de difracción para definir la orientación de las moléculas en
la celda unidad (función de rotación); (3) trasladar la estructura
conocida en tres dimensiones para colocar correctamente las
moléculas en la celda unidad (función de traslación); (4) determinar
las fases de los datos de difracción de rayos X y calcular un
factor R calculado a partir del conjunto de datos de referencia y a
partir de los nuevos datos, en el que un factor R entre
30-50% indica que las orientaciones de los átomos
en la celda unidad se han determinado razonablemente mediante el
método; y (5) opcionalmente disminuir el factor R hasta
aproximadamente 20% refinando el nuevo mapa de densidad electrónica
usando técnicas de refinamiento iterativas conocidas por los
expertos en la materia (refinamiento).
En una forma de realización de la invención, se
proporciona un método para determinar estructura tridimensionales
de polipéptidos con estructura desconocida (por ejemplo
AR-LBD natural o mutado adicional) aplicando las
coordenadas estructurales de una estructura de
AR-LBD para proporcionar un conjunto de datos
cristalográficos de rayos X para un polipéptido de estructura
desconocida, y (b) determinar una conformación de baja energía de la
estructura resultante.
Las coordenadas estructurales de una estructura
de AR-LBD se pueden aplicar a datos de resonancia
magnética nuclear (RMN) para determinar las estructuras
tridimensionales de polipéptidos (por ejemplo AR-LBD
natural o mutado adicional). (Véase por ejemplo Wuthrich, 1986,
John Wiley and Sons, New York: 176-199; Pflugrath
et al., 1986, J. Molecular Biology 189:
383-386; Kline et al., 1986 J. Molecular
Biology 189:377-382). Mientras que la estructura
secundaria de un polipéptido se puede determinar a menudo mediante
los datos de RMN, las conexiones espaciales entre piezas
individuales de la estructura secundaria no se determinan tan
fácilmente. Las coordenadas estructurales de un polipéptido definido
mediante cristalografía de rayos X pueden guiar al espectroscopista
en resonancia RMN a una comprensión de las interacciones espaciales
entre elementos estructurales secundarios en un polipéptido de
estructura relacionada. La información sobre interacciones
espaciales entre elementos estructurales secundarios se puede
simplificar enormemente mediante datos del efecto
Over-hauser nuclear (NOE) a partir de experimentos
de RMN bidimensional. Además, la aplicación de las coordenadas
estructurales tras la determinación de la estructura secundaria
mediante técnicas de RMN simplifica la asignación del NOE que se
refiere a aminoácidos particulares en la secuencia polipeptídica, y
no distorsiona enormemente el análisis de RMN de la estructura
polipeptídica.
A su vez, ésta se puede someter a cualquiera de
las varias formas de refinamiento para proporcionar una estructura
final exacta del cristal desconocido. Lattman, E., "Use of the
Rotation and Translation Functions", en Methods in Enzymology,
115, p. 55-77 (1985); M. G. Rossmann, ed., "The
Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Ser., No. 13,
Gordon & Breach, New York, (1972).
También se pueden emplear según la presente
invención otras técnicas de obtención de modelos moleculares.
Véase, por ejemplo, Cohen, N. C. et al, "Molecular
Modelling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med.
Chem., 33, p. 883-894 (1990). Véase también Navia,
M. A. y M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug
Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, p.
202-210 (1992).
La presente invención se refiere asimismo a un
método de cribado para un ligando capaz de unirse al
AR-LBD y/o que sea capaz de modular la capacidad de
unión del AR-LBD, en el que dicho método comprende
el uso del cristal o modelo según la invención.
El método puede emplear un sistema de cribado 3D
sólido, o un sistema de cribado computacional. Usando estos
sistemas, los compuestos de ensayo se pueden cribar para encontrar
los que interactúan espacial y preferentemente con el
AR-LBD, ya sea mediante acoplamiento computacional o
manual.
En un aspecto, la invención se refiere a un
método de cribado de un ligando capaz de unirse a un
AR-LBD, en el que el AR-LBD se
define mediante las coordenadas estructurales del resto de
aminoácidos dadas anteriormente, comprendiendo el método poner en
contacto el AR-LBD con un compuesto de ensayo y
determinar si dicho compuesto de ensayo se une a dicho
AR-LBD.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "compuesto de ensayo" incluye, pero no se limita a,
un compuesto que se puede obtener a partir de, o se puede producir
mediante, cualquier fuente adecuada, ya sea natural o no. El
compuesto de ensayo se puede diseñar u obtener a partir de una
librería de compuestos que puede comprender péptidos, así como
otros compuestos, tales como pequeñas moléculas orgánicas y
particularmente nuevos compuestos de plomo. A título de ejemplo, el
compuesto de ensayo puede ser una sustancia natural, una
macromolécula biológica, o un extracto obtenido de materiales
biológicos tales como bacterias, hongos, o células o tejidos
animales (particularmente mamíferos), una molécula orgánica o
inorgánica, un compuesto de ensayo sintético, un compuesto de
ensayo semisintético, un mimético estructural o funcional, un
péptido, un péptido mimético, un compuesto de ensayo derivatizado,
un péptido escindido de una proteína completa, o péptidos
sintetizados sintéticamente (tales como, a título de ejemplo,
usando un sintetizador de péptidos o mediante técnicas recombinantes
o sus combinaciones, un compuesto de ensayo recombinante, un
compuesto de ensayo natural o no natural, una proteína de fusión o
equivalente de la misma y mutantes, derivados o combinaciones de los
mismos.
El término "modular" significa inducir un
incremento o una disminución en la actividad del receptor de
andrógenos a través de la unión de un compuesto de ensayo a un
AR-LBD. El término también engloba la eliminación de
la actividad del receptor.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "mimético" se refiere a cualquier compuesto químico
que incluya, pero no se limite a, un péptido, polipéptido,
anticuerpo u otro compuesto químico orgánico que tenga la misma
actividad cualitativa o efecto que un compuesto de ensayo conocido.
Esto es, el mimético es un equivalente funcional de un compuesto de
ensayo conocido (tal como un ligando conocido capaz de unirse al
AR-LBD).
El término "derivado" o "derivatizado"
tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la modificación
química de un compuesto de ensayo. Ilustrativas de tales
modificaciones químicas serían la sustitución de hidrógeno por un
grupo halo, un grupo alquilo, un grupo acilo o un grupo amino.
Típicamente, el compuesto de ensayo se preparará
mediante técnicas de ADN recombinantes, y/o técnicas de síntesis
química.
Una vez se ha identificado un compuesto de
ensayo capaz de interactuar con un resto de aminoácido clave en el
AR-LBD, se pueden llevar a cabo otras etapas para
seleccionar y/o modificar compuestos y/o modificar compuestos
existentes, para modular la interacción con los restos de
aminoácidos clave en el AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de ensayo y ligandos que se
identificaron con el cristal de la presente invención se pueden
cribar en ensayos, tales como los bien conocidos en la técnica. El
cribado puede ser, por ejemplo, en cultivo celular in vitro
y/o in vivo. Los ensayos de cribado biológico se centran
preferentemente en modelos de respuesta basados en actividad,
ensayos de unión (que miden lo bien que se une un compuesto al
receptor), extirpes bacterianas, de levaduras y de células animales
(que miden el efecto biológico de un compuesto en una célula). Los
ensayos se pueden automatizar para un cribado con un resultado de
alta capacidad y alto rendimiento (HTS), en el que se pueden
ensayar grandes números de compuestos para identificar compuestos
con la actividad deseada. El ensayo biológico también puede ser un
ensayo en busca de la actividad de unión de ligando de un compuesto
que se une selectivamente al LBD en comparación con otros receptores
nucleares.
En una forma de realización, la presente
invención proporciona un método de cribado para un compuesto de
ensayo capaz de interactuar con un resto de aminoácido clave del
AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto preferido de la invención
proporciona un procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- llevar a cabo el método de cribado para un ligando como se describe anteriormente;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un dominio de unión de ligando; y
- (c)
- preparar una cantidad de dicho uno o más ligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
Un aspecto adicional preferido de la invención
proporciona un procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- llevar a cabo el método de cribado para un ligando como se describe anteriormente;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un AR-LBD; y
- (c)
- preparar una composición farmacéutica que comprende dicho uno o más ligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
Aún otro aspecto preferido de la invención
proporciona un procedimiento que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- llevar a cabo el método de cribado para un ligando como se describe anteriormente;
- (b)
- identificar uno o más ligandos capaces de unirse a un AR-LBD;
- (c)
- preparar una cantidad de dicho uno o más ligandos capaces de unirse a un AR-LBD;
- (d)
- llevar a cabo dicho método de cribado para un ligando como se describe anteriormente;
- (e)
- preparar opcionalmente una composición farmacéutica que comprende dicho uno o más ligandos.
\vskip1.000000\baselineskip
De este modo, la información estructural
procedente de la estructura cristalina de la presente invención es
útil en el diseño de ligandos potenciales capaces de interactuar con
el AR-LBD y/o capaces de modular la capacidad de
unión del ADN del AR-LBD, y los modelos de la
presente invención son útiles para examinar el efecto que dicho
ligando es probable que tenga sobre la estructura y/o función del
AR-LBD.
En un aspecto, la presente invención se refiere
a un ligando identificado usando tales métodos de cribado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "ligando" se refiere a un compuesto de ensayo capaz de
unirse a uno o más restos clave en el LBD. Dicho ligando también se
puede denominar como un compuesto de unión al receptor de
andrógenos. Preferentemente, el ligando es capaz de modular la
actividad de AR-LBD.
Los moduladores (por ejemplo inhibidores) de un
AR-LBD se pueden diseñar e identificar de forma que
puedan modificar un AR-LBD implicado en un
trastorno clínico. El diseño e identificación racional de
moduladores de AR-LBD se puede lograr usando las
coordenadas estructurales atómicas que definen una estructura de
AR-LBD, o una parte de la misma. Los métodos de
identificación de diseño de moduladores basados en la estructura son
técnicas poderosas que pueden implicar búsquedas de bases de datos
por ordenador que contienen una variedad de moduladores y grupos
funcionales químicos potenciales. (Véase Kuntz et al., 1994,
Acc. Chem. Res. 27:117; Guida, 1994, Current Opinion in Struc.
Biol. 4: 777; y Colman, 1994, Current Opinion in Struc. Biol. 4:
868, para repasos de diseño e identificación de fármacos a base de
la estructura; y Kuntz et al 1982, J. Mol. Biol. 162:269;
Kuntz et al., 1994, Ace. Chem. Res. 27: 117; Meng et
al., 1992, J. Compt. Chem. 13: 505; Bohm, 1994, J. Comp. Aided
Molec. Design 8: 623 para métodos de diseño de moduladores a base de
estructuras).
Las estructuras de AR-LBD, y las
partes de las mismas descritas en la presente memoria, y las
estructuras de otros polipéptidos determinados mediante la
formación de modelos de homología, sustitución molecular y técnicas
de RMN descritas en la presente memoria, también se pueden aplicar a
métodos de diseño e identificación de moduladores.
Los moduladores de AR-LBD se
pueden identificar adaptando la representación de compuestos por
ordenador a partir de una base de datos de moléculas. Las bases de
datos que se pueden usar incluyen ACD (Molecular Designs Limited),
NCI (National Cancer Institute), CCDC (Cambridge Crystallographic
Data Center), CAST (Chemical Abstract Service), Derwent (Derwent
Information Limited), Maybridge (Maybridge Chemical Company Ltd),
Aldrich (Aldrich Chemical Company), DOCK (University of California
in San Francisco), y el Directory of Natural Products (Chapman
& Hall). Para convertir un conjunto de datos representados en
dos dimensiones en uno representado en tres dimensiones, se pueden
usar programas de ordenador tales como CONCORD (Tripos Associates) o
DB-Converter (Molecular Simulations Limited).
\vskip1.000000\baselineskip
Los programas de ordenador pueden comprender las
siguientes etapas:
- (a)
- adaptar una representación por ordenador de una estructura de un compuesto en una representación por ordenador de un AR-LBD definido según la invención usando el programa de ordenador, o moviendo interactivamente la representación del compuesto en la representación del sitio de unión;
- (b)
- caracterizar la geometría y las interacciones complementarias formadas entre los átomos del sitio de unión y del compuesto; opcionalmente
- (c)
- buscar librerías para fragmentos moleculares que pueden ajustar en el espacio vacío entre el compuesto y el sitio de unión y se puedan enlazar al compuesto; y
- (d)
- enlazar el fragmento encontrado en (c) al compuesto y evaluar el nuevo compuesto modificado.
\vskip1.000000\baselineskip
También se proporcionan métodos para identificar
un modulador potencial de una función de AR-LBD
adaptando una representación por ordenador de un compuesto con una
representación por ordenador de una estructura de un
AR-LBD que se define mediante interacciones
atómicas, contactos atómicos, o coordenadas estructurales atómicas
descritas en la presente memoria. En una forma de realización, el
método comprende las siguientes etapas:
- (a)
- adaptar una representación por ordenador de un compuesto procedente de una base de datos con una representación por ordenador de un sitio seleccionado (por ejemplo el sitio de unión del inhibidor) en una estructura de AR-LBD definida según la invención, para obtener un complejo;
- (b)
- determinar una conformación del complejo con un ajuste geométrico favorable e interacciones complementarias favorables; y
- (c)
- identificar compuestos que se ajustan mejor al sitio seleccionado como moduladores potenciales del AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
"Adaptar" se refiere a un proceso de
colocar un compuesto en proximidad cercana con un sitio activo de un
polipéptido (es decir, un AR-LBD), o un proceso de
hallar conformaciones de baja energía de un complejo de
compuesto/polipéptido (es decir, un complejo de
compuesto/AR-LBD).
Ejemplos de otros programas de ordenador que se
pueden usar para el diseño de moduladores a base de estructuras son
CAVEAT (Bartlett et al., 1989, en "Chemical and Biological
Problems in Molecular Recognition", Roberts, S.M. Ley, S.V.;
Campbell, N.M. eds; Royal Society of Chemistry: Cambridge, p
182-196); FLOG (Miller et al., 1994, J.
Comp. Aided Molec. Design 8:153); PRO Modulator (Clark et
al., 1995 J. Comp. Aided Molec. Design 9:13); MCSS (Miranker y
Karplus, 1991, Proteins: Structure, Fuction, and Genetics 8:195);
and, GRID (Goodford, 1985, J. Med. Chem. 28:849).
En una forma de realización de la invención, se
proporciona un método para identificar moduladores potenciales de
la función de AR-LBD. El método utiliza las
coordenadas estructurales de una estructura tridimensional de
AR-LBD, o un sitio de unión de la misma. El método
comprende las etapas siguientes: (a) generar una representación por
ordenador de una estructura de AR-LBD, y adaptar una
representación por ordenador de un compuesto procedente de una base
de datos por ordenador con una representación por ordenador del
AR-LBD para formar un complejo; (b) determinar una
conformación del complejo con un ajuste geométrico favorable o
interacciones complementarias favorables; y (c) identificar
compuestos que ajusten mejor el AR-LBD como
moduladores potenciales de la función de AR-LBD. La
estructura de AR-LBD inicial puede tener o no
compuestos unidos a ella. Un ajuste geométrico favorable se produce
cuando las áreas superficiales de un compuesto en un complejo de
compuesto-AR-LBD están en estrecha
proximidad con el área superficial del AR-LBD sin
formar interacciones desfavorables. Una interacción complementaria
favorable se produce cuando un compuesto en un complejo de
compuesto-AR-LBD interactúa mediante
fuerzas hidrófobas, aromáticas, iónicas, o dadoras y aceptoras de
hidrógenos, con el AR-LBD sin formar interacciones
desfavorables. Las interacciones desfavorables pueden ser un
impedimento estérico entre átomos en el compuesto y átomos en el
AR-LBD.
En otra forma de realización, se identifican
moduladores potenciales utilizando una estructura de
AR-LBD con o sin compuestos unidos a ella. El
método comprende las etapas siguientes: (a) modificar una
representación por ordenador de un AR-LBD que tiene
uno o más compuestos unidos a él, cuando las representaciones por
ordenador del compuesto o compuestos y AR-LBD se
definen mediante coordenadas estructurales atómicas; (b) determinar
una conformación del complejo con un ajuste geométrico favorable e
interacciones complementarias favorables; y (c) identificar los
compuestos que se ajustan mejor al AR-LBD como
moduladores potenciales. Una representación por ordenador se puede
modificar suprimiendo o añadiendo un grupo o grupos químicos. Las
representaciones por ordenador de los grupos químicos se pueden
seleccionar a partir de una base de datos por ordenador.
Otra forma de identificar moduladores
potenciales es modificar un modulador existente en un sitio de unión
de polipéptido. La representación por ordenador de moduladores se
puede modificar dentro de la representación por ordenador de un
AR-LBD. Esta técnica se describe con detalle en
Molecular Simulations User Manual, 1995 en LUDI. La representación
por ordenador de un modulador se puede modificar suprimiendo un
grupo o grupos químicos, o añadiendo un grupo o grupos químicos.
Después de cada modificación a un compuesto, los átomos del
compuesto modificado y del sitio de unión se pueden desplazar en
conformación, y la distancia entre los átomos del modulador y del
sitio de unión se pueden puntuar basándose en el ajuste geométrico y
en las interacciones complementarias favorables entre las
moléculas. Los compuestos con puntuaciones favorables son
moduladores potenciales.
Los compuestos diseñados mediante programas de
ordenador que construyen moduladores o que buscan moduladores se
pueden cribar para identificar moduladores potenciales. Los ejemplos
de tales programas de ordenador incluyen programas en el paquete
Molecular Simulations Package (Catalyst), ISIS/HOST, ISIS/BASE, e
ISIS/DRAW (Molecular Designs Limited), y UNITY (Tripos Associates).
Se puede usar un programa de construcción para sustituir la
representación por ordenador de grupos químicos en un compuesto
complejado con un AR-LBD con grupos procedentes de
una base de datos por ordenador. Se puede usar un programa de
búsqueda para buscar representaciones por ordenador de compuestos a
partir de una base de datos de ordenador que tengan estructuras
tridimensionales similares y grupos químicos similares como un
compuesto que se une a un AR-LBD. Los programas se
pueden hacer funcionar en la estructura de la estructura de
AR-LBD.
\vskip1.000000\baselineskip
Un programa típico pude comprender las
siguientes etapas:
- (a)
- cartografiar características químicas de un compuesto, tales como dadores o aceptores de enlaces de hidrógeno, sitios hidrófobos/lipófilos, sitios positivamente ionizables, o sitios negativamente ionizables;
- (b)
- añadir restricciones geométricas para seleccionar características cartografiadas;
- (c)
- buscar bases de datos con el modelo generado en (b).
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización de la invención, se
proporciona un método para identifica moduladores potenciales de un
AR-LBD usando la conformación tridimensional del
AR-LBD en diversos programas de ordenador de
construcción de moduladores o de búsqueda de moduladores en
compuestos complejados con el AR-LBD. El método
comprende las etapas siguientes: (a) generar una representación por
ordenador de uno o más compuestos complejados con un
AR-LBD; (b) (i) buscar una base de datos para un
compuesto con una estructura geométrica similar o grupos químicos
similares a los compuestos generados usando un programa de ordenador
que busca representaciones por ordenador de compuestos a partir de
una base de datos que tiene estructuras tridimensionales similares y
grupos químicos similares, o (ii) sustituir porciones de los
compuestos complejados con el AR-LBD con estructuras
químicas similares (es decir, forma y volumen casi idénticos) a
partir de una base de datos usando un programa por ordenador para
la construcción de compuestos, que sustituye las representaciones
por ordenador de grupos químicos con grupos procedentes de una base
de datos de ordenador, en el que las representaciones de los
compuestos se definen mediante coordenadas estructurales.
Un compuesto que interactúa con un
AR-LBD identificado usando un método de la invención
se puede usar como un modulador de cualquier AR-LBD
o composición que tenga el dominio de unión de interacción. Por lo
tanto, la invención se refiere a un modulador de un
AR-LBD identificado mediante un método de la
invención.
La invención contempla además un método para
diseñar inhibidores potenciales de un AR-LBD, que
comprende la etapa de usar las coordenadas estructurales de un
inhibidor o sustrato o sus partes, definido en relación con su
asociación espacial con una estructura de AR-LBD
para generar un compuesto que es capaz de asociarse con el
AR-LBD.
En una forma de realización de la invención, se
proporciona un método para diseñar inhibidores potenciales de un
AR-LBD, que comprende la etapa de usar las
coordenadas estructurales de AR-LBD en la Tabla 4
para generar un compuesto para asociarlo con el sitio activo de un
AR-LBD. Se emplean las siguientes etapas en un
método particular de la invención: (a) generar una representación
por ordenador de AR-LBD definido por sus coordenadas
estructurales enumeradas en la Tabla 4; (b) buscar moléculas en una
base de datos que sean estructural o químicamente similares al
AR-LBD definido, usando un programa de ordenador de
búsqueda, o sustituir porciones del compuesto con estructuras
químicas similares a partir de una base de datos usando un programa
de ordenador que construye
compuestos.
compuestos.
Se apreciará que un modulador de un
AR-LBD se puede identificar generando un modelo
tridimensional real de una cavidad de unión, sintetizando un
compuesto, y examinando los componentes para ver si se produce la
interacción requerida.
Los moduladores potenciales de
AR-LBD identificados usando los métodos descritos
anteriormente, se pueden preparar usando métodos descritos en
fuentes de referencia estándar utilizadas por los expertos en la
materia. Por ejemplo, los compuestos orgánicos se pueden preparar
mediante métodos sintéticos orgánicos descritos en las referencias
tales como March, 1994, Advanced Organic Chemistry: Reactions,
Mechanisms, and Structure, New York, McGraw Hill.
La invención se refiere asimismo a un modulador
potencial identificado por los métodos de la invención. En
particular, se proporcionan clase de moduladores de
AR-LBD que se basan en la estructura tridimensional
de una asociación espacial del inhibidor o del modulador con una
estructura de AR-LBD.
La invención contempla todos los isómeros
ópticos y formas racémicas de los moduladores de la invención.
"Modulador" se refiere a una molécula que
cambia o altera la actividad biológica de un AR-LBD.
Un modulador puede aumentar o disminuir la actividad de
AR-LBD, o cambiar sus características, o propiedades
funcionales o inmunológicas. Puede ser un inhibidor que disminuya
la actividad biológica o inmunológica de la proteína. Un modulador
puede potenciar o inhibir la actividad biológica de
AR-LBD.
Los moduladores incluyen, pero no se limitan a,
péptidos, miembros de librerías de péptidos al azar y librerías
moleculares derivadas de química combinatoria, fosfopéptidos
(incluyendo miembros de librerías de fosfopéptidos dirigidas, al
azar o parcialmente degeneradas), anticuerpos, hidratos de carbono,
nucleósidos o nucleótidos o sus partes, y pequeñas moléculas
orgánicas o inorgánicas. Un modulador puede ser un compuesto
fisiológico endógeno, o puede ser un compuesto natural o
sintético.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "ligando" incluye, pero no se
limita a, ligandos esteroideos y no esteroideos. Los ligandos pueden
ser naturales o sintéticos. Los ligandos pueden ser ligandos de
AR-LBD estructuralmente nuevos. Como alternativa,
los ligandos pueden ser análogos de ligandos de
AR-LBD conocidos, pero con propiedades mejoradas. El
ligando puede ser un mimético de andrógeno. El ligando puede ser
capaz de modular (por ejemplo aumentar) la expresión génica del
receptor de andrógenos. Como alternativa, el ligando puede ser capaz
de bloquear la actividad de andrógenos uniéndose a un
AR-LBD con afinidad elevada. El ligando puede ser
capaz de disminuir la expresión génica del receptor de andrógenos.
El término "ligando" se refiere asimismo a un ligando
químicamente modificado.
El ligando puede actuar, por ejemplo, como un
agonista, un agonista parcial, un antagonista y/o un antagonista
competitivo del receptor de andrógenos.
Para algunas formas de realización, el ligando
está en una forma pura y/o aislada.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "ligandos de diseñador" significa compuestos de
ensayo que es probable que se unan al AR-LBD
basándose en su forma tridimensional en comparación con la del
receptor de andrógenos, y en particular el
AR-LBD.
Preferentemente, los compuestos que tienen una
estructura que es complementaria a la del
AR-LBD.
Preferentemente, los ligandos comprenden
sustituyentes del ligando que compensan los cambios estructurales
en el bolsillo de unión de ligando (LBP) entre los
AR-LBD de tipo natural y los mutantes.
El compuesto de ensayo se puede evaluar para
determinar su interacción con un resto de aminoácido que interactúa
en el AR-LBD. Como alternativa, el compuesto de
ensayo puede afectar a la unión del ligando actuando como agonista
o como antagonista.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "agonista" significa cualquier ligando que sea capaz
de unirse a un AR-LBD y que es capaz de aumentar una
proporción del AR que está en forma activa, dando como resultado un
aumento de la respuesta biológica. El término incluye agonistas
parciales y agonistas inversos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "agonista parcial" significa un agonista que es
incapaz de provocar la respuesta máxima de un sistema biológico,
incluso a una concentración suficiente para saturar los receptores
específicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "agonista inverso parcial" es un agonista inverso
que provoca una respuesta por debajo de la máxima de un sistema
biológico, incluso a una concentración suficiente para saturar los
receptores específicos. A concentraciones elevadas, disminuirá las
acciones de un agonista inverso completo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "antagonista" significa cualquier agente que reduce la
acción de otro agente, tal como un agonista, el antagonista puede
actuar en el mismo receptor que el agonista. La acción antagonista
puede resultar de una combinación de que la sustancia está siendo
antagonizada (antagonismo químico) o la producción de un efecto
opuesto a través de un receptor diferente (antagonismo funcional o
antagonismo fisiológico), o como consecuencia de la competición por
el sitio de unión de un intermedio que liga la activación del
receptor con el efecto observado (antagonismo indirecto).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "antagonismo competitivo" se refiere a la competición
entre un agonista y un antagonista por un receptor que se produce
cuando la unión del agonista y del antagonista se hace mutuamente
excluyente. Esto puede ser debido a que el agonista y el antagonista
compiten por el mismo sitio de unión, o se combinan con sitios
adyacentes pero solapantes. Una tercera posibilidad es que estén
implicados diferentes sitios, pero que puedan influir a las
macromoléculas del receptor de tal forma que las moléculas del
agonista y del antagonista no se puedan unir al mismo tiempo. Si el
agonista y el antagonista forman solo combinaciones de corta vida
con el receptor de forma que se alcance el equilibrio entre
agonista, antagonista y receptor durante la presencia del agonista,
el antagonismo puede ser superable a lo largo de un amplio
intervalo de concentraciones. Por el contrario, algunos
antagonistas, cuando están en una proximidad suficientemente
cercana a su sitio de unión, pueden formar un enlace covalente
estable con él, y el antagonismo no puede ser superable cuando
quedan receptores disponibles.
En un aspecto, el ligando identificado puede
actuar como un modelo de ligando (por ejemplo, un molde) para el
desarrollo de otros compuestos.
La expresión "modelo de ligando" se refiere
a las coordenadas estructurales de un compuesto que encaja en el
AR-dominio de unión de ligando (LBD), y que se puede
usar para formar modelos para identificar y/o diseñar ligandos
(ligandos de diseñador) capaces de unirse al AR-LBD,
tal como para la modulación subsiguiente del mismo.
El experto en la materia puede usar uno de
varios métodos para ensayar compuestos en busca de su capacidad
para asociarse con el AR-LBD. Este proceso puede
comenzar mediante inspección visual de, por ejemplo, un sitio diana
en el cribado por ordenador basado en las coordenadas estructurales
dadas en la Tabla 4. Los compuestos de ensayo seleccionados se
pueden situar entonces en una variedad de orientaciones, o
encajados, dentro de un sitio diana individual de
AR-LBD como se define más arriba. El acoplamiento se
puede lograr usando software tal como Quanta y Sybyl, seguido de
minimización de energía y dinámica molecular con campos de fuerza de
mecánica molecular estándar, tales como CHARMM y AMBER. Los
programas de ordenador especializados también pueden ayudar en el
proceso de seleccionar ligandos potenciales. Éstos incluyen:
1. GRID (Goodford, P. J., "A Computational
Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on
Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, p.
849-857 (1985)). GRID está disponible de Oxford
University, Oxford, UK.
2. MCSS (Miranker, A. y M. Karplus,
"Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous
Search Method." Proteins: Structure. Function and Genetics, 11,
p. 29-34 (1991)). MCSS está disponible de Molecular
Simulations, Burlington, Mass.
3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. y A. J. Olsen,
"Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated
Annealing", Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, p.
195-202 (1990)). AUTODOCK está disponible de Scripps
Research Institute, La Jolla, Calif.
4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., "A
Geometric Approach to Macromolecule-Ligand
Interactions", J. Mol. Biol., 161, p. 269-288
(1982)). DOCK está disponible de University of California, San
Francisco, Calif.
Una vez que un ligando se ha seleccionado o
diseñado de forma óptima, entonces se pueden realizar sustituciones
en algunos de sus átomos o grupos laterales con el fin de mejorar o
modificar sus propiedades de unión. Generalmente, las sustituciones
iniciales son conservativas, es decir, el grupo de sustitución
tendrá aproximadamente el mismo tamaño, forma, hidrofobia y carga
que el grupo original. Por supuesto, se debe entender que se
deberían evitar componentes conocidos en la técnica por alterar la
conformación. Tales compuestos químicos sustituidos se pueden
analizar entonces para determinar la eficacia para encajar en
AR-LBD mediante los mismos métodos por ordenador
descritos anteriormente.
Preferentemente, las posiciones para la
sustitución se seleccionan basándose en la orientación de unión
predicha de un compuesto de ensayo con el
AR-LBD.
Los ligandos de la presente invención pueden ser
naturales o sintéticos. El término "ligando" se refiere
asimismo a un ligando químicamente modificado.
El ligando de la presente invención o sus
miméticos se pueden producir usando métodos químicos para sintetizar
el ligando en todo o en parte. Por ejemplo, los péptidos se pueden
sintetizar mediante técnicas en fase sólida, escindidos de la
resina, y purificados mediante cromatografía de líquidos de altas
prestaciones preparativa (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins
Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York
NY). La composición de los péptidos sintéticos se puede confirmar
mediante análisis o secuenciación de aminoácidos (por ejemplo, el
procedimiento de degradación de Edman; Creighton, más
arriba).
La síntesis directa del ligando o su mimético se
puede llevar a cabo usando diversas técnicas en fase sólida
(Roberge JY et al (1995) Science 269:
202-204) y se pueden lograr síntesis automatizadas,
por ejemplo usando el sintetizador de péptidos ABI 431 A (Perkin
Elmer) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
Adicionalmente, las secuencias de los aminoácidos que se pueden
obtener a partir del ligando o cualquier parte de las mismas, se
pueden alterar durante la síntesis directa y/o se pueden combinar
usando métodos químicos con un secuencia procedente de otras
subunidades, o cualquier parte de las mismas, para producir un
ligando variante.
En una forma de realización alternativa de la
invención, la secuencia codificante del ligando o su mimético se
puede sintetizar, en todo o en parte, usando métodos químicos bien
conocidos en la técnica (véase Caruthers MH et al (1 980)
Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al
(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Por tanto, los ligandos se pueden sintetizar
químicamente, o se pueden preparar usando técnicas
recombinantes.
En un aspecto, preferentemente, el ligando se
prepara mediante el uso de técnicas de síntesis química.
En otro aspecto, preferentemente los ligandos de
la presente invención se pueden producir a partir de células
hospedantes usando técnicas recombinantes.
Para la expresión de las secuencias
nucleotídicas que codifican los ligandos de la presente invención,
se puede emplear una amplia variedad de células hospedantes. Estas
células pueden ser células hospedantes tanto procariotas como
eucariotas. Las células hospedantes adecuadas incluyen bacterias
tales como E. coli, levadura, hongos filamentosos, células
de insectos, células de mamíferos, típicamente inmortalizadas, por
ejemplo de ratón, CHO, extirpes celulares humanas y de monos, y sus
derivados. Las células hospedantes preferidas son capaces de
procesar los productos de expresión para producir un polipéptido
maduro apropiado. El procesamiento incluye pero no se limita a
glucosilación, ubiquitinación, formación de enlaces de disulfuro y
modificación post-translacional general.
En una forma de realización de la presente
invención, el ligando puede ser un ligando químicamente
modificado.
La modificación química de un ligando y/o un
resto de aminoácido clave de la presente invención, puede potenciar
o reducir la interacción de enlaces de hidrógeno, la interacción de
las cargas, la interacción hidrófoba, la interacción de, Van Der
Waals o la interacción bipolar entre el ligando y el resto o restos
de aminoácidos clave del AR-LBD. A título de
ejemplo, el impedimento estérico es un medio habitual para cambiar
la interacción del dominio de unión de AR-LBD con
el dominio de activación.
Preferentemente, tales modificaciones implican
la adición de sustituyentes sobre un compuesto de ensayo, de forma
que los sustituyentes están situados para chocar o para unirse
preferentemente con uno o más restos de aminoácidos que
corresponden a los restos de aminoácidos clave del
AR-LBD de la presente invención.
Las características únicas implicadas en la
unión de ligando selectiva a AR se pueden identificar comparando
estructuras cristalinas de diferentes receptores de esteroides,
tales como el AR y los receptores de progesterona (PR) y/o
isoformas del mismo tipo de receptor.
En un séptimo aspecto, la presente invención
proporciona el uso de un ligando identificado mediante un método de
cribado, que comprende el uso de una estructura cristalina que
comprende un AR-LBD, en la preparación de un
medicamento para prevenir y/o tratar trastornos relacionados con
andrógenos.
La expresión trastornos relacionados con
andrógenos se refiere a un trastorno tal como cáncer de próstata
(PC), síndrome de insensibilidad a andrógenos (AIS), síndrome de
insensibilidad parcial a andrógenos (PAIS), síndrome de
insensibilidad leve a andrógenos (MAIS) y síndrome de insensibilidad
completa a andrógenos (CAIS).
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona una composición farmacéutica, que comprende un ligando
según la presente invención y opcionalmente un vehículo, diluyente o
excipiente farmacéuticamente aceptable (incluyendo sus
combinaciones). La composición farmacéutica puede comprender o se
puede usar juntamente con un compuesto farmacéuticamente activo o
composición adicional.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser para
uso humano o animal en medicina humana y veterinaria, y comprenderán
típicamente uno cualquiera o más de un diluyente, vehículo o
excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes
aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica
farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit.
1985). La elección del vehículo, excipiente o diluyente
farmacéutico se puede realizar con respecto a la vía pretendida de
administración y la práctica farmacéutica estándar. Las
composiciones farmacéuticas pueden comprender como - o además de -
el vehículo, excipiente o diluyente cualquier aglutinante o
aglutinantes, lubricante o lubricantes, agente o agentes de
suspensión, agente o agentes de revestimiento, agente o agentes
solubilizantes adecuados.
En la composición farmacéutica se pueden
proporcionar conservantes, estabilizantes, colorantes e incluso
agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen
benzoato sódico, ácido sórbico y ésteres de ácido
p-hidroxibenzoico. También se pueden usar
antioxidantes y agentes de suspensión.
Puede haber diferentes requisitos de
composición/formulación dependiendo de los diferentes sistemas de
suministro. A título de ejemplo, la composición farmacéutica de la
presente invención se puede formular para ser administrada usando
una minibomba o mediante una vía mucosal, por ejemplo como una
pulverización o aerosol nasal para inhalación, o como disolución
ingerible, o parenteralmente, en cuyo caso la composición se formula
en forma inyectable, para administración, por ejemplo, mediante una
vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Como alternativa, la
formulación se puede diseñar para ser administrada mediante dos
vías.
Cuando la composición farmacéutica se va a
administrar de forma mucosal a través de la mucosa
gastro-intestinal, debería de ser capaz de
permanecer estable durante el tránsito a través del tubo digestivo;
por ejemplo, debería de ser resistente a la degradación
proteolítica, debería de ser estable a pH ácido y resistente a los
efectos detergentes de la bilis.
Cuando sea apropiado, las composiciones
farmacéuticas se pueden administrar mediante inhalación, en forma
de un supositorio o pesario, tópicamente en forma de una loción,
disolución, crema, ungüento o polvo fino, mediante uso de un parche
para la piel, oralmente en forma de comprimidos que contienen
excipientes tales como almidón o lactosa o yeso, o en cápsulas u
óvulos, ya sea solos o en mezcla con excipientes, o en forma de
elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes
saborizantes o colorantes, o se pueden inyectar parenteralmente,
por ejemplo intravenosa, intramuscular o subcutáneamente. Para la
administración parenteral, las composiciones se pueden usar mejor
en forma de disolución acuosa estéril, que puede contener otras
sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para
hacer a la disolución isotónica con la sangre. Para la
administración bucal o sublingual, las composiciones se pueden
administrar en forma de comprimidos o pastillas, que se pueden
formular de manera convencional.
La invención proporciona además un método para
prevenir y/o tratar un trastorno relacionado con andrógenos en un
mamífero, comprendiendo el método administrar a un mamífero un
ligando que se une a por lo menos el AR-LBD con
afinidad elevada, y en algunos casos en un grado tal para modular
dicho AR-LBD. En un aspecto, la unión de bloque de
otros ligandos a por lo menos el AR-LBD. Tales
ligandos pueden ser útiles, por ejemplo, en el tratamiento de
trastornos mediados por el AR en hombres o mujeres.
Típicamente, el médico determinará la dosis real
que será la más adecuada para un individuo, y variará con la edad,
peso y respuesta del paciente particular y gravedad de la afección.
Las dosis a continuación son ejemplares del caso medio. Por
supuesto, puede haber casos individuales que merezcan intervalos de
dosis mayores o menores.
Las composiciones (o partes componentes de las
mismas) de la presente invención se pueden administrar oralmente.
Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes
de las mismas) de la presente invención se pueden administrar
mediante inyección directa. Además, o como alternativa, las
composiciones (o partes componentes de las mismas) de la presente
invención se pueden administrar tópicamente. Además, o como
alternativa, las composiciones (o partes componentes de las mismas)
de la presente invención se pueden administrar mediante inhalación.
Además, o como alternativa, las composiciones (o partes componentes
de las mismas) de la presente invención también se pueden
administrar mediante uno o más de: medios de administración
parenteral, mucosal, intramuscular, intravenoso, subcutáneo,
intraocular o transdérmico, y se formulan para dicha
administración.
A título de ejemplo adicional, la composición
farmacéutica de la presente invención se puede administrar según un
régimen de 1 a 10 veces por día, tal como una o dos veces por día.
El nivel de dosis específico y la frecuencia de la dosificación
para un paciente particular pueden variar y dependerán de una
variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto
específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de
acción de ese compuesto, la edad, peso corporal, salud general,
sexo, dieta, modo y tiempo de administración, velocidad de
excreción, combinación farmacéutica, la gravedad de la afección
particular, y el hospedante que sufre la terapia.
El término "administrado" también incluye,
pero no se limita a, la administración mediante vía mucosal, por
ejemplo como una pulverización o aerosol nasal para inhalación, o
como una disolución ingerible; una vía parenteral, en la que la
administración se realiza mediante forma inyectable, tal como, por
ejemplo, una vía intravenosa, intramuscular o subcutánea.
Por tanto, la composición farmacéutica de la
presente invención se puede administrar mediante una o más de las
siguientes vías: administración oral, inyección (tal como inyección
directa), tópica, inhalación, administración parenteral,
administración mucosal, administración intramuscular, administración
intravenosa, administración subcutánea, administración intraocular
o administración transdérmica.
Un aspecto de la invención proporciona un método
para determinar las estructuras secundarias y/o terciarias de
polipéptidos con estructuras desconocidas, que comprende la etapa de
usar una estructura cristalina o modelo de la invención.
El polipéptido bajo investigación está
preferentemente relacionado estructural o funcionalmente con el
dominio de unión de ligando del receptor de andrógenos. Por
ejemplo, el polipéptido puede mostrar un grado de homología a lo
largo de algunas o todas las partes de la secuencia de aminoácidos
primaria.
Como se aplica a polipéptidos, la expresión
"identidad sustancial de secuencias" significa que dos
secuencias peptídicas, cuando se alinean óptimamente, tal como
mediante los programas GAP o BESTFIT usando un salto por defecto,
comparten por lo menos 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, u 85% de
identidad de secuencias, preferentemente por lo menos 90 por ciento
de identidad de secuencias, más preferentemente por lo menos 95 por
ciento de identidad de secuencias o más. Preferentemente, las
posiciones de los restos que no son idénticas difieren mediante
sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, la
sustitución de aminoácidos que tienen propiedades químicas
similares, tales como carga o polaridad, probablemente no afectará a
las propiedades de una proteína. Los ejemplos incluyen glutamina
para aspargina o ácido glutámico para ácido aspártico.
En una forma de realización adicional, la
invención se refiere a un método para determinar estructuras
tridimensionales de polipéptidos con estructuras desconocidas,
preferentemente un AR-LBD natural o mutado,
aplicando las coordenadas estructurales de una estructura de
AR-LBD de la invención a datos de resonancia
magnética nuclear (RMN) de la estructura desconocida. Este método
comprende las etapas siguientes: (a) determinar la estructura
secundaria de una estructura desconocida usando datos de RMN; y (b)
simplificar la asignación de interacciones a través del espacio de
los aminoácidos. La expresión "interacciones a través del
espacio" define la orientación de los elementos estructurales
secundarios en la estructura tridimensional y las distancias entre
aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia de aminoácidos.
El término "asignación" define un método para analizar datos
de RMN e identificar qué aminoácidos dan lugar a señales en el
espectro de RMN.
El polipéptido puede ser por ejemplo una forma
mutante de un AR-LBD. El término "mutante" se
refiere a un polipéptido que se obtiene sustituyendo por lo menos
un resto de aminoácido en un AR-LBD natural con un
resto de aminoácido diferente. La mutación también se puede lograr
añadiendo y/o suprimiendo restos de aminoácidos en el
AR-LBD natural o parte del mismo. Un mutante puede
ser o no funcional.
Como alternativa, el polipéptido puede ser un
AR-LBD procedente de una especie diferente.
Como alternativa, el polipéptido puede realizar
una función análoga, o puede ser sospechoso de mostrar un mecanismo
de unión similar al AR-LBD.
La presente invención proporciona una estructura
secundaria o tridimensional de un AR-LBD o una parte
del mismo. En una forma de realización, la estructura es una forma
cristalina. Una estructura de AR-LBD puede
comprender una celda unidad de AR-LBD.
Una estructura de AR-LBD incluye
la estructura secundaria o tridimensional de un
AR-LBD natural, un AR-LBD derivado,
o un AR-LBD mutante. De esto modo, una forma
cristalina incluye cristales naturales, cristales derivados y
cocristales. Los cristales generalmente comprenden un
AR-LBD sustancialmente puro en forma cristalina. Se
entiende que las estructuras de AR-LBD de la
invención no están limitadas a un AR-LBD de origen
natural o nativo, sino que incluyen polipéptidos con una identidad
de secuencias sustancial con un AR-LBD. Una
estructura de AR-LBD también incluye mutantes de un
AR-LBD natural obtenidos sustituyendo por lo menos
un resto de aminoácido en un AR-LBD natural por un
resto de aminoácido diferente, o añadiendo o suprimiendo restos de
aminoácidos en el polipéptido natural, y que tiene sustancialmente
la misma estructura secundaria o tridimensional que el
AR-LBD natural del que deriva el mutante, es decir,
que tiene un conjunto de coordenadas estructurales atómicas que
tienen una desviación de raíz cuadrática media menor o igual a
aproximadamente 5, 4, 3, 2, o 1,5 \ring{A} cuando se superpone
con las coordenadas estructurales atómicas del
AR-LBD natural del que deriva el mutante cuando por
lo menos 50% a 100% de los átomos del AR-LBD natural
se incluyen en la superimposición. Se debe observar que las
estructuras de AR-LBD contempladas en la presente
memoria no necesitan mostrar actividad de
AR-LBD.
Una estructura de AR-LBD
derivada de la invención comprende una estructura de
AR-LBD en asociación con uno o más restos que
tienen átomos de metales pesados. Por ejemplo, los cristales
derivados de la invención comprenden generalmente un
AR-LBD cristalino en asociación covalente con uno o
más átomos de metales pesados. El AR-LBD puede
corresponder a un AR-LBD natural o mutado. Los
átomos de metales pesados útiles para proporcionar estructuras de
AR-LBD derivadas incluyen, a título de ejemplo, y
sin limitación, oro, mercurio, etc.
La invención se refiere a una estructura de
AR-LBD en asociación con uno o más restos que son
ligandos. La asociación puede ser covalente o no covalente. Las
formas cristalinas de este tipo son denominadas en este caso como
cocristales. El compuesto puede ser cualquier molécula orgánica, y
puede modular la función de un AR-LBD por ejemplo
inhibiendo o potenciando su función, o puede ser un sustrato para el
AR-LBD. Se prefiere que la geometría del compuesto
y las interacciones formadas entre el compuesto y el
AR-LBD proporcionan una unión de elevada afinidad
entre las dos moléculas.
Las estructuras secundarias o tridimensionales
del AR-LBD particular descrito en la presente
memoria proporciona modelos útiles para las estructuras secundarias
o tridimensionales de AR-LBD de cualquier especie,
particularmente mamífera, incluyendo bovina, ovina, porcina,
murina, equina, preferentemente humana, procedente de cualquier
fuente, ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante.
En una forma de realización particular de la
invención, se proporciona una estructura cristalina secundaria o
tridimensional de un AR-LBD que se asocia con un
inhibidor de un AR-LBD, que comprender por lo menos
dos o tres contactos atómicos de interacciones atómicas en la
figura 4, definiéndose cada interacción atómica allí mediante un
contacto atómico (más preferentemente, un átomo específico cuando se
indica) sobre el inhibidor, y un contacto atómico (más
preferentemente, un resto de aminoácido específico cuando se indica)
sobre el AR-LBD (es decir, contacto atómico de
ligando). El dominio de unión se puede definir mediante los
contactos atómicos de ligandos de interacciones atómicas en la
figura 4. Preferentemente, el dominio de unión se define mediante
los átomos de los contactos atómicos de ligandos que tienen las
coordenadas estructurales para los átomos enumerados en la Tabla
4.
El conocimiento de una estructura de
AR-LBD de la invención permite al experto en la
materia identificar homólogos de AR-LBD. Esto se
logra mediante búsquedas de bases de datos tridimensionales. Puesto
que los plegamientos estructurales se conservan en una medida mayor
que la secuencia, se pueden identificar homólogos con una identidad
o similitud de secuencias muy pequeña. Los programas que
proporcionan este tipo de búsqueda en bases de datos son conocidos
en la técnica e incluyen Dali. Las coordenadas estructurales de una
estructura proteínica se presentan, y el programa realiza un
alineamiento estructural múltiple con proteínas en un banco de datos
proteínico. Los homólogos identificados según la presente invención
se pueden usar en los métodos de la invención descritos en la
presente memoria.
La presente invención también proporciona
cristales experimentalmente aislados para el PR-LBD
en complejo con el ligando metribolona (R1881). A partir de estos
cristales aislados experimentalmente, se ha producido una
estructura tridimensional (3-D) para el receptor de
PR de resolución media. El PR-LBD comprende un LBD
que es sustancialmente el mismo que el LBD del
AR-LBD, excepto que el LBD comprende una flexión más
pronunciada de las hélices H10 y H11, y la hélice H9 tiene una
longitud que es por lo menos una vuelta helicoidal más corta que el
AR-LBD. La secuencia para el sitio de
PR-LBD de tipo natural comprende por lo menos SEC ID
nº 3 (véase la figura 1). El complejo de cristal
PR-LBD-R1881 pertenece al mismo
grupo espacial P2_{1}, y tiene las dimensiones unitarias a =
58,40 \ring{A}, b = 65,0 \ring{A}, c = 71,18 \ring{A} y un
ángulo \beta de 95,7º, y con las dimensiones de celda unidad
según se presenta en la Tabla 1.
La presente invención también demuestra el
hallazgo sorprendente de que las dos moléculas independientes en la
estructura cristalina de hPR LBD-R1881 muestran
diferentes modos de unión de ligando. Una orientación de R1881 en
un monómero se asemeja a la de R1881 en el complejo de hAR LBD,
mientras que el segundo monómero R1881 está orientado similarmente
a la progesterona en el complejo de hPR
LBD-progesterona. De este modo, puede ser posible
diseñar ligandos que se unen selectivamente a uno o ambos de los
monómeros en el complejo de
hPR-LBD-ligando, disociando de ese
modo los efectos preventivos y/o terapéuticos deseables de los
efectos secundarios indeseables de los ligandos de PR.
Se ha creado un modelo de homología parcial del
receptor de AR basándose en el complejo cristalino de
hPR-LBD-progesterona derivado
experimentalmente. Este modelo de homología captura la diferencia
esencial en la unión entre las estructuras de cristal
AR-LBD y del modelo de AR-LBD. Este
modelo de homología también destaca las diferencias con respecto a
la alineación de la estructura secundaria entre la estructura del
modelo de la presente invención y la de otros modelos
publicados.
A título de ejemplo, la estructura del modelo de
la presente invención difiere de otros modelos publicados [Yong,
1998] con respecto a la alineación de la estructura secundaria. Yong
[1998] basó su modelo en la estructura cristalina del RAR\alpha
LBD [Bourguet, 1995]. La alineación de la estructura secundaria
mediante Yong et al, según se compara con la estructura
cristalina de hAR LBD, es similar entre las hélices H3 y H10, pero
la alineación difiere mayoritariamente para las hélices H11, H12 y
la hélice adicional en el extremo C-terminal.
Se han determinado las interacciones del
bolsillo de unción de ligando de la presente invención usando la
estructura cristalina de hAR LBD-R1881 y el complejo
de hPR LBD-R1881.
Basándose en una comparación de las
interacciones de LBP, se pueden determinar las diferencias en las
especificidades de unión de ligando entre el AR y el PR. Usando
estas diferencias, se puede predecir la capacidad de un ligando
para unirse a uno o ambos del AR y PR. Por tanto, si se sabe que un
tejido posee únicamente una forma de un receptor de AR y/o PR,
entonces puede ser posible conferir un grado de especificidad
tisular a un ligando diseñando un ligando para que se una a la
forma predominante del AR y/o PR presente en ese tejido.
De este modo, la presente invención también
proporciona una comprensión de las diferencias entre la unión de
R1881 y de progesterona a los receptores de AR y PR, y por lo tanto
un medio para diseñar ligandos de AR y PR con el grado deseado de
eficacia.
La presente invención también proporciona un
modelo cristalino que comprende el hPR-LBD que se
forma a partir de todas o parte de los datos de coordenadas
cristalinas como se muestran en la Tabla 5 (véase la figura 7).
La presente invención también abarca estos
nuevos aspectos y sus usos. A este respecto, las enseñanzas del
AR-LBD (es decir, hAR-LBD) son
igualmente aplicables a los nuevos aspectos del
PR-LBD (es decir, hPR-LBD).
De este modo, por ejemplo, aspectos de la
presente invención que implican a PR-LBD se refieren
a;
Una estructura cristalina que comprende un
PR-LBD.
Una estructura cristalina para
PR-LBD.
Un PR-LBD cristalino que tiene
las coordenadas estructurales como se exponen en la Tabla 5.
Una estructura cristalina que comprende un
complejo de PR-LBD-ligando
complex.
Una estructura cristalina que comprende un
PR-LBP.
Un modelo de por lo menos parte de un
PR-LBD obtenido usando o que comprende o
representando una estructura cristalina según uno cualquiera de los
aspectos anteriores de la invención. La estructura cristalina y el
modelo se pueden proporcionar en forma de un medio legible por
ordenador.
Un método de cribado en busca de un ligando
capaz de unirse un dominio de unión del receptor de andrógenos, que
comprende el uso de una estructura cristalina o un modelo de
PR-LBD. Por ejemplo, el método puede comprender la
etapa de poner en contacto el PR-LBD con un
compuesto de ensayo, y determinar si dicho compuesto de ensayo se
une a dicho dominio de unión de ligando. El método puede ser un
método in vitro y/o un método in silica y/o un método
in vivo.
Un ligando identificado mediante un método de
cribado de un aspecto anterior de la invención. Preferentemente, el
ligando es capaz de modular la actividad de un
PR-LBD. Como se ha mencionado anteriormente, los
ligandos que son capaces de modular la actividad de los
PR-LBD tienen un considerable potencial terapéutico
y profiláctico.
El uso de un ligando según el aspecto anterior
de la invención, en la fabricación de un medicamento para tratar
y/o prevenir una enfermedad en un paciente mamífero. También se
proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho
ligando, y un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que
comprende administrar la etapa de administrar dicho ligando o
composición farmacéutica a un paciente mamífero.
Las estructuras cristalinas y modelos descritos
anteriormente también proporcionan información sobre la estructura
secundaria y terciaria de los PR-LBD. Esto se puede
usar para recoger información estructural sobre otros polipéptidos
previamente no caracterizados. De este modo, según un aspecto de la
invención, se proporciona un método para determinar las estructuras
secundarias y/o terciarias de polipéptidos con estructura
desconocida (o sólo parcialmente conocida), que comprende la etapa
de usar dicho cristal o modelo. El polipéptido bajo investigación
está preferentemente relacionado estructural o funcionalmente con el
dominio de unión de ligando del receptor de progesterona. Por
ejemplo, el polipéptido puede mostrar un grado de homología a lo
largo de alguna o toda la secuencia de aminoácidos primaria. Como
alternativa, el polipéptido puede realizar una función análoga, o
es posible que muestre un mecanismo de unión similar al
PR-LBD.
La invención se describirá ahora adicionalmente
sólo a título de ejemplo, en el que se hace referencia a las
siguientes figuras:
La figura 1, que muestra un listado de
secuencias para las secuencias de aminoácidos de
hAR-LBD (SEC ID nº 1) y hPR LBD (SEC ID nº 3) y una
estructura secundaria para hAR-LBD (SEC ID nº 2). La
SEC ID nº 1 se presenta en la segunda línea de la figura 1. La SEC
ID nº 3 se presenta como la primera línea en la figura 1. La SEC ID
nº 2 se presenta como la tercera línea en la figura 1.
La figura 2 que muestra fórmulas químicas;
La figura 3 que muestra estructuras
tridimensionales de hAR LBD y hPR LBD complejados con metribolona
(R1881);
La figura 4, que muestra estereodiagramas que
muestran interacciones entre un ligando unido y una cadena
proteínica en complejos de hAR-LBD y
hPR-LBD con el ligando;
La figura 5, que muestra un estereodiagrama que
muestra la localización de mutaciones patógenas del
hAR-LBP;
La figura 6, que presenta la Tabla 4, que tiene
las coordenadas estructurales para el hAR-LBD; y
La figura 7 que presenta la Tabla 5, que tiene
las coordenadas estructurales para el hPR-LBD.
Con mayor detalle:
La figura 1 muestra una comparación entre las
secuencias de aminoácidos de hAR LBD y hPR LBD. El esquema de
numeración de AR es según [Lubahn, 1988]. El alineamiento de
secuencias se realizó con CLUSTALW [Thompson, 1994]. El número de
restos se aplica al resto directamente por encima o por debajo del
último dígito. Los restos idénticos se destacan en recuadros
negros; el sombreado gris representa los restos no localizados en
la densidad electrónica, y de este modo no incluidos en el modelo.
Los elementos de estructura secundaria seleccionados proceden de
PROCHECK [Laskowski, 1993] según Kabsch y Sander [Kabsch, 1983]: E,
hebra en la lámina \beta; H, hélice \alpha; los aminoácidos que
interactúan con los ligandos unidos (R1881 o progesterona) tienen
un color rojo (distancia de corte de van der Waals 4,0 \ring{A}).
Las mutaciones actualmente conocidas para AIS en el hAR LBD están
marcadas por debajo de la posición apropiada del aminoácido
respectivo en el hAR LBD. Abreviaturas: x = cáncer de próstata, p =
PAIS/MAIS, c = CAIS, a = PAIS/MAIS y CAIS, b = PAIS/MAIS y cáncer
de próstata, v = CAIS y cáncer de próstata, w = PAIS/MAIS y CAIS y
cáncer de próstata.
La figura 2 muestra el esquema de numeración de
R1881 (izquierda) y progesterona (derecha).
La figura 3 muestra los diagramas de las
estructuras tridimensionales de hAR-LBD y
hPR-LBD complejados con R1881. (A)
MOLSCRIPT/Raster3D [Kraulis, 1991; Merritt, 1994] diagrama de bandas
de hAR LBD. (B) MOLSCRIPT estereovisión de la traza de C^{\alpha}
de las estructuras superpuestas de hAR LBD R1881 (negro) y hPR LBD
R1881 (rojo), que muestra la numeración de los restos de
hAR-LBD. La vista (B) está relacionada con (A)
mediante una rotación de 90º en sentido horario alrededor del eje
vertical.
La figura 4 muestra los estereodiagramas que
muestran las interacciones entre el ligando unido y la cadena
proteínica en hAR LBD-R1881 (A), hPR
LBD-R1881 (molécula B) (B) y hPR
LBD-progesterona (C). Los restos incluidos están
enlazados mediante hidrógeno o tienen contactos de Van der Waals
(distancia de corte 4,0 \ring{A}) con cualquiera de los ligandos.
Los restos V685, Y763 en hAR LBD, y los restos correspondientes
I699, Y777 en hPR LBD, están enlazados mediante hidrógeno a otros
restos o moléculas de agua próximos al sitio de unión de ligando, y
también se incluyen. El ligando unido tiene color negro, los restos
conservados tienen color gris, los diferentes restos en hAR LBD y
hPR LBD tienen color rojo. Las etiquetas de los restos con un
asterisco (*) representan restos que no tienen contactos de Van der
Waals dentro de la distancia de corte especificada con el ligando.
Las distancias de enlace de hidrógeno para el complejo hPR
LBD-progesterona se calcularon a partir de las
coordenadas depositadas de PDB de la molécula A. las figuras se
produjeron con MOLSCRIPT [Kraulis, 1991].
La figura 5 muestra el estereodiagrama que
muestra la localización de las mutaciones patógenas de hAR LBP: las
esferas coloreadas están representadas en la posición C^{\alpha}
de los restos: las mutaciones observadas en el cáncer de próstata
(PC) están representadas en rojo, las observadas para CAIS se
muestran en amarillo, y las observadas para PAIS/MAIS están
coloreadas en ciano. La mutación de un resto (Met 749) está
implicada tanto en cáncer de próstata como en CAIS, y se representa
en naranja. La figura se produjo con MOLSCRIPT [Kraulis, 1991] y
Raster3D [Merritt, 1994]. La vista está girada aproximadamente 80º
en sentido horario alrededor de un eje vertical con respecto a la
orientación mostrada en la 3A.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Los ADNc que codifican los receptores de
andrógenos y de progesterona humanos se obtuvieron de los grupos A.
Cato (Forschungszentrum Karlsruhe, Alemania) y P. Chambon (IGBMC,
Estrasburgo, Francia) respectivamente. Los dominios de unión de
ligando (LBD) del receptor de andrógenos (restos de aminoácidos (aa)
663-919) y el receptor de progesterona (aa
678-933) se amplificaron mediante la tecnología de
PCR usando cebadores apropiados y se clonaron en un vector
pGEX-KG [Hakes, 1991]. Las proteínas de fusión
resultantes consistieron en una
glutationa-S-transferasa, que
contiene un sitio de escisión de trombina
C-terminal, optimizada mediante una región
"ligadora" rica en glicina, seguido del correspondiente LBD.
Los constructos se transformaron entonces en la cepa BL21 (DE3) de
E. coli.
La fermentación usando las cepas de E.
Coli recombinantes correspondientes que expresan hAR LBD se
llevó a cabo en medio 2XYT en presencia de ampicilina (200 ug/ml)
suplementado con 10 uM R1881. La expresión se indujo con 30 \muM
de IPTG
(isopropil-\beta-D-tiogalactósido)
y la fermentación (10 l) se continuó a 15ºC durante
14-16 horas. Las células se cosecharon mediante
centrifugación y se destruyeron dos veces en un homogeneizador a
alta presión continuo (9000PSI) en un tampón que contiene 50 mM de
Tris/HCl, pH 8, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 10% de glicerol, 100
uM de R1881, 100 uM de PMSF y 10 mM de DTT. Todos los tampones se
purgaron con nitrógeno antes de añadir DTT. Los sobrenadantes
procedentes de la ultracentrifugación se cargaron en una columna de
glutationa sefarosa, se lavaron con 50 mM de Tris_HCl, pH 8, 150 mM
de NaCl, 5 mM de EDTA, 10% de glicerol, 10 uM de R1881, 0,1%
n-octil-\beta-glucósido
y 1 mM de DTT, y la proteína de fusión se eluyó usando el mismo
tampón suplementado con 15 mM de glutationa reducida. El eluato se
diluyó con 100 mM de HEPES pH 7,2, 150 mM de NaCl, 0,5 mM EDTA, 10%
de glicerol, 10 uM de R1881, 1 mM de DTT y 0,1%
n-octil-\beta-glucósido,
hasta una concentración de proteína fusionada de 1 mg/ml. Se llevó
a cabo una escisión de trombina (2 unidades N.I.H./mg de proteína
de fusión) toda la noche a 4ºC. La mezcla proteínica se diluyó
adicionalmente tres veces con 10 mM de HEPES pH 7,2, 10% de
glicerol, 10 nM de R1881, 10 mM de DTT y 0,1%
n-octil-\beta-glucósido,
y se cargó en una columna Fractogel SO_{3}^{-}, y se eluyó con
un gradiente de 50-500 mM de NaCl en un tampón de
10 mM de HEPES pH 7,2, 10% de glicerol suplementado con 10 nM de
R1881, 10 mM de DTT y 0,1%
n-octil-\beta-glucósido.
Se pueden recuperar de los cultivos celulares de E. coli de
un l aproximadamente 2,4 mg de hAR LBD purificado. La concentración
proteínica se determinó con un ensayo de proteínas de
Bio-rad. La fermentación y purificación del hPR LBD
se llevaron a cabo de forma idéntica, pero se usó desde el principio
un tampón de HEPES de pH 7,3.
Las proteínas de fusión con
glutationa-S-transferasa se pueden
expresar en niveles muy elevados en la cepa BL 21 (DE3) de E.
coli [Hakes, 1991]. Se ha usado este sistema con éxito para la
producción de los dominios de unión de ligando de los receptores de
progesterona [Williams, 1998] y de andrógeno humanos. La expresión
óptima y estable de proteínas de fusión solubles depende enormemente
de la presencia del ligando en las células durante la fermentación
(dato no mostrado). Durante la destrucción celular, se evitó la
purificación y concentración y cualquier oxidación de la proteína.
Por lo tanto, todos los tampones se purgaron con cuidado con
nitrógeno, y se usó DTT como antioxidante. Las proteínas de fusión
se purificaron mediante el uso de
glutationa-sefarosa, y se escindieron
subsiguientemente con trombina. Los dominios de unión de ligando se
separaron de los productos de escisión y de la trombina mediante
cromatografía de intercambio catiónico. La concentración se llevó a
cabo con la ayuda de un sistema de diafiltración con presión de
nitrógeno, y el concentrado se usó inmediatamente para experimentos
de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Ambas proteínas se dializaron tras la
purificación con tampón que contiene 50 mM de HEPES pH 7,2 para hAR
LBD, o 10 mM de HEPES pH 7,2 para hPR LBD, respectivamente, 10% de
glicerol, 10 mM de DTT, 0,1%
n-octil-\beta-glucósido,
10 mM de R1881 y 150 mM de Li_{2}SO_{4}, y se concentraron
hasta 3 mg/ml para el hPR LBD-R1881 y hasta 4,4
mg/ml para el hAR LBD-R1881, respectivamente. Ambas
proteínas se cristalizaron usando el método de difusión de vapor a
20ºC para el complejo de hAR LBD, y a 4ºC para el complejo de hPR
LBD, respectivamente. Debido a la inestabilidad y precipitación
continua de ambas proteínas, los experimentos de cristalización se
tuvieron que realizar inmediatamente después de la concentración.
Para el complejo de hAR LBD-R1881, la disolución
del depósito contenía 0,4M de Na_{2}HPO_{4}.2(H_{2}O),
0,4 M de K_{2}HPO_{4}, 0,1 M de TRIS-HCl pH
8,5, 0,1 M de (NH_{4})_{2}HPO_{4} y 5% PEG200. Las
gotas estaban compuestas de volúmenes iguales de proteína y de
disolución de depósito, y se montaron usando el método de gota
sedente. En dos días, aparecieron cristales y crecieron hasta
dimensiones típicas de 50x50x80 \mum^{3} rodeados de
precipitado. Los cristales se congelaron instantáneamente usando
una disolución crioprotectora de 60% de PEG 400 en 0,1 M de
TRIS-HCl pH 8,5. Los datos se recogieron de un
cristal en el ESRF (Grenoble, Francia) en la línea de haz de
ID14-EH4 a una resolución de 2,4 \ring{A}. Para
el complejo de hPR LBD-R1881, la disolución de
depósito contenía 10% de isopropanol y 100 mM de citrato de sodio
en 50 mM de HEPES pH 7,5. Las gotas se montaron usando el método de
gota colgante, y estaban compuestas de una relación 2:1 de proteína
y disolución de depósito. Primero, los cristales aparecieron
después de cinco semanas y crecieron hasta un tamaño de
aproximadamente 160x120x40 \mum^{3}. Un cristal se congeló
instantáneamente usando una disolución crioprotectora que contiene
30% de glicerol. Los datos se recogieron en la línea de haz BM14 en
el ESRF (Grenoble, Francia) a una resolución de 2,8 \ring{A}.
Antes de que la recogida de datos estuviese terminada, el cristal se
descompuso en el haz de rayos X.
Ambos conjuntos de datos se integraron y
redujeron usando DENZO y SCALEPACK [Otwinowski, 1997]. En la Tabla
1 se resumen las estadísticas de la recogida y procesamiento de
datos de rayos X.
Contrariamente al complejo de hPR
LBD-progesterona, que cristaliza con un homodímero
en el grupo espacial monoclínico P2_{1}, el hAR LBD cristaliza
con un monómero en el grupo espacial ortorómbico
P2_{1}2_{1}2_{1}. Por lo tanto, la determinación de la
estructura para el complejo de hAR LBD-R1881 se
llevó a cabo usando el método de sustitución molecular en AMoRe
[Navaza, 1994] con las coordenadas de sólo el monómero A del dímero
hPR LBD (entrada de PDB: 1A28, [Williams, 1998]) sin el ligando de
progesterona. El complejo de hPR LBD-R1881
cristaliza en el mismo grupo espacial monoclínico P2_{1} y con
constantes de celdas similares que el complejo hPR
LBD-progesterona, y de este modo todo el dímero sin
el ligando se usó como un modelo de búsqueda en AMoRe. Se
obtuvieron disoluciones transparentes para ambas estructuras usando
datos entre 15,0 y 3.5 \ring{A} para el hAR LBD y 12,0 y 3,5
\ring{A} para el hPR LBD, respectivamente.
La disolución de sustitución molecular obtenida
se refinó usando X-PLOR [Brünger, 1992]. En todos
los refinamientos y cálculos de mapa con X-PLOR, se
usó una corrección de disolvente en bruto, y se incluyeron todos los
datos de baja resolución. Antes de los cálculos del refinamiento,
se marcó una muestra de 5% al azar de los datos de reflexión para
los cálculos libres de R [Brünger, 1992]. Toda visualización y
edición interactiva del modelo se llevó a cabo usando TURBO
[Roussel, 1990]. El refinamiento comenzó usando datos de hasta 3,5
\ring{A}, y la resolución se extendió gradualmente hasta 2,4
\ring{A}. El modelo se editó según la secuencia conocida de hAR
LBD [Lubahn, 1988] usando mapas de
2|F_{0}|-|F_{c}| y
|F_{0}|-|F_{c}| calculados a una
resolución de 3,2 \ring{A} y simuló mapas de omisión hibridados.
También se aplicó el protocolo de sustitución molecular rápido wARP
[Lamzin, 1997; Perrakis, 1997] después de cada refinamiento con
XPLOR, para mejorar adicionalmente el mapa de densidad electrónica
2|F_{0}|-|F_{c}|. Antes de su inclusión
en el modelo, la densidad electrónica para el ligando R1881 fue
claramente visible en todos los mapas. Se obtuvo un modelo para el
ligando a partir de la entrada HMESTR de la base de datos
estructural de Cambridge [Precigoux, 1981; Allen, 1979]. La
topología de XPLOR y los diccionarios de parámetros se construyeron
usando el programa XPLO2D [Kleywegt, 1995]. En el refinamiento
final a 2,4 \ring{A}, se incluyeron 26 moléculas de agua en el
modelo, y los factores B restringidos individuales se refinaron
para todos los átomos que no eran hidrógeno. Los valores finales de
R y libres de R fueron 21,0% y 29,7%, respectivamente. La relación
libre de R/R es sólo ligeramente más pequeña que la esperada
[Tickle, 1998] para el número de átomos y reflexiones usados en el
refinamiento. Los resultados del refinamiento y la estadística se
muestran en la Tabla 2.
La disolución de sustitución molecular obtenida
se refinó usando REFMAC [Murshudov, 1997] usando el enfoque de
máxima probabilidad. El aumento de Fo y Fc mediante el disolvente en
bruto se aplicó basándose en la corrección del disolvente de
Tronrud y se usaron todos los datos disponibles sin cortes de sigma.
Todos los cálculos de mapas se realizaron valores F calculados para
reflexiones perdidas. Para evitar tendencias del modelo, se
comprobaron los mapas calculados usando sólo Fo. Después de la
primera etapa de refinamiento, los mapas
2|F_{0}|-|F_{c}| y
|F_{0}|-|F_{c}| calculados ponderados
con sigma A se inspeccionaron usando el programa O [Jones, 1991] y
se observó claramente una densidad electrónica del ligando. El
ligando se construyó en SYBYL6.5 (Tripos Inc., 1998), y se incluyó
en etapas de refinamiento posteriores. Se preparó un archivo de
diccionario para restricciones de distancia para la molécula de
R1881 usando MAKEDICT [Collaborative Computational Project Number
4, 1994]. El modelo se refinó adicionalmente con ciclos alternantes
de construcción de modelo interactivo y etapas de refinamiento
iterativas. Hacia el final del refinamiento, sólo se añadió una
molécula de agua en el LBP. Aunque se localizaron algunos sitios de
agua posibles adicionales en la densidad electrónica, se decidió no
incluirlos en el modelo debido a la baja resolución y pérdida de
datos. El modelo final comprendió 4.027 átomos de proteína, 42
átomos de ligando y una molécula de agua, con valores R finales de R
= 21,7% y libres de R = 34,3%, respectivamente. En la Tabla 2 se
incluye un sumario del refinamiento y de la estadística del
modelo.
Ambas estructuras cristalinas se analizaron con
PROCHECK [Laskowski, 1993] y sus parámetros de calidad
estereoquímica estaban dentro de sus intervalos de confianza
respectivo. En la gráfica de Ramachandran \varphi \psi para los
restos que no son prolina ni glicina (no mostrados), el 87,7% para
la estructura de hAR LBD-R1881 y 85% para la
estructura de hPR LBD-R1881, respectivamente, están
dentro de las regiones más favorecidas. Para el complejo de hAR
LBD-R1881 ningún resto está fuera de las regiones
normalmente permitidas, mientras que en el complejo de hPR
LBD-R1881 se localizan dos restos en regiones no
permitidas (Asn 705 y Ser 793 en la molécula A) y tres restos (Thr
796 en la molécula A, Asn 705 y Ser 793 en la molécula B) están
localizados en regiones generosamente permitidas. Estos restos no
están implicados en la unión del ligando y están localizados en
regiones de bucle que muy probablemente no están implicadas en el
reconocimiento del ligando. En la estructura de hAR
LBD-R1881 sólo hay un contacto próximo (2,6
\ring{A}) entre los oxígenos carbonílicos de Met895 y Ala896. en
la estructura de hPR LBD-R1881, se observaron
algunos contactos próximos, pero debido a la resolución y
terminación de los datos esto no es sorprendente. El plegamiento
global de las estructuras de hAR y hPR LBD-R1881 es
muy similar, y también con el de hPR LBD complejado con progesterona
[Williams, 1998]. En base a la estructura secundaria calculada con
PROCHECK [Laskowski, 1993] según Kabsch y Sander [Kabsch, 1983], la
estructura de hAR LBD-R1881 contiene 9 hélices
\alpha, dos hélices 3_{10} y cuatro hebras \beta cortas
asociadas en dos láminas \beta antiparalelas. Las hélices están
dispuestas en el patrón típico de "sándwich helicoidal" como
en el complejo de hPR LBD-progesterona [Williams,
1998], y las hélices H4, H5 y H10, H11 son contiguas. Hay unas
pocas variaciones menores en la estructura secundaria entre hAR
LBD-R1881 y hPR LBD-progesterona,
pero probablemente lo más interesante es que en hAR
LBD-R1881 la hélice H12 parece dividirse en dos
segmentos helicoidales más cortos con nueve y cinco restos cada uno
respectivamente. Esta observación no se vio en la estructura de hPR
LBD-R1881, aunque también se observa en este caso
una flexión de la hélice H12. La figura 1 muestra una comparación
entre las secuencias de aminoácidos de hAR LBD y hPR LBD. En la
figura 3 se muestra un diagrama de bandas de la estructura de hAR
LBD-R1881 junto con una traza C^{\alpha}
sobreimpuesta de las moléculas de hAR LBD-R1881 y
hPR LBD-R1881. Las coordenadas estructurales del
cristal de hAR LBD-R1881 se superpusieron con las
de hPR LBD-R1 881 (molécula B) y hPR
LBD-progesterona (molécula A) usando LSQKAB
[Kabsch, 1976]. Para la superposición, se usaron los átomos de la
cadena principal, excepto tres restos N-terminales
(Cys 669-Pro 671) y uno C-terminal
(Thr 918). Las desviaciones de coordenadas r.m.s. fueron 1,16 y 1,22
\ring{A} respectivamente, nuevamente una indicación de la
similitud del plegamiento global de estas tres moléculas. En hAR
LBD-R1 881, Cys 669 y Cys 844 están muy próximos, y
se formó un modelo de un puente de disulfuro entre ellos, basándose
en la densidad electrónica. Sin embargo, no hay ningún signo
bioquímico que lo apoye hasta ahora, y se debería observar que los
factores de temperatura de ambos restos de cisteína y los restos
adyacentes son muy elevado. En la posición Pro 849 en hAR
LBD-R1881 se encuentra un enlace peptídico
cis.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se construyó un modelo del hAR LBD basándose en
las coordenadas del complejo de hPR LBD-progesterona
(molécula A) [Williams, 1998]. Se realizaron sustituciones de
aminoácidos basándose en el alineamiento de secuencias en la figura
1 usando el programa de software Insight 98.0 (MSI Inc., San Diego,
CA USA 1998). Las moléculas de agua, según se observan en la
estructura cristalina de hPR LBD (molécula A) se incluyeron en los
cálculos.
El empapamiento del modelo inicial y protocolos
de minimización de energía aplicados se describe con más detalle en
otra parte [Letz, 1999].
El modelo y la estructura cristalina del hAR LBD
son muy similares con respecto a la estructura global, el bolsillo
de unión de ligando (LBP) y la orientación del ligando. La
desviación de la raíz cuadrática media (r.m.s.) entre 149 átomos
C^{\alpha} equivalentes en hélices entre la estructura del modelo
y la estructura cristalina del hAR LBD es 1,09 \ring{A}. Es
comparable a la desviación r.m.s. de 0,84 \ring{A} y 0,85
\ring{A} entre las estructuras cristalinas del hAR LBD y el
complejo de hPR LBD-progesterona, en las cuales se
basó el modelo del hAR LBD, y el modelo de hAR LBD y la estructura
cristalina hPR LBD-progesterona, respectivamente.
La diferencia más llamativa entre el modelo y la estructura
cristalina se encontró en la región de la hélice H6. En la
estructura cristalina de hAR LBD, esta región se identificó como una
hélice \alpha (calculada con el algoritmo de Kabsch y Sander
[Kabsch, 1983] según se implementó en Insight98.0 (MSI Inc., San
Diego USA, 1998), mientras que en el complejo de hPR
LBD-progesterona (molécula A) no se observó la
hélice \alpha. Tampoco hubo ninguna hélice \alpha en el modelo
de hAR LBD en esta área. La orientación del ligando tanto en la
estructura cristalina como en el modelo hAR
LBD-R1881 es muy similar. Se encuentran los mismos
enlaces de hidrógeno entre el O3 de R1881 y Arg 752, con una
distancia de 3,0 \ring{A} en el cristal y 3,4 \ring{A} en la
estructura del modelo, respectivamente. En el anillo D del ligando
O17 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno a Asn 705 y
Thr 877, 3,1 y 3,0 \ring{A} en la estructura cristalina, 2,6 y 3,3
\ring{A} en la estructura del modelo, respectivamente.
El modelo del hAR LBD en el que se basa el
complejo de hPR LBD-progesterona es muy similar a la
estructura cristalina de hAR LBD con respecto al plegamiento global
y a la orientación de los ligandos. Las diferencias más llamativas
fueron una flexión más pronunciadas de las hélices H10 y H11 en el
modelo en comparación con la estructura cristalina del hAR LBD. Se
realizó un modelo de la hélice H9 con la misma longitud que en la
estructura cristalina del complejo hPR
LBD-progesterona. En la estructura cristalina de hAR
LBD, es una vuelta de hélice más corta. Esta región está lejos del
LBP y por lo tanto no tiene influencia en el tamaño del LBP. Esta
estructura modelo difiere de otros modelos publicados [Yong, 1998]
con respecto al alineamiento de la estructura secundaria, puesto
que los autores basan su modelo en la estructura cristalina del
RAR\alpha LBD [Bourguet, 1995]. El alineamiento de la estructura
secundaria por Yong et al., según se compara con la
estructura cristalina de hAR LBD, es similar entre las hélices H3 y
H10, el alineamiento difiere principalmente para las hélices H11,
H12 y la hélice adicional en el extremo C terminal.
Hay un total de 18 restos de aminoácidos en hAR
LBD y hPR LBD que interactúan con el ligando unido (ya sea R1881 o
progesterona). Estos restos se destacan en la figura 1, y se
incluyen en la figura 4. La mayoría de estos restos son hidrófobos
e interactúan principalmente con el armazón esteroideo, mientras que
unos pocos son polares y pueden formar enlaces de hidrógeno con los
átomos polares en el ligando. El esquema de enlazamiento de
hidrógeno a O3 de R1881 y progesterona es similar pero no idéntico,
como se muestra en la figura 4. En la estructura cristalina de hAR
LBD-R1881, este átomo de oxígeno forma un enlace de
hidrógeno con Arg 752 (Arg 766 en hPR LBD), pero en contraste con
el complejo de hPR LBD-progesterona la distancia de
3,9 \ring{A} a Gln 711 (Gln 725 en hPR LBD) no permite un enlace
de hidrógeno. Hay una molécula de agua cerca de O3 que está
enlazada mediante hidrógeno a otros tres restos con una geometría
casi triangular (R752 N^{\eta 1}, M745 O y Q711 O^{\varepsilon
1} en hAR LBD; R766 N^{\eta 1}, M759 O y Q725 O^{\varepsilon 1}
en el hPR LBD-progesterona). Dos de estos restos
son aceptores; por lo tanto, es improbable un tercer átomo aceptor
(O3 en progesterona o R1881) en una dirección perpendicular al plano
del triángulo, también debido a geometría desfavorable. La molécula
de agua enlazada mediante hidrógeno a Q711 N^{\varepsilon 2} en
hAR LBD (Q725 en hPR LBD) tiene enlaces de hidrógeno a otros dos
restos (V685 O y F764 O en hAR LBD, I699 O y F777 O en hPR LBD) y
en hAR LBD está enlazado mediante hidrógeno a otra molécula de agua,
siendo la geometría del enlace de hidrógeno global casi
tetraédrica. En la estructura de hPR LBD-R1881, los
ligandos en las moléculas A y B poseen patrones de enlace de
hidrógeno ligeramente diferentes. En la molécula A, O3 de R1881
forma dos enlaces de hidrógeno (3,2 \ring{A} a Gln 725
N^{\varepsilon 2} y 2,9 \ring{A} a Arg 766 N^{\eta 2}). Una
molécula de agua se localizó en la densidad electrónica
F_{o}-F_{c} con la misma geometría tetraédrica
que la observada en la estructura de hAR LBD-R1881.
En la molécula B, el ligando está en una posición ligeramente
diferente, y el patrón de enlace de hidrógeno difiere del observado
en la molécula A. El O3 de R1881 forma nuevamente un enlace de
hidrógeno con Arg 766 N^{\eta 2} con una distancia de 2,9
\ring{A} mientras que la distancia a Gln725 N^{\varepsilon 2}
es ahora 3,7 \ring{A}, fuera del intervalo aceptable para un
enlace de
hidrógeno.
hidrógeno.
El grupo 17\beta hidroxilo de R1881 forma
diferentes enlaces de hidrógeno cuando se une a hAR LBD o hPR LBD
(figura 4). En hAR LBD, el grupo 17\beta hidroxilo está enlazado
mediante hidrógeno a Asn 705 (2,8 \ring{A}) y Thr 877 (2,9
\ring{A}). Se observa el mismo patrón en la molécula B del
complejo de hPR LBD-R1881 en el que el grupo
17\beta hidroxilo de R1881 también forma una interacción fuerte
con Asn 719 (2,8 \ring{A}), mientras que en la molécula A la
distancia correspondiente de 3,5 \ring{A} está sólo en el
intervalo de una interacción débil. Contrariamente al hAR LBD, en
ambos monómeros de hPR LBD el Cys 891 (Thr877 en hAR LBD) muestra
solo una interacción débil con el grupo 17\beta hidroxilo de R1881
(3,7 \ring{A} en la molécula A, y de 4,0 \ring{A} en la
molécula B, respectivamente). Sin embargo, la orientación relativa
de la cadena lateral de Cys 891 con relación al grupo hidroxilo no
sugiere que esta interacción es relevante para la unión del
ligando.
El ligando R1881 se une con una afinidad de
unión relativa (RBA) de 290 al hAR de tipo natural, en comparación
con un valor de 180 para DHT y de 100 para testosterona,
respectivamente [Teutsch, 1994]. En cuánto a hPR de tipo natural,
la afinidad de unión relativa de R1881 es 190 con respecto a la
progesterona (RBA = 100). Globalmente, R1881 muestra afinidades de
unión comparablemente buenas con ambos receptores, lo que también
se refleja en la orientación del ligando en los LBP del hAR LBD y el
hPR LBD (figura 4). Thr 894 en hPR LBD se sustituye por Leu 880 en
hAR LBD, y el átomo C^{\delta 2} de esta leucina forma contacto de
van der Waals (3,9 \ring{A}) con el átomo de oxígeno del grupo
17\beta hidroxi de R1881. Esta cadena lateral más voluminosa,
junto con la sustitución de Cys 891 en hPR LBD por Thr 877 en hAR
LBD es responsable muy probablemente del reconocimiento específico
del grupo 17\beta hidroxilo de R1881, contrariamente al grupo
17\beta acetilo de progesterona. No sólo hay un resto polar extra
(Thr 877 además de Asn 705 que está conservado en AR), que puede
formar un enlace de hidrógeno adicional con el oxígeno de 17\beta
hidroxilo, sino que la disminución dirigida en el volumen del
bolsillo provocado con el cambio de Thr894 a Leu880 muy
probablemente inhibirá la unión de otros ligandos más voluminosos
tales como progesterona. Como se ha señalado previamente [Williams,
1998] no hay interacciones fuertes enlazadas mediante hidrógeno
entre el átomo de oxígeno carbonílico O20 de progesterona y la
proteína en hPR LBD, indicando que el reconocimiento de este grupo
se realiza probablemente solo a través de interacciones hidrófobas
y estéricas. El hPR LBD puede unir R1881 así como la progesterona
y, como se puede observar a partir de la discusión anterior del
enlazamiento mediante hidrógenos y el patrón de interacción de van
der Waals entre la cadena proteínica y el ligando en la estructura
cristalina, la molécula de hPR LBD parece que muestra dos modos de
unión diferentes para R1 881, uno que se parece al de progesterona
(03 con dos enlaces de hidrógeno a la cadena proteínica y la función
17\beta interactuando débilmente con la cadena proteínica) y uno
similar al de hAR LBD (03 con sólo un enlace de hidrógeno a la
cadena proteínica y la función 17\beta también enlazada mediante
hidrógeno a la cadena proteínica. Sin embargo, estos modos de unión
no parecen implicar cambios significativos en la posición y
orientación del ligando en el LBP.
Se analizó si los restos de aminoácidos mutados
se encuentran predominantemente en el interior de la proteína o en
la superficie. La comparación de la accesibilidad del disolvente de
estos restos reveló que se encontró una distribución casi uniforme
entre restos enterrados, medio o completamente accesibles. La Tabla
3 enumera todas las mutaciones en o próximas al bolsillo de unión
de ligando de AR (LBP) que se sabe que están implicadas en AIS y
cáncer de próstata (PC), su localización con respecto a elementos
estructurales secundarios así como el efecto potencial de las
mutaciones.
Las mutaciones se dan para 12 de los 18 restos
que se considera que interactúan con el ligando R1881 con 4,0
\ring{A} como se explica anteriormente, así como dos restos
adicionales en 5,0 \ring{A} del ligando (G708 y V746 en hAR LBD,
G722 y Val760 en hPR LBD). En algunos casos, el mismo aminoácido
puede estar mutado en dos restos diferentes, por ejemplo T877A y
T877S. Para la mayoría de estas mutaciones, se puede asociar con la
sustitución un efecto estructura. Por ejemplo, cuando se sustituye
Met 749 en hAR LBD por el aminoácido ramificado valina, los átomos
de la cadena lateral C^{\gamma} se aproximarían demasiado al
ligando. La localización de estas mutaciones en la estructura
tridimensional de hAR LBD-R1881 se muestra en la
figura 5, y se puede observar que las mutaciones implicadas en el
cáncer de próstata (PC) agrupan principalmente casi el grupo
17\beta hidroxilo de R1881, mientras que las implicadas en AIS
están dispuestas principalmente alrededor de las otras partes del
ligando. Una excepción notable es Met 749, que tiene mutaciones
implicadas tanto en PC como en CAIS, y está localizado en la
vecindad de R1881 03, opuesto a las otras mutaciones implicadas en
el PC.
La extirpe celular de tumor de próstata LNCaP
contiene un receptor de AR que muestra una afinidad de unión
significativa incrementada para esteroides gestágenos y estrógenos,
pero muestra idéntica unión a R1881 (Veldscholte et al.
1990). Una mutación de un solo punto (T877A) está asociada con este
comportamiento anormal. Con una alanina en esta posición faltaría
una pareja de enlace de hidrógeno importante para el grupo 17\beta
hidroxilo en R1881, testosterona o dihidrotestosterona (DHT), pero
la otra pareja de enlace de hidrógeno, Asn 705, implicada en la
unión del ligando, todavía podría orientar el ligando en el LBP.
Experimentos de mutagénesis de hPR enfatizan el papel crítico de
este resto de asparagina en la interacción del ligando (Letz et
al. 1999). En la estructura cristalina del complejo de hPR
LBD-progesterona, se encuentra Cys 891 en la
posición de Thr 877, pero no se observó ningún enlace de hidrógeno
del grupo 17\beta acetilo de progesterona aunque Cys 891 está
relativamente próximo (4,3 \ring{A} en la molécula A, 4,4
\ring{A} en la molécula B) a 020 de progesterona. Sin embargo,
extractos bacterianos de un hPR LBD mutado (C891S o C891V) mostraron
una gran disminución en la afinidad de unión relativa para
progesterona, y el hPR LBD mutado purificado fue completamente
inactivo en los ensayos de unión [Letz, 1999].
Las tres mutaciones en el hAR LBP descritas para
CAIS son sustituciones que cambian considerablemente el tamaño de
las cadenas laterales de aminoácidos respectivas, N705S [Bellis,
1992; Pinsky, 1992], L707R [Lumbroso, 1996] y M749V [Bellis, 1992;
Jakubicza, 1992]. Este cambio de tamaño altera el LBP, de forma que
se perturba la estructura local y las interacciones con el
ligando.
En las estructuras cristalinas de AR LBD y PR
LB, Asn 705 o Asn 719, respectivamente, es uno de las parejas de
enlace de hidrógeno del ligando R1881, pero no de la progesterona.
Si este resto se sustituye por Val en hPR LBD, sólo se observó un
efecto moderado en la actividad de unión de progesterona,
considerando los valores de semivida y K_{D} [Letz, 1999]. En la
estructura cristalina del complejo hPR
LBD-progesterona, Asn 719 está implicado en la
estabilización del bucle entre H11 y H12, vía un enlace de hidrógeno
entre Asn 719 N^{\delta 2} y Glu 904 O. En el hAR LBD, se
encuentra una estabilización idéntica por medio de un enlace de
hidrógeno entre Asn 705 N^{\delta 2} y Asp 890 O. Una mutación
N705S, observada en un paciente que sufre CAIS, tendría un efecto
de dos veces de desestabilización de la estructura y pérdida de una
pareja de enlace de hidrógeno para el ligando.
En el mutante de hAR descrito L707R, la
perturbación de la integridad de la estructura también se refleja
en las constantes de unión. Considerando una distancia de corte de
van der Waals de 4,0 \ring{A}, la cadena lateral de Leu 707 haría
contactos próximos con el anillo A de R1881 así como cinco restos en
la cadena proteínica: V685, A687, Q711, F764 y L768. Los primeros
dos restos están localizados en la región del bucle entre H2 y H3,
el tercero está localizado en H3 y está implicado en el patrón de
enlazamiento por hidrógeno de una molécula de agua próxima al átomo
O3 de R1881, y los dos últimos pertenecen a cada una de las dos
hebras S1 y S2 de la primera lámina \beta corta. Claramente,
dicha variación en el tamaño de la cadena lateral tendría un gran
impacto, no sólo en el LBP sino en la interrupción del propio
plegamiento global de la proteína. El receptor mutado muestra
afinidad de unión indetectable por el ligando R1881 según se obtiene
mediante análisis de gráfica Scatchard, y no se encuentra actividad
transcripcional [Lumbroso, 1996].
Siete mutaciones descritas en el hAR LBP están
asociadas con PAIS/MAIS, y se observaron múltiples sustituciones
para aminoácidos en la posición 708 [Albers, 1997] y 742 [Bevan,
1996]. En la estructura cristalina de hAR LBD se debería de tolerar
una sustitución de Gly 708, mientras que una valina en esta posición
interferiría con la unión del ligando. La distancia más próxima del
átomo C de un resto de alanina al ligando sería 3,0 \ring{A}; sin
embargo, los átomos CG de una valina estarían demasiado próximos a
los átomos del ligando (1,5 \ring{A}). La sustitución de la Gly
722 equivalente en el receptor de hPR por serina no influye la
unión de agonistas, sino la del antagonista RU486 [Benhamou,
1992].
En todos los receptores de esteroides, el
esteroide se estabiliza mediante un enlace de hidrógeno entre el
anillo A del ligando y una arginina (Arg 752 en hAR). Un resto de
aminoácido más pequeño en esta posición (mutación de glutamina en
hAR) debería tener un impacto drástico sobre la unión del ligando,
ya que la estabilización del anillo A estaría impedida gravemente
debido a la falta de una interacción electrostática (Cabral et
al. 1998, Komori, 1998). Se ha dado a conocer un efecto similar
para el receptor de hPR, en el que una mutación (R766H) dio como
resultado una afinidad de unión baja o incluso no detectable. La
cadena lateral de histidina es demasiado pequeña para servir como
pareja de enlace de hidrógeno al átomo O3 en progesterona [Letz,
1999].
En la mutación de hAR F764S, R1881 muestra una
afinidad de unión similar al del receptor de tipo natural, pero se
observa una disociación rápida de ligando [Marcelli, 1994]. En la
estructura cristalina, Phe 764 está implicado en la estabilización
de la posición del anillo A. Un aminoácido más pequeño, como serina,
permitiría la unión de ligando, pero muy probablemente no
contribuiría a la unión fuerte de R1881.
Las mutaciones M742V o M7421 reducen ambas
drásticamente la afinidad de unión de R1881 [Bevan, 1996]. Aunque
ILE y VAL encajan en el LBP, el entorno cambiado está menos
fuertemente empaquetado y el LBP está agrandado, afectando así a la
unión del ligando.
Sin embargo, no todas las mutaciones se pueden
relacionar con una perturbación de la estructura. En el caso de la
mutación M787V en el hAR LBD, se encontró mediante análisis de
Scatchard que la unión de R1881 y DHT fue indetectable o se redujo
fuertemente [Nakao, 1992]. La falta de unión del andrógeno se pensó
que era debida a AIS. En la estructura cristalina, se podría
tolerar una sustitución de metianina por valina. La falta de
afinidad de unión encontrada para R1881 puede dar cuenta de una
desestabilización en el LBP, puesto que la cadena lateral de Met
787 está en contacto de van der Waals con otros aminoácidos como Val
760 y Leu 887, así como átomos del ligando.
Ejemplo
4
El constructo pGEX-KG-hPR
LBD, en lugar del constructo pGEX-KG-hAR LBD,
se usó para la fermentación. Como resultado, comparada con la
purificación de hPR LBD "normal", hubo unas pocas diferencias
al comienzo del procedimiento de purificación. Estas diferencias se
relacionaron con el tamaño del constructo y con diferentes valores
de pH, concentraciones de sal y de aditivos:
- Constructo
- purificación de hPR LBD "normal": constructo pGEX-2T-hPR LBD (Gly-hPR LBD 677-933), esta vez: pGEX-KG-hPR LBD: (GSPGISGGGGGI-hPR LBD 678-933) (extremo N-terminal expandido en 10 restos).
- pH
- Reducción de pH 8,0 a pH 7,3 (en lugar de pH 7,5)
- NaCl
- aumenta desde 200 hasta 300 mM
- EDTA
- aumenta desde 0,5 a 5 mM
- DTT
- aumenta desde 5 hasta 10 mM
- R1881
- 100 \muM en la lisis y unión a columna de glutationa sefarosa
- Urea
- Reducción desde 2 M a 0 M (¡purificación sin urea!)
La purificación fue exitosa, y la proteína se
concentró hasta 3 mg/ml (proteína total 1,0 mg después de SDS
PAGE.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se llevaron a cabo cálculos de minimización de
energía con los ligandos R1881, testosterona y
19Nor-testosterona. En una primera etapa, los
protocolos usados en los cálculos se optimizaron de tal forma que el
cálculo de minimización de energía del complejo hAR
LBD-R1881 reprodujo las interacciones entre la
proteína y el ligando como se observa en la estructura cristalina
del mismo complejo, especialmente las parejas de enlaces de
hidrógeno de los átomos O3 y O17 del ligando con la proteína, es
decir, Arg752, Gln711 y Asn705. Después, se usaron los mismos
protocolos para los cálculos de los complejos de hAR
LBD-testosterona y hAR
LBD-19Nor-testosterona.
Los resultados de los cálculos de minimización
de energía confirman las interacciones de enlaces de hidrógeno en
el átomo O3 tanto de testosterona como de
19Nor-testosterona, como se observa en la estructura
cristalina entre R1881 y el hAR LBD (con Arg752 y Gln711). Sin
embargo, las parejas de interacción del átomo O17 en el anillo D
son diferentes debido al sustituyente metílico unido a la posición
10 del esqueleto del esteroide (posición 19).
En el caso del ligando
19Nor-testosterona, el átomo O17 interactúa con la
cadena lateral de Asn705. los cálculos del hAR LBD en el complejo
con el ligando testosterona mostró un desplazamiento en la
orientación del ligando en el bolsillo de unión de ligando (LBP)
muy probablemente debido a la presencia del grupo metilo unido a la
posición 10 del armazón esteroideo. En este caso, se observa en los
cálculos una interacción del átomo O17 con la cadena lateral de
Thr877. El grupo metilo en esa posición en el ligando estaría
demasiado próximo a los restos de aminoácidos Trp741 y Met745. Con
el fin de acomodar este ligando en el LBP, el ligando está
desplazado así como las cadenas laterales de los restos de
aminoácidos Trp741 y Met745.
Los restos de aminoácidos hAR LBD dentro de un
radio 4 \ring{A} alrededor de los respectivos ligandos son los
mismos para R1881 y 19Nor-testosterona. Debido al
ligero desplazamiento de testosterona de aproximadamente 1,5
\ring{A} en el área del anillo D, los restos de aminoácidos Trp741
e Ile899 ahora están más lejos de la testosterona.
Se proporciona un cristal que comprende un
dominio de unión de ligando del receptor de andrógenos
(AR-LBD). También se proporcionan las estructuras
cristalinas del receptor de andrógenos humanos (hAR) en comparación
con los dominios de unión de ligando (LBD) del receptor de
progesterona humano (hPR) en complejo con el mismo ligando
metribolona (R1881). Las estructuras tridimensionales del hAR LBD
así como del hPR LBD muestran el plegamiento típico del receptor
nuclear. El cambio de dos restos en el bolsillo de unión de ligando
(LBP) entre hPR y hAR se identificó como la fuente más probable de
la especificidad de la unión del ligando R1881 a hAR LBD. Los
restos de aminoácidos de AR-LBD son Leu 880 y Thr
877. Los restos de aminoácidos de PR correspondientes Thr894 y
Cys891. Además, hay otros tres cambios de aminoácidos que pueden
estar implicados en la unión de ligandos distintos de R1881. Los
restos de aminoácidos de AR son Gln 783, Met 749 y Phe 876. Los
restos de aminoácidos de PR son Leu 797, Leu 763 y Tyr 890. Se
analizaron las implicaciones estructurales de las 14 mutaciones
conocidas en el LBP del hAR LBD asociadas con cáncer de próstata o
el síndrome de insensibilidad parcial o completa del receptor de
andrógenos. Los efectos de la mayoría de estos mutantes se podrían
explicar basándose en la estructura del cristal.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método para identificar un compuesto que modula (es decir,
aumenta o disminuye) la actividad de AR, que comprende: formar
modelos de compuestos de ensayo que se ajustan espacialmente en el
AR LBD de interés usando un modelo de AR-LBD o una
porción del mismo, cribar los compuestos de ensayo en un ensayo,
por ejemplo un ensayo biológico, caracterizado por la unión de un
compuesto de ensayo al LBD, e identificar un compuesto de ensayo
que modula la actividad de AR, en el que el modelo estructural
comprende coordenadas estructurales de los restos de aminoácidos de
LBD: L701; L704; N705; L707; Q711; M742; L744; M745; M749; R752;
F764; Q783; M787; F876; T877; L880; F891; M895 o un homólogo de los
mismos.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un medio legible por ordenador que tiene almacenado en él
un modelo de un cristal que comprende una estructura de LBD del
AR-LBD.
En un aspecto adicional, la presente invención
se refiere a un medio legible por ordenador que tiene almacenado en
él un modelo de un cristal que comprende un AR-LBD,
en el que dicho modelo se construye a partir de todo o parte de los
datos de difracción de rayos X mostrados en la Tabla 1 y/o Tabla
2.
En un aspecto incluso adicional, se proporciona
el uso de coordenadas estructurales proporcionadas en la Tabla 4
para la identificación de un ligando o para construir una estructura
cristalina para un AR-LBD.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere a un método controlado por ordenador para diseñar un ligando
capaz de unirse al receptor de AR, que comprende:
- (i)
- proporcionar un modelo de la estructura cristalina del AR-LBD;
- (ii)
- analizar dicho modelo para diseñar un ligando que se une al LBD; y
- (iii)
- determinar el efecto de dicho ligando sobre dicho AR-LBD.
En un aspecto adicional, se proporciona un medio
de almacenamiento de datos legibles por una máquina, que comprende
un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles
por una máquina que, cuando se usa una máquina programada con
instrucciones para usar dichos datos, es capaz de presentar una
representación tridimensional gráfica de un cristal o un homólogo
de dicho cristal.
La presente invención proporciona asimismo un
ordenador que comprende dicho medio de almacenamiento.
La presente invención también proporciona el uso
de dicho ordenador en un contexto industrial, tal como la
identificación de ligandos putativos.
En otro aspecto, se proporciona un método para
la formación de modelos de homología de un cristal que comprende un
AR-LBD o un homólogo del mismo que comprende:
- (i)
- alinear la secuencia del AR-LBD (SEC ID nº 1 o SEC ID nº 2) o un homólogo de AR-LBD con la secuencia de AR-LBD, e incorporar esta secuencia en el modelo de AR-LBD;
- (ii)
- someter un modelo preliminar de AR-LBD a minimización de energía dando como resultado un modelo con energía minimizada;
- (iii)
- remodelar las regiones de dicho modelo de energía minimizado, en el que se violan las restricciones estereoquímicas; y
- (iv)
- obtener un modelo de homología final.
\vskip1.000000\baselineskip
Albers, N., Ulrichs, C.,
Glüer, S., Hiort, O., Sinnecker, G.H.G.,
Mildenberger, H. y Brodehl, J. (1997) Etiologic
classification of severe hypospadias: Implications for prognosis
and management. J. Pediatr., 131,
386-393.
Allen, F.H., Bellard, S.,
Brice, M.D., Cartwright, B., Doubleday, A.,
Higgs, H., Hummelink, T.,
Hummelink-Peters, B.G., Kennard, O.,
Motherwell, W.D.S., Rodgers, J.R. y Watson,
D.G. (1979) Cambridge Structural Database. Acta
Crystallogr., Sect. B, 35, 2331-2339.
Bellis, A.D., Quigley, C.A.,
Cariello, N.F., El-Awady, M.K., Sar, M.,
Lane, M.V., Wilson, E.M. y French, F.S.
(1992) Single base mutations in the androgen receptor gene
causing complete androgen insensitivity: rapid detection by a
modified denaturing gradient gel electrophoresis technique. Mol
Endocrinol., 6, 1909-1920.
Benhamou, B., Garcia, T.,
Lerouge, T., Vergezac, A., Gofflo, D.,
Begogne, C., Chambon, P. y Gronemeyer, H.
(1992) A single amino acid that determines the sensitivity of
progesterone receptors to RU486. Science, 255,
206-209.
Bevan, C.L., Brown, B.B.,
Davies, H.R., B. A. J. Evans, Hughes, I.A. y
Patterson, M.N. (1996) Functional analysis of six
androgen receptor mutations identified in patients with partial
androgen insensitivity syndrome. Hum. Mol. Genet., 5,
265-273.
Bourguet, W., Ruff, M.,
Chambon, P., Gronemeyer, H. y Moras, D.
(1995) Crystal structure of the
ligand-binding domain of the human nuclear receptor
RXR-alpha. Nature, 375,
377-382.
Brünger, A.T. (1992a) Free R
value: A novel statistical quantity for assessing the accuracy of
crystal structures. Nature, 355,
472-474.
Brünger, A.T. (1992b)
X-PLOR: a system for Crystallography and NMR. The
Howard Hughes Medical Institute and Department of Molecular
Biophysics and Biochemistry, Yale University, U.S.A.
Brzozowski, A.M., Pike, A.C.W.,
Dauter, Z., Hubbard, R.E., Bonn, T.,
Engström, O., Öhman, L., Greene, G.L.,
Gustafsson, J.A. y Carlquist, M. (1997)
Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.
Nature, 389, 753-758.
Cabral, D.F.,
Maciel-Guerra, A.T. y Hackel, C.
(1998) Mutations of the androgene receptor gene in Brazilian
patients with male pseudohermaphroditism. Brazilian J. Med. Biol.
Research, 31, 775-778.
Collaborative Computational Project Number 4, C.
(1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography.
Acta Crystallogr., Sect D., 50, 760-763.
Gottlieb, B., Lehvaslaiho, H.,
Beitel, L.K., Lumbroso, R., Pinsky, L. y
Trifiro, M. (1998) The androgen receptor gene
mutation database. Nucleic Acid Res., 26,
234-238.
Hakes, D.J. y Dixon, J.E.
(1991) New vectors for high level expression of recombinant
proteins in bacteria. Anal. Biochem., 202,
293-298.
Jakubicza, S., Werder, E.A. y
Weiacker, P. (1992) Point mutation in the steroid
binding domain of the androgen receptor gene in a family with
complete androgen insensitivity syndrome (CAIS). Hum. Genet.,
90, 311-312.
Jones, T.A., Zou, J.Y.,
Cowan, S.W. y Kjeldgaard, M. (1991) Improved
methods for building protein models in electron density maps and
the location of errors in these models. Acta Crystallogr. A,
47, 110-119.
Kabsch, W. (1976) A solution for
the best rotation to relate two sets of vectors. Acta.
Crystallogr. A, 32, 922-923.
Kabsch, W. y Sander, C.
(1983) Dictionary of protein secondary structure: pattern
recognition of hydrogen-bonded and geometrical
features. Biopolymers, 22, 2577-2637.
Klaholz, B.P., Renaud, J.P.,
Mitschler, A., Zusi, C., Chambon, P.,
Gronemeyer, H. y Moras, D. (1998)
Conformational adaption of agonists to the human nuclear receptor
RAR gamma. J Nature Struct. Biol., 5,
199-202.
Kleywegt, G.J. (1995) Dictionaries
for Heteros. Joint CCP4 and ESF-EACMB Newsletter on
Protein Oystallography, Vol. 31, p. 45-50.
Komori, S., Kasumi, H.,
Sakata, K., Tanaka, H., Hamada, K. y
Koyama, K. (1998) Molecular analysis of the androgen
receptor gene in four patients with complete androgen
insensitivity. Arch. Gynecol. Obstet. 95-100,
261.
Kraulis, P.J. (1991) MOLSCRIPT: A
program to produce both detailed and schematic plots of protein
structures. J. Appl. Cryst., 24,
946-950.
Lamzin, V.S. y Wilson, K.S.
(1997) Automated refinement for protein crystallography. En
Jr., C.W.C. y Sweet, R.M. (eds.), Macromolecular Crystallography
part B. Academic Press, Nueva York, U.S.A., Vol. 277, p.
269-305.
Laskowski, R.A., MacArthur, M.W.,
Moss, D.S. y Thornton, J.M. (1993) PROCHECK - a
program to check the stereochemical quality of proteins. J Appl
Crystallogr, 26, 283-291.
Letz, M., Bringmann, P.,
Mann, M., A. Mueller-Fahrnow, D, R.,
P. Scholz, P., Wurtz, J.M. y Egner, U.
(1999) Investigation of the binding interactions of
progesterone using muteins of the human progesterone receptor
ligand binding domain designed on the basis of a
three-dimensional model. Biochim. Biophys.
Acta, 1429, 391-400.
Lubahn, D.B., Joseph, D.R.,
Sar, M., Tan, J., Higgs, H.N., Larson,
R.E., French, F.S. y Wilson, E.M. (1988) The
human androgen receptor: complementary deoxyribonucleic acid
cloning, sequence analysis and gene expression in prostate. Mol.
Endocrinol., 2, 1265-1275.
Lumbroso, R., Lobaccaro, J.M.,
Georget, V., Leger, J., Poujol, N.,
Rerouanne, B., Evian-Brion, D.,
Czernichow, P. y Sultan, C. (1996) A novel
substitution Leu707Arg in exon 4 of the androgen receptor causes
complete androgen resistance. J. Clin. Endocrinol. Metab.,
81, 1984-1996.
\newpage
Marcelli, M., Zoppi, S.,
Wilson, C.M., Griffin, J.E. y McPhaul, M.J.
(1994) Amino acid substitutions of the
hormone-binding domain of the human androgen
receptor alter the stability of the hormone receptor complex. J.
Clin. Invest., 94, 1642-1650.
Merritt, E.A. y Murphy, M.E.P.
(1994) Raster3D version 2.0. A program for photorealistic
molecular graphics. Acta Crystallogr. D, 50,
869-873.
Moras, D. y Gronemeyer, H.
(1998) The nuclear receptor ligand-binding
domain: structure and function. Curr. Opinion Cell Biol.,
10, 384-391.
Murshudov, G.N., Vagin, A.A. y
Dodson, E.J. (1997) Refinement of macromolecular
structures by the maximum-likelihood method.
Acta Crystallogr., Sect. D, 53, 240-255.
Nakao, R., Haji, M.,
Yanase, T., Ogo, A., Takayanagi, R.,
Katsube, T., Fukumaki, Y. y Nawata, H.
(1992) A single amino acid substitution (Met786Val) in the
steroid binding domain of human androgen receptor leads to complete
androgen insensitivity syndrome. J. Clin. Endocrinol. Metab.,
74, 1152-1157.
Navaza, J. (1994) Acta
Crystallogr., Sect A, 50, 157-163.
Nolte, R.T., Wisely, G.B.,
Westin, S., Cobb, J.E., Lambert, M.H.,
Kurokawa, R., Rosenfeld, M.G., Willson, T.M.,
Glass, C.K. y Milburn, M.V. (1998) Ligand
binding and co-activator assembly of the peroxisome
proliferator-activated
receptor-gamma. Nature, 395,
137-143.
Otwinowski, Z. y Minor, W.
(1997) Processing of x-ray diffraction data
collected in oscillation mode. En Jr, C.W.C. y Sweet, R.M. (eds.),
Macromolecular Crystallography part A. Academic Press, Nueva
York, USA, Vol. 276, p. 307-326.
Perrakis, A., Sixma, T.K.,
Wilson, K.S. y Lamzin, V.S. (1997) wARP:
improvement and extension of crystallographic phases by weighted
averaging of multiple refined dummy atomic models. Acta
Cryst. D, 53, 448-455.
Pinsky, L., Trifiro, M.,
Kaufman, M., Beitel, L.K., Mhatre, A.,
Kazemi-Esfarjani, P., Sabbaghian, N.,
Lumbroso, R., Alvarado, C., Vasiliou, M. y B.
Gottlieb, B. (1992) Androgen resistance due to
mutation of the androgen receptor. Clin. Invest. Med., 15,
456-472.
Precigoux, G., Busetta, B. y S.
Geoffre. (1981)
17beta-Hydroxy-17alphamethyl-4,9,11-estratrien-3-one.
Acta Crys-tallogr., Sect. B, 37,
291-293.
Read, R.J. (1986) Improved Fourier
coefficients for maps using phases from partial structures with
errors. Acta Cryst A, 42, 140-149.
Renaud, J.P., Rochel, N.,
Ruff, M., Vivat, V., Chambon, P.,
Gronemeyer, H. y Moras, D. (1995) Crystal
structure of the RAR-gamma
ligand-binding domain bound to
all-trans retinoic acid. Nature, 378,
681-689.
Ribeiro, R.C.J., Apriletti, J.W.,
Wagner, R.L., Feng, W., Kushner, P.J.,
Nilsson, S., Scanlan, T.S., West, B.L.,
Fletterick, R.J. y J. D. Baxter, J.D. (1998)
X-ray crystallographic and functional studies of
thyroid hormone receptor. J. Steroid Biochem. Molec. Biol.,
65, 133-141.
Rochel, N., Wurtz, J.M.,
Mitchler, A., Klaholz, B. y Moras, D.
(2000) Crystal structure of the nuclear receptor for vitamin
D bound to its natural ligand. Molec. Cell, 5,
173-9.
Roussel, A.,
Fontecilla-Camps, J.C. y Cambillau, C.
(1990) TURBO-FRODO: a new program for protein
crystal-lography and modelling. XV IUCr Congress,
Bordeaux, Francia, p. 66-67.
Shiau, A.K., Barstad, D.,
Loria, P.M., Cheng, L., Kushner, P.J.,
Agard, D.A. y Greene, G.L. (1998) The
structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and
the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell, 95,
927-937.
Tannenbaum, D.M., Y. Wang,
Williams, S.P. y Sigler, P.B. (1998)
Crystallographic comparison of the estrogen and progesterone
receptor's ligand binding domains. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 95, 5998-6003.
Teutsch, G., Goubet, F.,
Battmann, T., Bonfils, A., Bouchoux, F.,
Cerede, E., Gofflo, D., Kelly, M.G. y
Philibert, D. (1994) Non-steroidal
antiandrogens: Synthesis and biological profile of
high-affinity ligands for the androgen receptor.
J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 48,
111-119.
Thompson, J.D., Higgins, D.G. y
Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through
sequence weighting, positions-specific gap penalties
and weight matrix choice. Nucl. Acids Res., 22,
4673-4680.
Tickle, I.J., Laskowski, R.A. y
Moss, D.S. (1998) R-free and the
R-free Ratio. I. Derivation of the expected values
of cross-validation residuals used in macromolecular
least-squares refinement. Acta Crystallogr.,
Sect. D, 54, 547-557.
Uppenberg, J., Svensson, C.,
Jaki, M., Bertilsson, G., Jendeberg, L. y
Berkenstam, A. (1998) Crystal structure of the ligand
binding domain of the human nuclear receptor PPARgamma. J. Biol.
Chem., 273, 31108-31112.
Veldscholte, J.,
Ris-Stalpers, C., Kuiper, G.G.J.M.,
Jenster, G., Berrevoets, C., Claassen, E.,
Rooij, H.C.J.v., Trap-man, J.,
Brinkmann, A.O. y Mulder, E. (1990) A mutation
in the ligand binding domain of the androgen receptor of human
LNCaP cells affects steroid binding characteristics and response to
antiandrogens. Biochem. Biophys. Res. Commun., 173,
534-540.
Wagner, R.L., Apriletti, J.W.,
McGrath, M.E., West, B.L., Baxter, J.D. y
Fletterick, R.J. (1995) A structural role for hormone
in the thyroid hormone receptor. Nature, 378,
690-697.
Williams, S.P. y Sigler, P.B.
(1998) Atomic structure of progesterone complexed with its
receptor. Nature, 393, 392-396.
Yong, E.L., Tut, T.G.,
Ghadessy, F.J., Prins, G. y Ratnam, S.S.
(1998) Partial androgen insensitivity and correlations with
the predicted three dimensional structure of the androgen receptor
ligand-binding domain. Mol. Cell
Endocrinol., 137,41-50.
Claims (6)
1. Cristal que consiste en un dominio de unión
de ligando del receptor de andrógenos (AR-LBD), en
el que dicho AR-LBD comprende un bolsillo de unión
de ligando (LBP) y un ligando unido al LBP, en el que el ligando es
metribolona (R1881), y en el que dicho cristal presenta las
coordenadas estructurales proporcionadas en la Tabla 4 (figura
6).
2. Método de cribado para un ligando capaz de
unirse a un LBD, en el que el método comprende el uso de un cristal
según la reivindicación 1.
3. Método de cribado para un ligando capaz de
unirse a un LBP, en el que el LBP se define en la reivindicación 1,
y el método comprende poner en contacto el LBP con un compuesto de
ensayo, y determinar si dicho compuesto de ensayo se une a dicho
LBP.
4. Método según la reivindicación 3, en el que
el método está destinado a cribar un ligando útil en la prevención
y/o tratamiento de un trastorno relacionado con andrógenos, en el
que el trastorno relacionado con andrógenos se selecciona de entre
el grupo constituido por el síndrome de insensibilidad a andrógenos
(AIS), el síndrome de insensibilidad parcial a andrógenos (PAIS),
el síndrome de insensibilidad leve a andrógenos (MAIS), el síndrome
de insensibilidad completa a andrógenos (CAIS) y el cáncer de
próstata (PC).
5. Uso de un cristal según la reivindicación 1,
en el que el AR-LBD se usa para cribar ligandos que
pueden modular la actividad del AR-LBD.
6. Método para predecir, simular o formar
modelos de las características moleculares y/o interacciones
moleculares de un dominio de unión de ligando (LBD), que comprende
el uso de un modelo por ordenador, comprendiendo dicho modelo por
ordenador la utilización o la representación de las coordenadas
estructurales de un dominio de unión de ligando según la
reivindicación 1 para proporcionar una imagen de dicho dominio de
unión de ligando, y opcionalmente presentar dicha imagen.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0005689 | 2000-03-09 | ||
| GBGB0005689.5A GB0005689D0 (en) | 2000-03-09 | 2000-03-09 | Crystal |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2326516T3 true ES2326516T3 (es) | 2009-10-14 |
Family
ID=9887287
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01923873T Expired - Lifetime ES2326516T3 (es) | 2000-03-09 | 2001-03-09 | Cristal. |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030167999A1 (es) |
| EP (1) | EP1265927B1 (es) |
| JP (1) | JP2003525948A (es) |
| AT (1) | ATE430163T1 (es) |
| AU (1) | AU2001250557A1 (es) |
| DE (1) | DE60138532D1 (es) |
| ES (1) | ES2326516T3 (es) |
| GB (2) | GB0005689D0 (es) |
| WO (1) | WO2001066599A1 (es) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7235367B2 (en) * | 2000-07-12 | 2007-06-26 | Genetics Institute, Llc. | Method using crystal structure of estrogen receptor-β complex |
| JP4447826B2 (ja) * | 2002-06-03 | 2010-04-07 | 武田薬品工業株式会社 | 変異アンドロゲン受容体、それを発現する癌細胞、それらの作出方法およびそれらの用途 |
| WO2006117592A1 (en) * | 2005-04-29 | 2006-11-09 | Inserm | Methods of modulating nuclear receptors |
| PE20190845A1 (es) * | 2012-07-27 | 2019-06-17 | Aragon Pharmaceuticals Inc | Metodos para determinar resistencia a terapia de receptor de androgeno |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997021993A2 (en) * | 1995-12-13 | 1997-06-19 | The Regents Of The University Of California | Nuclear receptor ligands and ligand binding domains |
| JP2003511467A (ja) * | 1999-10-14 | 2003-03-25 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | アンドロゲンレセプターリガンド結合ドメインの結晶構造 |
-
2000
- 2000-03-09 GB GBGB0005689.5A patent/GB0005689D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-03-09 GB GB0214799A patent/GB2373505A/en not_active Withdrawn
- 2001-03-09 ES ES01923873T patent/ES2326516T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-09 US US10/220,981 patent/US20030167999A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-09 DE DE60138532T patent/DE60138532D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-09 JP JP2001565763A patent/JP2003525948A/ja active Pending
- 2001-03-09 AU AU2001250557A patent/AU2001250557A1/en not_active Abandoned
- 2001-03-09 EP EP01923873A patent/EP1265927B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-09 WO PCT/IB2001/000475 patent/WO2001066599A1/en active Application Filing
- 2001-03-09 AT AT01923873T patent/ATE430163T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003525948A (ja) | 2003-09-02 |
| WO2001066599A1 (en) | 2001-09-13 |
| GB0005689D0 (en) | 2000-05-03 |
| EP1265927B1 (en) | 2009-04-29 |
| GB0214799D0 (en) | 2002-08-07 |
| AU2001250557A1 (en) | 2001-09-17 |
| DE60138532D1 (de) | 2009-06-10 |
| ATE430163T1 (de) | 2009-05-15 |
| EP1265927A1 (en) | 2002-12-18 |
| GB2373505A (en) | 2002-09-25 |
| US20030167999A1 (en) | 2003-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lewis et al. | Structure and dynamics of NBD1 from CFTR characterized using crystallography and hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry | |
| Pioszak et al. | Molecular recognition of corticotropin-releasing factor by its G-protein-coupled receptor CRFR1 | |
| EP0873361B1 (en) | Crystals of the ligand-binding domain of the thyroid hormone receptor complexed to a ligand | |
| EP2274327B1 (en) | Crystal structure of human sortilin and uses thereof for identifying ligands to sortilin | |
| US6266622B1 (en) | Nuclear receptor ligands and ligand binding domains | |
| US20040137518A1 (en) | CRYSTALLIZED PPARa LIGAND BINDING DOMAIN POLYPEPTIDE AND SCREENING METHODS EMPLOYING SAME | |
| AU2005287557A1 (en) | Use of microproteins as tryptase inhibitors | |
| AU2017298565B2 (en) | Insulin analogs | |
| US20220340636A1 (en) | Insulin analogs | |
| US20070020684A1 (en) | Structure of a glucocorticoid receptor ligand binding domain comprising an expanded binding pocket and methods employing same | |
| ES2326516T3 (es) | Cristal. | |
| US8536306B2 (en) | Human A2A adenosine receptor crystals and uses thereof | |
| US20050202440A1 (en) | Inhibitors for androgen antagonist refractory prostate cancer | |
| JP4409284B2 (ja) | レチノイン酸関連オーファン受容体（ｒｏｒ）に由来するポリペプチド、およびその応用 | |
| Caldwell et al. | X-ray crystallographic and molecular dynamic analyses of Drosophila melanogaster embryonic muscle myosin define domains responsible for isoform-specific properties | |
| US7491523B2 (en) | Voltage-dependent calcium channel beta subunit functional core | |
| US20040018560A1 (en) | Crystallized LXR polypeptide in complex with a ligand and screening methods employing same | |
| Piscitelli et al. | Equilibrium between metarhodopsin-I and metarhodopsin-II is dependent on the conformation of the third cytoplasmic loop | |
| ES2277862T3 (es) | Polipeptidos derivados del receptor nuclear de la vitamina d, y sus utilizaciones en particular en el ambito del cribado de analogos de la vitamina d. | |
| US7590494B1 (en) | Drug design based on the structure of LTA4 hydrolase | |
| JP2010527246A (ja) | 方法 | |
| US7705127B1 (en) | HDM2 Polypeptides | |
| WO2002064632A2 (en) | Crystallized ppar$g(a) ligand binding domain polypeptide and screening methods employing same | |
| NZ750355B2 (en) | Insulin analogs | |
| EP1393235A1 (en) | Crystallized human xenobiotic nuclear receptor pxr/sxr ligand binding domain polypeptide and screening methods employing same |