ES2342309T3 - Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bolsillo de union del inhibidor. - Google Patents
Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bolsillo de union del inhibidor. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2342309T3 ES2342309T3 ES06012247T ES06012247T ES2342309T3 ES 2342309 T3 ES2342309 T3 ES 2342309T3 ES 06012247 T ES06012247 T ES 06012247T ES 06012247 T ES06012247 T ES 06012247T ES 2342309 T3 ES2342309 T3 ES 2342309T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- baselineskip
- inhibitor
- hpv
- tad
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 115
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 title description 15
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title description 6
- 238000002288 cocrystallisation Methods 0.000 title description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 60
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000013461 design Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 claims description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 34
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 32
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 30
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 25
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 22
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 19
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 18
- 241000701646 Kappapapillomavirus 2 Species 0.000 description 18
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 108010060219 Apolipoprotein E2 Proteins 0.000 description 17
- 239000011548 crystallization buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 12
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 11
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 10
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical group Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000742664 Human papillomavirus 11 Regulatory protein E2 Proteins 0.000 description 5
- 208000000260 Warts Diseases 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 5
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- SAMYCKUDTNLASP-UHFFFAOYSA-N hexane-2,2-diol Chemical compound CCCCC(C)(O)O SAMYCKUDTNLASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 5
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- RFXBCGVZEJEYGG-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2,3-dihydro-1h-indene Chemical compound CC1=CC=C2CCCC2=C1 RFXBCGVZEJEYGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 4
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 229940124686 HPV inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 101710185720 Putative ethidium bromide resistance protein Proteins 0.000 description 4
- 208000032124 Squamous Intraepithelial Lesions Diseases 0.000 description 4
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- OOGJCWRSXJSCJR-UHFFFAOYSA-N 5-methylindene-1,3-dione Chemical compound CC1=CC=C2C(=O)CC(=O)C2=C1 OOGJCWRSXJSCJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000000907 Condylomata Acuminata Diseases 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 208000025009 anogenital human papillomavirus infection Diseases 0.000 description 3
- 201000004201 anogenital venereal wart Diseases 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 3
- NIQCNGHVCWTJSM-UHFFFAOYSA-N dimethyl benzenedicarboxylate Natural products COC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OC NIQCNGHVCWTJSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 3
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 125000004189 3,4-dichlorophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(Cl)=C(Cl)C([H])=C1* 0.000 description 2
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N Sodium methoxide Chemical compound [Na+].[O-]C WQDUMFSSJAZKTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N Triiodomethane Natural products IC(I)I OKJPEAGHQZHRQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- FBSAITBEAPNWJG-UHFFFAOYSA-N dimethyl phthalate Natural products CC(=O)OC1=CC=CC=C1OC(C)=O FBSAITBEAPNWJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001826 dimethylphthalate Drugs 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N imiquimod Chemical compound C1=CC=CC2=C3N(CC(C)C)C=NC3=C(N)N=C21 DOUYETYNHWVLEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N iodomethane Chemical compound IC INQOMBQAUSQDDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 2
- 229960002718 selenomethionine Drugs 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000011232 storage material Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- ZWUSBSHBFFPRNE-UHFFFAOYSA-N 3,4-dichlorobenzaldehyde Chemical compound ClC1=CC=C(C=O)C=C1Cl ZWUSBSHBFFPRNE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 238000012287 DNA Binding Assay Methods 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150005585 E3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066038 E4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070004 E8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101710121996 Hexon protein p72 Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 206010023849 Laryngeal papilloma Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710157639 Minor capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000010103 Podophyllin Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710132593 Protein E2 Proteins 0.000 description 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N Selenium-L-methionine Chemical compound C[Se]CC[C@H](N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N Selenomethionine Natural products C[Se]CCC(N)C(O)=O RJFAYQIBOAGBLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N Sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 TATA Proteins 0.000 description 1
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002463 Transcription Factor TFIIIB Human genes 0.000 description 1
- 108010068071 Transcription Factor TFIIIB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 108091006088 activator proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940060265 aldara Drugs 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000315 cryotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000012926 crystallographic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N epipodophyllotoxin Natural products COC1=C(OC)C(OC)=CC(C2C3=CC=4OCOC=4C=C3C(O)C3C2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 239000004333 gold (food color) Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002751 imiquimod Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 201000000089 larynx squamous papilloma Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L nickel sulfate Chemical compound [Ni+2].[O-]S([O-])(=O)=O LGQLOGILCSXPEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000363 nickel(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940068585 podofilox Drugs 0.000 description 1
- 229940068582 podophyllin Drugs 0.000 description 1
- YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N podophyllotoxin Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@H](O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 YJGVMLPVUAXIQN-XVVDYKMHSA-N 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012312 sodium hydride Substances 0.000 description 1
- 229910000104 sodium hydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
- C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
- C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
- C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
- C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Laminated Bodies (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
El uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para identificar un inhibidor potencial de una molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2 del VPH que comprende los pasos de: a) el uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para generar una estructura tridimensional de la molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2; b) emplear dicha estructura 3-D para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial; c) sintetizar dicho inhibidor; d) poner en contacto dicho inhibidor con dicha molécula para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interaccionar con dicha molécula.
Description
Cocristalización del dominio de transactivación
E2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos X
que definen el bolsillo de unión del inhibidor.
La invención esta relacionada con la proteína E2
del virus del papiloma humano, concretamente la estructura
cristalina del dominio de transactivación de la proteína E2 del
virus del papiloma humano 11 (VPH-11) que forma un
complejo con un inhibidor. En particular, la invención proporciona
coordenadas de la estructura cristalina que definen un bolsillo de
unión del inhibidor y describe un modelo estructural tridimensional
mediante el que se pueden identificar inhibidores potenciales que
encajarían en este bolsillo. También se describen métodos para
facilitar el diseño y la selección de inhibidores de la actividad
de la proteína E2 implicada en la replicación de DNA de
papilomavirus, en concreto del papilomavirus humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Los papilomavirus (PV) son virus de DNA sin
envoltura que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio.
Estos virus están muy extendidos en la naturaleza y se han
reconocido en vertebrados superiores. Se han caracterizado virus en
humanos, ganado vacuno, conejos, caballos y perros, entre otros. El
primer papilomavirus descrito fue el papilomavirus del conejo común
(CRPV), descrito en 1933. Desde entonces, el papilomavirus del
conejo común (CRPV) y el papilomavirus bovino tipo 1
(BPV-1) han sido utilizados como prototipos
experimentales para estudios sobre los papilomavirus. La mayor
parte de los papilomavirus animales están asociados a lesiones
proliferativas exclusivamente epiteliales y la mayoría de las
lesiones en animales son cutáneas. En los humanos existen más de 75
tipos de papilomavirus (VPH) identificados que se han catalogado en
función de la localización de la infección: epitelio cutáneo,
epitelio de las mucosas (oral y genital). Las enfermedades
relacionadas con la piel incluyen verrugas planas, verrugas
plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con las mucosas
incluyen papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los
carcinomas cervicales (Fields. Virology. 3rd ed. Philadelphia, NY:
Lippincott - Raven Pub.; 1996).
Existen más de 25 tipos del VPH implicados en
las enfermedades anogenitales; estos se agrupan en tipos de "alto
riesgo" o de "bajo riesgo". Los tipos de bajo riesgo
incluyen el VPH tipo 6 y el tipo 11, que inducen lesiones mayormente
benignas como las condyloma acuminata (verrugas genitales) y
lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (SIL). En Estados
Unidos hay unos 5 millones de personas afectadas de verrugas
genitales de las que el 90% se atribuye a VPH-6 y
VPH-11.
Los tipos de alto riesgo están asociados a SIL
de alto grado y cáncer cervical, y mayormente incluyen los tipos 16,
18, 31, 33, 35, 45 y 52 del VPH. La progresión desde una SIL de bajo
grado a una de alto grado es mucho más frecuente en el caso de
lesiones que contienen VPH-16 y 18 de elevado riesgo
en comparación con aquellas que contienen tipos del VPH de bajo
riesgo. Además, en el cáncer cervical solamente cuatro tipos del VPH
se detectan con frecuencia (los tipos 16, 18, 31 y 45). A escala
mundial se diagnostican anualmente cerca de 500.000 casos nuevos de
cáncer de cérvix invasivo (Fields, 1996, supra).
El tratamiento para las verrugas genitales
incluye la eliminación física como es la crioterapia, el láser de
CO_{2}, la electrocirugia o la extirpación quirúrgica. También
cabe la posibilidad de utilizar agentes citotóxicos como el ácido
tricloroacético (ATC), la podofilina o el podofilox. También se
dispone de agentes inmunomoduladores como Interferón o Imiquimod
(Aldara®, 3M Pharmaceuticals). Estos tratamientos no son
completamente efectivos en la eliminación de la totalidad de las
partículas víricas y conllevan tanto un elevado coste como unos
efectos secundarios desagradables. Además las verrugas recurrentes
son comunes (Beutner & Ferenczy. Amer J Med. 1997;
102(5A): 28-37).
La ineficacia de los métodos actuales de
tratamiento de las infecciones por VPH ha puesto de manifiesto la
necesidad de identificar nuevos sistemas de control o eliminación de
estas infecciones. En los últimos años se ha dedicado mucho esfuerzo
a encontrar compuestos antivirales y, en especial, compuestos con
capacidad para interferir en la replicación vírica (Hughes y
Romanos. Nucleic Acids Res. 1993; 21: 5817-5823;
Clark, et al. Antiviral Res. 1998; 37(2):
97-106; Hajduk, et al. J Med Chem. 1997;
49(20): 3144-3150 y Cowsert, et al.
Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37(2):
171-177). Por esta razón, ha adquirido importancia
el estudio de la genética de los VPH con el fin de identificar
posibles dianas quimioterapéuticas que contengan y posiblemente
eliminen cualquier enfermedad causada por una infección de VPH.
El ciclo de vida de PV se encuentra
estrechamente relacionado con la diferenciación de los
queratinocitos. Se piensa que la infección tiene lugar en un lugar
de interrupción histica del epitelio basal. A diferencia de lo que
sucede con células normales, la división celular continúa a medida
que la célula experimenta una diferenciación vertical. Mientras las
células infectadas sufren una diferenciación progresiva, la
maquinaria de replicación celular se mantiene lo que permite el
aumento de la replicación de DNA vírico, situación que finalmente
dará lugar a una expresión génica tardía y a un ensamblaje de
viriones en queratinocitos con diferenciación terminal, y a la
liberación de partículas víricas (Fields, supra).
\newpage
La cadena codificante de cada uno de los genomas
del papilomavirus contiene aproximadamente diez marcos abiertos de
lectura (ORF) designados para traducción que se han clasificado en
ORF tempranos u ORF tardíos. Los genes de E1 a E8 se expresan al
principio del ciclo de replicación vírica. Los dos genes tardíos (L1
y L2) codifican las proteínas de cápside mayor y menor,
respectivamente. Los productos de los genes E1 y E2 intervienen en
la replicación de DNA vírico mientras que E5, E6 y E7 modulan la
proliferación de las células huésped. Las funciones de los
productos de los genes E3, E4 y E8 actualmente se desconocen.
Hay estudios sobre el VPH que han demostrado que
las proteínas E1 y E2 son las únicas proteínas víricas necesarias
para la replicación de DNA vírico (Kuo, et al. J Biol Chem.
1994; 30: 24058-24065). Este requisito es similar al
del virus del papiloma bovino tipo 1 (BPV-1). De
hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y E2
y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV), sin importar
la especie o el tipo vírico (Kuo, et al. 1994,
supra).
Cuando la replicación de DNA vírico tiene lugar
in vitro, en la que la proteína E1 está presente en exceso,
la replicación puede continuar en ausencia de E2. In vivo,
en presencia de una cantidad enorme de DNA, la replicación requiere
de la presencia tanto de E1 como de E2. Se piensa que el mecanismo
de iniciación de la replicación in vivo implica la unión
conjunta de E1 y E2 al origen, lo que conduce a la constitución de
un complejo terciario de proteína y DNA (Mohr, et al.
Science. 1990; 250: 1694-1699). La proteína E2 es un
activador transcripcional que se une a la proteína E1 y debido a
esto potencia la unión de E1 al origen de replicación de BVP (Seo,
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993b; 90:
2865-2869). De esta forma, E2 actúa como un factor
de especificidad cuando dirige a E1 hacia el origen de replicación
(Sedman y Stenlund. Embo J. 1995; 14: 6218-6228). En
el caso del VPH, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la
unión de E1 a la secuencia ori (J Biol Chem. 1995; 270(45):
27283-27291 y McBride et al. J Biol Chem.
1991; 266: 18411-18414). Estas interacciones de DNA
con proteína y proteína con proteína se dan en el origen de la
replicación de DNA (Sverdrup y Myers, supra).
Las proteínas E2 de \sim45 kD descritas en
numerosos serotipos animales y humanos comparten una organización
común en dos dominios. El dominio de transactivación (TAD)
N-terminal tiene una longitud de unos 220
aminoácidos y el dominio de unión a DNA (DBD)
C-terminal de 100 aminoácidos. Los dos dominios
están unidos por una región enlazante flexible.
E2 activa la replicación vírica a través de la
unión conjunta con la proteína iniciadora vírica E1 al origen de la
replicación de DNA, dando como resultado al final, hexámeros de E1
funcionales. E2 también es un regulador central de la transcripción
vírica. Interactúa con factores de transcripción basal, como la
proteína de unión a TATA, TFIIIB y TAF_{II}70 humana; con proteína
promotora proximal de unión como Sp1; y con otros factores celulares
como AMF-1, que afectan de forma positiva a la
activación transcripcional de E2.
Sin embargo, resulta más ambiguo discernir
cuáles de estas muchas interacciones son suficientes o necesarias
para conseguir la activación transcripcional. Estos detalles
concuerdan con la idea de que las proteínas activadoras de unión
funcionan como activadores transcripcionales al utilizar contactos
específicos proteína-proteína para enlazar
componentes de la maquinaria general de transcripción a un promotor,
con la finalidad de reclutar a la RNA polimerasa II. Una tercera
función de E2 es la de facilitar la segregación correcta de DNA
vírico. El genoma del virus del papiloma bovino (BVP) y la proteína
E2 colocalizan con los cromosomas de la célula huésped durante la
mitosis, dependiendo de un TAD intacto de E2.
El DBD de E2 se dimeriza para formar un barril
\beta con hélices flanqueantes de reconocimiento situadas en las
principales cavidades del bolsillo de unión de DNA. Por el
contrario, la estructura del TAD de E2 no se ha conocido hasta que
Harris y Botchan (Science. 1999; 284(5420): 1673)
proporcionaron un primer modelo de un fragmento proteolitico del
TAD de E2 del VPH-18 mediante cristalografía de
rayos X. El modelo sugiere una proteína con forma de anacardo de 55
\ring{A} x 40 \ring{A} x 30 \ring{A} con una hendidura concava
en un lado de la proteína y crestas en la superficie opuesta.
Harris y Botchan estudiaron si superficies discretas estaban
correlacionadas con actividades de E2 conocidas y en particular
identificaron una agrupación prominente de residuos que formaban el
borde interno de la cavidad principal que engloba a E175, L178, Y179
y 173 que define una superficie característica importante para la
transcripción.
Antson, et al. (Nature. 2000; (403)
805-809) describen la estructura cristalina del TAD
completo de E2 del VPH-16, incluyendo una segunda
interacción putativa recientemente identificada entre E2 y TAD de
E2 que contiene una agrupación de 7 residuos conservados (R37, A69,
173, E76, L77, T81 y Q80). Anston, et al. sugirieron que Q12
y E39 pueden estar implicadas en la interacción con E1.
La solicitud de patente internacional WO
01/21645 describe un método para identificar un inhibidor del VPH
candidato, en el que se aplica un diseño de fármaco racionalizado a
una estructura cristalina con un módulo N-terminal
de 200 aminoácidos (E2NT) del VPH y en el que la estructura
cristalina puede comprender las porciones de 12 aminoácidos
especificados, incluyendo W33 y L94. El diseño de fármaco
racionalizado puede comprender el diseño de fármacos que
interacciona con la dimerización de la superficie de E2NT.
La proteína E2 se considera una diana potencial
para agentes antivirales. Sin embargo, los esfuerzos realizados en
el descubrimiento de fármacos dirigidos hacia E2 se han visto
obstaculizados por la falta de información estructural de una E2
unida a un inhibidor formando un complejo. Ni el modelo de Harris ni
el de Antson proporcionan ninguna información respecto a la
localización o la caracterización de un posible bolsillo de unión
del inhibidor. La información estructural del dominio TAD de apo E2
ha generado cierto conocimiento muy útil de la superficie de la
apoproteína, pero ahora parece claro que esto no es representativo
de los cambios de conformación inducidos al unirse a un
inhibidor.
La falta de inhibidores específicos de E2, que
son necesarios para la obtención de la cocristalización de E2 y los
inhibidores, ha obstaculizado la búsqueda de un bolsillo de unión
del inhibidor en E2. Por tanto, el análisis cristalográfico por
difracción de rayos X de un complejo
inhibidor-proteína de este tipo no ha sido
posible.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe una nueva composición que contiene
un dominio de transactivación de la proteína E2 del virus del
papiloma humano en forma de complejo con una pequeña molécula
inhibidora de E2, y métodos para fabricar esta composición y
métodos para utilizar dicha composición. También se describe un
complejo E2-inhibidor capaz de ser cristalizado y
analizado por difracción de rayos X, y así proporcionar información
importante acerca del bolsillo de unión del inhibidor del dominio
de transactivación de la proteína E2 del VPH. El inhibidor
constituye una herramienta inmejorable para producir una
cocristalización y permitir así la caracterización de un bolsillo de
unión del inhibidor previamente desconocido que puede estar
interactuando con E1 durante el ciclo de replicación del VPH.
La invención proporciona un uso de coordenadas
atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para
identificar un inhibidor potencial de una molécula que comprende un
bolsillo de unión de tipo TAD de E2 del VPH que comprende los pasos
de:
a) el uso de las coordenadas atómicas de H32,
W33 y L94 como se define en la Figura 9 para generar una estructura
tridimensional de la molécula que comprende un bolsillo de unión de
tipo TAD de E2;
b) emplear dicha estructura 3-D
para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;
c) sintetizar dicho inhibidor;
d) poner en contacto dicho inhibidor con dicha
molécula para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial
para interaccionar con dicha molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención proporciona un método para evaluar
el potencial de una entidad química para asociarse con una molécula
o complejo que comprende una cavidad profunda definida por las
coordenadas de la estructura de aminoácidos H32, W33 y L94 del TAD
de E2 del VPH 11 de acuerdo con la Figura 9 o un modelo
tridimensional del mismo que comprende los pasos:
i) emplear medios computacionales para realizar
una operación de ajuste entre la entidad química y una molécula o
complejo que comprende un bolsillo de unión definido por las
coordenadas de la estructura de los aminoácidos H32, W33 y L94 del
TAD de E2 del VPH11 como se define en la Figura 9;
ii) analizar los resultados de dicha operación
de ajuste para evaluar la asociación entre la entidad química y el
bolsillo de unión VPH.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe una composición
cristalizable que comprende un polipéptido de tipo TAD de E2 del PV
con ID. de SEC. Núm. 2, que forma un complejo con un inhibidor
L:
También se describe un cristal que comprende un
polipéptido de tipo TAD de E2 del PV de ID. de SEC. Núm. 2 que
forma un complejo con un inhibidor L, antes definido.
También se describe un método para producir un
complejo inhibidor TAD de E2 del PV cristalizado (PV E2
TAD-L) como se ha definido antes, que comprende:
a) la mezcla del TAD de E2 del PV purificado,
contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L
solubilizado para generar una solución compleja que contenga dicho
complejo PV E2 TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en
un tampón de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un método para producir TAD
de apo E2 del PV cristalizado que comprende:
a) la mezcla de TAD de apo E2 del PV contenido
en un tampón de purificación, con un tampón de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un método para producir un
complejo inhibidor TAD de E2 del PV cristalizado (PV E2
TAD-L), antes definido, que comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en
un tampón de cristalización y
b) la inmersión del TAD de apo E2 del PV
cristalizado anteriormente definido en a).
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la invención se proporcionan unas
coordenadas de la estructura cristalina de rayos X del complejo
inhibidor TAD de E2 del PV (PV E2 TAD-L) definido
anteriormente.
Se describe además un medio de almacenamiento de
datos de lectura informática que comprende un material de
almacenamiento de datos codificado con las coordenadas de
estructura cristalina de rayos X, o al menos una porción de las
coordenadas estructurales, expuestas en la Figura 9.
Por otro lado, se describe también un ordenador
que genera una representación tridimensional de dicho complejo PV
E2 TAD-L aquí definido, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de
lectura informática que comprende un material de almacenamiento de
datos codificado con dichas coordenadas estructurales expuestas en
la Figura 9;
b) una memoria destinada al almacenamiento de
instrucciones para el procesamiento de los datos de lectura
informática mencionados;
c) una unidad central de proceso acoplada a
dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática para
el procesado de dichos datos y generar la representación
tridimensional mencionada; y
d) un monitor acoplado a la unidad central de
proceso para mostrar dicha representación tridimensional.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describe un método para la producción
de una proteína E2, siendo dicha proteína de utilidad en la
identificación o caracterización de inhibidores de TAD de E2, que
comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina
del VPH E2 TAD-L aquí definida para identificar residuos del
VPH del bolsillo de unión del inhibidor;
b) la comparación de estos residuos del VPH del
bolsillo de unión del inhibidor con residuos análogos en otra E2 del
PV;
c) la mutación de estos otros residuos de PV en
dichos residuos del VPH para producir un híbrido; y
d) someter a ensayo la inhibición de dicho
híbrido con un inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vez descrita la invención de forma general,
pasamos a referirnos a las imágenes anexas, mostrando mediante
ilustración una realización preferida de la misma en la que:
la Figura 1A representa la secuencia
aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del
VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 1) obtenida por Sakai,
et al. J Virol. 1996; 70: 1602-11;
la Figura IB representa la secuencia
aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del
VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 2) obtenida según el
procedimiento del Ejemplo 1;
la Figura 2 representa diagramas estereográficos
en cintas de la apo E2 del VPH-16 como los
descritos en Antson, et al. (supra);
la Figura 3 representa diagramas estereográficos
en cintas de la apo E2 del VPH-11 generadas por el
Solicitante;
la Figura 4 representa diagramas de lazos de la
E2 del VPH-11 en complejo con el compuesto L
aquí descrito;
la Figura 5 constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor del TAD de apo E2 del VPH-l6 (Antson,
et al. supra);
la Figura 6A constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor de la apo E2 del VPH-11 producida por el
Solicitante;
la Figura 6B constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor del co-cristal;
la Figura 7 muestra una representación
esquemática del movimiento de Y19 y H32 que tiene lugar en el
bolsillo de unión al unirse con un inhibidor;
la Figura 8 representa una visión superior de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión que
muestra en especial una cavidad profunda y una cavidad poco
profunda;
la Figura 9 muestra una lista de las coordenadas
de la estructura atómica del TAD de E2 en complejo con el compuesto
L generadas mediante difracción de rayos X a partir del
complejo cocristalizado (a partir de ahora referido como VPH TAD
E2-L). La preparación del complejo se describe en el Ejemplo
3. Los siguientes términos tienen estos significados: el término
A.A. se refiere al aminoácido identificado por cada coordenada; en
esta columna, el término "CPR" significa cisprolina; BLHA =
primera molécula del inhibidor L y BLHB = segunda molécula
del inhibidor L. Falta la información acerca de los
aminoácidos 197 y 201 de la cadena A debido a la elevada
flexibilidad de estos residuos que les confiere la facultad de ser
invisibles a los rayos X. Por esta misma razón, los siguientes
aminoácidos se modelan como Alanina: E2, K107, K173, S180, M182,
H183 y P196. "X, Y, Z" definen cristalográficamente la
posición atómica determinada para cada átomo en un espacio de
coordenadas cartesianas. "Occ." es un factor de, ocupación que
hace referencia a la fracción de las moléculas en la que cada átomo
ocupa la posición especificada por las coordenadas. Un valor de
"1" indica que cada átomo tiene la misma conformación, p. ej.
la misma posición, en todas las moléculas del cristal. "B" es
un factor térmico que mide el movimiento del átomo alrededor de su
centro atómico. Las coordenadas de los residuos que forman la
cavidad profunda se muestran en negrita; y
la Figura 10 representa la alineación de los
grupos de secuencias aminoacídicas que definen de forma general la
región del bolsillo de unión del inhibidor del dominio de
transactivación de E2 del VPH-6A,
VPH-11, VPH-16 y
VPH-18. Los residuos que están en negrita indican
que definen la cavidad profunda del bolsillo de unión del
inhibidor. El subrayado único define los residuos del fondo del
bolsillo profundo. El doble subrayado indica los residuos del
bolsillo poco profundo. Y19 está indicado en cursiva.
\vskip1.000000\baselineskip
Las siguientes abreviaciones se utilizan a lo
largo de la especificación.
El término "en asociación con" o "de
unión a" se refiere a una condición de proximidad entre entidades
químicas o compuestos, o porciones de los mismos. La asociación
puede ser no covalente, en la que la yuxtaposición está favorecida
en cuanto a la energía por enlaces de hidrógeno o interacciones de
van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente.
El término "bolsillo de unión", tal como se
utiliza aquí, hace referencia a una región de una molécula o
complejo molecular que, gracias a su forma, se asocia de forma
ventajosa con otra molécula, complejo molecular, entidad química o
compuesto. Tal como aquí se emplea, el bolsillo comprende al menos
una cavidad profunda y, opcionalmente una cavidad poco profunda.
Tal como aquí se utiliza, el término
"complejo" se refiere a la combinación de una molécula o una
proteína, de análogos conservativos o truncaciones de los mismos,
asociados con una entidad química.
\newpage
Las abreviaturas de los aminoácidos utilizados
en esta solicitud se disponen de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El término "análogo" del modo aquí empleado
y en el contexto de esta invención denota una secuencia
aminoacídica que retiene una actividad biológica (o funcional o
estructural) que es sustancialmente similar a la de la secuencia
original. Este análogo puede ser de la misma especie o no y puede
ser un análogo natural o estar preparado de forma sintética. Estos
análogos incluyen secuencias aminoacídicas con sustituciones,
deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos, siempre y cuando se
conserve la actividad biológica de la proteína. En concreto, el
término "análogo conservativo" denota un análogo con un
aminoácido sustituido por otro aminoácido con una fuerte o débil
similitud (véase, por ejemplo, Dayhoff MO. Atlas of Protein Sequence
and Structure. Washington DC, National Biomedical Research
Foundation; 1978; 5 Suppl 3.) como se define en la Tabla que aparece
a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
El término "cadena lateral" en referencia a
un aminoácido o un residuo de aminoácido significa un grupo unido
al átomo de carbono \alpha del aminoácido \alpha. Por ejemplo,
la cadena lateral del grupo R para la glicina es hidrógeno, para
alanina es metilo o para valina es isopropilo. Para los grupos R
específicos o cadenas laterales de los aminoácidos \alpha se hace
referencia al texto de A.L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el
capitulo 4).
El término "truncación" hace referencia a
cualquier segmento de la secuencia aminoacídica de TAD de E2, o de
cualquier segmento de cualquiera de los análogos descritos aquí
anteriormente, que comprende los suficientes aminoácidos para
definir la cavidad profunda del bolsillo de unión del inhibidor de
la presente invención en la misma relación espacial que la definida
por las coordenadas de la Figura 9.
El término "desviación media cuadrática" o
"desviación rms" o "rmsd" significa la raíz cuadrada de la
media aritmética del cuadrado de las desviaciones de la media. En
el contexto de objetos atómicos, los números se proporcionan en
angstroms (\ring{A}). Consiste en una manera de expresar la
desviación o variación respecto a una pauta o un objeto. En el caso
de la presente invención, todas las comparaciones de rmsd se
obtuvieron comparando estructuras que se hablan superpuesto
utilizando solamente los átomos de la cadena principal de H32, W33 y
L94 con el mínimo solapamiento de rms. Esto se realizó
exclusivamente mediante movimiento de cuerpos rígidos. La rmsd de
los átomos de cadena principal para esta acción entre la estructura
apo en cuestión y el complejo aquí descrito es de 0,078
\ring{A}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona una composición cristalizable que
comprende un polipéptido de tipo TAD de E2 de HPV de ID. de SEC.
Núm. 2 en complejo con un inhibidor L:
La composición comprende los aminoácidos 1 a 220
de la proteína E2 del VPH (ID. de SEC. Núm. 1) definida según la
numeración de Swiss Prot: locus VE2_HPV11 acceso P04015; ID. único:
gl37671, análogos conservativos o truncaciones de los mismos.
Alternativamente, el dominio de transactivación (TAD) de E2
comprende los aminoácidos 1 a 218, 1 a 215 ola 201. El TAD de E2
utilizado para la presente invención comprenda los aminoácidos 2 a
201 y en particular 2 a 196. finalmente, lo más preferible es que la
composición contenga los aminoácidos 15 a 104 del TAD de E2.
El TAD de E2 del VPH utilizado para la presente
invención se obtiene a partir de la cepa del VPH-11
y se encuentra formando un complejo con la molécula pequeña
inhibidora L. La presente invención también contempla otros
tipos de papilomavirus (PV), incluidos BPV (virus del papiloma
bovino) o CRPV (virus del papiloma del conejo común).
Se proporciona un cristal que comprende un
polipéptido de tipo TAD de E2 de HPV de ID. de SEC. Núm. 2 en
complejo con un inhibidor L:
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona un método de producción de un
complejo inhibidor TAD de E2 de HPV cristalizado (VPH E2
TAD-L) definido anteriormente, que comprende:
a) la mezcla de TAD de E2 de HPV purificado
contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L
solubilizado para generar así una solución compleja que contenga
dicho complejo VPH E2 TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en
un tampón de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
De forma alternativa al paso a), el inhibidor L
se solubiliza en DMSO al 100% a una concentración de 60 mM.
En el paso a), el tampón de purificación
contiene un agente reductor que puede ser TCEP o DTT. El agente
reductor puede ser TCEP a una concentración de alrededor de 1 mM a
alrededor de 10 mM o a una concentración de 5 mM.
El tampón de purificación se utiliza a un pH de
entre 7 y 9 o el tampón de purificación se utiliza a un pH de 8.
Además del agente reductor, es posible añadir
una sal para facilitar la estabilidad del TAD de E2 del VPH. La sal
puede seleccionarse de entre NaCl, NH_{4}SO_{4} o KCl. La sal
puede ser NaCl a una concentración de alrededor de 200 mM a
alrededor de 800 mM o a una concentración de 500 mM.
También se puede añadir además del agente
reductor un tampón para facilitar aún más la estabilidad del TAD de
E2 del VPH. El tampón puede ser Tris-HCl, HEPES o
bis-Tris. El tampón puede ser
Tris-HCl a una concentración de entre 0 nM y 50 mM o
a una concentración de 25 nM.
Otro componente que puede añadirse además del
agente reductor es un agente quelante para reducir la degradación
del TAD de E2 del VPH por proteasas. El agente quelante puede ser
EDTA o EGTA. El agente quelante puede ser EDTA a una concentración
de entre 0 mM y 1 mM o a una concentración de entre 0 mM y 0,5 mM o
a una concentración de 0,1 mM.
La solución proteica de TAD de E2 del VPH se
utiliza a una concentración de alrededor de 5 mg/ml en el tampón de
purificación o a una concentración de unos 10 mg/ml.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El tampón de cristalización puede ser MES,
fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico o succinato
sódico. El tampón de cristalización puede ser MES a una
concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 0,2 M o a una
concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización contiene además un
agente precipitante que facilita la cristalización del TAD de E2 del
VPH. El agente precipitante puede ser MPD, isopropanol, etanol o
butanol terciario. El agente precipitante puede ser MPD a una
concentración del 30% a alrededor del 40% o a una concentración del
35%.
El tampón de cristalización se utiliza
preferentemente a un pH de entre 4,5 y 6,5 o a un pH de 5,5.
En el paso b), la cristalización se llevó a cabo
entre 0ºC y 10ºC o a 4ºC.
La cristalización del complejo VPH E2
TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica por difusión de
vapor en gota colgante o "hanging drop".
El complejo cristalizado VPH E2 TAD-L es
susceptible a la cristalografía por rayos X. Mediante el uso de
análisis de cristalografía por rayos X, los cristales de complejo
inhibidor de TAD de E2 del VPH obtenidos pertenecen al grupo de
espacio P4(1) con una dimensión de celda unidad de a=b=60.7
\ring{A} y c=82,5 \ring{A} y contienen una molécula por unidad
asimétrica. Los datos iniciales de difracción se midieron mediante
un generador de rayos X de fuente propia (Rigaku, Japón) equipado
con un detector de área de impresión de placa R-axis
II (Molecular Structure Corp, Texas). Se recogieron preferentemente
datos a una resolución de 3,15 \ring{A} en un cristal único del
complejo enfriado a 100 K.
Se proporciona un método de producción de TAD de
apo E2 de HPV cristalizado, que comprende:
a) la mezcla de TAD de apo E2 de HPV, contenido
en un tampón de purificación, con un tampón de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
El TAD de apo E2 de HPV es TAD de apo E2 del
VPH-11, o el TAD de apo E2 de HPV es TAD de apo E2
de SE-VPH-11.
La solución proteica de TAD de apo E2 de HPV se
utiliza a una concentración de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de
15 mg/ml en el tampón de purificación o a una concentración de
alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml de TAD de E2 en el
tampón de purificación o a una concentración de 5 mg/ml en el tampón
de purificación.
El tampón de cristalización puede ser MES,
fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico o succinato
sódico. El tampón de cristalización puede ser succinato sódico a una
concentración de alrededor de 50 mM a alrededor de 0,2 M, o a una
concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización también contiene
PEG8K, PEG4K o PEG5K monoetiléter. El tampón de cristalización
también contiene PEG5K monoetiléter a una concentración de
alrededor de un 10% a alrededor de un 25% o a una concentración
del 18%.
El tampón de cristalización se emplea a un pH de
entre 4,5 y 6,5, o a un pH de 5,0.
El tampón de cristalización además contiene
sulfato de amonio a una concentración de alrededor de 0,1 M a
alrededor de 0,4 M o a una concentración de 0,2 M.
La cristalización se lleva a cabo entre 0ºC y
10ºC o a 4ºC.
Los cristales de TAD de apo E2 del
VPH-11 pertenecen al grupo de espacio C222 con
dimensión de celda unidad de a=54,9 \ring{A}; b=169,9 \ring{A} y
c=46,1 \ring{A} y contenían una molécula por unidad asimétrica.
Los datos de difracción se recogieron en una linea de haz X4a
(NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York). Se recogieron 4
conjuntos de datos a partir de un único cristal enfriado a 100 K, a
cuatro longitudes de onda de rayos X diferentes cercanas al limite
de absorción del selenio (0,9790 \ring{A}, 0,9794 \ring{A},
0,9743 \ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se tomaron imágenes en un
ADSC Q4 CCD. La máxima resolución preferida fue de 2,4
\ring{A}.
Se proporciona un método para producir un
complejo inhibidor TAD de E2 de HPV (VPH E2 TAD-L) como el
antes definido, que comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en
un tampón de cristalización; y
b) la inmersión del TAD de apo E2 de HPV, como
el antes definido, en a).
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto alternativo, se proporciona un
método para producir un complejo inhibidor TAD de E2 de HPV (VPH E2
TAD-L) como el antes definido, que comprende:
a) la adición de inhibidor L a un tampón de
cristalización que contiene un TAD de E2 de HPV cristalizado.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se proporcionan las coordenadas de la estructura
cristalina por rayos X del complejo inhibidor TAD de E2 de HPV (VPH
E2 TAD-L), antes definido. Más preferiblemente, las
coordenadas corresponden al bolsillo de unión del inhibidor. Más
preferiblemente, el conjunto de coordenadas para el complejo
inhibidor TAD de E2 de HPV están definidas según la Figura 9.
Es preferible que el bolsillo de unión del
inhibidor contenga una cavidad profunda que está delimitada por las
cadenas laterales de los aminoácidos H32, W33 y L94, donde la
cadena lateral del yl9 del TAD de E2 del VPH es desplazado de su
posición original para formar una cavidad profunda de tal dimensión
que permite la entrada de una molécula inhibidora pequeña. Es más
preferible que la cavidad profunda esté alineada en su parte
inferior por los aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible es que el
bolsillo además contenga una cavidad poco profunda que esté
delimitada por uno o más aminoácidos de L15, 136, E39, K68, N71 y
A72.
Preferiblemente, el bolsillo de unión del
inhibidor está definido de acuerdo con las coordenadas asignadas a
los siguientes grupos de aminoácidos:
Más preferiblemente, el bolsillo de unión del
inhibidor, y en concreto su cavidad profunda, está definido por las
coordenadas de H32, W33 y L94 según la Figura 9. Aún más
preferiblemente, están definidas por las coordenadas de las cadenas
laterales de h32, W33 y L94.
De forma alternativa, cabe la posibilidad de
considerar el cambio de la cadena lateral de Y19 desde un constructo
de proteína que reproduciría una cavidad profunda similar, pero sin
el estorbo de la cadena lateral de Y19.
Todavía es más preferible que el fondo de la
cavidad profunda esté definido por las coordenadas de los
aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible incluso es que la cavidad
poco profunda del bolsillo de unión del inhibidor esté definida por
las coordenadas de uno o más de los aminoácidos L15, 136, E39, K68,
N71 y A72.
La estructura tridimensional del complejo VPH E2
TAD-L de esta invención está definida por un conjunto de
coordenadas estructurales como las expuestas en la Figura 9. El
término "coordenadas estructurales" se refiere a coordenadas
cartesianas procedentes de operaciones matemáticas relacionadas con
los patrones obtenidos con la difracción de un haz monocromático de
rayos X por los átomos (centros de difracción) de un complejo
E2-L en forma de cristal. Los datos de difracción se utilizan
para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad del
cristal repetida. Entonces se utilizan esos mapas de densidad de
electrones para establecer las posiciones de los átomos individuales
del bolsillo de unión del inhibidor en el TAD de E2.
Los expertos en la materia comprenderán que un
conjunto de coordenadas estructurales para una proteína o un
complejo proteína-inhibidor o una porción de los
mismos, es un conjunto relativo de puntos que definen una forma en
tres dimensiones. Por lo tanto, es posible que un conjunto
completamentte diferente de coordenadas defina una forma similar o
idéntica.
Las variaciones de coordenadas pueden generarse
debido a manipulaciones matemáticas de las coordenadas
estructurales. Por ejemplo, las coordenadas estructurales expuestas
en la Figura 9 se podrían manipular por permutaciones
cristalográficas de las mismas, por fraccionalización o por
operaciones matriciales en conjuntos de las coordenadas
estructurales, o cualquier combinación de las opciones
mencionadas.
Para determinar si una molécula, un complejo
molecular o una porción de los mismos son suficientemente similar a
la totalidad o a partes de la proteína E2 del VPH, o del TAD de E2
del VPH, descritos anteriormente, como para considerarlas iguales,
son necesarios diversos análisis informáticos. Estos análisis pueden
llevarse a cabo en aplicaciones actuales de programas informáticos,
como la aplicación de Similitud Molecular de QUANTA (Molecular
Simulations Inc., San Diego, CA), versión 4.1.
La aplicación de Similitud Molecular permite
realizar comparaciones entre estructuras diferentes, conformaciones
diferentes de una misma estructura y partes diferentes de la misma
estructura. El procedimiento utilizado en la Similitud Molecular
para comparar estructuras se divide en cuatro pasos: 1) carga de
las estructuras a comparar; 2) definición de la equivalencia atómica
en estas estructuras; 3) realización de una operación de
"fitting" (superposición); y 4) análisis de los resultados.
Cada estructura está identificada por un nombre.
Entonces se identifica una estructura como diana (es decir, la
estructura fija); el resto de estructuras son las estructuras
operativas (es decir, estructuras en movimiento). Dado que la
equivalencia atómica en QUANTA viene definida por la entrada del
usuario, para el propósito de esta invención se determinaron los
valores de rmsd utilizando átomos de las cadenas principales de los
aminoácidos H32, W33 y L94 entre las dos estructuras comparadas.
En los casos en que se utiliza un método de
"fitting" rígido, la estructura operativa sufre una traslación
y una rotación para encajar de forma óptima con la estructura diana.
La operación de "fitting" utiliza un algoritmo que calcula la
traslación y rotación óptimas que se deben aplicar a la estructura
móvil de modo que la diferencia media cuadrática del encaje
respecto de los pares especificados del átomo equivalente sea un
mínimo absoluto. Una vez superpuestas las dos estructuras es posible
calcular un valor rmsd para conjuntos específicos de átomos
equivalentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona un medio de almacenamiento de
datos de lectura informática que contiene un material de
almacenamiento de datos codificado con las coordenadas
estructurales, o al menos una parte de las coordenadas estructurales
expuestas en la Figura 9. Los expertos en la materia conocerán
perfectamente estos medios de almacenamiento de lectura informática
como son los CD-ROM o los disquetes ("disco
flexible").
Por tanto, de acuerdo con la presente invención,
las coordenadas estructurales de un complejo inhibidor de E2 del
VPH, y en particular un complejo VPH E2 TAD-L, y de porciones
de los mismos pueden almacenarse en un medio de almacenamiento de
lectura informática. Estos datos se pueden utilizar con diversos
propósitos, por ejemplo el hallazgo de fármacos o el análisis
cristalográfico por rayos X de cristales de proteína.
También se proporciona un ordenador para generar
una representación tridimensional del complejo VPH E2
TAD-L, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de
lectura informática que comprende un material de almacenamiento de
datos codificado con las coordenadas estructurales expuestas en la
Figura 9;
b) una memoria para el almacenamiento de
instrucciones para el procesado de dichos datos de lectura
informática;
c) una unidad central de proceso acoplada a
dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática, para
el procesado de dichos datos de lectura informática con el fin de
generar la representación tridimensional; y
d) un monitor acoplado a dicha unidad central de
proceso que muestre dicha representación tridimensional.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención también proporciona una estructura
tridimensional de al menos una parte del complejo molecular, que
contiene características de estructura similar a un bolsillo de
unión del inhibidor de TAD de E2 del VPH.
La forma del bolsillo de unión del inhibidor, de
acuerdo con la presente invención, se puede visualizar como que
contiene un bolsillo profundo y, de forma opcional, un bolsillo
menos profundo (véase la Figura 7). La forma de la cavidad profunda
está definida por las posiciones relativas de las cadenas laterales
de los aminoácidos H32, W33 y L49 y no por sus coordenadas absolutas
según la Figura 9. Es posible obtener coordenadas o modelos
estructurales similares a partir de técnicas diferentes (p. ej. RMN,
modelado, etc.) y estos se consideran dentro del alcance de la
presente invención.
Así, esta invención también proporciona la
estructura tridimensional de un complejo inhibidor de E2 del VPH, en
concreto un complejo VPH E2 TAD-L. Cabe destacar que esta
estructura ha proporcionado por primera vez información sobre la
estructura y la forma de este bolsillo de unión del inhibidor de
TAD de E2 del VPH.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona un método para la evaluación del
potencial de una entidad química de asociarse con un dominio de
transactivación de E2 de papilomavirus que comprende un bolsillo de
unión definido por las coordinadas estructurales de un dominio de
transactivación de la proteína E2 del VPH-11 que
contiene los aminoácidos H32, W33 y L94, o un modelo tridimensional
del mismo;
Opcionalmente, la invención también proporciona
para el mismo método en el que el bolsillo de unión también
comprende las coordenadas estructurales de uno de H29 y T97 o de
ambos que definen la parte inferior del bolsillo profundo; o
\newpage
Opcionalmente, la invención también proporciona
para el mismo método en el que el bolsillo de unión también
comprende la coordenada estructural de al menos un aminoácido
seleccionado del grupo formado por: L15, 136, E39, K68, N71 y
A72.
Por primera vez, la presente invención permite
la utilización de técnicas de diseño racional de fármacos o basado
en la estructura para diseñar, seleccionar y sintetizar entidades
químicas que incluyen compuestos inhibidores con capacidad para
encajar y/o unirse al bolsillo de unión del inhibidor del TAD de E2
del VPH, o cualquier porción de los mismos.
Una técnica de diseño de fármacos
particularmente útil que facilita esta invención es el diseño
iterativo de fármacos. Esta técnica es un método de optimización de
las asociaciones entre una proteína y un compuesto mediante la
determinación y evaluación de estructuras tridimensionales de
conjuntos sucesivos de complejos
proteína-complejo.
Los expertos en la materia se percatarán de que
la asociación de ligandos o sustratos naturales con el bolsillo de
unión de sus receptores o enzimas correspondientes constituye la
base de múltiples mecanismos de acción biológicos. Igualmente, hay
una gran cantidad de fármacos que ejercen sus efectos biológicos
mediante la asociación con las cavidades de unión de receptores o
enzimas. Estas asociaciones pueden tener lugar con cualquiera de las
partes, o todas ellas, del bolsillo de unión. La comprensión de este
tipo de asociaciones facilitará la orientación del diseño de
fármacos hacia la obtención de asociaciones más favorables con sus
receptor o enzima diana y, por tanto, de efectos biológicos
mejorados. De esta forma, esta información es valiosa para el diseño
de ligandos o inhibidores potenciales de receptores o enzimas, como
los inhibidores de polipéptidos de tipo E2 del VPH o, especialmente,
de TAD de E2 del VPH.
En el diseño iterativo de fármacos se obtienen
cristales de una serie de complejos
proteína-compuesto y a continuación se genera la
estructura tridimensional de cada complejo. Este tipo de enfoque
proporciona nuevos conocimientos sobre la asociación entre las
proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se consigue
mediante la selección de compuestos con actividad inhibidora,
obteniendo cristales de este nuevo complejo
proteína-compuesto, resolviendo la estructura
tridimensional del complejo, y comparando las asociaciones entre
los complejo proteína-compuesto nuevos y los
complejos proteína-compuesto previamente resueltos.
Es posible optimizar estas asociaciones a través de la observación
de cómo afectan los cambios del compuesto a las asociaciones
proteína-compuesto.
En algunos casos, el diseño iterativo de
fármacos se lleva a cabo creando complejos sucesivos
proteína-compuesto y a continuación cristalizando
cada complejo nuevo. De forma alternativa, se introduce en presencia
de un inhibidor un cristal de proteína formado previamente, tal como
se ha descrito anteriormente, formando de esta forma un complejo
proteína-compuesto y obviando la necesidad de
cristalizar cada complejo proteína-compuesto
individual. De forma favorable, los cristales de proteína E2 del
VPH, y en concreto los cristales de TAD de E2, proporcionados por
esta invención pueden introducirse en presencia de un inhibidor o
más concretamente de un inhibidor de E2 como un compuesto L,
para proporcionar complejos de cristal E2-inhibidor,
como se ha descrito anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertos casos es posible sintetizar un TAD de
E2 que carezca de la cadena lateral de Y19 para reproducir el
bolsillo de unión del inhibidor definido aquí. Se pretende que
estas modificaciones de la secuencia primaria para conseguir un
bolsillo de unión similar estén dentro del alcance de la presente
invención. También se contempla la utilización de este tipo de TAD
de E2 modificado para realizar el cribado (mediante cualquiera de
los siguientes: RMN, MS, ensayos de desplazamiento de sonda, etc.)
en busca de un posible inhibidor del bolsillo acabado de
definir.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona un método de producción de una
proteína E2, siendo dicha proteína útil para la identificación o
caracterización de inhibidores de TAD de E2, que comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina
del VPH E2 TAD-L, definida anteriormente, para
identificar residuos del bolsillo de unión del inhibidor del
VPH;
b) la comparación de dichos residuos del
bolsillo de unión del inhibidor del VPH con residuos proteicos de
virus del papiloma de conejo común (CRPV);
c) la mutación de dichos residuos de CRPV en los
residuos del VPH mencionados, para producir un híbrido; y
d) ensayar la inhibición de dicho híbrido por un
inhibidor.
\vskip1.000000\baselineskip
La infección de conejos de laboratorio con virus
del papiloma de conejo común (CRPV) o la introducción del genoma
del CRPV en la piel de estos conejos da lugar a la aparición de
grandes verrugas. El sistema del modelo de CRPV se ha utilizado
para evaluar posibles tratamientos anti-VPH (Kreider
JW, et al. (1992) "Preclinical system for evaluating
topical podofilox treatment of papillomas: dose response and
duration of growth prior to treatment" J Invest Dermatol. 1992;
99,813-818). Es fácil visualizar que esta cuestión
constituiría un sistema adecuado para ensayar la eficacia in
vivo de inhibidores de la replicación de DNA del VPH de unión a
E2. Sin embargo, las proteínas E2 de CRPV y del VPH solamente
comparten el 39% de identidad de secuencia y es posible que los
inhibidores de unión a la proteína del VPH no se unan a la E2 del
CRPV.
La estructura cristalina del inhibidor de TAD de
E2 del VPH, aquí descrita, se puede utilizar para identificar
residuos que forman parte del bolsillo de unión del inhibidor del
VPH y que difieren de la proteína del CRPV. Es posible entonces
mutar los residuos de CRPV hacia el correspondiente del VPH. El
híbrido resultante puede someterse a ensayo mediante traducción
in vivo del gen del híbrido para producir una proteína E2
que podría probarse en ensayos in vitro como el ensayo de
unión de DNA a E1 dependiente de E2 (véase el Ejemplo 6). Si la
proteína híbrida resulta funcional en el ensayo, y se demuestra que
es sensible a los inhibidores del VPH, se puede utilizar el gen
correspondiente para inducir el crecimiento de verrugas en conejos.
Las verrugas resultantes de este procedimiento deben ser tratables
mediante inhibidores dirigidos originalmente a E2 del VPH. Así, la
utilización de este modelo híbrido, generado mediante el análisis
del complejo inhibidor de TAD del VPH, se podría utilizar para
ensayar compuestos del VPH en un modelo animal. Esta técnica
también puede ser aplicable a otros virus de papiloma como, entre
otros, el virus del papiloma bovino (BVP).
Con el propósito de que esta invención se
entienda más completamente se exponen los siguientes ejemplos. Estos
ejemplos solamente están destinados a ilustrar y de ningún modo
deben entenderse como limitadores del alcance de esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Expresión de dominio de transactivación de E2
del VPH-11 marcado con His. Se amplificaron por
PCR los aminoácidos 2-201 del
VPH-11 E2 (ID. de SEC. Núm. 2) a partir del plásmido
PCR3-E2 (Titolo, 1999) utilizando los cebadores
5'-CAA GAC GTG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC
CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG-3'(directo) (ID. DE SEC.
NÚM. 3) y 5'-CAC CAA GTG GAT CCG CTA GCT TAG CTA GAT
ACA GAT GCA GGA-3' (indirecto) (ID. DE SEC. NÚM. 4).
El producto de PCR se digirió utilizando NcoI y BamHI y se ligó a un
plásmido pET-28b, que habla sido digerido de forma
similar. El producto de ligación se transformó en E. coli
DH5\alpha MAX Efficiency® competentes (Life Technologies). El
plásmido recombinante que codifica el VPH11 E2 TAD marcado con His
(His-TAD) se aisló de un cultivo del DH5a
transformado y se verificó si era correcta la secuencia de 7 DNA del
TAD de E2. El plásmido aislado se transformó entonces en la cepa de
E. coli BL21 (DE3)pLysS
(Novagen).
(Novagen).
Se generó mediante PCR un segundo constructo que
codificaba cuatro Usinas adicionales situadas en el extremo
C-terminal del dominio de transactivación de E2
(TAD con cola de Lys) utilizando el cebador directo
5'-GGG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC
GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA G-3' (ID. DE SEC. NÚM.
5) y el cebador indirecto 5'-CCC CGG ATC CTC ATT ACT
TTT TCT TTT TGC TAG ATA CAG ATG CAG GAG AAC-3' (ID.
DE SEC. NÚM. 6). Este producto se digirió del mismo modo que antes y
se ligó al plásmido pET15b. Se verificó que la secuencia de DNA que
codifica los aminoácidos 2-201 de E2 del VPH11 era
correcta y se transformó el plásmido en la cepa de E. coli
strain BL21(DE3)pLysS como se ha descrito
anteriormente.
Para la expresión de proteínas, se inoculó medio
de cultivo CircleGrow (Bio101) que contenía 34 \mug/ml de
cloranfenicol y 50 \mug/ml de canamicina
(His-TAD) o 100 \mug/ml de ampicilina (TAD con
cola de Lys) con una vigésimo quinta parte del volumen de un cultivo
fresco de toda la noche y se cultivaron células a 37ºC hasta
alcanzar una DO (600 nm) de aproximadamente 1,0. A continuación se
cambió el cultivo a 22ºC y se indujo la expresión proteica a una DO
(600 nm) =1,4 con IPTG 0,5 mM. Transcurridas seis horas, se
recogieron las células mediante centrifugación y se congelaron en
hielo seco; entonces se conservaron a 80ºC.
Purificación de proteínas del TAD del VPH11
marcadas con His. El procedimiento de purificación fue idéntico
para las proteínas de TAD marcado con His y TAD con cola de Lys;
todos los pasos se llevaron a cabo a 4ºC. Las células se
resuspendieron a 5 ml por gramo en tampón de purificación
(Tris-HCl 25 mM pH 8,0; NaCl 500 mM, TCEP 5 mM) con
los inhibidores de proteasa pepstatina, leupeptina y antipaína (cada
uno a 5 \mug/ml), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM) y
Pefabloc® (Roche, 0,4 mM). La suspensión se sonicó, y el lisado
bruto se centrifugó durante 30 min a 26.000 g. El sobrenadante se
inyectó en una columna quelante Hi-Trap de 5
ml (APB) equilibrada con sulfato de níquel. Tras el lavado con
tampón de purificación más imidazol 0 mM y 25 mM, se eluyó el TAD
con tampón de purificación que contenía imidazol 100 mM. Las
fracciones que contenían TAD se agruparon y concentraron a menos de
5 mi, a continuación se cargaron sobre una columna de gel de
filtración Superdex-75 (APB) equilibrada con tampón
de purificación más EDTA 0,1 mM. Las fracciones que contenían TAD
puro se agruparon y concentraron a aproximadamente 5 mg/ml (TAD
marcado con His) o 12 mg/ml (TAD con cola de Lys). Se tomaron
alícuotas de proteína concentrada, se congelaron en hielo seco y se
conservaron a -80ºC.
Expresión y purificación de selenometionina
que contiene His-TAD. El plásmido que codificaba
His-TAD se transformó en la cepa de E. coli
B834 (auxotrófica para metionina). Se utilizó una única colonia
bacteriana para inocular un cultivo incubado toda la noche en medio
LB que contenía 34 \mug/ml de cloranfenicol y 50 \mug/ml de
canamicina. Una parte de este cultivo se diluyó 1:4000 en medio DL30
(LeMaster DM y Richards RM. Biochemistry. 1985; 24:
7263-68) en ausencia de metionina y complementado
con 2 \mug/ml de biotina y tiamina y 50 \mug/ml de
d,1-selenometionina y los mismos antibióticos.
Pasadas 26 horas a 37ºC, el cultivo había alcanzado una densidad de
0,8 (DO a 600 nm), y se indujo la expresión a 23ºC con IPTG 0,5 mM.
Transcurridas siete horas aproximadamente, se recogieron las células
y se conservaron del modo antes descrito. La purificación se llevó
a cabo de la misma forma descrita para His-TAD,
excepto en que los tampones de purificación se rociaron con helio
antes de su utilización, y se eluyó His-TAD con
imidazol 200 mM tras el lavado a 50 y 100 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
A una suspensión de anhídrido
4-metilftálico (25,65 g; 158,2 mmol) en MeOH (79 ml)
a temperatura ambiente, se le añadió metóxido sódico (69 ml de
solución al 25% en peso, 316 mmol). Transcurridos 30 min, la mezcla
de reacción se diluyó en agua y la capa acuosa se lavó con
Et_{2}O. La capa acuosa se acidificó con HCl (4N) y se extrajo
con Et_{2}O. La capa orgánica se enjuagó con salmuera, se secó
(MgSO_{4}), filtró y concentró a presión reducida.
El residuo bruto se disolvió en acetonitrilo (79
ml) y se enfrió hasta 0ºC. A la solución resultante se le añadió DBU
de forma sucesiva (31,3 g; 206 mmol) y yodometano (33,7 g; 237, 3
mmol). Tras 1 hora a 0ºC, se añadió yodometano (33,7 g; 237,3 mmol)
y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante
una hora más. La mezcla de reacción se concentró a presión
reducida, y el residuo se diluyó en Et_{2}O (300 ml). La solución
etérea se lavó sucesivamente con HCl acuoso (4 N, 100 ml), NaOH
(10%) y salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró por
evaporación. El residuo resultante se trató con una solución etérea
de diazometano para completar la esterificación, tras la cual se
concentró para proporcionar el 4-metil dimetil
ftalato (222 g, rendimiento del 67%) en forma de aceite amarillo
claro.
A una solución de 4-metil
dimetil ftalato bruto (22,20 g, 1 06,6 mmol) en etilacetato (107
ml), se añadió hidruro sódico (97%, 3,84 g, 160 mmol). La suspensión
resultante se calentó a reflujo durante 4,5 horas y seguidamente se
dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió Et2Ü (100 ml) para
proporcionar un precipitado amarillo. El sólido amarillo se filtró y
lavó dos veces con una mezcla de alcohol etílico/dietiléter
(1/1).
Este sólido amarillo se disolvió entonces en HCl
(4 N, 100 ml) y se calentó a reflujo durante 30 min. Una vez
enfriado, se añadió EtOAc y la fase orgánica se separó y se lavó
con salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró para
proporcionar 5-metil 1,3-indanodiona
en forma de sólido amarillo (3,7 g; 22% de rendimiento).
Paso a: A una solución de
5-metil
indan-1,3-diona (A) (410 mg; 2,6
mmol) en EtOH (13 ml) se añadió
3,4-diclorobenzaldehído (B) (493 mg 2,8 mmol)
seguido de piperidina (1 gota). La mezcla de reacción se calentó a
reflujo durante 30 min. Una vez enfriada, a la mezcla de reacción
se le añadió peróxido de hidrógeno acuoso (30%, 0,87 ml; 7,7 mmol) y
DBU (97 mg; 0,6 mmol). Se continuó agitando durante 30 min y a
continuación se añadió hexano (5 ml) y se filtró el precipitado. El
sólido resultante se trituró dos veces con una mezcla de
propanol/hexano (1/1) y se secó bajo vacío elevado para proporcionar
3-(3,4-diclorofenil)-spiro(oxirano-2,2'-[5-Metil-indan])-1',3'-diona
(D) (701 mg; 82% de rendimiento).
Paso c: Una mezcla de
3(3,4-diclorofenil)-spiro(oxirano-2,2'-[5-Metil-indan])-1',3'-diona
(D) (200 mg; 0,8 mmol) y
1-(4-[1,2,3]tiazol-4il-fenil)-pirro1-2,5-diona
(e) (155 mg; 0,6 mmol) en tolueno (46 ml) se calentó a reflujo
durante 16 h. Una vez enfriado y concentrado, el residuo se trituró
con EtOAc para proporcionar una mezcla de dos compuestos F/G
(isómeros racémicos cis/cis, 228 mg, 60% de rendimiento).
Paso d: A una solución de compuestos F/G
(210 mg; 0,36 mmol) en CH-{3}CN (36 ml) se le añadió NaOH (0,02 N;
17,8 ml; 0,36 mmol) utilizando una bomba de infusión con jeringa
durante 1 h. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción
se agitó durante 1 h más. A continuación se liofilizó la solución
para proporcionar una mezcla de compuestos J/K racémicos
(227 mg, rendimiento cuantitativo). Se obtuvo enantiómero L
puro mediante separación en HPLC preparativa utilizando una columna
quiral (Chiracel OD, eluyente isocrático 65% CH_{3}CN/H_{2}O que
contiene 0,06% de TFA; lámpara de UV a 205 nm; flujo de 7 ml/min).
Las fracciones deseadas se combinaron y liofilizaron. La sal sódica
correspondiente se preparó mediante tratamiento con NaOH (0,02 N; 1
equiv.) en acetonitrilo seguido de liofilización para proporcionar
las sales sódicas (15 mg) en forma de sólido blanco.
L: ^{1}H-RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 10,35 (s, 1H) ; 8,40 (d, J
=8,6 Hz; 2H); 7,89-7,80 (m, 3H); 7,64 (m, 3H); 7,52
(d, J = 8,3 Hz; 1H); 7,51-7,34 (m, 1H); 5,75 (s,
1H); 4,19 (m, 1H) 3,78 (m, 1H); 2,57 (s, 3H); ES MS m/z 606
(MH+).
La actividad inhibidora del compuesto se evaluó
de acuerdo con los ensayos descritos en el Ejemplo 6 y se determinó
que tenia un CI_{50} de 180 nM. La selectividad del inhibidor se
verificó por ausencia de actividad (o menor potencia) en el ensayo
del antígeno T mayor de SV40 descrito en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Se solubilizó polvo de inhibidor L en
DMSO al 100% a una concentración de 60 mM. La solución proteica
estaba formada por 10 mg/ml de E2TAD en tampón de purificación
(Tris-HCl 25 mM pH a 8,0; NaCl 500 mM; TCEP 5 mM;
EDTA 0,1 mM). El complejo de E2TAD-L se consiguió mezclando 1
\mul de inhibidor L en 74 \mul de solución proteica. La
solución se mantuvo a 4ºC durante 2-3 horas antes
de realizar los experimentos de cristalización.
\vskip1.000000\baselineskip
\global\parskip0.900000\baselineskip
La cristalización del TAD de apoE2 y del
complejo E2TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica por
difusión de vapor en gota colgante (McPherson A. Preparation and
Analysis of Protein Cristals. Krieger Pub. 1989) en placas de
cristalización VDX (Hamton Research, Laguna Niguel,
California).
En particular para la apo VPH-11
E2 TAD: 1 \mul de la solución Se-E2 TAD (5 mg/ml
en tampón de purificación) se mezcló con 1 \mul de una solución
compuesta por succinato sódico 0,1 M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y
sulfato amónico 0,2 M. La gota resultante de 2 \mul se suspendió
sobre 1 ml de solución de reserva compuesta por succinato sódico 0,1
M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y sulfato amónico 0,2 M. Los cristales
obtenidos a 4ºC pertenecen al grupo espacial C222 con una dimensión
de celda unidad de a=54,9 \ring{A}; b=169,9 \ring{A} y c=46,1
\ring{A} y contienen una molécula por unidad asimétrica.
Los datos de difracción se recopilaron en la
linea de haz X4a (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York).
Se recogieron cuatro grupos de datos a partir de un único cristal
enfriado a 100 K, a cuatro longitudes de onda de rayos X diferentes
cercanas al límite de absorción del Selenio (0,9790 \ring{A};
0,9794 \ring{A}; 0,9743 \ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se
recogieron las imágenes en un ADSC Q4 CCD; la resolución máxima fue
de 2,4 \ring{A}.
Para la cristalización del complejo: 1 \mul de
la solución compleja, descrita en el ejemplo 3, se mezcló con 1
\mul de una solución compuesta por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35%
(metil pentano diol). La gota resultante se suspendió sobre 1 ml de
solución de reserva formada por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35%. A
continuación se conservaron placas a 4ºC. Los cristales obtenidos
pertenecen al grupo espacial P4(l) con una dimensión de celda
unidad de a=b=60,7 \ring{A} y c=82,5 \ring{A} y contienen una
molécula por unidad asimétrica.
Los datos iniciales de difracción se midieron
utilizando un generador de rayos X de fuente propia (Rigaku, Japón)
equipado con un detector de área de impresión de placa
R-axis II (Molecular Estructura Corp, Texas). Se
recogieron datos a una resolución de 3,15 \ring{A} en un cristal
único del complejo enfriado a 100 K.
A continuación se recopilaron datos de
difracción a alta resolución en una línea de haz X25 (NSLS,
Brookhaven National Laboratory, New York). Las imágenes de
difracción se recogieron en un detector Brandéis B4 (Brandéis
University) montado sobre un goniómetro de ejes con geometría kappa
(Enraf-Nonius, Países Bajos). Se recogió un
conjunto completo de datos a una resolución de 2,4 \ring{A} sobre
un único cristal del cora-1 piejo enfriado a 100 K
(presentado en la Figura 9).
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la fase de los datos del apo
cristal se realizó mediante MAD (Multi wavelength Anomalous
Dispersión, difracción de longitud de onda múltiple anómala)
utilizando el programa MLPHARE (Collaborative Computational
Project, número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein
Crystallography, Acta Cryst. D50, 760-763).
En el caso del cristal complejo se utilizó el
método de Sustitución Molecular (MR, del inglés Molecular
Replacement) para la estimación inicial de las fases de datos de
difracción. La apo estructura de Se-E2TAD se
utilizó como modelo. Se realizó una búsqueda de rotación y
traslación a través del programa AMORE (Collaborative Computational
Project, número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein
Crystallography, Acta Cryst D50, 760-763).
La construcción de un modelo en un mapa de
densidad de electrones se llevó a cabo con el programa informático O
(Alwyn Jones, Upsala University, Suecia) y el refinamiento del
modelo se realizó con el programa informático CNX (Molecular
Simulation Inc, San Diego, California). A continuación, se mejoró el
nuevo modelo mediante un procedimiento de ciclado que incluía el
cálculo de mapas de densidad de electrones, la reconstrucción del
modelo y los pasos de refinamiento. El modelo final constaba de 2 a
196 residuos de TAD de E2 y dos moléculas L inhibidoras. El
factor R cristalográfico final fue 24,6% y el factor R libre es
29,3%.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo se diseñó tomando como modelo un
ensayo similar para el antígeno T de SV40 descrito por Mckay (J Mol
Biol. 1981; 145: 471). Se generó por PCR una sonda de DNA con
radiomarcaje de 400 pb, que contenía el origen de replicación del
VPH-11 (Chiang et al. Proc Natl Acad Sci USA.
1992; 89: 5799), utilizando como molde el plásmido
pBluescript^{TM} SK que codificaba el origen (nucleótidos
7886-61 del genoma del VPH-11 en
sitio BAMH1 único) y cebadores flanqueantes del origen. El
radiomarcaje se incorporó en forma de [^{33}P]dCTP. El
tampón del ensayo de unión consistía en Tris 20 mM a pH 7,6; NaCl
100 mM; DTT 1 mmol y EDTA 1 mM.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Otros reactivos utilizados fueron: microesferas
de SPA con proteína A (tipo II, Amersham) y antisuero policlonal de
conejo K72, generado frente a un péptido que corresponde a los 14
aminoácidos del extremo C-terminal de E1 del
VPH-11. Siguiendo el protocolo de Amersham, se
mezcló un frasco de microesferas con 25 ml de tampón de ensayo de
unión. Para el ensayo se añadió una cantidad saturante de antisuero
K72 a las microesferas y la mezcla se incubó durante 1 h, se lavó
con un volumen de tampón de ensayo de unión y seguidamente se
resuspendió en el mismo volumen de tampón fresco de ensayo de unión.
Las reacciones de unión contenían 8 ng de E2, aproximadamente
100-200 ng de extracto nuclear que contenía E1 de
células infectadas por baculovirus (como se describe en WO 99/57283)
y 0,4 ng de sonda con radiomarcaje en un total de 80 \mul de
tampón de ensayo de unión. Transcurrida 1 h a temperatura ambiente,
se añadieron 25 \mul de suspensión de anti-cuerpo
K72 con microesferas SPA a la reacción de unión y se mezcló el
resultado. Después de una hora adicional de incubación a
temperatura ambiente, las reacciones se centrifugaron brevemente
para obtener un pellet de las microesferas y se determinó el alcance
de la formación de complejo mediante contaje por centelleo en un
Packard TopCount^{TM}. Generalmente la señal de las reacciones que
contenían E1 y E2 era 20-30 veces mayor que el ruido
de fondo observado cuando se omitía El, E2 o ambas proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ensayo mide la formación de un complejo
antígeno T de SV40 (Tag)-origen. El ensayo fue
desarrollado por McKay RDG (J Mol Biol. 1981; 145:
471-488). En principio, es muy similar al ensayo de
unión a DNA de E1 dependiente de E2 (Ejemplo 6), con TAg
sustituyendo a E1 y E2 y una sonda ori de SV40 con radiomarcaje en
lugar de la sonda ori del VPH. El ensayo se utiliza para contrastar
el ensayo del Ejemplo 6, dado que TAg comparte homología funcional
con E1 y E2, pero posee una similitud de secuencia muy baja.
La sonda de DNA radiomarcada que contiene la
secuencia ori se generó por PCR utilizando el plásmido pCH110
(Pharmacia) como molde. Este molde codifica el origen mínimo de
replicación de SV40 en los nucleótidos 7098-7023.
Los cebadores eran: "sv40-6958sens" =
5'-GCC CCT AAC TCC GCC CAT CCC GC (ID. de SEC. NÚM.
7) y "sv40-206anti" = 5'-ACC
AGA CCG CCA CGG CTT ACG GC (ID. de SEC. NÚM. 8). El producto de PCR
tenía una longitud aproximada de 370 pares de bases y se marcó con
isótopo radiactivo utilizando 50 \muCi/100 \mul de reacción de
PCR de dCTP (\alpha-^{33}P). A continuación de
la reacción de PCR se purificó el producto utilizando el equipo de
purificación de PCR de Qiagen® o un procedimiento de extracción de
fenol/precipitación de etanol. El producto purificado se diluyó a
1,5 ng/\mul (estimado mediante electroforesis en gel) en TE. Las
preparaciones nuevas tenían aproximadamente 150.000 cpm/\mul.
Las reacciones de unión se llevaron a cabo
mediante la mezcla de 30 \mul de solución TAg (100 ng/pocillo, 200
ng de una sonda de DNA con radiomarcaje de ^{33}P y 7,5 \mul de
10 x tampón de unión a DNA (Tris-HCl 200 mM a pH
7,6; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM) en un volumen final de 75
\mul. Se permitió que las reacciones de unión tuvieran lugar a
temperatura ambiente durante 60 min. El antígeno T mayor, adquirido
de Chimerix, a 2,0 mg/ml.
Los complejos de DNA y proteína se captaron
inmunológicamente utilizando un anticuerpo monoclonal
\alpha-TAg (PAb 101, subtipo IgG2a, hibridoma
obtenido de ATCC y anticuerpo purificado en el propio laboratorio)
unido a microesferas de SPA con proteína A.
La inmunoprecipitación de complejos
proteína-DNA se realizó durante 1 h a temperatura
ambiente. Las placas se centrifugaron por un breve espacio de
tiempo y se realizó el recuento de fragmentos precipitados de DNA
radiomarcado en un contador TopCount®.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 2 muestra un modelo de la estructura
cristalina de TAD de E2 del VPH-16 (Antson et
al. Nature. 2000; 403: 805-809). Una vista
aumentada de la región del bolsillo de unión de este modelo, como
se muestra en la figura 5, demuestra que los aminoácidos Y32, W33 y
L94 delimitan una cavidad que es demasiado pequeña para definir un
bolsillo adecuado que permita la unión de una pequeña molécula
inhibidora al mismo, sin ajustes comparables de las cadenas
laterales de los aminoácidos que puedan acoger al inhibidor.
Incluso cuando el dominio TAD de E2 del VPH11
correspondiente es cristalizado y modelizado, los aminoácidos
correspondientes de nuevo demuestran una cavidad demasiado pequeña
para definir cualquier tipo de bolsillo que pudiera contemplarse
como una diana adecuada para la unión de inhibidor (Figura 6A). Tal
como se muestra en la figura 6B, la presente invención muestra por
primera vez que la estructura cristalina del nuevo complejo
inhibidor del TAD de E2 proporciona un bolsillo nuevo e inesperado
de unión del inhibidor que constituye una herramienta única para
identificar inhibidores potenciales del proceso de replicación del
DNA del VPH.
Sorprendentemente, la estructura del complejo
inhibidor del TAD de E2 muestra que la unión del inhibidor L induce
un movimiento de la cadena lateral de la tirosina en posición 19
(Figura 7) allí donde el anillo aromático rota de forma
significativa hacia fuera de la pequeña cavidad observada en la
apoestructura, lo que da como resultado la formación de una cavidad
profunda. El movimiento de la cadena lateral de la tirosina en
posición 19 da una desviación rms para todos los átomos de 1,959
\ring{A}. Los expertos en la materia comprenderán que esta
desviación constituye un movimiento enorme, movimiento del que no
se podría haber predicho que hubiese ocurrido en solitario o en
presencia de un inhibidor de moléculas pequeñas.
Además, el anillo de imidazol de la histidina 32
rota 90 grados para acoger al inhibidor, pero aún sigue formando
parte de la cavidad profunda. El movimiento de la cadena principal
de la histidina 32 da una desviación rms para todos los átomos de
0,704 \ring{A}. No se podría haber predicho que tuviera lugar
ninguno de estos movimientos de rotación ni que dieran lugar a la
formación de esta cavidad profunda en el bolsillo de unión.
Como se muestra en la figura 6A, la cavidad
profunda viene definida por los aminoácidos histidina 32, triptófano
33 y leucina 94. El desplazamiento rmsd de "todos los átomos"
de estos tres residuos aminoacidicos es 0,5154 \ring{A}. No es
posible explicar este rms por la flexibilidad original de estos
tres residuos dentro del contexto del bolsillo de unión. De hecho,
una desviación rms de 1,0 \ring{A} se considera dentro de los
limites normales del contexto de una proteína completa de 200
aminoácidos. En el presente caso, la variación de rms para todos los
átomos de H32, W33 y L94 entre apo E2TAD del VPH-16
de Antson supra y apo E2TAD del VPH-11 del
Solicitante es 0,212 \ring{A}. Esto define el limite (superior)
predecible dentro del cual estos 3 residuos pueden moverse a la vez.
La presente invención se encuentra fuera del margen de movimiento
predecible para estos tres residuos.
La serina 98 no se encuentra en el mismo plano
que H32, W33 y L94 y forma parte de una porción menos profunda que
también se puede utilizar para generar modelos de un bolsillo mayor
que contenga una cavidad profunda formada por la H32, W33 y L94 y
una cavidad poco profunda definida por uno o más aminoácidos
seleccionados de: L15, 136, E39, K68, N71, A72, S98 e Y99 (véase la
Figura 8).
La Figura 9 contiene la lista de las coordenadas
de rayos X del complejo proteína-inhibidor que
pueden utilizarse para modelizar. De estas coordenadas se puede
inferir el hecho de que el complejo obtenido por el Solicitante
contiene dos moléculas de inhibidor; sin embargo el modelo mostró
que el segundo inhibidor se encuentra fuera de la cavidad profunda
y no interacciona con la proteína de forma significativa. Asimismo,
los siguientes aminoácidos están modelados como Alanina debido a su
elevada flexibilidad que les hace invisibles a los rayos X: E2,
K107, K173, S180, M182, H183 y P196.
De acuerdo con Harris & Botchan (Science.
1999; 284(5420); 1673), diversas proteínas E2 tienen de media
solamente el 30% de identidad de secuencia aminoacídica. Sin
embargo, el análisis mutacional sugiere que diversos TAD de E2
comparten un pliegue y un mecanismo de acción comunes. Siguiendo
con este argumento, los grupos de aminoácidos que definen el
bolsillo de unión del inhibidor identificado por el Solicitante
poseen una cantidad sorprendente de identidad/similitud, incluso
entre VPH de bajo y de elevado riesgo (Figura 10). El primer grupo
identificado contiene la cadena lateral del aminoácido Y19 que se
aleja de la región del bolsillo abriendo de esta forma la cavidad
profunda. Este aminoácido se encuentra altamente conservado entre
diversos tipos del VPH, presentando una identidad del 100% entre
VPH-6, 11, 16 y 18. El segundo grupo contiene la
histidina 32 y el triptófano 33 que definen la cavidad profunda del
bolsillo. La histidina 32 es idéntica en VPH-6 y
VPH—11 y presenta una fuerte similitud entre VPH de bajo y alto
riesgo, mientras que el triptófano 33 es 100% idéntico en los cuatro
tipos. Finalmente, el cuarto grupo contiene la Leucina 94 que
también define la cavidad profunda del bolsillo y se encuentra
conservada en un 100% en los 4 tipos del VPH.
Al definir la parte inferior de la cavidad
profunda, H29 es idéntico en VPH-6, 11 y 16 y es
similar en VPH-18. De igual forma, T97 es idéntico
en VPH-6, 11 y 18 y es similar en
VPH-16.
Si definimos la cavidad poco profunda del
bolsillo, el aminoácido L15 forma parte del primer grupo
identificado y es muy similar en los VPH de riesgo bajo o alto. En
el segundo grupo, 136 también es muy elevado mientras que E39 está
muy conservado en los 4 tipos. Se identifica un tercer grupo que
bordea la cavidad poco profunda del bolsillo de unión en el que K68
y N72 se encuentran altamente conservados en los diversos tipos.
Finalmente, N71 es idéntico en VPH-6 y 11 y es
similar a lo tipos de alto riesgo. El bolsillo poco profundo también
contiene aminoácidos del cuarto grupo como son S98 e Y99 que también
son muy similares en los diferentes tipos del VPH.
El elevado grado de identidad/similitud indica
que este bolsillo definido según el TAD de E2 del
VPH-11 de la invención también se encontrará en
otros tipos del VPH, tanto de bajo riesgo como de alto. Es de
suponer que los inhibidores que se unan a este bolsillo,
particularmente a la cavidad profunda, diseñados utilizando los
datos de la Figura 9 tienen una elevada probabilidad de
unirse/inhibir la proteína E2 de una amplia variedad de virus del
papiloma.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADA)
LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COCRISTALIZACIÓN DEL DOMINIO DE
TRANSACTIVACIÓN DE E2 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO/INHIBIDOR y
COORDENADAS DE RAYOS X QUE DEFINEN EL BOLSILLO DE UNIÓN DEL
INHIBIDOR
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 13/100
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/304 412
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> IDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH18
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (6)
1. El uso de las coordenadas atómicas de H32,
W33 y L94 como se define en la Figura 9 para identificar un
inhibidor potencial de una molécula que comprende un bolsillo de
unión de tipo TAD de E2 del VPH que comprende los pasos de:
a) el uso de las coordenadas atómicas de H32,
W33 y L94 como se define en la Figura 9 para generar una estructura
tridimensional de la molécula que comprende un bolsillo de unión de
tipo TAD de E2;
b) emplear dicha estructura 3-D
para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;
c) sintetizar dicho inhibidor;
d) poner en contacto dicho inhibidor con dicha
molécula para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial
para interaccionar con dicha molécula.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que se utiliza en (a) las coordenadas atómicas de H29, H32, W33,
L94 y T97 como se define en la Figura 9.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en
el que se utiliza en (a) las coordenadas atómicas de L15, H29, H32,
W33, 136, E39, K68, N71, A72, L94 y T97 como se define en la Figura
9.
4. Un método para evaluar el potencial de una
entidad química para asociarse con una molécula o complejo que
comprende una cavidad profunda definida por las coordenadas de la
estructura de los aminoácidos H32, W33 y L94 del TAD de E2 del VPH
11 de acuerdo con la Figura 9 o un modelo tridimensional del mismo
que comprende los pasos:
i) emplear medios computacionales para realizar
una operación de ajuste entre la entidad química y una molécula o
complejo que comprende un bolsillo de unión definido por las
coordenadas de la estructura de los aminoácidos H32, W33 y L94 del
TAD de E2 del VPH 11 como se define en la Figura 9;
ii) analizar los resultados de dicha operación
de ajuste para evaluar la asociación entre la entidad química y el
bolsillo de unión VPH.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4
en el que se utiliza la molécula o complejo molecular que comprende
un bolsillo de unión definido por las coordenadas de la estructura
de los aminoácidos H29, H32, W33, L94 y T97 como se define en la
Figura 9.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4
en el que se utiliza la molécula o complejo molecular que comprende
un bolsillo de unión definido por las coordenadas de la estructura
de los aminoácidos L15, H29, H32, W33, 136, E39, K68, N71, A72, L94
y T97 como se define en la Figura 9.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US30441201P | 2001-07-12 | 2001-07-12 | |
US304412 | 2001-07-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2342309T3 true ES2342309T3 (es) | 2010-07-05 |
Family
ID=23176405
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES02745024T Expired - Lifetime ES2274051T3 (es) | 2001-07-12 | 2002-07-12 | Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bosillo de union del inhibidor. |
ES06012247T Expired - Lifetime ES2342309T3 (es) | 2001-07-12 | 2002-07-12 | Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bolsillo de union del inhibidor. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES02745024T Expired - Lifetime ES2274051T3 (es) | 2001-07-12 | 2002-07-12 | Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bosillo de union del inhibidor. |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7167801B2 (es) |
EP (2) | EP1409525B1 (es) |
JP (1) | JP4602665B2 (es) |
AT (2) | ATE343588T1 (es) |
AU (1) | AU2002317122B2 (es) |
CA (1) | CA2448482C (es) |
DE (2) | DE60215658T2 (es) |
DK (2) | DK1409525T3 (es) |
ES (2) | ES2274051T3 (es) |
HU (1) | HUP0402069A3 (es) |
IL (2) | IL159150A0 (es) |
MX (1) | MXPA04000271A (es) |
NZ (1) | NZ531068A (es) |
WO (1) | WO2003006495A2 (es) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2565308A1 (en) * | 2003-05-06 | 2004-11-25 | New Century Pharmaceuticals | Albumin binding sites for evaluating drug interactions and methods of evaluating or designing drugs based on their albumin binding properties |
ATE447610T1 (de) * | 2003-05-26 | 2009-11-15 | Biotie Therapies Corp | Kristalliner vap-1 und verwendung |
EP1684705A4 (en) * | 2003-11-03 | 2008-02-20 | New Century Pharmaceuticals | ALBUMIN BINDING FACILITIES FOR THE EVALUATION OF MEDICAMENTAL INTERACTION EFFECTS AND METHOD FOR ASSESSING OR DESIGNING MEDICAMENT BASED ON THEIR ALBUMIN BONDING PROPERTIES |
US20090118301A1 (en) * | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Arbor Vita Corporation | Compositions and Methods for Treating Cancer |
CN112891520A (zh) * | 2021-04-13 | 2021-06-04 | 吉林省国大生物工程有限公司 | 一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(hpv)的活性生物蛋白的制备方法 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07500245A (ja) * | 1991-10-11 | 1995-01-12 | カイロン コーポレーション | パピローマウイルスの複製の阻害剤を同定する方法および組成物 |
HUP0101396A3 (en) | 1998-05-01 | 2006-03-28 | Boehringer Ingelheim Ca Ltd | Preparation of human papillomavirus e1 having helicase activity and method therefor |
ATE235509T1 (de) | 1998-06-30 | 2003-04-15 | Deutsches Krebsforsch | Peptide zur inhibition von hpv e7 proteinen |
WO2000075182A1 (fr) * | 1999-06-04 | 2000-12-14 | Akira Kaji | Cristal de proteine du facteur de recyclage ribosomique (rrf) et son application sur la base de donnees de structure tridimensionnelles provenant du cristal |
GB9921938D0 (en) | 1999-09-17 | 1999-11-17 | Univ York | Target for antiviral therapy |
CA2389569A1 (en) * | 1999-11-16 | 2001-05-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Crystallizable compositions comprising a caspase-7 |
ATE357447T1 (de) | 2000-12-18 | 2007-04-15 | Boehringer Ingelheim Ca Ltd | Inhibitoren des papilloma-virus |
-
2002
- 2002-07-11 US US10/193,460 patent/US7167801B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 DE DE60215658T patent/DE60215658T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 ES ES02745024T patent/ES2274051T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 IL IL15915002A patent/IL159150A0/xx unknown
- 2002-07-12 ES ES06012247T patent/ES2342309T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 AU AU2002317122A patent/AU2002317122B2/en not_active Ceased
- 2002-07-12 DE DE60236114T patent/DE60236114D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 EP EP02745024A patent/EP1409525B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 CA CA2448482A patent/CA2448482C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 NZ NZ531068A patent/NZ531068A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-07-12 JP JP2003512265A patent/JP4602665B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-12 EP EP06012247A patent/EP1695980B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-12 DK DK02745024T patent/DK1409525T3/da active
- 2002-07-12 AT AT02745024T patent/ATE343588T1/de active
- 2002-07-12 AT AT06012247T patent/ATE465414T1/de active
- 2002-07-12 DK DK06012247.0T patent/DK1695980T3/da active
- 2002-07-12 HU HU0402069A patent/HUP0402069A3/hu unknown
- 2002-07-12 WO PCT/CA2002/001058 patent/WO2003006495A2/en active IP Right Grant
- 2002-07-12 MX MXPA04000271A patent/MXPA04000271A/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-12-02 IL IL159150A patent/IL159150A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE60215658T2 (de) | 2007-12-27 |
MXPA04000271A (es) | 2005-03-07 |
US7167801B2 (en) | 2007-01-23 |
ES2274051T3 (es) | 2007-05-16 |
DK1695980T3 (da) | 2010-08-02 |
JP4602665B2 (ja) | 2010-12-22 |
ATE343588T1 (de) | 2006-11-15 |
CA2448482A1 (en) | 2003-01-23 |
EP1695980B1 (en) | 2010-04-21 |
EP1695980A3 (en) | 2006-09-06 |
IL159150A (en) | 2009-09-01 |
HUP0402069A2 (hu) | 2005-01-28 |
CA2448482C (en) | 2011-12-06 |
EP1409525B1 (en) | 2006-10-25 |
IL159150A0 (en) | 2004-06-01 |
US20030082769A1 (en) | 2003-05-01 |
DK1409525T3 (da) | 2007-02-05 |
HUP0402069A3 (en) | 2012-09-28 |
JP2005512954A (ja) | 2005-05-12 |
NZ531068A (en) | 2006-06-30 |
DE60215658D1 (de) | 2006-12-07 |
WO2003006495A2 (en) | 2003-01-23 |
EP1409525A2 (en) | 2004-04-21 |
EP1695980A2 (en) | 2006-08-30 |
DE60236114D1 (de) | 2010-06-02 |
AU2002317122B2 (en) | 2007-03-15 |
WO2003006495A3 (en) | 2003-07-31 |
ATE465414T1 (de) | 2010-05-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Surleraux et al. | Design of HIV-1 protease inhibitors active on multidrug-resistant virus | |
JP2005517183A6 (ja) | Hpvのインヒビターを同定するためのe2置換アッセイ | |
JP2005517183A (ja) | Hpvのインヒビターを同定するためのe2置換アッセイ | |
JP2008526777A (ja) | ユビキチンリガーゼインヒビター | |
Yurtsever et al. | The crystal structure of phosphorylated MAPK13 reveals common structural features and differences in p38 MAPK family activation | |
ES2342309T3 (es) | Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bolsillo de union del inhibidor. | |
Schulze et al. | Crystal structure of a non-discriminating glutamyl-tRNA synthetase | |
Xue et al. | Disordered interactome of human papillomavirus | |
US20180044649A1 (en) | Influenza a 2009 pandemic h1n1 polypeptide fragments comprising endonuclease activity and their use | |
CA2526506A1 (en) | Inhibitors of papilloma virus | |
Illiano et al. | Production of functional, stable, unmutated recombinant human papillomavirus E6 oncoprotein: Implications for HPV-tumor diagnosis and therapy | |
AU2002317122A1 (en) | Human papillomavirus E2 transactivation domain/inhibitor co-crystal and x-ray coordinates defining the inhibitor-binding pocket | |
JP2005512954A6 (ja) | ヒトパピローマウイルスe2トランスアクチベーションドメイン/インヒビター共結晶および前記インヒビター結合ポケットの境界を定めるx線座標 | |
Yamamoto et al. | Crystallization and preliminary X-ray study of the cathepsin B complexed with CA074, a selective inhibitor | |
Bryan et al. | The human papillomavirus type 11 E1∧ E4 protein is phosphorylated in genital epithelium | |
JP2004535377A (ja) | Metap2を阻害する方法 | |
JP4430821B2 (ja) | E1オリゴマー化に関係するパピローマウイルスe1ヘリカーゼの領域 | |
Finer-Moore et al. | The structure of Cryptococcus neoformans thymidylate synthase suggests strategies for using target dynamics for species-specific inhibition | |
US7590494B1 (en) | Drug design based on the structure of LTA4 hydrolase | |
CA2342858A1 (en) | Method of screening compounds useful in the treatment of a desease caused by or exacerbated by mpv | |
Kathman | Inhibitors of the Ubiquitin Ligase Nedd4-1 Discovered by Covalent Fragment Screening | |
Kamionka | Structural Investigations on Proteins Involved in Cancer Development | |
US20040106119A1 (en) | Crystal structure of the mouse apoptosis-inducing factor AIF and applications of such structural data to structure-based identification, screening, or design of AIF agonists or antagonists as well as AIF fragments, mutants or variants | |
Nelson | Nuclear import pathways for HPV* L1 major capsid proteins of human papillomaviruses | |
O'Donnell | The synthesis and evaluation of novel specific calmodulin antagonists |