ES2274051T3 - Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bosillo de union del inhibidor. - Google Patents

Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bosillo de union del inhibidor. Download PDF

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Abstract

Un cristal que contiene un polipéptido de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NeM. 2 en complejo con un inhibidor L: (Ver fórmula)

Description

Cocristalización del dominio de transactivación E2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos X que definen el bolsillo de unión del inhibidor.
Campo de la invención
La invención esta relacionada con la proteína E2 del virus del papiloma humano, concretamente la estructura cristalina del dominio de transactivación de la proteína E2 del virus del papiloma humano 11 (VPH-11) que forma un complejo con un inhibidor. En particular, la invención proporciona coordenadas de la estructura cristalina que definen un bolsillo de unión del inhibidor y proporciona un modelo estructural tridimensional mediante el que se pueden identificar inhibidores potenciales que encajarían en este bolsillo. También se describen métodos para facilitar el diseño y la selección de inhibidores de la actividad de la proteína E2 implicada en la replicación de DNA de papilomavirus, en concreto del papilomavirus humano.
Antecedentes de la invención
Los papilomavirus (PV) son virus de DNA sin envoltura que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio. Estos virus están muy extendidos en la naturaleza y se han reconocido en vertebrados superiores. Se han caracterizado virus en humanos, ganado vacuno, conejos, caballos y perros, entre otros. El primer papilomavirus descrito fue el papilomavirus del conejo común (CRPV), descrito en 1933. Desde entonces, el papilomavirus del conejo común (CRPV) y el papilomavirus bovino tipo 1 (BPV-1) han sido utilizados como prototipos experimentales para estudios sobre los papilomavirus. La mayor parte de los papilomavirus animales están asociados a lesiones proliferativas exclusivamente epiteliales y la mayoría de las lesiones en animales son cutáneas. En los humanos existen más de 75 tipos de papilomavirus (VPH) identificados que se han catalogado en función de la localización de la infección: epitelio cutáneo, epitelio de las mucosas (oral y genital). Las enfermedades relacionadas con la piel incluyen verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con las mucosas incluyen papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los carcinomas cervicales (Fields. Virology. 3rd ed. Philadelphia, NY: Lippincott - Raven Pub.; 1996).
Existen más de 25 tipos de VPH implicados en las enfermedades anogenitales; estos se agrupan en tipos de "alto riesgo" o de "bajo riesgo". Los tipos de bajo riesgo incluyen el VPH tipo 6 y el tipo 11, que inducen lesiones mayormente benignas como las condyloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (SIL). En Estados Unidos hay unos 5 millones de personas afectadas de verrugas genitales de las que el 90% se atribuye a VPH-6 y VPH-11.
Los tipos de alto riesgo están asociados a SIL de alto grado y cáncer cervical, y mayormente incluyen los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 52 de VPH. La progresión desde una SIL de bajo grado a una de alto grado es mucho más frecuente en el caso de lesiones que contienen VPH-16 y 18 de elevado riesgo en comparación con aquellas que contienen tipos de VPH de bajo riesgo. Además, en el cáncer cervical solamente cuatro tipos de VPH se detectan con frecuencia (los tipos 16, 18, 31 y 45). A escala mundial se diagnostican anualmente cerca de 500.000 casos nuevos de cáncer de cérvix invasivo (Fields, 1996, supra).
El tratamiento para las verrugas genitales incluye la eliminación física como es la crioterapia, el láser de CO_{2}, la electrocirugía o la extirpación quirúrgica. También cabe la posibilidad de utilizar agentes citotóxicos como el ácido tricloroacético (ATC), la podofilina o el podofilox. También se dispone de agentes inmunomoduladores como Interferón o Imiquimod (Aldara®, 3M Pharmaceuticals). Estos tratamientos no son completamente efectivos en la eliminación de la totalidad de las partículas víricas y conllevan tanto un elevado coste como unos efectos secundarios desagradables. Además las verrugas recurrentes son comunes (Beutner & Ferenczy. Amer J Med. 1997; 102(5A):28-37).
La ineficacia de los métodos actuales de tratamiento de las infecciones por VPH ha puesto de manifiesto la necesidad de identificar nuevos sistemas de control o eliminación de estas infecciones. En los últimos años se ha dedicado mucho esfuerzo a encontrar compuestos antivirales y, en especial, compuestos con capacidad para interferir en la replicación vírica (Hughes y Romanos. Nucleic Acids Res. 1993; 21:5817-5823; Clark, et al. Antiviral Res. 1998; 37(2):97-106; Hajduk, et al. J Med Chem. 1997; 49(20):3144-3150 y Cowsert, et al. Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37(2):171-177). Por esta razón, ha adquirido importancia el estudio de la genética de los VPH con el fin de identificar posibles dianas quimioterapéuticas que contengan y posiblemente eliminen cualquier enfermedad causada por una infección de VPH.
El ciclo de vida de PV se encuentra estrechamente relacionado con la diferenciación de los queratinocitos. Se piensa que la infección tiene lugar en un lugar de interrupción hística del epitelio basal. A diferencia de lo que sucede con células normales, la división celular continúa a medida que la célula experimenta una diferenciación vertical. Mientras las células infectadas sufren una diferenciación progresiva, la maquinaria de replicación celular se mantiene lo que permite el aumento de la replicación de DNA vírico, situación que finalmente dará lugar a una expresión génica tardía y a un ensamblaje de viriones en queratinocitos con diferenciación terminal, y a la liberación de partículas víricas (Fields, supra).
La cadena codificante de cada uno de los genomas del papilomavirus contiene aproximadamente diez marcos abiertos de lectura (ORF) designados para traducción que se han clasificado en ORF tempranos u ORF tardíos. Los genes de E1 a E8 se expresan al principio del ciclo de replicación vírica. Los dos genes tardíos (L1 y L2) codifican las proteínas de cápside mayor y menor, respectivamente. Los productos de los genes E1 y E2 intervienen en la replicación de DNA vírico mientras que E5, E6 y E7 modulan la proliferación de las células huésped. Las funciones de los productos de los genes E3, E4 y E8 actualmente se desconocen.
Hay estudios sobre el VPH que han demostrado que las proteínas E1 y E2 son las únicas proteínas víricas necesarias para la replicación de DNA vírico (Kuo, et al. J Biol Chem. 1994; 30:24058-24065). Este requisito es similar al del virus del papiloma bovino tipo 1 (BPV-1). De hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV), sin importar la especie o el tipo vírico (Kuo, et al. 1994, supra).
Cuando la replicación de DNA vírico tiene lugar in vitro, en la que la proteína E1 está presente en exceso, la replicación puede continuar en ausencia de E2. In vivo, en presencia de una cantidad enorme de DNA, la replicación requiere de la presencia tanto de E1 como de E2. Se piensa que el mecanismo de iniciación de la replicación in vivo implica la unión conjunta de E1 y E2 al origen, lo que conduce a la constitución de un complejo terciario de proteína y DNA (Mohr, et al. Science. 1990; 250:1694-1699). La proteína E2 es un activador transcripcional que se une a la proteína E1 y debido a esto potencia la unión de E1 al origen de replicación de BVP (Seo, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993b; 90:2865-2869). De esta forma, E2 actúa como un factor de especificidad cuando dirige a E1 hacia el origen de replicación (Sedman y Stenlund. Embo J. 1995; 14:6218-6228). En el caso del VPH, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 a la secuencia ori (J Biol Chem. 1995; 270(45):27283-27291 y McBride et al. J Biol Chem. 1991; 266:18411-18414). Estas interacciones de DNA con proteína y proteína con proteína se dan en el origen de la replicación de DNA (Sverdrup y Myers, supra).
Las proteínas E2 de \sim45 kD descritas en numerosos serotipos animales y humanos comparten una organización común en dos dominios. El dominio de transactivación (TAD) N-terminal tiene una longitud de unos 220 aminoácidos y el dominio de unión a DNA (DBD) C-terminal de 100 aminoácidos. Los dos dominios están unidos por una región enlazante flexible.
E2 activa la replicación vírica a través de la unión conjunta con la proteína iniciadora vírica E1 al origen de la replicación de DNA, dando como resultado al final, hexámeros de E1 funcionales. E2 también es un regulador central de la transcripción vírica. Interactúa con factores de transcripción basal, como la proteína de unión a TATA, TFIIIB y TAF_{II}70 humana; con proteína promotora proximal de unión como Sp1; y con otros factores celulares como AMF-1, que afectan de forma positiva a la activación transcripcional de E2.
Sin embargo, resulta más ambiguo discernir cuáles de estas muchas interacciones son suficientes o necesarias para conseguir la activación transcripcional. Estos detalles concuerdan con la idea de que las proteínas activadoras de unión funcionan como activadores transcripcionales al utilizar contactos específicos proteína-proteína para enlazar componentes de la maquinaria general de transcripción a un promotor, con la finalidad de reclutar a la RNA polimerasa II. Una tercera función de E2 es la de facilitar la segregación correcta de DNA vírico. El genoma del virus del papiloma bovino (BVP) y la proteína E2 colocalizan con los cromosomas de la célula huésped durante la mitosis, dependiendo de un TAD intacto de E2.
El DBD de E2 se dimeriza para formar un barril \beta con hélices flanqueantes de reconocimiento situadas en las principales cavidades del bolsillo de unión de DNA. Por el contrario, la estructura del TAD de E2 no se ha conocido hasta que Harris y Botchan (Science. 1999; 284(5420):1673) proporcionaron un primer modelo de un fragmento proteolítico del TAD de E2 de VPH-18 mediante cristalografía de rayos X. El modelo sugiere una proteína con forma de anacardo de 55 \ring{A} x 40 \ring{A} x 30 \ring{A} con una hendidura cóncava en un lado de la proteína y crestas en la superficie opuesta. Harris y Botchan estudiaron si superficies discretas estaban correlacionadas con actividades de E2 conocidas y en particular identificaron una agrupación prominente de residuos que formaban el borde interno de la cavidad principal que engloba a E175, L178, Y179 y 173 que define una superficie característica importante para la transcripción.
Antson, et al. (Nature. 2000; (403)805-809) describen la estructura cristalina del TAD completo de E2 del VPH-16, incluyendo una segunda interacción putativa recientemente identificada entre E2 y TAD de E2 que contiene una agrupación de 7 residuos conservados (R37, A69, I73, E76, L77, T81 y Q80). Anston, et al. sugirieron que Q12 y E39 pueden estar implicadas en la interacción con E1.
La proteína E2 se considera una diana potencial para agentes antivirales. Sin embargo, los esfuerzos realizados en el descubrimiento de fármacos dirigidos hacia E2 se han visto obstaculizados por la falta de información estructural de una E2 unida a un inhibidor formando un complejo. Ni el modelo de Harris ni el de Antson proporcionan ninguna información respecto a la localización o la caracterización de un posible bolsillo de unión del inhibidor. La información estructural del dominio TAD de apo E2 ha generado cierto conocimiento muy útil de la superficie de la apoproteína, pero ahora parece claro que esto no es representativo de los cambios de conformación inducidos al unirse a un inhibidor.
La falta de inhibidores específicos de E2, que son necesarios para la obtención de la cocristalización de E2 y los inhibidores, ha obstaculizado la búsqueda de un bolsillo de unión del inhibidor en E2. Por tanto, el análisis cristalográfico por difracción de rayos X de un complejo inhibidor-proteína de este tipo no ha sido posible.
\newpage
La presente invención hace referencia a una serie de documentos cuyo contenido se incorporan aquí mediante referencias.
Resumen de la invención
La presente invención resuelve los problemas que trabajos anteriores habían dejado sin resolver proporcionando una nueva composición que contiene un dominio de transactivación de la proteína E2 del virus del papiloma humano en forma de complejo con una pequeña molécula inhibidora de E2, y métodos para fabricar esta composición. De forma ventajosa, la presente invención proporciona también un complejo E2-inhibidor capaz de ser cristalizado y analizado por difracción de rayos X, y así proporcionar información importante acerca del bolsillo de unión del inhibidor del dominio de transactivación de la proteína E2 de VPH. El inhibidor constituye una herramienta inmejorable para producir una cocristalización y permitir así la caracterización de un bolsillo de unión del inhibidor previamente desconocido que puede estar interactuando con E1 durante el ciclo de replicación de VPH.
También se describe un método de determinación de al menos una porción de la estructura tridimensional de moléculas o complejos moleculares, que contiene al menos algunas características similares en estructura a un bolsillo de unión del inhibidor de E2 del VPH.
Se describe, además, un modelo 3-D de análisis y predicción de la unión de inhibidores potenciales para así facilitar la búsqueda de nuevos inhibidores que se puedan unir al bolsillo de unión identificado. La localización y caracterización de este bolsillo de unión, como se describe en la presente invención, proporciona una posible diana terapéutica nueva en el tratamiento de infecciones por PV.
Otro método que se describe es un cribado para identificar agentes que tengan la capacidad de modular esta nueva diana, y un sistema para seleccionar al menos uno de estos agentes capaz de impedir la replicación del DNA de PV.
También se describe un método de producción de un fármaco que inhibe la interacción entre E1 y E2, que comprende la identificación o el diseño de un fármaco que encaje en el bolsillo de unión del modo aquí descrito.
De acuerdo con el primer aspecto de la invención, se proporciona un cristal que contiene un polipéptido de tipo PV E2 TAD con ID. de SEC. Núm. 2, que forma un complejo con un inhibidor L:
1
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un método de producción de un polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un inhibidor L, antes definido, que comprende:
a) la mezcla del polipéptido de tipo PV E2 TAD purificado, contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L solubilizado para generar un solución compleja que contenga dicho complejo PV E2 TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en un tampón de cristalización.
Otro método que aquí se describe consiste en producir un polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado con ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un inhibidor L, que comprende la mezcla de polipéptido de tipo PV E2 TAD con ID. de SEC. Núm. 2, contenido en un tampón de purificación, con un tampón de cristalización.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un inhibidor L (PV E2 TAD-L), antes definido, que comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en un tampón de cristalización y
b) la inmersión del polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 anteriormente definido en a).
También se describen unas coordenadas de la estructura cristalina de rayos X del complejo PV E2 TAD-inhibidor (PV E2 TAD-L) definido anteriormente.
Se describe además un medio de almacenamiento de datos de lectura informática que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas de estructura cristalina de rayos X, o al menos una porción de las coordenadas estructurales, expuestas en la Figura 9.
Por otro lado, se describe también un ordenador que genera una representación tridimensional de dicho complejo PV E2 TAD-L aquí definido, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de lectura informática que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con dichas coordenadas estructurales expuestas en la Figura 9;
b) una memoria destinada al almacenamiento de instrucciones para el procesamiento de los datos de lectura informática mencionados;
c) una unidad central de proceso acoplada a dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática para el procesado de dichos datos y generar la representación tridimensional mencionada; y
d) un monitor acoplado a la unidad central de proceso para mostrar dicha representación tridimensional.
También se describe un método para la producción de una proteína E2, siendo dicha proteína de utilidad en la identificación o caracterización de inhibidores de TAD de E2, que comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina de VPH E2 TAD-L aquí definida para identificar residuos de VPH del bolsillo de unión del inhibidor;
b) la comparación de estos residuos de VPH del bolsillo de unión del inhibidor con residuos análogos en otra E2 de PV;
c) la mutación de estos otros residuos de PV en dichos residuos de VPH para producir un híbrido; y
d) someter a ensayo la inhibición de dicho híbrido con un inhibidor.
Breve descripción de las figuras
Una vez descrita la invención de forma general, pasamos a referirnos a las imágenes anexas, mostrando mediante ilustración una realización preferida de la misma en la que:
la Figura 1A representa la secuencia aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 1) obtenida por Sakai, et al. J Virol. 1996; 70:1602-11;
la Figura 1B representa la secuencia aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 2) obtenida según el procedimiento del Ejemplo 1;
la Figura 2 representa diagramas estereográficos en cintas de la apo E2 del VPH-16 como los descritos en Antson, et al. (supra);
la Figura 3 representa diagramas estereográficos en cintas de la apo E2 del VPH-11 generadas por el Solicitante;
la Figura 4 representa diagramas de lazos de la E2 del VPH-11 en complejo con el compuesto L aquí descrito;
la Figura 5 constituye una representación de la superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del inhibidor del TAD de apo E2 del VPH-16 (Antson, et al. supra);
la Figura 6A constituye una representación de la superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del inhibidor de la apo E2 del VPH-11 producida por el Solicitante;
la Figura 6B constituye una representación de la superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del inhibidor del co-cristal;
la Figura 7 muestra una representación esquemática del movimiento de Y19 y H32 que tiene lugar en el bolsillo de unión al unirse con un inhibidor;
\newpage
la Figura 8 representa una visión superior de la superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión que muestra en especial una cavidad profunda y una cavidad poco profunda;
la Figura 9 muestra una lista de las coordenadas de la estructura atómica del TAD de E2 en complejo con el compuesto L generadas mediante difracción de rayos X a partir del complejo cocristalizado (a partir de ahora referido como VPH TAD E2-L). La preparación del complejo se describe en el Ejemplo 3. Los siguientes términos tienen estos significados: el término A.A. se refiere al aminoácido identificado por cada coordenada; en esta columna, el término "CPR" significa cis-prolina; BLHA = primera molécula del inhibidor L y BLHB = segunda molécula del inhibidor L. Falta la información acerca de los aminoácidos 197 y 201 de la cadena A debido a la elevada flexibilidad de estos residuos que les confiere la facultad de ser invisibles a los rayos X. Por esta misma razón, los siguientes aminoácidos se modelan como Alanina: E2, K107, K173, S180, M182, H183 y P196. "X, Y, Z" definen cristalográficamente la posición atómica determinada para cada átomo en un espacio de coordenadas cartesianas. "Occ." es un factor de ocupación que hace referencia a la fracción de las moléculas en la que cada átomo ocupa la posición especificada por las coordenadas. Un valor de "1" indica que cada átomo tiene la misma conformación, p. ej. la misma posición, en todas las moléculas del cristal. "B" es un factor térmico que mide el movimiento del átomo alrededor de su centro atómico. Las coordenadas de los residuos que forman la cavidad profunda se muestran en negrita; y
la Figura 10 representa la alineación de los grupos de secuencias aminoacídicas que definen de forma general la región del bolsillo de unión del inhibidor del dominio de transactivación de E2 de VPH-6A, VPH-11, VPH-16 y VPH-18. Los residuos que están en negrita indican que definen la cavidad profunda del bolsillo de unión del inhibidor. El subrayado único define los residuos del fondo del bolsillo profundo. El doble subrayado indica los residuos del bolsillo poco profundo. Y19 está indicado en cursiva.
Descripción detallada de la invención Definiciones
Las siguientes abreviaciones se utilizan a lo largo de la especificación.
El término "en asociación con" o "de unión a" se refiere a una condición de proximidad entre entidades químicas o compuestos, o porciones de los mismos. La asociación puede ser no covalente, en la que la yuxtaposición está favorecida en cuanto a la energía por enlaces de hidrógeno o interacciones de van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente.
El término "bolsillo de unión", tal como se utiliza aquí, hace referencia a una región de una molécula o complejo molecular que, gracias a su forma, se asocia de forma ventajosa con otra molécula, complejo molecular, entidad química o compuesto. Tal como aquí se emplea, el bolsillo comprende al menos una cavidad profunda y, opcionalmente una cavidad poco profunda.
Tal como aquí se utiliza, el término "complejo" se refiere a la combinación de una molécula o una proteína, de análogos conservativos o truncaciones de los mismos, asociados con una entidad química.
Las abreviaturas de los aminoácidos utilizados en esta solicitud se disponen de la siguiente manera:
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(Tabla pasa a página siguiente)
2 
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El término "análogo" del modo aquí empleado y en el contexto de esta invención denota una secuencia aminoacídica que retiene una actividad biológica (o funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Este análogo puede ser de la misma especie o no y puede ser un análogo natural o estar preparado de forma sintética. Estos análogos incluyen secuencias aminoacídicas con sustituciones, deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos, siempre y cuando se conserve la actividad biológica de la proteína. En concreto, el término "análogo conservativo" denota un análogo con un aminoácido sustituido por otro aminoácido con una fuerte o débil similitud (véase, por ejemplo, Dayhoff MO. Atlas of Protein Sequence and Structure. Washington DC, National Biomedical Research Foundation; 1978; 5 Suppl 3.) como se define en la Tabla que aparece a continuación:
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Tabla de similitud de aminoácidos
3
El término "cadena lateral" en referencia a un aminoácido o un residuo de aminoácido significa un grupo unido al átomo de carbono \alpha del aminoácido \alpha. Por ejemplo, la cadena lateral del grupo R para la glicina es hidrógeno, para alanina es metilo o para valina es isopropilo. Para los grupos R específicos o cadenas laterales de los aminoácidos \alpha se hace referencia al texto de A.L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el capítulo 4).
El término "truncación" hace referencia a cualquier segmento de la secuencia aminoacídica de TAD de E2, o de cualquier segmento de cualquiera de los análogos descritos aquí anteriormente, que comprende los suficientes aminoácidos para definir la cavidad profunda del bolsillo de unión del inhibidor de la presente invención en la misma relación espacial que la definida por las coordenadas de la Figura 9.
El término "desviación media cuadrática" o "desviación rms" o "rmsd" significa la raíz cuadrada de la media aritmética del cuadrado de las desviaciones de la media. En el contexto de objetos atómicos, los números se proporcionan en angstroms (\ring{A}). Consiste en una manera de expresar la desviación o variación respecto a una pauta o un objeto. En el caso de la presente invención, todas las comparaciones de rmsd se obtuvieron comparando estructuras que se habían superpuesto utilizando solamente los átomos de la cadena principal de H32, W33 y L94 con el mínimo solapamiento de rms. Esto se realizó exclusivamente mediante movimiento de cuerpos rígidos. La rmsd de los átomos de cadena principal para esta acción entre la estructura apo en cuestión y el complejo aquí descrito es de 0,078 \ring{A}.
Realizaciones preferidas 1. Composición
De acuerdo con una primera realización, se proporciona un cristal que contiene un polipéptido de tipo VPH E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2 en complejo con un inhibidor L:
5
Se prefiere que la composición contenga los aminoácidos 1 a 220 de la proteína E2 del VPH (ID. de SEC. Núm. 1) definida según la numeración de Swiss Prot: locus VE2_HPV11 acceso P04015; ID. único:g137671, análogos conservativos o truncaciones de los mismos. Más preferiblemente, el dominio de transactivación (TAD) de E2 contiene los aminoácidos 1 a 218, en particular 1 a 215 y aún más preferiblemente 1 a 201. Más preferible aún es que el TAD de E2 utilizado para la presente invención comprenda los aminoácidos 2 a 201 y en particular 2 a 196. finalmente, lo más preferible es que la composición contenga los aminoácidos 15 a 104 del TAD de E2.
En otro aspecto de la primera realización, el TAD de E2 del VPH utilizado para la presente invención se obtiene a partir de la cepa de VPH-11 y se encuentra formando un complejo con la molécula pequeña inhibidora L. La presente invención también contempla otros tipos de papilomavirus (PV), incluidos BPV (virus del papiloma bovino) o CRPV (virus del papiloma del conejo común).
2. Método de cristalización
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método de producción de un polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 en complejo con el inhibidor L definido anteriormente, que comprende:
a) la mezcla de polipéptido purificado de tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2, contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L solubilizado y para generar así así generar una solución compleja que contenga dicho complejo PV E2 TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en un tampón de cristalización.
En un aspecto preferido del paso a) de la tercera realización, el inhibidor L es solubilizado en DMSO al 100% a una concentración de 60 mM.
En un aspecto preferido del paso a) de la tercera realización, el tampón de purificación contiene un agente reductor que puede seleccionarse entre TCEP o DTT. Es más preferible que el agente reductor sea TCEP. Preferiblemente, el agente reductor es TCEP a una concentración de alrededor de 1 mM a alrededor de 10 mM. Es más preferible que el agente reductor sea TCEP a una concentración de 5 mM.
El tampón de purificación se utiliza de un modo preferido a un pH de entre 7 y 9. Más preferiblemente se utiliza a un pH de 8.
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Además del agente reductor, es posible añadir una sal para facilitar la estabilidad del TAD de E2 del VPH. La sal puede seleccionarse preferiblemente de entre NaCl, NH_{4}SO_{4} o KCl. La sal más preferible es NaCl a una concentración de cerca de 200 mM a cerca de 800 mM. Aún más preferible es que la sal sea NaCl a una concentración de 500 mM.
También se puede añadir además del agente reductor un tampón para facilitar aún más la estabilidad del TAD de E2 del VPH. El tampón puede seleccionarse preferiblemente de entre Tris-HCl, HEPES o bis-Tris. El tampón más preferible es Tris-HCl a una concentración de cerca de 0 nM a cerca de 50 mM. Aún más preferible es que el tampón sea Tris-HCl a una concentración de 25 nM.
Otro componente que puede añadirse además del agente reductor es un agente quelante para reducir la degradación del TAD de E2 de VPH por proteasas. El agente quelante puede ser preferiblemente EDTA o EGTA. Más preferiblemente, el agente quelante es EDTA a una concentración de entre 0 mM y 1 mM. Es aún más preferible que el agente quelante sea EDTA a una concentración de entre 0 mM y 0,5 mM. Lo más preferible es que sea EDTA a una concentración de 0,1 mM.
En un aspecto preferido del paso a) de la tercera realización se utiliza preferentemente la solución proteica de TAD de E2 del VPH a una concentración de unos 5 g/ml en el tampón de purificación. Es más preferible utilizar el TAD de E2 del VPH a una concentración de unos 10 mg/ml en el tampón de purificación.
En un aspecto preferido del paso b) de la tercera realización es preferible seleccionar el tampón de cristalización de entre MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico o succinato sódico. Más preferible es que el tampón de cristalización sea MES a una concentración de cerca de 50 mM a cerca de 0,2 M. El tampón de cristalización más preferido es MES a una concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización preferiblemente contiene además un agente precipitante que facilita la cristalización del TAD de E2 del VPH. El agente precipitante puede seleccionarse preferiblemente de entre MPD, isopropanol, etanol o butanol terciario. Es más preferible que el agente precipitante sea MPD a una concentración del 30% al 40% aproximadamente. Lo más preferible es que el agente precipitante sea MPD a una concentración del 35%.
El tampón de cristalización se utiliza preferentemente a un pH de entre 4,5 y 6,5, pero lo más preferible es utilizarlo a un pH de 5,5.
En un aspecto preferido del paso b) de la tercera realización, la cristalización del complejo HPV E2 TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica por difusión de vapor en gota colgante o "hanging drop".
En un aspecto importante de la tercera realización, la invención del complejo cristalizado HPV E2 TAD-L es susceptible a la cristalografía por rayos X. Mediante el uso de análisis de cristalografía por rayos X, los cristales de complejo HPV E2 TAD-inhibidor obtenidos pertenecen al grupo de espacio P4(1) con una dimensión de celda unidad de a = b = 60.7 \ring{A} y c = 82,5 \ring{A} y contienen una molécula por unidad asimétrica. Los datos iniciales de difracción se midieron mediante un generador de rayos X de fuente propia (Rigaku, Japón) equipado con un detector de área de impresión de placa R-axis II (Molecular Structure Corp, Texas). Se recogieron preferentemente datos a una resolución de 3,15 \ring{A} en un cristal único del complejo enfriado a 100 K.
También se describe un método de producción de apo VPH E2 TAD cristalizado, que comprende:
a) la mezcla de apo VPH E2 TAD, contenido en un tampón de purificación, con un tampón de cristalización.
En otro aspecto de la misma realización, el apo VPH E2 TAD es apo VPH-11 E2 TAD. Más preferiblemente, el apo VPH E2 TAD es apo SE-VPH-11 E2 TAD.
En otro aspecto de la misma, el contenido del tampón de purificación es el aquí descrito. Preferiblemente, la solución proteica de apo VPH E2 TAD se utiliza a una concentración de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 15 mg/ml en el tampón de purificación. Es más preferible que se utilice el apo VPH E2 TAD a una concentración de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml de TAD de E2 en el tampón de purificación. Pero lo más preferible es que se utilice el apo VPH E2 TAD a una concentración de 5 mg/ml en el tampón de purificación.
Además, el tampón de cristalización puede seleccionarse de entre MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico o succinato sódico. Más preferible es que el tampón de cristalización sea succinato sódico a una concentración de cerca de 50 mM a cerca de 0,2 M. El tampón de cristalización más preferido es succinato sódico a una concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización también contiene PEG8K, PEG4K o PEG5K monoetiléter. Más preferiblemente, el tampón de cristalización también contiene PEG5K monoetiléter a una concentración de cerca de un 10% a cerca de un 25%. La forma más preferible es que el tampón de cristalización también contenga PEG5K monoetiléter a una concentración de cerca del 18%.
Preferentemente, el tampón de cristalización se emplea a un pH de entre 4,5 a 6,5, pero lo más preferible es que se emplee a un pH de 5,0.
Es preferible que el tampón de cristalización además contenga sulfato de amonio a una concentración de aprox. 0,1 M a aprox. 0,4 M. Lo más preferible es que además lo contenga a una concentración de 0,2 M.
La cristalización se lleva a cabo entre 0ºC y 10ºC, siendo la temperatura más preferida la de 4ºC.
Los cristales de apo VPH-11 E2 TAD pertenecen al grupo de espacio C222 con dimensión de celda unidad de a = 54,9 \ring{A}; b = 169,9 \ring{A} y c = 46,1 \ring{A} y contenían una molécula por unidad asimétrica. Los datos de difracción se recogieron en una línea de haz X4a (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York). Se recogieron 4 conjuntos de datos a partir de un único cristal enfriado a 100 K, a cuatro longitudes de onda de rayos X diferentes cercanas al límite de absorción del selenio (0,9790 \ring{A}, 0,9794 \ring{A}, 0,9743 \ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se tomaron imágenes en un ADSC Q4 CCD. La máxima resolución preferida fue de 2,4 \ring{A}.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona un método para producir un polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un inhibidor L, como el antes definido, que comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en un tampón de cristalización; y
b) la inmersión del polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2, como el antes definido, en a).
En un aspecto alternativo de dicha realización de la invención, se proporciona un método para producir un complejo cristalizado PV E2 TAD-inhibidor como el antes definido, que comprende:
a) la adición de inhibidor L a un tampón de cristalización que contiene un polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2.
3. Coordenadas de rayos X
Además también se describen coordenadas de la estructura cristalina por rayos X del complejo VPH E2 TAD-inhibidor (HPV E2 TAD-L), antes definido. Preferiblemente, las coordenadas corresponden al bolsillo de unión del inhibidor. Más preferiblemente, el conjunto de coordenadas para el complejo VPH E2 TAD-inhibidor están definidas según la Figura 9.
Es preferible que el bolsillo de unión del inhibidor contenga una cavidad profunda que está delimitada por las cadenas laterales de los aminoácidos H32, W33 y L94, donde la cadena lateral del y19 del TAD de E2 de VPH es desplazado de su posición original para formar una cavidad profunda de tal dimensión que permite la entrada de una molécula inhibidora pequeña. Es más preferible que la cavidad profunda esté alineada en su parte inferior por los aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible es que el bolsillo además contenga una cavidad poco profunda que esté delimitada por uno o más aminoácidos de L15, I36, E39, K68, N71 y A72.
Preferiblemente, el bolsillo de unión del inhibidor está definido de acuerdo con las coordenadas asignadas a los siguientes grupos de aminoácidos:
100
LLELYEE.....KHIMHWKCIRLE....KGHNA......EPWTLQDTSYEMWLT
(ID SEC Núm.9)(ID SEC Núm.10)(ID SEC Núm.11)(ID SEC Núm.18)
Más preferiblemente, el bolsillo de unión del inhibidor, y en concreto su cavidad profunda, está definido por las coordenadas de H32, W33 y L94 según la Figura 9. Aún más preferiblemente, están definidas por las coordenadas de las cadenas laterales de h32, W33 y L94.
De forma alternativa, cabe la posibilidad de considerar el cambio de la cadena lateral de Y19 desde un constructo de proteína que reproduciría una cavidad profunda similar, pero sin el estorbo de la cadena lateral de Y19.
Todavía es más preferible que el fondo de la cavidad profunda esté definido por las coordenadas de los aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible incluso es que la cavidad poco profunda del bolsillo de unión del inhibidor esté definida por las coordenadas de uno o más de los aminoácidos L15, I36, E39, K68, N71 y A72.
La estructura tridimensional del complejo VPH E2 TAD-L de esta invención está definida por un conjunto de coordenadas estructurales como las expuestas en la Figura 9. El término "coordenadas estructurales" se refiere a coordenadas cartesianas procedentes de operaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos con la difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos (centros de difracción) de un complejo E2-L en forma de cristal. Los datos de difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad de electrones de la unidad del cristal repetida. Entonces se utilizan esos mapas de densidad de electrones para establecer las posiciones de los átomos individuales del bolsillo de unión del inhibidor en el TAD de E2.
Los expertos en la materia comprenderán que un conjunto de coordenadas estructurales para una proteína o un complejo proteína-inhibidor o una porción de los mismos, es un conjunto relativo de puntos que definen una forma en tres dimensiones. Por lo tanto, es posible que un conjunto completamente diferente de coordenadas defina una forma similar o idéntica.
Las variaciones de coordenadas pueden generarse debido a manipulaciones matemáticas de las coordenadas estructurales. Por ejemplo, las coordenadas estructurales expuestas en la Figura 9 se podrían manipular por permutaciones cristalográficas de las mismas, por fraccionalización o por operaciones matriciales en conjuntos de las coordenadas estructurales, o cualquier combinación de las opciones mencionadas.
Para determinar si una molécula, un complejo molecular o una porción de los mismos son suficientemente similar a la totalidad o a partes de la proteína E2 del VPH, o del TAD de E2 del VPH, descritos anteriormente, como para considerarlas iguales, son necesarios diversos análisis informáticos. Estos análisis pueden llevarse a cabo en aplicaciones actuales de programas informáticos, como la aplicación de Similitud Molecular de QUANTA (Molecular Simulations Inc., San Diego, CA), versión 4.1.
La aplicación de Similitud Molecular permite realizar comparaciones entre estructuras diferentes, conformaciones diferentes de una misma estructura y partes diferentes de la misma estructura. El procedimiento utilizado en la Similitud Molecular para comparar estructuras se divide en cuatro pasos: 1) carga de las estructuras a comparar; 2) definición de la equivalencia atómica en estas estructuras; 3) realización de una operación de "fitting" (superposición); y 4) análisis de los resultados.
Cada estructura está identificada por un nombre. Entonces se identifica una estructura como diana (es decir, la estructura fija); el resto de estructuras son las estructuras operativas (es decir, estructuras en movimiento). Dado que la equivalencia atómica en QUANTA viene definida por la entrada del usuario, para el propósito de esta invención se determinaron los valores de rmsd utilizando átomos de las cadenas principales de los aminoácidos H32, W33 y L94 entre las dos estructuras comparadas.
En los casos en que se utiliza un método de "fitting" rígido, la estructura operativa sufre una traslación y una rotación para encajar de forma óptima con la estructura diana. La operación de "fitting" utiliza un algoritmo que calcula la traslación y rotación óptimas que se deben aplicar a la estructura móvil de modo que la diferencia media cuadrática del encaje respecto de los pares especificados del átomo equivalente sea un mínimo absoluto. Una vez superpuestas las dos estructuras es posible calcular un valor rmsd para conjuntos específicos de átomos equivalentes.
4. Coordenadas almacenadas en medio de lectura informática
En esta invención también se describe un medio de almacenamiento de datos de lectura informática que contiene un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas estructurales, o al menos una parte de las coordenadas estructurales expuestas en la Figura 9. Los expertos en la materia conocerán perfectamente estos medios de almacenamiento de lectura informática como son los CD-ROM o los disquetes ("discos flexibles").
Por tanto, de acuerdo con la presente invención, las coordenadas estructurales de un complejo VPH E2- inhibidor, y en particular un complejo VPH E2 TAD-L, y de porciones de los mismos pueden almacenarse en un medio de almacenamiento de lectura informática. Estos datos se pueden utilizar con diversos propósitos, por ejemplo el hallazgo de fármacos o el análisis cristalográfico por rayos X de cristales de proteína.
También se describe un ordenador para generar una representación tridimensional del complejo VPH E2 TAD-L, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de lectura informática que comprende un material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas estructurales expuestas en la Figura 9;
b) una memoria para el almacenamiento de instrucciones para el procesado de dichos datos de lectura informática;
c) una unidad central de proceso acoplada a dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática, para el procesado de dichos datos de lectura informática con el fin de generar la representación tridimensional; y
d) un monitor acoplado a dicha unidad central de proceso que muestre dicha representación tridimensional.
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5. Estructura tridimensional del bolsillo
En la presente invención también se describe una estructura tridimensional de al menos una parte del complejo molecular, que contiene características de estructura similar a un bolsillo de unión del inhibidor de TAD de E2 del VPH.
La forma del bolsillo de unión del inhibidor, de acuerdo con la presente invención, se puede visualizar como que contiene un bolsillo profundo y, de forma opcional, un bolsillo menos profundo (véase la Figura 7). La forma de la cavidad profunda está definida por las posiciones relativas de las cadenas laterales de los aminoácidos H32, W33 y L49 y no por sus coordenadas absolutas según la Figura 9. Es posible obtener coordenadas o modelos estructurales similares a partir de técnicas diferentes (p. ej. RMN, modelado, etc.) y estos se consideran dentro del alcance de la presente invención.
Así, se describe la estructura tridimensional de un complejo VPH E2-inhibidor, en concreto un complejo VPH E2 TAD-L. Cabe destacar que esta estructura ha proporcionado por primera vez información sobre la estructura y la forma de este bolsillo de unión del inhibidor de TAD de E2 del VPH.
6. Utilización del modelo tridimensional para el cribado
Otra descripción es un método para la evaluación del potencial de una entidad química de asociarse con un dominio de transactivación de E2 de papilomavirus que comprende un bolsillo de unión definido por las coordinadas estructurales de un dominio de transactivación de la proteína E2 del VPH-11 que contiene los aminoácidos H32, W33 y L94, o un modelo tridimensional del mismo; o
un bolsillo de unión que además contiene las coordenadas estructurales de uno de H29 y T97 o de ambos que definen la parte inferior del bolsillo profundo; o
un bolsillo de unión que además comprende la coordenada estructural de al menos un aminoácido seleccionado del grupo formado por: L15, I36, E39, K68, N71 y A72.
También se describe la utilización de técnicas de diseño racional de fármacos o basado en la estructura para diseñar, seleccionar y sintetizar entidades químicas que incluyen compuestos inhibidores con capacidad para encajar en el bolsillo de unión del inhibidor del TAD de E2 del VPH, o de unirse a el, o cualquier porción de los mismos.
Una técnica de diseño de fármacos particularmente útil que facilita esta invención es el diseño iterativo de fármacos. Esta técnica es un método de optimización de las asociaciones entre una proteína y un compuesto mediante la determinación y evaluación de estructuras tridimensionales de conjuntos sucesivos de complejos proteína-complejo.
Los expertos en la materia se percatarán de que la asociación de ligandos o sustratos naturales con el bolsillo de unión de sus receptores o enzimas correspondientes constituye la base de múltiples mecanismos de acción biológicos. Igualmente, hay una gran cantidad de fármacos que ejercen sus efectos biológicos mediante la asociación con las cavidades de unión de receptores o enzimas. Estas asociaciones pueden tener lugar con cualquiera de las partes, o todas ellas, del bolsillo de unión. La comprensión de este tipo de asociaciones facilitará la orientación del diseño de fármacos hacia la obtención de asociaciones más favorables con sus receptor o enzima diana y, por tanto, de efectos biológicos mejorados. De esta forma, esta información es valiosa para el diseño de ligandos o inhibidores potenciales de receptores o enzimas, como los inhibidores de polipéptidos de tipo E2 VPH o, especialmente, de TAD de E2 del VPH.
En el diseño iterativo de fármacos se obtienen cristales de una serie de complejos proteína-compuesto y a continuación se genera la estructura tridimensional de cada complejo. Este tipo de enfoque proporciona nuevos conocimientos sobre la asociación entre las proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se consigue mediante la selección de compuestos con actividad inhibidora, obteniendo cristales de este nuevo complejo proteína-compuesto, resolviendo la estructura tridimensional del complejo, y comparando las asociaciones entre los complejo proteína-compuesto nuevos y los complejos proteína-compuesto previamente resueltos. Es posible optimizar estas asociaciones a través de la observación de cómo afectan los cambios del compuesto a las asociaciones proteína-compuesto.
En algunos casos, el diseño iterativo de fármacos se lleva a cabo creando complejos sucesivos proteína-compuesto y a continuación cristalizando cada complejo nuevo. De forma alternativa, se introduce en presencia de un inhibidor un cristal de proteína formado previamente, tal como se ha descrito anteriormente, formando de esta forma un complejo proteína-compuesto y obviando la necesidad de cristalizar cada complejo proteína-compuesto individual. De forma favorable, los cristales de proteína E2 del VPH, y en concreto los cristales de TAD de E2, proporcionados por esta invención pueden introducirse en presencia de un inhibidor o más concretamente de un inhibidor de E2 como un compuesto L, para proporcionar complejos de cristal E2-inhibidor, como se ha descrito anteriormente.
7. Utilización del bolsillo para el cribado
En ciertos casos es posible sintetizar un TAD de E2 que carezca de la cadena lateral de Y19 para reproducir el bolsillo de unión del inhibidor definido aquí. Se pretende que estas modificaciones de la secuencia primaria para conseguir un bolsillo de unión similar estén dentro del alcance de la presente invención. También se contempla la utilización de este tipo de TAD de E2 modificado para realizar el cribado (mediante cualquiera de los siguientes: RMN, MS, ensayos de desplazamiento de sonda, etc.) en busca de un posible inhibidor del bolsillo acabado de definir.
8. Alteración de E2 del virus del papiloma del conejo común (CRPV) para la unión eficiente de inhibidores
Asimismo, se describe un método de producción de una proteína E2, siendo dicha proteína útil para la identificación o caracterización de inhibidores de TAD de E2, que comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina de VPH E2 TAD-L, definida anteriormente, para identificar residuos del bolsillo de unión del inhibidor del VPH;
b) la comparación de dichos residuos del bolsillo de unión del inhibidor del VPH con residuos proteicos de virus del papiloma de conejo común (CRPV);
c) la mutación de dichos residuos de CRPV en los residuos de VPH mencionados, para producir un híbrido; y
d) ensayar la inhibición de dicho híbrido por un inhibidor.
La infección de conejos de laboratorio con virus del papiloma de conejo común (CRPV) o la introducción del genoma del CRPV en la piel de estos conejos da lugar a la aparición de grandes verrugas. El sistema del modelo de CRPV se ha utilizado para evaluar posibles tratamientos anti-VPH (Kreider JW, et al. (1992) "Preclinical system for evaluating topical podofilox treatment of papillomas: dose response and duration of growth prior to treatment" J Invest Dermatol. 1992; 99,813-818). Es fácil visualizar que esta cuestión constituiría un sistema adecuado para ensayar la eficacia in vivo de inhibidores de la replicación de DNA del VPH de unión a E2. Sin embargo, las proteínas E2 de CRPV y de VPH solamente comparten el 39% de identidad de secuencia y es posible que los inhibidores de unión a la proteína de VPH no se unan a la E2 del CRPV.
La estructura cristalina del inhibidor de TAD de E2 del VPH, aquí descrita, se puede utilizar para identificar residuos que forman parte del bolsillo de unión del inhibidor de VPH y que difieren de la proteína del CRPV. Es posible entonces mutar los residuos de CRPV hacia el correspondiente de VPH. El híbrido resultante puede someterse a ensayo mediante traducción in vivo del gen del híbrido para producir una proteína E2 que podría probarse en ensayos in vitro como el ensayo de unión de DNA a E1 dependiente de E2 (véase el Ejemplo 6). Si la proteína híbrida resulta funcional en el ensayo, y se demuestra que es sensible a los inhibidores de VPH, se puede utilizar el gen correspondiente para inducir el crecimiento de verrugas en conejos. Las verrugas resultantes de este procedimiento deben ser tratables mediante inhibidores dirigidos originalmente a E2 de VPH. Así, la utilización de este modelo híbrido, generado mediante el análisis del complejo inhibidor de TAD del VPH, se podría utilizar para ensayar compuestos del VPH en un modelo animal. Esta técnica también puede ser aplicable a otros virus de papiloma como, entre otros, el virus del papiloma bovino (BVP).
Con el propósito de que esta invención se entienda más completamente se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos solamente están destinados a ilustrar y de ningún modo deben entenderse como limitadores del alcance de esta invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión y purificación de VPH-11 E2 TAD
Expresión de dominio de transactivación de E2 del VPH-11 marcado con His. Se amplificaron por PCR los aminoácidos 2-201 de VPH-11 E2 (ID. de SEC. Núm. 2) a partir del plásmido pCR3-E2 (Titolo, 1999) utilizando los cebadores 5'-CAA GAC GTG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG-3'(directo) (ID. DE SEC. NÚM. 3) y 5'-CAC CAA GTG GAT CCG CTA GCT TAG CTA GAT ACA GAT GCA GGA-3' (indirecto) (ID. DE SEC. NÚM. 4). El producto de PCR se digirió utilizando NcoI y BamHI y se ligó a un plásmido pET-28b, que había sido digerido de forma similar. El producto de ligación se transformó en E. coli DH5\alpha MAX Efficiency® competentes (Life Technologies). El plásmido recombinante que codifica el VPH11 E2 TAD marcado con His (His-TAD) se aisló de un cultivo del DH5a transformado y se verificó si era correcta la secuencia de DNA del TAD de E2. El plásmido aislado se transformó entonces en la cepa de E. coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen).
Se generó mediante PCR un segundo constructo que codificaba cuatro lisinas adicionales situadas en el extremo C-terminal del dominio de transactivación de E2 (TAD con cola de Lys) utilizando el cebador directo 5'-GGG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA G-3' (ID. DE SEC. NÚM. 5) y el cebador indirecto 5'-CCC CGG ATC CTC ATT ACT TTT TCT TTT TGC TAG ATA CAG ATG CAG GAG AAC-3' (ID. DE SEC. NÚM. 6). Este producto se digirió del mismo modo que antes y se ligó al plásmido pET15b. Se verificó que la secuencia de DNA que codifica los aminoácidos 2-201 de E2 del VPH11 era correcta y se transformó el plásmido en la cepa de E. coli strain BL21(DE3)pLysS como se ha descrito anteriormente.
Para la expresión de proteínas, se inoculó medio de cultivo CircleGrow (Bio101) que contenía 34 \mug/ml de cloranfenicol y 50 \mug/ml de canamicina (His-TAD) o 100 \mug/ml de ampicilina (TAD con cola de Lys) con una vigésimo quinta parte del volumen de un cultivo fresco de toda la noche y se cultivaron células a 37ºC hasta alcanzar una DO (600 nm) de aproximadamente 1,0. A continuación se cambió el cultivo a 22ºC y se indujo la expresión proteica a una DO (600 nm) = 1,4 con IPTG 0,5 mM. Transcurridas seis horas, se recogieron las células mediante centrifugación y se congelaron en hielo seco; entonces se conservaron a 80ºC.
Purificación de proteínas de VPH11 TAD marcadas con His. El procedimiento de purificación fue idéntico para las proteínas de TAD marcado con His y TAD con cola de Lys; todos los pasos se llevaron a cabo a 4ºC. Las células se resuspendieron a 5 ml por gramo en tampón de purificación (Tris-HCl 25 mM pH 8,0; NaCl 500 mM, TCEP 5 mM) con los inhibidores de proteasa pepstatina, leupeptina y antipaína (cada uno a 5 \mug/ml), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM) y Pefabloc® (Roche, 0,4 mM). La suspensión se sonicó, y el lisado bruto se centrifugó durante 30 min a 26.000 g. El sobrenadante se inyectó en una columna quelante Hi-Trap de 5 ml (APB) equilibrada con sulfato de níquel. Tras el lavado con tampón de purificación más imidazol 0 mM y 25 mM, se eluyó el TAD con tampón de purificación que contenía imidazol 100 mM. Las fracciones que contenían TAD se agruparon y concentraron a menos de 5 ml, a continuación se cargaron sobre una columna de gel de filtración Superdex-75 (APB) equilibrada con tampón de purificación más EDTA 0,1 mM. Las fracciones que contenían TAD puro se agruparon y concentraron a aproximadamente 5 mg/ml (TAD marcado con His) o 12 mg/ml (TAD con cola de Lys). Se tomaron alícuotas de proteína concentrada, se congelaron en hielo seco y se conservaron a -80ºC.
Expresión y purificación de selenometionina que contiene His-TAD. El plásmido que codificaba His-TAD se transformó en la cepa de E. coli B834 (auxotrófica para metionina). Se utilizó una única colonia bacteriana para inocular un cultivo incubado toda la noche en medio LB que contenía 34 \mug/ml de cloranfenicol y 50 \mug/ml de canamicina. Una parte de este cultivo se diluyó 1:4000 en medio DL30 (LeMaster DM y Richards RM. Biochemistry. 1985;24:7263-68) en ausencia de metionina y complementado con 2 \mug/ml de biotina y tiamina y 50 \mug/ml de d,l-selenometionina y los mismos antibióticos. Pasadas 26 horas a 37ºC, el cultivo había alcanzado una densidad de 0,8 (DO a 600 nm), y se indujo la expresión a 23ºC con IPTG 0,5 mM. Transcurridas siete horas aproximadamente, se recogieron las células y se conservaron del modo antes descrito. La purificación se llevó a cabo de la misma forma descrita para His-TAD, excepto en que los tampones de purificación se rociaron con helio antes de su utilización, y se eluyó His-TAD con imidazol 200 mM tras el lavado a 50 y 100 mM.
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(Esquema pasa a página siguiente)
Ejemplo 2 Síntesis y Purificación del compuesto L
6
5-Metil 1,3-indanodiona (A)
A una suspensión de anhídrido 4-metilftálico (25,65 g; 158,2 mmol) en MeOH (79 ml) a temperatura ambiente, se le añadió metóxido sódico (69 ml de solución al 25% en peso, 316 mmol). Transcurridos 30 min, la mezcla de reacción se diluyó en agua y la capa acuosa se lavó con Et_{2}O. La capa acuosa se acidificó con HCl (4N) y se extrajo con Et_{2}O. La capa orgánica se enjuagó con salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró a presión reducida.
El residuo bruto se disolvió en acetonitrilo (79 ml) y se enfrió hasta 0ºC. A la solución resultante se le añadió DBU de forma sucesiva (31,3 g; 206 mmol) y yodometano (33,7 g; 237,3 mmol). Tras 1 hora a 0ºC, se añadió yodometano (33,7 g; 237,3 mmol) y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante una hora más. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida, y el residuo se diluyó en Et_{2}O (300 ml). La solución etérea se lavó sucesivamente con HCl acuoso (4 N, 100 ml), NaOH (10%) y salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró por evaporación. El residuo resultante se trató con una solución etérea de diazometano para completar la esterificación, tras la cual se concentró para proporcionar el 4-metil dimetil ftalato (222 g, rendimiento del 67%) en forma de aceite amarillo claro.
A una solución de 4-metil dimetil ftalato bruto (22,20 g, 106,6 mmol) en etilacetato (107 ml), se añadió hidruro sódico (97%, 3,84 g, 160 mmol). La suspensión resultante se calentó a reflujo durante 4,5 horas y seguidamente se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió Et_{2}O (100 ml) para proporcionar un precipitado amarillo. El sólido amarillo se filtró y lavó dos veces con una mezcla de alcohol etílico/dietiléter (1/1).
Este sólido amarillo se disolvió entonces en HCl (4 N, 100 ml) y se calentó a reflujo durante 30 min. Una vez enfriado, se añadió EtOAc y la fase orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró para proporcionar 5-metil 1,3-indanodiona en forma de sólido amarillo (3,7 g; 22% de rendimiento)
Paso a
A una solución de 5-metil indan-1,3-diona (A) (410 mg; 2,6 mmol) en EtOH (13 ml) se añadió 3,4-diclorobenzaldehído (B) (493 mg 2,8 mmol) seguido de piperidina (1 gota). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 30 min. Una vez enfriada, a la mezcla de reacción se le añadió peróxido de hidrógeno acuoso (30%, 0,87 ml; 7,7 mmol) y DBU (97 mg; 0,6 mmol). Se continuó agitando durante 30 min y a continuación se añadió hexano (5 ml) y se filtró el precipitado. El sólido resultante se trituró dos veces con una mezcla de propanol/hexano (1/1) y se secó bajo vacío elevado para proporcionar 3-(3,4-diclorofenil)-spiro(oxirano-2,2'-[5-Meil-indan])-1',3'-diona (D) (701 mg; 82% de rendimiento).
Paso c
Una mezcla de 3(3,4-diclorofenil)-spiro(oxi-rano-2,2'-[5-Metil-indan])-1',3'-diona (D) (200 mg; 0,8 mmol) y 1-(4-[1,2,3]tiazol-4il-fenil)-pirrol-2,5-diona (e) (155 mg; 0,6 mmol) en tolueno (46 ml) se calentó a reflujo durante 16 h. Una vez enfriado y concentrado, el residuo se trituró con EtOAc para proporcionar una mezcla de dos compuestos F/G (isómeros racémicos cis/cis, 228 mg, 60% de rendimiento).
Paso d
A una solución de compuestos F/G (210 mg; 0,36 mmol) en CH_{3}CN (36 ml) se le añadió NaOH (0,02 N; 17,8 ml; 0,36 mmol) utilizando una bomba de infusión con jeringa durante 1 h. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 1 h más. A continuación se liofilizó la solución para proporcionar una mezcla de compuestos J/K racémicos (227 mg, rendimiento cuantitativo). Se obtuvo enantiómero L puro mediante separación en HPLC preparativa utilizando una columna quiral (Chiracel OD, eluyente isocrático 65% CH_{3}CN/H_{2}O que contiene 0,06% de TFA; lámpara de UV a 205 nm; flujo de 7 ml/min). Las fracciones deseadas se combinaron y liofilizaron. La sal sódica correspondiente se preparó mediante tratamiento con NaOH (0,02 N; 1 equiv.) en acetonitrilo seguido de liofilización para proporcionar las sales sódicas (15 mg) en forma de sólido blanco.
L: ^{1}H-RMN (400 MHz, DMSO-d_{6})\delta 10,35 (s, 1H); 8,40 (d, J = 8,6 Hz; 2H); 7,89-7,80 (m, 3H); 7,64 (m, 3H); 7,52 (d, J = 8,3 Hz; 1H); 7,51-7,34 (m, 1H); 5,75 (s, 1H); 4,19 (m, IH); 3,78 (m, 1H); 2,57 (s, 3H); ES MS m/z 606 (MH+).
La actividad inhibidora del compuesto se evaluó de acuerdo con los ensayos descritos en el Ejemplo 6 y se determinó que tenía un CI_{50} de 180 nM. La selectividad del inhibidor se verificó por ausencia de actividad (o menor potencia) en el ensayo del antígeno T mayor de SV40 descrito en el Ejemplo 7.
Ejemplo 3 Formación del complejo E2 TAD-inhibidor
Se solubilizó polvo de inhibidor L en DMSO al 100% a una concentración de 60 mM. La solución proteica estaba formada por 10 mg/ml de E2TAD en tampón de purificación (Tris-HCl 25 mM pH a 8,0; NaCl 500 mM; TCEP 5 mM; EDTA 0,l mM). El complejo de E2TAD-L se consiguió mezclando 1 \mul de inhibidor L en 74 \mul de solución proteica. La solución se mantuvo a 4ºC durante 2-3 horas antes de realizar los experimentos de cristalización.
Ejemplo 4 Cristalización y recopilación de datos
La cristalización del TAD de apoE2 y del complejo E2TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica por difusión de vapor en gota colgante (McPherson A. Preparation and Analysis of Protein Cristals. Krieger Pub. 1989) en placas de cristalización VDX (Hamton Research, Laguna Niguel, California).
En particular para la apo VPH-11 E2 TAD: 1 \mul de la solución Se-E2 TAD (5 mg/ml en tampón de purificación) se mezcló con 1 \mul de una solución compuesta por succinato sódico 0,1 M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y sulfato amónico 0,2 M. La gota resultante de 2 \mul se suspendió sobre 1 ml de solución de reserva compuesta por succinato sódico 0,1 M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y sulfato amónico 0,2 M. Los cristales obtenidos a 4ºC pertenecen al grupo espacial C222 con una dimensión de celda unidad de a = 54,9 \ring{A}; b = 169,9 \ring{A} y c = 46,1 \ring{A} y contienen una molécula por unidad asimétrica.
Los datos de difracción se recopilaron en la línea de haz X4a (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York). Se recogieron cuatro grupos de datos a partir de un único cristal enfriado a 100 K, a cuatro longitudes de onda de rayos X diferentes cercanas al límite de absorción del Selenio (0,9790 \ring{A}; 0,9794 \ring{A}; 0,9743 \ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se recogieron las imágenes en un ADSC Q4 CCD; la resolución máxima fue de 2,4 \ring{A}.
Para la cristalización del complejo: 1 \mul de la solución compleja, descrita en el ejemplo 3, se mezcló con 1 \mul de una solución compuesta por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35% (metil pentano diol). La gota resultante se suspendió sobre 1 ml de solución de reserva formada por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35%. A continuación se conservaron placas a 4ºC. Los cristales obtenidos pertenecen al grupo espacial P4(1) con una dimensión de celda unidad de a = b = 60,7 \ring{A} y c = 82,5 \ring{A} y contienen una molécula por unidad asimétrica.
Los datos iniciales de difracción se midieron utilizando un generador de rayos X de fuente propia (Rigaku, Japón) equipado con un detector de área de impresión de placa R-axis II (Molecular Estructura Corp, Texas). Se recogieron datos a una resolución de 3,15 \ring{A} en un cristal único del complejo enfriado a 100 K.
A continuación se recopilaron datos de difracción a alta resolución en una línea de haz X25 (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York). Las imágenes de difracción se recogieron en un detector Brandeis B4 (Brandeis University) montado sobre un goniómetro de ejes con geometría kappa (Enraf-Nonius, Paises Bajos). Se recogió un conjunto completo de datos a una resolución de 2,4 \ring{A} sobre un único cristal del complejo enfriado a 100 K (presentado en la Figura 9).
Ejemplo 5 Determinación de la fase, construcción de modelos y refinamiento
La determinación de la fase de los datos del apo cristal se realizó mediante MAD (Multi wavelength Anomalous Dispersion, difracción de longitud de onda múltiple anómala) utilizando el programa MLPHARE (Collaborative Computational Project, número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst. D50, 760-763).
En el caso del cristal complejo se utilizó el método de Sustitución Molecular (MR, del inglés Molecular Replacement) para la estimación inicial de las fases de datos de difracción. La apo estructura de Se-E2TAD se utilizó como modelo. Se realizó una búsqueda de rotación y traslación a través del programa AMORE (Collaborative Computational Project, número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein Crystallography, Acta Cryst D50, 760-763).
La construcción de un modelo en un mapa de densidad de electrones se llevó a cabo con el programa informático O (Alwyn Jones, Upsala University, Suecia) y el refinamiento del modelo se realizó con el programa informático CNX (Molecular Simulation Inc, San Diego, California). A continuación, se mejoró el nuevo modelo mediante un procedimiento de ciclado que incluía el cálculo de mapas de densidad de electrones, la reconstrucción del modelo y los pasos de refinamiento. El modelo final constaba de 2 a 196 residuos de TAD de E2 y dos moléculas L inhibidoras. El factor R cristalográfico final fue 24,6% y el factor R libre es 29,3%.
Ejemplo 6 Ensayo de unión al origen de E1 dependiente de E2
Este ensayo se diseñó tomando como modelo un ensayo similar para el antígeno T de SV40 descrito por Mckay (J Mol Biol. 1981; 145:471). Se generó por PCR una sonda de DNA con radiomarcaje de 400 pb, que contenía el origen de replicación del VPH-11 (Chiang et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1992;89:5799), utilizando como molde el plásmido pBluescript™ SK que codificaba el origen (nucleótidos 7886-61 del genoma de VPH-11 en sitio BAMH1 único) y cebadores flanqueantes del origen. El radiomarcaje se incorporó en forma de [^{33}P]dCTP. El tampón del ensayo de unión consistía en Tris 20 mM a pH 7,6; NaCl 100 mM; DTT 1 mmol y EDTA 1 mM.
Otros reactivos utilizados fueron: microesferas de SPA con proteína A (tipo II, Amersham) y antisuero policlonal de conejo K72, generado frente a un péptido que corresponde a los 14 aminoácidos del extremo C-terminal de E1 del VPH-11. Siguiendo el protocolo de Amersham, se mezcló un frasco de microesferas con 25 ml de tampón de ensayo de unión. Para el ensayo se añadió una cantidad saturante de antisuero K72 a las microesferas y la mezcla se incubó durante 1 h, se lavó con un volumen de tampón de ensayo de unión y seguidamente se resuspendió en el mismo volumen de tampón fresco de ensayo de unión. Las reacciones de unión contenían 8 ng de E2, aproximadamente 100-200 ng de extracto nuclear que contenía E1 de células infectadas por baculovirus (como se describe en WO 99/57283) y 0,4 ng de sonda con radiomarcaje en un total de 80 \mul de tampón de ensayo de unión. Transcurrida 1 h a temperatura ambiente, se añadieron 25 \mul de suspensión de anticuerpo K72 con microesferas SPA a la reacción de unión y se mezcló el resultado. Después de una hora adicional de incubación a temperatura ambiente, las reacciones se centrifugaron brevemente para obtener un pellet de las microesferas y se determinó el alcance de la formación de complejo mediante contaje por centelleo en un Packard TopCount™. Generalmente la señal de las reacciones que contenían E1 y E2 era 20-30 veces mayor que el ruido de fondo observado cuando se omitía E1, E2 o ambas proteínas.
Ejemplo 7 Ensayo de unión a DNA del antígeno T de SV40
Este ensayo mide la formación de un complejo antígeno T de SV40 (Tag)-origen. El ensayo fue desarrollado por McKay RDG (J Mol Biol. 1981; 145:471-488). En principio, es muy similar al ensayo de unión a DNA de E1 dependiente de E2 (Ejemplo 6), con TAg sustituyendo a E1 y E2 y una sonda ori de SV40 con radiomarcaje en lugar de la sonda ori de VPH. El ensayo se utiliza para contrastar el ensayo del Ejemplo 6, dado que TAg comparte homología funcional con E1 y E2, pero posee una similitud de secuencia muy baja.
La sonda de DNA radiomarcada que contiene la secuencia ori se generó por PCR utilizando el plásmido pCH110 (Pharmacia) como molde. Este molde codifica el origen mínimo de replicación de SV40 en los nucleótidos 7098-7023. Los cebadores eran: "sv40-6958sens" = 5'-GCC CCT AAC TCC GCC CAT CCC GC (ID. de SEC. NÚM. 7) y "sv40-206anti" = 5'-ACC AGA CCG CCA CGG CTT ACG GC (ID. de SEC. NÚM. 8). El producto de PCR tenía una longitud aproximada de 370 pares de bases y se marcó con isótopo radiactivo utilizando 50 \muCi/100 \mul de reacción de PCR de dCTP (\alpha-^{33}P). A continuación de la reacción de PCR se purificó el producto utilizando el equipo de purificación de PCR de Qiagen® o un procedimiento de extracción de fenol/precipitación de etanol. El producto purificado se diluyó a 1,5 ng/\mul (estimado mediante electroforesis en gel) en TE. Las preparaciones nuevas tenían aproximadamente 150.000 cpm/\mul.
Las reacciones de unión se llevaron a cabo mediante la mezcla de 30 \mul de solución TAg (100 ng/pocillo, 200 ng de una sonda de DNA con radiomarcaje de ^{33}P y 7,5 \mul de 10 x tampón de unión a DNA (Tris-HCl 200 mM a pH 7,6; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM) en un volumen final de 75 \mul. Se permitió que las reacciones de unión tuvieran lugar a temperatura ambiente durante 60 min. El antígeno T mayor, adquirido de Chimerix, a 2,0 mg/ml.
Los complejos de DNA y proteína se captaron inmunológicamente utilizando un anticuerpo monoclonal \alpha-TAg (PAb 101, subtipo IgG2a, hibridoma obtenido de ATCC y anticuerpo purificado en el propio laboratorio) unido a microesferas de SPA con proteína A.
La inmunoprecipitación de complejos proteína-DNA se realizó durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se centrifugaron por un breve espacio de tiempo y se realizó el recuento de fragmentos precipitados de DNA radiomarcado en un contador TopCount®.
Discusión
La figura 2 muestra un modelo de la estructura cristalina de TAD de E2 del VPH-16 (Antson et al. Nature. 2000; 403:805-809). Una vista aumentada de la región del bolsillo de unión de este modelo, como se muestra en la figura 5, demuestra que los aminoácidos Y32, W33 y L94 delimitan una cavidad que es demasiado pequeña para definir un bolsillo adecuado que permita la unión de una pequeña molécula inhibidora al mismo, sin ajustes comparables de las cadenas laterales de los aminoácidos que puedan acoger al inhibidor.
Incluso cuando el dominio TAD de E2 del VPH11 correspondiente es cristalizado y modelizado, los aminoácidos correspondientes de nuevo demuestran una cavidad demasiado pequeña para definir cualquier tipo de bolsillo que pudiera contemplarse como una diana adecuada para la unión de inhibidor (Figura 6A). Tal como se muestra en la figura 6B, la presente invención muestra por primera vez que la estructura cristalina del nuevo complejo E2 TAD-inhibidor proporciona un bolsillo nuevo e inesperado de unión del inhibidor que constituye una herramienta única para identificar inhibidores potenciales del proceso de replicación del DNA de VPH.
Sorprendentemente, la estructura del complejo E2 TAD-inhibidor muestra que la unión del inhibidor L induce un movimiento de la cadena lateral de la tirosina en posición 19 (Figura 7) allí donde el anillo aromático rota de forma significativa hacia fuera de la pequeña cavidad observada en la apoestructura, lo que da como resultado la formación de una cavidad profunda. El movimiento de la cadena lateral de la tirosina en posición 19 da una desviación rms para todos los átomos de 1,959 \ring{A}. Los expertos en la materia comprenderán que esta desviación constituye un movimiento enorme, movimiento del que no se podría haber predicho que hubiese ocurrido en solitario o en presencia de un inhibidor de moléculas pequeñas.
Además, el anillo de imidazol de la histidina 32 rota 90 grados para acoger al inhibidor, pero aún sigue formando parte de la cavidad profunda. El movimiento de la cadena principal de la histidina 32 da una desviación rms para todos los átomos de 0,704 \ring{A}. No se podría haber predicho que tuviera lugar ninguno de estos movimientos de rotación ni que dieran lugar a la formación de esta cavidad profunda en el bolsillo de unión.
Como se muestra en la figura 6A, la cavidad profunda viene definida por los aminoácidos histidina 32, triptófano 33 y leucina 94. El desplazamiento rmsd de "todos los átomos" de estos tres residuos aminoacídicos es 0,5154 \ring{A}. No es posible explicar este rms por la flexibilidad original de estos tres residuos dentro del contexto del bolsillo de unión. De hecho, una desviación rms de 1,0 \ring{A} se considera dentro de los límites normales del contexto de una proteína completa de 200 aminoácidos. En el presente caso, la variación de rms para todos los átomos de H32, W33 y L94 entre apo E2TAD del VPH-16 de Antson supra y apo E2TAD del VPH-11 del Solicitante es 0,212 \ring{A}. Esto define el límite (superior) predecible dentro del cual estos 3 residuos pueden moverse a la vez. La presente invención se encuentra fuera del margen de movimiento predecible para estos tres residuos.
La serina 98 no se encuentra en el mismo plano que H32, W33 y L94 y forma parte de una porción menos profunda que también se puede utilizar para generar modelos de un bolsillo mayor que contenga una cavidad profunda formada por la H32, W33 y L94 y una cavidad poco profunda definida por uno o más aminoácidos seleccionados de: L15, I36, E39, K68, N71, A72, S98 e Y99 (véase la Figura 8).
La Figura 9 contiene la lista de las coordenadas de rayos X del complejo proteína-inhibidor que pueden utilizarse para modelizar. De estas coordenadas se puede inferir el hecho de que el complejo obtenido por el Solicitante contiene dos moléculas de inhibidor; sin embargo el modelo mostró que el segundo inhibidor se encuentra fuera de la cavidad profunda y no interacciona con la proteína de forma significativa. Asimismo, los siguientes aminoácidos están modelados como Alanina debido a su elevada flexibilidad que les hace invisibles a los rayos X: E2, K107, K173, S180, M182, H183 y P196.
De acuerdo con Harris & Botchan (Science. 1999; 284(5420); 1673), diversas proteínas E2 tienen de media solamente el 30% de identidad de secuencia aminoacídica. Sin embargo, el análisis mutacional sugiere que diversos TAD de E2 comparten un pliegue y un mecanismo de acción comunes. Siguiendo con este argumento, los grupos de aminoácidos que definen el bolsillo de unión del inhibidor identificado por el Solicitante poseen una cantidad sorprendente de identidad/similitud, incluso entre VPH de bajo y de elevado riesgo (Figura 10). El primer grupo identificado contiene la cadena lateral del aminoácido Y19 que se aleja de la región del bolsillo abriendo de esta forma la cavidad profunda. Este aminoácido se encuentra altamente conservado entre diversos tipos de VPH, presentando una identidad del 100% entre VPH-6, 11, 16 y 18. El segundo grupo contiene la histidina 32 y el triptófano 33 que definen la cavidad profunda del bolsillo. La histidina 32 es idéntica en VPH-6 y VPH-11 y presenta una fuerte similitud entre VPH de bajo y alto riesgo, mientras que el triptófano 33 es 100% idéntico en los cuatro tipos. Finalmente, el cuarto grupo contiene la Leucina 94 que también define la cavidad profunda del bolsillo y se encuentra conservada en un 100% en los 4 tipos de VPH.
Al definir la parte inferior de la cavidad profunda, H29 es idéntico en VPH-6,11 y 16 y es similar en VPH-18. De igual forma, T97 es idéntico en VPH-6, 11 y 18 y es similar en VPH-16.
Si definimos la cavidad poco profunda del bolsillo, el aminoácido L15 forma parte del primer grupo identificado y es muy similar en los VPH de riesgo bajo o alto. En el segundo grupo, I36 también es muy elevado mientras que E39 está muy conservado en los 4 tipos. Se identifica un tercer grupo que bordea la cavidad poco profunda del bolsillo de unión en el que K68 y N72 se encuentran altamente conservados en los diversos tipos. Finalmente, N71 es idéntico en VPH-6 y 11 y es similar a lo tipos de alto riesgo. El bolsillo poco profundo también contiene aminoácidos del cuarto grupo como son S98 e Y99 que también son muy similares en los diferentes tipos de VPH.
El elevado grado de identidad/similitud indica que este bolsillo definido según el TAD de E2 del VPH-11 de la invención también se encontrará en otros tipos de VPH, tanto de bajo riesgo como de alto. Es de suponer que los inhibidores que se unan a este bolsillo, particularmente a la cavidad profunda, diseñados utilizando los datos de la Figura 9 tienen una elevada probabilidad de unirse/inhibir la proteína E2 de una amplia variedad de virus del papiloma.
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADA) LTD.
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<120> COCRISTALIZACIÓN DEL DOMINIO DE TRANSACTIVACIÓN DE E2 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO/INHIBIDOR y COORDENADAS DE RAYOS X QUE DEFINEN EL BOLSILLO DE UNIÓN DEL INHIBIDOR
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<130> 13/100
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<150> 60/304 412
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<151> 2001-07-12
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<160> 22
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 220
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<212> PRT
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<213> VPH11
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<400> 1
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7 
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<210> 2
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<211> 211
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<212> PRT
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<213> VPH11
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<400> 2
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8 
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<210> 3
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<211> 57
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<212> DNA
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<213> Cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskip
caagacgtgc gctagaccat gggacatcac catcaccatc acgaagcaat agccaag 
\hfill
57 
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<210> 4
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<211> 42
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<212> DNA
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<213> Cebador
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<400> 4
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caccaagtgg atccgctagc ttagctagat acagatgcag ga 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcgctaga ccatgggaca tcaccatcac catcacgaag caatagccaa gcgtttag 
\hfill
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccccggatcc tcattacttt ttctttttgc tagatacaga tgcaggagaa c 
\hfill
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> IDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccctaact ccgcccatcc cgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
accagaccgc cacggcttac ggc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Glu Leu Tyr Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Ile Met His Trp Lys Cys Ile Arg Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gly His Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HPV11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Tyr Glu Met Trp Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Val Leu His Trp Lys Cys Met Arg His Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Trp Thr Leu Gln Glu Thr Ser Tyr Glu Met Trp Gln Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp His Ile asp Tyr Trp Lys Gln Met Arg Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala Leu Gln Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> VPH18
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<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Asp His Tyr Glu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> VPH18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\sa{Ser Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
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<213> VPH18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ala His Lys Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Trp Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu Leu Trp Asn Thr}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (41)

1. Un cristal que contiene un polipéptido de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 en complejo con un inhibidor L:
9
2. El cristal según la reivindicación 1, en el que dicho TAD de E2 contiene un bolsillo de unión del inhibidor en el que hay una cavidad profunda formada por las coordenadas de los aminoácidos H32, W33 y L94 de acuerdo con la Figura 9.
3. Un método de producción de un polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que se encuentra formando un complejo con un inhibidor L según la reivindicación 1, que comprende:
a) la mezcla de polipéptido purificado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2, contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L solubilizado para generar una solución compleja que contenga el complejo PV E2 TAD-L mencionado; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en un tampón de cristalización.
4. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de purificación del paso a) contiene un agente reductor seleccionado de entre TCEP y DTT.
5. El método según la reivindicación 4, en el que el agente reductor es TCEP a una concentración de 1 mM a 10 mM.
6. El método según la reivindicación 5, en el que el TCEP está a una concentración de 5 mM.
7. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de purificación del paso a) se utiliza a un pH de entre 7 y 9.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el tampón de purificación se utiliza a un pH de 8.
9. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de purificación del paso a) además contiene una sal seleccionada de entre NaCl, NH_{4}SO_{4} o KCl.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la sal es NaCl a una concentración de 200 mM a 800 mM.
11. El método según la reivindicación 10, en el que la sal es NaCl a una concentración de 500 mM.
12. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de purificación del paso a) además contiene un tampón estabilizador seleccionado de Tris-HCl, HEPES o bis-Tris.
13. El método según la reivindicación 12, en el que el tampón estabilizador es Tris-HCl a una concentración de entre 0 mM y 50 mM.
14. El método según la reivindicación 13, en el que el tampón estabilizador es Tris-HCl a una concentración de 25 mM.
15. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de purificación del paso a) además contiene EDTA a una concentración de entre 0 mM y 1 mM.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que el EDTA está a una concentración de entre 0 mM y 0,5 mM.
17. El método según la reivindicación 16, en el que el EDTA está a una concentración de 0,1 mM.
18. El método según la reivindicación 3, en el que el PV E2 TAD del paso a) se utiliza a una concentración de 5 mg/ml a 15 mg/ml en el tampón de purificación.
19. El método según la reivindicación 18, en el que el PV E2 TAD se utiliza a una concentración de 10 mg/ml de PV E2 TAD en el tampón de purificación.
20. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de cristalización del paso b) es seleccionado del grupo formado por: MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico y succinato sódico.
21. El método según la reivindicación 20, en el que el tampón de cristalización es MES a una concentración de 50 mM a 0,2 M.
22. El método según la reivindicación 21, en el que el tampón de cristalización es MES a una concentración de 0,1 M.
23. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de cristalización del paso b) además contiene un agente precipitante seleccionado del grupo formado por: MPD, isopropanol, etanol y terc-butanol.
24. El método según la reivindicación 23, en el que el agente precipitante es MPD a una concentración del 30% al 40%.
25. El método según la reivindicación 24, en el que el agente precipitante es MPD a una concentración del 35%.
26. El método según la reivindicación 3, en el que el tampón de cristalización del paso b) se utiliza a un pH de entre 4,5 y 6,5.
27. El método según la reivindicación 26 en el que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de 5,5.
28. El método según la reivindicación 3, en el que la cristalización del paso b) se lleva a cabo entre 0ºC y 10ºC.
29. El método según la reivindicación 28, en el que la cristalización se lleva a cabo a 4ºC.
30. Un método de producción de un polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que se encuentra formando un complejo con un inhibidor L, que comprende:
a) la solubilización de inhibidor L en un tampón de cristalización; y
b) la inmersión en a) de polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2.
31. Un método para la producción de un polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que se encuentra formando un complejo con un inhibidor L, que comprende la adición de inhibidor L en un tampón de cristalización que contiene PV E2 cristalizada.
32. El método según la reivindicación 30 o 31, en el que el tampón de cristalización es seleccionado del grupo formado por: MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico y succinato sódico.
33. El método según la reivindicación 32, en el que el tampón de cristalización es succinato sódico a una concentración de 50 mM a 0,2 M.
34. El método según la reivindicación 33, en el que el tampón de cristalización es succinato sódico a una concentración de 0,1 M.
35. El método según la reivindicación 34, en el que el tampón de cristalización además contiene PEG8K, PEG4K o PEG5K monometiléter.
36. El método según la reivindicación 35, en el que el tampón de cristalización además contiene PEG5K monometiléter a una concentración del 10% al 25%.
\newpage
37. El método según la reivindicación 36, en el que el tampón de cristalización además contiene PEG5K monometiléter a una concentración del 18%.
38. El método según la reivindicación 32 en el que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de entre 4,5 y 6,5.
39. El método según la reivindicación 38, en el que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de 5,0.
40. El método según la reivindicación 32, en el que el tampón de cristalización además contiene sulfato amónico a una concentración de 0,1 M a 0,4 M.
41. El método según la reivindicación 40, en el que el sulfato amónico está a una concentración de 0,2 M.
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