ES2274051T3 - Cocristalizacion del dominio de transactivacion e2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos x que definen el bosillo de union del inhibidor. - Google Patents
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Abstract
Un cristal que contiene un polipéptido de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NeM. 2 en complejo con un inhibidor L: (Ver fórmula)
Description
Cocristalización del dominio de transactivación
E2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos X
que definen el bolsillo de unión del inhibidor.
La invención esta relacionada con la proteína E2
del virus del papiloma humano, concretamente la estructura
cristalina del dominio de transactivación de la proteína E2 del
virus del papiloma humano 11 (VPH-11) que forma un
complejo con un inhibidor. En particular, la invención proporciona
coordenadas de la estructura cristalina que definen un bolsillo de
unión del inhibidor y proporciona un modelo estructural
tridimensional mediante el que se pueden identificar inhibidores
potenciales que encajarían en este bolsillo. También se describen
métodos para facilitar el diseño y la selección de inhibidores de la
actividad de la proteína E2 implicada en la replicación de DNA de
papilomavirus, en concreto del papilomavirus humano.
Los papilomavirus (PV) son virus de DNA sin
envoltura que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio.
Estos virus están muy extendidos en la naturaleza y se han
reconocido en vertebrados superiores. Se han caracterizado virus en
humanos, ganado vacuno, conejos, caballos y perros, entre otros. El
primer papilomavirus descrito fue el papilomavirus del conejo común
(CRPV), descrito en 1933. Desde entonces, el papilomavirus del
conejo común (CRPV) y el papilomavirus bovino tipo 1
(BPV-1) han sido utilizados como prototipos
experimentales para estudios sobre los papilomavirus. La mayor
parte de los papilomavirus animales están asociados a lesiones
proliferativas exclusivamente epiteliales y la mayoría de las
lesiones en animales son cutáneas. En los humanos existen más de 75
tipos de papilomavirus (VPH) identificados que se han catalogado en
función de la localización de la infección: epitelio cutáneo,
epitelio de las mucosas (oral y genital). Las enfermedades
relacionadas con la piel incluyen verrugas planas, verrugas
plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con las mucosas
incluyen papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los
carcinomas cervicales (Fields. Virology. 3rd ed. Philadelphia, NY:
Lippincott - Raven Pub.; 1996).
Existen más de 25 tipos de VPH implicados en las
enfermedades anogenitales; estos se agrupan en tipos de "alto
riesgo" o de "bajo riesgo". Los tipos de bajo riesgo
incluyen el VPH tipo 6 y el tipo 11, que inducen lesiones
mayormente benignas como las condyloma acuminata (verrugas
genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado
(SIL). En Estados Unidos hay unos 5 millones de personas afectadas
de verrugas genitales de las que el 90% se atribuye a
VPH-6 y VPH-11.
Los tipos de alto riesgo están asociados a SIL
de alto grado y cáncer cervical, y mayormente incluyen los tipos
16, 18, 31, 33, 35, 45 y 52 de VPH. La progresión desde una SIL de
bajo grado a una de alto grado es mucho más frecuente en el caso de
lesiones que contienen VPH-16 y 18 de elevado riesgo
en comparación con aquellas que contienen tipos de VPH de bajo
riesgo. Además, en el cáncer cervical solamente cuatro tipos de VPH
se detectan con frecuencia (los tipos 16, 18, 31 y 45). A escala
mundial se diagnostican anualmente cerca de 500.000 casos nuevos de
cáncer de cérvix invasivo (Fields, 1996, supra).
El tratamiento para las verrugas genitales
incluye la eliminación física como es la crioterapia, el láser de
CO_{2}, la electrocirugía o la extirpación quirúrgica. También
cabe la posibilidad de utilizar agentes citotóxicos como el ácido
tricloroacético (ATC), la podofilina o el podofilox. También se
dispone de agentes inmunomoduladores como Interferón o Imiquimod
(Aldara®, 3M Pharmaceuticals). Estos tratamientos no son
completamente efectivos en la eliminación de la totalidad de las
partículas víricas y conllevan tanto un elevado coste como unos
efectos secundarios desagradables. Además las verrugas recurrentes
son comunes (Beutner & Ferenczy. Amer J Med. 1997;
102(5A):28-37).
La ineficacia de los métodos actuales de
tratamiento de las infecciones por VPH ha puesto de manifiesto la
necesidad de identificar nuevos sistemas de control o eliminación de
estas infecciones. En los últimos años se ha dedicado mucho esfuerzo
a encontrar compuestos antivirales y, en especial, compuestos con
capacidad para interferir en la replicación vírica (Hughes y
Romanos. Nucleic Acids Res. 1993; 21:5817-5823;
Clark, et al. Antiviral Res. 1998;
37(2):97-106; Hajduk, et al. J Med
Chem. 1997; 49(20):3144-3150 y Cowsert, et
al. Antimicrob Agents Chemother. 1993;
37(2):171-177). Por esta razón, ha adquirido
importancia el estudio de la genética de los VPH con el fin de
identificar posibles dianas quimioterapéuticas que contengan y
posiblemente eliminen cualquier enfermedad causada por una infección
de VPH.
El ciclo de vida de PV se encuentra
estrechamente relacionado con la diferenciación de los
queratinocitos. Se piensa que la infección tiene lugar en un lugar
de interrupción hística del epitelio basal. A diferencia de lo que
sucede con células normales, la división celular continúa a medida
que la célula experimenta una diferenciación vertical. Mientras las
células infectadas sufren una diferenciación progresiva, la
maquinaria de replicación celular se mantiene lo que permite el
aumento de la replicación de DNA vírico, situación que finalmente
dará lugar a una expresión génica tardía y a un ensamblaje de
viriones en queratinocitos con diferenciación terminal, y a la
liberación de partículas víricas (Fields, supra).
La cadena codificante de cada uno de los genomas
del papilomavirus contiene aproximadamente diez marcos abiertos de
lectura (ORF) designados para traducción que se han clasificado en
ORF tempranos u ORF tardíos. Los genes de E1 a E8 se expresan al
principio del ciclo de replicación vírica. Los dos genes tardíos (L1
y L2) codifican las proteínas de cápside mayor y menor,
respectivamente. Los productos de los genes E1 y E2
intervienen en la replicación de DNA vírico mientras que E5, E6 y
E7 modulan la proliferación de las células huésped. Las funciones
de los productos de los genes E3, E4 y E8
actualmente se desconocen.
Hay estudios sobre el VPH que han demostrado que
las proteínas E1 y E2 son las únicas proteínas víricas necesarias
para la replicación de DNA vírico (Kuo, et al. J Biol Chem.
1994; 30:24058-24065). Este requisito es similar al
del virus del papiloma bovino tipo 1 (BPV-1). De
hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y
E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV), sin
importar la especie o el tipo vírico (Kuo, et al. 1994,
supra).
Cuando la replicación de DNA vírico tiene lugar
in vitro, en la que la proteína E1 está presente en exceso,
la replicación puede continuar en ausencia de E2. In vivo, en
presencia de una cantidad enorme de DNA, la replicación requiere de
la presencia tanto de E1 como de E2. Se piensa que el mecanismo de
iniciación de la replicación in vivo implica la unión
conjunta de E1 y E2 al origen, lo que conduce a la constitución de
un complejo terciario de proteína y DNA (Mohr, et al.
Science. 1990; 250:1694-1699). La proteína E2 es un
activador transcripcional que se une a la proteína E1 y debido a
esto potencia la unión de E1 al origen de replicación de BVP (Seo,
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993b;
90:2865-2869). De esta forma, E2 actúa como un
factor de especificidad cuando dirige a E1 hacia el origen de
replicación (Sedman y Stenlund. Embo J. 1995;
14:6218-6228). En el caso del VPH, Lui et al.
sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 a la secuencia ori (J
Biol Chem. 1995; 270(45):27283-27291 y
McBride et al. J Biol Chem. 1991;
266:18411-18414). Estas interacciones de DNA con
proteína y proteína con proteína se dan en el origen de la
replicación de DNA (Sverdrup y Myers, supra).
Las proteínas E2 de \sim45 kD descritas en
numerosos serotipos animales y humanos comparten una organización
común en dos dominios. El dominio de transactivación (TAD)
N-terminal tiene una longitud de unos 220
aminoácidos y el dominio de unión a DNA (DBD)
C-terminal de 100 aminoácidos. Los dos dominios
están unidos por una región enlazante flexible.
E2 activa la replicación vírica a través de la
unión conjunta con la proteína iniciadora vírica E1 al origen de la
replicación de DNA, dando como resultado al final, hexámeros de E1
funcionales. E2 también es un regulador central de la transcripción
vírica. Interactúa con factores de transcripción basal, como la
proteína de unión a TATA, TFIIIB y TAF_{II}70 humana; con
proteína promotora proximal de unión como Sp1; y con otros factores
celulares como AMF-1, que afectan de forma positiva
a la activación transcripcional de E2.
Sin embargo, resulta más ambiguo discernir
cuáles de estas muchas interacciones son suficientes o necesarias
para conseguir la activación transcripcional. Estos detalles
concuerdan con la idea de que las proteínas activadoras de unión
funcionan como activadores transcripcionales al utilizar contactos
específicos proteína-proteína para enlazar
componentes de la maquinaria general de transcripción a un promotor,
con la finalidad de reclutar a la RNA polimerasa II. Una tercera
función de E2 es la de facilitar la segregación correcta de DNA
vírico. El genoma del virus del papiloma bovino (BVP) y la proteína
E2 colocalizan con los cromosomas de la célula huésped durante la
mitosis, dependiendo de un TAD intacto de E2.
El DBD de E2 se dimeriza para formar un barril
\beta con hélices flanqueantes de reconocimiento situadas en las
principales cavidades del bolsillo de unión de DNA. Por el
contrario, la estructura del TAD de E2 no se ha conocido hasta que
Harris y Botchan (Science. 1999; 284(5420):1673)
proporcionaron un primer modelo de un fragmento proteolítico del
TAD de E2 de VPH-18 mediante cristalografía de rayos
X. El modelo sugiere una proteína con forma de anacardo de 55
\ring{A} x 40 \ring{A} x 30 \ring{A} con una hendidura cóncava
en un lado de la proteína y crestas en la superficie opuesta.
Harris y Botchan estudiaron si superficies discretas estaban
correlacionadas con actividades de E2 conocidas y en particular
identificaron una agrupación prominente de residuos que formaban el
borde interno de la cavidad principal que engloba a E175, L178, Y179
y 173 que define una superficie característica importante para la
transcripción.
Antson, et al. (Nature. 2000;
(403)805-809) describen la estructura
cristalina del TAD completo de E2 del VPH-16,
incluyendo una segunda interacción putativa recientemente
identificada entre E2 y TAD de E2 que contiene una agrupación de 7
residuos conservados (R37, A69, I73, E76, L77, T81 y Q80). Anston,
et al. sugirieron que Q12 y E39 pueden estar implicadas en
la interacción con E1.
La proteína E2 se considera una diana potencial
para agentes antivirales. Sin embargo, los esfuerzos realizados en
el descubrimiento de fármacos dirigidos hacia E2 se han visto
obstaculizados por la falta de información estructural de una E2
unida a un inhibidor formando un complejo. Ni el modelo de Harris ni
el de Antson proporcionan ninguna información respecto a la
localización o la caracterización de un posible bolsillo de unión
del inhibidor. La información estructural del dominio TAD de apo E2
ha generado cierto conocimiento muy útil de la superficie de la
apoproteína, pero ahora parece claro que esto no es representativo
de los cambios de conformación inducidos al unirse a un
inhibidor.
La falta de inhibidores específicos de E2, que
son necesarios para la obtención de la cocristalización de E2 y los
inhibidores, ha obstaculizado la búsqueda de un bolsillo de unión
del inhibidor en E2. Por tanto, el análisis cristalográfico por
difracción de rayos X de un complejo
inhibidor-proteína de este tipo no ha sido
posible.
\newpage
La presente invención hace referencia a una
serie de documentos cuyo contenido se incorporan aquí mediante
referencias.
La presente invención resuelve los problemas que
trabajos anteriores habían dejado sin resolver proporcionando una
nueva composición que contiene un dominio de transactivación de la
proteína E2 del virus del papiloma humano en forma de complejo con
una pequeña molécula inhibidora de E2, y métodos para fabricar esta
composición. De forma ventajosa, la presente invención proporciona
también un complejo E2-inhibidor capaz de ser
cristalizado y analizado por difracción de rayos X, y así
proporcionar información importante acerca del bolsillo de unión
del inhibidor del dominio de transactivación de la proteína E2 de
VPH. El inhibidor constituye una herramienta inmejorable para
producir una cocristalización y permitir así la caracterización de
un bolsillo de unión del inhibidor previamente desconocido que
puede estar interactuando con E1 durante el ciclo de replicación de
VPH.
También se describe un método de determinación
de al menos una porción de la estructura tridimensional de
moléculas o complejos moleculares, que contiene al menos algunas
características similares en estructura a un bolsillo de unión del
inhibidor de E2 del VPH.
Se describe, además, un modelo
3-D de análisis y predicción de la unión de
inhibidores potenciales para así facilitar la búsqueda de nuevos
inhibidores que se puedan unir al bolsillo de unión identificado. La
localización y caracterización de este bolsillo de unión, como se
describe en la presente invención, proporciona una posible diana
terapéutica nueva en el tratamiento de infecciones por PV.
Otro método que se describe es un cribado para
identificar agentes que tengan la capacidad de modular esta nueva
diana, y un sistema para seleccionar al menos uno de estos agentes
capaz de impedir la replicación del DNA de PV.
También se describe un método de producción de
un fármaco que inhibe la interacción entre E1 y E2, que comprende
la identificación o el diseño de un fármaco que encaje en el
bolsillo de unión del modo aquí descrito.
De acuerdo con el primer aspecto de la
invención, se proporciona un cristal que contiene un polipéptido de
tipo PV E2 TAD con ID. de SEC. Núm. 2, que forma un complejo con un
inhibidor L:
De acuerdo con un segundo aspecto de la
invención, se proporciona un método de producción de un polipéptido
de tipo PV E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un
complejo con un inhibidor L, antes definido, que comprende:
a) la mezcla del polipéptido de tipo PV E2 TAD
purificado, contenido en un tampón de purificación, con inhibidor L
solubilizado para generar un solución compleja que contenga dicho
complejo PV E2 TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en
un tampón de cristalización.
Otro método que aquí se describe consiste en
producir un polipéptido de tipo PV E2 TAD cristalizado con ID. de
SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un inhibidor L, que comprende
la mezcla de polipéptido de tipo PV E2 TAD con ID. de SEC. Núm. 2,
contenido en un tampón de purificación, con un tampón de
cristalización.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para producir un polipéptido de tipo PV E2 TAD
cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un
inhibidor L (PV E2 TAD-L), antes definido, que
comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en un
tampón de cristalización y
b) la inmersión del polipéptido de tipo PV E2
TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 anteriormente definido en
a).
También se describen unas coordenadas de la
estructura cristalina de rayos X del complejo PV E2
TAD-inhibidor (PV E2 TAD-L) definido
anteriormente.
Se describe además un medio de almacenamiento de
datos de lectura informática que comprende un material de
almacenamiento de datos codificado con las coordenadas de estructura
cristalina de rayos X, o al menos una porción de las coordenadas
estructurales, expuestas en la Figura 9.
Por otro lado, se describe también un ordenador
que genera una representación tridimensional de dicho complejo PV
E2 TAD-L aquí definido, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de
lectura informática que comprende un material de almacenamiento de
datos codificado con dichas coordenadas estructurales expuestas en
la Figura 9;
b) una memoria destinada al almacenamiento de
instrucciones para el procesamiento de los datos de lectura
informática mencionados;
c) una unidad central de proceso acoplada a
dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática para
el procesado de dichos datos y generar la representación
tridimensional mencionada; y
d) un monitor acoplado a la unidad central de
proceso para mostrar dicha representación tridimensional.
También se describe un método para la producción
de una proteína E2, siendo dicha proteína de utilidad en la
identificación o caracterización de inhibidores de TAD de E2, que
comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina de
VPH E2 TAD-L aquí definida para identificar residuos
de VPH del bolsillo de unión del inhibidor;
b) la comparación de estos residuos de VPH del
bolsillo de unión del inhibidor con residuos análogos en otra E2 de
PV;
c) la mutación de estos otros residuos de PV en
dichos residuos de VPH para producir un híbrido; y
d) someter a ensayo la inhibición de dicho
híbrido con un inhibidor.
Una vez descrita la invención de forma general,
pasamos a referirnos a las imágenes anexas, mostrando mediante
ilustración una realización preferida de la misma en la que:
la Figura 1A representa la secuencia
aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del
VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 1) obtenida por Sakai,
et al. J Virol. 1996; 70:1602-11;
la Figura 1B representa la secuencia
aminoacídica del dominio de transactivación de E2 del
VPH-11 (ID. de SEC. Núm. 2) obtenida según el
procedimiento del Ejemplo 1;
la Figura 2 representa diagramas estereográficos
en cintas de la apo E2 del VPH-16 como los descritos
en Antson, et al. (supra);
la Figura 3 representa diagramas estereográficos
en cintas de la apo E2 del VPH-11 generadas por el
Solicitante;
la Figura 4 representa diagramas de lazos de la
E2 del VPH-11 en complejo con el compuesto L aquí
descrito;
la Figura 5 constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor del TAD de apo E2 del VPH-16 (Antson,
et al. supra);
la Figura 6A constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor de la apo E2 del VPH-11 producida por el
Solicitante;
la Figura 6B constituye una representación de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión del
inhibidor del co-cristal;
la Figura 7 muestra una representación
esquemática del movimiento de Y19 y H32 que tiene lugar en el
bolsillo de unión al unirse con un inhibidor;
\newpage
la Figura 8 representa una visión superior de la
superficie accesible para disolvente del bolsillo de unión que
muestra en especial una cavidad profunda y una cavidad poco
profunda;
la Figura 9 muestra una lista de las coordenadas
de la estructura atómica del TAD de E2 en complejo con el compuesto
L generadas mediante difracción de rayos X a partir del complejo
cocristalizado (a partir de ahora referido como VPH TAD
E2-L). La preparación del complejo se describe en el
Ejemplo 3. Los siguientes términos tienen estos significados: el
término A.A. se refiere al aminoácido identificado por cada
coordenada; en esta columna, el término "CPR" significa
cis-prolina; BLHA = primera molécula del inhibidor L y BLHB =
segunda molécula del inhibidor L. Falta la información acerca de
los aminoácidos 197 y 201 de la cadena A debido a la elevada
flexibilidad de estos residuos que les confiere la facultad de ser
invisibles a los rayos X. Por esta misma razón, los siguientes
aminoácidos se modelan como Alanina: E2, K107, K173, S180, M182,
H183 y P196. "X, Y, Z" definen cristalográficamente la
posición atómica determinada para cada átomo en un espacio de
coordenadas cartesianas. "Occ." es un factor de ocupación que
hace referencia a la fracción de las moléculas en la que cada átomo
ocupa la posición especificada por las coordenadas. Un valor de
"1" indica que cada átomo tiene la misma conformación, p. ej.
la misma posición, en todas las moléculas del cristal. "B" es
un factor térmico que mide el movimiento del átomo alrededor de su
centro atómico. Las coordenadas de los residuos que forman la
cavidad profunda se muestran en negrita; y
la Figura 10 representa la alineación de los
grupos de secuencias aminoacídicas que definen de forma general la
región del bolsillo de unión del inhibidor del dominio de
transactivación de E2 de VPH-6A,
VPH-11, VPH-16 y
VPH-18. Los residuos que están en negrita indican
que definen la cavidad profunda del bolsillo de unión del
inhibidor. El subrayado único define los residuos del fondo del
bolsillo profundo. El doble subrayado indica los residuos del
bolsillo poco profundo. Y19 está indicado en cursiva.
Las siguientes abreviaciones se utilizan a lo
largo de la especificación.
El término "en asociación con" o "de
unión a" se refiere a una condición de proximidad entre entidades
químicas o compuestos, o porciones de los mismos. La asociación
puede ser no covalente, en la que la yuxtaposición está favorecida
en cuanto a la energía por enlaces de hidrógeno o interacciones de
van der Waals o electrostáticas, o puede ser covalente.
El término "bolsillo de unión", tal como se
utiliza aquí, hace referencia a una región de una molécula o
complejo molecular que, gracias a su forma, se asocia de forma
ventajosa con otra molécula, complejo molecular, entidad química o
compuesto. Tal como aquí se emplea, el bolsillo comprende al menos
una cavidad profunda y, opcionalmente una cavidad poco
profunda.
Tal como aquí se utiliza, el término
"complejo" se refiere a la combinación de una molécula o una
proteína, de análogos conservativos o truncaciones de los mismos,
asociados con una entidad química.
Las abreviaturas de los aminoácidos utilizados
en esta solicitud se disponen de la siguiente manera:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
El término "análogo" del modo aquí empleado
y en el contexto de esta invención denota una secuencia aminoacídica
que retiene una actividad biológica (o funcional o estructural) que
es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Este
análogo puede ser de la misma especie o no y puede ser un análogo
natural o estar preparado de forma sintética. Estos análogos
incluyen secuencias aminoacídicas con sustituciones, deleciones o
adiciones de uno o más aminoácidos, siempre y cuando se conserve la
actividad biológica de la proteína. En concreto, el término
"análogo conservativo" denota un análogo con un aminoácido
sustituido por otro aminoácido con una fuerte o débil similitud
(véase, por ejemplo, Dayhoff MO. Atlas of Protein Sequence and
Structure. Washington DC, National Biomedical Research Foundation;
1978; 5 Suppl 3.) como se define en la Tabla que aparece a
continuación:
\newpage
Tabla de similitud de
aminoácidos
El término "cadena lateral" en referencia a
un aminoácido o un residuo de aminoácido significa un grupo unido
al átomo de carbono \alpha del aminoácido \alpha. Por ejemplo,
la cadena lateral del grupo R para la glicina es hidrógeno, para
alanina es metilo o para valina es isopropilo. Para los grupos R
específicos o cadenas laterales de los aminoácidos \alpha se hace
referencia al texto de A.L. Lehninger sobre Bioquímica (véase el
capítulo 4).
El término "truncación" hace referencia a
cualquier segmento de la secuencia aminoacídica de TAD de E2, o de
cualquier segmento de cualquiera de los análogos descritos aquí
anteriormente, que comprende los suficientes aminoácidos para
definir la cavidad profunda del bolsillo de unión del inhibidor de
la presente invención en la misma relación espacial que la definida
por las coordenadas de la Figura 9.
El término "desviación media cuadrática" o
"desviación rms" o "rmsd" significa la raíz cuadrada de la
media aritmética del cuadrado de las desviaciones de la media. En
el contexto de objetos atómicos, los números se proporcionan en
angstroms (\ring{A}). Consiste en una manera de expresar la
desviación o variación respecto a una pauta o un objeto. En el caso
de la presente invención, todas las comparaciones de rmsd se
obtuvieron comparando estructuras que se habían superpuesto
utilizando solamente los átomos de la cadena principal de H32, W33 y
L94 con el mínimo solapamiento de rms. Esto se realizó
exclusivamente mediante movimiento de cuerpos rígidos. La rmsd de
los átomos de cadena principal para esta acción entre la estructura
apo en cuestión y el complejo aquí descrito es de 0,078
\ring{A}.
De acuerdo con una primera realización, se
proporciona un cristal que contiene un polipéptido de tipo VPH E2
TAD de ID. de SEC. Núm. 2 en complejo con un inhibidor L:
Se prefiere que la composición contenga los
aminoácidos 1 a 220 de la proteína E2 del VPH (ID. de SEC. Núm. 1)
definida según la numeración de Swiss Prot: locus VE2_HPV11 acceso
P04015; ID. único:g137671, análogos conservativos o truncaciones de
los mismos. Más preferiblemente, el dominio de transactivación (TAD)
de E2 contiene los aminoácidos 1 a 218, en particular 1 a 215 y aún
más preferiblemente 1 a 201. Más preferible aún es que el TAD de E2
utilizado para la presente invención comprenda los aminoácidos 2 a
201 y en particular 2 a 196. finalmente, lo más preferible es que
la composición contenga los aminoácidos 15 a 104 del TAD de E2.
En otro aspecto de la primera realización, el
TAD de E2 del VPH utilizado para la presente invención se obtiene a
partir de la cepa de VPH-11 y se encuentra formando
un complejo con la molécula pequeña inhibidora L. La presente
invención también contempla otros tipos de papilomavirus (PV),
incluidos BPV (virus del papiloma bovino) o CRPV (virus del
papiloma del conejo común).
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un método de producción de un polipéptido de tipo PV
E2 TAD cristalizado de ID. de SEC. Núm. 2 en complejo con el
inhibidor L definido anteriormente, que comprende:
a) la mezcla de polipéptido purificado de tipo
PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2, contenido en un tampón de
purificación, con inhibidor L solubilizado y para generar así así
generar una solución compleja que contenga dicho complejo PV E2
TAD-L; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en
un tampón de cristalización.
En un aspecto preferido del paso a) de la
tercera realización, el inhibidor L es solubilizado en DMSO al 100%
a una concentración de 60 mM.
En un aspecto preferido del paso a) de la
tercera realización, el tampón de purificación contiene un agente
reductor que puede seleccionarse entre TCEP o DTT. Es más preferible
que el agente reductor sea TCEP. Preferiblemente, el agente
reductor es TCEP a una concentración de alrededor de 1 mM a
alrededor de 10 mM. Es más preferible que el agente reductor sea
TCEP a una concentración de 5 mM.
El tampón de purificación se utiliza de un modo
preferido a un pH de entre 7 y 9. Más preferiblemente se utiliza a
un pH de 8.
\newpage
Además del agente reductor, es posible añadir
una sal para facilitar la estabilidad del TAD de E2 del VPH. La sal
puede seleccionarse preferiblemente de entre NaCl, NH_{4}SO_{4}
o KCl. La sal más preferible es NaCl a una concentración de cerca
de 200 mM a cerca de 800 mM. Aún más preferible es que la sal sea
NaCl a una concentración de 500 mM.
También se puede añadir además del agente
reductor un tampón para facilitar aún más la estabilidad del TAD de
E2 del VPH. El tampón puede seleccionarse preferiblemente de entre
Tris-HCl, HEPES o bis-Tris. El
tampón más preferible es Tris-HCl a una
concentración de cerca de 0 nM a cerca de 50 mM. Aún más preferible
es que el tampón sea Tris-HCl a una concentración
de 25 nM.
Otro componente que puede añadirse además del
agente reductor es un agente quelante para reducir la degradación
del TAD de E2 de VPH por proteasas. El agente quelante puede ser
preferiblemente EDTA o EGTA. Más preferiblemente, el agente
quelante es EDTA a una concentración de entre 0 mM y 1 mM. Es aún
más preferible que el agente quelante sea EDTA a una concentración
de entre 0 mM y 0,5 mM. Lo más preferible es que sea EDTA a una
concentración de 0,1 mM.
En un aspecto preferido del paso a) de la
tercera realización se utiliza preferentemente la solución proteica
de TAD de E2 del VPH a una concentración de unos 5 g/ml en el tampón
de purificación. Es más preferible utilizar el TAD de E2 del VPH a
una concentración de unos 10 mg/ml en el tampón de purificación.
En un aspecto preferido del paso b) de la
tercera realización es preferible seleccionar el tampón de
cristalización de entre MES, fosfato sódico, fosfato potásico,
acetato sódico o succinato sódico. Más preferible es que el tampón
de cristalización sea MES a una concentración de cerca de 50 mM a
cerca de 0,2 M. El tampón de cristalización más preferido es MES a
una concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización preferiblemente
contiene además un agente precipitante que facilita la
cristalización del TAD de E2 del VPH. El agente precipitante puede
seleccionarse preferiblemente de entre MPD, isopropanol, etanol o
butanol terciario. Es más preferible que el agente precipitante sea
MPD a una concentración del 30% al 40% aproximadamente. Lo más
preferible es que el agente precipitante sea MPD a una concentración
del 35%.
El tampón de cristalización se utiliza
preferentemente a un pH de entre 4,5 y 6,5, pero lo más preferible
es utilizarlo a un pH de 5,5.
En un aspecto preferido del paso b) de la
tercera realización, la cristalización del complejo HPV E2
TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica por
difusión de vapor en gota colgante o "hanging drop".
En un aspecto importante de la tercera
realización, la invención del complejo cristalizado HPV E2
TAD-L es susceptible a la cristalografía por rayos
X. Mediante el uso de análisis de cristalografía por rayos X, los
cristales de complejo HPV E2 TAD-inhibidor obtenidos
pertenecen al grupo de espacio P4(1) con una dimensión de
celda unidad de a = b = 60.7 \ring{A} y c = 82,5 \ring{A} y
contienen una molécula por unidad asimétrica. Los datos iniciales
de difracción se midieron mediante un generador de rayos X de fuente
propia (Rigaku, Japón) equipado con un detector de área de impresión
de placa R-axis II (Molecular Structure Corp,
Texas). Se recogieron preferentemente datos a una resolución de 3,15
\ring{A} en un cristal único del complejo enfriado a 100 K.
También se describe un método de producción de
apo VPH E2 TAD cristalizado, que comprende:
a) la mezcla de apo VPH E2 TAD, contenido en un
tampón de purificación, con un tampón de cristalización.
En otro aspecto de la misma realización, el apo
VPH E2 TAD es apo VPH-11 E2 TAD. Más
preferiblemente, el apo VPH E2 TAD es apo
SE-VPH-11 E2 TAD.
En otro aspecto de la misma, el contenido del
tampón de purificación es el aquí descrito. Preferiblemente, la
solución proteica de apo VPH E2 TAD se utiliza a una concentración
de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 15 mg/ml en el tampón de
purificación. Es más preferible que se utilice el apo VPH E2 TAD a
una concentración de alrededor de 1 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml
de TAD de E2 en el tampón de purificación. Pero lo más preferible
es que se utilice el apo VPH E2 TAD a una concentración de 5 mg/ml
en el tampón de purificación.
Además, el tampón de cristalización puede
seleccionarse de entre MES, fosfato sódico, fosfato potásico,
acetato sódico o succinato sódico. Más preferible es que el tampón
de cristalización sea succinato sódico a una concentración de cerca
de 50 mM a cerca de 0,2 M. El tampón de cristalización más preferido
es succinato sódico a una concentración de 0,1 M.
El tampón de cristalización también contiene
PEG8K, PEG4K o PEG5K monoetiléter. Más preferiblemente, el tampón
de cristalización también contiene PEG5K monoetiléter a una
concentración de cerca de un 10% a cerca de un 25%. La forma más
preferible es que el tampón de cristalización también contenga PEG5K
monoetiléter a una concentración de cerca del 18%.
Preferentemente, el tampón de cristalización se
emplea a un pH de entre 4,5 a 6,5, pero lo más preferible es que se
emplee a un pH de 5,0.
Es preferible que el tampón de cristalización
además contenga sulfato de amonio a una concentración de aprox. 0,1
M a aprox. 0,4 M. Lo más preferible es que además lo contenga a una
concentración de 0,2 M.
La cristalización se lleva a cabo entre 0ºC y
10ºC, siendo la temperatura más preferida la de 4ºC.
Los cristales de apo VPH-11 E2
TAD pertenecen al grupo de espacio C222 con dimensión de celda
unidad de a = 54,9 \ring{A}; b = 169,9 \ring{A} y c = 46,1
\ring{A} y contenían una molécula por unidad asimétrica. Los datos
de difracción se recogieron en una línea de haz X4a (NSLS,
Brookhaven National Laboratory, New York). Se recogieron 4 conjuntos
de datos a partir de un único cristal enfriado a 100 K, a cuatro
longitudes de onda de rayos X diferentes cercanas al límite de
absorción del selenio (0,9790 \ring{A}, 0,9794 \ring{A}, 0,9743
\ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se tomaron imágenes en un ADSC Q4
CCD. La máxima resolución preferida fue de 2,4 \ring{A}.
De acuerdo con otra realización de la invención,
se proporciona un método para producir un polipéptido cristalizado
de tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2 que forma un complejo con un
inhibidor L, como el antes definido, que comprende:
a) la solubilización del inhibidor L en un
tampón de cristalización; y
b) la inmersión del polipéptido cristalizado de
tipo PV E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2, como el antes definido, en
a).
En un aspecto alternativo de dicha realización
de la invención, se proporciona un método para producir un complejo
cristalizado PV E2 TAD-inhibidor como el antes
definido, que comprende:
a) la adición de inhibidor L a un tampón de
cristalización que contiene un polipéptido cristalizado de tipo PV
E2 TAD de ID. de SEC. Núm. 2.
Además también se describen coordenadas de la
estructura cristalina por rayos X del complejo VPH E2
TAD-inhibidor (HPV E2 TAD-L), antes
definido. Preferiblemente, las coordenadas corresponden al bolsillo
de unión del inhibidor. Más preferiblemente, el conjunto de
coordenadas para el complejo VPH E2 TAD-inhibidor
están definidas según la Figura 9.
Es preferible que el bolsillo de unión del
inhibidor contenga una cavidad profunda que está delimitada por las
cadenas laterales de los aminoácidos H32, W33 y L94, donde la cadena
lateral del y19 del TAD de E2 de VPH es desplazado de su posición
original para formar una cavidad profunda de tal dimensión que
permite la entrada de una molécula inhibidora pequeña. Es más
preferible que la cavidad profunda esté alineada en su parte
inferior por los aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible es que el
bolsillo además contenga una cavidad poco profunda que esté
delimitada por uno o más aminoácidos de L15, I36, E39, K68, N71 y
A72.
Preferiblemente, el bolsillo de unión del
inhibidor está definido de acuerdo con las coordenadas asignadas a
los siguientes grupos de aminoácidos:
LLELYEE.....KHIMHWKCIRLE....KGHNA......EPWTLQDTSYEMWLT
(ID SEC Núm.9)(ID SEC Núm.10)(ID SEC Núm.11)(ID
SEC Núm.18)
Más preferiblemente, el bolsillo de unión del
inhibidor, y en concreto su cavidad profunda, está definido por las
coordenadas de H32, W33 y L94 según la Figura 9. Aún más
preferiblemente, están definidas por las coordenadas de las cadenas
laterales de h32, W33 y L94.
De forma alternativa, cabe la posibilidad de
considerar el cambio de la cadena lateral de Y19 desde un constructo
de proteína que reproduciría una cavidad profunda similar, pero sin
el estorbo de la cadena lateral de Y19.
Todavía es más preferible que el fondo de la
cavidad profunda esté definido por las coordenadas de los
aminoácidos H29 y T97. Lo más preferible incluso es que la cavidad
poco profunda del bolsillo de unión del inhibidor esté definida por
las coordenadas de uno o más de los aminoácidos L15, I36, E39, K68,
N71 y A72.
La estructura tridimensional del complejo VPH E2
TAD-L de esta invención está definida por un
conjunto de coordenadas estructurales como las expuestas en la
Figura 9. El término "coordenadas estructurales" se refiere a
coordenadas cartesianas procedentes de operaciones matemáticas
relacionadas con los patrones obtenidos con la difracción de un haz
monocromático de rayos X por los átomos (centros de difracción) de
un complejo E2-L en forma de cristal. Los datos de
difracción se utilizan para calcular un mapa de densidad de
electrones de la unidad del cristal repetida. Entonces se utilizan
esos mapas de densidad de electrones para establecer las posiciones
de los átomos individuales del bolsillo de unión del inhibidor en el
TAD de E2.
Los expertos en la materia comprenderán que un
conjunto de coordenadas estructurales para una proteína o un
complejo proteína-inhibidor o una porción de los
mismos, es un conjunto relativo de puntos que definen una forma en
tres dimensiones. Por lo tanto, es posible que un conjunto
completamente diferente de coordenadas defina una forma similar o
idéntica.
Las variaciones de coordenadas pueden generarse
debido a manipulaciones matemáticas de las coordenadas
estructurales. Por ejemplo, las coordenadas estructurales expuestas
en la Figura 9 se podrían manipular por permutaciones
cristalográficas de las mismas, por fraccionalización o por
operaciones matriciales en conjuntos de las coordenadas
estructurales, o cualquier combinación de las opciones
mencionadas.
Para determinar si una molécula, un complejo
molecular o una porción de los mismos son suficientemente similar
a la totalidad o a partes de la proteína E2 del VPH, o del TAD de E2
del VPH, descritos anteriormente, como para considerarlas iguales,
son necesarios diversos análisis informáticos. Estos análisis pueden
llevarse a cabo en aplicaciones actuales de programas informáticos,
como la aplicación de Similitud Molecular de QUANTA (Molecular
Simulations Inc., San Diego, CA), versión 4.1.
La aplicación de Similitud Molecular permite
realizar comparaciones entre estructuras diferentes, conformaciones
diferentes de una misma estructura y partes diferentes de la misma
estructura. El procedimiento utilizado en la Similitud Molecular
para comparar estructuras se divide en cuatro pasos: 1) carga de las
estructuras a comparar; 2) definición de la equivalencia atómica en
estas estructuras; 3) realización de una operación de
"fitting" (superposición); y 4) análisis de los resultados.
Cada estructura está identificada por un nombre.
Entonces se identifica una estructura como diana (es decir, la
estructura fija); el resto de estructuras son las estructuras
operativas (es decir, estructuras en movimiento). Dado que la
equivalencia atómica en QUANTA viene definida por la entrada del
usuario, para el propósito de esta invención se determinaron los
valores de rmsd utilizando átomos de las cadenas principales de los
aminoácidos H32, W33 y L94 entre las dos estructuras
comparadas.
En los casos en que se utiliza un método de
"fitting" rígido, la estructura operativa sufre una traslación
y una rotación para encajar de forma óptima con la estructura diana.
La operación de "fitting" utiliza un algoritmo que calcula la
traslación y rotación óptimas que se deben aplicar a la estructura
móvil de modo que la diferencia media cuadrática del encaje
respecto de los pares especificados del átomo equivalente sea un
mínimo absoluto. Una vez superpuestas las dos estructuras es posible
calcular un valor rmsd para conjuntos específicos de átomos
equivalentes.
En esta invención también se describe un medio
de almacenamiento de datos de lectura informática que contiene un
material de almacenamiento de datos codificado con las coordenadas
estructurales, o al menos una parte de las coordenadas
estructurales expuestas en la Figura 9. Los expertos en la materia
conocerán perfectamente estos medios de almacenamiento de lectura
informática como son los CD-ROM o los disquetes
("discos flexibles").
Por tanto, de acuerdo con la presente invención,
las coordenadas estructurales de un complejo VPH E2- inhibidor, y
en particular un complejo VPH E2 TAD-L, y de
porciones de los mismos pueden almacenarse en un medio de
almacenamiento de lectura informática. Estos datos se pueden
utilizar con diversos propósitos, por ejemplo el hallazgo de
fármacos o el análisis cristalográfico por rayos X de cristales de
proteína.
También se describe un ordenador para generar
una representación tridimensional del complejo VPH E2
TAD-L, que comprende:
a) un medio de almacenamiento de datos de
lectura informática que comprende un material de almacenamiento de
datos codificado con las coordenadas estructurales expuestas en la
Figura 9;
b) una memoria para el almacenamiento de
instrucciones para el procesado de dichos datos de lectura
informática;
c) una unidad central de proceso acoplada a
dicho medio de almacenamiento de datos de lectura informática, para
el procesado de dichos datos de lectura informática con el fin de
generar la representación tridimensional; y
d) un monitor acoplado a dicha unidad central de
proceso que muestre dicha representación tridimensional.
\newpage
En la presente invención también se describe una
estructura tridimensional de al menos una parte del complejo
molecular, que contiene características de estructura similar a un
bolsillo de unión del inhibidor de TAD de E2 del VPH.
La forma del bolsillo de unión del inhibidor, de
acuerdo con la presente invención, se puede visualizar como que
contiene un bolsillo profundo y, de forma opcional, un bolsillo
menos profundo (véase la Figura 7). La forma de la cavidad profunda
está definida por las posiciones relativas de las cadenas laterales
de los aminoácidos H32, W33 y L49 y no por sus coordenadas
absolutas según la Figura 9. Es posible obtener coordenadas o
modelos estructurales similares a partir de técnicas diferentes (p.
ej. RMN, modelado, etc.) y estos se consideran dentro del alcance
de la presente invención.
Así, se describe la estructura tridimensional de
un complejo VPH E2-inhibidor, en concreto un
complejo VPH E2 TAD-L. Cabe destacar que esta
estructura ha proporcionado por primera vez información sobre la
estructura y la forma de este bolsillo de unión del inhibidor de
TAD de E2 del VPH.
Otra descripción es un método para la evaluación
del potencial de una entidad química de asociarse con un dominio de
transactivación de E2 de papilomavirus que comprende un bolsillo de
unión definido por las coordinadas estructurales de un dominio de
transactivación de la proteína E2 del VPH-11 que
contiene los aminoácidos H32, W33 y L94, o un modelo tridimensional
del mismo; o
un bolsillo de unión que además contiene las
coordenadas estructurales de uno de H29 y T97 o de ambos que
definen la parte inferior del bolsillo profundo; o
un bolsillo de unión que además comprende la
coordenada estructural de al menos un aminoácido seleccionado del
grupo formado por: L15, I36, E39, K68, N71 y A72.
También se describe la utilización de técnicas
de diseño racional de fármacos o basado en la estructura para
diseñar, seleccionar y sintetizar entidades químicas que incluyen
compuestos inhibidores con capacidad para encajar en el bolsillo de
unión del inhibidor del TAD de E2 del VPH, o de unirse a el, o
cualquier porción de los mismos.
Una técnica de diseño de fármacos
particularmente útil que facilita esta invención es el diseño
iterativo de fármacos. Esta técnica es un método de optimización de
las asociaciones entre una proteína y un compuesto mediante la
determinación y evaluación de estructuras tridimensionales de
conjuntos sucesivos de complejos
proteína-complejo.
Los expertos en la materia se percatarán de que
la asociación de ligandos o sustratos naturales con el bolsillo de
unión de sus receptores o enzimas correspondientes constituye la
base de múltiples mecanismos de acción biológicos. Igualmente, hay
una gran cantidad de fármacos que ejercen sus efectos biológicos
mediante la asociación con las cavidades de unión de receptores o
enzimas. Estas asociaciones pueden tener lugar con cualquiera de
las partes, o todas ellas, del bolsillo de unión. La comprensión de
este tipo de asociaciones facilitará la orientación del diseño de
fármacos hacia la obtención de asociaciones más favorables con sus
receptor o enzima diana y, por tanto, de efectos biológicos
mejorados. De esta forma, esta información es valiosa para el diseño
de ligandos o inhibidores potenciales de receptores o enzimas, como
los inhibidores de polipéptidos de tipo E2 VPH o, especialmente, de
TAD de E2 del VPH.
En el diseño iterativo de fármacos se obtienen
cristales de una serie de complejos
proteína-compuesto y a continuación se genera la
estructura tridimensional de cada complejo. Este tipo de enfoque
proporciona nuevos conocimientos sobre la asociación entre las
proteínas y los compuestos de cada complejo. Esto se consigue
mediante la selección de compuestos con actividad inhibidora,
obteniendo cristales de este nuevo complejo
proteína-compuesto, resolviendo la estructura
tridimensional del complejo, y comparando las asociaciones entre
los complejo proteína-compuesto nuevos y los
complejos proteína-compuesto previamente resueltos.
Es posible optimizar estas asociaciones a través de la observación
de cómo afectan los cambios del compuesto a las asociaciones
proteína-compuesto.
En algunos casos, el diseño iterativo de
fármacos se lleva a cabo creando complejos sucesivos
proteína-compuesto y a continuación cristalizando
cada complejo nuevo. De forma alternativa, se introduce en presencia
de un inhibidor un cristal de proteína formado previamente, tal
como se ha descrito anteriormente, formando de esta forma un
complejo proteína-compuesto y obviando la necesidad
de cristalizar cada complejo proteína-compuesto
individual. De forma favorable, los cristales de proteína E2 del
VPH, y en concreto los cristales de TAD de E2, proporcionados por
esta invención pueden introducirse en presencia de un inhibidor o
más concretamente de un inhibidor de E2 como un compuesto L, para
proporcionar complejos de cristal E2-inhibidor, como
se ha descrito anteriormente.
En ciertos casos es posible sintetizar un TAD de
E2 que carezca de la cadena lateral de Y19 para reproducir el
bolsillo de unión del inhibidor definido aquí. Se pretende que estas
modificaciones de la secuencia primaria para conseguir un bolsillo
de unión similar estén dentro del alcance de la presente invención.
También se contempla la utilización de este tipo de TAD de E2
modificado para realizar el cribado (mediante cualquiera de los
siguientes: RMN, MS, ensayos de desplazamiento de sonda, etc.) en
busca de un posible inhibidor del bolsillo acabado de definir.
Asimismo, se describe un método de producción de
una proteína E2, siendo dicha proteína útil para la identificación
o caracterización de inhibidores de TAD de E2, que comprende:
a) la utilización de la estructura cristalina de
VPH E2 TAD-L, definida anteriormente, para
identificar residuos del bolsillo de unión del inhibidor del
VPH;
b) la comparación de dichos residuos del
bolsillo de unión del inhibidor del VPH con residuos proteicos de
virus del papiloma de conejo común (CRPV);
c) la mutación de dichos residuos de CRPV en los
residuos de VPH mencionados, para producir un híbrido; y
d) ensayar la inhibición de dicho híbrido por un
inhibidor.
La infección de conejos de laboratorio con virus
del papiloma de conejo común (CRPV) o la introducción del genoma
del CRPV en la piel de estos conejos da lugar a la aparición de
grandes verrugas. El sistema del modelo de CRPV se ha utilizado
para evaluar posibles tratamientos anti-VPH (Kreider
JW, et al. (1992) "Preclinical system for evaluating
topical podofilox treatment of papillomas: dose response and
duration of growth prior to treatment" J Invest Dermatol. 1992;
99,813-818). Es fácil visualizar que esta cuestión
constituiría un sistema adecuado para ensayar la eficacia in
vivo de inhibidores de la replicación de DNA del VPH de unión a
E2. Sin embargo, las proteínas E2 de CRPV y de VPH solamente
comparten el 39% de identidad de secuencia y es posible que los
inhibidores de unión a la proteína de VPH no se unan a la E2 del
CRPV.
La estructura cristalina del inhibidor de TAD de
E2 del VPH, aquí descrita, se puede utilizar para identificar
residuos que forman parte del bolsillo de unión del inhibidor de VPH
y que difieren de la proteína del CRPV. Es posible entonces mutar
los residuos de CRPV hacia el correspondiente de VPH. El híbrido
resultante puede someterse a ensayo mediante traducción in
vivo del gen del híbrido para producir una proteína E2 que
podría probarse en ensayos in vitro como el ensayo de unión
de DNA a E1 dependiente de E2 (véase el Ejemplo 6). Si la proteína
híbrida resulta funcional en el ensayo, y se demuestra que es
sensible a los inhibidores de VPH, se puede utilizar el gen
correspondiente para inducir el crecimiento de verrugas en conejos.
Las verrugas resultantes de este procedimiento deben ser tratables
mediante inhibidores dirigidos originalmente a E2 de VPH. Así, la
utilización de este modelo híbrido, generado mediante el análisis
del complejo inhibidor de TAD del VPH, se podría utilizar para
ensayar compuestos del VPH en un modelo animal. Esta técnica también
puede ser aplicable a otros virus de papiloma como, entre otros, el
virus del papiloma bovino (BVP).
Con el propósito de que esta invención se
entienda más completamente se exponen los siguientes ejemplos. Estos
ejemplos solamente están destinados a ilustrar y de ningún modo
deben entenderse como limitadores del alcance de esta
invención.
Expresión de dominio de transactivación de E2
del VPH-11 marcado con His. Se amplificaron por
PCR los aminoácidos 2-201 de VPH-11
E2 (ID. de SEC. Núm. 2) a partir del plásmido
pCR3-E2 (Titolo, 1999) utilizando los cebadores
5'-CAA GAC GTG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC
CAT CAC GAA GCA ATA GCC AAG-3'(directo) (ID. DE SEC.
NÚM. 3) y 5'-CAC CAA GTG GAT CCG CTA GCT TAG CTA
GAT ACA GAT GCA GGA-3' (indirecto) (ID. DE SEC. NÚM.
4). El producto de PCR se digirió utilizando NcoI y BamHI y se ligó
a un plásmido pET-28b, que había sido digerido de
forma similar. El producto de ligación se transformó en E.
coli DH5\alpha MAX Efficiency® competentes (Life
Technologies). El plásmido recombinante que codifica el VPH11 E2 TAD
marcado con His (His-TAD) se aisló de un cultivo
del DH5a transformado y se verificó si era correcta la secuencia de
DNA del TAD de E2. El plásmido aislado se transformó entonces en la
cepa de E. coli BL21 (DE3)pLysS (Novagen).
Se generó mediante PCR un segundo constructo que
codificaba cuatro lisinas adicionales situadas en el extremo
C-terminal del dominio de transactivación de E2 (TAD
con cola de Lys) utilizando el cebador directo
5'-GGG CGC TAG ACC ATG GGA CAT CAC CAT CAC CAT CAC
GAA GCA ATA GCC AAG CGT TTA G-3' (ID. DE SEC. NÚM.
5) y el cebador indirecto 5'-CCC CGG ATC CTC ATT
ACT TTT TCT TTT TGC TAG ATA CAG ATG CAG GAG AAC-3'
(ID. DE SEC. NÚM. 6). Este producto se digirió del mismo modo que
antes y se ligó al plásmido pET15b. Se verificó que la secuencia de
DNA que codifica los aminoácidos 2-201 de E2 del
VPH11 era correcta y se transformó el plásmido en la cepa de E.
coli strain BL21(DE3)pLysS como se ha descrito
anteriormente.
Para la expresión de proteínas, se inoculó medio
de cultivo CircleGrow (Bio101) que contenía 34 \mug/ml de
cloranfenicol y 50 \mug/ml de canamicina (His-TAD)
o 100 \mug/ml de ampicilina (TAD con cola de Lys) con una
vigésimo quinta parte del volumen de un cultivo fresco de toda la
noche y se cultivaron células a 37ºC hasta alcanzar una DO (600 nm)
de aproximadamente 1,0. A continuación se cambió el cultivo a 22ºC y
se indujo la expresión proteica a una DO (600 nm) = 1,4 con IPTG
0,5 mM. Transcurridas seis horas, se recogieron las células
mediante centrifugación y se congelaron en hielo seco; entonces se
conservaron a 80ºC.
Purificación de proteínas de VPH11 TAD
marcadas con His. El procedimiento de purificación fue idéntico
para las proteínas de TAD marcado con His y TAD con cola de Lys;
todos los pasos se llevaron a cabo a 4ºC. Las células se
resuspendieron a 5 ml por gramo en tampón de purificación
(Tris-HCl 25 mM pH 8,0; NaCl 500 mM, TCEP 5 mM) con
los inhibidores de proteasa pepstatina, leupeptina y antipaína (cada
uno a 5 \mug/ml), fluoruro de fenilmetilsulfonilo (1 mM) y
Pefabloc® (Roche, 0,4 mM). La suspensión se sonicó, y el lisado
bruto se centrifugó durante 30 min a 26.000 g. El sobrenadante se
inyectó en una columna quelante Hi-Trap de 5
ml (APB) equilibrada con sulfato de níquel. Tras el lavado con
tampón de purificación más imidazol 0 mM y 25 mM, se eluyó el TAD
con tampón de purificación que contenía imidazol 100 mM. Las
fracciones que contenían TAD se agruparon y concentraron a menos de
5 ml, a continuación se cargaron sobre una columna de gel de
filtración Superdex-75 (APB) equilibrada con tampón
de purificación más EDTA 0,1 mM. Las fracciones que contenían TAD
puro se agruparon y concentraron a aproximadamente 5 mg/ml (TAD
marcado con His) o 12 mg/ml (TAD con cola de Lys). Se tomaron
alícuotas de proteína concentrada, se congelaron en hielo seco y se
conservaron a -80ºC.
Expresión y purificación de selenometionina
que contiene His-TAD. El plásmido que codificaba
His-TAD se transformó en la cepa de E. coli
B834 (auxotrófica para metionina). Se utilizó una única colonia
bacteriana para inocular un cultivo incubado toda la noche en medio
LB que contenía 34 \mug/ml de cloranfenicol y 50 \mug/ml de
canamicina. Una parte de este cultivo se diluyó 1:4000 en medio DL30
(LeMaster DM y Richards RM. Biochemistry.
1985;24:7263-68) en ausencia de metionina y
complementado con 2 \mug/ml de biotina y tiamina y 50 \mug/ml
de d,l-selenometionina y los mismos antibióticos.
Pasadas 26 horas a 37ºC, el cultivo había alcanzado una densidad de
0,8 (DO a 600 nm), y se indujo la expresión a 23ºC con IPTG 0,5 mM.
Transcurridas siete horas aproximadamente, se recogieron las
células y se conservaron del modo antes descrito. La purificación se
llevó a cabo de la misma forma descrita para
His-TAD, excepto en que los tampones de purificación
se rociaron con helio antes de su utilización, y se eluyó
His-TAD con imidazol 200 mM tras el lavado a 50 y
100 mM.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
A una suspensión de anhídrido
4-metilftálico (25,65 g; 158,2 mmol) en MeOH (79 ml)
a temperatura ambiente, se le añadió metóxido sódico (69 ml de
solución al 25% en peso, 316 mmol). Transcurridos 30 min, la mezcla
de reacción se diluyó en agua y la capa acuosa se lavó con
Et_{2}O. La capa acuosa se acidificó con HCl (4N) y se extrajo
con Et_{2}O. La capa orgánica se enjuagó con salmuera, se secó
(MgSO_{4}), filtró y concentró a presión reducida.
El residuo bruto se disolvió en acetonitrilo (79
ml) y se enfrió hasta 0ºC. A la solución resultante se le añadió
DBU de forma sucesiva (31,3 g; 206 mmol) y yodometano (33,7 g; 237,3
mmol). Tras 1 hora a 0ºC, se añadió yodometano (33,7 g; 237,3 mmol)
y la reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante
una hora más. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida,
y el residuo se diluyó en Et_{2}O (300 ml). La solución etérea se
lavó sucesivamente con HCl acuoso (4 N, 100 ml), NaOH (10%) y
salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró por evaporación.
El residuo resultante se trató con una solución etérea de
diazometano para completar la esterificación, tras la cual se
concentró para proporcionar el 4-metil dimetil
ftalato (222 g, rendimiento del 67%) en forma de aceite amarillo
claro.
A una solución de 4-metil
dimetil ftalato bruto (22,20 g, 106,6 mmol) en etilacetato (107 ml),
se añadió hidruro sódico (97%, 3,84 g, 160 mmol). La suspensión
resultante se calentó a reflujo durante 4,5 horas y seguidamente se
dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió Et_{2}O (100 ml)
para proporcionar un precipitado amarillo. El sólido amarillo se
filtró y lavó dos veces con una mezcla de alcohol etílico/dietiléter
(1/1).
Este sólido amarillo se disolvió entonces en HCl
(4 N, 100 ml) y se calentó a reflujo durante 30 min. Una vez
enfriado, se añadió EtOAc y la fase orgánica se separó y se lavó con
salmuera, se secó (MgSO_{4}), filtró y concentró para
proporcionar 5-metil 1,3-indanodiona
en forma de sólido amarillo (3,7 g; 22% de rendimiento)
Paso
a
A una solución de 5-metil
indan-1,3-diona (A) (410 mg; 2,6
mmol) en EtOH (13 ml) se añadió
3,4-diclorobenzaldehído (B) (493 mg 2,8 mmol)
seguido de piperidina (1 gota). La mezcla de reacción se calentó a
reflujo durante 30 min. Una vez enfriada, a la mezcla de reacción
se le añadió peróxido de hidrógeno acuoso (30%, 0,87 ml; 7,7 mmol)
y DBU (97 mg; 0,6 mmol). Se continuó agitando durante 30 min y a
continuación se añadió hexano (5 ml) y se filtró el precipitado. El
sólido resultante se trituró dos veces con una mezcla de
propanol/hexano (1/1) y se secó bajo vacío elevado para
proporcionar
3-(3,4-diclorofenil)-spiro(oxirano-2,2'-[5-Meil-indan])-1',3'-diona
(D) (701 mg; 82% de rendimiento).
Paso
c
Una mezcla de
3(3,4-diclorofenil)-spiro(oxi-rano-2,2'-[5-Metil-indan])-1',3'-diona
(D) (200 mg; 0,8 mmol) y
1-(4-[1,2,3]tiazol-4il-fenil)-pirrol-2,5-diona
(e) (155 mg; 0,6 mmol) en tolueno (46 ml) se calentó a reflujo
durante 16 h. Una vez enfriado y concentrado, el residuo se trituró
con EtOAc para proporcionar una mezcla de dos compuestos F/G
(isómeros racémicos cis/cis, 228 mg, 60% de rendimiento).
Paso
d
A una solución de compuestos F/G (210 mg; 0,36
mmol) en CH_{3}CN (36 ml) se le añadió NaOH (0,02 N; 17,8 ml; 0,36
mmol) utilizando una bomba de infusión con jeringa durante 1 h. Una
vez completada la adición, la mezcla de reacción se agitó durante 1
h más. A continuación se liofilizó la solución para proporcionar
una mezcla de compuestos J/K racémicos (227 mg, rendimiento
cuantitativo). Se obtuvo enantiómero L puro mediante separación en
HPLC preparativa utilizando una columna quiral (Chiracel OD,
eluyente isocrático 65% CH_{3}CN/H_{2}O que contiene 0,06% de
TFA; lámpara de UV a 205 nm; flujo de 7 ml/min). Las fracciones
deseadas se combinaron y liofilizaron. La sal sódica
correspondiente se preparó mediante tratamiento con NaOH (0,02 N; 1
equiv.) en acetonitrilo seguido de liofilización para proporcionar
las sales sódicas (15 mg) en forma de sólido blanco.
L: ^{1}H-RMN (400 MHz,
DMSO-d_{6})\delta 10,35 (s, 1H); 8,40 (d,
J = 8,6 Hz; 2H); 7,89-7,80 (m, 3H); 7,64 (m, 3H);
7,52 (d, J = 8,3 Hz; 1H); 7,51-7,34 (m, 1H); 5,75
(s, 1H); 4,19 (m, IH); 3,78 (m, 1H); 2,57 (s, 3H); ES MS m/z 606
(MH+).
La actividad inhibidora del compuesto se evaluó
de acuerdo con los ensayos descritos en el Ejemplo 6 y se determinó
que tenía un CI_{50} de 180 nM. La selectividad del inhibidor se
verificó por ausencia de actividad (o menor potencia) en el ensayo
del antígeno T mayor de SV40 descrito en el Ejemplo 7.
Se solubilizó polvo de inhibidor L en DMSO al
100% a una concentración de 60 mM. La solución proteica estaba
formada por 10 mg/ml de E2TAD en tampón de purificación
(Tris-HCl 25 mM pH a 8,0; NaCl 500 mM; TCEP 5 mM;
EDTA 0,l mM). El complejo de E2TAD-L se consiguió
mezclando 1 \mul de inhibidor L en 74 \mul de solución
proteica. La solución se mantuvo a 4ºC durante 2-3
horas antes de realizar los experimentos de cristalización.
La cristalización del TAD de apoE2 y del
complejo E2TAD-L se llevó a cabo mediante la técnica
por difusión de vapor en gota colgante (McPherson A. Preparation
and Analysis of Protein Cristals. Krieger Pub. 1989) en placas de
cristalización VDX (Hamton Research, Laguna Niguel, California).
En particular para la apo VPH-11
E2 TAD: 1 \mul de la solución Se-E2 TAD (5 mg/ml
en tampón de purificación) se mezcló con 1 \mul de una solución
compuesta por succinato sódico 0,1 M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y
sulfato amónico 0,2 M. La gota resultante de 2 \mul se suspendió
sobre 1 ml de solución de reserva compuesta por succinato sódico 0,1
M a pH 5,0; PEG5000mme al 18% y sulfato amónico 0,2 M. Los cristales
obtenidos a 4ºC pertenecen al grupo espacial C222 con una dimensión
de celda unidad de a = 54,9 \ring{A}; b = 169,9 \ring{A} y c =
46,1 \ring{A} y contienen una molécula por unidad asimétrica.
Los datos de difracción se recopilaron en la
línea de haz X4a (NSLS, Brookhaven National Laboratory, New York).
Se recogieron cuatro grupos de datos a partir de un único cristal
enfriado a 100 K, a cuatro longitudes de onda de rayos X diferentes
cercanas al límite de absorción del Selenio (0,9790 \ring{A};
0,9794 \ring{A}; 0,9743 \ring{A} y 0,9879 \ring{A}). Se
recogieron las imágenes en un ADSC Q4 CCD; la resolución máxima fue
de 2,4 \ring{A}.
Para la cristalización del complejo: 1 \mul de
la solución compleja, descrita en el ejemplo 3, se mezcló con 1
\mul de una solución compuesta por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35%
(metil pentano diol). La gota resultante se suspendió sobre 1 ml de
solución de reserva formada por MES 0,1 M a pH 5,5 y MPD al 35%. A
continuación se conservaron placas a 4ºC. Los cristales obtenidos
pertenecen al grupo espacial P4(1) con una dimensión de celda
unidad de a = b = 60,7 \ring{A} y c = 82,5 \ring{A} y contienen
una molécula por unidad asimétrica.
Los datos iniciales de difracción se midieron
utilizando un generador de rayos X de fuente propia (Rigaku, Japón)
equipado con un detector de área de impresión de placa
R-axis II (Molecular Estructura Corp, Texas). Se
recogieron datos a una resolución de 3,15 \ring{A} en un cristal
único del complejo enfriado a 100 K.
A continuación se recopilaron datos de
difracción a alta resolución en una línea de haz X25 (NSLS,
Brookhaven National Laboratory, New York). Las imágenes de
difracción se recogieron en un detector Brandeis B4 (Brandeis
University) montado sobre un goniómetro de ejes con geometría kappa
(Enraf-Nonius, Paises Bajos). Se recogió un conjunto
completo de datos a una resolución de 2,4 \ring{A} sobre un único
cristal del complejo enfriado a 100 K (presentado en la Figura
9).
La determinación de la fase de los datos del apo
cristal se realizó mediante MAD (Multi wavelength Anomalous
Dispersion, difracción de longitud de onda múltiple anómala)
utilizando el programa MLPHARE (Collaborative Computational Project,
número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein Crystallography,
Acta Cryst. D50, 760-763).
En el caso del cristal complejo se utilizó el
método de Sustitución Molecular (MR, del inglés Molecular
Replacement) para la estimación inicial de las fases de datos de
difracción. La apo estructura de Se-E2TAD se utilizó
como modelo. Se realizó una búsqueda de rotación y traslación a
través del programa AMORE (Collaborative Computational Project,
número 4, 1994, el grupo CCP4: programs for Protein Crystallography,
Acta Cryst D50, 760-763).
La construcción de un modelo en un mapa de
densidad de electrones se llevó a cabo con el programa informático O
(Alwyn Jones, Upsala University, Suecia) y el refinamiento del
modelo se realizó con el programa informático CNX (Molecular
Simulation Inc, San Diego, California). A continuación, se mejoró el
nuevo modelo mediante un procedimiento de ciclado que incluía el
cálculo de mapas de densidad de electrones, la reconstrucción del
modelo y los pasos de refinamiento. El modelo final constaba de 2 a
196 residuos de TAD de E2 y dos moléculas L inhibidoras. El factor
R cristalográfico final fue 24,6% y el factor R libre es 29,3%.
Este ensayo se diseñó tomando como modelo un
ensayo similar para el antígeno T de SV40 descrito por Mckay (J Mol
Biol. 1981; 145:471). Se generó por PCR una sonda de DNA con
radiomarcaje de 400 pb, que contenía el origen de replicación del
VPH-11 (Chiang et al. Proc Natl Acad Sci USA.
1992;89:5799), utilizando como molde el plásmido pBluescript™ SK que
codificaba el origen (nucleótidos 7886-61 del genoma
de VPH-11 en sitio BAMH1 único) y cebadores
flanqueantes del origen. El radiomarcaje se incorporó en forma de
[^{33}P]dCTP. El tampón del ensayo de unión consistía en
Tris 20 mM a pH 7,6; NaCl 100 mM; DTT 1 mmol y EDTA 1 mM.
Otros reactivos utilizados fueron: microesferas
de SPA con proteína A (tipo II, Amersham) y antisuero policlonal de
conejo K72, generado frente a un péptido que corresponde a los 14
aminoácidos del extremo C-terminal de E1 del
VPH-11. Siguiendo el protocolo de Amersham, se
mezcló un frasco de microesferas con 25 ml de tampón de ensayo de
unión. Para el ensayo se añadió una cantidad saturante de antisuero
K72 a las microesferas y la mezcla se incubó durante 1 h, se lavó
con un volumen de tampón de ensayo de unión y seguidamente se
resuspendió en el mismo volumen de tampón fresco de ensayo de unión.
Las reacciones de unión contenían 8 ng de E2, aproximadamente
100-200 ng de extracto nuclear que contenía E1 de
células infectadas por baculovirus (como se describe en WO 99/57283)
y 0,4 ng de sonda con radiomarcaje en un total de 80 \mul de
tampón de ensayo de unión. Transcurrida 1 h a temperatura ambiente,
se añadieron 25 \mul de suspensión de anticuerpo K72 con
microesferas SPA a la reacción de unión y se mezcló el resultado.
Después de una hora adicional de incubación a temperatura ambiente,
las reacciones se centrifugaron brevemente para obtener un pellet de
las microesferas y se determinó el alcance de la formación de
complejo mediante contaje por centelleo en un Packard TopCount™.
Generalmente la señal de las reacciones que contenían E1 y E2 era
20-30 veces mayor que el ruido de fondo observado
cuando se omitía E1, E2 o ambas proteínas.
Este ensayo mide la formación de un complejo
antígeno T de SV40 (Tag)-origen. El ensayo fue
desarrollado por McKay RDG (J Mol Biol. 1981;
145:471-488). En principio, es muy similar al ensayo
de unión a DNA de E1 dependiente de E2 (Ejemplo 6), con TAg
sustituyendo a E1 y E2 y una sonda ori de SV40 con radiomarcaje en
lugar de la sonda ori de VPH. El ensayo se utiliza para contrastar
el ensayo del Ejemplo 6, dado que TAg comparte homología funcional
con E1 y E2, pero posee una similitud de secuencia muy baja.
La sonda de DNA radiomarcada que contiene la
secuencia ori se generó por PCR utilizando el plásmido pCH110
(Pharmacia) como molde. Este molde codifica el origen mínimo de
replicación de SV40 en los nucleótidos 7098-7023.
Los cebadores eran: "sv40-6958sens" =
5'-GCC CCT AAC TCC GCC CAT CCC GC (ID. de SEC. NÚM.
7) y "sv40-206anti" = 5'-ACC
AGA CCG CCA CGG CTT ACG GC (ID. de SEC. NÚM. 8). El producto de PCR
tenía una longitud aproximada de 370 pares de bases y se marcó con
isótopo radiactivo utilizando 50 \muCi/100 \mul de reacción de
PCR de dCTP (\alpha-^{33}P). A continuación de
la reacción de PCR se purificó el producto utilizando el equipo de
purificación de PCR de Qiagen® o un procedimiento de extracción de
fenol/precipitación de etanol. El producto purificado se diluyó a
1,5 ng/\mul (estimado mediante electroforesis en gel) en TE. Las
preparaciones nuevas tenían aproximadamente 150.000 cpm/\mul.
Las reacciones de unión se llevaron a cabo
mediante la mezcla de 30 \mul de solución TAg (100 ng/pocillo, 200
ng de una sonda de DNA con radiomarcaje de ^{33}P y 7,5 \mul de
10 x tampón de unión a DNA (Tris-HCl 200 mM a pH
7,6; NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT 10 mM) en un volumen final de 75
\mul. Se permitió que las reacciones de unión tuvieran lugar a
temperatura ambiente durante 60 min. El antígeno T mayor, adquirido
de Chimerix, a 2,0 mg/ml.
Los complejos de DNA y proteína se captaron
inmunológicamente utilizando un anticuerpo monoclonal
\alpha-TAg (PAb 101, subtipo IgG2a, hibridoma
obtenido de ATCC y anticuerpo purificado en el propio laboratorio)
unido a microesferas de SPA con proteína A.
La inmunoprecipitación de complejos
proteína-DNA se realizó durante 1 h a temperatura
ambiente. Las placas se centrifugaron por un breve espacio de tiempo
y se realizó el recuento de fragmentos precipitados de DNA
radiomarcado en un contador TopCount®.
La figura 2 muestra un modelo de la estructura
cristalina de TAD de E2 del VPH-16 (Antson et
al. Nature. 2000; 403:805-809). Una vista
aumentada de la región del bolsillo de unión de este modelo, como se
muestra en la figura 5, demuestra que los aminoácidos Y32, W33 y L94
delimitan una cavidad que es demasiado pequeña para definir un
bolsillo adecuado que permita la unión de una pequeña molécula
inhibidora al mismo, sin ajustes comparables de las cadenas
laterales de los aminoácidos que puedan acoger al inhibidor.
Incluso cuando el dominio TAD de E2 del VPH11
correspondiente es cristalizado y modelizado, los aminoácidos
correspondientes de nuevo demuestran una cavidad demasiado pequeña
para definir cualquier tipo de bolsillo que pudiera contemplarse
como una diana adecuada para la unión de inhibidor (Figura 6A). Tal
como se muestra en la figura 6B, la presente invención muestra por
primera vez que la estructura cristalina del nuevo complejo E2
TAD-inhibidor proporciona un bolsillo nuevo e
inesperado de unión del inhibidor que constituye una herramienta
única para identificar inhibidores potenciales del proceso de
replicación del DNA de VPH.
Sorprendentemente, la estructura del complejo E2
TAD-inhibidor muestra que la unión del inhibidor L
induce un movimiento de la cadena lateral de la tirosina en posición
19 (Figura 7) allí donde el anillo aromático rota de forma
significativa hacia fuera de la pequeña cavidad observada en la
apoestructura, lo que da como resultado la formación de una cavidad
profunda. El movimiento de la cadena lateral de la tirosina en
posición 19 da una desviación rms para todos los átomos de 1,959
\ring{A}. Los expertos en la materia comprenderán que esta
desviación constituye un movimiento enorme, movimiento del que no se
podría haber predicho que hubiese ocurrido en solitario o en
presencia de un inhibidor de moléculas pequeñas.
Además, el anillo de imidazol de la histidina 32
rota 90 grados para acoger al inhibidor, pero aún sigue formando
parte de la cavidad profunda. El movimiento de la cadena principal
de la histidina 32 da una desviación rms para todos los átomos de
0,704 \ring{A}. No se podría haber predicho que tuviera lugar
ninguno de estos movimientos de rotación ni que dieran lugar a la
formación de esta cavidad profunda en el bolsillo de unión.
Como se muestra en la figura 6A, la cavidad
profunda viene definida por los aminoácidos histidina 32, triptófano
33 y leucina 94. El desplazamiento rmsd de "todos los átomos"
de estos tres residuos aminoacídicos es 0,5154 \ring{A}. No es
posible explicar este rms por la flexibilidad original de estos tres
residuos dentro del contexto del bolsillo de unión. De hecho, una
desviación rms de 1,0 \ring{A} se considera dentro de los límites
normales del contexto de una proteína completa de 200 aminoácidos.
En el presente caso, la variación de rms para todos los átomos de
H32, W33 y L94 entre apo E2TAD del VPH-16 de Antson
supra y apo E2TAD del VPH-11 del Solicitante
es 0,212 \ring{A}. Esto define el límite (superior) predecible
dentro del cual estos 3 residuos pueden moverse a la vez. La
presente invención se encuentra fuera del margen de movimiento
predecible para estos tres residuos.
La serina 98 no se encuentra en el mismo plano
que H32, W33 y L94 y forma parte de una porción menos profunda que
también se puede utilizar para generar modelos de un bolsillo mayor
que contenga una cavidad profunda formada por la H32, W33 y L94 y
una cavidad poco profunda definida por uno o más aminoácidos
seleccionados de: L15, I36, E39, K68, N71, A72, S98 e Y99 (véase la
Figura 8).
La Figura 9 contiene la lista de las coordenadas
de rayos X del complejo proteína-inhibidor que
pueden utilizarse para modelizar. De estas coordenadas se puede
inferir el hecho de que el complejo obtenido por el Solicitante
contiene dos moléculas de inhibidor; sin embargo el modelo mostró
que el segundo inhibidor se encuentra fuera de la cavidad profunda y
no interacciona con la proteína de forma significativa. Asimismo,
los siguientes aminoácidos están modelados como Alanina debido a su
elevada flexibilidad que les hace invisibles a los rayos X: E2,
K107, K173, S180, M182, H183 y P196.
De acuerdo con Harris & Botchan (Science.
1999; 284(5420); 1673), diversas proteínas E2 tienen de media
solamente el 30% de identidad de secuencia aminoacídica. Sin
embargo, el análisis mutacional sugiere que diversos TAD de E2
comparten un pliegue y un mecanismo de acción comunes. Siguiendo con
este argumento, los grupos de aminoácidos que definen el bolsillo de
unión del inhibidor identificado por el Solicitante poseen una
cantidad sorprendente de identidad/similitud, incluso entre VPH de
bajo y de elevado riesgo (Figura 10). El primer grupo identificado
contiene la cadena lateral del aminoácido Y19 que se aleja de la
región del bolsillo abriendo de esta forma la cavidad profunda. Este
aminoácido se encuentra altamente conservado entre diversos tipos de
VPH, presentando una identidad del 100% entre VPH-6,
11, 16 y 18. El segundo grupo contiene la histidina 32 y el
triptófano 33 que definen la cavidad profunda del bolsillo. La
histidina 32 es idéntica en VPH-6 y
VPH-11 y presenta una fuerte similitud entre VPH de
bajo y alto riesgo, mientras que el triptófano 33 es 100% idéntico
en los cuatro tipos. Finalmente, el cuarto grupo contiene la Leucina
94 que también define la cavidad profunda del bolsillo y se
encuentra conservada en un 100% en los 4 tipos de VPH.
Al definir la parte inferior de la cavidad
profunda, H29 es idéntico en VPH-6,11 y 16 y es
similar en VPH-18. De igual forma, T97 es idéntico
en VPH-6, 11 y 18 y es similar en
VPH-16.
Si definimos la cavidad poco profunda del
bolsillo, el aminoácido L15 forma parte del primer grupo
identificado y es muy similar en los VPH de riesgo bajo o alto. En
el segundo grupo, I36 también es muy elevado mientras que E39 está
muy conservado en los 4 tipos. Se identifica un tercer grupo que
bordea la cavidad poco profunda del bolsillo de unión en el que K68
y N72 se encuentran altamente conservados en los diversos tipos.
Finalmente, N71 es idéntico en VPH-6 y 11 y es
similar a lo tipos de alto riesgo. El bolsillo poco profundo también
contiene aminoácidos del cuarto grupo como son S98 e Y99 que también
son muy similares en los diferentes tipos de VPH.
El elevado grado de identidad/similitud indica
que este bolsillo definido según el TAD de E2 del
VPH-11 de la invención también se encontrará en
otros tipos de VPH, tanto de bajo riesgo como de alto. Es de suponer
que los inhibidores que se unan a este bolsillo, particularmente a
la cavidad profunda, diseñados utilizando los datos de la Figura 9
tienen una elevada probabilidad de unirse/inhibir la proteína E2 de
una amplia variedad de virus del papiloma.
<110> BOEHRINGER INGELHEIM (CANADA)
LTD.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COCRISTALIZACIÓN DEL DOMINIO DE
TRANSACTIVACIÓN DE E2 DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO/INHIBIDOR y
COORDENADAS DE RAYOS X QUE DEFINEN EL BOLSILLO DE UNIÓN DEL
INHIBIDOR
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 13/100
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/304 412
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-07-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 211
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagacgtgc gctagaccat gggacatcac catcaccatc acgaagcaat agccaag
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaccaagtgg atccgctagc ttagctagat acagatgcag ga
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgctaga ccatgggaca tcaccatcac catcacgaag caatagccaa gcgtttag
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccccggatcc tcattacttt ttctttttgc tagatacaga tgcaggagaa c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> IDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcccctaact ccgcccatcc cgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Primer
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaccagaccgc cacggcttac ggc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Leu Glu Leu Tyr Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Ile Met His Trp Lys Cys Ile Arg Leu
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH11
\vskip0.400000\baselineskip
<400>11
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Gly His Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HPV11
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Trp Thr Leu Gln Asp Thr Ser Tyr Glu
Met Trp Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys His Val Leu His Trp Lys Cys Met Arg His
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH6A
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Trp Thr Leu Gln Glu Thr Ser Tyr Glu
Met Trp Gln Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
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<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Leu Thr His Tyr Glu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> VPH16
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp His Ile asp Tyr Trp Lys Gln Met Arg Leu
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> VPH16
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<400> 17
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\sa{Lys Ala Leu Gln Ala}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> VPH16
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<400> 18
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\sa{Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp Val Ser Leu Glu
Val Tyr Leu Thr}
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\sa{Ile Leu Asp His Tyr Glu Asn}
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\sa{Ser Gln Ile Gln Tyr Trp Gln Leu Ile Arg Trp
Glu}
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\sa{Lys Ala His Lys Ala}
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<400> 22
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\sa{Glu Asp Trp Thr Leu Gln Asp Thr Cys Glu Glu
Leu Trp Asn Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (41)
1. Un cristal que contiene un polipéptido de
tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 en complejo con un inhibidor
L:
2. El cristal según la reivindicación 1, en el
que dicho TAD de E2 contiene un bolsillo de unión del inhibidor en
el que hay una cavidad profunda formada por las coordenadas de los
aminoácidos H32, W33 y L94 de acuerdo con la Figura 9.
3. Un método de producción de un polipéptido
cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que se
encuentra formando un complejo con un inhibidor L según la
reivindicación 1, que comprende:
a) la mezcla de polipéptido purificado de tipo
PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2, contenido en un tampón de
purificación, con inhibidor L solubilizado para generar una solución
compleja que contenga el complejo PV E2 TAD-L
mencionado; y
b) la cristalización de dicho complejo de a) en
un tampón de cristalización.
4. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de purificación del paso a) contiene un agente
reductor seleccionado de entre TCEP y DTT.
5. El método según la reivindicación 4, en el
que el agente reductor es TCEP a una concentración de 1 mM a 10
mM.
6. El método según la reivindicación 5, en el
que el TCEP está a una concentración de 5 mM.
7. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de purificación del paso a) se utiliza a un pH de
entre 7 y 9.
8. El método de acuerdo con la reivindicación
7, en el que el tampón de purificación se utiliza a un pH de 8.
9. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de purificación del paso a) además contiene una sal
seleccionada de entre NaCl, NH_{4}SO_{4} o KCl.
10. El método de acuerdo con la reivindicación
9, en el que la sal es NaCl a una concentración de 200 mM a 800
mM.
11. El método según la reivindicación 10, en el
que la sal es NaCl a una concentración de 500 mM.
12. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de purificación del paso a) además contiene un tampón
estabilizador seleccionado de Tris-HCl, HEPES o
bis-Tris.
13. El método según la reivindicación 12, en el
que el tampón estabilizador es Tris-HCl a una
concentración de entre 0 mM y 50 mM.
14. El método según la reivindicación 13, en el
que el tampón estabilizador es Tris-HCl a una
concentración de 25 mM.
15. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de purificación del paso a) además contiene EDTA a una
concentración de entre 0 mM y 1 mM.
16. El método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que el EDTA está a una concentración de entre 0 mM y 0,5
mM.
17. El método según la reivindicación 16, en el
que el EDTA está a una concentración de 0,1 mM.
18. El método según la reivindicación 3, en el
que el PV E2 TAD del paso a) se utiliza a una concentración de 5
mg/ml a 15 mg/ml en el tampón de purificación.
19. El método según la reivindicación 18, en el
que el PV E2 TAD se utiliza a una concentración de 10 mg/ml de PV E2
TAD en el tampón de purificación.
20. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de cristalización del paso b) es seleccionado del
grupo formado por: MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato
sódico y succinato sódico.
21. El método según la reivindicación 20, en el
que el tampón de cristalización es MES a una concentración de 50 mM
a 0,2 M.
22. El método según la reivindicación 21, en el
que el tampón de cristalización es MES a una concentración de 0,1
M.
23. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de cristalización del paso b) además contiene un
agente precipitante seleccionado del grupo formado por: MPD,
isopropanol, etanol y terc-butanol.
24. El método según la reivindicación 23, en el
que el agente precipitante es MPD a una concentración del 30% al
40%.
25. El método según la reivindicación 24, en el
que el agente precipitante es MPD a una concentración del 35%.
26. El método según la reivindicación 3, en el
que el tampón de cristalización del paso b) se utiliza a un pH de
entre 4,5 y 6,5.
27. El método según la reivindicación 26 en el
que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de 5,5.
28. El método según la reivindicación 3, en el
que la cristalización del paso b) se lleva a cabo entre 0ºC y
10ºC.
29. El método según la reivindicación 28, en el
que la cristalización se lleva a cabo a 4ºC.
30. Un método de producción de un polipéptido
cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que se
encuentra formando un complejo con un inhibidor L, que
comprende:
a) la solubilización de inhibidor L en un tampón
de cristalización; y
b) la inmersión en a) de polipéptido
cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2.
31. Un método para la producción de un
polipéptido cristalizado de tipo PV E2 TAD de ID. DE SEC. NÚM. 2 que
se encuentra formando un complejo con un inhibidor L, que comprende
la adición de inhibidor L en un tampón de cristalización que
contiene PV E2 cristalizada.
32. El método según la reivindicación 30 o 31,
en el que el tampón de cristalización es seleccionado del grupo
formado por: MES, fosfato sódico, fosfato potásico, acetato sódico y
succinato sódico.
33. El método según la reivindicación 32, en el
que el tampón de cristalización es succinato sódico a una
concentración de 50 mM a 0,2 M.
34. El método según la reivindicación 33, en el
que el tampón de cristalización es succinato sódico a una
concentración de 0,1 M.
35. El método según la reivindicación 34, en el
que el tampón de cristalización además contiene PEG8K, PEG4K o
PEG5K monometiléter.
36. El método según la reivindicación 35, en el
que el tampón de cristalización además contiene PEG5K monometiléter
a una concentración del 10% al 25%.
\newpage
37. El método según la reivindicación 36, en el
que el tampón de cristalización además contiene PEG5K monometiléter
a una concentración del 18%.
38. El método según la reivindicación 32 en el
que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de entre 4,5 y
6,5.
39. El método según la reivindicación 38, en el
que el tampón de cristalización se utiliza a un pH de 5,0.
40. El método según la reivindicación 32, en el
que el tampón de cristalización además contiene sulfato amónico a
una concentración de 0,1 M a 0,4 M.
41. El método según la reivindicación 40, en el
que el sulfato amónico está a una concentración de 0,2 M.
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