CN112891520A - 一种预防和控制人乳头瘤病毒感染（hpv）的活性生物蛋白的制备方法 - Google Patents

一种预防和控制人乳头瘤病毒感染（hpv）的活性生物蛋白的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，包括以下步骤：1、取活性蛋白或活性肽溶于超纯水中，配置成浓度为0.05‑0.2g/mL的活性蛋白溶液；2、取酸酐或酸酐衍生物，加入水，配置成质量分数为10‑50％的酸酐水溶液；3、配置磷酸盐缓冲溶液，用盐酸调节溶液pH值；4、取活性蛋白溶液，将其加入到磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，30‑40℃下搅拌1h以上；5、将步骤4的溶液倒入透析袋中，之后放入磷酸盐缓冲溶液中透析；6、用注射器取步骤5的溶液，微孔滤膜过滤除菌；7、冷冻干燥后，冷藏保存。采用该方法制备的活性生物蛋白能够预防和控制HPV的病毒、并阻止病毒感染。

Description

一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的 制备方法
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法。
背景技术
人乳头瘤病毒持续感染属于宫颈比较常见的疾病类型。据不完全统计，全球正常女性宫颈HPV感染率可达到13％左右，而国内稍高于该值，其中性活跃女性中生殖道HPV感染甚至能超过80％。大多数情况下，HPV感染后可经机体免疫调节清除，但约有10％左右HPV会持续存于宫颈，这类持续感染是导致宫颈癌最为主要的一个原因。基于此，尽早诊断与治疗宫颈HPV持续感染十分关键。
目前，能够治疗或预防人乳头瘤病毒感染的产品并不少，但这些产品的治疗效果一般，无法彻底阻断HPV病毒感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，采用该方法制备的活性生物蛋白能够预防和控制HPV的病毒、并阻止病毒感染。
为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、取活性蛋白或活性肽溶于超纯水中，配置成浓度为0.05-0.2g/mL的活性蛋白溶液；
步骤2、取酸酐或酸酐衍生物，加入水，配置成质量分数为10-50％的酸酐水溶液；
步骤3、配置磷酸盐缓冲溶液，用盐酸调节溶液pH值；
步骤4、取活性蛋白溶液，将其加入到磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，30-40℃下搅拌1h以上；
步骤5、将步骤4的溶液倒入透析袋中，之后放入磷酸盐缓冲溶液中透析；
步骤6、用注射器取步骤5的溶液，微孔滤膜过滤除菌；
步骤7、冷冻干燥后，冷藏保存。
作为本发明的优选，所述活性蛋白包括：活性动物胶原蛋白、重组人源胶原蛋白、抗菌蛋白；所述活性肽包括：抗菌肽Nal-P-113、抗菌肽PL-5。
作为本发明的优选，所述酸酐或酸酐衍生物包括：琥珀酸酐、琥珀酸酐衍生物、马来酸酐、马来酸酐衍生物、3-羟基-邻苯二甲酸酐、乙酸酐。
作为本发明的优选，磷酸盐缓冲液配置方式为：取7.9g氯化钠、0.2g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾和1.8g磷酸氢二钾，溶于800mL超纯水中，用盐酸调节溶液pH值至7.0，最后加超纯水定容至1L。
本发明的优点和积极效果：采用本发明提供的方法所获得的抗HPV活性生物蛋白经正负电荷作用破坏HPV蛋白构象，使HPV失活。同时，该活性生物蛋白也可与HPV衣壳蛋白的L1的C端和L2肽段的N端的正电荷区域结合，阻断病毒侵入宿主细胞，从而达到阻断HPV感染的目的。
附图说明
图1是GD蛋白对HPV6的抑制作用图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明所述的技术方案，但并不以此限制本发明。
实施例1
一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、取活性动物胶原蛋白冻干粉1g(西安凌丰生物科技有限公司)，溶于10mL超纯水中，配置成浓度为0.1g/mL的活性蛋白溶液；
步骤2、取20g琥珀酸酐，加入80mL水，配置成质量分数为20％的琥珀酸酐水溶液；
步骤3、配置磷酸盐缓冲溶液：取7.9g氯化钠，0.2g氯化钾，0.24g磷酸二氢钾和1.8g磷酸氢二钾，溶于800mL超纯水中，用盐酸调节溶液pH值至7.0，最后加超纯水定容至1L；
步骤4、取2mL 0.1g/mL活性蛋白溶液，加入5mL磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将5mL琥珀酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，37℃下搅拌2h；
活性蛋白与琥珀酸酐化学反应式如下：
Figure BDA0003017420170000021
步骤5、透析：取透析袋10-15cm，将其一端用棉绳扎死，由开口端倒入5mL步骤4获得的溶液，开口端用棉绳扎死，放入30mL磷酸盐缓冲溶液，用磁力搅拌器搅拌4h，促进溶液交换；
步骤6、过滤除菌：用注射器取5mL步骤5获得的溶液，将注射器插入0.22μm一次性针头过滤器中，过滤除菌；
步骤7、冷冻干燥：-50℃下，真空(1.3-13帕真空度)干燥至干，得活性生物蛋白，4℃保存。
实施例2
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌肽Nal-P-113(来源：Prospec)，琥珀酸酐替换成马来酸酐，其它步骤参照实施例1。
实施例3
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌肽抗菌肽PL-5(来源：Prospec)，琥珀酸酐替换成3-羟基-邻苯二甲酸酐，其它步骤参照实施例1。
实施例4
与实施例1的区别在于：活性动物胶原蛋白冻干粉替换成抗菌蛋白(来源：Prospec)，琥珀酸酐替换成乙酸酐，其它步骤参照实施例1。
本发明实施例1至实施例4制备的产品接枝率计算及对HPV6抑制率的研究：
1、接枝率计算
表1 活性生物蛋白接枝率
产物名称 接枝前羧基含量(mol/L) 接枝后羧基含量(mol/L) 接枝率(％)
实施例1(GD蛋白) 2.8×10<sup>-5</sup> 3.8×10<sup>-5</sup> 35.7％
实施例2 1.7×10<sup>-5</sup> 2.34×10<sup>-5</sup> 37.6％
实施例3 2.33×10<sup>-5</sup> 2.79×10<sup>-5</sup> 19.7％
实施例4 3.08×10<sup>-5</sup> 4.34×10<sup>-5</sup> 40.9％
2、对HPV6抑制率的研究
表2 活性生物蛋白对HPV6的抑制作用
Figure BDA0003017420170000031
Figure BDA0003017420170000041
上述对照组为直接采用活性动物胶原蛋白后将其溶于超纯水中，配置成上述浓度的溶液。

Claims (4)

1.一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取活性蛋白或活性肽溶于超纯水中，配置成浓度为0.05-0.2g/mL的活性蛋白溶液；
步骤2、取酸酐或酸酐衍生物，加入水，配置成质量分数为10-50％的酸酐水溶液；
步骤3、配置磷酸盐缓冲溶液，用盐酸调节溶液pH值；
步骤4、取活性蛋白溶液，将其加入到磷酸盐缓冲溶液中，搅拌均匀后，将酸酐水溶液缓慢倒入活性蛋白溶液中，30-40℃下搅拌1h以上；
步骤5、将步骤4的溶液倒入透析袋中，之后放入磷酸盐缓冲溶液中透析；
步骤6、用注射器取步骤5的溶液，微孔滤膜过滤除菌；
步骤7、冷冻干燥后，冷藏保存。
2.根据权利要求1所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述活性蛋白包括：活性动物胶原蛋白、重组人源胶原蛋白、抗菌蛋白；所述活性肽包括：抗菌肽Nal-P-113、抗菌肽PL-5。
3.根据权利要求1所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，其特征在于，所述酸酐或酸酐衍生物包括：琥珀酸酐、琥珀酸酐衍生物、马来酸酐、马来酸酐衍生物、3-羟基-邻苯二甲酸酐、乙酸酐。
4.根据权利要求1所述的一种预防和控制人乳头瘤病毒感染(HPV)的活性生物蛋白的制备方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液配置方式为：取7.9g氯化钠、0.2g氯化钾、0.24g磷酸二氢钾和1.8g磷酸氢二钾，溶于800mL超纯水中，用盐酸调节溶液pH值至7.0，最后加超纯水定容至1L。
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