JPH07500245A - パピローマウイルスの複製の阻害剤を同定する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 パピローマウィルスの複製の阻害剤を同定する方法および組成物 本願発明は分子生物学の分野におけるものであり、パピローマウィルス疾患、特 に床（いぼ）および癌の処置に用い得る医薬の同定に重点をおいている。

パピローマウィルスは近年、ヒトを含む多くの高等なを椎動物において病気を引 き起こす原因として知られている。パピローマウィルスは小さいＤＮＡウィルス で、包膜を持たず、鱗状上皮細胞の核において複製する。それらは自然界中に広 く存在し、上皮の増殖性病変の原因となっている。かかる病変として特に良性の 線維乳頭腫があり、より一般的には化として知られている。パピローマウィルス は多くの癌ともつながりがある。ゲノムの関連性の範囲および程度に基づいて、 現在までに約５８の異なるヒトパピローマウィルスが同定されている。

床の臨床的重要性は相当に変化し、決定要因は感染しているウィルス型、床の位 置、およびその宿主に特有の要因である。例えば、皮膚の上に位置する床は、臨 床的に重要ではなく、自己制限的である。しかしながら、声帯上の床は呼吸器官 を障害する結果、生命を脅かし得る。皮膚の床の大多数は、それらが最初に現れ た後、数年以内に自然に退行するが、より長期間残存するものもある。この例外 は、ｅｐｉｄｅｒｍｏｄｙｓｐａｓｉａ　ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓと呼ばれ る、生命を脅かす希なパピローマウィルス疾患である。この病気においては、感 染した個体は自然退行を経験することはなく、むしろその感染は悪性の段階へと 進行し得る。Ｓａｌｚｍａｎ、　Ｎ、　Ｐ、　Ｈｏｖｌｅｙ、　Ｐ、　Ｍ、編ｔ ｈｅ　ｐａｐＯＶａｖｉｒｉｄａｅ、ｖｏｌ、２．Ｎ、Ｙ、：Ｐｌｅｎｕｉ　Ｐ ｒｅｓｓ　１９８７：１９９−２４３にある０ｒｔｈ、Ｇ、　ｅｐｉｔｅｒｍｏ ｄｙｓｐａｓｉａ　ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉｓｏ　この疾患は、世界中に存在 するが、希であり、家族間においてしばしば見いだされる。従って、遺伝的要因 がこの疾患の病因学に関係していると考えられている。

パピローマウィルスはまた、性交によって伝染する生殖器官の痣の生成にも関係 する。米国内だけで、百方を優に越える症例が報告されている。Ｂｅｃｋｔｅｒ 、　Ｔ、　Ｍ、　５ｔｏｎｅ、　Ｋ、　Ｍ、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、Ｅ、Ｒ，、 生殖によるヒトパピローマウィルス感染：　Ａ　ＧｒｏｗｉｎｇＣｏｎｃｅｒｎ 　０ｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ　Ｃ１１ｎ　Ｎｏｒｔｈ　ａｔａ　１９８７： １４：３８９−３９６゜上述のように、パピローマウィルスはいくつかの異なる タイプの癌の原因であると考えられている。その中には頚部の癌があり、年毎に 約ｓｏｏ、　ｏｏｏの新しい症例が診断されている。

Ｐｅｔａ　Ｒ，、ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ　Ｈ，編のＶｉｒｏｌ　Ｅｔｉｏｌｏｇ ｙ　ｏｆ　Ｃｅｒｖｉｃａｌ　ＣａｎｅｅｒにあるＰｔｏ　Ｒ，、序論：地理学 的様式および傾向。ＢａｎＢｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ　２１．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａ″’ｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８６；３−１５゜頚部癌に加えて、パピ ローマウィルスは、鼻腔の腫瘍、および種々の口腔癌の病原因子として関係づけ られている。

床は概して自発的に退行するので、患者が処置をめる理由は、一時的な痛みもし くは不快を軽減するため、または美容上の理由である。床に対する処置は概して 、寒冷療法を適用すること、または、一つもしくはそれ以上のＤＮＡ合成阻害剤 を用いるごと、または床を外科的に単に除去することから成る。さらなる処置は 、特に、難治性の生殖器の床に対して、特に種々のインターフェロンを適用する ことから成る。この方法は部分的には成功し、それは自然緩解が３％であるのに 対して、約３６％の範囲の治癒率を示す。

パピローマウィルス感染の患者を、管理もしくは治癒するための統合的な処置の 方策が欠けていることは、部分的には、ウィルスをインビトロで生育させること ができず、したがって、有効な薬剤を同定するための簡便で信幀できるアッセイ を開発できないことにより説明される。大部分において、パピローマウィルスの 研究は、インビトロにおける形質転換アッセイの開発に由来し、その開発は、細 胞の増殖の誘発に関係するウィルスの機能を同定することを容易にした。これら の研究に用いられているプロトタイプのパピローマウィルスは、ウソのパピロー マウィルスタイプＩ　（ＢＰＶ−１）である。

パピローマウィルスは約８．０００塩基対の二本鎖ＤＮＡからなる。６種の動物 および９種のヒトパピローマウィルスに基づ＜配列決定の研究により、パピロー マウィルスのゲノムの構成が、極めてよく保存されていることが明らかになった 。鍵となる共通の特徴は、これらのウィルスの全てが、ウィルスのＤＮＡの一つ の鏡上にオープンリーディングフレームを有することである。約ｌＯのオープン リーディングフレームがあり、ウィルスのゲノムにおけるそれらの位置をもとに 分類されている。

異なる複数の経路が、ＤＮＡ複製の開始を調節しているらしい。例えば、合成に 必要なタンパク質の翻訳後修飾は、複雑な方式で極めて重要な役割を果たすこと が知られている（Ｍｏｈｒら、ＥＭＢＯＪ、（１９８７）６：１５３−１６０； ＭｃＶｅｙら、　ＬＬＬＬＩ（１９１１９）３４１　：５０３−５０７　；Ｄ’ 　Ｕｒｓｏら、　５ｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０ニア８６−７９１　；Ｄｉ ｎら、Ｇｅｎｅｓ＆　Ｄｅｖ、（１９９０）４：９６８−９７７；およびＶｉｒ ｓｈｕｐら、ＥＭＢＯＪ、（１９８９）ｉ：３８９１−３８１８参照）。面白い ことには、複製起点に結合するタンパク質は、転写の制御においても機能する（ Ｄｅｐａｍｐｈｉｌｉｓ、Ｍ。

Ｌ、、Ｃａ且（１９８８）５２：６３５およびＢｒａｎｄら、堕■（１９８７） ］ニア０９）。染色体複製の調節における転写因子の役割は曖昧である。しかし ながら、非常に多くの実験から、組織特異的な遺伝子の発現は、活性遺伝子およ びその周囲のフランキングＤＮＡの早期の復製と相関があり、一方、別の組織に おいて不活性であるときには、その同じ遺伝子が細胞のサイクル内の遅い時期に 複製することが示されている（Ｈａｔｔｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ（１９ ８ｇ）ト３３５−３４０）。これは転写の制御と複製の制御との間のつながりを 意味している。

ウソパピローマウィルスタイプＩ　（ＢＰＶ−１）によって、真核ＤＮＡ複製に おいて転写因子の役割を調べるための枠組みが供給される。形質転換した細胞に おいて、ウィルスの染色体は、宿主ＤＮＡと同時に複製される、安定な核プラス ミドとして維持される。二つのウィルスタンパク質Ｅ１およびＥ２は、どちらも 複製のために必要でありかつ十分なものである（Ｕｓｔａｖおよび５ｔｅｎｌｕ ｎｄ、ＥＭＢＯＪ、（１９９１）１０：４４９−４５７）。Ｅｌは６８ｋＤのタ ンパク質で、このＡＴＰ結合結合タンパクワいての突然変異を伴うウィルスのＤ ＮＡは、核プラスミドとして維持され得ない。（Ｓｕｎら、　Ｊ、　Ｖｊｒｏｌ 、　（１９９０）６４：５０９３−５１０５）。３つの関連する位置特異的ＤＮ Ａ結合タンパク質が、Ｅ２　０ＲＦにコードされている（　■皿■■（Ｆ　ｉ　 ｅ　Ｉ　ｄ　ｓおよびＫｎｉｐｅｍ＞におけるＨｏｗｌｅｙ、Ｐ、　Ｍ、　１６ ２５−１６５０（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、　１９９０）。４８ｋ Ｄのトランスアクティベーター、および活性化ドメインを欠く２つのリプレッサ ー、Ｅ２ＣおよびＥ　８／Ｅ　２である。４８ｋＤのトランスアクティベーター は、ＤＮＡに２量体として結合し、５Ｐ−１（Ｌｉら、堕ＩＩ（１９９１）■・ ３８０−４００）を含む細胞因子との組合せによって、ウィルスの多くのプロモ ーターからノ転写を活性化する。従って、Ｅ２ファミリーのタンパク質の相対的 な濃度は、ウィルスのプラスミドの転写プログラムを複雑に調節している。本願 発明者らの研究室の研究によって、４８ｋＤのＥ２タンパク質がＥｌタンパク質 と強固な複合体を形成し得ることが示された（Ｍｏｈｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　（ １９９０）２５０：１６９４−１６９９）。部分精製したＥｌは、弱い特異的Ｄ ＮＡ結合活性を示し、この活性はＥ２によって著しく刺激された。機構の研究を 容易にするために、およびＥ２がＤＮＡ複製において、直接的な役割を演じてい るかどうかを確認するために、我々は細胞を含まない複製系を開発した。

発明の開示 発明の第１の目的は、パピローマウィルスＤＮＡの複製を阻害する化合物の同定 方法の記述である。この方法は、パピローマウィルスタンパク質Ｅ１およびＥ２ の存在下で、パピローマウィルスＤＮＡ複製を支持する、細胞を含まない抽出物 を単離する工程；細胞を含まない抽出物、ＥｌおよびＥ２、パピローマウィルス ＤＮＡの複製の測定を支持し、そして可能にするアッセイ試薬、および上記の化 合物から成る混合物を形成する工程；前記化合物の存在下で生じるＤＮＡ複製量 を、前記化合物の非存在下で生じるＤＮＡ複製量と比較して測定する工程から成 る。

発明の第２の目的は、パピローマウィルスタンパク質Ｅ　１およびＥ２、および パピローマウィルスＤＮＡの複製を支持する、細胞を含まない抽出物を含むパピ ローマウィルスＤＮＡを複製するための組成物の記述である。

本願発明のこれらの目的、およびその他の目的は、以下の開示を十分に考慮する ことで明らかになる。

図面の簡単な説明 図ＩＡはＢＰＶ　ＥｌおよびＥ２１７１精製を示す。ＢＰＶ　ＥｌおよびＥ２を コードしている配列は、バキュロウィルスの発現系へとクローン化され、これら のタンパク質は、Ｍｏｈｒら・録ムｌ赳（１９９０）　２５０　：１６９４−１ ６９９１ｃ記述されテイルヨウニ、イムノアフィニティークロマトグラフィーに よって精製した。

Ｅｌは、そのアミノ末端を９アミノ酸ペプチド（ＥＥエピトープ）で標識し、そ の標識ペプチドに特異的なモノクローナル抗体を用いて精製した（抗体Ｅ　Ｅ　 （Ｇｒｕｓｓｅｒｖｅｙｅｒら、ｒｍｌｉｓｔ（１９８５）８２ニア９５２−７ ９５４））はタンパク質Ｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｅｉａ　ＬＫＢ に架橋された）。充填したカラムをＬＩＣｌで洗浄した後、タンパク質は２０■ 閤トリエチルアミンで溶出し、　（必要な場合には）固体のポリエチレングリコ ール（Ｍ、Ｗ、８００Ｇ）　ニ対して透析し、ソノ後、２０＋ｅＭ！７７酸カリ ウｔ、　（ｐＦＩ７．５）、１００５Ｍグルタミン酸カリウム、１１Ｍ　ＥＤＴ Ａ、　１　ｍＭ　ＤＴＴ、および１０％グリセロールで長時間透析することによ り濃縮した。それぞれのレーンにおいて、タンパク質調製物２００ｎｇを、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥによって分画し、銀で染色した。Ｂ２およびＥｌ−Ｅ２？１合体（ Ｅｌ／Ｅ２と表示する）は、Ｂ２（Ｂ２０２）”に特異的なモノクローナル抗体 を用いて、同様に精製した。ＭＫレーンは、分子量マーカーを含んでいる。

図ＩＢは、Ｅｌ／Ｅ２およびＢＶＰ起点の配列に依存性のインビトロにおけるＤ ＮＡ複製を示す。Ｅｌ／Ｅ２＋で標識したレーンには、精製したＥｌ／Ｅ２複合 体４００ｎｇを加えた。

３つのテンプレートＤＮＡをここに示す：　ｐＫｓｏは７８０５−１００からの ＢＰＶ配列を含み；　９３ＭはＢＰＶ−１の制限フラグメントＬｕｍ　（６９５ ｇ）−Ｍｌｕ（７３５１）を含み；そしてｐＫＳはベクタープラスミド（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ）である。■および■はＩ型および■型ＤＮＡを示し、Ｒ１１， は複製中間物を示す。Ｎ末端にＥＥエピトープが付いたＥｌ、および野生型のＥ ｌは、どちらも、ＡＴＰアーゼ、および複製アッセイおいて同一の活性を示した 。しかし、Ｃ末端にＥＥエピトープが付いたＥｌは、どちらのアッセイにおいて も不活性であった（データは示さず）。

図ＩＣは、複製した■型ＤＮＡが、　ガ狙１の消化に耐える　。

ことを示す。複製生成物、およびマーカーであるｐＫｓｏ　２００％ｇを混合し 、そして２０諷Ｍのトリス−酢酸（ｐＨ８，０）緩衝液中で、１％５ｅａＰｌａ ｑｕｅゲルを通して電気泳動により分離した。■型のバンドを、ゲルから切り取 り、ＤＢＩ＋こより加水分解した。エチジウムプロミドで染色すると、検出可能 な■型ＤＮＡは、全て酵素によって開裂されていることを示した。ＭＫレーンは 、マーカーとしてｐＫｓｏ複製生成物を用いている。

図２Ａは、インビトロにおけるＢＰＶ　ＤＮＡ複製の経時変化を示す。複製アッ セイは、２００μｌまで規模を上げた。反応はｐＫｓＯを６４０％ｇ、　Ｅ　１ を２．２μｇ、およびＢ２を０．６μｇ含んで行われた。表示された各時点にお いて、反応サンプル２５μＩを取り、反応を停止した。図の上の部分は、経時サ ンプルの電気泳動後のオートラジオグラフである。図の下の部分は、各時点にお けるｄＮＭＰのＤＮＡへの全取込み量を示す。図２Ｂは、ＢＰＶ　ＤＮＡが２方 向で複製する証拠を示す。複製アッセイにおける異なる時点からのＤＮＡサンプ ルを％　１ｍ１−および…ｘ１で消化して、結果として生じたＤＮＡフラグメン １−　（Ａ−Ｆ）を、５％のポリアクリルアミドゲルにおいて分離した。ゲルの オートラジオグラムを、右側に示す。各バンドの強度は、Ｐｈｏｓｐｈｏｒ　Ｉ ｇ＋ａｇｅｒ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用で定量した。ヌ クレオチド毎の取込みを、各時点における各フラグメントについて計算して、放 射能の相対量を左側にプロットした。白丸は、２０分を示し、黒丸は４０分を、 白四角は１２０分を表す。プラスミドｐＫｓＯの図表を、下に示す。白矢印はｐ ■■部位、黒矢印はＢｓｔＸ１部位である。

図３は、複製に必要なシスエレメントを同定するために用いた欠失分析を示して いる。上部の物理的地図は、ＢＰＶの上流調節領域（Ｕ　ＲＲ）を示し、含有さ れる１２のＢ２結合部位は黒四角で描かれている。ウィルスのゲノムの異なる領 域にまたがるＤＮＡフラグメントを、インビトロの系において、ＤＮＡ複製の起 点として機能する能力について試験した。

全ての反応は、各反応にＤ　Ｎ　Ａ　５０ｎｇを用いて、図１に記述したよウニ 行った。定量は２つのプロトコールによった二取込んだ標識物の直接の計測；お よび各サンプルについての各ゲルレーンの走査および積分によるものである。６ ピコモルの正味の合成物が、ｐＫｓｏを用いて得られ、この数を１００％として 定めた。テンブレー）　９３Ｍから９３１（までについては、明瞭なバンドは検 出されず（例えば図ＩＢ）、これらのテンプレートは、インビトロにおけるＤＮ Ａ複製に対して、完全に陰性であると判断される。ｐＫｓＯＭは、ヌクレオチド ７８０５−２２　（５９ｂｐｓ）にまたがり、これまでに試験した中で、複製活 性を示す最も小さいフラグメントである。座標上の（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）数 が与えられたところで、ＰＣＲを用いて、プラスミドポリリンカー中に置かれた ＢＰＶ挿入物を調製した。他の全てのフラグメントは、制限部位の融合によって 、ベクターのポリリンカーに挿入した。ｐＫｓＯおよびｐＫｓＯＭの両方につい ては、プライマーを使用したＰＣＨによって、石旧部位を５゛末端に、ＥｃｏＲ １部位を３′末端に形成した。

図４は、ＢＰＶ　ＤＮＡ複製のインビトロにおける起点の構造を示す。図４Ａの 上部の線は、Ｂ２結合部位１１からＢ２結合部位１２までのＢＰＶ配列を示す。

Ｌ１１部位を中心とする１８ｂｐの逆向きくり返しを、尾と尾でつながった２つ の矢印で示す。シカ、ヘラシカ、およびヒトパピローマウィルスの調節領域にお いて存在する配列と、この逆向きくり返しとの間の著しい相同性が、注目される 。図４Ｂは、逆向きくり返しの中心でのリンカ−の挿入がインビトロにおける複 製を不可能にすることを示す。馳１リンカ−（配列番号：　１）を、ｐＫｓ。

およびｐＫｓＯＭの論１部位に挿入した。標準的な複製ア、、セイを、野生型お よび突然変異型のテンプレート上で行った。ｒＥ１／Ｅ　２　＋Ｊと記されたレ ーンは、Ｅｌ／Ｅ２複合体４００ｎｇを含んでいた。全ての反応は３７℃で２時 間インキュベートした０図５は、Ｂ２が、Ｅｌ依存性の複製を刺激することを示 す。

図５Ａは、Ｂ２結合部位１１および１２の両方を含むｐＫｓｏを、複製アッセイ において、テンプレートＤＮＡとして用いたことを示す。標準的な複製アッセイ を、３７°Ｃで２時間、ＥｌおよびＢ２タンパク質の存在下または非存在下で行 った。上の図は、ゲル電気泳動によって分画された後の、複製生成物のオートラ ジオグラムである。各反応におけるウィルスタンパク質の量は、Ｅ　１　：　２ ８０ｎｇ　（レーンｌおよび４　）　；　１４０ｎｇ　（レーン２および５　） 　；７０ｎｇ　（レーン３および６）である。Ｂ２：１１００ｎ　（レーン４− ７）である。レーン８は、タンパク質を添加していないコントロールである。下 の図は、ＥｌおよびＢ２について行った滴定実験の一組、および表示のように定 量、およびプロｙ）した［３２ｐ］の取込みを示す。図５Ｂは複製アッセイにお けるテンプレートＤＮＡとしての（Ｂ２結合部位を含まない）　ｐＫｓＯＭを示 す。上の図は、複製生成物のオートラジオグラムを示す。Ｅ　１　：　２８０ｎ ｇ　（レーン１１および１４）　；１４０ｎｇ　（レーン１２および１５）　； ７０ｎｇ　（レーン１３および１６）である。

Ｅ　２　：　１１００ｎ　（レーン１４−１７）である。タンパク質を添加して いないのが、レーン１８である。下の図は、ｐＫｓＯＭのテンプレートについて の、濃縮Ｅ１およびＥ２タンパク質濃度および複製の滴定を示す。この図の記号 は、白丸、Ｂ２無し；黒丸、Ｅ　２　１１００ｎ；白四角、Ｅ２３０ｎｇである 。Ｂ２濃度を１１００ｎより高くしても、さらに刺激はされなかった（データは 示さず）図６ＡおよびＢは、Ｂ２によって刺激される、ＢＰＶ複製の起点へのＥ ｌの結合を示す。ＢＰＶ配列７８０５−１００を含むＤＮＡフラグメントは、６ 鎖の５°末端を３２ｐで標識した（Ａは石器部位で標識した上の鎖；ＢはＥｃｏ ＲＩで標識した下の鎖）。ＤＮアーゼ■のフットプリント分析を、以下のように 修正を加えて、以前記述されたように（Ｌｉら、Ｃｅ１１（ｆ９９１）６５：３ ８０−４００）行った。２緩衝液は、２０ｍＭリン酸カワウＡ　（ｐＨ７，５） 、１００ｍＭグＪＬＩタミン酸カリウム、１ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、０．５＋＊ Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔ。

および１０％グリセロールを含む新しい緩衝液と取り替えた。

結合反応は、３７°Ｃで１５分行い、続いて標準的なりＮアーゼＩでの消化を行 った。Ｅｌ濃度：レーン２および７は９００ｎｇ　；レーン３および８は３００ ｎｇ　；レーン４および９は１１００ｎ　；レーン５および１０は３３ｎｇテあ る。Ｂ２濃度：Ｌ／−７６−１０は１１００ｎである。ＢＳＩＩおよびＢ５１２ は、Ｂ２の結合部位１１および１２を示す。レーンＭはＡＧ配列サイズマーカー を含む。

図６０は、Ｂ２結合部位が無い時、Ｂ２のＤＮＡとの相互作用にＥｌが必要であ ることを示す。ＥｌおよびＢ２のＤＮＡとの相互作用は、最小の複製起点を含む （すなわちＢ２結合部位が無い）、［３２ｐ］で標識し、ブロモデオキシウリジ ンで置換したＤＮＡへの、これらのタンパク質のＵＶ−架橋により調べた。その 後ＤＮＡを消化して、タンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動により分析した 。Ｅ１タンパク質濃度については：レーンＡおよびＣ，２８０ｎｇ；レーンＢお よびＤ１９０ｎｇである。Ｅ２タンパク質濃度については：レーンＣ−Ｅ。

１１００ｎである。

発明を実施するための形態 本願明細書に記載された発明は、以前に公表した研究、および係属中の特許出願 を参考にしている。例を挙げれば、そのような研究は科学論文、特許、あるいは 係属中の特許出願から成る。上記あるいは下記に引用する、これらの刊行物およ び出願の全ては、本願明細書において参考として援用する。

下記の方法を利用して、本願発明を使用した。追加の物質、および方法は、１９ ９２年７月９日に公開された、同一出願人に係るＰＣＴ出願公開第Ｗ　Ｏ９２／ １１２９０号に記載されている。

ｒＥｌおよびＥ２Ｊは、ＥｌおよびＢ２のオープンリーディングフレームによっ てコードされるパピローマウィルスタンパク質を指す。これらのタンパク質は、 それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤの分子量を有し、そしてパピローマウィルス ＤＮＡに結合する複合体を形成し、結果として、ウィルスのＤＮＡ合成の開始に 関与する。本願明細書に記載の、発明の鍵となる局面は、ウィルスのＤＮＡ複製 にＥｌおよびＢ２が必須であることの発見であるので、この定義は、異なる分子 量を有し得るが、機能的に関連した様式で挙動する、同様のパピローマウィルス タンパク質を、含むことを意図する。さらに、ＥｌおよびＢ２の活性フラグメン トは、この定義の範囲内にある。

「制御配列」は、ある特定の宿主生物において、操作可能に連結されたコーディ ング配列の発現に必要な、ＤＮＡ配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例 えば、プロモーターを含み、任意にオペレーター配列、リボゾーム結合部位を含 み、そして、今のところわずかしか理解されていない他の配列を含み得る。真核 細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサ−を利用す ることが知られている。

「発現系」は、所望のコーディング配列および制御配列を操作可能な連結状態で 含む、ＤＮＡ配列を指す。その連結の結果、これらの配列で形質転換された宿主 は、コードされたタンパク質を生成し得る。形質転換するためには、発現系はベ クター上に含ませ得るが、関連したＤＮＡはまた宿主の染色体内にも統合され得 る。

本願明細書中において、「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養」は、交換可 能な用語として使用され、このようなすべての名称は、娘細胞（ｐｒｏｇｅｎｙ ）を含む。従って、「形質転換体」あるいは「形質転換した細胞」は、１次的な 対象細胞、および転移の数には関わりな（、それらに由来する培養物を含む。全 ての娘細胞は、意図的あるいは偶然の突然変異の結果として、ＤＮＡの内容にお いて必ずしも厳密に同一ではない。最初の形質転換細胞において選択されたもの と同じ機能を有する、突然変異体の娘細胞は含まれる。不明瞭な名称が意図され る場合は、その文脈から明らかである。

本願明細書中で使用する用語「パピローマウィルス疾患」は、癌および床を含み 、このウィルスが原因となる、いかなる疾患をも指す。

パピローマウィルスのＥｌおよびＢ２タンパク質の生産本明細書中に記述される 発明は、ウィルスのＤＮＡ合成に作用スる、パピローマウィルスの６８ｋＤのＥ ｌ複製タンパク質、および４８ｋＤのＥ２）ランスアクティベータータンパク質 を示°　す。以下のＥｌおよびＥ２に対する言及は、これらのタンパク質、また は同様の分子量、および機能を伴うタンパク質を示すことは理解される。機能特 徴付けの鍵は、ウィルスＤＮＡ合成を支持するタンパク質の能力である。ウィル スの複製を誘導するＥｌ／Ｅ２の阻害剤は、パピローマウィルス疾患の処置のた めの医薬として、適切に使用される。従って、ウィルスの複製を誘導するＥｌ／ ′Ｅ２を阻害する、医薬の能力により、それらについてアッセイするためには、 ＥｌおよびＥ２タンパク質の適切な供給源が、アッセイを実行するために必要で ある。ＥｌおよびＥ２は、好ましくは組換え的に生産され、そして種々の既知の 生化学的精製プロトコール、あるいは、それから変更をしたプロトコールを用い て、単離される。

一般的に、組換え体ＥｌまたはＥ２の生産は、以下を含む第１に、タンパク質を コードするＤＮＡが得られ、そして該タンパク質の発現が、それらをプロセ・／ ンングできる適当な発現系において得られ得る。この配列は切り出しができて、 そして回収可能な形態であるべきである。

切り出されまたは回収されたコーディング配列は、次いで好ましくは、複製可能 な発現ベクター内に、適当な制御配列と共に、操作可能な連鎖で配置される。上 記ベクターは、適した宿主を形質転換するのに使用され、そして、形質転換した 宿主は、組換えタンパク質の生産に効果のある好ましい条件下で、培養される。

上述の各工程は、種々の方法で行われ得る。種々の宿主内において操作可能な発 現ベクターのための構築は、以下に示すように、適当なレプリコン、および制御 配列を用いて作成される。適した制限部位は、普通に入手利用できなくても、上 記コーディング配列の末端に加えられ得、そしてこれらのベクターに挿入する、 切り出され得る遺伝子が供給される。

、制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現させるのに用 いる宿主細胞のタイプに依存する。概して、原核、酵母、昆虫、またはは乳類細 胞は、現在宿主として有用である。原核の宿主は、概して組換えタンパク質の生 産に、もっとも効果的で便利ではあるが、真核細胞、そして特定すれば、は乳類 細胞、または昆虫細胞が、それらのプロセッシング能力に関して好ましい。

Ｅ、　ｃｏｌ　ｉの種々の株が原核生物を、もっともよく表している。

しかしながら、他の微生物菌株もまた使用され得る。例えばｈム旧」Ｌ姐■■ｌ のようなりａｃｉｌｌｉ、　ｈＬ虫ｌ匪■属の様々な種、または、他の細菌株な どである。このような原核系においては、宿主と適合する種由来の複製部位およ び制御配列を含有するプラスミドベクターが用いられる。例えば、旦４立■は、 Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７、Ｇｅｎｅ　ｉ：９５に記載のＥ、　ｃｏｌ　ｉ種 由来のプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体を用いて、典型的に形質転換される。

ｐＢＲ３２２はアンピシリン、およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含有し、そ してさらに所望のベクターを構築する際に、保持、または破壊され得る、付加的 マーカーを提供する。一般的に使用される原核の制御配列（本明細書中では任意 にオペレーターを伴い、リポソーム結合部位を伴う転写開始のプロモーター、を 含有するものと規定される。）は、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）お よびラクトース（１ａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７７、Ｎａｔｕ ｒｅ　１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ ｄｄｅｌら、１９８０．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｔｄｓ　Ｒｅｓ、　８：４０５７ ）、およびラムダ由来ＰＬプロモーター（Ｓｈｊ＋ｍａＬａｋｅら、１９８１． Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２ｇ）のような一般的に用いられるプロモーター、お よび、本明細書中にすべて参考として援用されている、米国特許Ｎｏ、４，７１ １，８４５．１９８７年１２月８日発行、に開示され、転移可能な制御カセット に有用なＮ−遺伝子リポソーム結合部位を含有する。このカセットは、ＰＬプロ モーターである第１ＤＮＡ配列が、作動可能なように第２ＤＮＡ配列に連結し、 ここで第２ＤＮＡ配列は、第３ＤＮＡ配列より上流のＮｐｅｓに対応し、ここで 第３　ＤＮＡ配列は、Ｎｐｅｓ配列３°側の６ｂｐ以内を切断する制限部位を、 少な（とも１つは持っている配列、を含有する。本明細書中にすべて参考として 援用される、米国特許Ｎｏ、　４．６６６、８４８．１９８７年５月１９日発行 、は発現能を増大した、他のベクターを開示する。Ｃｈａｎｇらによって、本明 細書中に参考として援用される、欧州特許公開第１９６．８６４号、（１９８６ 年１０月８日公開）に記述されるホスファターゼＡ　（ｐｈｏＡ）系もまた有用 である。とはいえ、原核生物に適した全ての市販プロモーター系が使用され得る 。

ＥｌおよびＥ２の核酸配列は、プライマーを用いて、それらと非相補的な末端に 制限部位を含有する配列を、増幅することによってベクター内へクローン化され 得る。これは、米国特許Ｎｏ、　４．６８３．１９５．１９８７年７月２８日発 行、Ｎｏ、　４．６８３．２０２．１９８７年７月２８日発行、Ｎｏ、　４．１ １００．１５９．１９８９年１月２４日発行、で開示される一般的方法に従って 行い、この最後の発行物は、本明細書中にすべて参考として援用される。熱安定 性■Ｊ１■ｕ恨上１ｃｕｓ　（Ｔａｑ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼの使用を伴な う、この手法の変更は、本明細書中にすべて参考として援用される、欧州特許公 開第２５１１．０１７号（１９１１１１年３月２日公開）に記述されそして特徴 付けされる。本明細書中にすべて参考として援用される、欧州特許公開第２３６ ．０６９号（１９８７年９月９日公開）に記述される、熱サイクル機関（Ｔｈｅ ｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　１ｎｓｔｒｕ＋＊ｅｎｔ）　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ＋ ＊ｅｒ−ＣｅＬｕｓ）の使用もまた有用である。

概して、クローン化される核酸配列は、各鎖毎に一つのオリゴヌクレオチドプラ イマーで処理される。そして各プライマーの伸張生産物が合成される。その生産 物は、各核酸鎖に対して相補的である。ＰＣＨのテンプレートとして、Ｅｌおよ びＥ２タンパク質をコードする、プラスミドＤＮＡを使用することの代替は、米 国特許Ｎｏ、　４．８００．１５９に記述されているように、これらのタンパク 質を生産する、任意の細胞からのＲＮＡを、ＰＣＨのテンプレートとして使用す ることである。

ＲＮＡが開始材料として手にはいる場合は、一つのプライマーから合成した伸張 生産物は、その相補鎖から分離したとき、他のプライマーの伸張生産物の合成の 為のテンプレートとして、利用し得る。前述のように、各プライマーは、その５ ′末端に他方のプライマーの制限部位と同じまたは異なる制限部位を含む。十分 に増幅させて得た増幅生産物は、制限処理において切断産物を得るために、適切 な制限酵素で処理される。次いでクローン化する、所望のフラグメントが、単離 され、適切なりローニングベクター内へ連結される。

配列の変更の必要がある、ｃ　ＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡ由来ノベクターの一 部については、部位特異的プライマーに誘発される突然変異誘発が用いられる。

この技法は、当該分野では今日標準的で、そして限定されたミスマツチングを除 いて、所望の変異を示す、突然変異を一本部ファージＤＮＡに誘発するため、一 本部ファージＤＮＡに対して、相捕的な合成オリゴヌクレオチドのプライマーを 用いて実行される。

簡単にいえば、上記ファージに対して相補的鎖を直接合成するためのプライマー として、合成オリゴヌクレオチドを用いる。そして生じた２本鎖ＤＮＡを、ファ ージを維持する宿主細菌内へ形質転換する。上記形質転換細菌の培養物は、寒天 上にブレーティングされ、ファージを宿す単一細胞からのプラーク形成を促す。

所望のＥｌおよびＥ２をコードする配列を含む適切なベクターの構築には、当該 分野でよく理解されている標準的な連結、および制限技法を使用する。単離され たベクター、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、切断され、調製さ れ、そして所望の形に連結される。

部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般に理解される条件下で、適した制限酵 素を用いた処理で、行われる。そして、その特定の条件は、これらの市販制限酵 素の製造者によって指定された。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓの製品カタログを参照のこと。概して、約１μｇのプラスミド、またはＤＮ Ａ配列が、約２０μ！の緩衝液中で酵素１ユニツトにより切断する。本明細書中 の実施例においては、典型的には過剰な制限酵素が、ＤＮＡ基質の完全な切断を 確実にするために用いられた。条件の変動は容認し得るが、約３７℃における約 １〜２時間のインキュページ言ン時間で、実現できる。各インキュベーション後 、タンパク質はフェノール／クロロホルムを用いる抽出により取り除かれ、引続 きエーテル抽出され得る。そして核酸は、エタノール沈澱により水相画分より回 収し、続いて、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムを用いたクロマトグラ フィーに供した。所望されれば切断フラグメントの、サイズ分画は、標準的な技 法を用いて、ポリアクリルアミドゲル、またはアガロースゲル電気泳動によって 実施され得る。サイズ分画の一般的記述は、Ｍｅｔ　ｄｓ　ｍ　ｏ　、１９８Ｇ 、６５：４９９−５６０中に見られる。

制限処理で切断されたフラグメントは、４つのデオキシヌクレオチド３リン酸（ ｄＮＴＰｓ）存在下で、５０１ＩＭトリスｐＨ７，Ｉｉ、５重ｇ＋Ｍ　ＮａＣｌ 、６重Ｍ　ＭｇＣｈ、６ｍＭ　ＤＴＴ、および１０５Ｍ　ｄＮＴＰｓ中で２０〜 ２５℃、インキュベーション時間約１５〜２５分で、ｌ、、　韻Ｄ　Ｎ　Ａポリ メラーゼＩの大きなフラグメント、つまりｌ［１ｅｎｏｗフラグメントで処理す ることによって、平滑末端化し得る。Ｋｌｅｎｏｖで処理した後、混合物はフェ ノール／クロロホルムで抽出され、そして、エタノール沈澱される。適当な条件 下での８１ヌクレアーゼ処理は、一本鎖部分の加水分解を生じる。

連結反応は、以下の標準的条件および温度下の１５〜３０μ！容量中で行なう： 　２重Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ（ｐＨ７，５）、ｌｏｍＭ　ＭｇＣｈ、１重Ｍ　ＤＴ Ｔ、　３３ｔｔ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　１０ｍＭ〜ＳＯ■Ｍ　ＮａＣｌ、および 「付着末端」連結反応については、１４℃で、１ｍＭ　ＡＴＰ、０．３〜０．６ （Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４　ＤＮＡリガーゼ、または「平滑末端」連結反応 については、１＋ｅＭ　ＡＴＰおよび０．３〜０．６ｆｆｅｉｓｓ）ユニットの Ｔ４リガーゼを用いた。分子間「付着末端」連結反応は、通常３３〜１００μｇ ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度で行なう。平滑末端連結反応では、該末端の総ＤＮＡ濃度 は、約１μＭである。

「ベクターフラグメント」を用いるベクター構築では、５゛リン酸基の除去およ びベクターの再連結反応を防ぐために、ベクターフラグメントは、一般にバクテ リア由来アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ”）で処理される。ＢＡＰ消化は、 ｐＨ８で約１５０ｍＭのトリス中、Ｎａ”およびＭ　ｇ　２　’の存在下、ベク ター１μｇあたり約１ユニツトのＢＡＰを用いて、６０℃で約１時間反応させて 行う。

核酸フラグメントは、上記調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、続いて エタノール沈澱により回収する。あるいは、不要なフラグメントの他の制限酵素 による切断による、２重に切断されたベクターはその再連結を防止し得る。

以下に示す構築では、最初に適切なＬｌｕ株を連結反応混合物で形質転換するこ とによって正しい連結反応が確立される。成功した形質転換体は、アンピシリン 、テトラサイクリン、または他の抗生物質に対する耐性、あるいは当分野で理解 されているプラスミド構築様式に依存する他のマーカーの使用により選別される 。小量調製（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）　ＤＮＡは、Ｄ、ｌｓｈ−Ｈｏｗｏｗｉｃｚら の方法（１９８１，Ｎｕｃ　ｃ　ｃ　ｄｓ　ｓ、、ｉ：２９８９）によって上記 形質転換体から調製され得、そして、制限（ｒａｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）によって 分析され得、および／または、Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら（１９７７、」カ頂臣紅、 ７４：５４６３）、さらにＭｅｓｓｉｎｇら（１９８１，肱吐虹り紅ｉｄｓ　Ｒ ｅｓ、、ｉ：３０９）により記載されるジデオキシ法、またはＭａｗａｓらの方 法（１９８０，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　、６５：４９９）に より配列決定され得る。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２株ＤＧ９ｇのようなファージに感染しやすいＬ匹且から成 るＭ１３へのクローニングに使用される宿主株が用いられる。上記００９８株は 、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託され、その寄託番号は１９６５である 。

使用する宿主細胞に依存して、それら細胞に適正な標準的技法を用いて形質転換 が行われる。Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ（１９７２，ヒｌ注■１．６９＋２１１０ ）により記載された塩化物を用いたカルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉｓら （１９８２，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、ｐ、２ ５４）に記載のＲｂＣＩ２法を、原核生物に用いた。

上記のように、多くの組換え系が、ＥｌおよびＥｌのクローニング、および発現 に有用で゛ある。しかしながら、好ましい系はバキュロウィルスである。したが って、それらのクローニングおよび発現を例示するため、ｌくキ二口ウイルスで 発現するウシパピローマウィルス構築物を使用してＥｌおよびＥｌを生産した（ ＰＣＴ出願Ｎｏ、Ｗ０９２／１１２９０参照）。

ウシパピローマウィルスＥＩ　ＯＲＦのソースとして、プラスミドｐＭＴＥＩＤ Ｍを用いて転移ベクターｐＡｃＥ１を作成した。この構築物は、プラスミドｐＭ ＴＥ１由来であり、それはＳｈａｍ　Ｓｕｎら（１９９０、Ｌ虹コお旦ｌ■、■ ：５０９）に詳細に記載される。ｐＭＴＥＩＤＭは、ｐＭＴＥＩＤＭのヌクレオ チドの１２３６番目がＧからＡに換わって（Ｘる以外は、本質的にｐＭＴＥｌと 同一である。この置換はスプライスされたＭタンパク質の産生を妨げる。したが って、ｐＭＴＥＩＤＭによって産生される６８ｋＤのＥ１タンパク質は、染色体 外エレメントとしてウシパピローマウィルスＤＮＡを維持する。次に、　Ｅｌを コードする見１１フラグメントをｐＭＴＥＩＤＭから除き、そのフラグメントを 転移ベクターｐＡｅｃ１３のＸｂａ１部位に挿入して転移ベクターｐＡｃＥ１を 作成した。ｐＭＴＥＩＤＭ由来の、Ｅｌをコードする出１フラグメントは、バキ ニロウイルスポリヘドリンプロモーターの下方にあることに注意。

遺伝子組換えウィルスを創出するために、ｒＡ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＭｅｔｈｏ ｄｓ　ｒｏｔ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃ ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓＪ　、Ｔｅｘａｓ　Ａ　 ＆　Ｍ　Ｐｒｅｓｓ：１９８６＋こおし為てＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈに より記載されるように２Ｍｇの転移ベクターを１Ｍｇの野生型ＤＮＡと共にＳｆ ９細胞に同時トランスフェクションシタ。

組換エウイルス（潜在性なし）　ｏｃｅｌｕｓｉｏｎ−ｎｅ　ａｔｉｖｅをＳｍ １ｔｈら（１９８３，…■工如ユ１．Ｂｉ釦工、且：２１５６−２１６５）が記 載のプラーク精製によってトランスフェクシッン上澄みから単離した。タンパク 質産生はウェスタン分析によってモニターした。好ましい電気泳動手法は、Ｂｕ ｒｎｅｔｔｅ（１９＋１１．　Ａｎａ　、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｔ　、　１１２： １９５）により記載されるウェスタンプロットゲル分析である。ウェスタンプロ ットは、ブロッキングされ、洗浄され、そして、好ましくは、ｌ５０５Ｍ塩化ナ トリウムを含有する１０ｗ＋Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中で０． １％ウシ血清アルブミン（Ｗ／Ｖ）および０．１％オボアルブミン（Ｗ／Ｖ）と 共にプローブされる。さらに、約０．１％濃度のＴｖｅｅｎ　２０のような界面 活性剤が好ましく使用される。アジ化ナトリウムもまた０、０２％の濃度で上記 溶液に含有され得る。上記プロットは洗浄して、Ｘ線フィルムを用いたオートラ ジオグラフィーに供される。

バキュロウィルス発現Ｅ２も同様に調製した。Ｅ２発現ベクター構築物の詳細お よび特異的オリゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフィーによるＥｌの 精製は、にｎｉｇｈｔおよびＢｏｔｅｈａｎ（１９９１，釘儲ｌ包盈υ−）によ り記載される。

組換えＥｌを生産するために、１細胞あたり５−１０　ＰＰＵの組換えウィルス をＳｆ９細胞に感染させた。Ｓｆ９細胞の感染方法および生育方法は、当分野で 周知であり、そして詳細な手法は、Ｍ、　Ｓｕｍ＋ｍｅｒｓおよびＧ、Ｓ＋ａｉ ｔｈ著の［＾Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉ ｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓＪ（Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、１５５５（１９８７ 年、５月））、またはＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈおよびＭ、　Ｄ、　Ｓｕｍｍｅｒｓの ＥＰ０１２７，８３９に見られ得る。好ましい培地および培養条件＋１、係属中 の同一出願人に係るＰＣＴ出願Ｎｏ、　ＷＯ３９１０１０２７、ＷＯ３９１０１ ０２８およびＷＯ３９１０１０２＋１に見られ得る。これらはすべて１９８９年 ２月９日に公開されたため、これらの公開物を参照として援用する。

Ｓｆ９細胞を１ｍｌあたり１−１５ｘｌＯ’細胞で感染させ、そして感染後、４ ８時間で採取した。感染細胞ペレットを液体窒素で冷凍し、そして−７０℃で保 存した。細胞を解凍して溶解し、そしてすぐに５ペレツト容量の低張（ｈｙｐｏ ）緩衝液（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ？、４．５ｍＭ　ＫＣＩ、１ｗ＋Ｍ　Ｍ ｇＣｌ２、ｔｓＭ　ＤＴＴ、ｉｏＩ１ｇ／ｍｌ　ロイペプチン、１ｗ＋ＭＰＭＳ Ｆ）に懸濁した。細胞核画分をダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（Ｂ− ベラスル）の１８ストロークで調製し、続１．％てその混合物を５，０００ｘｇ 　１０分間遠心分離（）ｌＢ４０−ター）して清澄イヒした。ペレットを２度、 核洗浄緩衝液（２０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＤＴＴ、 　１ＭＭ　ＥＤＴＡ、　１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌ　ロイペプチン、１ ０％スクロース）で洗浄し、そして５ペレ・ノド容量の低張緩衝液に懸濁した。

ＮａＣｌを最終濃度が０．３Ｍｌこなるまでゆっくりと加え、そして混合物を４ ℃で３０分間ゆっくりと力）き混ぜた。ＨＢ４０−ター中で、１０．００Ｏｒｐ ｍ、１０分間の遠、ｃ、、分離後、上澄みを０．３ＭＮａＣｌ　（Ａ／３００） を含有する緩衝液Ａ（２０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭＥＤ ＴＡ、　５％グリセロール、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００＞中で平衡イ ヒしたＤＥＡＥセファロースファーストフローカラム（Ｐｈａｒｎａｃｉａ）に 力）Ｃすた。上記カラムは、３倍容量のＡ／３００でリンスし、そして、ＤＥＡ Ｅフロースルーに従って分画され、画分は緩衝液Ａで０．２ＭＮａＣ１に調整し た。続いて個々の画分を連続的にＡ／２０Ｇで平衡化したホスホセルロースＰ− １１マトリックス（ｌｈａｔｗ＋ａｎｎ）にかけた。

カラムをＡ／２００で洗浄し、０．４Ｍ　ＮａＣ１を含有する緩衝液Ａで、次に ＩＭ　ＮａＣｌを含有する緩衝液＾で段階的に溶離した。続いてこれら個々の画 分をＡ／Ｚ００に対して透析（２５分ずつ５００■ｌで約４回）し、必要ならば 緩衝液Ａで０．２Ｍ　ＮａＣｌに調整した。各ブールを個々に、２５５Ｍ　Ｔｒ ｉｓ　ｐＨ８，ｏ、２００ｍＭ　ＮａＣ１，１ＭＭ　ＥＤＴＡ、　５％グリセロ ール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ　５７５ カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。上記カラムを同じ緩衝液でリンスした 。このカラムを続いて同じ緩衝液中、ＬＭ　ＮａＣ１で段階溶出した。Ｅｌを含 有する画分をウェスタンブロッティングで同定し、プールし、そして望ましい量 を発明を説明するために使インビトロでのＢＰＶ複製の条件は％Ｌ１およびＫｅ ｌｌｙ（ヒｌ匡賎紅（１９８４）８１：６９７３−６９７７）の条件を多少変更 して導いた。マウスＦＭ３Ａ細胞系からの抽出物を次のようにして調製した：！ Ｉ胞をＲＰＭＩ　１６４０培地（２５ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，２，５％ウ シ血清を補給）を含有する２リツトルの懸濁培養で生育させた。細胞を７ｘｌＯ ５細胞／　ｔｓ　ｌ密度で採取した。細胞ペレットを冷ＰＢＳ　３０ｍ１で洗浄 し、続いて１０ｍ１の低張緩衝液（２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，５＞、　５ ｍＭ　ＫＣＩ、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、およびＯ，ＦｖＭ　ＤＴＴ）で洗浄した。

上記細胞を次いで低張緩衝液に、最終容量が１０１になるように再懸濁し、氷上 で１５分間インキュページ言ンした。ダウンスホモジナイザーで２０ストローク 後、５Ｍ　ＮａＣ１を５００μＩ加え、抽出混合物を氷上で３０〜６０分インキ ュベーションした。この混合物をＳＷ４１０−ターで３０分間、２０Ｋ　ｒｐ− で遠心分離し、そして上澄みを１リツトルのＤ緩衝液（２０ｗＭ　Ｈｅｐｅｓ（ ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＮａＣ１，ｂｓＭ　ＥＤＴＡ、および０．５ｌＭ　Ｄ ＴＴ）に対して２度透析した。続いて抽出物をＨＢ４０−ターで８分間、８Ｋ　 ｒｐ■で遠心分離し、上澄みを液体窒素中に小滴凍結した。抽出物のタンパク質 濃度は、代表的には１５〜２０１１Ｅ／■ｌであり、凍結抽出物は一７０℃で保 存した。標準的複製アッセイ（２５μｌ）には、以下を含有させた：抽出物１０ ｕ１．精製１型２０ｗＭグルタミン酸カリウム、４ｇ＋Ｍ　Ａ丁Ｐ１　それぞれ １００μＭのＣＴＰ。

■ＴＰおよびＧＴＰ、それぞれ２６μＭの、ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ およびｄＣＴＰ、それぞれ２．５μＣｔの［３２Ｐｌ−ｄＮＴＰ、　４０■Ｍホ スホクレアチン、および１００μｇ／ｍｌタレアチンホスホキナーゼ、および必 要なウィルスタンパク質類。上記反応を、３７℃で２時間、インキユベーション した後、２０５Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，７）、２０＋＊Ｍ　ＥＤＴＡ、　２％Ｓ ＤＳ、および５０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫからなる溶液２５μｌを加えて 停止させ、さらに３０分間インキュベーションした。７．５Ｍ酢酸アンモニウム 溶液２５μｍおよび９５％エタノール１７５μｌを加えてＤＮＡを沈澱させた。

沈澱操作は２回繰り返し、沈澱したＤＮＡを５０μＩのＴＨに再懸濁した。上記 ＤＮＡを０．８％アガロースゲル中の電気泳動により分析した。乾燥させたゲル をＸ線フィルムにさ゛らした。ＦＭ３Ａ細胞からの抽出物は、能率的に修複合成 しうる。この活性はウィルスのコードされたタンパク質に依存せず、損傷ＤＮＡ テンプレートを用いて測定され得、１５分のインキュページ望ンにより本質的に 完了される（データは未開示）。

紫外線架橋についての実験的プロトコールを、以前にＬｉｎおよびＲｉｇｇｓ（ ＰＮＡＳ山臣１（１９７４）ｉｌ：９４７−９５１）により記載されたように行 なった。１本部ｐＫｓＯＭにアニールしたプライマーをｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、 　［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰおよび５−ブロモ−２゛−デオキシウリジントリホス フェートの存在下でＫｌｅｎｏｖ　ＤＨＡポリメラーゼにより伸張させた。２本 鎖ＤＮＡを制限酵素の石旧および論Ｒ１で切断し、そして最小の複製起点を含有 するＤＮＡフラグメントを単離して、架橋反応に使用した。ＥｌおよびＥ２タン パク質を３０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，５）、７ｓＭ　ＭｇＣｈ、および１０ ０ｍＭグルタミン酸カリウム中で、３７℃、３０分間、標ｍＤＮＡと共にインキ ュベージロンした。

次いで反応混合物に室温で６０分間、ＵＶを照射した。ＤＮアーゼ■およびミク ロコツカスヌクレアーゼで消化した後、ＥｌおよヒＥ２タンパク質を電気泳動に より１２％アクリルアミドゲル中テ分離し、オートラジオグラフィーで検出した 。

ＥｌおよびＥ２タンパク質を用いたインビトロでの複製ウィルスで形質転換され た細胞（ＩＣｌ３）から得られた、細胞を含まない抽出物は、外因性の加えられ たＢＰＶ−Ｉ　ＤＮＡのインビトロでの複製を支持しない。上記Ｅ１、Ｅ２タン パク質、およびＥｌ／Ｅ２？Ｊ［合体をバキ二ロウイルス発現系で過剰発現させ 、以前にＭｏｈ　ｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１６９４−１６９ ９）により記載された免疫アフィニティクロマトグラフィーによりタンパク質を 精製した。結果を図ＩＡに示す。精製したＥｌ／Ｅ２複合体をマウス＋Ｄ１３ま たはＦＭ３Ａ細胞（Ｎａｋａｎｏ、Ｎ、　、Ｌ■Ｌ勤Ｌ（１９６６）８８：６９ −８４）から得られた、細胞を含まない抽出物に加えると、複製活性が観測され た。図ＩＢに、ＦＭ３Ａ抽出物にＥｌ／Ｅ２複合体を補った時のみに、超コイル 状（＋）またはニックの入った（Ｉ　Ｉ）Ｉ）ＩＳＯ？−カーと共に移動する、 ｐＫｓｏプラスミドの複製産物を示す。加えて、複製中間体（Ｒ，１，）および 高分子量体のブロードなバンドが認められる。

まず最初に、以前に複製起点を含むことが示された上流調節領域（ＵＲＲ）　（ ＹａｎｇおよびＢｏｔｃｈａｎ、　Ｍｏ１．ＣｅユＬ」１ｌ−（１９９０）６４ ：５９１１−５９１３＞を含むプラスミドを複製のテンプレートとして用いた。

これらの反応に精製ｉ型ＤＮＡテンプレートを用いて、修複合成を最小にした。

完全に複製された夏型ＤＮＡが、より小さなテンプレート標的と共に増加するの が観測された。それゆえ、より小さなテンプレートは好ましい基質を供給する。

ＢＰＶ−Ｉ　ＤＮＡの後期領域（ｌａｔｅ　ｒｅｇｉｏｎ）を含むプラスミド（ ｐ３Ｍ＞およびベクター（ｐＫＳ）はどちらもＤＮＡ複製を指示し得なかった（ 図ＩＢ）。数多くの実験は、図ＩＢ中でＲ，１，と標識された不均一な物質が、 複製中間体を含有していることを示唆している。例えば、不均一な物質を１カ所 だけ切断する制限酵素で切断すると、それは開環ＤＮＡよりもずっと遅く移動し た。さらに１カ所だけ切断する酵素および非複製（ｕｎｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ） ＤＮＡを切断する！２Ｊｌ！ｆ１１での２重切断によって、不均一な物質は完全 長の直鎖ＤＮＡよりも速く移動したが、最も大きいＤＪＪＸ１フラグメントより は遅かった（データは未開示）。さらに、図２に示すタイムコースは、Ｒ１］、 と、１および！■型ＤＮＡとの間の前駆産物の関係に一致する。最後に、図ＩＣ は、超コイル状プラスミドの流動性に伴って移動する？Ｉ＆！ＤＮＡが、ＤＨ＋ による加水分解に対して完全に抵抗性であることを示している。

表１は、インビトロでのパピローマウィルス複製系のいくらかの本質的な必要条 件および特質をまとめたものである。

アフィジコリンによる阻害は、５ｐｖ−ｔ＊ａに１つまたはそれ以上の細胞性Ｄ ＮＡポリメラーゼα、δ、またはε（Ｓｙｖａｏｊａら、ヒ■鉦…７１１（１９ ９０＞８７：６６６４−６６６８）が伴うことを示唆している。さらに、α−ア マニチン耐性は、本質的にＥ２タンパク質およびＲＮＡポリメラーゼ１１により 仲介される転写が無関係であることを意味している。トポイソメラーゼ（■およ び１１型）インヒビターによるインビトロでの複製のブロックは、反応がＤＮＡ ２重ラセンの巻戻しを必要とすることを示唆している。

（以下余白） 表１ インビトロでのＢＰＶ　ＤＮＡ複製の要件−ＣＴＰ、ＵＴＰおよびＧＴＰ　７１ 一本ス本クレアチンおよびフレ１チンネス本Ａトセ゛　２２＋７７４シ゛］リン 　１０μｇ／−０ ＋α−１７二ｆ７　１００μｇ／ｍ１　９９２５０μｇ／ｍｌ　８１ ＋古７フ’　）チアンおよびＶＭ−２６（各４０μｇ／ｍｌ）　３゛「完全」系 は図１で述べられた標準反応混合物であり、複製の相対比較で１００％とする。

［３２ｐ］の取込み（よ、エコライト（ＥｃｏＬｉｔｅ）　（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃ ｈｅ＋＊１ｃａｌｓ）中のシンチレーシｇンカウンティングにより計量した。完 全な反応に対して実際（こ取込まれたカウントは４０．０００ｃｐｓ（９，４ｐ ｍｏｌ）であった。テンプレートＤＮＡを含有しない反応に対するカウントは、 １．０ＯＯｅｐ＋ｓ（０，２ｐｍｏｌ　）でこれを０％とした。ＤＮＡ　）ポイ ソメラーゼＩインヒビターであるカンプトテシンおよびＤＮＡ　）ボ仁ツメラー ゼ１１インヒビターであるＶ−Ｍ−２６は、Ｌ、Ｆ、Ｌｉｕ教授（Ｊｏｈｎ　Ｈ ｏｐｋｉｎｓ　５ｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）より提供された。

図２Ａに示す、取込み速度論的現象は、多成分または多段階反応に一致する。約 １５〜２０分の空白期間後、合成速度はプラトー域に達するまで約１時間増加す る。プラトー域では、２５μｍの反応液中、約７ピコモルのｄＮＴＰ類がＤＮＡ に合成された。類似の反応速度論的現象は、ＳＶ４０のインビトロ複製系で報告 されている（Ｖｉｒｓｈｕｐら、ＥＭＬＬ＜　ｔ　９８９　＞　ａ　：　３８９ 　ｔ　−３８１８、Ｓｔｌｌ１ｗ＋ａｎおよびＧｌｕｚｍａｎ、Ｍｏ１．　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏ＋、　（１９８５）ｉ：２０５１−２０６０、およびＷｏｂｂｅら 、　［（１９８６）８３　：４６１２−４６４６を参照のこと）。ＤＮＡ複製の 開始部位と方向性を決定するため、異なる時間経過点における生成物を石１およ びＢｓｔＸＩで切断した後、分析した。

もし復製がＢＰＶ−１配列から開始していれば、フラグメントＤかまず標識され るはずである。続いて、もし複製が両方向から進むならば、他のフラグメントが 、それらの分子量および特異開始部位に関連した位置に比例して標識されるはず である。

図２Ｂに示すように、フラグメントＤをピークとする対称的なカーブが観測され る。反応中の複製中間体が優勢なため、２時間のインキュベーシヲンの後でさえ も時間と共にカーブは全く平坦にならない（図２Ａ）。

ＢＰＶ　ＤＮＡについての最小複製起点ＢＰＶインビトロＤＮＡ複製に必要な遺 伝的エレメントの位置を決めるために用いた一連のプラスミドを図３に示す。本 発明者らは、プラスミドＰＣ１００ΔＲＥが完全なＵＲＲ（図３）で行うのと同 様の効率で複製されることを驚きを持って見いだした。本プラスミドは上記ＵＲ Ｈの他の領域に結合する複合体を高濃度に含有していないからである。Ｅｌが存 在しない状態では、Ｅｌはこ　゛れらの高親和性部位の外側に近接したＤＮＡに 対して弱い親和性を示した（図３およびＭｏｈ　ｒらの江」ユ鰭（１９９０）　 ２５０　：１６９４−１６９９を参照）。我々のデータに一致して、インビボで のＢＰＶ−１？ＪＩｉ２の研究（Ｕｓｔａｖおよび５ｔｅｎｌｕｎｄ、　肪■Ｌ Ｌ（１９９１）１０：４４９−４５７）は、これらの高親和性部位が、複製に関 する遺伝的エレメントとしてシスに必要ないという考えを支持した。インビトロ で複製されるプラスミド類のうち、ｐＫｓＯＭはわずかな量のウィルスＤＮＡを 含有する。このプラスミドは、図３および４に示すように、Ｅ２結合部位１２ノ 一部（Ｌｉら、Ｃｅ１ｌ（１９９１）６５：３８０−４００）、Ａ／Ｔリッチ領 域、および１８塩基対のパリンドローム配列を含有する。

このパリンドローム配列モチーフは多くの動物および人のパピローマウィルスで 保存されている。このパリンドローム配列の遺伝的重要性を調べるために、図４ Ａに示すように、１ｌｐｆ１１部位に合成リンカ−を挿入して変異体を作出した 。図４Ｂに見られるように、ｐＫｓｏ−ＮｅｏとｐＫｓＯＭ−Ｎｅｏのどちらも インビトロでの複製を支持し得なかった。これらの結果は、パリンドロームを三 等分した部位間の間隔がインビトロでの複製に重要であることを示唆している。

Ｅ２タンパク質を用いたＤＮＡ複製の促進Ｅ２がＤＮＡ合成で果たしている役割 を調べるため、ＢＰＶ−１に対するインビトロ複製系を用いた。図５のレーン７ および１７に示すように、Ｅ２タンパク質だけを受ける反応は、ＢＰＶ−１テン プレートを複製しなかった。図５のレーン１および１１に示すように、精製Ｅ１ タンパク質のみを補給した反応では、Ｅｌが高濃度時のみ極微量の復製を行なっ た。精製Ｅ１タンパク質と共に精製Ｅ２タンパク質を抽出物に加えた時、複製の 著しい促進が見られた（図５のトップおよびボトムパネル）。同様の取込みが二 つの異なるテンプレート、ｐＫｓｏまたはｐＫｓＯＭを用いて検出された。

Ｅｌと同一方法で精製したＥ２Ｃタンパク質１９はＥｌを活性化しなかったこと より、促進は本質的にＥ２タンパク質によるものであった。図５に示すように、 Ｅｌによる促進の程度は、ＥｌおよびＥｌの両方の濃度に依存した。著しくＥｌ が低濃度では、複製は完全に６２に依存した。Ｓ期間中のインビボでのＥｌタン パク質の絶対的なレベルは知られていないが、本発明者らは、細胞あたり約数千 分子と見積っているＥ２タンパク質のそれよりは低いと推定している。それゆえ 、インビボでのＥ２タンパク質に関する絶対的な要求量は、インビボでのＥｌタ ンノくり質の低いし　。

ベルを少なくともいくぶん反映し得る。

Ｅｌおよび８２間の相互作用が協同的ＤＮＡ結合を介しているかどうか決定する ために、ＤＮアーゼフットプリンティング研究を開始した。図６は、精製Ｅ２が 存在下および非存在下における精製Ｅ１タンパク質のＤＮアーゼフ・ソトプリン ト分析を示す。Ｅ１単独では明らかにｐｅｓｏの１１１ｂ、ｐ、パリンドローム （Ｏｒ＋で標識される）上に中心が置かれたＤＮＡ配列をプロテクトする。リン カー挿入変異体ｐｅｓｏ−Ｎｅｏは劇的にこのブロテクシ璽ンを解除する（デー タ未開示）。Ｅ２タンパク質は、実際、Ｅｌタンパク質のＤＮＡ結合能力を増進 する。ＥｌとＥｌが共存する時のＥｌタンパク質の結合部位のプロテクシ讐ンは 、Ｅｌの非存在下で等量のプロチクシランを発生するＥ１濃度よりも１０倍低い 濃度で起こる。

驚くべきことに、完全なＥ２結合部位を欠くテンブレー）　ｐｅｓ。

Ｍとの協同性もまた見られた。図６０に示す紫外線架橋実験はこの論点を詳述す る。Ｅｌの非存在下では、ＥｌはＤＮＡに架橋され得なかった。なぜなら本ター ゲット中にＥ２部位が存在しないからである。しかしながら、Ｅ１タンパク質存 在下では、Ｅ２タンパク質はＤＮＡに架橋され得る（図６ＣのレーンＣおよびＤ ）。上記のフットプリント分析と併せて、ＥｌおよびＥ２タンパク質は、複製起 点上において両タンパク質を含有する複合体の形成の安定化に寄与していること は明らかである。

パピローマウィルスのＤＮＡ複製の阻害剤の同定パピローマウィルスのＤＮＡ　 ｍ製の阻害剤は、Ｅｌ／Ｅ２に誘導されるパピローマウィルスのＤＮＡ複製を妨 げるそれらの能力で同定され得る。したがって、以上で示されたＤＮＡ複製を示 すアッセイは、そうした阻害剤をアッセイ混合物中に混合し、そして選択された 場合でのそれらの効果をモニターすることによって、阻害剤を同定するために使 用し得る。

本発明は、特定の実施態様に関して記述されている。しかしながら、本出願は、 添付の請求の範囲およびその意図から逸脱せずに、当業者により成され得る本発 明の改変および置換を網羅するものである。

配列表 （１）一般的情報： （１）出ｊ１人：ボノチ十ン、　マイケル　アール（ｉｉ＞発明の名称：パピロ ーマウィルスの複製の阻害剤を同定する方法および組成物 （ｌｉｔ）配列数＝２ （１ｖ）連絡住所： （Ａ）住所人二／−タス　コーポレイン嘗ン（Ｂ）番地：ツイツチイーサード　 ストリート　１４００（Ｃ）市：エメリービル （Ｄ）州：カリフォルニア （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４６０ｇ （Ｖ）コンピューター読み出し形態 （＾）媒体ヤニフロタビ−ディスク （Ｂ）コンビニ−ター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−Ｄ ＯＳ／ＭＳ−ＤＯ５（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１０、バージ ーン１１１．２５（ｖｌ）現在の出願データ： （＾）出ｌｌＩ＃号：　ＵＳ　０７／７７５，２７３（Ｂ）出願日：　１９９１ 年１０月１１日（Ｃ）分類： （ｖｉｌｉ）代理人／事務所情報： （Ａ）氏名：マクガリグル　ジュニア、フィリ・１プ　エル。

（Ｂ）登録番号：３１．３９５ （Ｃ）照会／記録番号：　２６１ｇ （ｉＸ）電話回線情報。

（＾）電話：　（５１０）　４２０−３２１７（Ｂ）テレファックス：　（５１ ０）　６５８−５２３９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉの情報：（ｉ）配列の特 色： （＾）長さ：１４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー・＋！鎖状 （ｉｉ）配列の種類ニゲツムＤＮ＾ （ｘｉ）配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＣ＾ＴＧＣＣＡＴＧＧ　Ｃ＾ＴＣ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さニア８塩基対 （Ｂ）壓：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （ｉｔ）配列の橿１ｍニゲツムＤＮＡ （ｘｉ＞配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：ＩＮ！１１：ＡＣＡＣ（ＩＪ　ＴＣ ＡＣＣＷＴ　７１展 一　電ｄｙ釦”’ｉ　’Ｉ　Ｃｄａ３ ＦＩＧ、　２Ａ ）−１ｎｄｌｌｌ　Ｍｌｕ　Ｃ１ａ　Ｈｐａｌｐｃ１００ΔＲＥ　トーー＋−− −−十−−−−Ｈ８２Ｂａｒ、１ｊｐＵ８２２９Ｈ−−Ｈ２ ＦＩＧ、　３ Ｍ１２３４５６７８９１０１１Ｍ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ボッチャン、マイケル　アール。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４７０７ケンジントン、アートモア　パス 　１ （７２）発明者　ヤン、リウ アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４７０７バークレー、ドウワイド　ウェイ 　１９３１（７２）発明者　リ、ロン アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５３０エル　セリト、エイピーティー、 エイ。

レキシントン　アベニュー　８３０ （７２）発明者　モーア、イアン　ジェイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４７０８バークレー、タマルパイス　ロー ド　５８（７２）発明者　クラーク、ロビン アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４６１１オークランド、コルトン　ブール バード

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．パピローマウイルスＤＮＡの複製を阻害する化合物を同定する方法であって 、以下の工程： ａ）パピローマウイルスタンパク質Ｅ１およびＥ２の存在下でバピローマウイル スＤＮＡの複製を支持する、細胞を含まない抽出物を単離する工程； ｂ）該細胞を含まない抽出物、Ｅ１およびＥ２、パピローマウイルスＤＮＡの複 製の測定を支持し、そして可能にするアッセイ試薬、および、該化合物を含有す る混合物を形成する工程；および ｃ）該化合物の存在下で生じるＤＮＡ複製量を、該化合物の非存在下で生じるＤ ＮＡ複製量と比較して測定する工程、を包含する方法。
2. ２．前記細胞を含まない抽出物が、Ｅ２の非存在下で、そして高められた濃度の Ｅ１存在下で、パピローマウイルスＤＮＡの複製を支持する、請求項１に記載の 方法。
3. ３．前記混合物が、Ｅ２を含まず、そして高められた濃度のＥ１を含有する、請 求項２に記載の方法。
4. ４．前記細胞を含まない抽出物が、細胞性ＤＮＡポリメラーゼおよびトポイソメ ラーゼに置き換えられた、請求項１に記載の方法。
5. ５．パピローマウイルスＤＮＡを複製するための組成物であって、パピローマウ イルスタンバク質Ｅ１およびＥ２、および、パピローマウイルスＤＮＡの複製を 支持する、細胞を含まない抽出物を含有する、組成物。
6. ６．Ｅ２を含有せず、そしてＥ２の非存在下でウイルスＤＮＡ複製が生じる程度 にＥ１濃度が高められた、請求項５に記載の組成物。
7. ７．パピローマウィルスＤＮＡを複製するための組成物であって、パピローマウ イルスタンバク質Ｅ１およびＥ２、細胞性ＤＮＡポリメラーゼ、およびトポイソ メラーゼを含有する、組成物。