ES2282320T3

ES2282320T3 - Proteasa hcv ns2/3 activa, purificada.

Info

Publication number: ES2282320T3
Application number: ES01994573T
Authority: ES
Inventors: Diane Thibeault; Daniel Lamarre; Roger Maurice; Louise Pilote; Arnim Pause
Original assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Current assignee: Boehringer Ingelheim Canada Ltd
Priority date: 2000-12-15
Filing date: 2001-12-13
Publication date: 2007-10-16
Anticipated expiration: 2021-12-13
Also published as: MXPA03004835A; ATE356875T1; WO2002048375A2; DE60127299T2; EP1343897B1; JP2004514459A; NZ526863A; US7264811B2; JP3878132B2; AU2468802A; HUP0302558A2; DE60127299D1; CA2430661C; HUP0302558A3; US20070160629A1; IL155760A; US6815159B2; IL155760A0; US20070172936A1; EP1343897A2

Abstract

un procedimiento para producir una proteasa HCV NS2/3 inactiva, replicada (amplificada), que comprende las etapas de: a) aislar la proteasa, en presencia de un agente caotrópico; b) replicar (amplificar) la proteasa aislada, procediendo a ponerla en contacto con un agente reductor y óxido de laurildietil-amina (LDAO), en presencia de una concentración reducida de agente caotrópico o un aditivo polar.

Description

Proteasa HCV NS2/3 activa, purificada.

Sector de la invención

La presente invención, se refiere, de una forma general, a procedimientos de purificación y activación, para el virus de la proteasa NS2/3 del virus la hepatitis C (HCV), de una forma particular, a un procedimiento para producir una proteasa inactiva, replicada, o truncaciones de ésta, la cual puede activarse posteriormente para autosegmentación. De una forma más particular, el procedimiento, proporciona proteasa HVC NS2/3 activa, purificada, y ensayos par identificar inhibidores de ésta.

Antecedentes y transfondo de la invención

El virus de la hepatitis C (HVC), es una importante causa de enfermedad crónica del hígado, la cual conduce a la cirrosis y a enfermedad del hígado en estado final, en los humanos. En el mundo entero, más de 150 millones de personas, se encuentran infectados, de una forma persistente, con HVC y, el número de muertes atribuibles a infección crónica, aumentará, probablemente, de una forma dramática, en los próximos 10 - 20 años. Las terapias actualmente disponibles, han involucrado la utilización del interferón alfa, bien ya sea solo, o bien ya sea en combinación con otros agentes antivíricos, tales como la ribavirina. Dado que se observa una reducida tasa de respuesta, adicionalmente a un alto grado de recaídas de los pacientes, así como efectos secundarios, se requieren nuevas terapias, las cuales puedan proporcionar beneficios a largo plazo de los tratamientos.

Se han analizado las secuencias parciales y completas, clonadas y caracterizadas, del genoma del HCV, con objeto de proporcionar apropiadas dianas para la terapia antivírica prospectiva. El HCV, es un virus de RNA positivo, provisto de envoltura, en la familia Flaviviridae. El genoma de HCV-RNA, de hebra individual, es de una longitud de aproximadamente 9600 nucleótidos, y tiene un marco de lectura abierto, individual (ORF - [del inglés, open reading frame]-), el cual codifica a una poliproteína amplia, individual, de aproximadamente 3010 aminoácidos. En células infectadas, esta poliproteína, se segmenta en múltiples sitios, mediante proteasas celulares y víricas, para producir las proteínas estructuradas y no estructuradas (NS [del inglés non-structural]-). En el caso del HCV, la generación de proteínas no estructurales maduras (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NSA5A, y NS5B), se efectúa mediante dos proteasas víricas. La primera de ellas, hasta ahora, todavía poco caracterizada, se segmenta en la junción (unión) NS2/3, y a ésta se le hace referencia, en la parte que sigue de este documento, como proteasa NS2/3. La segunda de ellas, es una serina-proteasa, la cual se encuentra contenida en la región N-terminal de NS3, a la cual se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como proteasa NS3, y hace de mediadora en todas las segmentaciones subsiguientes, corriente abajo de la NS3, en ambos casos, en cis, en el sitio de segmentación NS3/4A, y en trans, para los demás sitios NS4A/4B, NS4B/5A, NS5A/5B. La proteína NS4A, se muestra como sirviendo para múltiples funciones, actuando como cofactor para la proteasa NS3 y ayudando, posiblemente, en la localización membranaria de NS3 y de otros componentes de replicasa vírica. La formación del complejo de la proteína NS3, con NS4A, parece ser necesaria para los eventos de procesado, intensificando la eficacia proteolítica de todos los sitios. La proteína NS3, exhibe, también, actividades nucleósido trifosfatasa y RNA helicasa. La NS5B, es una RNA polimerasa RNA-dependiente, la cual se encuentra involucrada en la replicación del HCV.

La mayoría de las enzimas codificadas por el HCV, han sido evaluadas como dianas, para el desarrollo de nuevas terapias antivíricas, a saber, las actividades proteasa NS3, helicasa y ATPasa, así como también la actividad RNA polimerasa RNA-dependiente de NS5B (Dymock, B.W. et al. (2000) Antivirical Chemistry & Chemotherapy. 11(2): 79 - 96 y Walker, M.A. (1999) Drug Discovery Today 4(11): 518 - 529). La única enzima vírica que no se ha caracterizado hasta ahora, es la NS2/3, probablemente, debido al hecho de que ésta actúa co-translacionalmente (co-traductoramente).

La proteasa NS2/3, es responsable para la autosegmentación de la junción NS2 y NS3 entre aminoácidos Leu 1026 y Ala 1027 (Hirowatari, Y., et al (1993) Arch. Viril. 133: 349 - 356 y Reed, K.E. et al. (1995) J. Virol. 69 (7) 4127 - 4136). Esta segmentación, se presenta como siendo esencial para la replicación productiva, in vivo, tal y como se muestra mediante la ausencia de infección HCV en un chimpancé, después de la inoculación con un clon desprovisto de actividad proteasa NS2/3 (Kolykhalov, A.A., et al (2000) J. Virol. 74 (4) 2046 - 2051). Parece, también, que la generación de una secuencia N-terminal de proteasa NS2 funcional, y de una secuencia N-terminal de proteasa NS3 auténtica, se encuentran de alguna forma vinculadas a la fosforilación de NS5A (Liu, Q. et al. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 254, 572 - 577 y Neddermann P., et al. (1999) J. Virol 73 (12) 9984 - 9991).

La región mínima del marco de lectura abierto del HCV, requerida para la actividad de autosegmentación, ha sido reportada como encontrándose localizada en algún lugar comprendido entre los aminoácidos 898 y 907, para el límite fronterizo N-terminal, y el aminoácido 1206 para el límite fronterizo C-terminal (Hijikata, M. et al. (1993) J. Virol. 67 (8): 4665 - 4675.; Graakoui; A., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583 - 10587; Santolini, E., et al (1995) J. Virol. 69 (12): 7461 - 7471; y Liu, Q et al (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 254 - 572 - 577; Pallaoro et al., (2001) J. Virol. 75(20); 9939 - 46). De una forma interesante, la actividad proteasa NS2/3, es independiente de la actividad proteasa NS3 (Grakoui, A. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583 - 10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 (8): 4665 - 4667), pero el dominio de la proteasa NS3, no puede sustituirse por otra proteína no estructural (Santolini, E. et al. (1995). J. Virol. 69 (12): 7461 - 7471). Estudios de mutagénesis, han mostrado que, los residuos His 952 y Cys 993, son esenciales para la actividad de segmentación cis (Grakoui, A., et al. (1993) Proc. Acad. Sci. USA 90: 10583 - 10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 (8): 4665 - 4675). Gorbalenya, A. E. et al. (1996) Perspect. Drug Discovery Design, 6: 64 - 86), han sugerido el hecho de que, la NS2/3 proteasa, podría ser una proteasa cisteína. No obstante, la observación de que, la actividad, se estimula mediante iones metálicos y se inhibe mediante EDTA, conduce a la sugerencia de que, la proteasa NS2/3, es una metaloproteasa (Grakoui, A., et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583 - 10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 (8): 4665 - 4675). Estudios realizados con inhibidores clásicos de proteasa, en un ensayo de transcripción y traducción in vitro, (Pieroni, L. et al. (1997) J. Virol. 71 (9): 6373 - 6380) no han permitido todavía el alcanzar una clasificación definitiva.

El procesado, en la junción NS2/3, ha sido ya reportado (Darke, P.L. et al (1999) J. Biol. Chem. 274 (49 34511 - 34514 y WO 01 / 16 379; Grakoui, A., et al. (1993). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10583 - 10587; Hijikata, M. et al (1993) J. Virol. 67 (8): 4665 - 4675); (Pieroni, L. et al. (1997) J. Virol. 71 (9): 6373 - 6380 y (Santolini, E. et al. (1995). J. Virol. 69 (12): 7461 - 7471), siguiendo la expresión de la región NS2/3 en sistemas de traducción exentos de células, en E. coli, en células de infectadas con baculovirus recombinantes y / o en células mamarias (sistema híbrido de transfección transitoria o virus vacunal T7). No obstante, el procesado, no se ha sido reportado, en una enzima recombinante aislada, hasta muy recientemente (Pallaoro et al., (2001) J. Virol. 75 (20); 9939 - 46; Thibeault et al., J. Biol. Chem. 276 (49): 46678 - 46684).

Grakoui et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10583 - 10587 y Komoda et al, (1994) Gene, 145: 221 - 226 han descubierto, ambos, la expresión de polipéptidos HCV, incluyendo la proteasa NS2/3, en E. coli. Siguiendo a la expresión, el procesado, se asistió a partir de análisis de SDS-PAGE y de inmunoblot (inmunotransferencia) de lisados de células. Komoda, utilizando poliproteínas de HCV fusionadas a proteína de enlace de maltosa (MBP), en su término N, y dihidrofolato-reductasa (DHFR), en su término C, reportó también sobre la purificación parcial de los productos DHFR-fusionados, a partir de lisados, mediante cromatografía de afinidad, solamente para propósitos de secuenciación de N-terminales.

Así, de este modo, la caracterización bioquímica de la proteasa NS2/3, así como los estudios mecánicos y estructurales, han sido infructuosos, debido a la no disponibilidad de una forma recombinante pura de la enzima. Antes de que cualquier inhibidor de la proteasa NS2/3 pueda identificarse en un formato de alto rendimiento, debe existir una fuente disponible de formato de cribado de proteasa NS2/3-activa, purificada.

El documento de patente internacional WO 01 / 68 818, publicado en fecha 20 de Septiembre del 2001 (así como Pallaoro et al., (2001) J. Virol. 75 (20); 9939 - 46), han descrito un procedimiento para la purificación de una proteasa NS2/3, activa, recombinante. No obstante, su procedimiento de replicación, necesita llevarse a cabo a una temperatura de 4°C, con objeto de evitar la auto-catálisis.

El procedimiento de la presente invención, también dado a conocer en Thibeault et al., J. Biol. Chem. 276 (49): 46678 - 46684; da a conocer un procedimiento de purificación, el cual se realiza en 2 etapas, se lleva a cabo a la temperatura ambiente, y conduce, en el primer caso, a una proteasa NS2/3 insoluble, inactiva (estable a la temperatura ambiente), la cual puede aumentarse y almacenarse de una forma segura, sin auto-segmentación.

Es por lo tanto una ventaja de la presente invención, el proporcionar una un procedimiento de purificación de proteasa NS2/3, inactiva, replicada.

Es una ventaja adicional de la presente invención, el hecho de que, la proteasa soluble, inactiva, puede activarse adicionalmente, para producir proteasa NS2/3 activa, soluble para esfuerzos de cribado a gran escala.

Es también una ventaja adicional de la presente invención, el proporcionar una proteasa NS2/3 activa, recombinante, purificada, y truncaciones de ésta, en una escala tal, que se puedan cribar pequeñas moléculas y ligandos, como inhibidores potenciales.

Resumen de la invención

La presente invención, reduce las dificultades y las desventajas del arte de la técnica anterior, procediendo a proporcionar un nuevo procedimiento para la purificación y activación de la proteasa HCV NS2/3. De una forma ventajosa, este procedimiento, realiza ambas tareas, la de solubilizar la proteasa y la de replicarla bajo unas condiciones que no fomentarán la autosegmentación de la proteasa. Además, el procedimiento, tiene una ventaja adicional, consistente en el hecho de que se produce una forma N-terminal truncada de la proteasa NS2/3, a altos niveles, en cuerpos de inclusión, utilizando procedimientos recombinantes, a continuación de su expresión en E. coli. Este alto nivel de producción, permite que se aíslen y se purifiquen grandes cantidades de la proteasa.

Este es el primer reporte de una proteasa NS2/3, inactiva, aislada, la cual es estable a la temperatura ambiente, sin proceder a una auto-catálisis. Éste es, también, el primer reporte de una proteasa NS2/3 activa, recombinante, purificada, obtenida a partir del procedimiento de la invención. La disponibilidad de la proteasa NS2/3 recombinante, purificada, permitirá el que se realice una caracterización bioquímica detallada de la enzima, y el desarrollo de ensayos in vitro, para cribar nuevos inhibidores.

En concordancia con la primera forma de presentación, la invención, proporciona un procedimiento para producir una proteasa HCV NS2/3 inactiva, replicada (amplificada), que comprende las etapas de:

a) aislar la proteasa, en presencia de un agente caotrópico;

b) replicar (amplificar) la proteasa aislada, procediendo a ponerla en contacto con un agente reductor y óxido de laurildietil-amina (LDAO), en presencia de una concentración reducida de agente caotrópico o un aditivo polar.

En concordancia con una segunda forma de presentación de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende:

c) añadir un agente de activación, a un medio que contiene proteasa NS2/3 inactiva, soluble, obtenido en la etapa b), formando con ello un tampón de segmentación / activación, de tal forma que se induzca la auto-segmentación de la proteasa NS2/3.

Se procede adicionalmente a dar a conocer un procedimiento para ensayar la actividad de proteasa NS2/3, el cual comprende:

d) incubar la proteasa NS2/3, en el tampón de segmentación / activación de la etapa c), durante un transcurso de tiempo suficiente, de tal forma que, la proteasa NS2/3, se autosegmente; y

e) medir la presencia o la ausencia de productos de segmentación, o fragmentos de éstos, como una identificación para la autosegmentación.

Se procede igualmente a dar a conocer un ensayo para el cribado de un fármaco o ligando candidato, que inhiba la actividad proteasa de un proteasa NS2/3, el cual comprende:

d) incubar una muestra de la proteasa NS2/3, en el tampón de segmentación / activación de la etapa c), durante un transcurso de tiempo suficiente, en presencia o en ausencia del fármaco o ligando candidato;

e) medir la cantidad de productos de segmentación o fragmentos de éstos; y

f) comparar la cantidad de productos de segmentación o fragmentos de éstos, en presencia o ausencia del fármaco o ligando candidato.

En concordancia con la presente invención, se proporciona una proteasa NS2/3 activa, replicada, una truncación de ésta, o una variante funcionalmente equivalente de ésta, que tiene la secuencia de aminoácidos mínima, procedente de los residuos 906 a 1206, de la proteasa NS2/3 de longitud total, según se enumera, en concordancia con la numeración utilizada en la figura 1B.

En concordancia con la invención, se proporciona una composición que comprende una proteasa NS2/3, aislada, seleccionada a partir de la proteasa NS2/3 de longitud total, una truncación de ésta, o una secuencia tal y como se define en concordancia con la SEQ ID. Nº 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14, en donde, la citada proteasa, es una solución que comprende una concentración suficiente de LDAO, para evitar la autosegmentación de la citada proteasa.

Descripción resumida de los dibujos

Habiendo así descrito la invención, de una forma general, se hará ahora referencia a los dibujos que se acompañan, los cuales muestran, a título de ilustración, una forma preferida de presentación de éstos, y en los cuales:

La figura 1A, muestra una secuencia nucleótida de longitud total NS2/3 (810 - 1206)st, (SEQ ID NO. 1), de genotipo HCV 1b.

La figura 1B, muestra una secuencia de aminoácidos de la NS2/3 de longitud total (810 - 1206)st (SEQ ID NO. 1), codificada por la secuencia nucleótida de la figura 1A.

La figura 2, muestra un estudio de truncación N-terminal, en la cual, la longitud total de la proteasa HCV NS2/3 y los mutantes de deleción N-terminal que abarcan los aminoácidos desde 815 - 915 hasta 1206, se clonó en el vector de expresión pET11d. Los constructores de la proteasa NS2/3, se tradujeron in vitro, con un lisado de reticulocito de ratón. Los productos traducidos [^{35}S]-marcados, se separaron mediante SDS-PAGE (15%) y se visualizaron con un Phosphorolmager (A). La expresión de E. coli de los constructores de proteasa NS2/3, sin inducción (banda -) o a continuación de una inducción de 2 horas a una temperatura de 37°C, con 1 mM IPTG (bandas +), se evaluó, mediante SDG-PAGE (15%) (B), y análisis de inmunoblot (inmunotransferencia), utilizando un anticuerpo policlonal anti-NS2/3 (C). Las bandas, se enumeran en concordancia con el primer aminoácido de la proteasa NS2/3, expresada en cada transcripto. Las posiciones de los patrones standard de masa molecular, se encuentran indicadas, así como también la proteasa NS3.

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La figura 3, muestra un diagrama que representa un constructor de proteasa HCV NS3/2, el cual abarca a residuos de aminoácidos 904 - 1206, conjuntamente con lisina de los terminales N y C, un terminal N hexahistidina tag, y un terminal C estreptavidina tag ("St").

La figura 4, muestra un cromatograma obtenido a partir de la 4K-6H-NS2/3 (904 - 1206)st-4K (SEQ ID No. 4), sobre columna de filtración de gel Superosa 12. A continuación de la adición de 5 mM TCEP y 5 mM ZnCl_{2}, a los cuerpos de inclusión purificados, la enzima, se replicó y se eluyó en Tris 50 mM, pH 8,0, 0,5 arginina-HCl, 1% LDAO, 5 mM TCEP. La línea continua ( ------ ), representa la absorbancia, a 280 nm y, la línea discontinua (- - - - \cdot - - - -), indica la actividad del dominio de la proteasa NS3, controlada sobre fracciones seleccionadas, utilizando el substrato fluorogénico antranil-DD/VPAbu[C(O)-O]AMY(3-NO_{2})TW-OH.

La figura 5, muestra la producción y purificación de 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K, a partir de cuerpos controlados mediante 15% SDS-PAGE, marcados con análisis de inmunoblot (A) Cromassie blue, utilizando antisuero anti-NS3 del conejo (B) y análisis de inmunoblot, utilizando antisuero anti-His_{6} del conejo (C). Banda 1: extracto crudo de células de E. coli; bandas 2 - 5: lavados de anticuerpos de inclusión (IB); bandas 6 - 10: purificación de cuerpos de inclusión sobre columna quelante Ni^{2+}: banda 11: cuerpos de inclusión purificados; banda 12: carga de columna de filtración de gel de Superosa 12; banda 13: enzima replicada (véanse los ejemplos para los detalles). La enzima no procesada y los productos de segmentación 4K-6H-NS2 (904 - 1026) y NS3 (107 - 1206)st-4K), se encuentran indicados.

La figura 6, muestra el efecto de glicerol y CHAPS sobre la actividad de autoprocesado de la 4K-6H-NS2/3 (904 1206)st-4K, controlada mediante inmunoblot, utilizando un antisuero anti-NS3 del conejo. La reacción de autosegmentación, se inició mediante dilución de la enzima replicada en 50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM TCEP, que contenía cantidades varias de glicerol y CHAPS, seguido de la incubación, durante un transcurso de tiempo de 19 horas, a una temperatura de 23°C. Banda 1: 30% de glicerol, sin CHAPS; bandas 2 - 5; sin glicerol y 0,1, 0,25, 0,5 ó 1,0% CHAPS, respectivamente; bandas 6 - 9: 30% de glicerol y 1, 0,25, 0,5 ó 1,0% CHAPS, respectivamente. La enzima no procesada y el producto NS3(1027 - 1206)st-4K, se encuentran indicados.

La figura 7, muestra un curso del tiempo de la segmentación cis de 4K-6H-NS2/3 (904-1206)st-4K, mediante inmunoblot, utilizando antisuero anti-NS3 del conejo (A) y antisuero anti-His_{6} del conejo (B). La reacción de autosegmentación, se inició procediendo a diluir la enzima replicada en 50 mM Hepes, pH 7,0, 50% glicerol (peso / volumen), 1% n-\beta-D-dodecilmaltósido, 1 mM TCEP e incubando durante un transcurso de tiempo de 0, 1, 2, 4, 6 y 24 horas, a una temperatura de 23°C. La enzima no procesada y los productos 4K-6H-NS2 (904 - 1026) y NS3 (1027 - 1206)st-4K, se encuentran indicados.

La figura 8, muestra una comparación de la actividad proteasa NS2-NS3, del mutante His952Ala ("H952A"), purificado (SEQ ID NO 16) de la 4K-6H-NS2 (904 - 1026)st-4K, y el WT purificado mediante análisis de inmunoblot, utilizando antisuero anti-NS3 (A) o antisuero anti-His_{6} (B). La reacción de autosegmentación, se realizó en 50 mM Hepes, pH 7,0, 50% glicerol (peso / volumen), 1% n-\beta-D-dodecilmaltósido, 1 mM TCEP e incubando durante un transcurso de tiempo de 0,2 y 24 horas, a una temperatura de 23°C. La enzima no procesada y los productos de autosegmentación 4K-6H-NS2 (904 - 1026) y NS3 (1027 - 1206)st-4K, se encuentran indicados.

La figura 9A, muestra una secuencia nucleótida de 4K-6H-NS2/3 (904 - 1026) y NS3 (1027 - 1206)st-4K (SEQ. ID NO.3).

La figura 9B, muestra la secuencia de aminoácidos de 4K-6H-NS2/3 (904 - 1026) y NS3 (1027 - 1206)st-4K, (SEQ. ID NO 4), codificada por la secuencia de nucleótidos de la figura 9A.

La figura 10, es un diagrama que ilustra el formato de un ensayo de fluorescencia heterogénea resuelta con el tiempo (TRF).

La figura 11, es un diagrama que ilustra el formato de un ensayo de fluorescencia homogénea resuelta con el tiempo (TRF).

La figura 12, es un diagrama que ilustra el formato de un ensayo de polarización de fluorescencia.

La figura 13, es un diagrama que ilustra el formado de un ensayo radiométrico.

La figura 14, es una representación esquemática de un formato de ensayo TRF, que utiliza la proteasa NS2/3 purificada de la invención.

Descripción detallada de la invención Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí, tienen los mismos significados que los que se utilizan usualmente por parte de una persona usualmente especializada en el arte de la técnica a la cual pertenece la invención. De una forma general, el procedimiento para el cultivo de células, infección, procedimientos de biología molecular y por es estilo, son procedimientos comunes, utilizados en el arte especializado de la técnica. Tales tipos de técnicas, pueden encontrarse en manuales de referencia, tales como, por ejemplo, Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - A laboratory Manual - [1989, Clonación molecular - Un manual de laboratorio]-), Cold Springer Harbor Laboratories) y Austobel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology - [1994, Protocolos actuales en biología molecular]-), Wiley, New York.

Las secuencia nucleótidas, se presentan, aquí, mediante hebra individual, en la dirección 5’ a 3’, desde la izquierda hasta la derecha, utilizando símbolos nucleótidos de una letra, tal y como se utiliza usualmente en el arte especializado de la técnica, en concordancia con las recomendaciones de la Nomenclatura IUPAC-IUB de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica (Biochemistry, 1972, 11: 1726 - 1732).

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, los términos "proteasa NS2/3 activa", "proteasa" y "enzima", se utilizan de una forma intercambiable, en la totalidad de esta especificación, y se refieren a una proteasa NS2/3 codificada por HCV.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "proteasa NS2/3 activa", pretende describir la proteasa NS2/3 que retiene un nivel detectable de actividad de segmentación, entre los residuos 1026 - 1027. La actividad proteasa, se mide mediante el control de los niveles de proteasa NS2/3 no segmentada, restante, productos de segmentación tales como, bien ya se la proteína NS2 ó bien ya sea la proteasa NS3, o un fragmento de éstas, por ejemplo, en los ensayos enzimáticos, ELISA, o mediante análisis de Western blot (transferencia de Western).

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "aislado", con referencia a la proteasa NS2/3, pretende significar que, la proteasa NS2/3, se encuentra enriquecida, con respecto a los componentes celulares. De una forma particular, este término, significa que, la proteasa NS2/3, se encuentra enriquecida en un porcentaje del 50%, o mayor, si se compara con componentes celulares contaminantes.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término, el término "purificadora" (o de purificación) o "purificada", cuando se refiere a la proteasa NS2/3, se pretende dar a entender que, la proteasa NS2/3, se encuentra substancialmente exenta de componentes celulares contaminantes. De una forma preferible, la proteasa NS2/3, se encuentra purificada a un grado de pureza de aproximadamente un 90%. De una forma más preferible, la proteasa NS2/3, se encuentra purificada a un porcentaje de aproximadamente un 95%. De una forma mayormente preferible, la proteasa NS2/3, es encuentra purificada a un grado de pureza de aproximadamente un 98%.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "proteasa NS2/3 inactiva", pretende describir la proteasa NS2/3 en la que se ha reducido significativamente, o se ha eliminado esencialmente, la actividad de segmentación, entre los residuos Leu 1026 - Ala 1027, tal y como se determina mediante SDS - PAGE.

Tal y como se utiliza aquí, el término "molécula de ácido nucleico", pretende incluir moléculas de DNA (por ejemplo, cDNA ó DNA genómico) y moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA). La molécula de ácido nucleico, puede ser de hebra individual o de doble hebra, pero, de una forma preferible, ésta es DNA de doble hebra.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "vector", se refiere a una molécula de ácido nucleico, capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico, a la cual, a la cual ésta se ha unido. Un tipo de vector, es un plásmido, el cual se refiere a un bucle circular de DNA de doble enlace, en el cual, puede ligarse segmentos adicionales de DNA. Otro tipo de vector, es un vector vírico, en donde, segmentos adicionales de ADN, pueden ligarse en el genoma vírico. Ciertos vectores, tienen capacidad para la replicación autónoma en una célula huésped, en la cual éstos se encuentran introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos, que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos), se encuentran integrados en el genoma de una célula huésped, mediante la introducción, en la célula huésped, y así, de este modo, se replican conjuntamente con el genoma huésped. Adicionalmente, además, ciertos vectores, son capaces de dirigir la expresión de genes, a los cuales éstos se encuentran operativamente enlazados. A tales tipos de vectores, se les hace referencia como "vectores de expresión". De una forma general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de recombinantes de DNA, se encuentran, a menudo, en forma de plásmidos. En la presente especificación, " plásmido" y "vector", pueden utilizarse de una forma intercambiable, debido al hecho de que, el plásmido, es la forma más comúnmente utilizada de vector. No obstante, la invención, pretende incluir tales tipos de otras formas de vectores de expresión, tales como los vectores víricos, los cuales sirven como funciones equivalentes.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "célula huésped", pretende hacer referencia a una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico de la invención, tal como un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante", se utilizan, aquí, en este documento, de una forma intercambiable. Debería entenderse el hecho de que, tales términos, se refieren no únicamente a la célula particular objeto, sino también a la progenie o potencial de progenie de una célula de este tipo. Puesto que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones futuras, debido a bien ya sea la mutación, o bien ya sea a las influencias del entorno medioambiental, tal progenie, puede ser, de hecho, no idéntica a la célula madre, pero se encuentran todavía incluidas en el ámbito del término, tal y como se utiliza aquí.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "recombinante" o "producido de una forma recombinante", pretende indicar el hecho de que, una célula, replica o expresa una molécula de ácido nucleico, o expresa un péptido o proteína codificado por una molécula de ácido nucleico, cuyo origen, es exógeno a la célula. De una forma particular, la célula recombinante, puede expresar genes que no se encuentran en la forma nativa (o recombinante) de la célula.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, una "variante funcionalmente equivalente", cuando se utiliza para describir la proteasa NS2/3, pretende referirse a una secuencia de proteína, en donde, uno o más aminoácidos, se reemplazan por otro(s) aminoácido(s) o aminoácido(s) no naturales, que no afectan substancialmente a la actividad proteasa NS2/3. Tales tipos de reemplazos, incluyen a las sustituciones conservadoras de aminoácidos o sustituciones de ácidos nucleicos degenerados. Cuando se refieren a una secuencia de proteína, el aminoácido sustituyente, tiene unas propiedades físicas, las cuales son usualmente, pero no necesariamente, similares, a las del aminoácido sustituido. La propiedades químico-físicas similares, incluyen similitudes en carga, volumen de masa, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y por el estilo. Algunas de las sustituciones conservadoras de aminoácidos mayormente conocidas, incluyen, pero no de una forma limitativa, a: Leu o Val ó Ile; Gly o Ala; Asp o Glu; Asp o Asn o His; Glu o Gln, Lys o Arg; Phe o Trp o Tyr; Val o Ala; Cys o Ser; Thr o Ser; y Met o Leu.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "inhibir", cuando se utiliza con referencia a la proteasa NS2/3, pretende significar que, la capacidad de la proteasa, para autosegmentarse, se encuentra disminuida. Los fármacos o ligandos que puede inhibir proteasa NS2/3 (a los cuales se le hará referencia, en la parte que sigue de este documento, como "inhibidores potenciales", pueden ser de utilidad para modular la infección HCV, en una población de células, y así, por lo tanto, pueden ser de utilidad como medicamentos para tratar una patología caracterizada por la presencia de HCV en las células.

Tal y como se utiliza aquí, en este documento, el término "autosegmentación" o "aultosegmentado", cuando se utiliza para describir proteasa NS2/3, pretende dar a entender que, la segmentación, en la junción NS2/3 (Leu 1026 - Ala 1027), acontece de una forma intramuscular, sin un substrato exógeno.

El término "marcador de afinidad", tal y como se utiliza aquí, en este documento, se refiere a un marcador el cual se encuentra específicamente atrapado mediante un ligando complementario. Los ejemplos de pares de marcador de afinidad / ligando de afinidad, incluyen, pero no de una forma limitativa en cuanto a éstos, a: Proteína de Enlace de Maltosa (MBP)/Maltosa; Glutatión S Transferasa (GST) / glutatión; histidina (His) / metal; estraptavidina tag / estraptavidina o neutravidina. El metal utilizado como ligando de afinidad, puede seleccionarse de entre el grupo consistente en: cobalto, zinc, cobre, hierro, y níquel (Wong et al. (1991) Separation and Purification Methods, 20 (1), 49 - 106). El marcador de afinidad, puede posicionarse en el final N-terminal ó C-terminal de la proteína, pero, de una forma preferible, sobre el término N de la proteína. De una forma preferible, el metal seleccionado, es níquel. El ligando de afinidad, puede ajustarse en columnas, con objeto de facilitar la separación, mediante cromatografía de afinidad.

Formas preferidas de presentación I.- Procedimiento de replicación y purificación

En concordancia con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para producir una proteasa HCV NS2/3 inactiva, que comprende las etapas de:

a) aislar la proteasa a partir de cuerpos de inclusión, en presencia de una alta concentración de agente caotrópico;

b) replicar la proteasa aislada procediendo a poner en contacto la proteasa con un agente reductor y LDAO, en presencia de una reducida concentración de agente caotrópico o aditivo polar.

En un aspecto preferido de la primera forma de presentación, la proteasa NS2/3 activa, se produce utilizando técnicas de DNA recombinante. Los vectores de expresión de la invención (véanse los ejemplos), comprenden un ácido nucleico de la invención, en una forma apropiada para la expresión de la proteína en una célula huésped, lo cual significa el hecho de que, los vectores de expresión recombinantes, incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células huésped a ser utilizadas para la expresión, la cual se encuentra operativamente unida a la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína a expresarse. Mediante un vector de expresión recombinante, "operativamente unido", se intenta dar a entender el hecho de que, la secuencia nucleótida de interés, se encuentra unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s), de tal forma que ésta permita la expresión de la correspondiente secuencia de aminoácidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción / traducción in vitro, o en una célula huésped, cuando el vector se introduce en una célula huésped). El término "secuencia reguladora", pretende incluir a promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales tipos de secuencias reguladoras, se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185, - Tecnología de expresión de genes: Métodos en Enzimología, 185 -, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). La secuencias reguladoras, incluyen a aquéllas que constituyen directamente la expresión de una secuencia de ácido nucleico, en muchos tipos de células huésped, y a aquéllas que efectúan directamente la expresión de la secuencia nucleótida, únicamente en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejidos). Se apreciará, por parte de aquéllas personas expertas en el arte especializado de la técnica, el hecho de que, el diseño del vector de expresión, pueda depender de factores tales como los correspondientes a la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención, pueden introducirse en células huésped, para producir, con ello, proteínas o péptidos codificados por ácidos nucleicos tal y como se describen aquí, en este documento (por ejemplo, proteasa NS2/3, truncaciones de formas mutantes de NS2/3 proteasa).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención, pueden diseñarse para la expresión de proteasa NS2/3, en células procariotas o eucariotas. Así, por ejemplo, la proteasa NS2/3, puede expresarse en células bacterianas, tales como E. coli, células de insectos (utilizando vectores de expresión de baculovirus) células de levaduras o células de mamíferos. Las células apropiadas, se discuten adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185, - Tecnología de expresión de genes: Métodos en Enzimología, 185 -, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

La expresión de proteínas en procariotas, se lleva a cabo, los más a menudo, en E. coli, con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles, que dirigen la expresión de tanto las proteínas de fusión, como las proteínas de no fusión. Los vectores de fusión, añaden un determinado número de aminoácidos a una proteína codificada en éstos, usualmente, al término amino de proteína recombinante. Tales tipos de vectores de fusión, sirven típicamente para tres propósitos: 1) incrementar la expresión de proteína recombinante; 2) incrementar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante, actuando como un ligando, en purificación de afinidad (por ejemplo afinidad tag, tal como una hexahistidina tag). Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli, es la consistente en expresar la proteína en una bacteria huésped, con una capacidad debilitada para segmentar proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology; Methods in Enzymology 185, - Tecnología de expresión de genes: Métodos en Enzimología, 185 -, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119 - 128. Otra estrategia, es la de modificar la secuencia de ácido nucleico a ser insertada en el vector de expresión, de tal forma que, los codones individuales para cada aminoácido, sean aquéllos preferencialmente utilizados en E. coli (Wada et al., (1992) Nuc. Acids Res. 20: 2111 - 2118). Tal tipo de modificación de secuencias de ácido nucleico de la invención, pueden llevarse a cabo mediante técnicas standard de síntesis de DNA.

Un vector de DNA, puede introducirse en células procarióticas o eucarióticas, vía técnicas convencionales de transformación o de transfección. Tal y como se utiliza aquí, en este documento, los términos "transformación" y "transfección", pretenden referirse a una variedad de técnicas de reconocimiento en el arte especializado de la técnica, para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, DNA) en una célula huésped, incluyendo la co-precipitación de fosfato cálcico o de cloruro cálcico, la transfección mediatizada por DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Procedimientos apropiados para transformar o transfectar células huésped, pueden encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edition, - Clonación molecular: Un manual de laboratorio, 2 ª edición -, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989, y otros manuales de laboratorio.

A menudo, durante la expresión de la proteína, se forman los denominados cuerpos de inclusión. La proteasa NS2/3, puede aislarse de la célula huésped, por ejemplo, mediante la lisis de la célula huésped y la recuperación de la proteasa NS2/3 recombinante, a partir de los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión, son agregados de proteínas o polipéptidos, intactos, en conformaciones semejantes a la no nativas (véase Current Protocols in Protein Science, - Protocoles actuales en la ciencia de las proteínas (1997) John Wiley & Sons Inc.). Existen muchos ejemplos de cómo extraer proteína a partir de cuerpos de inclusión y éstos se discuten en Current Protocols in Protein Science. La célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariótica o eucariota, en cultivo, puede utilizarse para producir la proteasa NS2/3 de la presente invención.

Correspondientemente en concordancia, la invención, incluye el cultivar una célula huésped en un medio de cultivo. La célula huésped, contiene un vector de expresión, el cual tiene una región codificante de una secuencia de ácido nucleico que codifica a la proteasa NS2/3, teniendo como resultado la producción de proteasa NS2/3 recombinante, inactiva, no replicada o inapropiadamente replicada, en cuerpos de inclusión. Las células huésped, se lisan con un tampón de lisis, para producir lisados de células huésped. Los cuerpos de inclusión, en los lisados de células huésped, se recuperan a partir de éstos, mediante centrifugación a baja velocidad. De una forma preferible, el tampón de lisis, contiene aproximadamente 0,1% Triton X-100. Los cuerpos de inclusión, se extraen entonces, de una forma selectiva, utilizando un tampón de extracción, el cual contiene, de una forma preferible, aproximadamente 2% Triton X-100 y 2M urea. De una forma preferible, ambos, el tampón de lisis y el tampón de extracción, contienen un agente de reducción, seleccionado de entre el grupo consistente en DTT y TCEP.

De una forma alternativa, la proteasa NS2/3 recombinante, puede también prepararse con una proteína extracelular, procediendo a enlazar, de una forma operativa, un secuencia de señal heteróloga, al término amino de la proteasa, de tal forma que éste se secrete desde una célula eucariótica. En este caso, la proteasa NS2/3 recombinante, puede recuperarse a partir del medio de cultivo, en el cual se cultivan las células.

En otro aspecto de la primera forma de presentación, la proteasa NS2/3, se encuentra construida, para contener una afinidad tag, la cual puede utilizarse de tal forma que, la proteasa NS2/3 inactiva, pueda aislarse a partir de los cuerpos de inclusión, utilizando cromatografía de afinidad. Tal afinidad tag y el correspondiente ligando, son bien conocidos en el arte de la técnica especializada.

En un aspecto preferido de la primera forma de presentación, se utiliza LDAO, a su valor de concentración crítico de micelas, o por encima de su valor de concentración crítico de micelas. De una forma preferible, se utiliza LDAO, a un valor de concentración comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 0,003% y un 1%. En un aspecto mayormente preferido, se utiliza LDAO, a un valor de concentración comprendido dentro de unos márgenes situados entre un 0,03% y un 1%. Sin pretender ligarlo a ninguna teoría, los inventores, creen que el LDAO presente en el tampón de replicación (filtración de gel), se requiere para replicar, pero no es suficiente para la cis-segmentación de la enzima.

En un aspecto preferido de la primara forma de presentación, etapa b) el agente caotrópico o aditivo polar, se selecciona de entre el grupo consistente en: guanidina hidrocloruro, urea y arginina-hidrocloruro. De una forma más prefe-
rible, se utiliza guanidina-hidrocloruro ó arginina-HCl. De una forma mayormente preferible, se utiliza arginina-HCl.

En un aspecto preferido de la primara forma de presentación, etapa b) el agente caotrópico o aditivo polar, se utiliza, de una forma preferible, a una concentración comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,25 M y 2 M. En un aspecto mayormente preferido, éste se utiliza a una concentración comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,5 M y 1 M, de una forma mayormente preferible, a una concentración final de 0,5 M.

En otro aspecto preferido, el agente de reducción, se selecciona de entre el grupo consistente en TCEP y DTT. De una forma preferible, el agente de reducción, se encuentra presente a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0 y 100 mM, de una forma más preferible, entre 1 mM y 10 mM. De una forma mayormente preferible, el agente de reducción, se encuentra presente a una concentración final de 5 mM.

En un aspecto preferido de la primera forma de presentación, el procedimiento de replicación, descrito anteriormente, arriba, se lleva a cabo mediante diálisis o mediante filtración en gel, para proporcionar una proteasa NS2/3 purificada. En un importante aspecto, la proteasa NS2/3 inactiva, soluble, se replica utilizando filtración en gel. El tampón utilizado, contiene LDAO, arginina-HCl y el agente de reducción y la NS2/3 inactiva, soluble, se mantienen en el tampón de elución, durante un transcurso de tiempo suficiente, como para replicar la proteasa NS2/3. La colección de las fracciones principales, permite la recuperación de una enzima altamente purificada.

II.- Procedimientos de activación

c) la adición de una proteasa NS2/3 inactiva, soluble, obtenida en la etapa b), a un medio que contiene un agente de activación, de tal forma que se induzca auto-segmentación de la proteasa NS2/3.

En un aspecto preferido de la segunda forma de presentación, el agente de activación, se selecciona de entre el grupo consistente en: glicerol, o un detergente tal como CHAPS, Triton X-100, NP-40 y n-dodecil-\beta-D-maltósido.

Como una alternativa a esta segunda forma de presentación, se proporciona un procedimiento para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende:

c) diluir la proteasa NS2/3 inactiva, replicada, obtenida en la etapa b), en un medio que contiene un detergente de activación, para inducir auto-segmentación a la citada proteasa NS2/3.

De una forma preferible, el LDAO remanente en la proteasa NS2/3, después de la dilución, se encuentra a una concentración final por debajo de un 0,25%. De una forma mayormente preferible, el LDAO, se diluye a una concentración final igual o inferior a un 0,1%. De una forma mayormente preferible, el LDAO, se diluye a una concentración final por debajo del 0,05%.

De una forma preferible, el detergente de activación, se selecciona entre: CHAPS, Triton X-100, NP-40 y n-dodecil-\beta-D-maltósido. De una forma más preferible, el detergente de activación, es CHAPS ó n-dodecil-\beta-D-maltósido.

De una forma preferible, el detergente de activación, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente un 0,1% hasta aproximadamente un 3%. De una forma más preferible, el detergente de activación, se encuentra a una concentración comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente un 0,1% hasta aproximadamente un 1%. De una forma mayormente preferible, el detergente de activación, se encuentra a una concentración final del 0,5%.

Adicionalmente al detergente de activación, puede también añadirse glicerol, para ayudar en la activación de la proteasa NS2/3 inactiva, replicada. De una forma preferible, el glicerol, puede encontrarse presente a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre aproximadamente un 0% y un 60%. De una forma preferible, el glicerol, puede encontrarse presente a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 10% y un 50%. De una forma mayormente preferible, el glicerol, se encuentra presente a una concentración final del 30%.

De una forma importante, en un aspecto preferido, el agente de reducción, se encuentra todavía presente en el tampón o medio de activación / segmentación utilizado para la activación, aunque, no obstante, a una menor concentración que la necesaria para la etapa de replicación. El agente reductor, puede seleccionarse de entre el grupo consistente en TCEP y DDT. De una forma más preferible, el agente de reducción, es TCEP.

De una forma preferible, el agente de reducción, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 mM y 100 mM. De una forma más preferible, el agente de reducción, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 1 mM y 10 mM. De una forma mayormente preferible, el agente de reducción, se encuentra a una concentración final de 1 mM.

III.- Procedimiento para la medición de la actividad proteasa NS2/3

Adicionalmente, se da a conocer un procedimiento para la medición de la actividad de autosegmentación de proteasa NS2/3 purificada, que comprende:

c) incubar la proteasa NS2/3 inactiva, replicada, obtenida en la etapa b), en un tampón que contiene un agente de activación, durante un transcurso de tiempo suficiente como para que se autosegmente la proteasa NS2/3; y

d) medir la presencia o ausencia de la proteasa NS2/3 remanente, productos de segmentación, o fragmentos de éstos, como una indicación de la autosegmentación.

De una forma preferible, la proteasa NS2/3 inactiva replicada, se replica y se purifica, utilizando filtración en gel, previamente a llevar a cabo el ensayo anteriormente mencionado, arriba.

De una forma preferible, el detergente de activación, es: CHAPS, Triton X-100, NP-40 y n-dodecil-\beta-D-maltósido. De una forma más preferible, el detergente de activación, es n-dodecil-\beta-D-maltósido (DM), a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 0,1% y un 3%. De una forma aún más preferible, el detergente de activación, es n-dodecil-\beta-D-maltósido, a una concentración comprendida dentro de unos márgenes que van desde aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 1%. De una forma incluso todavía más preferible, el DM, se encuentra a una concentración final del 0,5%.

Con objeto de ayudar en la activación de la proteasa inactiva NS2/3 replicada, puede también añadirse un agente de activación adicional, tal como el glicerol. De una forma más preferible, el glicerol, puede encontrarse presente, a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 0% y un 60%. De una forma más preferible, el glicerol, puede encontrarse presente a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 10% y un 50%. De una forma mayormente preferible, el glicerol, se encuentra a una concentración final de un 30%.

De una forma preferible, la proteasa NS2/3, se incuba en el tampón de segmentación, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 1 hora, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van de 15°C a 30°C. De una forma más preferible, la proteasa NS2/3, se incuba en el tampón de segmentación, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 1 hora, a una temperatura comprendida dentro de unos márgenes que van de 15°C a 25°C. De una forma mayormente preferible, la proteasa NS2/3, se incuba en el tampón de segmentación, durante un transcurso de tiempo de por lo menos 1 hora, a la temperatura ambiente (aproximadamente 23°C.

En otro aspecto de la segunda forma de presentación, la reacción de segmentación, se para mediante la desnaturalización de la proteasa NS2/3. De una forma más preferible, la proteasa NS2/3, se desnaturaliza mediante calor. De una forma mayormente preferible, la proteasa NS2/3, se desnaturaliza con SDS, con objeto de parar la autosegmentación.

Los productos de segmentación son, de una forma preferible, proteína NS3 ó proteasa NS3. La cantidad de proteína NS2 ó proteasa NS3, o fragmentos de éstas, pueden medirse utilizando cualquiera de las muchas técnicas conocidas por parte de aquéllas personas usualmente expertas en el arte especializado de la técnica. Son ejemplos de tales tipos de técnicas, la actividad enzimática, el marcaje mediante inmunoblot (inmunotransferencia), quimioluminis-cencia, fluorescencia o marcaje de Coomassie. De una forma alternativa, la cantidad de proteasa NS2/3 no segmentada, remanente, puede también medirse, como un indicador de la autosegmentación.

IV.- Procedimientos de cribado de inhibidores

Adicionalmente, se da a conocer un test de ensayo para cribar inhibidores potenciales de la actividad de auto-segmentación de un proteasa NS3/3, que comprende:

c) incubar una muestra de la proteasa NS2/3 inactiva, replicada, obtenida en la etapa b), en un tampón que contiene un detergente de activación, durante un transcurso de tiempo suficiente, en presencia o ausencia del inhibidor poten-
cial;

d) medir la cantidad de productos de segmentación o fragmentos de éstos, y

e) comparar la cantidad de productos de segmentación o fragmentos de éstos, en presencia, o en ausencia, de un inhibidor potencial.

La muestra de la proteasa NS2/3 activa, se incuba, de una forma preferible, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, en el medio apropiado, con el fármaco candidato o ligando.

En un aspecto preferido, los productos de segmentación son, bien ya sea proteína NS2, o bien ya sea proteasa NS3. De una forma preferible, la presencia o ausencia de, bien ya sea la proteína NS2, o bien ya sea la proteasa NS3, o fragmentos de éstas, se analiza utilizando actividad enzimática, análisis de inmunoblot (inmunotransferencia), que comprende la utilización de anticuerpo anti-proteasa NS3, o un anticuerpo anti-histidina-tag. De una forma alternativa, la cantidad de proteasa NS2/3, puede también medirse como un indicador de segmentación.

V.- Proteasa NS2/3, polipéptidos y truncaciones / moléculas de ácido nucleico

De una forma preferible, la proteasa N2/3, es la proteasa Ns2/3 de longitud total 810 - 1206, o una truncación de ésta. De una forma más preferible, la proteasa NS2/3, está truncada N-terminalmente, teniendo su primer aminoácido correspondiente al aminoácido 815 hasta el aminoácido 906. De una forma todavía más preferible, la proteína truncada N-terminal, que tiene su primer aminoácido correspondiente a los aminoácidos 866 a 906. De una forma incluso más preferible, la proteína truncada N-terminal, que tiene su primer aminoácido correspondiente a los aminoácidos 890 a 904. De una forma mayormente preferible, se proporciona una proteína truncada NS2/3, que tiene la secuencia de aminoácidos mínima desde los residuos 904 a 1206 de la proteasa NS2/3 de longitud total. De una forma incluso todavía mayormente preferible, la proteína NS2/3 truncada, consiste de los aminoácidos 904 - 1206, tal y como se enumeran, en concordancia con la SEQ ID NO. 10.

En concordancia con la invención, se proporciona un polipéptido NS2/3 activo, consistente en proteasa NS2/3 activa, seleccionada de entre el grupo consistente en: una secuencia, tal y como se define en concordancia con la SEQ ID NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14. De una forma preferible, la proteasa NS2/3, tiene una secuencia seleccionada de entre el grupo consistente en: una secuencia tal y como se define en concordancia con las SEQ IDs NO. 4, 10, 11 y 12. De una forma más preferible, la proteasa NS2/3, tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO. 4 ó 10, o una variante funcionalmente equivalente de ésta. De una forma mayormente preferible, la proteasa NS2/3, tiene una secuencia mostrada en la SEQ ID NO. 4 ó 10.

En concordancia con otro aspecto de la invención, se proporciona una proteasa NS2/3, inactiva, replicada, seleccionada de entre el grupo consistente en: proteasa NS2/3 de longitud total, una secuencia tal y como se define según la SEQ ID. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14. De una forma más preferible, se proporciona una proteasa NS2/3 inactiva, replicada, tal y como se define según la SEQ ID. NO. 4 ó 10.

En concordancia con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos que tiene un 90% de identidad con respecto a su longitud total, al compararse con el polipéptido tal y como se define según la SEQ ID. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14. De una forma más preferible, se proporciona un polipéptido, consistente en una secuencia de aminoácidos que tiene un 90% de identidad con respecto a su longitud total, al compararse con el polipéptido tal y como se define según la SEQ ID. NO. 4 ó 10.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico, según la secuencia que se muestra en las SEQ IDs. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14 y 15, respectivamente.

Los fragmentos de ácido nucleico que codifican a las variantes funcionalmente equivalentes de proteasa NS2/3, pueden preparase procediendo a aislar una porción de los residuos de la SEQ. ID NO. 1, que expresan la porción codificada 810 - 1206 de la proteasa NS2/3, por ejemplo, mediante expresión recombinante en una célula huésped, tal y como se describe anteriormente, arriba, y valorando la capacidad de la porción para autosegmentar, a continuación de la purificación y replicación.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, pueden aislarse utilizando técnicas standard de biología molecular y la secuencia de información proporcionada aquí, en este documento. Una molécula de ácido nucleico que abarca a la totalidad o a una porción de residuos que codifican para el aminoácido 890 - 1206, puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores oligonucleótidos apropiados. Así, por ejemplo, el mRNA, puede aislarse a partir de células (por ejemplo, mediante el procedimiento de extracción de guanidinium-tiocianato de Chirwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294 - 5299), y el cDNA, puede prepararse utilizando transriptasa inversa (por ejemplo, Moloney MLV reverse trancriptase, comercialmente obtenible en el mercado, de procedencia de la firma Gibco / BRL, Bethesda, Md.; o AMV reverse transcriptase, comercialmente obtenible en el mercado, de procedencia de la firma Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, Fla.). Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos para la amplificación por PCR, pueden diseñarse en base a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO. 1. Un ácido nucleico de la invención, puede amplificarse utilizando cDNA ó, de una forma alternativa, DNA genómico, como un molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados, en concordancia con las técnicas standard de amplificación por PCR. El ácido nucleico de esta forma amplificado, puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse mediante análisis de secuencias de ADN. Adicionalmente, los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia nucléotido de proteasa NS2/3, puede prepararse mediante técnicas sintéticas standard, por ejemplo, utilizando un sintetizador de DNA automatizado.

Adicionalmente a las variantes de origen natural de la secuencia de proteasa NS2/3 que pueden existir en una población vírica, una persona usualmente experta en el arte especializado de la técnica, apreciará que pueden introducirse cambios, mediante mutación, en la secuencia de nucleótidos que codifica para el aminoácido 890 hasta 1206, conduciendo, con ello, a cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada, que pueden modificar, o no, la actividad funcional de la proteasa NS2/3. Así, por ejemplo, pueden realizarse sustituciones que conducen a las sustituciones de aminoácidos, en los residuos "no esenciales" de aminoácidos, en la SEQ. ID NO. 1. Un aminoácido "no esencial", es un residuo que puede modificarse a partir de la secuencia de longitud total de la proteasa NS2/3 (por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO. 2), sin modificar la actividad funcional de la proteasa NS2/3, mientras que, para la actividad funcional, se requiere un residuo aminoácido "esencial".

Correspondientemente en concordancia, la invención, pertenece a moléculas de ácido nucleico que codifican a la proteasa NS2/3, que contienen cambios en los residuos de aminoácido, que son esenciales para la actividad NS2/3 proteasa. Tales tipos de mutantes de proteasa NS2/3, difieren en la secuencia de aminoácidos, con respecto a la SEQ ID NO. 10, y han perdido su actividad proteasa. Los ejemplos de tales tipos de proteasas NS2/3 mutantes que pueden utilizarse en la presente invención, son la proteasa NS2/3 [904 - 1206]H952A (SEQ ID NO. 16) en la cual, la His-952, se encuentra reemplazada por Ala, proteasa NS2/3 [904 - 1206]\Deltal 1226A - 1027 (SEQ ID NO 17), que corresponde a una deleción en los residuos de sitios de segmentación entre las proteínas NS2 y NS3 y proteasa NS2/3 [904 - 1206]C993A, en donde, el Cys993, se encuentra reemplazado por Ala (SEQ ID NO 18).

Ejemplos

La presente invención, se ilustra en mayor detalle, mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Materiales y procedimientos Abreviaciones

Ala:: alanina

°C:: Celsius

CHAPS:: 3-[(3-colamidopropil)dimetil-amonio]-1-propano sulfonato

CMC:: concentración micelar crítica

DHFR:: dihidrofolato reductasa

DNASa:: desoxirribonucleasa

DTPA:: N,N-bis[2-(bis){carboximetil)amino}etil-glicina]

DTT:: ditiotreitol

EDTA:: ácido etilendiaminotetraacético

g:: gram

g:: fuerza centrífuga relativa

h:: hora

HCV:: virus de la hepatitis C

Hepes:: ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperizina-etano-sulfónico

His:: histidina

His_{6}:: hexahistidina tag

HMK:: cinasa del músculo cardíaco

IPTG:: isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido

kDa:: kilodalton

LDAO:: óxido de laurildietilamina

Leu:: leucina

M:: molar

MBP:: proteína de enlace de la maltosa

min:: minuto

ml:: mililitro

mM:: milimolar

Octyl-POE:: n-octilpentaoxietileno

PCR:: reacción en cadena de la polimerasa

SDS-PAGE:: electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida

st:: estreptavidina tag, según se describe en Schmidt & Skerra, Prot. Engineering (1993) 6; 109 - 122

TCEP:: hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina

Tris:: tris(hidroximetil)aminometano

\mug:: microgramo

\mum:: micrómetro

WT:: tipo salvaje

W/V:: peso por volumen

Materiales

Los detergentes CHAPS y Triton X-100, se obtuvieron de la firma Sigma, el LDAO, se obtuvo de la firma Calbiochem, el n-dodecil-\beta-D-maltósido, se obtuvo de la firma Anatrace Inc., el NP-40, se obtuvo de la firma Roche y el octil-POE, se obtuvo de la firma Bachem. Los agentes de reducción DDT y TCEP, se obtuvieron de las firmas Pharmacia Biotech y Pierce, respectivamente. El hidrocloruro de arginina, el glicerol, el Hepes, el imidazol y el cloruro magnésico, se obtuvieron, todos ellos, de la firma Sigma. El clorhidruro de guanidina y el Tris, se obtuvieron de la firma Gibco BRL, mientras que, el IPTG y la urea, se obtuvieron de la firma Roche. El cloruro de sodio y el cloruro de zinc, se obtuvieron de las firmas Fisher y Aldrich, respectivamente, el EDTA, se obtuvo de la firma Ambion y la DNasa, se obtuvo de la firma Pharmacia Biotech. Las enzimas de restricción, se obtuvieron de la firma Pharmacia Biotech. Las células E. coli XL-1 Blue, se obtuvieron de la firma Stratagene y las células BL21(DE3)pLywsS, se obtuvieron de la firma Novagen. El FLAG®, se obtuvo de la firma Eastman Kodak Company, y corresponde a una secuencia peptídica que se reconoce mediante un anticuerpo anti-FLAG. El HMK_{tag}, es un péptido de cinco residuos (RRASV), la cual es una secuencia de reconocimiento para la cinasa específica de proteína HMK (cinasa del músculo cardíaco), que introduce, por lo tanto, un sitio de fosforilación (Blanar, M. and Rutter, W. (1992) Science 256: 1014 - 1018).

Ejemplo 1 Constructor NS2/3 de longitud total

La secuencia de NS2/3 de longitud total (810 - 1206), se amplificó mediante PCR, a partir de la secuencia de HCV 1b-40 (publicación de patente internacional WO / 07733, por Boheringer-Ingelheim (Canadá) Ltd.), utilizando dos cebadores oligonucleótidos 5’-CCATGGACCGGGAGATGGCT-3’ (SEQ ID NO. 5) para el término N, y 5’GGATCCT
TAACCACCGAACTGCGGGTGACGCCAAGCGCTACTAGTCCGCATGGTAGTTTCCAT-3’(SEQ ID NO. 6), para el término C. Este procedimiento, introduce un sitio NcoI, en el extremo 5’, y una estreptavidina tag "st" (Schmidt & Skerra, Prot. Engineering (1993) 6; 109 - 122), seguido un sitio BamHI, en el extremo 3’, proporcionando una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO.1 (figura 1). El producto de PCR, se insertó en el vector pCR®, utilizando el equipo de clonación a modo de kit, del tipo TA cloning® kit, de la firma Invitrogen. El inserto, se transfirió, a continuación, a una vector de expresión bacteriana pET-11d (Novagen) mediante el cultivo con EcoRI, seguido por tratamiento de Klenow, para crear extremos despuntados, seguido de una digestión parcial con NcoI. Este constructor se designó pET-11d-NS3/3st. El DNA, se transformó en células de E. coli XL-1 Blue, se aisló y se secuenció. El DNA, se transfirió, a continuación, en E. coli BL21(DE3)pLysS, para la producción de proteína.

Ejemplo 2 Mutantes de deleción N-terminales NS2/3

Los mutantes de deleción N-terminales 815*- 1206, 827 - 1206, 855 - 1206, 866 - 1206, 904 - 1206 y 915 - 1206, se derivaron del molde pET-11d/NS2/3, que se diseñó con un sito NcoI en el final 5’ y dentro del dominio de aminoácido 1083. A continuación de la digestión del molde con NcoI, el fragmento del extremo 3’ y el vector, se purificaron en gel. Los mutantes, se obtuvieron mediante PCR, utilizando los cebadores oligonucleótidos sintéticos apropiados, que contenían la secuencia de NS2/3 procedente de nucleótidos que codifican los deseados residuos N-terminales hasta el aminoácido 1083. Los cebadores también introdujeron un sitio NcoI, en el extremo 5’, de tal forma que los insertos resultantes, pudieran ligarse al fragmento purificado mediante gel. La secuencia de DNA, se transformó en células de E. coli XL- Blue, se aisló y se secuenció. Finalmente, el DNA, se transformó en E. coli BL21(DE3)pLysS, para la producción de proteína. La expresión, se verificó mediante SDS-PAGE (figura 2A, 2B y 2C).

* La numeración de este fragmento, es errónea, debido al hecho de que, la primera metionina, es parte de la secuencia original y, por lo tanto, debería numerarse como "814". Así, por lo tanto, toda referencia a la truncación que se inicia con 815, se leyó como "814", tal y como se representa de una forma correcta en la SEQ ID NO. 11.

Ejemplo 3 Mutante de truncación N-terminal NS2/3 4K-6H(904-1206)st-4K (SEQ ID NO. 4)

En este constructor, se añadieron cuatro lisinas en los términos N y C, así como también una hexahistidina tag en el término N. Este constructor, se obtuvo utilizando PCR y el molde PET-11d/NS2/3st, con dos cebadores que contenían las secuencias para los tags, así como también la secuencia procedente de los nucleótidos que codifican a los residuos de aminoácidos 904 - 1206. Los cebadores introdujeron, también, un sito NdeI y BamHI, en los extremos 5’ y 3’, respectivamente. El inserto, se clonó en pET-11 y se designó como pET-11d 4K-6H-NS2/3(904 - 1206)-st-4K (SEQ ID NO. 3). El DNA, se transformó en células E. coli XL-1 Blue, se aisló y se secuenció. El DNA, se transformó, a continuación, en E. coli BL21(DE3)Plys S, para la producción de proteína.

Para el constructor truncado 904 - 1206, se utilizaron 4 cebadores y 2 reacciones sucesivas de PCR. Los cebadores utilizados en la primera reacción, eran:

GCTCGAGCATCACCATCACCATCACACTAGTGCAGGCATAACCAAA (SEQ ID NO.7) para el término N, y

AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO.8) para el término C. Para la segunda reacción por PCR, los cebadores utilizados, fueron

ACCTGCCATATGAAAAAGAAAAAGCTCGAGCATCACCATCACCAT (SEQ ID NO.9) para el término N, y

AACAATGGATCCTTACTTTTTCTTTTTACCACCGAACTGCGGGTG (SEQ ID NO.7) para el término C.

Ejemplo 4 Expresión y producción de enzimas

El genotipo de la proteasa HCV NS2/3, 1b [904 - 1206](figura 3), que tiene una hexahistidina tag N-terminal, se clonó en el vector de expresión pET-11d. Se añadieron, también, cuatro residuos de lisina, en ambos extremos, terminal N y terminal C, para intensificar la solubilidad de la proteína, conjuntamente con una estreptavidina tag en el extremo C-terminal, proporcionando la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO.3. La proteasa, se expresó en E. coli BL21(DE3)pLysS, siguiendo la inducción con IPTG 1 mM, durante un transcurso de tiempo de 3 horas, a una temperatura de 37°C. Una fermentación típica de 4 L, proporcionó aproximadamente 20 g de pasta de células, húmeda. La pasta de células, puede almacenarse a una temperatura de -80°C.

Ejemplo 5 Extracción de cuerpos de extracción

A continuación de un deshielo a una temperatura de 23°C, las células, se homogeneizaron en un tampón de lisis (5 ml/g), consistente en 100 mM Tris, pH 8,0, 0,1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 20 mM MgCl_{2}, 5 mM DTT seguido por un tratamiento de DNasa (20 \mug/ml), durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una temperatura de 4°C, y una centrifugación a 22.000 x g, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 4°C. El gránulo de células, se lavó, a continuación, dos veces, mediante homogeneización (5 ml/g), en 100 mL Tris, pH 8,0, 2% Triton X-100 5 mM EDTA, 2M urea, 5 mM DTT, y se centrifugó a 22.000 x g, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C. Finalmente, las células, se lavaron en 100 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA, 5 mM DTT. La inclusión de cuerpos, se recuperó, en el gránulo, mediante centrifugación a 22.000 x g, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C.

Ejemplo 6 a) Extracción de cuerpos de inclusión

Para solubilizar los cuerpos de inclusión, el gránulo de células, se suspendió en el tampón de extracción (4 ml/g), consistente en 100 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidina-HCl, 0,5 M NaCl, y se mantuvo en este tampón, durante un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 23°C. Se procedió, a continuación, a centrifugar la suspensión, a 125.000 x g, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 4°C. El sobrenadante resultante, se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. El extracto clarificado de cuerpos de inclusión, puede almacenarse a una temperatura de -80°C, hasta que se requiera.

b) Aislamiento de 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k, a partir de cuerpos de inclusión

Con objeto de aislar el 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k (SEQ ID NO. 4), el extracto de cuerpos de inclusión, se diluyó al doble de su valor inicial (a aproximadamente 1 mg/ml), en 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M guanidina-HCl, 0,5 M NaCl, y se aplicó en una columna de quelación Pharmacia Hi-Trap Ni^{2+}. La proteína aislada, se eluyó de una forma típica, con 250 mM imidazol, a partir de un gradiente lineal de 50 a 500 mM imidazol. Se procedió a reunir las fracciones correspondientes al pico mayor.

Ejemplo 7 Replicación y purificación en columna de filtración en gel

Se procedió a añadir, a la preparación de los cuerpos de inclusión aislados, 5 mM TCE y 5 mM ZnCl_{2}. Después de haber seguido una incubación, durante un transcurso de tiempo de 15 minutos, a una temperatura de 23°C, la muestra, se cargó en una columna de filtración en gel, del tipo Pharmacia Superosa 12. Se procedió, a continuación, a eluir el 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k, en Tris 50 mM, pH 8,0, 0,5 M arginina-HCl, 1% LDAO, 5 mM TCEP, proporcionando una proteasa NS2/3 replicada. Solamente aquéllas fracciones que correspondían al pico mayor (figura 4), se colectaron y se reunieron. Bajo estas condiciones, la autosegmentación, fue indetectable. La enzima inactiva purificada, replicada, se almacenó a una temperatura de -80°C, en el tampón de elución. De una forma típica, se obtuvieron aproximadamente 7 mg de proteasa NS2/3 replicada, por litro de cultivo de E. coli.

Con objeto de superar el problema de la autosegmentación de la proteasa NS2/3, las condiciones de replicación, se determinaron inicialmente, utilizando bien ya sea el mutante His95Ala (SEQ ID NO. 16) o bien ya sea el mutante \DeltaLeu1026 - Ala1027 (SEQ ID NO. 17) ó del 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k. Ambos de estos mutantes, se encuentran desprovistos de actividad autocatalítica. La replicación, se valoró de una forma indirecta, en base a la actividad de la proteasa NS3 (figura 4), mediante la incubación de diluciones en serie de la enzima replicada con 5 \muM del substrato fluorogénico extinguido, antranilil-DDIVPAbu[C(O)-O]AMY(3-NO_{2})TW-OH (SEQ IF NO. 19) en 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 30% glicerol, 1 mg/ml BSA y 1 mM TCEP, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos o de 60 minutos, a una temperatura de 23°C (específicamente descrito en el documento de patente internacional WO 99 / 07 733, incorporado aquí, en este documento, a título de referencia). La actividad proteolítica, se controló mediante el cambio de la fluorescencia, asociado con la segmentación del substrato y la apariencia del producto fluorescente antranilil-DDIVPAbu-COOH (SEQ IF NO. 20), en un lector de placa de 96 hoyos BMG Galaxy (filtro de excitación: 355 nm; filtro de emisión: 485 nm).

A continuación, se produjo 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k, se purificó y se replicó en concordancia con el mismo protocolo, dando como resultado una enzima > 95% pura. La replicación propia, se confirmó mediante la actividad proteasa (figura 4, línea de puntos).

Ejemplo 8 Validación de la actividad, después de la replicación Ensayo de cis-segmentación

La reacción de autosegmentación del 4k-6H-NS2/3 (904-1206)st-4k, se inició mediante la adición, a la enzima, del tampón de segmentación consistente en Hepes 50 mM, pH 7,0, 50% (peso / volumen) glicerol, 0,1% CHAPS (figura 6) ó 1% n-dodecil-\beta-D-maltósido (figuras 7, 8) (pueden también utilizarse los NP-40 y Triton X-100) y 1 mM TCEP. Esta mezcla de muestras de ensayos, se incubaron, a continuación, durante un transcurso de tiempo de 3 horas, a una temperatura de 23°C. La reacción, se paró mediante desnaturalización por calor, de la enzima, en presencia de SDS. La segmentación, en la junción NS2/3, se controló mediante SDS-PAGE (15%), y análisis de inmunoblot (inmunotransferencia), utilizando, o bien ya sea un anticuerpo policlonal de proteasa NS3 producido en casa, o un anticuerpo policlonal de hexahistidina tag, comercialmente obtenible en el mercado (Santa Cruz Biotechnology, Inc) (figura 5).

Ejemplo 9 Ensayo heterogéneo de fluorescencia resuelta con el tiempo

Se procede, en primer lugar, a inmovilizar la proteasa NS2/3, sobre una placa quelante de níquel (figura 10). A continuación, se añade un anticuerpo anti-NS2 ó anti-FLAG_{tag}, marcado con europium. Una persona experta en el arte especializado de la técnica, reconocerá el hecho de que, para marcar proteínas, se encuentran disponibles muchos tags. En este ejemplo, se utilizan FLAG® y HMK. A continuación del enlace del anticuerpo, se procede a realizar una etapa de lavado, con objeto de eliminar el exceso de lavado. A continuación, se inicia la reacción de autosegmentación, mediante la adición del tampón de segmentación. Después del apropiado tiempo de incubación, la mezcla de muestras de ensayos, se transfirieron a una segunda placa y, la autosegmentación, se controló, mediante la medición de fluorescencia resuelta con el tiempo, asociada con el producto marcado con europium. La segmentación de la proteasa NS2/3, puede también controlarse mediante el decrecimiento de la señal de fluorescencia del europium, resuelta con el tiempo, resultante de la enzima no procesada, unida a la placa de quelación, de níquel.

De una forma alternativa, se procede a incubar una proteasa NS2/3 que contiene Strep-tag®, en el tampón de activación, y se deja que procesa la reacción de autosegmentación (figura 14). El fragmento Strep-tag NS3 resultante, y la proteasa N32/3 Strep-tag, no segmentada, se inmoviliza, a continuación, en una placa recubierta con streptavidina. Se procede, a continuación, a añadir un anticuerpo anti-NS2 marcado con europium, y se mida la fluorescencia resuelta con el tiempo, con el anticuerpo marcado con europium, unido.

Protocolo del ensayo 1.- Reacción de autosegmentación

En una placa de polipropileno, de 96 hoyos, se procede a añadir, secuencialmente: 1) 20 \mul de tampón de ensayo (50 mM Hepes, pH 7,5, 30% glicerol, 1 mM TCEP), con la presencia, o sin la presencia, de un compuesto de ensayo (inhibidor potencial), y ii) 10 \mul de proteasa NS2/3 (a una concentración final de 200 nM), de la forma que se ha purificado según el ejemplo 7. La reacción de autosegmentación, se inicia mediante la adición de 20 \mul del tampón de activación (50 mM Hepes, pH 7,5, 30% glicerol, 0,5% n-dodecil-\beta-D-maltósido, 1mM TCEP) y se deja que proceda, durante un transcurso de tiempo de 1,5 horas, a una temperatura de 30°C.

2.- Enlace a placa de estreptovidina

En una placa recubierta con estreptavidina, blanca, de 96 hoyos, (Pierce), se procede a diluir la mezcla de reacción de autosegmentación, a un valor de 5 veces, en el tampón de ensayo (50 mM Hepes, pH 7,5; 30% glicerol, 1 mM TCE). A continuación de una incubación de un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 23°C, la placa, se lava con PBS, 0,05% Tween-20, 2M guanidina-HCl.

3.- Enlace de anti-NS2 marcado con Eu^{+3}

A la placa^{1} recubierta con estreptavidina, blanca, de 96 hoyos, se le añade, a continuación, el anti-NS2 marcado con Eu^{+3}, a una concentración final de 35 nM, en PBS, 0,05% Tween 20, 0,3% BSA, 1 \muM biotina, 100 \mum DTPA. A continuación de una incubación de un transcurso de tiempo de 1 hora, a una temperatura de 23°C, la placa, se lava con el tampón de lavado DELFIA (Perkin Elmer Wallac). Finalmente, se procede a añadir la solución de intensificación (Perkin Elmer Wallac), y se mide la fluorescencia resuelta con el tiempo, en un contador multi-marcador, del tipo Wallac 1420 VICTOR^{2} multi-label.

^{1}NOTA: pueden también utilizarse las placas de Neutravidina

Ejemplo 10 Ensayo de fluorescencia homogénea resuelta con el tiempo

Se procede a marcar la proteasa NS2/3 con un quelato de europium fluorescente, en un extremo, y con un extintor de fluorescencia de europium en el otro extremo (figura 11). Así, por ejemplo, se utiliza un anticuerpo anti-NS2 ó anti-FLAG_{tag}, como porción fluorescente, mientras que, el extintor de la fluorescencia de europium, o bien se enlaza de una forma covalente a la enzima, o bien se enlaza a un potente inhibidor de proteasa NS3. La reacción enzimática, se inicia mediante la adición del tampón de segmentación. Después de la autosegmentación, el quelato de europium y el extintor, se separan, dando como resultado un incremento en señal de fluorescencia resuelta con el tiempo, a través del tiempo.

Ejemplo 11 Ensayo de polarización fluorescente

Se procede a añadir una sonda fluorescente, tal como un potente inhibidor de proteasa NS3, marcado con una porción fluorescente, a una solución que contiene proteasa NS2/3 (figura 12). La reacción de autosegmentación, se inicia mediante la adición del tampón de segmentación. El cambio, en la polarización fluorescente de la sonda, después de la autosegmentación, se controla a través del tiempo. De una forma alternativa, puede también utilizarse una proteasa NS2/3 inmovilizada, sobre una placa de quelación, de níquel. A continuación de la incubación de la enzima con la sonda fluorescente, la reacción de autosegmentación, se inicia, mediante la adición del tampón de autosegmentación. Después del apropiado tiempo de incubación, se controla la segmentación, procediendo a medir el cambio en la polarización de fluorescencia de la sonda.

Ejemplo 12 Ensayo radiométrico

Se procede, en primer lugar, a inmovilizar la proteasa NS2/3, sobre una placa quelante, de níquel (figura 13). A continuación, se fosforiliza la HMK_{tag}, utilizando la proteína-kinasa A, y un substrato automarcado. Después de haberse completado la reacción de fosforilación, se procede a lavar la placa y se inicia la reacción de autosegmentación, mediante la adición del tampón de segmentación. Después del apropiado tiempo de reacción, se cuantifica, bien ya sea mediante la medición de la cantidad de producto radiomarcado liberado en la solución de ensayo, o bien ya sea de la cantidad de proteasa NS2/3 radiomarcada, no procesada. De una forma alternativa, la reacción de fosforilación, puede realizarse en primer lugar, seguido de la inmovilización sobre la placa quelante, de níquel.

Ejemplo 13 Inhibición de la proteasa NS2/3

Se procedió a evaluar los péptidos derivados de sitios de segmentación de proteasa NS2/3, como substratos potencialmente competentes (Tabla I). Se procedió a sintetizar, en casa, péptidos derivados de sitios de segmentación de proteasa NS2/3 y péptidos derivados de NS4A, utilizando la metodología standard de fase sólida, o se realizaron mediante sistemas del tipo Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). Se procedió a incubar varias concentraciones de péptidos, con 0,54 \muM proteasa NS2/3, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos, a una temperatura de 23°C, en 50 mM Hepes, pH 7,0, y 50% (peso / volumen) glicerol. La reacción de autosegmentación, se inició mediante la adición de n-dodecil-\beta-D-maltósido, a una concentración final del 0,5%. El contenido final de DMSO, nunca excedió de un 5% (volumen / volumen). La mezcla resultante, se incubó, a continuación, durante un transcurso de tiempo de 3 horas, a una temperatura de 23°C. Se paró la reacción, y se cuantificó. Ninguno de los péptidos derivados de sitios de segmentación de proteasa NS2/3, se segmentó en trans (datos no mostrados). Los residuos de péptidos en extensión, P10 - P10’, de la junción NS3/3 (péptido 1), inhibían la autosegmentación con un IC_{50} de 270 \muM, mientras que, los residuos en expansión del substrato péptido, P6 - P6’ (péptido 4), eran menos potentes, con un IC_{50} de 630 \muM. Entre los correspondientes productos de sitios de segmentación, el más activo, era el péptido SFEGQGWRLL (IC_{50} = 90 \muM, SEQ ID NO. 21), el producto N-terminal del péptido 1.

TABLA I Inhibición de la autosegmentacion de NS2/3, mediante péptidos^{a}

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}   \begin{minipage}[t]{145mm}Los péptidos, se prepararon
como una solución de abastecimiento, 20 mM, en DMSO. El contenido
final de DMS),  nunca excedió de un 5% (volumen /
volumen).\end{minipage} \cr   ^{b}  El ensayo, se realizó en
presencia de proteasa 0,54  \mu M NS2/3.\cr   ^{c}  El guión, indica
el sitio de segmentación entre los residuos P1 y
P1’.\cr}

Discusión

Hasta hoy en día, la producción de NS2 nativa, sola, o unida a NS3, ha sido impedida, debida a su naturaleza hidrofóbica, habiéndose logrado únicamente un reducido nivel de expresión. Un estudio de truncación de terminal N, ha permitido el proceder a la identificación de la proteasa NS2/3 (904 - 1206) (figura 3). Esta truncación, se expresó a altos niveles en E. coli, en la inducción de IPTG (figuras 2B y 2C, banda 904) y era activa, según se muestra mediante la presencia del producto de segmentación de la proteasa NS3 (figuras 2A y 2C, banda 904). No obstante, la proteasa NS2/3 [904 - 1206], se recuperó únicamente en la fracción insoluble, como cuerpos de inclusión. La utilización de compañeros solubles de fusión, tales como la proteína de enlace de la maltosa y la tioredoxina, no tuvo éxito en cuanto a incrementar la solubilidad de la proteasa, en la expresión (datos no mostrados).

El mantenimiento de una baja concentración de agente caotrópico o aditivo polar, tal como la correspondiente a 0,5 M arginina-HCl, era importante para mantener la 4K-6H-NS2/3 (904 - 1206)st-4K (figura 9B, SEQ ID NO. 4) en solución, durante el proceso de replicación. La arginina-HCl, es un aditivo polar, el cual desestabiliza ligeramente a las proteínas, de una forma comparable a la reducida concentración de caotropos. Se trabaja con la hipótesis en cuanto al hecho de que, la arginina-HCl, puede incrementar la solubilización de intermediarios de replicación (Lin, T. - Y et al. (1996) Protein Sci. 5:372 - 381).

Se requirió también un detergente, para replicar (amplificar), para reducir y / o suspender la agregación, después de la sustitución del tampón desnaturalizante, mediante el tampón de replicación. Se procedió a evaluar los detergentes LDAO, n-dodecil-\beta-D-maltósido y octil-POE, en cuanto a su capacidad para fomentar la replicación de 4K-6H-NS/2/3 (904 - 1206)st-4K, a una concentración igual o mayor que la correspondiente a su respectivo valor CMC de 0,03%, 0,01% y 0,025% (en agua). No fue detectable ninguna replicación, en presencia de octil-POE. Se encontró que, la LDAO y el n-dodecil-\beta-D-maltósido, inducían la activación de 4K-6H-NS2/3 (904 - 1206)st-4K. Se seleccionó la LDAO, puesto que, de una forma inesperada, ésta permitía la replicación (amplificación) y reconstitución de la actividad proteasa NS3, sin fomentar la autosegmentación. Finalmente, los inventores, han encontrado que, la presencia de un agente reductor, es decir, bien ya sea el DTT ó bien ya sea el TCEP, era necesaria, para replicar la enzima.

Se procedió a evaluar varios detergentes de segmentación / activación, en cuanto a su capacidad para fomentar la autosegmentación de 4K-6H-NS2/3 (904 - 1206)st-4K. Se observó un autoprocesado, después de la adición de CHAPS en el tampón de ensayo, procedente del ejemplo 7 (figura 6, bandas 2 - 5). Se observó también un autoprocesado similar, con el n-dodecil-\beta-D-maltósido, NP-40 y Triton X-100, si bien, 0,5% y 1% n-dodecil-\beta-D-maltósido, aparecieron como siendo superiores. Se observó no obstante un reducido procesado, en presencia de octil-POE, mientras que casi no se observó ninguno, con LDAO (datos no mostrados). Adicionalmente a los detergentes de segmentación / activación, se encontró también que, el glicerol, fomentaba la autosegmentación (figura 6, banda 1). De una forma interesante, se observaron reducidos niveles de segmentación, con 0% glicerol, mientras que se observaba una segmentación substancialmente intensificada, cuando se añadían ambos, el glicerol y el detergente de segmentación / activación, al tampón de ensayo (figura 6, banda 6).

La LDAO, la cual se utilizó durante la replicación (amplificación), inhibía el autoprocesado de tal forma que, la reacción de autosegmentación, sólo pudo iniciarse mediante la dilución de la enzima en el apropiado tampón de segmentación / activación, y dilución de la LDAO, a una concentración por debajo de un valor de aproximadamente un 0,25%.

La actividad proteasa NS2/3, se confirmó mediante análisis de SDS-PAGE y de inmunoblot (inmunotransferencia) (figura 7) y mediante la ausencia de productos de segmentación para el correspondiente mutante His952Ala (figura 8). Además, no se observó ningún cambio en la actividad, en presencia de potentes inhibidores de proteasa NS3 (datos no mostrados). Finalmente, la secuenciación N-terminal de ambos productos de cis-segmentación, confirmó el hecho de que acontecía autosegmentación, entre los residuos Leu1026 y Ala1027.

Se procedió a evaluar los substratos de péptidos de sitios de segmentación P10 - P10’ y P6 - P6’, como substratos potencialmente competentes. En un sistema de ensayo bien definido, mediante la utilización de NS2/3 purificada (904 -
1206) y un tampón de segmentación optimizado (que contenía un 50% de glicerol y un 0,5% de n-dodecil-\beta-D-maltósido), los péptidos P10 y P10’ y P6 - P6’, inhibían NS2/3, procesando con IC_{50}’s de 270 y 630 \muM, respectivamente; no obstante, bajo unas condiciones de ensayo idénticas, no se observó ninguna trans-segmentación de los péptidos (datos no mostrados). Los resultados, sugieren un enlace no productivo del substrato de péptido en el sitio activo. De una forma notable, el péptido de producto de segmentación N-terminal más corto, era el mejor inhibidor con una IC_{50} de 90 \muM, mientras que, el correspondiente producto C-terminal, se encontraba desprovisto de actividad inhibitoria.

<110> Boheringer Ingelheim (Canadá) Ltd.

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<120> Proteasa HCV NS2/3 activa, purificada

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<130> 13/082pct

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<150> 60/256,031

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<151> 2000-12-15

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<160> 21

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<170> SEQ rápida para windows, versión 4.0

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<210> 1

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<211> 1230

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<212> DNA

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<213> HCV

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1230)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

2

3

4

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 409

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<212> PRT

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<213> HCV

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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5

50

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<210> 3

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<211> 1011

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<212> DNA

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<213> HCV

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(1005)

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<400> 3

6

7

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<210> 4

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<211> 334

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<212> PRT

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<213> HCV

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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8

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatggaccg ggagatggct

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> HCV

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctcgagcat caccatcacc atcacactag tgcaggcata accaaa

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacaatggat ccttactttt tctttttacc accgaactgc gggtg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 45

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<212> DNA

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<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctgccata tgaaaaagaa aaagctcgag catcaccatc accat

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> HCV

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Asp marcado con antranililo

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en la posición 6 es Abu

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<221> VARIANTE

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<222> (6)...(7)

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<223> Abu-A entre la 6 y 7, es C(O)-O

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\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (9)...(9)

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<223> Tyr en la posición 9, se deriva con 3-NO2

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<400> 19

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\sa{Asp Asp Ile Val Pro Xaa Ala Met Tyr Thr Trp}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

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<212> PRT

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<213> HCV

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Asp marcado con antranililo

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<221> VARIANTE

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<222> (6)...(6)

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<223> Xaa en la posición 6 es Abu

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<400> 20

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\sa{Asp Asp Ile Val Pro Xaa}

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<210> 21

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> CHV

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<400> 21

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\sa{Ser Phe Glu Gly Gln Gly Trp Arg Leu Leu}

Claims

1. Un procedimiento para producir una proteasa HCV NS2/3 inactiva, replicada (amplificada), que comprende las etapas de:

a) aislar la proteasa, en presencia de un agente caotrópico;

2. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada LDAO, se encuentra una concentración final por encima de la concentración crítica de micelas.

3. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada LDAO, se encuentra una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 0,003% y un 1%.

4. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada LDAO, se encuentra una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 0,03% y un 1%.

5. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada LDAO, se encuentra una concentración final de un 1%.

6. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, en la etapa a), el citado agente caotrópico, se selecciona de entre el grupo consistente en guanidina-HCl, guanidina y urea.

7. El procedimiento, según la reivindicación 6, en donde, el citado agente caotrópico, se encuentra a una alta concentración, entre 5 M y 6 M.

8. El procedimiento, según la reivindicación 7, en donde, el citado agente caotrópico, es guanidina o guanidina-HCl, a una concentración final de 6 M, o urea, a una concentración final de 8 M.

9. El procedimiento, según la reivindicación 8, en donde, el citado agente caotrópico, es 6 M ganidina-CHl.

10. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, en la etapa b), el citado agente caotrópico o aditivo polar, se selecciona de entre el grupo consistente en guanidina, guanidina-HCl, urea y arginina-HCl.

11. El procedimiento, según la reivindicación 10, en donde se utiliza guanidina-HCl ó arginina-HCl.

12. El procedimiento, según la reivindicación 11, en donde se utiliza arginina-HCl.

13. El procedimiento, según la reivindicación 12, en donde, la citada arginina-HCl, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,25 M y 2 M.

14. El procedimiento, según la reivindicación 13, en donde, la citada arginina-HCl, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre 0,5 M y 1 M.

15. El procedimiento, según la reivindicación 14, en donde, la citada arginina-HCl, se encuentra a una concentración final de 0,5 M.

16. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, el agente de reducción, se selecciona de entre el grupo consistente en TCEP y DTT.

17. El procedimiento, según la reivindicación 16, en donde, el citado agente, es TCEP, a una concentración final de 5 mM.

18. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada proteasa, se aísla a partir de cuerpos de inclusión.

19. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada replicación (amplificación), se lleva a cabo mediante diálisis o mediante filtración en gel, para proporcionar una proteasa NS 2/3 purificada.

20. El procedimiento, según la reivindicación 19, en donde, la citada replicación (amplificación), se lleva a cabo mediante filtración en gel.

21. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada proteasa NS2/3, es la proteasa NS2/3 de longitud total, o una truncación de ésta, que tiene, como su residuo N-terminal, cualquier aminoácido desde el aminoácido 810 al aminoácido 906.

22. El procedimiento, según la reivindicación 1, en donde, la citada proteasa NS2/3, tiene la secuencia mínima de aminoácidos 904 a 1206, de la proteasa HCV 1b-40 NS2/3 de longitud total.

23. El procedimiento, según la reivindicación 22, en donde, la citada proteasa NS2/3, consiste en una proteasa NS2/3 truncada, tal y como se define según la SEQ ID. NO. 10.

24. Un procedimiento para producir una proteasa NS2/3 activa, que comprende:

c) diluir la citada proteasa NS2/3 inactiva, replicada (amplificada) , según se define en la reivindicación 1, en un medio que comprende un detergente de activación, para inducir autosegmentacion de la citada proteasa NS2/3.

25. El procedimiento, según la reivindicación 24, en donde, la citada LDAO, se diluye a una concentración final igual o inferior a un 0,1%.

26. El procedimiento, según la reivindicación 24, en donde, en la etapa c), se añade adicionalmente glicerol.

27. El procedimiento, según la reivindicación 26, en donde, el citado glicerol, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 10% y un 50%.

28. El procedimiento, según la reivindicación 24, en donde, el detergente de activación, se selecciona de entre el grupo consistente en: CHAPS, Triton X - 100, NP 40 y n-dodecil-\beta-D-maltósido.

29. El procedimiento, según la reivindicación 24, en donde, el citado detergente de activación, se encuentra a una concentración final comprendida dentro de unos márgenes situados entre un 0,1% y un 1%.

30. El procedimiento, según la reivindicación 29, en donde, el detergente de activación, es CHAPS.

31. El procedimiento, según la reivindicación 29, en donde, el citado detergente de activación, es n-dodecil-\beta-D-maltósido.

32. Una composición que comprende una proteasa HCV NS2/3 aislada, seleccionada de entre la proteasa NS2/3 de longitud total, una truncación de ésta, a una secuencia según se define en concordancia con al SEQ ID. NO. 2, 4, 10, 11, 12, 13 y 14, en donde, la citada proteasa, se encuentra en solución, comprendiendo una suficiente concentración de LDAO, para evitar la autosegmentación de la citada proteasa.