DE69509504T2

DE69509504T2 - Verfahrenm zum in vitro herstellung der proteolytischen wirkung von ns3 hepatitis c virus (hcv)

Info

Publication number: DE69509504T2
Application number: DE69509504T
Authority: DE
Inventors: Raffaele De Francesco; Cristina Failla; Licia Tomei
Original assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Current assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date: 1994-02-23
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 1999-09-02
Anticipated expiration: 2015-02-15
Also published as: DE69509504D1; GR3030166T3; RU2149185C1; ITRM940092A1; US5739002A; HK1010988A1; EP0746333A1; CA2182521A1; ATE179611T1; IT1272179B; JPH10500005A; JP3280384B2; ES2132644T3; ITRM940092A0; WO1995022985A1; DK0746333T3; AU691259B2; BR9506931A; EP0746333B1; AU1822395A

Description

Die vorliegende Erfindung hat ein Verfahren zum Rekonstituieren der Serinproteaseaktivität zum Thema, die mit dem HCV NS3 Protein assoziiert ist, welches von der Fähigkeit des HCV Proteins NS4A oder darin enthaltenen Sequenzen Gebrauch macht, als ein Cofaktor der Serinproteaseaktivität zu wirken oder allgemeiner gesprochen von enzymatischen Aktivitäten, die mit NS3 assoziiert sind.
Wie bekannt ist, ist das Hepatitis C Virus (HCV) der ätiologische Haupterreger von nicht-A, nicht-B Hepatitis (NANB). Es wird geschätzt, daß HCV mindestens 90% der posttransfusionalen NANB viralen Hepatitis und 50% der sporadischen NANB Hepatitis verursacht. Obwohl große Fortschritte in der Auswahl der Blutspender und in der immunologischen Charakterisierung des für Transfusionen benutzten Blutes gemacht worden sind, gibt es immer noch eine große Zahl an akuten HCV-Infektionen unter denen, die Bluttransfusionen erhalten (1 Million oder mehr Infektionen pro Jahr auf der gesamten Erde). Ungefähr 50% der HCV-infizierten Individuen entwickeln Zirrhose der Leber innerhalb einer Zeitspanne, die von 5 bis 40 Jahren reichen kann. Weiterhin deuten kürzliche klinische Studien an, daß es eine Korrelation zwischen chronischer HCV-Infektion und der Entwicklung von hepatozellulärem Karzinom gibt.
HCV ist ein komplexes Virus, daß ein RNA positives Genom von ungefähr 9,4 Kb enthält. Dieses Virus ist ein Mitglied der Flaviviridae Familie, deren andere Mitglieder die Flaviviren und die Pestiviren sind. Das RNA Genom von HCV ist kürzlich kartiert worden. Sequenzvergleiche von den HCV-Genomen, die in verschiedenen Teilen der Erde isoliert wurden, hat gezeigt, daß diese Sequenzen extrem heterogen sein können. Der Großteil des HCV-Genoms wird von einem offenen Laserraster (ORL) in Anspruch genommen, daß zwischen 9030 und 9099 Nukleotiden variieren kann. Dieses ORL kodiert für ein einzelnes virales Polyprotein, dessen Länge zwischen 3010 und 3033 Aminosäuren variieren kann. Während des viralen Infektionszyklus wird das Polyprotein proteolytisch in die individuellen Genprodukte prozessiert, die für die Replikation des Virus notwendig sind. Die Gene, die für HCV Strukturproteine kodieren, sind an dem 5'- Ende des ORL lokalisiert, wobei die Region, die für Nicht-Strukturproteine kodiert, den Rest des ORL's in Anspruch nimmt.
Die Strukturproteine bestehen aus C (Kern, 21 kDa), E1 (Hülle gp37) und E2 (NS1, gp61). C ist ein nichtglykosyliertes Protein von 21 kDa, welches wahrscheinlich das virale Nucleocapsid bildet. Das Protein E1 ist ein Glycoprotein von ungefähr 37 kDa und es wird angenommen, das es ein Strukturprotein für die äußere virale Hülle (engl. envelope) ist. E2, ein anderes Membran Glycoprotein von 61 kDa, ist wahrscheinlich ein zweites Strukturprotein in der äußeren Hülle des Virus.
Die nichtstrukturelle Region beginnt mit NS2 (p24), einem hydrophoben Protein von 24 kDa, dessen Funktion unbekannt ist. Es wird vorhergesagt, daß NS3, ein Protein von 68 kDa, welches in dem Polyprotein auf NS2 folgt, zwei funktionelle Domänen hat: Eine Serinproteasedomäne in den ersten 200 aminoterminalen Aminosäuren und eine RNA- abhängige ATPase-Domäne an dem Carboxyterminus. Die Genregion, die NS4 entspricht kodiert für NS4A (p6) und NS4B (p26), zwei hydrophobe Proteine von jeweils 6 und 26 kDa, deren Funktionen noch nicht geklärt worden sind. Das Gen, das NS5 entspricht, kodiert ebenfalls für zwei Proteine, NS5A (p56) und NS5B (p65), von jeweils 56 und 65 kDa. Eine Aminosäuresequenz, die in allen RNA-abhängigen RNA- Polymerasen vorhanden ist, kann innerhalb der NS5 Region wiedererkannt werden. Dieses deutet an, daß die NS5 Region Teile der viralen Replikationsmaschinerie enthält.
Verschiedene molekularbiologische Studien zeigen an, daß die Signalpeptidase, eine Protease, die mit dem endoplasmatischen Retikulum der Wirtszelle assoziiert ist, für proteolytisches Prozessieren in der nicht-strukturellen Region verantwortlich ist, das bedeutet an den Stellen C/E1, E1/E2 und E2/NS2. Die in NS3 enthaltene Serinprotease ist für die Spaltung an den Kontaktstelle (engl. junctions) zwischen NS3 und NS4A, zwischen NS4A und NS4B, zwischen NS4B und NS5A und zwischen NS5A und NS5B verantwortlich. Vor allem hat sich herausgestellt, daß die von dieser Serinprotease durchgeführte Spaltung einen Cystein- oder Threoninrest an der aminoterminalen Seite (Position P1) und einen Alanin- oder Serinrest an der carboxyterminalen Seite (Position P1') der gespaltenen Bindung zurückläßt. Eine zweite Proteaseaktivität von HCV scheint für die Spaltung zwischen NS2 und NS3 verantwortlich zu sein. Diese Proteaseaktivität ist in einer Region enthalten, die beide Teile von NS2 und den Teil von NS3 umfaßt, der die Serinproteasedomäne enthält, jedoch nicht denselben katalytischen Mechanismus benutzt.
Im Licht der obigen Beschreibung wird von der NS3 Protease angenommen ein potentielles Ziel für die Entwicklung von Anti-HCV therapeutischen Mitteln zu sein. Die Suche nach solchen Mitteln wurde jedoch durch den Beweis erschwert, daß die Serinproteaseaktivität, die von NS3 in vitro gezeigt wird, zu gering ist, um Durchmustern (engl. screening) von Inhibitoren zu erlauben.
Es wurde unerwarteter Weise festgestellt, daß diese wichtige Limitierung umgangen werden kann, durch Annahme des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, welches ebenfalls weitere Vorteile bietet, die aus dem folgenden offensichtlich werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zum Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der Protease NS3 von HCV in vitro charakterisiert durch Benutzen beider Sequenzen in der Reaktionsmischung, die in NS3 enthalten sind und Sequenzen, die in NS4 enthalten sind.
Optimale Serinproteaseaktivität wird erhalten, wenn NS4A in einem Verhältnis von 1 : 1 mit NS3 vorhanden ist.
NS3 und NS4A können ebenfalls in die Reaktionsmischung als NS3-NS4A Vorläufer inkorporiert werden, da dieser Vorläufer durch ein autoproteolytisches Ereignis äquimolare Mengen an NS3 und NS4A erzeugen wird.
Es ist ebenfalls möglich, die Stelle der Spaltung zwischen NS3 und NS4A in einem Vorläufer zu mutieren, so daß NS4A kovalent an NS3 gebunden bleibt. Die Sequenzen, die die proteolytische Aktivität von NS3 nicht beeinflussen, können anschließend von diesem nicht proteolytisch spaltbaren Vorläufer entfernt werden.
Die Erfindung erstreckt sich ebenfalls auf eine neue Zusammensetzung an Stoffen (engl. matter), die dadurch charakterisiert ist, daß sie Proteine umfaßt, deren Sequenzen in SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 beschrieben sind oder Sequenzen, die darin enthalten sind oder davon abgeleitet sind. Es heißt, daß diese Sequenzen in verschiedenen HCV-Isolaten variieren können, da alle die RNA-Viren einen hohen Grad an Variabilität zeigen. Diese neue Zusammensetzung an Stoffen hat die proteolytische Aktivität, die notwendig ist, um proteolytische Reifung von mehreren der nicht strukturellen HCV-Proteine zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls den Gebrauch dieser Zusammensetzungen an Stoffen zum Thema, um einen enzymatischen Test herzustellen, der in der Lage ist für therapeutische Zwecke Verbindungen zu identifizieren, die die enzymatische Aktivität, welche mit NS3 assoziiert ist, inhibieren, einschließlich Inhibitoren der Interaktion zwischen NS3 und NS4A.
Bis zu diesem Punkt wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nun eine detailliertere Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen davon gegeben, um ein klareres Verständnis ihrer Ziele, Charakteristika, Vorteile und Verfahrensweise zu geben.
Die Abbildung illustriert Plasmidvektoren, die in dem Verfahren benutzt wurden, um HCV NS3 Protease in kultivierten Zellen und in vitro zu aktivieren (Beispiel 1 und Beispiel 2).

Beispiel 1

Verfahren zum Aktivieren von HCV NS3 Serinprotease in kultivierten Zellen

Es wurden Plasmidvektoren zur Expression von NS3, NS4A und anderen nicht strukturellen HCV Proteinen in HeLa Zellen konstruiert. Die konstruierten Plasmide sind schematisch in Fig. 1 illustriert. Ausgewählte Fragmente der cDNA, die den Genom des HCV BK Isolates entsprechen (HCV-BK), wurden unterhalb des Promotors des Bakteriophagen T7 in den Plasmidvektor pCite-1R (Novagen) kloniert. Dieser Expressionsvektor enthält die interne Ribosomeneintrittsstelle des Encephalomyocarditis Virus, um selbst in der Abwesenheit einer CAP-Struktur eine effektive Translation der vom T7 Promotor transkribierten Boten-RNA zu garantieren.
Die verschiedenen Fragmente der HCV-BK cDNA wurden in das Plasmid pCite-1R unter Verwendung von in der molekularbiologischen Praxis bekannten Verfahren kloniert. pCite (NS3) enthält den Teil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 3351 und 5175 (Aminosäuren 1007-1615 des Polyproteins) enthalten sind. pCite (NS4B/5A) enthält den Anteil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 5652 und 7467 (Aminosäuren 1774-2380) enthalten ist. pCite (NS3/4A) enthält den Anteil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 3711 und 5465 (Aminosäuren 991 und 1711) enthalten ist. pCite (NS4A) enthält den Anteil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 5281 und 5465 (Aminosäuren 1649-1711) enthalten ist. pCite (NS5AB) enthält den Anteil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 6224 und 9400 (Aminosäuren 1965-3010) enthalten ist. Die oben angegebene Numerierung stimmt mit den Sequenzen für das Genom und das Polyprotein überein, die in Takamizawa et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers, (1991), J. Virol. 65, 1105-1113 für HCV-BK angegeben sind.
Um effiziente Expressionen der verschiedenen Teile des HCV Polyproteins zu erhalten, wurden HeLa Zellen mit vTF7-3, einem rekombinanten Vaccinia Virus infiziert, welcher Synthese der RNA Polymerase des Bakteriophagen T7 in dem Cytoplasma von infizierten Zellen erlaubt. Diese Zellen wurden dann nach Infektion mit Plasmidvektoren transfiziert, die unter den in der Figur beschriebenen ausgewählt wurden. Die HeLa Zellen, die so infiziert und transfiziert wurden, wurden dann metabolisch mit [³&sup5;S] Methionin markiert und die rekombinanten Proteine, die von den verschiedenen Plasmiden kodiert wurden, konnten durch Immunpräzipitation mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, die NS3, NS4 oder NS5A erkennen, immunpräzipitiert. Das in dem vorliegenden Beispiel beschriebene Verfahren zur Analyse von rekombinanten HCV Proteinen wurde bereits von L. Tomei et al. "NS3 is a serine protease required for processing of hepatits C virus polyprotein", J. Virol (1993) 67, 1017-1026 und in der darin erwähnten Bibliographie beschrieben.
Durch Transfektion des Plasmids pCite (NS3) in die HeLa Zellen, die mit vTF7-3 infiziert waren, ist es möglich, die Synthese eines Proteins zu beobachten, das die katalytische Domäne der HCV NS3 Protease enthält. pCite (NS4B5A) kodiert für einen Teil des HCV Polyproteins, welches eine Peptidbindung an der Kontaktstelle zwischen NS4B und NS5B enthält, von der angenommen werden könnte, daß sie von der Serinproteaseaktivität, die mit NS3 assoziiert ist, hydrolysiert wird. Wenn jedoch pCiteNS3 mit pCiteNS4B5A cotransfiziert wird, gibt es keinen Anhaltspunkt für proteolytische Spaltung. Umgekehrt kann die proteolytische Spaltung des Vorläufers, der von pCite (NS4B5A) kodiert wird, normal stattfinden, wenn die NS3 Serinproteasedomäne in Kombination mit NS4A exprimiert wird. Coexpressionen der NS3 Serinproteasedomäne und 4A kann zum Beispiel erzielt werden durch Transfektion mit äquimolaren Mengen der Plasmide pCite (NS3) und pCite (NS4A), durch Transfektion eines Plasmids, das für einen Vorläufer kodiert, der beide NS3 und NS4A [pCite(NS34A)] enthält oder durch Transfektion eines Derivates des letztgenannten Plasmids, in welchem alle Sequenzen, die für die Proteolyse nicht relevant sind, deletiert wurden [pCite(NS34A)] oder durch Transfektion eines Derivates des letztgenannten Plasmids, in dem alle Sequenzen, die nicht für Proteolyse relevant sind, deletiert wurden [pCite(NS3Δint1237-1635)]. Transient in HeLa Zellen exprimiertes NS4A kann so die proteolytische Aktivität, die mit NS3 assoziiert ist, aktivieren, welcher ansonsten nicht gesehen würde.

Beispiel 2

Verfahren zum Aktivieren der HCV Serin NS3 Protease in einem in vitro Translationstest

Die in Fig. 1 beschriebenen Plasmide können ebenfalls für in vitro Synthese von mRNA benutzt werden, die für die jeweiligen HCV Proteine unter Verwendung des gereinigten Polymeraseenzyms des Phagen T7 (Promega) kodiert.
Im allgemeinen wurden Plasmide, die von pCite-1R abstammen, unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme linearisiert und unter Verwendung des vom Hersteller (Promega) zur Verfügung gestellten Protokolls transkribiert. Diese synthetische mRNA konnte später benutzt werden, um die korrespondierenden Proteine in Extrakten von Kaninchenretikulozyten in der Anwesenheit von Mikrosomenmembranen aus Hundepankreas zu synthetisieren. Die Retikulozytenextrakte, die Mikrosomenmembranen aus Hundepankreas, ebenso wie alle weiteren benötigten Materialien wurden von Promega bezogen, welche ebenfalls die Instruktionen für das oben beschriebene in vitro Proteinsyntheseverfahren zur Verfügung stellten.
Durch Programmieren der in vitro Translationsmischung mit mRNA, die von pCite (NS3) transkribiert wurde, ist es möglich, die Synthese eines Proteins mit dem erwarteten Molekulargewicht (68 kDa) zu beobachten, das die gesamte NS3 Serinproteasedomäne enthält. Die von pCite (NS5AB) transkribierte mRNA leitet die Synthese eines Vorläufers von 115 kDa, der NS5A und NS5B enthält und ist so ein Substrat für die proteolytische Aktivität, die mit NS3 assoziiert ist.
Wenn jedoch die zwei Proteine, die die NS3 Serinproteasedomäne und das Substrat mit der Stelle, die der Kontaktstelle zwischen NS5A und NS5B entspricht, enthalten in der selben Reaktionsmischung synthetisiert werden, gibt es keinen klaren Anhaltspunkt für die proteolytische Aktivität von NS3.
Im Gegenteil, die von pCite (NS34A) transkribierte mRNA wird in ein Vorläuferprotein von ungefähr 76 kDa transkribiert, welches sich in vitro proteolytisch selbst prozessiert, um äquimolare Mengen an zwei Proteinen von 70 kDa und 6 kDa zu ergeben, die jeweils NS3 und NS4A enthalten.
Falls zusätzlich zu der mRNA, die von pCite (NS34A) transkribiert wird, die mRNA, die von pCite (NS5AB) transkribiert wird, in die in vitro Translationsmischung eingeschlossen wird, kann zusätzlich zu der Selbstproteolyse an der Stelle zwischen NS3 und NS4 die Erzeugung von zwei neuen Proteinen von 56 kDa und 65 kDa beobachtet werden, die jeweils NS5A und NS5B enthalten. Diese Proteine repräsentieren das Produkt der Proteolyse des Vorläufers, der NS5A und NS5B enthält, durch NS3. Ähnlich werden die 56 kDa und 65 kDa Proteinprodukte erhalten, die proteolytisch von dem NS5AB Vorläufer erzeugt werden, falls die von pCite (NS3Δint1237-1635) transkribierte mRNA mit der von pCite (NS5AB) translatierten mRNA cotranslatiert wird.
Dieses Ergebnis kann durch Feststellen zusammengefaßt werden, daß in vitro die Proteasedomäne von NS3 alleine nicht in der Lage ist Proteaseaktivität an einem Substrat zu zeigen, das NS5A und NS5B enthält. Die Serinproteaseaktivität von NS3 wird jedoch offensichtlich, falls eine andere Proteinsequenz, die NS4A enthält, zusätzlich zu der NS3 Proteasedomäne vorhanden ist.

Beispiel 3

Verfahren zum Aktivieren der HCV NS3 Protease unter Verwendung eines synthetischen Peptids, das NS4A Sequenzen enthält

Ein synthetisches Peptid, das die Sequenz SEQ ID NR: 3 enthält, wurde an Festphase synthetisiert. Diese Sequenz ist von dem C-terminalen Teil von SEQ ID NR: 2 abgeleitet. Synthese des Peptids fand an Festphase gemäß Verfahren statt, die denen, die in diesem Gebiet arbeiten bekannt sind. In diesem Peptid wurde das carboxyterminale Cystein mit Alpha-Aminobuttersäure (Abu) ersetzt.
Diese Peptid wurde zu einer in vitro Translationsmischung zugesetzt, die gleichzeitig mit den mRNAs, die von den Plasmiden pCite (NS3) und pCite (NS5AB) transkribiert wurden, programmiert wurden.
Es war daher möglich die proteolytische Aktivität, die mit der Serinproteasedomäne von NS3 assoziiert ist, zu beobachten, welches in der proteolytischen Spaltung des Substrates in die zwei Produkte, die die Proteine NS5A und NS5B enthalten, resultierte.
Diese Aktivität ist abhängig von der gleichzeitigen Anwesenheit der NS3 Serinproteasedomäne und des synthetischen Peptids mit der Sequenz SEQ ID NR: 3.

Beispiel 4

Verfahren zum Test einer rekombinanten HCV NS3 Serinprotease an einem Peptidsubstrat

Das Plasmid pT7-7 NS3 (1027-1206), das in Fig. 1 und in Beispiel 4 beschrieben ist, wurde konstruiert, um Expression des Proteinfragmentes, das zwischen Aminosäure 1 und Aminosäure 180 der SEQ ID NR: 1 enthalten ist, in E. coli zu erlauben. Solch ein Fragment enthält die Serinproteasedomäne von NS3, wie experimentell bestimmt. Das Fragment von HCV cDNA, das für das gerade beschriebene NS3 Fragment kodiert, wurde in das pT7-7 Plasmid kloniert, ein Expressionsvektor, der den T7 RNA Polymerase Promotor φ 10 und die Translationsstartstelle für das T7 Gen 10 Protein (Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective highlevel expression of cloned genes, (1986), J. Mol. Biol. 189, p. 113-130) enthält. Das cDNA Fragment, das für die NS3 Serinproteasedomäne wie oben definiert kodiert, wurde unterhalb des Bakteriophagen T7 Promotors in dem Raster mit dem ersten ATG Codon des T7 Gen 10 Proteins kodiert, unter Verwendung von Verfahren, die in der molekularbiologischen Praxis bekannt sind. Das pT7-7 Plasmid enthält ebenfalls das Gen für das β-Lactamaseenzym, welches als ein Marker für Selektion von E. coli Zellen benutzt werden kann, die mit Plasmiden, welche mit pT7-7 abstammen, transformiert wurden.
Das Plasmid pT7-7 NS3 (1027-1206) wird dann in den E. coli Stamm BL 21 (DE53) transformiert, welcher normalerweise für Expressionen mit hoher Effizienz (engl. high level expression) von Genen verwendet wird, die in Expressionsvektoren, welche T7 Promotor enthalten, kloniert sind. In diesem Stamm von E. coli liegt (engl. is carried) das T7 Polymerasegen auf dem Bakteriophagen λDE53, der in das Chromosom von BL21 integriert ist. Expressionen des Gens von Interesse wird durch Zusetzen von Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu dem Wachstumsmedium gemäß eines Verfahrens, das früher beschrieben wurde (Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, (1986), J. Mol. Biol-189, S. 113-130) induziert.
Das rekombinante NS3 Fragment, das die Serinproteasedomäne enthielt, konnte aus E. coli BL21 (DE53), das mit dem Plasmid pT7-7 NS3 (1027-1206) durch das unten zusammengefaßte Verfahren transformiert wurde, gereinigt werden.
Kurz, E. coli BL21 (DE53) Zellen, die das pT7-7 NS3 (1027-1206) Plasmid enthalten, wurden bei 37ºC zu einer optischen Dichte bei 600 nm von ungefähr 0,8 Absorptionseinheiten herangewachsen. Danach wurde das Medium auf 22ºC abgekühlt und die Herstellung des gewünschten Proteins durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,4 mM induziert. Nach 4-6 Stunden bei 22ºC in der Anwesenheit von IPTG wurden die Zellen geerntet und durch eine French-Presse in einem Puffer lysiert, der 20 mM Natriumphosphat pH 6,5, 0,5% (w/v) (3-[(3- Cholamidopropyl)-dimethylammonio] 1-Propansulfonat (CHAPS), 50% (v/v) Glycerol, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM EDTA (Lysepuffer) enthielt. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (1 Stunde bei 120000 · g) entfernt und das resultierende Sediment in Lysepuffer resuspendiert, mit DNAse I verdaut, re-homogenisiert und wie oben beschrieben re-zentrifugiert. S-Sepharose Fast Flow Ionenaustauschharz (Pharmacia), das in Lysepuffer prääquilibriert war, wurde zu den vereinigten Überständen (30% v/v) zugesetzt und der Brei (engl. slurry) wurde für eine Stunde bei 4ºC gerührt. Das Harz wurde sedimentiert und ausgiebig mit Lysepuffer gewaschen und auf eine Chromatographiesäule geladen. Die NS3 Protease wurde von dem Harz durch Anwenden eines 0-1 M NaCl Gradienten eluiert. Die Protease-enthaltenden Fraktionen, die mit 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,5, 10% (v/v) Glycerol, 0,5% (w/v) CHAPS und 2 mM Dithiothreitol äquilibriert waren. Das Protein war nach diesem Schritt 90-95 % rein. Reinigung bis > 98% wurde durch nachfolgende Chromatographie auf Heparinsepharose, die mit 50 mM Tris pH 7,5, 10% (v/v) Glycerol, 0,5% (w/v) CHAPS und 2 mM Dithiothreitol äquilibriert war, erzielt. Elution der NS3 Protease aus dieser Säule wurde durch Anwenden eines linearen 0-1 M NaCl Gradienten erzielt.
Die Konzentration des gereinigten Proteins wurde durch den Bio-Rad Proteintest (Bio- Rad Kat. 500-0006) bestimmt.
Die rekombinante NS3 Serinprotease, die gemäß dem obigen Verfahren in E. coli hergestellt wurde, konnte auf Aktivität getestet werden, durch Spalten eines Substrates, das meßbare Spaltprodukte zur Verfügung stellt. Das Signal ist vorzugsweise auf kolorimetrische oder fluorimetrische Weise detektierbar. Verfahren wie HPLC und ähnliche sind ebenfalls geeignet.
Zum Beispiel benutzten wir als Substrat synthetische Peptide, die der NS4A/4B Kontaktstelle des HCV Polyproteins entsprachen.
Der Aktivitätstest wird durch Inkubieren von 5-1000 um Substrat und 0,05-1 um Protease in Puffer, der 25 mM Tris/HCl pH 7,5, 3 mM Dithiothreitol, 0,5% (w/v) CHAPS und 10% (v/v) Glycerol enthält, für 1-3 Stunden bei 22ºC durchgeführt. Die Reaktion wird durch Zusetzen von Trifluoressigsäure beendet, um eine Endkonzentration von 0,1 % (w/v) zu ergeben.
Die Reaktionsprodukte werden dann durch HPLC auf einer C18 Reversephasesäule getrennt und gemäß ihrer Absorption des fernen UV-Lichtes quantifiziert.
Die proteolytische Aktivität, die durch aus E. coli gereinigter rekombinanter NS3 Serinprotease gezeigt wird, ist sehr niedrig, wenn der Aktivitätstest wie oben beschrieben durchgeführt wird. Wir fanden jedoch das ansteigende Mengen des synthetischen Peptids, beschrieben in SEQ ID NR: 3, die proteolytische Aktivität der rekombinanten NS3 Serinprotease um bis zu 20fach steigerten. Maximale Aktivität wird erzielt, wenn die rekombinante NS3 Serinprotease und das synthetische Peptid in äquimolaren Mengen vorhanden sind.
Der oben beschriebene Test kann für die Suche von Proteaseinhibitoren benutzt werden. Weil die Aktivität der NS3 Protease in solch einem Test von der Interaktionen der NS3 Serinproteasedomäne mit Aminosäuresequenzen, die von NS4A abstammen, abhängt, ist es ebenfalls möglich durch Verwendung des oben beschriebenen Tests Antagonisten der Interaktion zwischen NS3 und NS4A zu suchen, die letztendlich die proteolytische Aktivität, die mit NS3 assoziiert ist, inhibieren werden.

Beispiel 5

Detaillierte Konstruktion der Plasmide in der einzigen Figur

pCite(NS3) enthält den Teil des HCV-BK Genoms, der zwischen den Nukleotiden 3351 und 5175 (Aminosäuren 1007-1615 des Polyproteins) enthalten ist. Konstruktion dieses Plasmids wurde in L. Tomei et al. "NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein", J. Virol (1993) 67, 1017-1026 beschrieben.
pCite (NS4B/5A) wurde durch Klonieren eines Scal-BamHl Fragmentes, das aus dem Plasmid pCite (NS4-5) stammt, beschrieben in Tomei et al in pCite (NS3), erhalten, welches vorher mit Mscl und BamHl verdaut worden war. pCite (NS4B/5A) enthält den Teil des HCV Genoms, der zwischen den Nukleotiden 5652 und 7467 (Aminosäuren 1774-2380 des Polyproteins) enthalten ist.
pCite (NS5AB) kodiert für ein Protein, das die Sequenz von Aminosäure 1965 bis Aminosäure 3010 des HCV-BK Polyproteins enthält. Um dieses Plasmid zu konstruieren, wurde das Plasmid pCite (SX), beschrieben in Tomei et al (1993), supra, zuerst mit Asel verdaut und mit dem Klenowfragment der DNA Polymerase behandelt. Nach Inaktivierung des Klenowenzyms wurde das Plasmid mit Xbal verdaut. Das resultierende cDNA Fragment, das die Region zwischen den Nukleotiden 6224 und 9400 enthielt, wurde gereinigt und in die BstXl und Xbal Schnittstellen des Vektors pCite-1R inseriert, nachdem ein glattes Ende von BstXl mit T4 DNA Polymerase erzeugt worden war.
pCite (NS3/4A) wurde wie folgt erhalten. Ein cDNA Fragment, das der Region zwischen Nukleotiden 3711 und 5465 des HCV-BK Genoms entspricht, wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonukleotide als Primer synthetisiert. Ein UAG Stop Codon wurde in geeigneter Weise in das Antisense-Oligonukleotid eingeschlossen. Nach PCR Amplifikation wurde die resultierende cDNA an dem 5' Ende mit Sall geschnitten und das Produkt von 750 Basenpaaren direkt in die Sall und Nhel Schnittstellen des Plasmids pCite (SX) kloniert, nachdem das Nhel Ende mit dem Klenowfragment der DNA Polymerase glattgeschnitten (engl. blunt-ending) wurde. Das resultierende Plasmid kodiert für den Teil des HCV-BK Polyproteins, der zwischen den Aminosäuren 991 und 1711 enthalten ist.
Zur Konstruktion von pCite (NS4A) wurde ein cDNA Fragment, das der Region zwischen den Nukleotiden 5281 und 5465 des HCV-BK Genoms (Aminosäuren 1649- 1711) entsprach, durch Polymerasekettenreaktionsamplifikation (PCR) mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden als Primer erhalten. Die cDNA, die aus der PCR Amplifikation resultierte, wurde danach in die BstXl und Stul Schnittstellen des Plasmids pCite-1R kloniert, nachdem das BstXl verdaute Ende mit der DNA Polymerase der Bakteriophagen T4 glattgeschnitten worden war.
pCite (NS3Δint1237-1635) ist ein Derivat von pCite (NS3/4A), von dem alle Sequenzen, die zwischen Nukleotid 4043 und Nukleotid 5253 enthalten sind, deletiert worden waren. Es wurde durch Verdauen von pCite (NS3/4A) mit Bstell und partiell mit Scal erhalten. Das Fragment, das die Deletion von Interesse enthielt, wurde dann unter Verwendung von T4 DNA Ligase zirkularisiert. Dieses Plasmid kodiert für ein Protein, das die selben amino- und carboxyterminalen Enden hat, wie das, welches von pCite (NS3/4A) kodierte wird, aber alle die Aminosäurereste, die zwischen Aminosäure 1237 und Aminosäure 1635 enthalten sind, welche experimentell als entbehrlich für die Serinproteaseaktivität von NS3 befunden wurde, deletiert worden waren.
pT7-7 [NS3(1027-1206)] enthält die HCV Sequenz von Nukleotid 3411 bis Nukleotid 3951, welche das HCV NS3 Fragment kodiert, das zwischen Aminosäure 1027 und Aminosäure 1206 enthalten ist. Um dieses Plasmid zu erhalten, wurde ein DNA Fragment durch Amplifikation von HCV cDNA durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugt. Das durch PCR erhaltene cDNA Fragment wurde phosphoryliert, mit Nde I verdaut und anschließend unterhalb des Bakteriophagen T7 Promotors in den vorher mit Nde I und Sma I verdauten Vektor pT7-7 direkt auf das erste ATG Codon des T7 Gen 10 Protein folgend kloniert (Studier and Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, (1986), J. Mol. Biol. 189, S. 113-130). Es muß angemerkt werden, daß ein Stopcodon (engl. amber codon) direkt auf die HCV abgeleitete Sequenz folgend inseriert wurde.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Istituto di Ricerche di Biologia Moleculare P. Angeletti S. p. A.
(ii) NAME DER ERFINDUNG: Verfahren zum in vitro Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der NS3 Protease des Hepatitis C Virus
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Societa Italiana Brevetti
(B) STRASSE: Piazza di Pietra, 39
(C) STADT: Rom
(D) LAND: Italien
(E) POSTLEITZAHL: I - 00186
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) DATENSPEICHER: Floppy disk 3,5" 1,44 MBYTES
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS Rev. 5,0
(D) SOFTWARE: Microsoft Wordstar 4,0
(viii) ANWALTNERTRETER INFORMATION:
(A) NAME: Di Cerbo, Mario (Dr.)
(C) REFERENZ: RM/X88350/PCT-DC
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEPHON: 06/6785941
(B) TELEFAX: 06/6794692
(C) TELEAX: 612287 ROPAT

(1) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 631 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(v) FRAGMENTART: internes Fragment
(vi) HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: Hepatitis C Virus
(C) ISOLAT: BK
(vii) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: cDNA Klon pCD(38-9.4) beschrieben von Tomei et al. in 1993
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME: NS3 Serinproteasedomäne
(B) LAGE: 1-180
(C) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: experimentell (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 54 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Polypeptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(v) FRAGMENTART: intern
(vii) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT: cDNA Klon (siehe SEQ ID NR: 1)
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME: NS4A Protein
(C) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: experimentell (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2
(32) ANGABEN ZU SEQ ID NR: 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 34 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGART: einzeln
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Polypeptid
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTI-SENSE: nein
(v) FRAGMENTART: intern
(vii) URSPRÜNGLICHE HERKUNFT:
(A) SYNTHESE: Festphasenpeptidsynthese
(ix) EIGENSCHAFTEN:
(A) NAME: Cofaktor von NS3 Serinprotease
(C) IDENTIFIZIERUNGSVERFAHREN: experimentell (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 3

Claims

1. Verfahren zum Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der HCV NS3 Protease in vitro, dadurch gekennzeichnet, daß beide Sequenzen, die in NS3 enthalten sind und Sequenzen, die in NS4A enthalten sind, in der Reaktionsmischung benutzt werden.

2. Verfahren zum Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der HCV NS3 Protease in vitro nach Anspruch 1, wobei NS4A in einem Verhältnis von 1 : 1 im Bezug auf NS3 vorhanden ist.

3. Verfahren zum Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der HCV NS3 Protease in vitro nach Anspruch 1 oder 2, wobei NS3 und NS4 als NS3-NS4 Vorläufer in die Reaktionsmischung inkorporiert werden, wobei der Vorläufer durch ein autoproteolytisches Ereignis äquimolare Mengen an NS3 und NS4A erzeugt.

4. Verfahren zum Reproduzieren der proteolytischen Aktivität der HCV NS3 Protease in vitro nach mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Schnittstelle zwischen NS3 und NS4 in einem Vorläufer mutiert ist, so daß NS4 kovalent an NS3 gebunden bleibt, wodurch es folglich möglich ist, von dem nicht proteolytisch spaltbaren Vorläufer die Sequenzen zu entfernen, welche die proteolytische Aktivität von NS3 nicht beeinflussen.

5. Zusammensetzung an Stoffen, dadurch gekennzeichnet, daß sie NS3 und NS4A Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 4 enthält.

6. Zusammensetzung an Stoffen gemäß Anspruch 5, umfassend die Proteine, deren Sequenzen in SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 beschrieben sind, oder Sequenzen, die darin enthalten sind oder davon abstammen.

7. Verwendung der Zusammensetzungen an Stoffen gemäß Ansprüchen 5 und 6, um einen enzymatischen Test einzurichten, der in der Lage ist, Verbindungen für therapeutische Zwecke auszuwählen, welche die enzymatische Aktivität inhibieren, die mit NS3 assoziiert ist.