JP4299540B2 - C型肝炎ウイルスレプリコンおよびレプリコン増強細胞 - Google Patents
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Description
本発明のもう1つの態様は、ヒト組換え肝細胞癌細胞を記載する。組換え細胞なる言及は、当初生成した細胞およびこの子孫を示す。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、(a)細胞内にHCVレプリコンを導入し維持し、(b)該HCVレプリコンの細胞を矯正(cure)する工程を含む。
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載している実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を確認し使用することが可能である。
HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのHCV RNAおよびHCVタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強宿主は共に、細胞内でHCVレプリコンを維持する能力に関して選択することにより得ることができる。後記実施例に例示するとおり、宿主細胞およびHCVレプリコン中に存在する適応突然変異は共に、細胞内でのレプリコンの維持を補助しうる。
適応突然変異は、宿主細胞内でHCVレプリコンが維持され発現される能力を増強する。適応突然変異は、まず、野生型HCV RNA構築物または突然変異HCVレプリコンの使用に関して選択されうる。初期選択は、HCVレプリコンを細胞に与え、レプリコンを含有するクローンを同定することを含む。
5’UTR−ヌクレオチド1−341;
コア−ヌクレオチド342−914;
E1−ヌクレオチド915−1490;
E2−ヌクレオチド1491−2579;
P7−ヌクレオチド2580−2768;
NS2−ヌクレオチド2769−3419;
NS3−ヌクレオチド3420−5312;
NS4A−ヌクレオチド5313−5474;
NS4B−ヌクレオチド5475−6257;
NS5A−ヌクレオチド6258−7598;
NS5B−ヌクレオチド7599−9371;および
3’UTR−ヌクレオチド9374−9605。
種々の構造および非構造領域のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
A=Ala=アラニン:コドンGCA、GCC、GCG、GCU。
C=Cys=システイン:コドンUGC、UGU。
D=Asp=アスパラギン酸:コドンGAC、GAU。
E=Glu=グルタミン酸:コドンGAA、GAG。
F=Phe=フェニルアラニン:コドンUUC、UUU。
G=Gly=グリシン:コドンGGA、GGC、GGG、GGU。
H=His=ヒスチジン:コドンCAC、CAU。
I=Ile=イソロイシン:コドンAUA、AUC、AUU。
K=Lys=リシン:コドンAAA、AAG。
L=Leu=ロイシン:コドンUUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU。
M=Met=メチオニン:コドンAUG。
N=Asp=アスパラギン:コドンAAC、AAU。
P=Pro=プロリン:コドンCCA、CCC、CCG、CCU。
Q=Gln=グルタミン:コドンCAA、CAG。
R=Arg=アルギニン:コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU。
S=Ser=セリン:コドンAGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU。T=Thr=トレオニン:コドンACA、ACC、ACG、ACU。
V=Val=バリン:コドンGUA、GUC、GUG、GUU。
W=Trp=トリプトファン:コドンUGG。
Y=Tyr=チロシン:コドンUAC、UAU。
HCVレプリコンは、完全長HCVゲノムおよびサブゲノム構築物を含む。基本HCVレプリコンは、HCV 5’UTR−PC領域、HCV NS3−NS5Bポリタンパク質コード領域およびHCV 3’UTRを含有するサブゲノム構築物である。HCV NS2、構造HCVタンパク質および非HCV配列を与える核酸領域のような他の核酸領域が存在しうる。
HCVレプリコンは、HCV配列に加えて非HCV配列を含有しうる。該追加的配列は、複製および発現を妨げるものであるべきではなく、好ましくは、有用な機能を果たす。有用な機能を果たすよう使用しうる配列には、選択配列、レポーター配列、転写要素および翻訳要素が含まれる。
HCVレプリコン中の選択配列は、該レプリコンを含有する細胞の同定を容易にする。選択配列は、典型的には、該選択配列を含有しない細胞の増殖を抑制する何らかの選択圧と共に使用される。選択配列の具体例には、リボザイムおよび抗生物質耐性をコードする配列が含まれる。
レポーター配列は、レプリコン複製またはタンパク質発現を検出するために使用することができる。好ましいレポータータンパク質は、該タンパク質により産生された産物を測定することにより存在が検出されうる酵素タンパク質である。レポータータンパク質の具体例には、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、βグルクロニダーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびその誘導体が含まれる。また、相補的核酸により標的化されうる参照配列を得るために、レポーター核酸配列を使用することができる。該相補的核酸のその標的へのハイブリダイゼーションは、標準的な技術を用いて測定することができる。
追加的非HCV配列は、好ましくは、HCVレプリコンゲノムまたはサブゲノムゲノム領域の5’側または3’側に位置する。しかし、該追加的配列は、該配列が検出可能なレプリコン活性を妨げない限り、HCVゲノム中に位置しうる。所望により、リボザイムと共にリボザイム認識配列を使用することにより、追加的配列は該レプリコンから分離されうる。
レプリコン活性を検出するための方法には、レプリコンRNAおよびコード化タンパク質の産生または活性を測定する方法が含まれる。測定は定性的および定量的分析を含む。
レプリコン増強細胞は、まず、HCVレプリコンを維持しうる細胞を選択し次いで該レプリコンの細胞を矯正(cure)することにより製造される。このようにして製造された細胞は、後続のHCVレプリコンのトランスフェクションの後にレプリコンを維持する能力を増強していることが判明した。
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
本実施例は、適応突然変異およびレプリコン増強細胞を製造し分析するために用いる技術を例示する。
核酸の操作は標準的なプロトコール(Sambrookら,1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)に従い行った。プラスミドDNAは、Qiagen 500カラムを製造業者の説明に従い使用してLBブロス中のON培養から調製した。
トランスフェクションは、Huh−7細胞を使用して行った。該細胞を、10% FCSで補足されたダルベッコ変法最少必須培地(DMEM,Gibco,BRL)中で増殖させた。通常の研究には、1×トリプシン/EDTA(Gibco,BRL)を使用して、週2回、細胞を1〜5継代した。
HCVNeo.17RNAで行った3つの異なるトランスフェクション実験から全NS領域を再クローニングした。Qiagen RNAeasyミニキットを製造業者の説明に従い使用して又はChomczynskiら,1987.Anal.Biochem.162,156−159に記載されているとおりに、選択したクローンからRNAを抽出した。
TaqMan分析は、典型的には、HCV特異的オリゴ/プローブ(オリゴ1:5’−CGGGAGAGCCATAGTGG−3’;配列番号11、オリゴ2:5’−AGTACCACAAGGCCTTTCG−3’;配列番号12、プローブ:5’−CTGCGGAACCGGTGAGTACAC−3’;配列番号13)またはヒトGAPDH特異的オリゴ/プローブ(Pre−Developed TaqMan Assay Reagents,Endogenous Control Human GAPDH,Part Number 4310884E,Perkin Elmer Biosystems)と共に10ngのRNAを反応混合物(TaqMan Gold RT−PCRキット,Perkin Elmer Biosystems)中で使用して行った。PCRは、Perkin Elmer ABI PRISM 7700を以下の条件下で使用して行った:48℃で30分間(RT工程)、95℃で10分間ならびに40サイクル:95℃で15秒間および60℃で1分間。定量的計算を、GAPDH mRNAのレベルを一定とみなしてComparative CT Method(User Bulletin #2 ABI PRIM 7700 Sequence Detection Systems,Applied Biosystem,1997年12月に記載されている)を使用して行った。HCV RNAのすべての計算は、特異的対照に対する倍率相違として表されている。
マウスモノクローナル抗体(抗NS3 mab10E5/24)を標準的な技術(GalfreおよびMilstein,1981.Methods in Enzymology 73,1−46)により製造した。精製された組換えタンパク質を免疫原として使用した(Gallinariら,1999.Biochemistry 38,5620−5632)。
G418の不存在下または存在下でのトランスフェクト化細胞の生存を、フォーカス/クローンのニュートラルレッドでのインビボ染色およびそれに続く/クリスタルバイオレット染色によりモニターした。該培地を該細胞から除去し、0.0025% ニュートラルレッド(Sigma N2889)を含有する新鮮培地と交換し、該細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、3.5% ホルムアルデヒド中で15分間固定し、再びPBS中で2回、ついで蒸留水で洗浄し、(生きた)フォーカスの数を計数した。ついで、20% メタノール中の0.1% クリスタルバイオレット(Sigma C0775)溶液と共に室温で20分間インキュベートし、ついで20% メタノール中で3回洗浄し、蒸留水で洗浄することにより、該細胞はクリスタルバイオレットで再染色されることが可能であった。
10IFNおよびCl.60/cuと称されるレプリコン増強細胞を、種々のHCV抑制剤を使用して製造した。本明細書に記載の技術に基づき、更なるレプリコン増強クローンが容易に入手されうる。
Huh−細胞(2〜8×106個)を、インビトロ転写レプリコンRNA(10〜20μg)でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、2.5×103〜10×103/cm2の範囲の密度でプレーティングし、0.8〜1mg/ml G418の存在下で培養した。レプリコンでトランスフェクトされた細胞の大多数はG418に対して一過性に耐性となり、該薬物の存在下で通常7〜12日間で倍加し、一方、無関係なRNAでトランスフェクトされた細胞および模擬トランスフェクト化細胞は7日間より長くは生存しなかった(データは示していない)。G418に対する一過性の耐性は、該トランスフェクト化RNAから発現されたNeoタンパク質の維持によると考えられた。なぜなら、それは、複製不可能な突然変異レプリコンでも観察されたからである。トランスフェクションの約2週間後、一過性の耐性は減弱し、ほとんどの細胞は死に、HCVNeo.17 RNAでトランスフェクトされたサンプルにおいては、該抗生物質に対して永久的に耐性である細胞の小さなコロニーが認められたが、他のレプリコンRNAでトランスフェクトされた細胞では認められなかった。
HCVNeo.17 RNAトランスフェクションに由来するG418耐性クローンが少数であったことは、該レプリコンを該宿主細胞に適応させうる突然変異(適応突然変異)が複製に必要でありうること、および/または、小さな割合のHuh−7細胞しか、HCVの複製に適合しないことを示唆した。その第1の仮定を証明するために、選択した細胞クローンに由来するレプリコンRNA中の突然変異を同定した。
再クローン化レプリコンにおけるコンセンサス突然変異の同定は、選択した細胞クローンに含有されるレプリコンRNAの複製能がそのような突然変異の存在に左右されることを示した。この仮定を証明するために、レプリコンに対するいくつかのコンセンサス突然変異の効果を分析した。
G418選択の不存在下でのHCVレプリコンの複製を、定量的PCR(TaqMan)を用いて検出した。トランスフェクションの24時間後、NS5Bポリメラーゼの触媒性GDDモチーフ中に突然変異を含有するGAA対照レプリコンを含むすべてのレプリコンでトランスフェクトされた細胞において、多量のレプリコンRNAが検出された。この結果は、非常に初期の時点(トランスフェクションの24時間後まで)の分析が実質的には投入RNAを測定していることを示唆した。ノーザンブロット分析はまた、24時間後に、該トランスフェクト化RNAの大多数が細胞内で分解することを示した(データは示していない)。
HCVレプリコンを宿主中に導入し、ついで該宿主を該レプリコンに関して矯正することにより、HCVレプリコン増強細胞を製造した。適応突然変異(またはそれらの組合せ)自体は、G418 cfu効率を2桁までも増加させ、初期複製を同等に増強した。しかし、最も効果的な突然変異体においてさえも、小さな割合のトランスフェクト化細胞(<5%、データは示していない)しか、機能的レプリコンを含有するG418耐性クローンを与えなかった。この観察は、少なくとも部分的には、Huh−7細胞の低いクローニング効率に帰され(データは示していない)、一部のHuh−7細胞が複製に適合したに過ぎなかった。
本実施例は、本明細書に記載の適応突然変異を含有する完全長HCVゲノムがレプリコン増強宿主細胞内で複製される能力を例示する。HCV単離物Con−1(EMBL−Genbank No.AJ238799)(プラスミドpHCVRBFL.wt)ならびにN2041TおよびS2173F突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m8)またはS2197FおよびA2199T突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m11)を含有する2つの誘導体の完全長配列を、出発構築物として使用した。
本実施例は、レポーター遺伝子および適応突然変異を含有するHCVレプリコンを例示する。Neoコード領域がヒト胎盤分泌性アルカリホスファターゼのコード領域で置換されたpHCVNeo17.wt誘導体(pRBSEAP5.wt)、ならびにN2041TおよびS2173F突然変異をも含有する誘導体(プラスミドpRBSEAP5.m8)を構築した。これらのプラスミドから転写されたRNAを10IFN細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能を、アルカリホスファターゼの分泌を測定することにより評価した。分泌の速度論の分析は、プラスミドpRBSEAP5.m8のみが複製に適合することを示唆した(データは示していない)。
配列番号(SEQ.ID.)1および2を以下に示す。
1−341:HCV 5’非翻訳領域であり、これは、コア−neo融合タンパク質の翻訳を駆動する;
342−1181:コア−neo融合タンパク質、選択マーカー;
1190−1550:脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入シグナルであり、これは、HCV NS領域の翻訳を駆動する;
1551−1800:脳心筋炎ウイルスの内部リボソーム進入シグナルであり、これは、HCV NS領域の翻訳を駆動する;
1801−3100:非構造タンパク質3から非構造タンパク質5BまでのHCVポリタンパク質;
1801−3100:非構造タンパク質3(NS3)、HCV NS3プロテアーゼ/ヘリカーゼ;
3101−4650:非構造タンパク質3から非構造タンパク質5BまでのHCVポリタンパク質;
3101−3696:非構造タンパク質3(NS3)、HCV NS3プロテアーゼ/ヘリカーゼ;
3697−3858:非構造タンパク質4A(NS4A)、NS3プロテアーゼ補因子;
3859−4641:非構造タンパク質4B(NS4B);
4642−4650:非構造タンパク質5A(NS5A);
4651−7755:非構造タンパク質3から非構造タンパク質5BまでのHCVポリタンパク質;
4651−5982:非構造タンパク質5A(NS5A);
5983−6200:非構造タンパク質5B(NS5B);RNA依存性RNAポリメラーゼ;
6201−7750:非構造タンパク質3から非構造タンパク質5BまでのHCVポリタンパク質;
6201−7750:非構造タンパク質5B(NS5B);RNA依存性RNAポリメラーゼ;
7751−7755:非構造タンパク質3から非構造タンパク質5BまでのHCVポリタンパク質;
7751−7755:非構造タンパク質5B(NS5B);RNA依存性RNAポリメラーゼ;
7759−7989:HCV 3’非翻訳領域;および
7990−9300:複製起点、βラクタマーゼコード配列およびT7プロモーターを含むプラスミド配列。
9301−10690:複製起点、βラクタマーゼコード配列およびT7プロモーターを含むプラスミド配列。
Claims (22)
- HCV 5’UTR−PC領域、NS3コード領域、HCV NS4Aコード領域、HCV NS4Bコード領域、NS5Aコード領域、HCV NS5Bコード領域およびHCV 3’UTRを含むHCVレプリコンであって、当該HCVレプリコンは、以下のa)〜c)からなる群から選択される変異を有し、
a)1以上のNS3突然変異をコードする改変されたHCV NS3コード領域であって、該NS3突然変異の少なくとも1つは、配列番号1のアミノ酸配列の番号付けに基づく以下から選択される突然変異である:
Alaであるアミノ酸1095、
Glyであるアミノ酸1202、又は
Thrであるアミノ酸1347、
b)1以上のNS5A突然変異をコードする改変されたHCV NS5Aコード領域であって、該NS5A突然変異の少なくとも1つは、配列番号1のアミノ酸配列の番号付けに基づく以下から選択される突然変異である:
Thrであるアミノ酸2041、
残基2039と2040との間のLysの挿入、
Pheであるアミノ酸2173、
Pheであるアミノ酸2197、
Serであるアミノ酸2198、
Thrであるアミノ酸2199、又は
Argであるアミノ酸2204、および
c)1以上の脳心筋炎ウイルス(EMCV)内部リボソーム進入シグナル(IRES)突然変異を含有する改変されたEMCV IRES領域であって、当該EMCV IRES突然変異の少なくとも1つは、配列番号3のヌクレオチドの番号付けに基づく、ヌクレオチド1736におけるアデニンの挿入であり、
かつ、該HCVレプリコンは少なくとも、アミノ酸1202がGlyでありかつ2039と2040残基の間にLysが挿入されているか、又はアミノ酸2197がPheでありかつアミノ酸2199がThrである変異を有するHCVレプリコン。 - 該NS5Aに適応突然変異が少なくとも2つ存在する、請求項1記載のHCVレプリコン。
- 該NS3に適応突然変異が少なくとも2つ存在する、請求項1記載のHCVレプリコン。
- 該HCVレプリコンが、レポータータンパク質をコードする配列を更に含む、請求項1記載のHCVレプリコン。
- 該HCVレプリコンが、選択タンパク質をコードする配列を更に含む、請求項1記載のHCVレプリコン。
- 該HCVレプリコンが、HCVコアコード領域、HCV E1コード領域、HCV E2コード領域、HCV p7コード領域およびHCV NS2コード領域を更に含む、請求項1記載のHCVレプリコン。
- HCV 5’UTR−PC領域、NS3コード領域、HCV NS4Aコード領域、HCV NS4Bコード領域、NS5Aコード領域、HCV NS5Bコード領域およびHCV 3’UTRを含むHCVレプリコンであって、当該HCVレプリコンは、以下のa)〜c)からなる群から選択される変異を有し、
a)1以上のNS3突然変異を含有する改変されたHCV NS3コード領域であって、該NS3突然変異の少なくとも1つは、配列番号2のヌクレオチドの番号付けに基づく以下から選択される突然変異である:
シトシンであるヌクレオチド3625、
グアニンであるヌクレオチド3946、又は
アデニンであるヌクレオチド4380、
b)1以上のNS5A突然変異を含有する改変されたHCV NS5Aコード領域であって、該NS5A突然変異の少なくとも1つは、配列番号2のヌクレオチドの番号付けに基づく以下から選択される突然変異である:
ヌクレオチド6458と6459との間への3個のアデニン残基の挿入、
シトシンであるヌクレオチド6463、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド6859、
チミンまたはウラシルであるヌクレオチド6931、
シトシンであるヌクレオチド6934、
アデニンであるヌクレオチド6936、又は
アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド6953、および
c)1以上の脳心筋炎ウイルス(EMCV)内部リボソーム進入シグナル(IRES)突然変異を含有する改変されたEMCV IRES領域であって、該EMCV IRES突然変異の少なくとも1つは、配列番号3のヌクレオチドの番号付けに基づくヌクレオチド1736におけるアデニンの挿入であり、
かつ当該HCVレプリコンは配列番号1のアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸1202がGlyありかつ2039と2040残基の間にLysが挿入されているか、又はアミノ酸2197がPheありかつアミノ酸2199がThrである変異を有するHCVレプリコン。 - 該HCVレプリコンが前記の改変されたNS5Aコード領域を含み、前記の改変されたNS5A領域のヌクレオチド配列が、
a)ヌクレオチド6458と6459との間への3個のアデニン残基の挿入、
b)シトシンであるヌクレオチド6463、
c)チミンまたはウラシルであるヌクレオチド6859、
d)チミンまたはウラシルであるヌクレオチド6931、
e)シトシンであるヌクレオチド6934、
f)アデニンであるヌクレオチド6936および
g)アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド6953よりなる群から選ばれる該NS5A修飾の1以上で修飾された配列番号2の塩基6258−7598またはそのRNA形態により与えられる、請求項7記載のHCVレプリコン。 - 該5’UTR−PC領域が配列番号2の塩基1−377のRNA形態であり、該3’UTRが配列番号2の塩基9374−9605のRNA形態である、請求項7記載のHCVレプリコン。
- 該HCVレプリコンが、配列番号2の塩基1−377のRNA形態である 5’UTR−PC領域、配列番号2の塩基9374−9605のRNA形態である3’UTR、かつ修飾されたNS3−NS5B領域が、
a)アデニンであるヌクレオチド4380、
b)シトシンであるヌクレオチド3625、
c)グアニンであるヌクレオチド3946、
d)ヌクレオチド6458とヌクレオチド6459との間への3個のアデニン残基の挿入、
e)シトシンであるヌクレオチド6463、
f)ウラシルであるヌクレオチド6859、
g)ウラシルであるヌクレオチド6931、
h)シトシンであるヌクレオチド6934、
i)アデニンであるヌクレオチド6936および
j)アデニンまたはグアニンであるヌクレオチド6953よりなる群から選ばれる1以上の修飾で修飾された配列番号2の塩基3420−9371のRNA形態よりなる、請求項8記載のHCVレプリコン。 - 該レプリコンが、配列番号2のヌクレオチド378−3419のRNA形態を更に含むゲノムレプリコンである、請求項10記載のHCVレプリコン。
- a)アルギニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5335−5337、
b)フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5242−5244、
c)フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、
d)セリンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5317−5319、
e)ヌクレオチド4843の後に挿入されたリシンをコードするヌクレオチド、
f)グリシンをコードするよう修飾されたヌクレオチド2329−2331、トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド2764−2766、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5242−5244、およびヌクレオチド1736の後に挿入された追加的なアデノシン、
g)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド4846−4848、およびフェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5242−5244、
h)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド4846−4848、およびフェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、
i)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド4846−4848、およびセリンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5317−5319、
j)グリシンをコードするよう修飾されたヌクレオチド2329−2331、およびヌクレオチド4843の後に挿入されたリシンをコードするヌクレオチド、
k)フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、およびトレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5320−5322、
l)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド4846−4848、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、およびトレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5320−5322、
m)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド4846−4848、フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、およびヌクレオチド1736の後に挿入された追加的なアデノシン、
n)フェニルアラニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5314−5316、トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5320−5322、およびヌクレオチド1736の後に挿入された追加的なアデノシン、ならびに
o)トレオニンをコードするよう修飾されたヌクレオチド5320−5322よりなる群から選ばれる1以上の異なる修飾よりなる配列番号3の塩基1−7989の核酸塩基配列またはそのRNA形態を含んでなるHCVレプリコンであって、当該レプリコンは、少なくとも、配列番号1のアミノ酸の番号付けに基づくアミノ酸1202がGlyでありかつ2039と2040残基の間にLysが挿入されているか、又はアミノ酸2197がPheでありかつアミノ酸2199がThrである変異を有するHCVレプリコン。 - 前記の1以上の異なる修飾が、
a)C5337A、
b)C5243TまたはU、
c)C5315TまたはU、
d)TまたはU5318C、
e)4843の後に挿入されたAAA、
f)A2330G、G2764A、C5243TまたはU、および1736の後に挿入されたアデノシン、
g)A4847CおよびC5243TまたはU、
h)A4847CおよびC5315TまたはU、
i)A4847CおよびTまたはU5318C、
j)A2330Gおよび4843の後に挿入されたAAA、
k)C5315TまたはUおよびG5320A、
l)A4847C、C5315TまたはU、およびG5320A、
m)A4847C、C5315TまたはU、および1736の後に挿入されたアデノシン、
n)C5315TまたはU、G5320A、および1736の後に挿入されたアデノシン、ならびに
o)G5320A
よりなる群から選ばれる、請求項12記載のHCVレプリコン。 - RNA形態である請求項13で定義された核酸配列を含むHCVレプリコン。
- RNA形態である請求項13で定義された核酸配列からなる、請求項14記載のHCVレプリコン。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のHCVレプリコンをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターであって、該ヌクレオチド配列が外因性プロモーターに転写的に共役していることを特徴とする前記発現ベクター。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のHCVレプリコンをコードする核酸分子を含んでなる組換え細胞ヒト肝細胞癌細胞。
- 請求項16記載の発現ベクターを含む組換え細胞ヒト肝細胞癌細胞。
- 該肝細胞癌細胞がHuh−7細胞である、請求項17又は18に記載の組換え細胞。
- 該細胞がHuh−7細胞に由来する、請求項17又は18に記載の組換え細胞。
- 請求項1〜15のいずれか1項記載のHCVレプリコンをヒト肝細胞癌細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造された組換え細胞。
- 請求項16記載の発現ベクターをヒト肝細胞癌細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造された組換え細胞。
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