JP2009165477A - C型肝炎ウイルスレプリコンおよびレプリコン増強細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】HCVレプリコンの挿入および発現のための好ましい宿主であるレプリコン増強細胞の提供。
【解決手段】1以上の適応突然変異を含有する核酸、およびHCVレプリコン増強細胞に関する。適応突然変異は、HCVレプリコン活性を増強する突然変異である。HCVレプリコン増強細胞は、HCVレプリコンを維持する増強された能力を有する細胞である。HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのHCV RNAおよびHCVタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。
【選択図】なし
【解決手段】1以上の適応突然変異を含有する核酸、およびHCVレプリコン増強細胞に関する。適応突然変異は、HCVレプリコン活性を増強する突然変異である。HCVレプリコン増強細胞は、HCVレプリコンを維持する増強された能力を有する細胞である。HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのHCV RNAおよびHCVタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。
【選択図】なし
Description
本出願において引用されている参考文献は本発明の先行技術であると認められるものではない。
世界の人口の約3%がC型肝炎ウイルス(HCV)に感染していると見積もられている(Wasleyら,2000.Semin.Liver Dis.20,1−16)。HCVへの曝露は少数の場合には明らかな急性疾患を引き起こすが、ほとんどの場合には、該ウイルスは、肝炎を引き起こす慢性感染を確立し、肝不全および肝硬変へと徐々に進行させる(Iwarson,1994.FEMS Microbiol.Rev.14,201−204)。また、疫学的調査は、肝細胞癌の病理発生におけるHCVの重要な役割を示している(Kew,1994.FEMS Microbiol.14,211−220,Alter,1995.Blood 85,1681−1695)。
HCVゲノムは、約3000アミノ酸の前駆体ポリタンパク質をコードする約9.5kb長の一本鎖RNAよりなる(Chooら,1989.Science 244,362−364,Chooら,1989.Science 244,359−362,Takamizawaら,1991.J.Virol.65,1105−1113)。該HCVポリタンパク質は、C−E1−E2−p7−NS2−NS3−NS4A−NS4B−NS5A−NS5Bの順序でウイルスタンパク質を含有する。
個々のウイルスタンパク質は該HCVポリタンパク質のタンパク質分解により産生される。宿主細胞プロテアーゼは、推定構造タンパク質C、E1、E2およびp7を遊離させ、アミノ酸810におけるNS2のN末端を産生する(Mizushimaら,1994.J.Virol.68,2731−2734,Hijikataら,1993.P.N.A.S.USA 90,10773−10777)。
非構造タンパク質NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bは恐らくウイルス複製装置を形成し、該ポリタンパク質から遊離される。NS2とNS3のN末端とに会合した亜鉛依存性プロテアーゼがNS2とNS3との間の切断を引き起こす(Grakouiら,1993.J.Virol.67,1385−1395,Hijikataら,1993.P.N.A.S.USA 90,10773−10777)。NS3のN末端ドメインに位置する特徴的なセリンプロテアーゼが、NS3/NS4A、NS4A/NS4B、NS4B/NS5AおよびNS5A/NS5B結合部におけるタンパク質分解切断を引き起こす(Barthenschlagerら,1993.J.Virol.67,3835−3844,Grakouiら,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10583−10587,Tomeiら,1993.J.Virol.67,4017−4026)。NS4AはNS3活性のための補因子を与える(Faillaら,J.Virol.1994.68,3753−3760,De Francescoら,米国特許第5,739,002号)。NS5Aは、インターフェロン耐性を付与する高度にリン酸化されたタンパク質である(De Francescoら,2000.Semin Liver Dis.,20(1),69−83,Pawlotsky,1999.J.Viral Hepat.Suppl.1,47−48)。NS5BはRNAポリメラーゼを与える(De Francescoら,国際公開番号WO96/37619,Behrensら,1996.EMBO 15,12−22,Lohmannら,1998.Virology 249,108−118)。
Lohmannら,Science 285,110−113,1999は、ビスシストロン性(biscistronic)HCVレプリコンが肝細胞系において複製されうることを示している。該ビスシストロン性レプリコンは、ネオマイシンシストロンおよびNS2−NS5BまたはNS3−NS5Bシストロンを含有していた。「NS2−NS5B」はNS2−NS3−NS4−NS4B−NS5A−NS5Bポリタンパク質を意味する。「NS3−NS5B」はNS3−NS4−NS4B−NS5A−NS5Bポリタンパク質を意味する。
2000年10月11日付け公開のBartenschlager,欧州特許出願1 043 399(本発明の先行技術であるとは認められない)は、自律的HCV RNA複製およびタンパク質発現のための細胞培養系を記載している。複製およびタンパク質発現は、定量的測定に十分な程度に多量に生じることが示されている。欧州特許出願1 043 399は、HCVに感染した先行細胞系または初代細胞培養が、HCV複製を検出するための好ましい状況をもたらさないことを示している。
Chooら,1989.Science 244,359−364
Takamizawaら,1991.J.Virol.65,1105−1113
Mizushimaら,1994.J.Virol.68,2731−2734
Hijikataら,1993.P.N.A.S.USA 90,10773−10777
Grakouiら,1993.J.Virol.67,1385−1395
Barthenschlagerら,1993.J.Virol.67,3835−3844
Grakouiら,1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,10583−10587
Tomeiら,1993.J.Virol.67,4017−4026
Faillaら,J.Virol.1994.68,3753−3760
De Francescoら,2000.Semin Liver Dis.,20(1),69−83
Pawlotsky,1999.J.Viral Hepat.Suppl.1,47−48
Behrensら,1996.EMBO 15,12−22
Lohmannら,1998.Virology 249,108−118
Lohmannら,Science 285,110−113,1999
本発明は、1以上の適応(adaptive)突然変異を含有する核酸、およびHCVレプリコン増強細胞に関する。適応突然変異は、HCVレプリコン活性を増強する突然変異である。HCVレプリコン増強細胞は、HCVレプリコンを維持する増強された能力を有する細胞である。
HCVレプリコンは、培養細胞内で自律的に複製し検出可能なレベルの1以上のHCVタンパク質を与えうるRNA分子である。HCVレプリコンの基本サブユニットは、適当な5’UTR部分コア(PC)領域および3’UTRと共にHCV NS3−NS5Bポリタンパク質をコードしている。該5’UTR−PC領域は、5’UTR領域と、約36ヌクレオチドの該コアの開始部とから構成される。追加的な領域が存在することが可能であり、それらには、HCVタンパク質または要素、例えば完全コア、E1、E2、p7またはNS2をコードする領域、および他のタイプのタンパク質または要素、例えば脳心筋炎ウイルス(EMCV)内部リボソーム進入シグナル(IRES)、レポータータンパク質または選択タンパク質をコードする領域が含まれる。
本出願は、HCVレプリコン活性を増強する種々の適応突然変異を同定するものである。レプリコン活性の増強は以下の少なくとも1つを引き起こす:細胞内のレプリコンの維持の増加、レプリコンの複製の増加、およびレプリコンタンパク質発現の増加。
適応突然変異は、本発明では、特定の領域に存在する参照配列に対する該適応突然変異の位置を同定することにより記載されている。与えられた参照配列に基づき、該参照配列とは異なるアミノ酸配列を有する同等の領域の対応位置において、同じ適応突然変異が生成されうる。同等の領域は同じ機能を有し、同じ機能を有するポリペプチドをコードしている。
レプリコン増強細胞は、HCVレプリコンの挿入および発現のための好ましい宿主である。レプリコン増強細胞は、まず、HCVレプリコンを含有する細胞を作製し次いで該レプリコンの細胞を矯正(cure)することにより産生される。「レプリコン増強細胞」なる語は、HCVレプリコンに関して矯正された細胞(HCVレプリコンが除去された細胞)、およびそのような細胞の後代を含む。
したがって、本発明の第1の態様は、以下の領域の少なくとも1つを含む核酸分子を記載する:改変されたNS3コード領域、改変されたNS5Aコード領域、および改変されたEMCV IRES領域。該改変領域は1以上の適応突然変異を含有する。特定の適応突然変異に対する言及は、他の突然変異または適応突然変異の存在を除外するものではない。適応突然変異は、コード化アミノ酸配列または核酸配列に関して記載されている。
核酸分子は一本鎖であるか又は二本鎖の一部であることが可能であり、RNAまたはDNAでありうる。該核酸分子の構造に応じて、該分子はレプリコンとして又はレプリコンの製造において使用することができる。例えば、適切な領域を有する一本鎖RNAはレプリコンであることが可能であり、一方、レプリコンまたはレプリコン中間体をコードする配列の相補体を含む二本鎖DNAは該レプリコンまたはレプリコン中間体の製造において有用でありうる。
好ましい核酸分子は、1以上の適応突然変異を有する配列番号1、2または3からの領域を含有する核酸分子またはそのRNA形態である。「そのRNA形態」に対する言及は、リボースバックボーンを及びチミンではなくウラシルの存在を示す。
適応突然変異を含有する領域が存在するということは、少なくとも1つのそのような領域が存在することを示す。異なる実施形態においては、例えば、本明細書に記載の適応突然変異は、少なくとも、NS3領域中、NS5A領域中、NS3およびNS5A領域中、EMCV IRESおよびNS3領域中、EMCVおよびNS5A領域中、ならびにECMV IRES、NS3およびNS5A領域中に存在する。
本発明のもう1つの態様は、外因性プロモーと対になったHCVレプリコンまたはHCVレプリコン中間体のヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを記載する。「外因性プロモーターと対になった」ヌクレオチド配列との言及は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写をもたらすような、およびこのプロモーターが転写されるべきヌクレオチド配列を天然において伴っていないような、RNAプロモーターの存在および位置を示す。この発現ベクターはRNAレプリコンの生産に用いることができる。
本発明のもう1つの態様は、ヒト組換え肝細胞癌細胞を記載する。組換え細胞なる言及は、当初生成した細胞およびこの子孫を示す。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、(a)細胞内にHCVレプリコンを導入し維持し、(b)該HCVレプリコンの細胞を矯正(cure)する工程を含む。
本発明のもう1つの態様は、ヒト組換え肝細胞癌細胞を記載する。組換え細胞なる言及は、当初生成した細胞およびこの子孫を示す。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、(a)細胞内にHCVレプリコンを導入し維持し、(b)該HCVレプリコンの細胞を矯正(cure)する工程を含む。
本発明のもう1つの態様は、(a)細胞内にHCVレプリコンを導入し維持し、(b)該HCVレプリコンの細胞を矯正(cure)する工程を含む製造方法により製造されたHCVレプリコン増強細胞を記載する。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコンを含むHCVレプリコン増強細胞の製造方法を記載する。該方法は、(a)細胞内に第1 HCVレプリコンを導入し維持し、(b)該レプリコンの細胞を矯正(cure)し、(c)該矯正細胞内に第2レプリコンを導入し維持する工程を含み、該第2レプリコンは該第1レプリコンと同じ又は異なりうる。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコンをHCVレプリコン増強細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造されたHCVレプリコンを含有するHCVレプリコン増強細胞を記載する。該HCVレプリコン増強細胞内に導入されるHCVレプリコンは、該HCVレプリコン増強細胞を製造するために使用したHCVレプリコンと同じ又は異なりうる。好ましい実施形態においては、HCVレプリコン増強細胞内に導入されるHCVレプリコンは、該増強細胞を製造するために使用したのと同じレプリコンである。
本発明のもう1つの態様は、本明細書に記載の適応突然変異を含むHCVレプリコンを使用して、化合物がHCV活性に影響を及ぼす能力を測定する方法を記載する。該方法は、該HCVレプリコンを含む細胞に化合物を与え、該化合物が1以上のレプリコン活性に影響を及ぼす能力をHCV活性に対する影響の尺度として測定することを含む。
本発明のもう1つの態様は、HCVレプリコンを含むHCVレプリコン増強細胞を使用して、化合物がHCV活性に影響を及ぼす能力を測定する方法を記載する。該方法は、該細胞に化合物を与え、該化合物が1以上のレプリコン活性に影響を及ぼす能力をHCV活性に対する影響の尺度として測定することを含む
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載している実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を確認し使用することが可能である。
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載している実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を確認し使用することが可能である。
(発明の詳細な記載)
HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのHCV RNAおよびHCVタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強宿主は共に、細胞内でHCVレプリコンを維持する能力に関して選択することにより得ることができる。後記実施例に例示するとおり、宿主細胞およびHCVレプリコン中に存在する適応突然変異は共に、細胞内でのレプリコンの維持を補助しうる。
HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強細胞は、検出可能なレベルのHCV RNAおよびHCVタンパク質を与える細胞培養を製造するために使用することができる。HCVレプリコンおよびHCVレプリコン増強宿主は共に、細胞内でHCVレプリコンを維持する能力に関して選択することにより得ることができる。後記実施例に例示するとおり、宿主細胞およびHCVレプリコン中に存在する適応突然変異は共に、細胞内でのレプリコンの維持を補助しうる。
細胞培養系内でのHCV RNAの検出可能な複製および発現は、HCVの複製および発現の研究、HCVおよび宿主相互作用の研究、HCV RNAの製造、HCVタンパク質の製造ならびに化合物が1以上のHCV活性をモジュレーションする能力を測定するための系の提供における使用を含む多種多様な用途を有する。
HCVレプリコンと共に使用するための好ましい細胞としては、Huh−7細胞およびHuh−7誘導細胞が挙げられる。「Huh−7誘導細胞」は、Huh−7細胞から出発して1以上の表現型および/または遺伝子型修飾を導入することにより得られた細胞である。
適応突然変異
適応突然変異は、宿主細胞内でHCVレプリコンが維持され発現される能力を増強する。適応突然変異は、まず、野生型HCV RNA構築物または突然変異HCVレプリコンの使用に関して選択されうる。初期選択は、HCVレプリコンを細胞に与え、レプリコンを含有するクローンを同定することを含む。
適応突然変異は、宿主細胞内でHCVレプリコンが維持され発現される能力を増強する。適応突然変異は、まず、野生型HCV RNA構築物または突然変異HCVレプリコンの使用に関して選択されうる。初期選択は、HCVレプリコンを細胞に与え、レプリコンを含有するクローンを同定することを含む。
同定されたHCVレプリコンの核酸配列は、標準的な配列決定技術を用いて決定することができる。投入HCV構築物と選択構築物との配列比較は突然変異の位置を示す。特定の突然変異の効果は、例えば、特定の突然変異を含有するよう構築物を作製しこれらの突然変異の効果を測定することにより測定することができる。比較目的のための適当な制御構築物には、野生型構築物および既に評価されている構築物が含まれる。
適応突然変異はHCV NS3およびNS5A領域中に優先的に見出された。NS5AおよびNS5B中の2つのサイレント突然変異を除き、該NS領域中に生じるコンセンサス突然変異は該推定アミノ酸配列に対する変化を引き起こした。注目すべきことに、該アミノ酸変化は、すべて又は多数の天然HCV単離体において保存された残基において生じた。HCV配列は当技術分野においてよく知られており、例えばGenBankにおいて見出されうる。
本明細書に記載の適応突然変異は、参照配列と比較して示されうる。該参照配列は、例えばNS3もしくはNS5AのRNA、cDNAまたはアミノ酸配列中の適応突然変異の位置を与える。該配列の残部は、該参照配列と同じ又は異なる配列を有しうる機能的タンパク質をコードしている。
好ましいNS3およびNS5A適応突然変異、ならびにそのような突然変異を得るために施されうる変化の具体例を、表1および2に示す。表1および2に示すアミノ酸番号は配列番号1に基づくものである。表1および2に示すヌクレオチド番号は配列番号2に基づくものである。配列番号1は、Con1 HCV単離体(受託番号AJ238799)のアミノ酸配列を提供する。配列番号2はCon1 HCV単離体の核酸配列を提供する。
参照配列に基づき示される好ましい適応突然変異は、配列番号1のコード領域または同等配列を変化させて、示されている変化を得ることにより生成させることができる。表1および2に示す好ましい適応突然変異は、種々のHCV単離体間で保存されたアミノ酸において生じる。
適応突然変異は種々の効果を有する。いくつかの突然変異は、単独で又は他の突然変異との組合せで、HCVレプリコン活性を増強する。いくつかの場合には、2以上の突然変異が相乗効果を招き、1つの場合には、僅かに拮抗性の効果が観察された。
一旦同定された適応突然変異は、標準的な遺伝子技術を用いて出発構築物中に導入することができる。そのような技術の具体例は、Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987−1998、およびSambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989に記載されている。
適応突然変異を含有するHCVレプリコンは、本明細書に記載の1以上の適応突然変異を含有するNS3領域またはNS5A領域の周囲に構築されうる。最終的なレプリコンは、複製に必要なレプリコン成分を含有し、追加的な成分を含有しうる。
配列番号2は、以下のとおりに種々のHCV領域に関する参照点として使用することができる。
5’UTR−ヌクレオチド1−341;
コア−ヌクレオチド342−914;
E1−ヌクレオチド915−1490;
E2−ヌクレオチド1491−2579;
P7−ヌクレオチド2580−2768;
NS2−ヌクレオチド2769−3419;
NS3−ヌクレオチド3420−5312;
NS4A−ヌクレオチド5313−5474;
NS4B−ヌクレオチド5475−6257;
NS5A−ヌクレオチド6258−7598;
NS5B−ヌクレオチド7599−9371;および
3’UTR−ヌクレオチド9374−9605。
種々の構造および非構造領域のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
5’UTR−ヌクレオチド1−341;
コア−ヌクレオチド342−914;
E1−ヌクレオチド915−1490;
E2−ヌクレオチド1491−2579;
P7−ヌクレオチド2580−2768;
NS2−ヌクレオチド2769−3419;
NS3−ヌクレオチド3420−5312;
NS4A−ヌクレオチド5313−5474;
NS4B−ヌクレオチド5475−6257;
NS5A−ヌクレオチド6258−7598;
NS5B−ヌクレオチド7599−9371;および
3’UTR−ヌクレオチド9374−9605。
種々の構造および非構造領域のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
特定のアミノ酸をコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重を考慮して製造されうる。遺伝暗号の縮重は、ほとんどすべてのアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされるために生じる。特定のコドンから特定のアミノ酸への翻訳は当技術分野でよく知られている(例えば、Lewin GENES IV,p.119,Oxford University Press,1990を参照されたい)。アミノ酸は、以下のとおりにRNAコドンによりコードされる。
A=Ala=アラニン:コドンGCA、GCC、GCG、GCU。
C=Cys=システイン:コドンUGC、UGU。
D=Asp=アスパラギン酸:コドンGAC、GAU。
E=Glu=グルタミン酸:コドンGAA、GAG。
F=Phe=フェニルアラニン:コドンUUC、UUU。
G=Gly=グリシン:コドンGGA、GGC、GGG、GGU。
H=His=ヒスチジン:コドンCAC、CAU。
I=Ile=イソロイシン:コドンAUA、AUC、AUU。
K=Lys=リシン:コドンAAA、AAG。
L=Leu=ロイシン:コドンUUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU。
M=Met=メチオニン:コドンAUG。
N=Asp=アスパラギン:コドンAAC、AAU。
P=Pro=プロリン:コドンCCA、CCC、CCG、CCU。
Q=Gln=グルタミン:コドンCAA、CAG。
R=Arg=アルギニン:コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU。
S=Ser=セリン:コドンAGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU。
T=Thr=トレオニン:コドンACA、ACC、ACG、ACU。
V=Val=バリン:コドンGUA、GUC、GUG、GUU。
W=Trp=トリプトファン:コドンUGG。
Y=Tyr=チロシン:コドンUAC、UAU。
A=Ala=アラニン:コドンGCA、GCC、GCG、GCU。
C=Cys=システイン:コドンUGC、UGU。
D=Asp=アスパラギン酸:コドンGAC、GAU。
E=Glu=グルタミン酸:コドンGAA、GAG。
F=Phe=フェニルアラニン:コドンUUC、UUU。
G=Gly=グリシン:コドンGGA、GGC、GGG、GGU。
H=His=ヒスチジン:コドンCAC、CAU。
I=Ile=イソロイシン:コドンAUA、AUC、AUU。
K=Lys=リシン:コドンAAA、AAG。
L=Leu=ロイシン:コドンUUA、UUG、CUA、CUC、CUG、CUU。
M=Met=メチオニン:コドンAUG。
N=Asp=アスパラギン:コドンAAC、AAU。
P=Pro=プロリン:コドンCCA、CCC、CCG、CCU。
Q=Gln=グルタミン:コドンCAA、CAG。
R=Arg=アルギニン:コドンAGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGU。
S=Ser=セリン:コドンAGC、AGU、UCA、UCC、UCG、UCU。
T=Thr=トレオニン:コドンACA、ACC、ACG、ACU。
V=Val=バリン:コドンGUA、GUC、GUG、GUU。
W=Trp=トリプトファン:コドンUGG。
Y=Tyr=チロシン:コドンUAC、UAU。
本明細書に記載の適応突然変異の1以上を含有するサブゲノムおよびゲノムレプリコンを含む構築物はまた、追加的な突然変異を含有しうる。該追加的突然変異は、適応突然変異、およびレプリコン活性を実質的に抑制しない突然変異でありうる。レプリコン活性を実質的に抑制しない突然変異は、細胞内に導入され検出可能な活性を有しうるレプリコンを与える。
HCVレプリコン
HCVレプリコンは、完全長HCVゲノムおよびサブゲノム構築物を含む。基本HCVレプリコンは、HCV 5’UTR−PC領域、HCV NS3−NS5Bポリタンパク質コード領域およびHCV 3’UTRを含有するサブゲノム構築物である。HCV NS2、構造HCVタンパク質および非HCV配列を与える核酸領域のような他の核酸領域が存在しうる。
HCVレプリコンは、完全長HCVゲノムおよびサブゲノム構築物を含む。基本HCVレプリコンは、HCV 5’UTR−PC領域、HCV NS3−NS5Bポリタンパク質コード領域およびHCV 3’UTRを含有するサブゲノム構築物である。HCV NS2、構造HCVタンパク質および非HCV配列を与える核酸領域のような他の核酸領域が存在しうる。
該HCV 5’UTR−PC領域は、タンパク質の翻訳のための内部リボソーム進入シグナル(IRES)および複製に必要な要素を与える。該HCV 5’UTR−PC領域は、HCVコアコード領域中に約36ヌクレオチドにわたり伸長する天然に存在するHCV 5’UTR、およびその機能的誘導体を含む。該5’−UTR−PC領域は、種々の位置(例えば、選択タンパク質、レポーター、タンパク質またはHCVポリタンパク質をコードする配列の下流の部位)に存在しうる。
HCVの翻訳開始のための構造的要件を考慮して、翻訳を開始し複製を補助しうる5’−UTR−PC領域の機能的誘導体を設計することができる(例えば、Hondaら,1996.Virology 222,31−42を参照されたい)。5’−UTR−PC領域に対する種々の修飾の影響は、レプリコン活性を測定する技術を用いて測定することができる。
該HCV 5’UTR−PC領域に加えて、非HCV IRES要素も該レプリコン中に存在しうる。該非HCV IRES要素は、HCVポリタンパク質をコードする領域の直上流を含む種々の位置に存在しうる。使用しうる非HCV IRES要素の具体例としては、EMCV IRES、ポリオウイルスIRESおよびウシウイルス性下痢ウイルスIRESが挙げられる。
該HCV 3’UTRはHCVの複製を補助する。HCV 3’UTRは、天然に存在するHCV 3’UTRおよびその機能的誘導体を含む。天然に存在する3’UTRは、ポリU領域および約100ヌクレオチドの追加的領域を含む(Tanakaら,1996.J.Virol.70,3307−3312,Kolykhalovら,1996.J.Virol.70,3363−3371)。少なくともインビボでは、該3’UTRは複製に必須であるらしい(Kolykholovら,2000.J.Virol.2000 4,2046−2051)。天然に存在する3’UTR誘導体の具体例はBartenschlager,国際公開番号EP 1 043 399に記載されている。
NS3−NS5Bポリタンパク質コード領域は、細胞内で種々のタンパク質にプロセシングされうるポリタンパク質を与える。レプリコンの一部でありうる適当なNS3−NS5Bポリタンパク質配列には、NS3−NS5Bのプロセシングを引き起こして機能的複製装置を与える種々のHCV株に存在するもの及びその機能的誘導体が含まれる。適当なプロセシングは、例えばNS5B RNA依存性RNAポリメラーゼをアッセイすることにより測定することができる。
NS5Bタンパク質がRNAポリメラーゼ活性を付与する能力は、当技術分野においてよく知られた技術を用いて測定することができる(例えば、De Franscescoら,国際公開番号WO 96/37619,Behrensら,1996.EMBO 15:12−22,Lohmannら,1998.Virology 249:108−118を参照されたい)。好ましくは、該活性NS5Bの配列は、配列番号1に記載のもの又は野生型NS5B(例えば、株HCV−1、HCV−2、HCV−BK、HCV−J、HCV−N、HCV−H)と実質的に類似している。実質的に類似した配列は、検出可能なHCVポリメラーゼ活性を与え、HCV NS5Bポリメラーゼ中に存在する配列に対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個のアミノ酸改変を含有する。好ましくは、1、2、3、4または5個以下の改変が存在する。
アミノ酸配列に対する改変は置換、挿入、欠失またはそれらの組合せを与える。種々の改変の部位が、保存された及び変異可能なアミノ酸を同定するために種々のNS5Bポリメラーゼのアミノ酸配列を考慮して設計されることが可能であり、実験的に決定されうる。
HCVレプリコンは、多種多様な細胞において及びインビトロにおいて製造することができる。適当な細胞は、HCVレプリコンをコードする核酸の転写を可能にする。
追加的配列
HCVレプリコンは、HCV配列に加えて非HCV配列を含有しうる。該追加的配列は、複製および発現を妨げるものであるべきではなく、好ましくは、有用な機能を果たす。有用な機能を果たすよう使用しうる配列には、選択配列、レポーター配列、転写要素および翻訳要素が含まれる。
HCVレプリコンは、HCV配列に加えて非HCV配列を含有しうる。該追加的配列は、複製および発現を妨げるものであるべきではなく、好ましくは、有用な機能を果たす。有用な機能を果たすよう使用しうる配列には、選択配列、レポーター配列、転写要素および翻訳要素が含まれる。
選択配列
HCVレプリコン中の選択配列は、該レプリコンを含有する細胞の同定を容易にする。選択配列は、典型的には、該選択配列を含有しない細胞の増殖を抑制する何らかの選択圧と共に使用される。選択配列の具体例には、リボザイムおよび抗生物質耐性をコードする配列が含まれる。
HCVレプリコン中の選択配列は、該レプリコンを含有する細胞の同定を容易にする。選択配列は、典型的には、該選択配列を含有しない細胞の増殖を抑制する何らかの選択圧と共に使用される。選択配列の具体例には、リボザイムおよび抗生物質耐性をコードする配列が含まれる。
抗生物質耐性は、レプリコンを含有する細胞を選択するための抗生物質と共に用いることができる。抗生物質耐性を付与する選択配列の具体例としては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、ピューロマイシンまたはゼオシン(zeocin)に対する耐性をコードする配列が挙げられる。
選択配列として機能するリボザイムは、細胞増殖を妨げる抑制性核酸分子と共に使用することができる。該リボザイムは該抑制性核酸を認識し切断する。
レポーター配列
レポーター配列は、レプリコン複製またはタンパク質発現を検出するために使用することができる。好ましいレポータータンパク質は、該タンパク質により産生された産物を測定することにより存在が検出されうる酵素タンパク質である。レポータータンパク質の具体例には、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、βグルクロニダーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびその誘導体が含まれる。また、相補的核酸により標的化されうる参照配列を得るために、レポーター核酸配列を使用することができる。該相補的核酸のその標的へのハイブリダイゼーションは、標準的な技術を用いて測定することができる。
レポーター配列は、レプリコン複製またはタンパク質発現を検出するために使用することができる。好ましいレポータータンパク質は、該タンパク質により産生された産物を測定することにより存在が検出されうる酵素タンパク質である。レポータータンパク質の具体例には、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、βグルクロニダーゼ、グリーン蛍光タンパク質およびその誘導体が含まれる。また、相補的核酸により標的化されうる参照配列を得るために、レポーター核酸配列を使用することができる。該相補的核酸のその標的へのハイブリダイゼーションは、標準的な技術を用いて測定することができる。
追加的配列の配置
追加的非HCV配列は、好ましくは、HCVレプリコンゲノムまたはサブゲノムゲノム領域の5’側または3’側に位置する。しかし、該追加的配列は、該配列が検出可能なレプリコン活性を妨げない限り、HCVゲノム中に位置しうる。所望により、リボザイムと共にリボザイム認識配列を使用することにより、追加的配列は該レプリコンから分離されうる。
追加的非HCV配列は、好ましくは、HCVレプリコンゲノムまたはサブゲノムゲノム領域の5’側または3’側に位置する。しかし、該追加的配列は、該配列が検出可能なレプリコン活性を妨げない限り、HCVゲノム中に位置しうる。所望により、リボザイムと共にリボザイム認識配列を使用することにより、追加的配列は該レプリコンから分離されうる。
追加的配列は、該HCVポリタンパク質と同じシストロンの一部であることが可能であり、あるいは別々のシストロンであることが可能である。同じシストロンの一部の場合には、タンパク質をコードする選択またはレポーター配列は、キメラタンパク質として活性であるか又は細胞内で切断されてHCVタンパク質から分離される産物を与えるべきである。
タンパク質をコードする選択およびレポーター配列は、別々のシストロンとして存在する場合には、翻訳に必要な要素を伴っていなければならない。そのような要素には5’IRESが含まれる。
検出方法
レプリコン活性を検出するための方法には、レプリコンRNAおよびコード化タンパク質の産生または活性を測定する方法が含まれる。測定は定性的および定量的分析を含む。
レプリコン活性を検出するための方法には、レプリコンRNAおよびコード化タンパク質の産生または活性を測定する方法が含まれる。測定は定性的および定量的分析を含む。
RNA産生を測定するのに適した技術には、RNAの存在または活性を検出する技術が含まれる。RNAの存在は、例えば、相補的ハイブリダイゼーションプローブまたは定量的PCRを用いて検出することができる。相補的核酸間のハイブリダイゼーションの測定および定量的PCRのための技術は当技術分野においてよく知られている(例えば、Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley,1987−1998、Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989、および米国特許第5,731,148号を参照されたい)。
RNA酵素活性は、リボザイム配列を使用することにより、該レプリコンに付与することができる。リボザイム活性は、該リボザイムが標的配列を切断する能力を検出する技術を用いて測定することができる。
タンパク質産生を測定するための技術には、産生タンパク質の存在または活性を検出するための技術が含まれる。特定のタンパク質の存在は、例えば免疫学的技術により測定することができる。タンパク質活性は、HCVタンパク質またはレポータータンパク質配列の活性に基づいて測定することができる。
HCVタンパク質活性を測定するための技術は、測定するタンパク質に応じて様々である。NS2/3、NS3およびNS5Bのような種々の非構造タンパク質の活性を測定するための技術が当技術分野においてよく知られている(例えば、「背景技術」に記載の参考文献を参照されたい)。
また、レプリコン活性を測定するアッセイには、ビリオンを産生するレプリコンからのビリオンの産生を検出するアッセイ、およびそのような効果を奏するタンパク質を産生するレプリコンからの細胞変性効果を検出するアッセイが含まれる。細胞変性効果は、細胞生存性を測定するのに適したアッセイにより検出することができる。
レプリコン活性を測定するアッセイを用いて、化合物がHCV活性をモジュレーションする能力を評価することができる。そのようなアッセイは、HCVレプリコンを発現する細胞に1以上の試験化合物を与え、レプリコン活性に対する該化合物の効果を測定することにより行うことができる。2以上の化合物を含有する調製物がレプリコン活性をモジュレーションすることが判明している場合には、レプリコン活性化合物を同定するために個々の化合物またはより小さな化合物群を試験することができる。
HCV活性を抑制することが確認された化合物は、レプリコン増強細胞を得るために使用することが可能であり、治療用化合物でありうる。化合物が治療用化合物として機能しうることは、効力および毒性を測定するためのチンバンジーのようなモデル動物を使用して確認することができる。
レプリコン増強細胞
レプリコン増強細胞は、まず、HCVレプリコンを維持しうる細胞を選択し次いで該レプリコンの細胞を矯正(cure)することにより製造される。このようにして製造された細胞は、後続のHCVレプリコンのトランスフェクションの後にレプリコンを維持する能力を増強していることが判明した。
レプリコン増強細胞は、まず、HCVレプリコンを維持しうる細胞を選択し次いで該レプリコンの細胞を矯正(cure)することにより製造される。このようにして製造された細胞は、後続のHCVレプリコンのトランスフェクションの後にレプリコンを維持する能力を増強していることが判明した。
初期トランスフェクションは、野生型レプリコン、または1以上の適応突然変異を含有するレプリコンを使用して行うことができる。野生型レプリコンを使用する場合には、該レプリコンは、レプリコンの維持を促進する選択配列を含有すべきである。
細胞は、レプリコン抑制剤を使用する技術のような種々の技術を用いてレプリコンに関して矯正することができる。また、HCVレプリコンの複製は、コンフルエント細胞においては実質的に減弱する。したがって、細胞を高密度で培養することにより、レプリコンに関して細胞を矯正することが考えられる。
レプリコン抑制剤はレプリコン活性を抑制し、またはレプリコンを含有する細胞に対して選択する。そのような抑制剤の一例として、IFN−αが挙げられる。他のHCV抑制性化合物も使用することができる。HCV抑制性化合物は、例えば、Llinas−Brunetら,2000.Bioorg Med Chem.Lett.10(20),2267−2270に記載されている。
矯正された細胞がレプリコン増強細胞でありうることは、レプリコンを該細胞内に導入し後のレプリコン維持および活性の効率を測定することにより測定することができる。
(実施例)
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
本発明の種々の特徴を更に例示するために、以下に実施例を記載する。これらの実施例はまた、本発明を実施するための有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
技術
本実施例は、適応突然変異およびレプリコン増強細胞を製造し分析するために用いる技術を例示する。
本実施例は、適応突然変異およびレプリコン増強細胞を製造し分析するために用いる技術を例示する。
核酸の操作および組換えプラスミドの構築
核酸の操作は標準的なプロトコール(Sambrookら,1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)に従い行った。プラスミドDNAは、Qiagen 500カラムを製造業者の説明に従い使用してLBブロス中のON培養から調製した。
核酸の操作は標準的なプロトコール(Sambrookら,1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)に従い行った。プラスミドDNAは、Qiagen 500カラムを製造業者の説明に従い使用してLBブロス中のON培養から調製した。
所望の突然変異を含有するプラスミドは、突然変異に隣接する制限部位を使用する制限消化により、または適当な配列を有する合成オリゴヌクレオチドを使用する関心領域のPCR増幅により構築した。該突然変異を該PCRプライマー中に挿入することにより、部位特異的突然変異誘発を行った。高忠実度熱安定ポリメラーゼを使用して、または校正(プルーフリーディング)酵素を含有するポリメラーゼの混合物を使用して(Barnesら,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.91,2216−2220)、PCR増幅を行った。すべてのプラスミドは制限マッピングおよび配列決定により確認した。
pHCVneo17.wtは、Bartenschlagerにより記載されているレプリコンI377neo/NS3−3’/wtと同じHCVビシストロンレプリコンのcDNA(配列番号3)を含有する(Lohmannら,1999.Science 285,110−113,EMBL−genbank番号AJ242652)。該プラスミドは以下の要素を含む:HCV−IRESと該コアの一部とを含むHCVの5’非翻訳領域(nt1−377);ネオマイシンホスホトランスフェラーゼコード配列;およびEMCV IRES;NS3からNS5BまでのHCVコード配列;HCVの3’UTR。
NS5Bポリメラーゼの触媒アスパラギン酸(HCVポリタンパク質のアミノ酸2737および2738)をコードするGACトリプレット(pHCVNeo17配列のnt.6934−6939)が、アラニンをコードするGCGに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.GAAはpHCVNeo.17と同じである。
NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2204)をコードするトリプレットAGC(pHCVNeo17配列のnt.5335−5337)が、アルギニンをコードするAGAに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m0はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のアスパラギン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2041)をコードするトリプレットAAC(pHCVNeo17配列のnt.4846−4848)が、トレオニンをコードするACCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m1はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2173)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5242−5244)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m2はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2197)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5314−5316)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m3はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のロイシン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2198)をコードするトリプレットTTG(pHCVNeo17配列のnt.5317−5319)が、セリンをコードするTCGに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m4はpHCVNeo17と同じである。
リシンをコードする追加的なトリプレットAAAが、バリン2039をコードするトリプレットGTG(pHCVNeo17配列のnt.4840−4843)に変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m5はpHCVNeo17と同じである。
NS3タンパク質のグルタミン酸およびアラニン(HCVポリタンパク質のアミノ酸1202および1347)をコードするトリプレットGAAおよびGCC(pHCVNeo17配列のnt.2329−2331および2764−2766)が、それぞれグリシンおよびトレオニンをコードするGGAおよびACCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m6はpHCVNeo17と同じである。NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2173)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5242−5244)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化しており、EMCV IRES中(該レプリコン配列のチミジン1736の後)に追加的なアデノシンが挿入されている。
NS5Aタンパク質のアスパラギン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2041)をコードするトリプレットAAC(pHCVNeo17配列のnt.4846−4848)が、トレオニンをコードするACCに変化しており、NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2173)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5242−5244)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m7はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のアスパラギン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2041)をコードするトリプレットAAC(pHCVNeo17配列のnt.4846−4848)が、トレオニンをコードするACCに変化しており、NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2197)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5314−5316)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m8はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のアスパラギン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2041)をコードするトリプレットAAC(pHCVNeo17配列のnt.4846−4848)が、トレオニンをコードするACCに変化しており、NS5Aタンパク質のロイシン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2198)をコードするトリプレットTTG(pHCVNeo17配列のnt.5317−5319)が、セリンをコードするTCGに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m9はpHCVNeo17と同じである。
NS3タンパク質のグルタミン酸(HCVポリタンパク質のアミノ酸1202)をコードするトリプレットGAA(pHCVNeo17配列のnt.2329−2331)が、グリシンをコードするGGAに変化しており、リシンをコードする追加的なトリプレットAAAが、HCVポリタンパク質のバリン2039をコードするトリプレットGTG(pHCVNeo17配列のnt.4840−4843)の後に挿入されている以外は、プラスミドpHCVNeo17.m10はpHCVNeo17と同じである。
NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2197)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5314−5316)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m11はpHCVNeo17と同じである。NS5Aタンパク質のアラニン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2199)をコードするトリプレットGCC(pHCVNeo17配列のnt.5320−5322)は、トレオニンをコードするACCに変化している。
NS5Aタンパク質のアスパラギン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2041)をコードするトリプレットAAC(pHCVNeo17配列のnt.4846−4848)が、トレオニンをコードするACCに変化しており、NS5Aタンパク質のセリン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2197)をコードするトリプレットTCC(pHCVNeo17配列のnt.5314−5316)が、フェニルアラニンをコードするTTCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m12はpHCVNeo17と同じである。NS5Aタンパク質のアラニン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2199)をコードするトリプレットGCC(pHCVNeo17配列のnt.5320−5322)は、トレオニンをコードするACCに変化している。
プラスミドpHCVNeo17.m13は、EMCV IRES中(該レプリコン配列のチミジン1736の後)に追加的なアデノシンが挿入されている以外はpHCVNeo17.m8と同じ突然変異を有する。
プラスミドpHCVNeo17.m14は、EMCV IRES中(該レプリコン配列のチミジン1736の後)に追加的なアデノシンが挿入されている以外はpHCVNeo17.m11と同じ突然変異を有する。
NS5Aタンパク質のアラニン(HCVポリタンパク質のアミノ酸2199)をコードするトリプレットGCC(pHCVNeo17配列のnt.5320−5322)が、トレオニンをコードするACCに変化している以外は、プラスミドpHCVNeo17.m15はpHCVNeo17と同じである。
プラスミドpRBSEAP.5は、pBC12/RSV/SEAPプラスミド(Bergerら,1988.Gene 66.1−10)のヌクレオチド90−1580に対応するヒト胎盤アルカリホスファターゼをコードする配列でNeoコード配列が置換されたpHCVNeo.17誘導体である。
RNAトランスフェクション
トランスフェクションは、Huh−7細胞を使用して行った。該細胞を、10% FCSで補足されたダルベッコ変法最少必須培地(DMEM,Gibco,BRL)中で増殖させた。通常の研究には、1×トリプシン/EDTA(Gibco,BRL)を使用して、週2回、細胞を1〜5継代した。
トランスフェクションは、Huh−7細胞を使用して行った。該細胞を、10% FCSで補足されたダルベッコ変法最少必須培地(DMEM,Gibco,BRL)中で増殖させた。通常の研究には、1×トリプシン/EDTA(Gibco,BRL)を使用して、週2回、細胞を1〜5継代した。
プラスミドをScaIエンドヌクレアーゼ(New England Biolabs)で消化し、T7 Megascriptキット(Ambion)でインビトロで転写した。転写混合物をDNアーゼI(0.1U/ml)で37℃で30分間処理して鋳型DNAを完全に除去し、Chomczynski(Chomczynskiら,1987.Anal.Biochem.162,156−159)の方法に従い抽出し、RNアーゼを含有しないリン酸緩衝食塩水(rfPBS,Sambrookら,1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.)に再懸濁させた。
RNAトランスフェクションは、Liljestromら,1991.J.Virol.6,4107−4113に記載の方法を若干修飾した方法で行った。サブコンフルエントな活発に増殖している細胞を、トリプシン/EDTAを使用して該組織培養容器から解離させた。3〜10容積のDMEM/10% FCSの添加によりトリプシンを中和し、細胞を、Haereus卓上遠心機中、4℃、1200rpmで5分間遠心分離した。細胞を穏やかなピペッティングにより氷冷rfPBSに再懸濁させ、血球計算器で計数し、前記のとおりに遠心分離した。rfPBS洗浄を1回繰返し、細胞をrfPBS中で1〜2×107細胞/mlの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコートを無菌エッペンドルフチューブ中でRNAと混合した。該RNA/細胞混合物を直ちにエレクトロポレーションキュベット(氷上で予冷されたもの)中に移し、パルスコントローラー(Biorad)を備えた遺伝子パルサー装置で2回パルスした。該実験に応じて、0.1、0.2または0.4cm電極間隙キュベットを使用し、設定を調節した(表3)。
電気ショックの後、細胞を室温で1〜10分間(実質的には、すべてのサンプルをエレクトロポレーションするのに要する時間)放置し、ついで少なくとも20容積のDMEM/10% FCSで希釈し、該実験の必要に応じてプレーティングした。硫酸ネオマイシン(G418)の不存在下および存在下で種々の日数にわたり培養した細胞によるニュートラルレッドの取込みを測定することにより、生存およびトランスフェクション効率をモニターした。これらのパラメーターでは、Huh−7細胞の生存は通常40〜60%であり、トランスフェクション効率は40%〜100の範囲であった。
レプリコンRNAの配列分析
HCVNeo.17RNAで行った3つの異なるトランスフェクション実験から全NS領域を再クローニングした。Qiagen RNAeasyミニキットを製造業者の説明に従い使用して又はChomczynskiら,1987.Anal.Biochem.162,156−159に記載されているとおりに、選択したクローンからRNAを抽出した。
HCVNeo.17RNAで行った3つの異なるトランスフェクション実験から全NS領域を再クローニングした。Qiagen RNAeasyミニキットを製造業者の説明に従い使用して又はChomczynskiら,1987.Anal.Biochem.162,156−159に記載されているとおりに、選択したクローンからRNAを抽出した。
レプリコンRNA(5μgの全細胞RNA)を、オリゴヌクレオチドHCVG34(5’−ACATGATCTGCAGAGAGGCCAGT−3’;配列番号4)およびSuperscriptII逆転写酵素(Gibco,BRL)を製造業者の説明に従い使用して逆転写し、ついで2U/ml Ribonuclease H(Gibco BRL)で消化した。EMCV IRESからHCV 3’末端までに伸長するcDNA領域を、HCVG39(5’−GACASGCTGTGATAWATGTCTCCCCC−3’;配列番号5)およびCITE3(5’−TGGCTCTCCTCAAGCGTATTC−3’;配列番号6)ならびにLa Taq DNAポリメラーゼ(Takara LA Taq)を使用するPCRにより増幅した。
増幅したcDNAをKpnIエンドヌクレアーゼ(New England Biolabs)で消化し、5.8kbの断片をゲル精製し、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を製造業者の説明に従い使用して5.6kbのベクター断片(KpnIで消化したプラスミドpRBSRAP.5から精製したもの)に連結した。連結したDNAを、大腸菌(E.coli)のDH10BまたはJM119株におけるエレクトロポレーションにより形質転換した。
NS5A領域の場合には、3つのクローン(HB77、HB60およびHB68)から単離した全RNAを抽出し、RT−PCRに使用した。5μgの全RNA+20pmolのAS61オリゴ(5’−ACTCTCTGCAGTCAAGCGGCTCA−3’,RTアンチセンスオリゴ;配列番号7)を95℃で5分間加熱し、ついでDMSO(5% f.c.)、DTT(10mM f.c.)、1mM dNTP(1mM f.c.)、1×Superscriptバッファー(1×f.c.)および10u Superscript(Gibco)を20μlの総容積まで加え、42℃で3時間インキュベートした。2μlのこのRT反応を使用して、Elongase Enzyme Mix(Gibco)を該製造業者により提供された説明書に従い使用してオリゴS39(5’−CAGTGGATGAACCGGCTGATA−3’;センス;配列番号8)またはS41(5’−GGGGCGACGGCATCATGCAAACC−3’;センス;配列番号9)およびB43(5’−CAGGACCTGCAGTCTGTCAAAGG−3’;アンチセンス;配列番号10)でPCRを行った。得られたPCR断片を、TA Cloningキット(Invitrogen)を使用してpCR2.1ベクター中にクローニングし、Top10F’細菌株中に形質転換した。
Qiagen 500カラムを製造業者の説明に従い使用して、得られたアンピシリン耐性コロニーのON培養からプラスミドDNAを調製した。所望のDNAインサートの存在を制限消化により確認し、各プラスミドのヌクレオチド配列を自動配列決定により決定した。ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、GCGソフトウェアを使用して整列させた。
TaqMan
TaqMan分析は、典型的には、HCV特異的オリゴ/プローブ(オリゴ1:5’−CGGGAGAGCCATAGTGG−3’;配列番号11、オリゴ2:5’−AGTACCACAAGGCCTTTCG−3’;配列番号12、プローブ:5’−CTGCGGAACCGGTGAGTACAC−3’;配列番号13)またはヒトGAPDH特異的オリゴ/プローブ(Pre−Developed TaqMan Assay Reagents,Endogenous Control Human GAPDH,Part Number 4310884E,Perkin Elmer Biosystems)と共に10ngのRNAを反応混合物(TaqMan Gold RT−PCRキット,Perkin Elmer Biosystems)中で使用して行った。PCRは、Perkin Elmer ABI PRISM 7700を以下の条件下で使用して行った:48℃で30分間(RT工程)、95℃で10分間ならびに40サイクル:95℃で15秒間および60℃で1分間。定量的計算を、GAPDH mRNAのレベルを一定とみなしてComparative CT Method(User Bulletin #2 ABI PRIM 7700 Sequence Detection Systems,Applied Biosystem,1997年12月に記載されている)を使用して行った。HCV RNAのすべての計算は、特異的対照に対する倍率相違として表されている。
TaqMan分析は、典型的には、HCV特異的オリゴ/プローブ(オリゴ1:5’−CGGGAGAGCCATAGTGG−3’;配列番号11、オリゴ2:5’−AGTACCACAAGGCCTTTCG−3’;配列番号12、プローブ:5’−CTGCGGAACCGGTGAGTACAC−3’;配列番号13)またはヒトGAPDH特異的オリゴ/プローブ(Pre−Developed TaqMan Assay Reagents,Endogenous Control Human GAPDH,Part Number 4310884E,Perkin Elmer Biosystems)と共に10ngのRNAを反応混合物(TaqMan Gold RT−PCRキット,Perkin Elmer Biosystems)中で使用して行った。PCRは、Perkin Elmer ABI PRISM 7700を以下の条件下で使用して行った:48℃で30分間(RT工程)、95℃で10分間ならびに40サイクル:95℃で15秒間および60℃で1分間。定量的計算を、GAPDH mRNAのレベルを一定とみなしてComparative CT Method(User Bulletin #2 ABI PRIM 7700 Sequence Detection Systems,Applied Biosystem,1997年12月に記載されている)を使用して行った。HCV RNAのすべての計算は、特異的対照に対する倍率相違として表されている。
抗体および免疫学的技術
マウスモノクローナル抗体(抗NS3 mab10E5/24)を標準的な技術(GalfreおよびMilstein,1981.Methods in Enzymology 73,1−46)により製造した。精製された組換えタンパク質を免疫原として使用した(Gallinariら,1999.Biochemistry 38,5620−5632)。
マウスモノクローナル抗体(抗NS3 mab10E5/24)を標準的な技術(GalfreおよびMilstein,1981.Methods in Enzymology 73,1−46)により製造した。精製された組換えタンパク質を免疫原として使用した(Gallinariら,1999.Biochemistry 38,5620−5632)。
Cell−ELISA分析では、抗NS3 mab 10E5/24でのELISAにより、NS3タンパク質の発現に関してトランスフェクト化細胞をモニターした。細胞を、40,000、30,000、15,00および10,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート中に播き、氷冷イソプロパノールで固定した(トランスフェクションのそれぞれ1、2、3および4日後に行った)。該細胞をPBSで2回洗浄し、PBS+0.1% Triton X100+0.02% SDS(PBSTS)中の5% 脱脂乾燥乳でブロッキングし、ついで、乳(Milk)/PBSTS中で1:2000希釈された10E5/24mabと共に4℃で一晩インキュベートした。PBSTSで5回洗浄した後、乳/PBSTS中で1:2000希釈された抗マウスIgG Fc特異的アルカリホスファターゼ共役二次抗体(Sigma A−7473)と共に該細胞を室温で3時間インキュベートした。前記のとおりに再び洗浄した後、該反応をp−フェニルホスファート二ナトリウム基質(Sigma 104−105)で現像し、405nmでの吸光度を時折測定した。
該結果をスルホローダミンB(SRB Sigma S 1402)での染色により正規化して、細胞数を求めた。該アルカリホスファターゼ基質を該ウェルから除去し、該細胞をPBSで洗浄した。ついで該プレートを1% 酢酸中の0.4% SRBと共に30分間インキュベートし(200μl/ウェル)、1% 酢酸で4回リンスし、ブロッティングして乾燥させ、ついで200μl/ウェルの10mM Tris(pH10.5)を加えた。混合後、570nmでの吸光度を測定した。
フォーカスのニュートラルレッド/クリスタルバイオレット染色
G418の不存在下または存在下でのトランスフェクト化細胞の生存を、フォーカス/クローンのニュートラルレッドでのインビボ染色およびそれに続く/クリスタルバイオレット染色によりモニターした。該培地を該細胞から除去し、0.0025% ニュートラルレッド(Sigma N2889)を含有する新鮮培地と交換し、該細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、3.5% ホルムアルデヒド中で15分間固定し、再びPBS中で2回、ついで蒸留水で洗浄し、(生きた)フォーカスの数を計数した。ついで、20% メタノール中の0.1% クリスタルバイオレット(Sigma C0775)溶液と共に室温で20分間インキュベートし、ついで20% メタノール中で3回洗浄し、蒸留水で洗浄することにより、該細胞はクリスタルバイオレットで再染色されることが可能であった。
G418の不存在下または存在下でのトランスフェクト化細胞の生存を、フォーカス/クローンのニュートラルレッドでのインビボ染色およびそれに続く/クリスタルバイオレット染色によりモニターした。該培地を該細胞から除去し、0.0025% ニュートラルレッド(Sigma N2889)を含有する新鮮培地と交換し、該細胞を37℃で3時間インキュベートした。細胞をPBSで2回洗浄し、3.5% ホルムアルデヒド中で15分間固定し、再びPBS中で2回、ついで蒸留水で洗浄し、(生きた)フォーカスの数を計数した。ついで、20% メタノール中の0.1% クリスタルバイオレット(Sigma C0775)溶液と共に室温で20分間インキュベートし、ついで20% メタノール中で3回洗浄し、蒸留水で洗浄することにより、該細胞はクリスタルバイオレットで再染色されることが可能であった。
内因性レプリコンに関して矯正された細胞の調製
10IFNおよびCl.60/cuと称されるレプリコン増強細胞を、種々のHCV抑制剤を使用して製造した。本明細書に記載の技術に基づき、更なるレプリコン増強クローンが容易に入手されうる。
10IFNおよびCl.60/cuと称されるレプリコン増強細胞を、種々のHCV抑制剤を使用して製造した。本明細書に記載の技術に基づき、更なるレプリコン増強クローンが容易に入手されうる。
10IFNは、ヒトIFN−α2bを使用してHuh−7細胞をレプリコンに関して矯正することにより得た。HCVレプリコンを含有するHuh−7細胞(HBI10,HBIII4,HBIII27およびHBIII18と称される)を、100U/ml 組換えヒトIFN−α2b(Intron−A,Schering−Plough)の存在下で11日間培養し、ついでIFN−α2bの不存在下で4日間培養した。この期間のいくつかの時点で、該クローンをHCVタンパク質およびRNAの存在に関してウエスタンおよびノーザンブロット法により分析した。IFN−α2bと共に7日間インキュベートした後、HCVタンパク質は、もはや、これらのクローンのいずれにおいてもウエスタンブロット法により検出不可能であり、ノーザンブロットにおいてRNAシグナルで同様の効果が認められた。IFN−α2b処理細胞を、トランスフェクション実験に使用するまで液体窒素中で保存した。
Cl.60/cuは、HCV抑制化合物を使用してレプリコンに関してHuh−7細胞を矯正することにより得た。第4、9、12および15日にPCR(TaqMan)を用いてHCV RNAの存在を判定した。第9日から、HCV RNAの量は検出限界未満であった。該レプリコンの消失を更に試験するために、400万細胞の矯正クローン60細胞(15日間の処理の後)を1mg/ml G−418の存在下でプレーティングした。生存可能な細胞は観察されなかった。このことは、G−418耐性を付与しうるHCVレプリコンが存在しないことを証明している。
機能的HCVレプリコンを含有する細胞クローンの選択および特徴づけ
Huh−細胞(2〜8×106個)を、インビトロ転写レプリコンRNA(10〜20μg)でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、2.5×103〜10×103/cm2の範囲の密度でプレーティングし、0.8〜1mg/ml G418の存在下で培養した。レプリコンでトランスフェクトされた細胞の大多数はG418に対して一過性に耐性となり、該薬物の存在下で通常7〜12日間で倍加し、一方、無関係なRNAでトランスフェクトされた細胞および模擬トランスフェクト化細胞は7日間より長くは生存しなかった(データは示していない)。G418に対する一過性の耐性は、該トランスフェクト化RNAから発現されたNeoタンパク質の維持によると考えられた。なぜなら、それは、複製不可能な突然変異レプリコンでも観察されたからである。トランスフェクションの約2週間後、一過性の耐性は減弱し、ほとんどの細胞は死に、HCVNeo.17 RNAでトランスフェクトされたサンプルにおいては、該抗生物質に対して永久的に耐性である細胞の小さなコロニーが認められたが、他のレプリコンRNAでトランスフェクトされた細胞では認められなかった。
Huh−細胞(2〜8×106個)を、インビトロ転写レプリコンRNA(10〜20μg)でエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、2.5×103〜10×103/cm2の範囲の密度でプレーティングし、0.8〜1mg/ml G418の存在下で培養した。レプリコンでトランスフェクトされた細胞の大多数はG418に対して一過性に耐性となり、該薬物の存在下で通常7〜12日間で倍加し、一方、無関係なRNAでトランスフェクトされた細胞および模擬トランスフェクト化細胞は7日間より長くは生存しなかった(データは示していない)。G418に対する一過性の耐性は、該トランスフェクト化RNAから発現されたNeoタンパク質の維持によると考えられた。なぜなら、それは、複製不可能な突然変異レプリコンでも観察されたからである。トランスフェクションの約2週間後、一過性の耐性は減弱し、ほとんどの細胞は死に、HCVNeo.17 RNAでトランスフェクトされたサンプルにおいては、該抗生物質に対して永久的に耐性である細胞の小さなコロニーが認められたが、他のレプリコンRNAでトランスフェクトされた細胞では認められなかった。
いくつかの実験においては、G418耐性コロニーの頻度は10〜100コロニー/106トランスフェクト化細胞であった。約20個のG418耐性コロニーを単離し、増殖させ、分子的に特徴づけた。核酸のPCRおよびRT−PCR分析は、すべてのクローンがHCV RNAを含有するがHCV DNAを含有しないことを示し、このことは、G418耐性が機能的レプリコンの存在によるものであったことを示している(データは示していない)。この結果は、ノーザンブロット分析および3H−ウリジンでの代謝標識により確認され、これらは、予想サイズのゲノムHCV RNAおよびアンチゲノムHCV RNAの両方の存在を示した(データは示していない)。最後に、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光実験は、これらのクローンがすべてのHCV非構造タンパク質およびNeoタンパク質を発現することを示した(データは示していない)。
クローンは細胞形態および増殖速度の点で異なっていた。レプリコンRNAコピー数(500〜10000分子/細胞)およびウイルスタンパク質発現もクローンによって様々であった(データは示していない)。しかし、レプリコンRNAおよびタンパク質の量は、継代および培養条件によっても様々であり、細胞をコンフルエントに到達させなかった場合には、より高く、このことは、レプリコンが、分裂中の細胞においては静止細胞の場合より効率的に複製されることを示唆している。ウイルスポリタンパク質のプロセシングは、トランスフェクト化細胞において認められたのと同様の速度論で生じた。
興味深いことに、すべての試験クローンにおいて、HCVの複製は、該細胞をIFN−α2bで処理することにより効率的に抑制された。該EC50は、該クローンに応じて1〜10U/mlであった。
適応突然変異の同定
HCVNeo.17 RNAトランスフェクションに由来するG418耐性クローンが少数であったことは、該レプリコンを該宿主細胞に適応させうる突然変異(適応突然変異)が複製に必要でありうること、および/または、小さな割合のHuh−7細胞しか、HCVの複製に適合しないことを示唆した。その第1の仮定を証明するために、選択した細胞クローンに由来するレプリコンRNA中の突然変異を同定した。
HCVNeo.17 RNAトランスフェクションに由来するG418耐性クローンが少数であったことは、該レプリコンを該宿主細胞に適応させうる突然変異(適応突然変異)が複製に必要でありうること、および/または、小さな割合のHuh−7細胞しか、HCVの複製に適合しないことを示唆した。その第1の仮定を証明するために、選択した細胞クローンに由来するレプリコンRNA中の突然変異を同定した。
種々のレプリコンのRNA配列を、標準的な技術を用いて決定した。そのような技術は、いくつかの独立したクローンからのRNAの単離、逆転写によるcDNAの産生、PCRによるcDNAの増幅および適当なベクター中へのクローニングを含むものであった。5つのクローン(HBI10、HBIII12、HBIII18、HBIII27、HBIV1)からのほぼ全てのHCV NS領域(EMCV IRESの3’末端における126bpおよびHCV NS領域の5650bp(すなわち、3’末端における298ヌクレオチドおよび全NS ORFおよび))に伸長するcDNAを再クローニングし配列決定した。また、3つの更なるクローン(HB77、HB68およびHB60)からのNS5Aコード領域(nt.4784−6162)を再クローニングし配列決定した。
レプリコンRNA中に存在する突然変異を、該クローニング法に由来するものから区別するために、独立したRT−PCR実験に由来する少なくとも2つの単離物を各細胞クローンに関して配列決定した。該ヌクレオチド配列と該親配列との比較は、各単離物がいくつかの突然変異を含有することを示した(表4Aおよび4B)。
突然変異の頻度は1.7×10−3〜4.5×10−3(平均3×10−3)であった。1以上のヌクレオチドの挿入も観察されたが、突然変異の大多数はヌクレオチド置換であった(表4Aおよび4B)。
1つの単離物のみにおいて見出された突然変異(非コンセンサス)の約85%は、再クローン化断片中にランダムに分布しており、おそらく、PCR増幅中の過誤取込みを含むであろう。逆に、該突然変異の残り(15%)は、独立したRT−PCR実験に由来する2以上の単離物において共通であり(コンセンサス突然変異)、おそらく、鋳型RNA中に存在する突然変異を反映するものであろう。
コンセンサス突然変異はすべての単離物において見出され、同じクローンに由来する単離物に共通(コンセンサスA)であるか又は異なるクローンに由来する単離物に共通(コンセンサスB)であった。同じ細胞クローンに由来する追加的単離物の分析は、コンセンサスA突然変異が、1つのクローンに由来するすべての単離物に必ずしも存在するわけではないことを示した(データは示していない)。この観察は、コンセンサスB突然変異の存在と共に、単一細胞クローンにおいてさえも、種々の配列を有する分子の準種(クエザイスペーシス)としてレプリコンが存在することを示唆している。
非コンセンサス突然変異とは異なり、コンセンサス突然変異はランダムには分布していなかったが、NS5Aタンパク質(頻度1×10−3)およびNS3タンパク質(頻度0.5×10−3)をコードする領域中に密集していた。NS5Bタンパク質をコードする領域中には1つのコンセンサス突然変異のみが見出され(頻度0.1×10−3ヌクレオチド)、NS4AおよびNS4Bをコードする領域中には全く見出されなかった。興味深いことに、EMCV IRES中にも1つのコンセンサス突然変異が認められた。
NS5AおよびNS5B中で見出された2つのサイレント突然変異を除き、NS領域中に存在するコンセンサス突然変異は推定アミノ酸配列における変化を引き起こした(表5Aおよび5B)。注目すべきことに、これらのアミノ酸の変化は、すべて又はほとんどの天然HCV単離物において保存された残基において生じた。興味深いことに、クローンHB77およびHB60は、同じアミノ酸突然変異(S2204R)を引き起こす異なるヌクレオチド置換(それぞれC5337AおよびC5337G)を示した。
コンセンサス突然変異の機能的特徴づけ
再クローン化レプリコンにおけるコンセンサス突然変異の同定は、選択した細胞クローンに含有されるレプリコンRNAの複製能がそのような突然変異の存在に左右されることを示した。この仮定を証明するために、レプリコンに対するいくつかのコンセンサス突然変異の効果を分析した。
再クローン化レプリコンにおけるコンセンサス突然変異の同定は、選択した細胞クローンに含有されるレプリコンRNAの複製能がそのような突然変異の存在に左右されることを示した。この仮定を証明するために、レプリコンに対するいくつかのコンセンサス突然変異の効果を分析した。
NS5A領域中に見出されたコンセンサス突然変異を、より詳細に分析した。コンセンサス突然変異を非コンセンサス突然変異から分離し、単一または複数のコンセンサス突然変異を含有するpHCVNeo.17誘導体を構築した(表6)。
これらの構築物からインビトロで転写されたRNAをHuh−7細胞内にトランスフェクトし、ネオマイシン耐性コロニー(G418 cfu)を計数することにより複製に対する影響を推定した。表6に示すとおり、単一コンセンサス突然変異を含有する1つの構築物を除くすべてはG418 cfu効率における有意な増加を示し、したがって、このことは、対応する突然変異が複製を改善したことを示している。注目すべきことに、NS5A中に単一突然変異を含有する2つの突然変異体(m3およびm15)は、明らかに、すべての他の単一突然変異体より効率的であった。2以上の突然変異を含有する突然変異体の結果は、いくつかの組合せ(m8、m9、m11および恐らくm10)における相乗効果の存在を示したが、1つの突然変異体(m7)においては僅かに拮抗性の効果をも示した。
選択の不存在下でのレプリコンの複製
G418選択の不存在下でのHCVレプリコンの複製を、定量的PCR(TaqMan)を用いて検出した。トランスフェクションの24時間後、NS5Bポリメラーゼの触媒性GDDモチーフ中に突然変異を含有するGAA対照レプリコンを含むすべてのレプリコンでトランスフェクトされた細胞において、多量のレプリコンRNAが検出された。この結果は、非常に初期の時点(トランスフェクションの24時間後まで)の分析が実質的には投入RNAを測定していることを示唆した。ノーザンブロット分析はまた、24時間後に、該トランスフェクト化RNAの大多数が細胞内で分解することを示した(データは示していない)。
G418選択の不存在下でのHCVレプリコンの複製を、定量的PCR(TaqMan)を用いて検出した。トランスフェクションの24時間後、NS5Bポリメラーゼの触媒性GDDモチーフ中に突然変異を含有するGAA対照レプリコンを含むすべてのレプリコンでトランスフェクトされた細胞において、多量のレプリコンRNAが検出された。この結果は、非常に初期の時点(トランスフェクションの24時間後まで)の分析が実質的には投入RNAを測定していることを示唆した。ノーザンブロット分析はまた、24時間後に、該トランスフェクト化RNAの大多数が細胞内で分解することを示した(データは示していない)。
後の時点における分析は、レプリコンHCVNeo17.wtでトランスフェクトされた細胞においては、レプリコンRNAの量が第4日には相当に減少し、最終的には検出不可能になるが(6/8日)、レプリコンm0、m3およびm15でトランスフェクトされた細胞においては高いままであることを示した(表7)。第6日には、レプリコンRNAの量は、レプリコンHCVNeo17.wt、m0およびm2でトランスフェクトされた細胞においては検出不可能になったが、レプリコンm3およびm15でトランスフェクトされた細胞においては検出可能であった(表7)。
m0、m3およびm15レプリコンRNAの維持は、インターフェロンαまたはHCV抑制性化合物での処理により阻止された(データは示していない)。さらに、RNAの維持は、適応突然変異以外にNS5B GAA突然変異を保持する突然変異レプリコンでは観察されなかった(データは示していない)。総合すると、これらの結果は、定量的PCRが、トランスフェクション後の初期の時点で複製をモニターするために利用可能であり、突然変異を含有するレプリコンRNAの複製能を評価するために利用可能であることを示している。
表6および7に示す結果の比較は、TaqManにより検出されるレプリコンRNAの量とG418 cfu効率との間に良好な相関が存在することを示した。しかし、いくつかの突然変異体(m2、m3)は、G418 cfu効率に対する顕著な効果、およびTaqMan PCRにより測定される初期複製に対する有ったとしても僅かな効果を示し、一方、他の突然変異体(m0)は逆の挙動を示した。
HCVレプリコン増強細胞
HCVレプリコンを宿主中に導入し、ついで該宿主を該レプリコンに関して矯正することにより、HCVレプリコン増強細胞を製造した。適応突然変異(またはそれらの組合せ)自体は、G418 cfu効率を2桁までも増加させ、初期複製を同等に増強した。しかし、最も効果的な突然変異体においてさえも、小さな割合のトランスフェクト化細胞(<5%、データは示していない)しか、機能的レプリコンを含有するG418耐性クローンを与えなかった。この観察は、少なくとも部分的には、Huh−7細胞の低いクローニング効率に帰され(データは示していない)、一部のHuh−7細胞が複製に適合したに過ぎなかった。
HCVレプリコンを宿主中に導入し、ついで該宿主を該レプリコンに関して矯正することにより、HCVレプリコン増強細胞を製造した。適応突然変異(またはそれらの組合せ)自体は、G418 cfu効率を2桁までも増加させ、初期複製を同等に増強した。しかし、最も効果的な突然変異体においてさえも、小さな割合のトランスフェクト化細胞(<5%、データは示していない)しか、機能的レプリコンを含有するG418耐性クローンを与えなかった。この観察は、少なくとも部分的には、Huh−7細胞の低いクローニング効率に帰され(データは示していない)、一部のHuh−7細胞が複製に適合したに過ぎなかった。
いくつかのクローンを、それらをIFN−αまたはHCV抑制性化合物で約2週間にわたり処理することにより、内因性レプリコンに関して矯正した。該処理の終了時における分析は、ウイルスタンパク質もレプリコンRNAも検出不可能であることを示した。
矯正細胞(10IFNおよびCl.60/cu)を突然変異レプリコンでトランスフェクトし、複製効率をネオマイシン耐性クローンの計数により(10IFN)またはTaqManにより(10IFNおよびCl.60/cu)測定した。表8に示すとおり、すべての試験レプリコンに関して、10IFN細胞におけるG418 cfu効率は親Huh−7細胞の場合より少なくとも5倍高かった。G418 cfu効率におけるこの増加は、特に、突然変異体(m3、m5、m8、m9、m15)のサブセットに関連していた。
顕著だったのは、最良の突然変異体が、G418の不存在下で増殖した細胞クローンの20〜80%の範囲の多数のG418耐性クローンを与えたことであり(データは示していない)、このことは、10IFN細胞の大多数が複製に適合したことを示している。この結果は、TaqMan分析により確認され(表9)、この場合、親Huh−7細胞に対する増加倍率は非常に高かった。該データは、適応突然変異を保持するレプリコンが、10IFNおよびCl.60/cuのようなレプリコン増強細胞内で活発に複製されることを示している。
96ウェルマイクロタイタープレート中にプレーティングされたトランスフェクト化細胞においてNS3タンパク質を検出するよう設計されたELISAアッセイ(Cell−ELISA)を用いて、レプリコン増強細胞においてウイルスタンパク質の発現を測定した。表10に示すとおり、トランスフェクションの24時間後、すべての試験レプリコンでトランスフェクトされた細胞は、低いが検出可能なレベルのNS3タンパク質を発現した。
表10に示されている初期発現は、トランスフェクトされたRNAの翻訳によるものであるらしい。なぜなら、それはすべてのレプリコン(GAA突然変異を保持するレプリコンを含む)において比較しうるものであり、IFN−αにより影響されなかったからである。トランスフェクションの4日後、NS3発現は、コンセンサス突然変異を保持するレプリコンでトランスフェクトされた細胞においては持続し増加したが、wtおよびGAAレプリコンでトランスフェクトされた細胞においてはもはや検出することができなかった。また、細胞をIFN−αの存在下で培養した場合には、NS3発現はほぼ完全に阻止された。
総合すると、これらの結果は、N3発現のレベルが複製率を反映することを示した。実際のところ、NS3発現レベル(表10)は、TaqManにより測定したRNAレベル(表9)と釣り合った。10IFN細胞の高い複製能は更に免疫蛍光実験により確認され、それは、レプリコンm8およびm11でトランスフェクトされた細胞の50%以上が高レベルのウイルスタンパク質を発現すること、および発現がIFN−αによりほぼ完全に阻止されることを示した。
完全長構築物の複製
本実施例は、本明細書に記載の適応突然変異を含有する完全長HCVゲノムがレプリコン増強宿主細胞内で複製される能力を例示する。HCV単離物Con−1(EMBL−Genbank No.AJ238799)(プラスミドpHCVRBFL.wt)ならびにN2041TおよびS2173F突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m8)またはS2197FおよびA2199T突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m11)を含有する2つの誘導体の完全長配列を、出発構築物として使用した。
本実施例は、本明細書に記載の適応突然変異を含有する完全長HCVゲノムがレプリコン増強宿主細胞内で複製される能力を例示する。HCV単離物Con−1(EMBL−Genbank No.AJ238799)(プラスミドpHCVRBFL.wt)ならびにN2041TおよびS2173F突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m8)またはS2197FおよびA2199T突然変異(プラスミドpHCVRBFL.m11)を含有する2つの誘導体の完全長配列を、出発構築物として使用した。
該出発構築物から転写されたRNAを10IFN細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能をCell−ELISA、免疫蛍光およびTaqManにより評価した。コンセンサス突然変異を含有する両方の構築物(pHCVRBFL.m8およびpHCVRBFL.m11)は複製されたが、該wt.構築物では複製の徴候は全く観察されなかった(データは示されていない)。
レポーター遺伝子を有するレプリコン
本実施例は、レポーター遺伝子および適応突然変異を含有するHCVレプリコンを例示する。Neoコード領域がヒト胎盤分泌性アルカリホスファターゼのコード領域で置換されたpHCVNeo17.wt誘導体(pRBSEAP5.wt)、ならびにN2041TおよびS2173F突然変異をも含有する誘導体(プラスミドpRBSEAP5.m8)を構築した。これらのプラスミドから転写されたRNAを10IFN細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能を、アルカリホスファターゼの分泌を測定することにより評価した。分泌の速度論の分析は、プラスミドpRBSEAP5.m8のみが複製に適合することを示唆した(データは示していない)。
本実施例は、レポーター遺伝子および適応突然変異を含有するHCVレプリコンを例示する。Neoコード領域がヒト胎盤分泌性アルカリホスファターゼのコード領域で置換されたpHCVNeo17.wt誘導体(pRBSEAP5.wt)、ならびにN2041TおよびS2173F突然変異をも含有する誘導体(プラスミドpRBSEAP5.m8)を構築した。これらのプラスミドから転写されたRNAを10IFN細胞内にトランスフェクトし、それらの複製能を、アルカリホスファターゼの分泌を測定することにより評価した。分泌の速度論の分析は、プラスミドpRBSEAP5.m8のみが複製に適合することを示唆した(データは示していない)。
配列番号1および2
配列番号(SEQ.ID.)1および2を以下に示す。
配列番号(SEQ.ID.)1および2を以下に示す。
他の実施形態も特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態が示され説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
Claims (7)
- HCVレプリコン増強細胞の製造方法であって、
a)細胞内にHCVレプリコンを導入し維持し、該細胞はHuh−7細胞であるか、又はHuh−7細胞に由来し、
b)該細胞から該HCVレプリコンを除去して、該レプリコン増強細胞を得、
c)該レプリコン増強細胞が、レプリコンを維持したことがないか、レプリコンを除去されたことがない同じ型の細胞よりもHCVレプリコンを維持する能力が高いことを確認する、
工程を含んでなる前記製造方法。 - 細胞がHuh−7細胞である請求項1に記載の方法。
- 細胞がHuh−7細胞に由来する細胞である請求項1に記載の方法。
- 機能的HCVレプリコンを含有するHCVレプリコン増強細胞の製造方法であって、
a)細胞内に第1 HCVレプリコンを導入し維持し、該細胞はHuh−7細胞であるか、又はHuh−7細胞に由来し、
b)該細胞から該第1レプリコンを除去して、該第1レプリコンが除去された細胞を得、
c)レプリコンが除去された該細胞内に該第1 HCVレプリコンと同じ又は異なりうる第2 HCVレプリコンを導入し維持する、
工程を含んでなる前記製造方法。 - 該ヒト肝細胞癌細胞がHuh−7細胞である請求項4に記載の方法。
- 該ヒト肝細胞癌細胞がHuh−7細胞に由来する細胞である請求項4に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法で製造されたHCVレプリコン増強細胞。
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