JPH10500005A - Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）のｎｓ３プロテアーゼの蛋白分解活性のインビトロにおける再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は，ＨＣＶ ＮＳ３蛋白質に伴うセリンプロテアーゼ活性をインビトロで再生する方法において，ＮＳ３に含まれる配列およびＮＳ４Ａに含まれる配列の両者の使用からなる方法である．この方法は，ＨＣＶ ＮＳ４Ａ蛋白質もしくはそれに含まれる配列がセリンプロテアーゼ活性，もっと一般的にいえばＮＳ３に伴う酵素活性の補因子として働く能力を利用する．ＮＳ４ＡがＮＳ３と少なくとも１：１の比で存在する場合に，至適なセリンプロテアーゼ活性が得られる．ＮＳ３−ＮＳ４Ａ前駆体は自己蛋白分解現象によって等モル量のＮＳ３およびＮＳ４Ａを産生するので，ＮＳ３およびＮＳ４Ａはまた，その前駆体として反応混合物中に導入することもできる．また，前駆体中のＮＳ３とＮＳ４Ａの間の切断部位を突然変異させて，その結果，ＮＳ４ＡがＮＳ３に共有結合したまま残存させることも可能である．ＮＳ３の蛋白分解活性に影響しない配列は続いて上記非蛋白分解性の前駆体から取り出すことができる．本発明はまたＮＳ３およびＮＳ４Ａ中に含まれる配列からなる組成物，ならびに，ＮＳ３に伴う酵素活性を阻害する化合物の治療目的での選択が可能な酵素試験のセットアップのためのこれらの組成物の使用に関する．図面は，培養細胞中およびインビトロにおいてＨＣＶＮＳ３プロテアーゼを活性化する方法に用いられるプラスミドベクターを示す

Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＮＳ３プロテアーゼの蛋白分解活性の インビトロにおける再生方法 発明の説明 本発明は，ＨＣＶ蛋白質ＮＳ４Ａもしくはそれに含まれる配列が，セリンプロ テアーゼ活性，もっと一般的にいえばＨＣＶ ＮＳ３に伴う酵素活性の補因子と して働く能力を利用して，ＨＣＶ ＮＳ３蛋白質に伴うセリンプロテアーゼ活性 を再構成する方法をその課題とするものである． 既に知られているように，Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡ ＮＢ）の主要な病原因子である．ＨＣＶは少なくとも，輸血後ＮＡＮＢウイルス 性肝炎の90％および散発性ＮＡＮＢ肝炎の50％の原因となっていると推定されて いる．献血者の選択および輸血に使用される血液の免疫学的特性の検査は著しく 進歩はしたものの，輸血を受けた患者の間では，いまだに高レベルの急性ＨＣＶ 感染（全世界で毎年百万例もしくはそれ以上の感染）が認められている．ＨＣＶ 感染個体のおよそ50％は，５〜40年の範囲の期間内に肝硬変を発症している．さ らに，最近の臨床研究では，慢性ＨＣＶ感染と肝細胞癌の発症の間に相関のある ことが示唆されている． ＨＣＶは，エンベロープがあるウイルスで，約 9.4 kb のＲＮＡ＋鎖ゲノムを 有する．このウイルスはフラビウイルス科に属す．この科の他のメンバーには， フラビウイルスおよびペスチウイルスがある．ＨＣＶのＲＮＡゲノムは最近マッ ピングされた．世界各地で単離されたＨＣＶゲノムからの配列を比較した結果， これらの配列は，きわめて不均質であることが明らかにされている．ＨＣＶゲノ ムの大部分は，9030〜9099塩基の間で変動するオープンリーディングフレーム（ ＯＲＦ）によって占められている．このＯＲＦは一本鎖のウイルスポリプロテイ ンをコードし，その長さは 3010 〜3033アミノ酸長で変動できる．ウイルスの感 染周期時には，ポリプロテインはウイルスの複製に必要な個々の遺伝子産物へ蛋 白分解的プロセッシングを受ける．ＨＣＶの構造蛋白質をコードする遺伝子は ＯＲＦの５'-末端に位置し，一方，非構造蛋白質をコードする領域はＯＲＦの残 部を占めている． 構造蛋白質は，Ｃ（核，21 kDa），Ｅ１（エンベロープ，ｇｐ37），ならびに Ｅ２（ＮＳ１，ｇｐ61）から構成される．Ｃはおそらくウイルスのヌクレオカプ シドを形成する 21 kDa の非グリコシル化蛋白質である．蛋白質Ｅ１はほぼ 37 kDa の糖蛋白質で，外側のウイルスエンベロープの構造蛋白質であろうと考えら れている．61 kDaのもう一つの膜糖蛋白であるＥ２は，おそらくウイルスの外側 エンベロープの第２の構造蛋白質と思われる． 非構造領域は，24 kDaの疎水性蛋白質，ＮＳ２（ｐ24）に始まるが，その機能 はまだわかっていない．ポリプロテイン中でＮＳ２に続く 68 kDa の蛋白質，Ｎ Ｓ３は２つの機能性ドメイン，すなわち，最初の 200アミノ末端アミノ酸中のセ リンプロテアーゼドメイン，およびカルボキシ末端に位置するＲＮＡ依存性ＡＴ Ｐアーゼドメインを有することが予測される．ＮＳ４に相当する遺伝子領域はそ れぞれ６および 26 kDa の２つの疎水性蛋白質，ＮＳ４Ａ（ｐ６）およびＮＳ４ Ｂ（ｐ26）をコードするが，それらの機能はまだ解明されていない．ＮＳ５に相 当する遺伝子もまた，それぞれ 56 および 65 kDa の２つの蛋白質であるＮＳ５ Ａ（ｐ56）およびＮＳ５Ｂ（ｐ65）をコードしている．すべてのＲＮＡ依存性Ｒ ＮＡポリメラーゼ中に存在するアミノ酸配列は，ＮＳ５領域内に認めることがで きる．これは，ＮＳ５領域がウイルス複製機構の部分を含むことを示唆している ． 様々な分子生物学的研究から，宿主細胞の小胞体と会合するプロテアーゼであ るシグナルペプチダーゼが非構造領域，すなわちＣ／Ｅ１，Ｅ１／Ｅ２ならびに Ｅ２／ＮＳ２における蛋白分解的プロセッシングに関与することが指示されてい る．ＮＳ３中に含まれるセリンプロテアーゼはＮＳ３とＮＳ４Ａの間，ＮＳ４Ａ とＮＳ４Ｂの間，ＮＳ４ＢとＮＳ５Ａの間およびＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂの間の接合 部の切断に関与している．とくに，このセリンプロテアーゼによって行われる切 断では，容易に切断可能な結合のアミノ末端側（位置Ｐ１）にシステインまたは スレオニンの残基を，またカルボキシ末端側（位置Ｐ１’）にアラニンまたはセ リン残基を残すことが見出されている．ＨＣＶの第２のプロテアーゼ活性はＮＳ ２とＮＳ３の間の切断に関与するものと思われる．このプロテアーゼ活性は，セ リンプロテアーゼドメインを含有するＮＳ２の部分およびＮＳ３の部分の両者か らなる領域中に含まれているが，同一の触媒機構を使用していない． 以上の説明に照らして見れば，ＮＳ３プロテアーゼには，抗−ＨＣＶ治療薬の 開発のターゲットとしての可能性が考えられる．しかしながら，このような薬剤 の探索には，インビトロにおいてＮＳ３によって発揮されるセリンプロテアーゼ 活性はきわめて低く阻害剤のスクリーニングは不可能であるという事情が支障に なってきた． この重大な限界は，予想外に，本発明の方法を適用することによって克服でき ることが，今回見出されたのである．この方法は，以下の説明から明らかなよう にその他の利点も提供する． 本発明は，ＨＣＶのプロテアーゼＮＳ３の蛋白分解活性をインビトロで再生す る方法において，ＮＳ３に含有される配列およびＮＳ４Ａに含有される配列の両 者を反応混合物に使用することを特徴とする方法である． 至適なセリンプロテアーゼ活性は，ＮＳ４ＡがＮＳ３と１：１の比で存在する 場合に得られる． ＮＳ３およびＮＳ４Ａはまた，ＮＳ３−ＮＳ４Ａ前駆体として反応混合物中に 導入することもできる．この前駆体は自己蛋白分解現象により等モル量のＮＳ３ およびＮＳ４Ａを産生するからである． 前駆体中のＮＳ３とＮＳ４Ａの間の切断部位を突然変異させることも可能で， その結果，ＮＳ４ＡはＮＳ３と共有結合したまま残存する．ＮＳ３の蛋白分解活 性に影響しない配列はついでこの蛋白分解されない前駆体から除去できる． 本発明はまた，配列番号：１および配列番号：２に記載の配列またはそれらに 含まれる配列もしくはそれから誘導される配列を有する蛋白質からなることを特 徴とする新規な組成物材料に拡張される．ＲＮＡウイルスはすべて高度な変異性 を示すので，これらの配列はＨＣＶ単離体が異なると変動する可能性があること を理解すべきである．この新規な組成物材料は数種の非構造性ＨＣＶ蛋白質の蛋 白分解的成熟を達成するのに必要な蛋白分解活性を有するものである． 本発明はまたその課題として，治療目的のために，ＮＳ３に伴う酵素活性を阻 害する化合物を，たとえばＮＳ３とＮＳ４Ａの間の相互作用の阻害剤を含めて， 同定可能な酵素アッセイを提供するための上記組成物材料の使用を包含する． ここまでは本発明を一般的に説明してきた．本発明の目的，特徴，利点および 操作方法を明瞭に理解できるように，以下の実施例によって，本発明の特定の実 施態様をさらに詳細に説明する． 図面は，培養細胞中およびインビトロにおいてＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼを 活性化する方法（例１および例２）に用いられたプラスミドベクターを例示する ものである． 例１ 培養細胞におけるＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼの活性化方法 プラスミドベクターは，ＮＳ３，ＮＳ４Ａならびに他の非構造性ＨＣＶ蛋白質 のＨｅＬａ細胞内での発現のために，構築された．構築されたプラスミドを図式 的に図１に例示する．ＨＣＶ ＢＫ単離体（ＨＣＶ−ＢＫ）のゲノムに相当する ｃＤＮＡの選ばれたフラグメントを，プラスミドベクターｐＣｉｔｅ−１(登録 商標，Novagen)中のバクテリオファージＴ７のプロモーターの下流にクローン化 した．この発現ベクターには，ＣＡＰ構造の不存在下でもプロモーターＴ７から 転写されたメッセンジャーＲＮＡの効率的な翻訳が保証されるように，脳心筋炎 ウイルスの内部リボソームエントリー部位を含有させた． ＨＣＶ−ＢＫ ｃＤＮＡのさまざまなフラグメントを，分子生物学的慣用手段 として知られている方法を用い，プラスミドｐＣｉｔｅ−１（登録商標）中にク ローン化した．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）はヌクレオチド 3351 〜5175（ポリプロテ インのアミノ酸 1007 〜1615）からなるＨＣＶ−ＢＫゲノムの部分を含有する． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ｂ／５Ａ）は，ヌクレオチド 5652 〜7467（アミノ酸 1774 〜2380）からなるＨＣＶ−ＢＫの部分を含有する．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３／４Ａ） はヌクレオチド 3711 〜5465（アミノ酸 991〜1711）からなるＨＣＶ−ＢＫゲノ ムの部分を含有する．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ａ）はヌクレオチド 5281 〜5465（ア ミノ酸 1649 〜1711）からなるＨＣＶ−ＢＫの部分を含有する．ｐＣｉｔｅ（Ｎ Ｓ５ＡＢ）はヌクレオチド 6224 〜9400（アミノ酸 1965 〜3010）からなるＨＣ Ｖ−ＢＫゲノムの一部分を含有する．上記の番号表示は，Takamizawaら，Struct ure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers，(1991)，J．Virol．65，1105-1113においてＨＣＶ−ＢＫに与 えられたゲノムおよびポリプロテインの順序と一致する． ＨＣＶポリプロテインの各種部分の効率的な発現を達成するために，ＨｅＬａ 細胞をｖＴＦ７−３，インフェクトされた細胞の細胞質中でのバクテリオファー ジＴ７のＲＮＡポリメラーゼの合成を可能にする組換えワクシニアウイルスでイ ンフェクトした．インフェクション後，これらの細胞をついで図中に記載の中か ら選択されたプラスミドベクターによってトランスフェクトした．このようにし てインフェクトされ，トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞を，ついで［³⁵Ｓ］ メチオニンで代謝的に標識し，各種プラスミドによってコードされた組換え蛋白 質は，ＮＳ３，ＮＳ４またはＮＳ５Ａを認識するポリクローナルウサギ抗体によ る免疫沈降法によって同定することが可能であった．本実施例中に記載の組換え ＨＣＶ蛋白質の分析方法は，L.Tomei ら，NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein，J．Virol．(1993),67，10 17-1026およびそれに言及されている文献中に既に記載されている． プラスミドｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）をｖＴＦ７−３でインフェクトしたＨｅＬａ 細胞にトランスフェクトすることにより，ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの触媒ド メインを含有する蛋白質の合成を観察することが可能である．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ ４Ｂ５Ａ）は，ＮＳ４ＢとＮＳ５Ｂの間の接合部に，ＮＳ３に伴うセリンプロテ アーゼ活性による加水分解が期待されるペプチド結合を含有するＨＣＶポリプロ テインの部分をコードしている．しかしながら，ｐＣｉｔｅＮＳ３がｐＣｉｔｅ ＮＳ４Ｂ５Ａとコトランスフェクトされた場合には，蛋白分解的切断の形跡は認 められない．これに反して，ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインがＮＳ４Ａと結 合して発現された場合は，ｐＣｉｔｅ（ＮＳＢ５Ａ）によってコードされる前駆 体の蛋白分解的切断を正常に起こすことができる．ＮＳ３セリンプロテアーゼド メインと４Ａの共発現はたとえば，等モル量のプラスミドｐＣｉｔｅ（ＮＳ３） とｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ａ）でのトランスフェクション，ＮＳ３およびＮＳ４Ａの 両者を含有する前駆体をコードするプラスミド［ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３４Ａ）］の トランスフェクション，または蛋白分解に関連のないすべての配列が削除されて いる後者のプラスミドの誘導体［ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３４Ａ）］のトランスフェク ションもしくは蛋白分解に関連のないすべての配列が削除されている後者のプラ スミドの誘導体［ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３Δｉｎｔ 1237-1635）］のトランスフェク ションによって達成できる．ＨｅＬａ細胞中で一過性に発現されるＮＳ４Ａは， したがって，他の場合には認められないＮＳ３に伴う蛋白分解活性を活性化する ことができる． 例２ インビトロ翻訳検定におけるＨＣＶセリンＮＳ３プロテアーゼの活性化方法 図１に記載のプラスミドはまた，ファージＴ７の精製ＲＮＡポリメラーゼ酵素 (Promega)を用いるそれぞれのＨＣＶ蛋白質をコードするｍＲＮＡのインビトロ 合成にも使用することができる． 一般的には，ｐＣｉｔｅ−１（登録商標）由来のプラスミドを，適当な制限酵 素を用いて線状化し，ついで製造業者(Promega)によって供給されているプロト コールを用いて転写する．これらの合成ｍＲＮＡは以後，イヌ膵臓ミクロソーム 膜の存在下ウサギ網状赤血球の抽出物中において，相当する蛋白質を合成するた めに使用できた．網状赤血球抽出物，イヌ膵臓ミクロソーム膜は，他の必要材料 と同様，上述のインビトロ蛋白質合成法の説明書も供給している Promegaから購 入した． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）から転写されたｍＲＮＡを含むインビトロ翻訳混合物を 組み込めば，ＮＳ３セリンプロテアーゼ全ドメインを含有する期待される分子量 （68 kDa）の蛋白質の合成を観察することができる．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ５ＡＢ） から転写されたｍＲＮＡはＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含有し，したがってＮＳ３ に伴う蛋白分解活性の基質である 115 kDaの前駆体の合成を誘導する． しかしながら，ＮＳ３セリンプロテアーゼドメインおよびＮＳ５ＡとＮＳ５Ｂ の間の接合部に相当する部位を有する基質の２つの蛋白質が同一の反応混合物中 で合成された場合には，ＮＳ３の蛋白分解活性の明瞭な証明は得られない． これに反して，ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３４Ａ）から転写されたｍＲＮＡは，約 76 kDa の前駆体蛋白質に翻訳され，これはインビトロで蛋白分解的に自己プロセッ シングされて，それぞれＮＳ３およびＮＳ４Ａを含有する 70 kDa および６ kDa の２種の蛋白質の等モル量を与える． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３４Ａ）から転写されたｍＲＮＡに加え，ｐＣｉｔｅ（ＮＳ ５ＡＢ）から転写されたｍＲＮＡがインビトロ翻訳混合物中に包含されている場 合には，ＮＳ３とＮＳ４Ａの間の部位での自己蛋白分解に加えて，それぞれＮＳ ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含有する 56 kDa および 65 kDa の２種の新たな蛋白質の 発生が観察できる．これらの蛋白質はＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含有する前駆体 のＮＳ３による蛋白分解産物である．同様にｐＣｉｔｅ（ＮＳ３Δｉｎｔ 1237- 1635）から転写されたｍＲＮＡが，ｐＣｉｔｅ（ＮＳ５ＡＢ）から転写されたｍ ＲＮＡと共翻訳される場合には，ＮＳ５ＡＢ前駆体から蛋白分解によって産生さ れる 56 kDa および 65 kDa の蛋白質産物が得られる． この結果は，インビトロにおいては，ＮＳ３の単独のプロテアーゼドメインは ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含む基質上でプロテアーゼ活性を発揮できないと要約 することができる．しかしながら，ＮＳ４Ａを含む他の蛋白質配列がＮＳ３プロ テアーゼドメインに加えて存在する場合には，ＮＳ３のセリンプロテアーゼ活性 が明瞭になる． 例３ ＮＳ４Ａ配列を含む合成ペプチドを用いたＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの活性 化方法 配列番号：３の配列を含む合成ペプチドを固相上で合成した．この配列は配列 番号：２のＣ−末端部分に由来する．ペプチドの合成は本分野の熟練者によく知 られている方法に従い固相上で行われた．このペプチドでは，カルボキシ末端の システインがα−アミノ酪酸（Ａｂｕ）で置換されている． このペプチドを，プラスミドｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）およびｐＣｉｔｅ（ＮＳ５ ＡＢ）から転写されたｍＲＮＡが同時に組み込まれたインビトロ翻訳混合物中に 添加した． このようにしてＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインに伴う蛋白分解活性を観 察することが可能となり，これにより，蛋白質ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含む２ つの産物への基質の蛋白分解的切断が生じた．この活性は，ＮＳ３セリンプロテ アーゼドメインと配列番号：３の配列を有する合成ペプチドが同時に存在するこ とに依存する． 例４ ペプチド基質に対する組換えＨＣＶ ＮＳ３セリンプロテアーゼの検出方法 図１および例４に記載のプラスミドｐＴ７−７ ＮＳ３(1027-1206)は，配列 番号：１のアミノ酸１〜180 からなる蛋白質フラグメントの大腸菌内発現を可能 にするために構築された．このフラグメントは，実験的に決定されたＮＳ３のセ リンプロテアーゼドメインを含有する．上述のＮＳ３フラグメントをコードする ＨＣＶ ｃＤＮＡのフラグメントを，Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ10 およびＴ７遺伝子10蛋白質の翻訳開始部位を含有する発現ベクター，ｐＴ７−７ プラスミド［Studier & Moffatt，Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes，(1986)，J．Mol ．Biol．189，113-130］中にクローン化した．上に特定されたＮＳ３セリンプロ テアーゼドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントは，バクテリオファージＴ ７プロモータの下流に，Ｔ７遺伝子10蛋白質の最初のＡＴＧコドンとインフレー ムに，分子生物学的慣用手段として知られている方法を用いて，クローン化した ．ｐＴ７−７プラスミドはまた，β−ラクタマーゼ酵素の遺伝子も含有し，これ はｐＴ７−７誘導プラスミドでトランスフォームされた大腸菌の選択マーカーと して使用できる． プラスミドｐＴ７−７ ＮＳ３(1027-1206)をついで，Ｔ７プロモーター含有 発現ベクターにクローン化された遺伝子の高レベル発現に通常用いられる大腸菌 株ＢＬ21（ＤＥ53）にトランスフォームされる．この大腸菌株中では，Ｔ７遺伝 子ポリメラーゼはバクテリオファージλＤＥ53に運ばせて，これをＢＬ21の染色 体に挿入する．関心遺伝子からの発現は，既述の操作［Studier & Moffatt，Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expre ssion of cloned genes(1986)，J.Mol.Biol，189，113-130］に従い，増殖培地 にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して誘発する． セリンプロテアーゼドメインを含有する組換えＮＳ３フラグメントは，プラス ミドｐＴ７−７ ＮＳ３(1027-1206)によってトランスフォームされた，大腸菌 ＢＬ21（ＤＥ53）から，以下に要約する操作によって精製することができた． 略述すれば，ｐＴ７−７ ＮＳ３(1027-1206)プラスミドを繋留する大腸菌株 ＢＬ21（ＤＥ53）細胞を37℃で，600 nmにおいて約 0.8吸収単位の至適密度まで 増殖させた．その後，培地を22℃に冷却し，最終濃度が 0.4ｍＭになるようにＩ ＰＴＧを添加して所望の蛋白質の産生を誘発させた．ＩＰＴＧの存在下22℃に４ 〜６時間置いたのち，細胞を収穫して，20ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ 6.5，0. 5％(w/v)の3-[(3-クロラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]1-プロパンスルホ ネート（ＣＨＡＰＳ），50％(v/v)グリセロール，10ｍＭジチオスレイトールお よび１ｍＭＥＤＴＡを含有する緩衝液（溶解緩衝液）中でフレンチプレスを用い て細胞を溶解させる．細胞残屑を遠心分離（120000×g，１時間）によって除去 し，得られたペレットを溶解緩衝液中に再懸濁し，ＤＮＡアーゼＩで消化し，上 述のように再均質化および再遠心分離を行った．溶解緩衝液中で予め平衡化した S-Sepharose Fast Flowイオン交換樹脂(Pharmacia)を，プールした上清に添加 し(30％v/v)，ついで，スラリーを４℃で１時間撹拌した．樹脂を沈降させて溶 解緩衝液によって完全に洗浄し，クロマトグラフィーカラムに注入した．０〜１ Ｍ ＮａＣｌ勾配を適用すると樹脂からＮＳ３プロテアーゼが溶出した．プロテ アーゼ含有分画を 50 ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ 7.5，10％(v/v)グリ セロール，0.5％(w/v)ＣＨＡＰＳおよび２ｍＭジチオスレイトールで平衡化した ．この工程後の蛋白質は純度は 90 〜95％であった．＞98％への精製は続いて， 50ｍＭトリスｐＨ 7.5，10％(v/v)グリセロール，0.5％(w/v)ＣＨＡＰＳおよび ２ｍＭジチオスレイトールで平衡化した Heparin Sepharose上クロマトグラフィ ーを行うことによって達成された．このカラムからのＮＳ３プロテアーゼの溶出 を線状０〜１Ｍ ＮａＣｌ勾配の適用によって達成された． 精製された蛋白質の濃度は Bio-Rad蛋白アッセイ(Bio-Rad cat 500-0006)によ って測定した． 上述の操作により，大腸菌内で産生された組換えＮＳ３セリンプロテアーゼは 検出可能な切断産物を提供する基質を切断することにより活性を検出できた．シ グナルは比色法または蛍光法によって検出可能であることが好ましい．ＨＰＬＣ 等のような方法もまた適当である． たとえば，本発明者らは基質として，ＨＣＶポリプロテインのＮＳ４Ａ／４Ｂ 接合部に相当し，配列番号：４またはその一部のアミノ酸配列を含有する合成ペ プチドを用いた． 別法として，配列番号：５として指示した一般構造を有するペプチドエステル がある． 活性の検出は，５〜1000μＭの基質および 0.05 〜１μＭのプロテアーゼを， 25ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ 7.5，３ｍＭジチオスレイトール，0.5％(w/v)ＣＨＡＰ Ｓおよび 10％(v/v)グリセロールを含有する緩衝液中，22℃で１〜３時間インキ ュベートすることによって行われる．トリフルオロ酢酸を最終濃度 0.1％(w/v) になるように添加して反応を停止させる． 反応生成物をついでＣ18逆相カラム上ＨＰＬＣによって分離し，それらの遠紫 外部吸収によって定量する． 上述のように活性の検定を行った場合，大腸菌から精製された組換えＮＳ３セ リンプロテアーゼの示す蛋白分解活性はきわめて低い．しかしながら，本発明者 らは配列番号：３に記載の合成ペプチドの量を増大させていくと，組換えＮＳ３ セリンプロテアーゼの蛋白分解活性は20倍まで刺激されることを見出したのであ る．組換えＮＳ３セリンプロテアーゼと合成ペプチドが等モル量で存在する場合 に最大の活性に到達する． 上述のアッセイはプロテアーゼ阻害剤の探索に使用することができる．このよ うなアッセイにおけるＮＳ３プロテアーゼの活性は，ＮＳ３セリンプロテアーゼ ドメインのＮＳ４Ａ由来アミノ酸配列との相互作用に依存するので，上述のアッ セイを用いることにより，最終的にはＮＳ３に伴う蛋白分解活性を阻害するＮＳ ３とＮＳ４Ａの間の相互作用のアンタゴニストの探索も可能である． 例５ 図中のプラスミドの構築の詳細 ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）はヌクレオチド3351〜5175（ポリプロテインのアミノ酸 1007〜1615）からなるＨＣＶ−ＢＫゲノムの一部分を含有する．このプラスミド の構築は，L.Tomeiら，NS3 is a serine protease required for procesing of hepatitis C virus polyprotein，J．Virol(1993)67，1017-1026に記載されてい る． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ｂ／５Ａ）は，Tomei らによって記載されているプラスミ ドｐＣｉｔｅ（ＮＳ４−５）から誘導される ScaI-BamHI フラグメントを，予め MscIおよび BamHIで消化したｐＣｉｔｅ（ＮＳ３）中にクローンニングすること によって得られた．ｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ｂ／５Ａ）は，ヌクレオチド 5652 〜74 67（ポリプロテインのアミノ酸 1774 〜2380）からなるＨＣＶゲノムの部分を含 有する． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ５ＡＢ）はＨＣＶ−ＢＫポリプロテインのアミノ酸 1965 〜 アミノ酸 3010 の配列からなる蛋白質をコードする．このプラスミドを構築する ためには，Tomei ら（1993，前出）に記載されたプラスミドｐＣｉｔｅ（ＳＸ） を最初に AseI で消化し，ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントで処置し た．クレノウ酵素の不活性化後に，プラスミドを XbaI で消化した．ヌクレオチ ド 6224 〜9400の領域を含む，得られたｃＤＮＡフラグメントを精製し，BstXI によって生じた末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化したのちベクター ｐＣｉｔｅ−１（登録商標）の BstXIおよび XbaI 部位に挿入した． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３／４Ａ）は以下のようにして得られた．ＨＣＶ−ＢＫゲノ ムのヌクレオチド 3711 〜5465の領域に相当するｃＤＮＡフラグメントをポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により，プライマーとして配列特異的オリゴヌクレオ チドを用いて合成した．ＵＡＧ停止コドンはアンチセンスオリゴヌクレオチド中 に適当に挿入された．ＰＣＲ増幅後，得られたｃＤＮＡを５’末端で SalI によ って切断し，750 塩基対の生成物はＤＮＡポリメラーゼクレノウフラグメントに より NheI 末端を平滑末端化したのち，プラスミドｐＣｉｔｅ（ＳＸ）のSalI および NheI 部位に方向性にクローン化した．得られたプラスミドは，アミノ酸 991 〜1711からなるＨＣＶ−ＢＫポリプロテインの部分をコードする． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ４Ａ）の構築のためには，ＨＣＶ−ＢＫゲノムのヌクレオチ ド 5281 と 5465 の間の領域（アミノ酸 1649 〜1711）に相当するｃＤＮＡフラ グメントを，プライマーとして配列特異的なオリゴヌクレオチドを用い，ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により得た．ＰＣＲ増幅から得られたｃＤＮＡを 続いて，BstXI 消化末端をバクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼで平滑 化したのち，プラスミドｐＣｉｔｅ−１（登録商標）の BstXIおよび StuI 部位 でクローン化した． ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３Δｉｎｔ 1237-1635）は，ヌクレオチド 4043 とヌクレオ チド 5235 の間からなる配列すべてが削除されたｐＣｉｔｅ（ＮＳ３／４Ａ）の 誘導体である．これは，ｐＣｉｔｅ（ＮＳ３／４Ａ）を BstelI および部分的に ScaIで消化することによって得られた．興味ある削除を含むフラグメントを，つ いでＴ４ ＤＮＡライガーゼを用いて環化した．このプラスミドはｐＣｉｔｅ（ ＮＳ３／４Ａ）によってコードされるのと同一のアミノおよびカルボキシ末端を 有する蛋白質をコードするが，セリンプロテアーゼＮＳ３活性に必ずしも必須で はないことが実験により見出されたアミノ酸 1237 とアミノ酸 1635 の間に含ま れるアミノ酸残基がすべて削除されている． ｐＴ７−７［ＮＳ３(1027-1206)］はアミノ酸 1027 〜アミノ酸 1206 からな るＨＣＶ ＮＳ３フラグメントをコードするＨＣＶ配列ヌクレオチド 3411 〜ヌ クレオチド 3951 を含有する．このプラスミドを得るためには，配列番号：６お よび配列番号：７として示したオリゴヌクレオチドを用い，ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）によってＨＣＶ ｃＤＮＡを増幅させることにより，ＤＮＡフラグ メントを生成させた．ＰＣＲによって得られたｃＤＮＡフラグメントをリン酸化 して，NdeIで消化し，ついて，予め NdeI および SmaI で消化したベクターｐＴ ７−７中のバクテリオファージＴ７プロモーターの下流，Ｔ７遺伝子 10 蛋白質 の最初のＡＴＧコドンの直後に，クローン化した［Studier & Moffatt，Use of bacteriophage T7RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes(1986)，J.Mol.Biol．189，113-130］．ＨＣＶ−由来の配列の 直後にアンバーコドンが挿入されたことに注意すべきである．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＣＳ (72)発明者 トメイ，リシア イタリア国 アイ − 80123 ナポリ, ビアレ アウグスト 122

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛋白分解活性をインビトロで再生する方法 において，ＮＳ３に含まれる配列およびＮＳ４Ａに含まれる配列の両者を反応混 合物中に使用することを特徴とする方法． ２．ＮＳ４ＡはＮＳ３と１：１の比で存在させる「請求項１」に記載のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛋白分解活性をインビトロで再生する方法． ３．ＮＳ３およびＮＳ４ＡはＮＳ３−ＮＳ４Ａ前駆体として反応混合物中に導 入され，その前駆体は自己蛋白分解現象により等モル量のＮＳ３およびＮＳ４Ａ を産生する「請求項１または２」に記載のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛋白分 解活性をインビトロで再生する方法． ４．前駆体中のＮＳ３とＮＳ４Ａの間の切断部位が突然変異されていて，その 結果，ＮＳ４ＡはＮＳ３に共有結合したまま残存し，ついで上記非蛋白分解性の 前駆体からＮＳ３の蛋白分解活性に影響しない配列を取り除くことが可能である 「請求項１〜３」のいずれかに記載のＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛋白分解活 性をインビトロで再生する方法． ５．「請求項１〜４」に記載のＮＳ３およびＮＳ４Ａ配列を含有することを特 徴とする組成物． ６．配列番号：１および配列番号：２に記載の配列またはそれらに含まれるか それらに由来する配列の蛋白質からなる「請求項５」に記載の組成物． ７．ＮＳ３に伴う酵素活性を阻害する化合物の治療目的での選択が可能な酵素 試験のセットアップのための「請求項５または６」に記載の組成物の使用． ８．ＮＳ３に伴う酵素活性を阻害する化合物の治療目的での選択が可能な酵素 試験のセットアップのため，上記説明，実施例および請求の範囲に従ってＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼの蛋白分解活性をインビトロで再生する方法，組成物およ びその組成物の使用．