DE60217384T2

DE60217384T2 - Screening nach antiviralen verbindungen, die die signalpeptidase beeinflussen

Info

Publication number: DE60217384T2
Application number: DE60217384T
Authority: DE
Inventors: J. MRC Virology Unit Div. of Virolog MCLAUCHLAN; B. Swiss Federal Inst. of Tech. Zuri MARTOGLIO
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2001-11-07
Filing date: 2002-11-07
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2022-11-08
Also published as: WO2003040684A3; AU2002337378A1; GB0126782D0; EP1444522B1; EP1444522A2; WO2003040684A2; US20050089839A1; ATE350664T1; DE60217384D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen Assay. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Assays zum Identifizieren von Mitteln (Substanzen), die befähigt sind, die Interaktion zwischen viralen Proteinen zu modulieren, die zur Bindung an intrazelluläre Signalpeptidpeptidase befähigt sind.
Hintergrund der Erfindung
Hepatitis C-Virus (HCV) ist eines der hauptsächlichen auslösenden Agenzien der chronischen Hepatitis und Lebererkrankung. Es wird geschätzt, dass weltweit etwa 300 Millionen Individuen mit dem Virus infiziert sind. Die meisten der Patienten entwickeln eine chronische Infektion, wovon 20% der Wahrscheinlichkeit nach eine milde bis schwere Lebererkrankung entwickeln, die potentiell entweder in Zirrhose oder Leberzellkarzinom kulminiert (Di Bisceglie, 1998, Lancet, 351, 351–355). Abgesehen von dem Risiko, den Langzeitfolgen der Infektion zu erliegen, beherbergen diese Individuen außerdem ein großes Reservoir des Virus für weitere Übertragungen.
Derzeit ist die einzige in breitem Umfang verwendete Therapie für HCV die Behandlung mit Interferon, entweder alleine oder in Kombination mit Ribovirin. Eine nachhaltige Antwort wird jedoch in weniger als 50% der Fälle erreicht. Darüber hinaus existiert derzeit kein Impfstoff, um gegen die Infektion zu schützen. Da die Anzucht des Virus in Gewebekultursystemen bisher nicht möglich war, ist unser Kenntnisstand über die molekularen Ereignisse, die für die virale Infektion, Replikation und Genexpression entscheidend sind, begrenzt.
Die WO 95/12677 beschreibt ein Polypeptid von etwa 8 bis etwa 100 Aminosäuren, umfassend oder bestehend aus wenigstens 8 zusammenhängenden Aminosäuren, ausgewählt aus dem „Core" (Kern) und/oder den Regionen E1 und/oder E2 und/oder NS3 des HCV-Polyproteins, wobei diese zusammenhängenden Aminosäuren ein T-Zell-stimulierendes Epitop enthalten.
Die WO 01/21189 beschreibt ein Fragment, das aus der Aminosäuresequenz SFSIFLLALLSCLTV besteht.
Die WO 00/43505 beschreibt eine Protease mit zwei Aspartatresten in einer katalytisch aktiven Struktur.
Die WO 96/13590 beschreibt HCV-Typ- und -Subtyp-Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung möchte neue Ziele für antivirale Mittel bereitstellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung haben wir neue antivirale Ziele identifiziert.
Bei einem Aspekt haben wir nun neue Anti-HCV-Ziele identifiziert.
HCV ist in einer separaten Gattung in der Familie der Flaviviridae klassifiziert worden und besitzt ein Positivsinn aufweisendes, einzelsträngiges RNA-Genom von etwa 9400 Nukleotiden und enthält ein offenes Leseraster, das für einen einzelnen Polyprotein-Vorläufer von etwa 3000 Aminosäuren codiert (Choo et al., 1989, Science, 244, 359-362; Choo et al., 1991, PNAS, 88, 2451-2455; Takamizawa et al., 1991, J Virol, 65, 1105-1113).
Es ist bekannt, dass das HCV-Core-Protein mit Lipidtröpfchen im Zytoplasma der Zelle assoziieren kann (Barba, G. et al., 1997, 1997, PNAS, 94, 1200-1205; Moradpour, D. et al., 1996, Virology, 222, 51-63). Ein definierendes Merkmal von HCV-Core-Protein bei Säugerzellen nach der Prozessierung des HCV-Polyproteins ist seine Assoziation mit zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (Hope und McLauchlan, 2000, J. Gen Virol, 81, 1913-1925). HCV-Core enthält eine zusammengesetzte Zielsequenz, die drei trennbare, jedoch untereinander abhängige Motive beinhaltet.
Es ist bekannt, dass das HCV-Polyprotein zunächst gespalten wird. Wir nennen dieses initiale Spaltungsereignis ein primäres (oder 1 °) Spaltungsereignis. Das 1 °-Spaltungsereignis dient der Erzeugung von zehn einzelnen Proteinen NH₂-Core-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH. NS2-NS5B sind putative Nicht-Strukturproteine, die an der Replikation von HCV beteiligt sind. NS2/3 ist eine Metalloprotease, die in cis an der NS2/3-Verbindungsstelle spaltet. NS3 besitzt Serinprotease- und RNA-Helikase-Aktivität und ist verantwortlich für die Spaltung der verbleibenden Nicht-Strukturproteine. Für NS4A wird vorgeschlagen, dass es ein Cofaktor der NS3-Proteaseaktivität ist. Obwohl die Funktionen von p7, NS4B und NS5A nicht gut verstanden sind, ist eine Mutation in NS5A mit der Empfindlichkeit gegenüber Interferon (IFN) in Verbindung gebracht worden (Enomoto et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334: 77-81).
Man nimmt an, dass alle nicht strukturellen, von HCV codierten Proteine durch die Spaltung durch Virus-codierte Proteasen erzeugt werden.
Core und E1/E2 werden als ein Capsid-Protein bzw. als Hüll-Glykoproteine angesehen, von denen man annimmt, dass sie durch die Spaltung mittels Wirtszell-Signalpeptidasen erzeugt werden (Hijikita et al., 1991, PNAS, 88, 6647-5551; Reed und Rice, 1998, Curr. Stud. Hematol. Blood Transf. 62, 1-37; Santolini et al., 1994, J. Virol 68, 3631-3641; Hussy et al., 1996, Virology, 224, 93- 104; Wu L., 2001; IUBMB Life, 51, 19-23; auch zusammengefasst in Suzuki et al., 1999, Intervirology, 42, 145-152; McLauchlan J., 2000, J. Viral Hepat 7, 2-14).
Das erste (1 °) Spaltungsereignis des naszierenden HCV-Polyproteins resultiert in der Kompartimentierung der reifen viralen Proteine an der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER). Es ist vorgeschlagen worden, dass die Signalpeptidprozessierung des HCV-Polyproteins in der ER-Membran den Zusammenbau des Virions und das Ausknospen von der ER-Membran einleitet.
Wichtiger Weise und in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung haben wir nun ein zweites (oder 2°) Prozessierungs-/Spaltungsereignis des HCV-Polyproteins identifiziert. Wir glauben, dass dieses 2°-Prozessierungs-/Spaltungsereignis bislang im Reich der Viren nicht festgestellt worden ist. Die 2°-Prozessierung des HCV-Polyproteins, wie hier beschrieben, ist eine Konsequenz einer proteolytischen Spaltung des HCV-Polyproteins durch spezifische zelluläre Signalpeptidpeptidasen (SPPase). Die Spaltung durch SPPase folgt der Signalpeptidase-Spaltung des HCV-Polyproteins in einer sequentiellen Weise. In einem Aspekt nehmen wir an, dass es wichtig (z.B entscheidend) ist, dass die SPPase-Spaltung des HCV-Polyproteins stattfindet, damit die Ablösung von HCV-Core von der ER-Membran ermöglicht wird, worauf dann eine Lokalisierung im Zytoplasma erfolgt.
Die Identifizierung neuer Enzyme, die eine essentielle Komponente im Lebenszyklus von HCV und der Virus-assoziierten Pathologie darstellen, hat ein wirksames Werkzeug zum Modulieren der zugrunde liegenden molekularen Ereignisse bereitgestellt, die die Prozessivität des Polyproteins regulieren, die zur Produktion infektiöser Viruspartikel führt, und somit eine massiv benötigte Therapie für HCV-assoziierte Erkrankungen.
Zusätzlich haben wir außerdem eine zelluläre Signalpeptidpeptidase (SPPase) identifiziert, die das HCV-Genom prozessieren kann. Diese SPPase kann das Poly-Protein an einer spezifischen Signalpeptidpeptidasestelle, die sich an der Verbindung der Core-E1-Sequenzen befindet, spalten. Die hier präsentierten Daten liefern zwingende Beweise, dass die Core-E1-Sequenz zuerst durch Signalpeptidasen in dem Spaltungsereignis 1° gespalten wird, wonach eine Prozessierung durch eine zelluläre SPPase in dem Spaltungsereignis 2° stattfindet. Wir waren außerdem erfolgreich beim genauen Kartieren der Peptidsequenzen, die durch die zelluläre Signalpeptidase, 1°-Spaltstelle, und durch die zelluläre SPPase, 2°-Spaltstelle, gespalten wurden. Dies sind signifikante Erkenntnisse.
Die Sequenz der spezifischen SPPase wurde in der WO-A-01/12660 offenbart. Jedoch offenbarte dieses Dokument keine technische Information über die Sequenz. Insbesondere wurde der Sequenz keine spezifische Funktion zugeordnet. Darüber hinaus gibt es keine Erwähnung von HCV.
Eine Zielsequenz kann das Signalpeptid umfassen, das für die Translokation/Zielsteuerung und Signalpeptidabspaltung notwendig ist. Bei HCV erfolgt dies typischerweise zwischen den Resten 170-197, genauer gesagt 173-188.
Eine zusammengesetzte Zielsequenz kann ein Lipidtröpfchen-Bindungsmotiv umfassen (Reste 118-169), ein Signalpeptid, das für die Translokation/Zielsteuerung und die Signalpeptidspaltung notwendig ist (Reste 170-197), sowie ein Subfragment des Signalpeptids, das die SPPase-Spaltstelle darstellt (Reste 173-188, siehe SEQ ID No: 3).
Hier zeigen wir, dass die Spaltung des HCV-Polyproteins durch das Signalpeptidpeptidase (SPPase)-Enzym das HCV-Core-Protein von der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) ablöst. Nach dem Spaltungsereignis gibt es eine nachfolgende Wanderung von Core zu Lipidtröpfchen im Zytosol.
Die „minimale" HCV-Core-Sequenz, die durch SPPase erkannt wird, kann ein Abschnitt von wenigstens 8 oder mehr hydrophoben Aminosäureresten sein, die eine Helix ausbilden, die z.B eine Gruppe von Aminosäureresten umfasst, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Aminosäuren Leu, Ile, Val, Phe, Trp, Met enthalten kann.
Typischerweise enthält die SPPase-Sequenz außerdem wenigstens einen oder mehrere Helix-brechende(n) Rest(e) mit kleinen Seitenketten, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, die Aminosäuren Gly, Ser, Asn, Ala, Cys beinhalten können. Ohne sich hier theoretisch festlegen zu wollen, schlagen wir vor, dass der Zweck des hydrophoben Aminosäureabschnitts darin besteht, in die Lipid-Doppelschicht einzutreten bzw. diese zu durchspannen, während die Helix-brechenden (Helix-beugenden) Reste Flexibilität im Peptid-Rückgrat erzeugen, welches in Folge zugänglich für SPPase wird.
Am wichtigsten ist, dass wir einen spezifischen Inhibitor identifiziert haben, der die SPPase-Prozessierung von Core in vitro blockiert, und wir stellen den ersten formalen Nachweis bereit, dass das Core-E1-Signalpeptid ein spezifisches Substrat für SPPase ist. Durch Mutieren des Core-E1-Signalpeptidpeptidasesignals, derart dass die SPPase-Prozessierung sowohl in vivo als auch in vitro blockiert wird, zeigen wir, dass diese zweite Spaltung wichtig (z.B entscheidend) ist für die Ablösung von ER-Membranen, was wiederum die nachfolgende Assoziation mit Lipidtröpfchen erlaubt. Interessanterweise haben wir außerdem gezeigt, dass die Unfähigkeit zur Freisetzung von der ER-Membran bei einer mutanten Form von Core nach der SPPase-katalysierten Proteolyse einige Mutanten des Proteins nicht den abbauenden Prozessen aussetzt, die auf Core einwirken.
In Ermangelung jedweder früheren formellen Definition der Aktivität, die die Spaltung durch Signalpeptidpeptidasen beschreibt, schlagen wir, ohne uns hier theoretisch festlegen zu wollen, vor, dass SPPase eine mit Präsenilin verwandte, am ER lokalisierte Aspartyl-Protease ist, die die Intra membran-Proteolyse von Signalpeptiden unterstützt. Somit stellt die Katalyse von HCV-Core durch SPPase, die dann die Assoziation von Core mit intrazellulären Lipidkügelchen im Zytosol unterstützt, ein Ziel für Therapien dar, die dafür angelegt sind, die Wirkungen und/oder das Fortschreiten der HCV-Infektion zu verhindern oder zu reduzieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um ein Kandidatenmittel zu identifizieren, welches eine virale Infektion beeinflussen kann, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer ersten Komponente, welche eine Zielsequenz für Signalpeptidpeptidase umfasst,
(b) Bereitstellen einer zweiten Komponente, welche eine Signalpeptidpeptidase umfasst,
(c) Inkontaktbringen der beiden Komponenten mit einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung der beiden Komponenten in Abwesenheit des Mittels gestatten, und
(d) Bestimmen, ob das Mittel die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert,

Der Begriff „ableitbar von", wie er hier verwendet wird, bedeutet, dass die Sequenz nicht tatsächlich von HCV selbst erhalten werden muss. Beispielsweise kann die Sequenz durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt werden.
Die Modulation (z.B die Trennung) der Interaktion zwischen der ersten und der zweiten Komponente durch das Kandidatenmittel zeigt typischerweise an, dass das Mittel befähigt ist, die virale Infektion zu beeinflussen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das zu testende Mittel einer Zelle verabreicht, wobei die SPPase-Zielsequenz in dieser Zelle exprimiert wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Signalpeptidpeptidase eine rekombinante Signalpeptidpeptidase oder ein natürlicher Bestandteil dieser Zelle.
Das Verfahren der Erfindung kann weiterhin folgendes umfassen:

(e) Verabreichen eines Virus an eine Zelle in Abwesenheit des Mittels, von dem festgestellt wurde, dass es die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert,
(f) Verabreichen des Virus an die Zelle in Gegenwart des Mittels und
(g) Bestimmen, ob das Mittel die Anfälligkeit der Zelle für eine virale Infektion oder die Auswirkungen einer viralen Infektion reduziert oder beseitigt.

Die vorliegende Erfindung liefert außerdem ein Verfahren zur Identifizierung eines Mittels zur Behandlung oder Verhinderung einer Hepatitisinfektion oder anderen Virusinfektion, wobei das Verfahren die Bestimmung umfasst, ob dieses Mittel die Expression eines Signalpeptidpeptidaseenzyms in einer Säugerzelle modulieren kann.
Dort, wo Zellen bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, sind die Zellen bevorzugt Säugerzellen, bevorzugter Primatenzellen, z.B menschliche Zellen. Die Zielzellen, die durch das Virus von Interesse infiziert werden, sind für die Verwendung bei den Testverfahren dieser Erfindung besonders bevorzugt. Vor allem Leberzellen sind besonders bevorzugt.
Agenzien, die durch die Verfahren der Erfindung identifizierbar sind, können bei Verfahren zur Beeinflussung der viralen Infektion verwendet werden, wie etwa zur Behandlung oder Verhinderung der viralen Infektion.
Es wird außerdem ein Verfahren beschrieben, umfassend die Identifizierung eines zur Beeinflussung viraler Infektion befähigten Mittels durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung und dann entweder Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die das Mittel zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, oder Modifizieren des Mittels, um dessen antivirale Eigenschaften zu verändern, wobei dann optional ein geeignet modifiziertes Mittel zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel enthalten ist.
Es wird außerdem ein Mittel beschrieben, das befähigt ist, eine Interaktion zwischen (i) einer SPPase-Zielsequenz und (ii) einer SPPase zur Verwendung bei der Beeinflussung einer Virusinfektion aufzubrechen, bevorzugt wobei die Zielsequenz von HCV-Core-Protein oder einem Derivat, einer Variante oder einem Homologen hiervon ableitbar ist.
Da wir zeigen, dass HCV-Core-E1-Protein und Fragmente hiervon durch SPPase prozessiert werden (was wiederum den Transport zu den intrazellulären Lipidkügelchen beeinflusst), kann ein Protein, umfassend HCV-Core-E1-Protein oder Fragmente hiervon, verwendet werden, um die Wirkung von HCV-Core-E1-Protein, das im Verlauf der HCV-Infektion produziert wird, zu reduzieren oder zu verhindern.
Es wird außerdem ein Protein, umfassend eine SPPase-Zielsequenz, für die Verwendung bei der Verhinderung oder Behandlung einer viralen Infektion beschrieben, wobei die Zielsequenz von HCV-Core-E1-Protein oder einem Derivat, einer Variante oder einem Homologen hiervon ableitbar ist.
Bevorzugt sind die HCV-Core-E1-Proteinaminosäuren 173 bis 188 (SEQ ID No: 3) vorhanden.
Die SPPase-Zielsequenz kann eine hydrophile Aminosäuresequenz von wenigstens 4 Aminosäuren umfassen. Die SPPase-Zielsequenz kann eine hydrophile Aminosäuresequenz von wenigstens 5 Aminosäuren umfassen. Die SPPase-Zielsequenz kann eine hydrophile Aminosäuresequenz von wenigstens 6 Aminosäuren umfassen. Die SPPase-Zielsequenz kann eine hydrophile Aminosäuresequenz von wenigstens 7 Aminosäuren umfassen. Die SPPase-Zielsequenz kann eine hydrophile Aminosäuresequenz von wenigstens 8 Aminosäuren umfassen.
Mittel, die die Interaktion von HCV-Core-Protein mit intrazellulärer SPPase modulieren, können in die normale Funktion des Core-Proteins eingreifen. Ein Beispiel einer „normalen Funktion" wäre dessen Assoziation mit Lipidtröpfchen, moduliert durch Reduzieren der Affinität von SPPase für HCV-Core-Zielsequenzen.
Im folgenden Textteil wird Signalpeptidpeptidase aus praktischen Gründen als SPPase bezeichnet. Ebenso, und wie hier verwendet, bezieht sich „Aminosäure" auf eine Peptid- oder Proteinsequenz und kann sich auf Teile hiervon beziehen. Zusätzlich ist der Begriff „Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung" synonym mit dem Ausdruck „Polypeptid der vorliegenden Erfindung". Auch ist der Begriff „Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung" synonym mit dem Ausdruck „Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung".
Aspekte der vorliegenden Erfindung
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein Kandidatenmittel zu identifizieren, welches eine virale Infektion beeinflussen kann, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen einer ersten Komponente, welche eine Zielsequenz für die Signalpeptidpeptidase-Spaltung umfasst,
(b) Bereitstellen einer zweiten Komponente, welche ein Signalpeptidpeptidase-Enzym umfasst,
(c) Inkontaktbringen der beiden Komponenten mit einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung der beiden Komponenten in Abwesenheit des Mittels gestatten, und
(d) Bestimmen, ob das Mittel die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert,

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zum Identifizieren eines Mittels zur Behandlung oder Verhinderung einer Hepatitisinfektion oder anderen viralen Infektion der menschlichen oder tierischen Leber, wobei das Verfahren die Bestimmung umfasst, ob das Mittel die Expression oder Aktivität eines Signalpeptidpeptidaseenzyms in einer Säugerzelle modulieren kann.
Bei einem weiteren Aspekt wird ein Proteinfragment bereitgestellt, das aus einer Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz besteht, wobei das Fragment aus der SEQ ID No: 3 des HCV-Core-Proteins besteht oder aus der SEQ ID No: 4, 5 oder 6 besteht.
Bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung
Als ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung kann das Kandidatenmittel, das die Interaktion zwischen der Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und dem Signalpeptidpeptidaseenzym moduliert, einer Zelle verabreicht werden, wobei die Spaltungszielsequenz der Signalpeptidpeptidase in dieser Zelle exprimiert wird.
Bevorzugt ist die Signalpeptidpeptidase eine rekombinante Signalpeptidpeptidase oder ein natürlicher Bestandteil der Zelle.
Bevorzugt umfasst das Verfahren weiterhin:

(a) Verabreichen eines Virus an eine Zelle in Abwesenheit des Kandidatenmittels, von dem festgestellt wurde, dass es die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert,
(b) Verabreichen des Virus an die Zelle in Gegenwart des Mittels und
(c) Bestimmen, ob das Mittel die Anfälligkeit der Zelle für eine virale Infektion oder die Auswirkungen einer viralen Infektion reduziert oder beseitigt.

Eine bevorzugte Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz umfasst die SEQ ID No. 3 des HCV-Core-Proteins oder ein Homologes davon mit wenigstens 60% Identität dazu.
Bevorzugt ist die Zelle eine Leberzelle (Hepatozyte).
Bei einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das Proteinfragment verwendet, um eine virale Infektion zu verhindern oder zu behandeln.
Bevorzugt wird das Polynukleotid, das für das Proteinfragment codiert, verwendet, um eine virale Infektion zu behandeln.
Bevorzugt wird die Verwendung des Proteinfragments oder des Polynukleotids bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung oder Verhinderung einer viralen Infektion bereitgestellt.
Bevorzugt ist die virale Infektion eine Hepatitisinfektion oder eine andere virale Infektion der menschlichen oder tierischen Leber.
Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Obwohl die hier erwähnten Techniken allgemein in der Technik wohlbekannt sind, kann insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc. verwiesen werden.
A. Proteine/Polypeptide
Der Begriff „Protein" beinhaltet einzelkettige Polypeptidmoleküle ebenso wie Multi-Polypeptidkomplexe, bei denen einzelne als Bestandteile vorliegende Polypeptide durch kovalente oder nicht-kovalente Mittel verbunden sind. Der Begriff „Polypeptid" beinhaltet Peptide mit zwei oder mehr Aminosäuren Länge, typischerweise mit mehr als 5, 10 oder 20 Aminosäuren.
SPPase-Zielsequenz
Der Begriff „SPPase-Zielsequenz" bezeichnet eine Aminosäuresequenz, die zur Assoziation mit SPPase befähigt ist, bevorzugt mit einer biologisch vorkommenden SPPase, wie etwa einer intrazellulären SPPase. Die SPPase-Assoziation kann in einer nicht-zellulären und/oder extrazellulären Umgebung stattfinden, wie etwa in einer Apparatur- z.B einer Schale, einem Röhrchen, einer Flasche bzw. einem Kolben, oder sogar in einem Bottich. Alternativ kann sie in einer zellulären Umgebung stattfinden, wo die exprimierte Zielsequenz zu dem intrazellulären SPPase-Protein geleitet wird.
Die SPPase-Zielsequenz ist von Viren abgeleitet, deren genomische Sequenz wenigstens 60% Identität zu HCV-Core-Protein besitzt.
So kann beispielsweise, ausgehend von Sequenzvergleichen, die Region von HCV Core auch vorhanden sein in dem entsprechenden Protein von GB Virus B (GBV-B), einem Virus, dessen genomische Sequenz signifikante Ähnlichkeit zu HCV besitzt. GBV-B ist unter der Gattung der Flaviviridae noch unklassifiziert. GBV-B hat mit HCV einen Tropismus für Leber-Hepatozyten gemeinsam und ist bei Tamarinen infektiös. Somit ist vorgeschlagen worden, dass die GBV-B-Infektion von Tamarinen ein Ersatzmodellsystem für die HCV-Infektion von Menschen sein kann (Virology, 1999, 262, 470-2478). Die Sequenz von GBV-B Core-Protein ist in J. Biol. Chem. (2002) 277, S. 4261-4270 gezeigt. Ein Aminosäurevergleich zwischen den vorhergesagten Core-Proteinen von HCV und GBV-B zeigt, dass die Aminosäuren in GBV-B, die den Positionen 173-188 von HCV entsprechen, die folgenden sind: ¹⁴⁰VHLFWCLLSLACPCSG¹⁵⁶. Vorteilhafter Weise kann das GBV-B Core-Protein verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, die befähigt sind, eine virale Infektion zu beeinflussen, wie etwa eine HCV-Infektion.
Eine hochgradig bevorzugte Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz besteht aus den SEQ ID No: 3, 4, 5 oder 6.
Die Fähigkeit einer Aminosäuresequenz, mit SPPase zu assoziieren bzw. auf SPPase abzuzielen, kann entweder in vitro oder in vivo bestimmt werden. Beispielsweise kann eine Kandidaten-Zielsequenz mit einem Protein von Interesse verbunden werden, und in eine Milch-produzierende Zelle in Kultur eingeführt werden, und es kann bestimmt werden, ob die Zielsequenz bzw. das Protein von Interesse in das Kulturmedium sekretiert wurde. Die immunzytochemische Technik, die in den Beispielen dargestellt ist, kann ebenfalls verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann es möglich sein, sowohl auf die SPPase-Zielsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung als auch auf Sequenzen abzuzielen, die verantwortlich dafür sind, Core von intrazellulären Lipidkügelchen zu verdrängen und/oder die Niveaus an Core-Protein in einer Zelle zu reduzieren, wenn eine Expression in oder eine Verabreichung an die Zelle erfolgt (zur Veranschaulichung siehe Beispiele). Geeignete Techniken zur Bestimmung, ob eine Kandidatensequenz diese Eigenschaften besitzt, sind unten beschrieben.
Geeignete SPPase-Zielsequenzen werden von einem HCV-Core-Protein erhalten. Die Aminosäuresequenz des HCV-Core-Proteins ist für eine große Anzahl an verschiedenen HCV-Isolaten erhalten worden. Diese Sequenzen sind für den Fachmann leicht zugänglich. Eine solche Sequenz für HCV entspricht dem Stamm Glasgow (Hope und McLauchlan, J Gen Virol, 2000, Aug; 81 Pt 8: 1913-1925). Die Mittel zur Klonierung und Identifizierung neuer HCV-Stämme und somit zum Erhalt weiterer Core-Sequenzen können auf denen basieren, die in der EP-B-318,216 beschrieben sind.
Es ist bevorzugt, Fragmente des HCV-Core-Proteins zu verwenden, die befähigt sind, Moleküle, mit denen sie verbunden sind, auf SPPase hin zu steuern. Die Aminosäurenummerierung für bevorzugte unten dargestellte Fragmente erfolgt im Bezug auf den Glasgow Stamm von HCV. Es versteht sich jedoch, dass gleichwertige Fragmente des Core-Proteins anderer HCV-Stämme/Isolate ebenfalls verwendet werden können. Eine von HCV-Coreprotein ableitbare SPPase-Zielsequenz der Erfindung ist bevorzugt eine minimale Aminosäuresequenz, die außerdem ein Molekül, typischerweise ein Protein, zu Lipidkügelchen steuern kann. Die Minimalsequenz wird typischerweise eine Helix-brechende hydrophobe Aminosäuresequenz, abgeleitet von den Aminosäuren 118 bis 197 einer HCV-Core-Sequenz, umfassen, wobei diese bevorzugt verbunden ist mit einer hydrophilen Aminosäuresequenz von wenigstens 5, bevorzugt 10, bevorzugter von wenigstens 12 Aminosäuren. Es ist nicht notwendig, dass die hydrophile Sequenz direkt mit der hydrophoben Sequenz zusammenhängt. Beispielsweise kann ein Protein von Interesse zwischen die beiden Sequenzen platziert werden, sodass die hydrophile Sequenz am N-Terminus und die hydrophobe Sequenz sich am C-Terminus befindet.
Die hydrophobe Aminosäuresequenz umfasst typischerweise wenigstens 8, bevorzugt wenigstens 15 oder 20 zusammenhängende Aminosäuren und besitzt einen Hydropathie-Index von wenigstens +40 kJ/Mol (bestimmt z.B theoretisch, wie beschrieben von Engelman et al., 1986, Ann Rev Biophys Chem, 15, 343). Die hydrophile Aminosäuresequenz besitzt typischerweise eine Hydropathie-Auftragung von weniger als –20 kJ/Mol, bevorzugt von weniger als –40 kJ/Mol.
Bevorzugt enthalten die HCV-Core-Fragmente die Aminosäuren 118 bis 197.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die SPPase-Zielsequenz der Erfindung eine hydrophile Aminosäuresequenz, die die Aminosäuren 170 bis 197 der HCV-Core-Sequenz oder einer Variante, eines Homologen oder eines Derivats hiervon enthält. Bevorzugter enthält das Fragment die Aminosäuren 173 bis 188.
Da außerdem nun gezeigt wurde, dass die Aminosäuren 9 bis 43, 49 bis 75 und 80 bis 118 nicht für die SPPase-Prozessierung benötigt werden, müssen bevorzugte HCV-Core-Protein-Fragmente nicht eine oder mehrere dieser Sequenzen beinhalten. Geeignete Fragmente werden wenigstens eine Größe von etwa 5, z.B 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren besitzen, und bevorzugt besitzen sie weniger als 100, 90, 80, 70, 60 oder 50 Aminosäuren. Bei einem bevorzugten Aspekt enthalten die Fragmente ein HCV-Epitop.
SPPase-Zielsequenzen, z.B HCV-Core-Protein-Sequenzen und Fragmente hiervon, können jedoch Teil eines größeren Polypeptids sein, z.B. eines Fusionsproteins. In diesem Fall sind die zusätzlichen Polypeptidsequenzen vorzugsweise Polypeptidsequenzen, mit denen die SPPase-Zielsequenz der Erfindung normalerweise nicht assoziiert ist.
Im Kontext der SPPase-Zielsequenz wird ein Homologes herangezogen, um eine Aminosäuresequenz einzubeziehen, die auf Aminosäureebene bei wenigstens 5, bevorzugt 8, 10, 15, 20, 30 oder 40 Aminosäuren zu wenigstens 60, 70, 80 oder 90% identisch, bevorzugt zu wenigstens 95% oder 98% identisch ist mit einer HCV-Core-Protein-SPPase-Zielsequenz, z.B wie sie in der Sequenzliste hier gezeigt ist. Insbesondere sollte Homologie typischerweise im Hinblick auf solche Regionen der Zielsequenz betrachtet werden, für die bekannt ist, dass sie für die SPPase-Assoziation essentiell sind, weniger im Hinblick auf nicht-essentielle Nachbarsequenzen. Für verschiedene Homologievergleiche wird auf die unten stehenden Verfahren verwiesen.
SPPase
Wie oben beschrieben, ist das SPPase-Enzym eine mit Präsenilin verwandte, im ER lokalisierte Aspartyl-Protease, die die Intramembran-Proteolyse von Signalpeptiden befördert.
Bei einer anderen Ausführungsform des in vitro-Assay-Verfahrens der vorliegenden Erfindung kann die SPPase zu dem Gemisch hinzugegeben werden, um im Bezug auf eine SPPase-Zielsequenz zu konkurrieren.
Das SPPase-Protein kann Säuger-SPPase oder eine Variante, ein Derivat, ein Homologes oder eine Variante hiervon sein.
Beispielsweise ist ein Homologes des SPPase-Enzyms im humanen Malaria-Parasiten Plasmodium falciparum vorhanden. Die Sequenz dieses Homologen hat die Zugangsnummer 23509765 (Nature 419 (6906), 498-511 (2002)). Vorteilhafterweise kann die Plasmodium falciparum SPPase in einem Assay verwendet werden, um Mittel zu identifizieren, die SPPase in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung modulieren, und die nützlich bei der Behandlung von Malaria und/oder von mit Malaria assoziierten Krankheiten sein können. Hintergrundwissen über Malaria ist in der Technik verfügbar, beispielsweise in Parassitologia (2002) 44, 33-42, Clin. Microbiol. Rev. (2002) 15(4): 564-94 und Chem. Immunol. (2002) 80: 50-69.
Das SPPase-Protein kann auf eine Reihe von Wegen erhalten werden, z.B durch die Reinigung aus Säugerzelllinien (Heid et al., 1998, Cell Tissue Res., 294, 309-321). Alternativ kann SPPase durch rekombinante Mittel erhalten werden, wie unten detailliert beschrieben.
Die Sequenz von humaner SPPase ist in SEQ ID No. 1 dargestellt.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in einer weitgehend isolierten Form vorliegen. Es versteht sich, dass das Polypeptid mit Trägern oder Verdünnungsmitteln gemischt werden kann, die nicht störend in den gewünschten Zweck des Polypeptids eingreifen werden, und dabei nach wie vor als weitgehend isoliert betrachtet werden kann. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann auch in einer weitgehend gereinigten Form vorliegen, wobei in diesem Fall das Polypeptid in einer Zubereitung enthalten sein wird, in der mehr als 90%, z.B 95%, 98% oder 99% des Polypeptids in der Zubereitung ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist. Polypeptide der vorliegenden Erfindung können z.B modifiziert werden durch Anfügen von Histidinresten, um ihre Reinigung zu erleichtern oder durch die Anfügung einer Signalsequenz, um ihre Sekretion aus einer Zelle zu befördern, wie unten diskutiert.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch synthetische Mittel erzeugt werden (z.B wie beschrieben von Geysen et al., 1996, Chem. Biol. 8: 679-88) oder rekombinant, wie unten beschrieben.
Rekombinante SPPase kann in einem SPPase-negativen Hintergrund exprimiert werden, wie etwa in einer Wirtszelle, die keine für SPPase codierende Nukleotidsequenz umfasst und/oder exprimiert.
Die Aminosäuresequenz deckt die native SPPase (SEQ ID No 1) ab, wenn sie in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt und wenn sie durch ihre native codierende Nukleotidsequenz exprimiert wurde, die ebenfalls in ihrer natürlichen Umgebung vorliegt, und wenn diese Nukleotidsequenz unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt.
Die Begriffe „Variante", „Homologes" oder „Fragment" im Bezug auf die Aminosäuresequenz für das Enzym beinhalten jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäuren von oder an die Sequenz, unter der Maßgabe, dass das resultierende Enzym SPPase-Aktivität besitzt, wobei es bevorzugt biologisch wenigstens so aktiv ist wie das Enzym, das in den angefügten Sequenzlisten gezeigt ist. Insbesondere deckt der Begriff „Homologes" Homologie im Hinblick auf Struktur und/oder Funktion ab. Im Hinblick auf die Sequenzhomologie gibt es bevorzugt wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu der gezeigten Sequenz (siehe SEQ ID No. 1). Bevorzugter gibt es wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu der gezeigten Sequenz (siehe SEQ ID No. 2). Bevorzugter gibt es wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu einer beliebigen der Sequenzen, die in der angefügten Sequenzliste gezeigt sind. Bevorzugter gibt es wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einer beliebigen der Sequenzen, wie sie in der angefügten Sequenzliste gezeigt sind.
Typischerweise sollten die Typen von Aminosäuresubstitutionen, die durchgeführt werden können, die Hydrophobizität/Hydrophilität der Aminosäuresequenz aufrechterhalten. Aminosäuresubstitutionen können z.B. an 1, 2 oder 3 bis 10, 20 oder 30 Substitutionen durchgeführt werden, unter der Maßgabe, dass die modifizierte Sequenz die Fähigkeit behält, als ein SPPase-Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung zu wirken. Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung nicht-natürlich vorkommender Analoga, z.B zur Erhöhung der Halbwertszeit im Blutplasma, beinhalten.
Die Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann durch die Expression einer Nukleotidsequenz erzeugt werden, die für selbige in einem geeigneten Expressionssystem codiert.
Zusätzlich oder alternativ kann das Protein selbst unter Verwendung chemischer Verfahren hergestellt werden, um eine SPPase-Aminosäuresequenz zu synthetisieren, und zwar in ihrer Gesamtheit oder als Teil. Beispielsweise können Peptide durch Festphasentechniken synthetisiert werden, von dem Harz abgespalten werden und durch präparative Hochleistungsflüssig-Chromatographie gereinigt werden (z.B Creighton (1983) Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman & Co, New York NY). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann durch Aminosäureanalyse oder durch Sequenzierung (z.B Prozedur des Edman-Abbaus) bestätigt werden.
Eine direkte Peptidsynthese kann unter Verwendung verschiedener Festphase-Techniken durchgeführt werden (Roberge JY et al., 1995, Science, 269, 202-204), und eine automatisierte Synthese kann z.B erreicht werden unter Verwendung des ABI 43 1 A Peptid-Synthesegeräts (Perkin Elmer), wobei gemäß Herstelleranweisung vorgegangen wird. Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz von SPPase oder jedes Teils hiervon bei der direkten Synthese und/oder kombiniert mittels Verwendung chemischer Verfahren mit einer Sequenz aus anderen Untereinheiten oder eines beliebigen Teils hiervon verändert werden, um ein variantes Polypeptid zu produzieren.
Eine natürliche, modifizierte oder rekombinante SPPase-Sequenz kann mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zu codieren. Beispielsweise, zum Durchtesten von Peptidbibliotheken auf Inhibitoren der SPPase-Aktivität, kann es nützlich sein, ein chimäres SPPase-Protein zu codieren, das ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem kommerziell erhältlichen Antikörper erkannt wird. Ein Fusionsprotein kann auch hergestellt werden, um eine Spaltstelle zu beinhalten, die zwischen einer SPPase-Sequenz und der heterologen Proteinsequenz liegt, sodass die SPPase gespalten und ausgehend von der heterologen Gruppierung gereinigt werden kann.
SPPase kann auch als ein rekombinantes Protein exprimiert werden, bei dem eine oder mehrere zusätzliche Polypeptiddomänen angefügt sind, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Solche die Reinigung erleichternden Domänen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Metall chelierende Peptide, wie etwa Histidin-Tryptophan-Module, die eine Reinigung an immobilisierten Metallen erlauben (Porath J, 1992, Protein Expr Purif 3), Protein A-Domänen, die eine Reinigung an immobilisiertem Immunglobulin erlauben, und die Domäne, die im FLAGS Verlängerungs-/Affinitäts-Reinigungssystem (Immunex Corp, Seattle, WA) verwendet wird. Die Einbeziehung einer spaltbaren Linkersequenz, wie etwa von Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA), zwischen der Reinigungsdomäne und der SPPase ist nützlich, um die Reinigung zu erleichtern.
Spezifische Aminosäuresequenzen von SPPase sind als SEQ ID No. 1 dargestellt. Jedoch umfasst die vorliegende Erfindung Aminosäuresequenzen, die für andere Mitglieder der SPPase-Familie codieren, was Aminosäuresequenzen einbezieht, die wenigstens 60% Identität (bevorzugter wenigstens 75% Identität) zu einer beliebigen der Aminosäuresequenzen von SEQ ID No. 1 besitzen. Wie angezeigt, werden geeignete generische Formeln für die SPPase-Familie in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung präsentiert.
B. Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung
Der Begriff „Nukleotidsequenz", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Oligonukleotidsequenz oder eine Polynukleotidsequenz. Die Nukleotidsequenz kann DNA oder RNA sein, die genomischen, synthetischen oder rekombinanten Ursprungs sein kann, die doppelsträngig oder einzelsträngig sein kann und den Sinn- oder den Gegensinn-Strang repräsentieren kann.
Bei einigen Ausführungsformen bezeichnet der Begriff „Nukleotidsequenz" DNA. In diesen Fällen bedeutet der Begriff „Nukleotidsequenz" bevorzugt DNA, die durch die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt wurde (d.h. rekombinante DNA).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform deckt die Nukleotidsequenz per se der vorliegenden Erfindung nicht die native codierende Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in ihrer natürlichen Umgebung ab, wenn diese unter der Kontrolle ihres nativen Promotors steht, der ebenfalls in seiner natürlichen Umgebung vorliegt. Zur Erleichterung der Bezugnahme haben wir diese bevorzugte Ausführungsform die „nicht-native Nukleotidsequenz" genannt.
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können in sich synthetische oder modifizierte Nukleotide enthalten. Es ist eine Anzahl verschiedener Typen von Modifikation an Oligonukleotiden in der Technik bekannt. Diese beinhalten Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Rückgrate und die Anfügung von Acridin- oder Polylysin-Ketten an das 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht es sich, dass die hier beschriebenen Nukleotidsequenzen durch jedwedes in der Technik verfügbare Verfahren modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität und/oder Lebensdauer von Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung zu erhöhen.
Es werden Nukleotidsequenzen beschrieben, die zu den hier dargestellten Sequenzen oder beliebigen Derivaten, Fragmenten oder Derivaten hiervon komplementär sind. Wenn die Sequenz komplementär zu einem Fragment hiervon ist, so kann diese Sequenz als Sonde verwendet werden, um ähnliche codierende Sequenzen in anderen Organismen zu identifizieren, etc.
Es werden Nukleotidsequenzen beschrieben, die befähigt sind, mit den hier dargestellten Sequenzen oder einem beliebigen Derivat, Fragment oder Derivat hiervon zu hybridisieren.
Es werden Nukleotidsequenzen beschrieben, die befähigt sind, mit Sequenzen zu hybridisieren, die komplementär sind zu den hier dargestellten Sequenzen, oder zu einem beliebigen Derivat, Fragment oder Derivat hiervon.
Der Begriff „Variante" umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen hybridisieren können.
Der Begriff „Variante" umfasst bevorzugt Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die unter stringenten Bedingungen (z.B 65°C und 0,1x SSC {1xSSC: 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-Citrat, pH 7,0}) an die hier dargestellten Nukleotidsequenzen hybridisieren können.
Nukleotidsequenzen, die an die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung hybridisieren können (einschließlich komplementärer Sequenzen der hier dargestellten Sequenzen), werden ebenfalls beschrieben.
Nukleotidsequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die an die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung hybridisieren können, (einschließlich komplementärer Sequenzen der hier dargestellten Sequenzen), werden ebenfalls beschrieben.
Polynukleotidsequenzen, die mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen unter Bedingungen mittlerer bis maximaler Stringenz hybridisieren können, sind ebenfalls beschrieben.
Nukleotidsequenzen, die mit den Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung oder einer komplementären Sequenz hierzu unter stringenten Bedingungen (z.B 65°C und 0,1x SSC) hybridisieren können, sind ebenfalls beschrieben.
Beispielhafte Nukleinsäuren können alternativ als solche Nukleotidsequenzen charakterisiert werden, die ein SPPase-Protein codieren und die mit irgendeiner oder mehreren der DNA-Sequenzen, die in der angefügten Sequenzliste gezeigt sind, hybridisieren. Bevorzugt sind solche Sequenzen codierende SPPase-Sequenzen, die unter hoch-stringenten Bedingungen an eine beliebige der in der angefügten Sequenzliste dargestellten Sequenzen oder an das komplementäre Gegenstück hiervon hybridisieren.
Es werden Nukleinsäuresequenzen beschrieben, die befähigt sind, unter stringenten Bedingungen an ein Fragment irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind, oder an das komplementäre Gegenstück hiervon zu hybridisieren. Bevorzugt ist das Fragment zwischen 15 und 50 Basen lang. Vorteilhafterweise ist es etwa 25 Basen lang.
Die Begriffe „Variante", „Homologes" oder „Fragment" im Bezug auf die Nukleotidsequenz, die für das SPPase-Enzym codiert, beinhalten jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jedwede Deletion oder Addition von einem (oder mehreren) Nukleotid(en) von oder an die Sequenz, unter der Maßgabe, dass die resultierende Nukleotidsequenz für ein Enzym mit SPPase-Aktivität codiert oder codieren kann, wobei dieses bevorzugt biologisch wenigstens so aktiv ist wie das Enzym, das von irgendeiner der Sequenzen codiert wird, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind. Insbesondere der Begriff „Homologes" deckt Homologie im Hinblick auf die Struktur und/oder Funktion ab, unter der Maßgabe, dass die resultierende Nukleotidsequenz für ein Enzym mit SPPase-Aktivität codiert oder codieren kann. Im Hinblick auf die Sequenzhomologie gibt es bevorzugt wenigstens eine 75%ige, bevorzugter eine wenigstens 85%ige, bevorzugter eine wenigstens 90%ige Homologie zu einer Nukleotidsequenz der SEQ ID No. 2, die für die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Bevorzugter gibt es wenigstes 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu einer Nukleotidsequenz der SEQ ID No. 2, die für die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert. Bevorzugt, im Hinblick auf die Sequenzhomologie, gibt es vorzugsweise wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind. Bevorzugter gibt es wenigstens 95%, noch bevorzugter wenigstens 98% Homologie zu irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind.
Homologe Sequenzen für die Nukleotidsequenz, die für das SPPase-Enzym codiert, sind in 14 gezeigt, und sind außerdem beschrieben in Science (2002) 296, S. 2215-2218.
Es werden DNA-Segmente beschrieben, die die DNA-Sequenz irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind, oder allelischer Variationen solcher Sequenzen umfassen.
Es werden Polypeptide beschrieben, die durch die Expression in einer Wirtszelle erzeugt werden, in die die vorstehend genannten DNA-Sequenzen oder allelische Variationen hiervon eingebaut wurden.
Es wird DNA beschrieben, die die DNA-Sequenz irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind, oder einer allelischen Variation hiervon umfasst.
Es wird nicht-native DNA beschrieben, die die DNA-Sequenz irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind, oder einer allelischen Variation hiervon umfasst.
Es wird rekombinante DNA beschrieben, die die DNA-Sequenz irgendeiner der Sequenzen, die in der angehängten Sequenzliste gezeigt sind, oder einer allelischen Variation hiervon umfasst.
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung beinhalten Nukleinsäuresequenzen, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren. Es wird ersichtlich sein, dass als Folge der Degene riertheit des genetischen Codes eine Bandbreite verschiedener Polynukleotide eine gegebene Aminosäuresequenz codiert.
Durch die Kenntnis der hier dargestellten Aminosäuresequenzen ist es möglich, partielle und volle Länge besitzende Nukleinsäuresequenzen, wie etwa cDNA-Klone und/oder genomische Klone, die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, zu entwerfen. Beispielsweise können Polynukleotide der vorliegenden Erfindung unter Verwendung degenerierter PCR erhalten werden, die Primer verwenden wird, die erstellt wurden, um auf Sequenzen abzuzielen, die die hier präsentierten Aminosäuresequenzen codieren. Die Primer werden typischerweise mehrere degenerierte Positionen enthalten. Jedoch, um die Degeneriertheit zu minimieren, werden Sequenzen ausgewählt, die Regionen der hier präsentierten Aminosäuresequenzen codieren, die Aminosäuren, wie etwa Methionin enthalten, die durch nur ein Triplett codiert werden. Zusätzlich werden Sequenzen ausgewählt, um die Codon-Nutzung in dem Organismus zu berücksichtigen, dessen Nukleinsäure als Matrizen-DNA für die PCR-Prozedur verwendet wird. Die PCR wird bei Stringenzbedingungen angewendet werden, die niedriger sind als diejenigen, die für die Klonierung von Sequenzen mit Einzelsequenz- (nicht degenerierten) Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet wurden.
Nukleinsäuresequenzen, die durch PCR erhalten werden, und die für Polypeptidfragmente der vorliegenden Erfindung codieren, können dann verwendet werden, um unter Verwendung von Bibliotheks-Durchmusterungs-Techniken mittels Hybridisierung größere Sequenzen zu erhalten. Beispielsweise kann ein identifizierter Klon durch PCR mit radioaktiven Atomen markiert werden und verwendet werden, um eine cDNA-Bibliothek oder genomische Bibliothek von anderen Spezies, bevorzugt anderen Säugerspezies, zu durchmustern. Die Hybridisierungsbedingungen werden typischerweise Bedingungen von mittlerer bis hoher Stringenz sein (z.B 0,03 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat bei etwa 50°C bis 60°C).
Die degenerierten Nukleinsäuresonden, die die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz codieren, können auch verwendet werden, um cDNA und/oder genomische Bibliotheken anderer Spezies, bevorzugt anderer Säugerspezies, einer Sondenmarkierung zu unterziehen. Es ist jedoch bevorzugt, die PCR-Techniken zuerst durchzuführen, um eine einzige Sequenz für die Verwendung bei weiteren Durchmusterungsprozeduren zu erhalten.
SPPase-Polynukleotidsequenzen, die für SPPase, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente hiervon codieren, können verwendet werden, um rekombinante DNA-Moleküle zu erzeugen, die die Expression von SPPase in geeigneten Wirtszellen steuern. Aufgrund der innewohnenden Degeneriertheit des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die eine im Wesentlichen gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, verwendet werden, um SPPase zu klonieren und zu exprimieren. Wie von Fachleuten verstanden werden wird, kann es vorteilhaft sein, SPPase-codierende Nukleotidsequenzen, die nicht natürli cherweise vorkommende Codons besitzen, zu produzieren. Codons, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden (Murray et al., 1989, Nuc Acids Res, 17, 477-508) können ausgewählt werden, z.B um die Rate der SPPase-Expression zu steigern oder um rekombinante RNA-Transkripte zu produzieren, die die gewünschten Eigenschaften, wie etwa eine längere Halbwertszeit als solche Transkripte besitzen, die von der natürlich vorkommenden Sequenz produziert werden.
Polynukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, die unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken erhalten wurden, können verwendet werden, um weitere homologe Sequenzen und Varianten unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken zu erhalten. Sie können auch modifiziert werden für die Verwendung zur Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung in einer Vielzahl von Wirtszellsystemen, z.B um die Codon-Präferenz für eine bestimmte Wirtszelle zu optimieren, in der die Polynukleotidsequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzveränderungen können gewünscht sein, um Restriktionsenzymerkennungsstellen einzuführen, oder um die Eigenschaften oder Funktion der von den Polynukleotiden codierten Polypeptide zu verändern.
Veränderte SPPase-Polynukleotidsequenzen, die in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden können, beinhalten Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen verschiedener Nukleotidreste, was zu einem Polynukleotid führt, das das gleiche oder ein funktionell äquivalentes SPPase-Enzym codiert. Das Protein kann auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten aufweisen, die eine stille Veränderung erzeugen und in einem funktionell äquivalenten SPPase-Enzym resultieren. Vorsätzliche Aminosäuresubstitutionen können auf Basis einer Ähnlichkeit der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilität und/oder der amphipathischen Natur der Reste durchgeführt werden, solange die biologische Aktivität des SPPase-Proteins erhalten bleibt. Beispielsweise beinhalten negativ geladene Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren beinhalten Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilitätswerten beinhalten Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin (siehe Aminosäure-Tabelle 1, unten).
Eingeschlossen in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung sind Allele von SPPase. Wie hier verwendet, ist ein „Allel" oder eine „allele Sequenz" eine alternative Form des endogenen SPPase-Enzyms. Allele resultieren aus einer Mutation, d.h. einer Veränderung der Nukleinsäuresequenz, und produzieren im Allgemeinen veränderte mRNAs oder Polypeptide, deren Struktur oder Funktion verändert oder unverändert sein kann. Jedes gegebene Gen kann keine, eine oder zahlreiche allele Formen besitzen. Allgemeine Mutationsveränderungen, die zur Entstehung von Allelen führen, werden im Allgemeinen Deletionen, Additionen oder Substitutionen von Aminosäuren zuge schrieben. Jeder dieser Typen von Veränderungen kann alleine oder in Kombination mit den anderen erfolgen, einmal oder mehrmals bei einer gegebenen Sequenz.
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können künstlich erzeugt werden, um die für SPPase codierende Sequenz aus einer Vielzahl von Gründen zu verändern, wobei diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, Veränderungen beinhalten, die die Klonierung, Prozessierung und/oder Expression des Genprodukts modifizieren. Beispielsweise können Mutationen unter Verwendung von Techniken eingeführt werden, die in der Technik wohlbekannt sind, z.B positionsspezifische Mutagenese zur Einführung neuer Restriktionsstellen, zur Veränderung des Glykosylierungsmusters oder zur Veränderung der Codon-Bevorzugung.
Polynukleotide der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um einen Primer herzustellen, z.B einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, eine Sonde, z.B markiert mit einer aussagekräftigen Markierung durch konventionelle Mittel unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen, oder die Polynukleotide können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden wenigstens 15, bevorzugt wenigstens 20, z.B wenigstens 25, 30 oder 40 Nukleotide lang sein.
Polynukleotide oder Primer können eine identifizierbare Markierung tragen. Geeignete Markierungen beinhalten Radioisotope, wie etwa ³²P, ³³P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie etwa Biotin. Solche Markierungen können an Polynukleotide oder Primer der vorliegenden Erfindung angefügt werden und können unter Verwendung von Techniken, die als solche bekannt sind, detektiert werden.
Polynukleotide, wie etwa DNA-Polynukleotide und Primer, können rekombinant, synthetisch oder durch beliebige Mittel, die dem Fachmann auf dem Gebiet zugänglich sind, hergestellt werden. Sie können außerdem durch Standardtechniken kloniert werden.
Im Allgemeinen werden Primer durch synthetische Mittel hergestellt, was eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz mit einem Nukleotid je Zeiteinheit beinhaltet. Techniken, um dies unter Verwendung automatisierter Techniken zu erreichen, sind in der Technik problemlos verfügbar.
Längere Polynukleotide werden allgemein unter Verwendung rekombinanter Mittel hergestellt, z.B unter Verwendung von PCR (Polymerasekettenreaktion)-Klonierungstechniken. Dies wird die Herstellung eines Paars von Primern (z.B bevorzugt mit zwischen 15 und 30 Nukleotiden Länge) für eine Region der Nukleotidsequenz, die man klonieren will, beinhalten, wobei man die Primer in Kontakt bringt mit mRNA oder cDNA, die man von einer Pilz-, Pflanzen- oder prokaryotischen Zelle erhalten hat, und wobei man eine Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen durchführt, die die Amplifikation der gewünschten Region mit sich bringen, gefolgt vom Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B durch Reinigen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und dem Wiedergewinnen des amplifizierten DNA-Fragments. Die Primer können spezifisch entworfen werden, um geeignete Endonuklease-Restriktionsstellen zu enthalten, sodass das amplifizierte DNA-Fragment in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann. DNA-Moleküle können mit Vorsatz modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und die Halbwertszeit zu verlängern, beispielsweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, durch die Anfügung flankierender Sequenzen an das 5'- und/oder 3'-Ende des Moleküls oder durch die Verwendung von Phosphorothioat oder 2'-O-Methyl anstelle der Phosphodiester-Verbindungen im Rückgrat des Moleküls.
Wie zuvor erwähnt, werden Nukleotidsequenzen beschrieben, die befähigt sind, mit der Gesamtheit oder einem Teil einer beliebigen der Sequenzen zu hybridisieren, die in der angefügten Sequenzliste gezeigt sind, oder mit einer allelischen Variation hiervon. Diese Nukleotidsequenzen können in Antisense-Techniken verwendet werden, die in der Technik bekannt sind, um die SPPase-Expression zu modifizieren. Alternativ können diese Sequenzen (oder Teile hiervon) als Sonde verwendet werden, oder um die Gesamtheit oder einen Teil einer solchen Sequenz zu amplifizieren, wenn sie als Polymerasekettenreaktions-Primer verwendet werden.
Zusätzlich zu den rekombinanten DNA-Sequenzen, sind genomische Sequenzen auch von Nutzen im Kontext der Arzneimittelentdeckung. Es kann eher wertvoll sein, die mRNA-Transkription einer bestimmten Isoform zu inhibieren als das translatierte Protein zu inhibieren. Dies kann im Fall von SPPase gelten, wenn es Spleiß-Varianten gibt und wenn diese verschiedenen Spleiß-Varianten von verschiedenen Promotoren aus transkribiert werden können. Es gibt den Präzedenzfall, dass multiple Promotoren die Transkription einer Maushirn-2',3'-cyclischen-Nukleotid-3'-Phosphodiesterase steuern (Kurihara T et al., 1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 170, 1074).
Ein weiterer Nutzen der Erfindung besteht darin, dass DNA-Sequenzen, sobald sie bekannt sind, die Information geben, die benötigt wird, um Assays zu erstellen, um Isoenzyme oder Spleiß-Varianten spezifisch zu detektieren. Isozym-spezifische PCR-Primer-Paare sind nur ein Beispiel für einen Assay, der vollständig von der Kenntnis der spezifischen DNA-Sequenz des Isozyms oder der Spleißvariante abhängt. Ein solcher Assay erlaubt die Detektion von mRNA für das Isozym, um die Gewebeverteilung und die biologische Relevanz jedes Isozyms bei einem bestimmten Krankheitszustand zu bestimmen. Er erlaubt auch die Identifizierung von Zelllinien, die natürlicherweise nur ein Isozym exprimieren können – eine Entdeckung, die der Notwendigkeit abhelfen kann, rekombinante Gene zu exprimieren. Wenn für spezifische SPPase-Isoenzyme gezeigt wird, dass sie mit einer Anfälligkeit für HCV-Infektion assoziiert sind, wäre die Erfindung wertvoll bei der Erstellung diagnostischer Assays, um die Anwesenheit von Isozym-mRNA zu detektieren.
Die codierende Sequenz von SPPase kann, ganz oder teilweise, unter Verwendung in der Technik wohlbekannter chemischer Verfahren synthetisiert werden (siehe Caruthers MH et al., 1980, Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T of al., 1980, Nuc Acids Res Symp Ser 225-232).
Wie hier verwendet, bezieht sich „natürlich vorkommend" auf SPPase mit einer in der Natur zu findenden Aminosäuresequenz.
Die Begriffe „isoliert" und gereinigt", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf Moleküle, entweder Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entnommen und von wenigstens einer anderen Komponente, mit der sie natürlicherweise assoziiert sind, isoliert oder abgetrennt werden.
„Biologisch aktiv", wie hier verwendet, bezieht sich auf SPPase – wie etwa eine rekombinante SPPase – mit einer ähnlichen strukturellen Funktion (jedoch nicht notwendigerweise im selben Maße) und/oder einer ähnlichen regulatorischen Funktion (jedoch nicht notwendigerweise im selben Maße) und/oder einer ähnlichen biochemischen Funktion (jedoch nicht notwendigerweise im selben Maße) und/oder immunologischen Aktivität (jedoch nicht notwendigerweise im selben Maße) wie die natürlich vorkommende SPPase. Spezifisch besitzt SPPase die Fähigkeit, HCV Core proteolytisch zu spalten, welche eine der charakteristischen Aktivitäten des Enzyms ist.
„Immunologische Aktivität" ist definiert als Fähigkeit der natürlichen, rekombinanten oder synthetischen SPPase oder eines beliebigen Oligopeptids davon, eine spezifische Immunantwort in geeigneten Tieren oder Zellen zu induzieren und mit spezifischen Antikörpern zu binden.
„Derivat", wie es hier im Bezug auf die Aminosäuresequenz verwendet wird, beinhaltet eine chemische Modifikation von SPPase. Beispielhaft für solche Modifikationen wäre ein Austausch von Wasserstoff durch eine Alkyl-, Acyl- oder Aminogruppe.
„Deletion" definiert eine Veränderung entweder der Nukleotid- oder der Aminosäuresequenz, bei der ein oder mehrere Nukleotide bzw. Aminosäurereste fehlen.
Wie hier verwendet, definieren die Begriffe „Insertion" oder „Addition" eine Veränderung in der Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenz, die in der Anfügung eines oder mehrerer Nukleotide bzw. Aminosäurereste im Vergleich zur natürlich vorkommenden SPPase resultiert haben.
Der Begriff „Substitution", wie er hier verwendet wird, beschreibt einen Austausch eines/einer oder mehrerer Nukleotide oder Aminosäuren durch andere Nukleotide bzw. Aminosäuren.
Der Begriff „stillgelegt", wie er hier verwendet wird, beschreibt den Prozess, eine Enzym-Restriktionsstelle wenigstens im Wesentlichen nicht funktionsfähig zu machen, wie etwa unerkennbar durch das Restriktionsenzym. Dies kann, ohne hierauf beschränkt zu sein, erreicht werden durch Aminosäuredeletion, Insertion oder Addition, durch Substitution und/oder Modifikation.
Der Begriff „Homologes", wie er hier im Hinblick auf die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz verwendet wird, kann synonym mit allelischen Variationen der aufgelisteten Sequenzen sein.
Insbesondere kann der Begriff „Homologie", wie er hier verwendet wird, mit dem Begriff „Identität" gleichgesetzt werden. Die Sequenzhomologie im Hinblick auf die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz kann hier durch einen einfachen „Augapfel"-Vergleich (d.h. einen strengen Vergleich) von einer beliebigen oder von mehreren der Sequenzen mit einer anderen Sequenz bestimmt werden, um zu sehen, ob diese andere Sequenz eine wenigstens 75%ige Identität mit der/den Sequenz(en) aufweist. Die relative Sequenzhomologie (d.h. die Sequenzidentität) kann auch über kommerziell erhältliche Computerprogramme bestimmt werden, die die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen können. Ein typisches Beispiel für ein solches Computer-Programm ist CLUSTAL.
Die prozentuale Homologie kann über zusammenhängende Sequenzen berechnet werden, d.h. eine Sequenz wird einem Alignment mit der anderen Sequenz unterzogen, und jede Aminosäure in einer Sequenz wird direkt mit der korrespondieren Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, bei jeweils einem Rest zur gleichen Zeit. Dies wird als „lückenloses" Alignment bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Alignments nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten (z.B weniger als 50 zusammenhängende Aminosäuren) durchgeführt.
Obwohl dies ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren ist, berücksichtigt es nicht, dass z.B bei einem ansonsten identischen Sequenzpaar eine Insertion oder Deletion bewirken wird, dass die folgenden Aminosäurereste aus dem Alignment herausgenommen werden, was somit potentiell in einer großen Verringerung der prozentualen Homologie resultiert, wenn ein allgemeines Alignment durchgeführt wird. Demzufolge sind die meisten Sequenzvergleichsverfahren so gestaltet, dass sie optimale Alignments produzieren, die mögliche Insertionen und Deletionen berücksichtigen, ohne dabei das allgemeine Homologieergebnis unverhältnismäßig zu belasten. Dies wird erreicht, indem man „Lücken" in das Sequenz-Alignment einführt, um eine Maximierung der lokalen Homologie zu versuchen.
Jedoch ordnen diese komplexeren Verfahren jeder Lücke, die im Alignment auftritt, „Lückenstrafen" zu, sodass bei der gleichen Anzahl identischer Aminosäuren ein Sequenz-Alignment mit möglichst wenig Lücken – was eine höhere Verwandtschaft zwischen den zwei verglichenen Se quenzen widerspiegelt – ein höheres Ergebnis erzielen wird als ein Alignment mit vielen Lücken. Es werden typischerweise „affine Lückenkosten" verwendet, die für die Existenz einer Lücke relativ hohe Kosten veranschlagen, und eine kleinere Strafe für jeden nachfolgenden Rest in der Lücke. Dies ist das am weitesten verwendete System zur Bewertung von Lücken. Hohe Lückenstrafen werden natürlich optimierte Alignments mit weniger Lücken ergeben. Die meisten Alignmentprogramme erlauben es, dass die Lückenstrafen modifiziert werden. Jedoch ist es bevorzugt, die Default-Werte zu verwenden, wenn solche Software für Sequenzvergleiche verwendet wird. Wenn beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Paket (siehe unten) verwendet wird, so beträgt die Default-Lückenstrafe bei Aminosäuresequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Erweiterung.
Die Berechnung der maximalen prozentualen Homologie erfordert deshalb zunächst die Herstellung eines optimalen Alignments, das Lückenstrafen berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm zur Durchführung solcher Alignments ist das GCG Wisconsin Bestfit Paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele für andere Software, die Sequenzvergleiche durchführen kann, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das BLAST-Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Kapitel 18), FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410) und die GENEWORKS-Reihe von Vergleichswerkzeugen. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für die Offline- und Online-Suche verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibidem, Seiten 7-58 bis 7-60). Für einige Anwendungen ist es ist jedoch bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden.
Obwohl die endgültige prozentuale Homologie in Begriffen der Identität gemessen werden kann, basiert der Alignment-Prozess selbst in einigen Fällen typischerweise nicht auf einem Alles-oder-Nichts-Paarvergleich. Stattdessen wird allgemein eine skalierte Ähnlichkeitsergebnis-Matrix verwendet, die jedem paarweisen Vergleich auf Basis einer chemischen Ähnlichkeit oder einer evolutionären Distanz Ergebniswerte zuordnet. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix, die Default-Matrix für die Reihe der BLAST-Programme. Die GCG-Wisconsin-Programme verwenden generell entweder die allgemeinen Default-Werte oder eine Gebrauchs-Symbolvergleichstabelle, sofern geliefert (siehe Benutzerhandbuch für weitere Details). Es ist bevorzugt, die allgemeinen Default-Werte für das GCG-Paket zu verwenden, oder, im Falle anderer Software, die Default-Matrix, wie etwa BLOSUM62.
Sobald die Software ein optimales Alignment erstellt hat, ist es möglich, den %-Wert der Homologie, bevorzugt die prozentuale Sequenzidentität, zu berechnen. Die Software tut dies typischer Weise als Teil des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Ergebnis.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist eine homologe Sequenz so zu verstehen, dass sie eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die auf der Aminosäureebene wenigstens zu 60, 70, 80 oder 90% identisch ist, und bevorzugt zu wenigstens 95 oder 98% identisch ist über wenigstens 5, bevor zugt 8, 10, 15, 20, 30 oder 40 Aminosäuren mit zellulärer SPPase, z.B wie sie hier in der Sequenzliste gezeigt ist. Insbesondere sollte die Homologie typischerweise im Hinblick auf solche Regionen der Zielsequenz berücksichtigt werden, die bekannter Weise essentiell für die SPPase-Assoziation sind, anstatt im Hinblick auf nicht-essentielle benachbarte Sequenzen. Homologievergleiche können mit dem Auge durchgeführt werden, oder, gebräuchlicher, mit Hilfe eines leicht verfügbaren Sequenzvergleich-Computerprogramms. Diese kommerziell erhältlichen Computerprogramme können die prozentuale Homologie zwischen zwei oder mehr Sequenzen berechnen. Wie oben erwähnt, ist ein typisches Beispiel für ein solches Computerprogramm CLUSTAL.
Wie angezeigt, kann die Sequenzhomologie (oder Identität) bei einigen Anwendungen darüber hinaus unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Homologie-Algorithmus, der z.B Default-Parameter verwendet, bestimmt werden. Vorteilhafterweise wird der BLAST-Algorithmus verwendet, wobei die Parameter auf Default-Werte eingestellt sind. Der BLAST-Algorithmus ist detailliert beschrieben unter http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html. Alternative Algorithmen der Sequenzhomologie sind unter http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/virus database/bookmark.htm zu finden. Die Suchparameter sind wie folgt definiert und werden vorteilhafterweise auf die definierten Default-Parameter eingestellt.
Vorteilhafterweise entspricht „weitgehende Homologie", wenn die Untersuchung mittels BLAST erfolgt, Sequenzen, die einem EXPECT-Wert von wenigstens etwa 7 entsprechen, bevorzugt von wenigstens etwa 9 und am bevorzugtesten von 10 oder mehr. Der Default-Schwellenwert für EXPECT bei der BLAST-Suche beträgt für gewöhnlich 10.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) ist der heuristische Suchalgorithmus, der von den Programmen blastp, blastn, blastx, tblastn und tblastx verwendet wird; diese Programme ordnen ihren Ergebnissen Signifikanz zu, wobei sie die statistischen Verfahren von Karlin und Altschul (siehe http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html) mit einigen wenigen Verbesserungen verwenden. Die BLAST-Programme wurden maßgeschneidert für die Suche nach Sequenzähnlichkeit, z.B um Homologe zu einer Suchsequenz zu identifizieren. Die Programme sind nicht allgemein nützlich für die Suche im Motiv-Stil. Eine Diskussion der Grundlagen der Ähnlichkeitssuche von Sequenzdatenbanken ist veröffentlicht worden (Altschul et al., 1994, Nature Genetics, 6, 119-129).
Die fünf BLAST-Programme, die unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov verfügbar sind, führen die folgenden Aufgaben durch:
blastp – vergleicht eine Aminosäure-Suchsequenz mit einer Proteinsequenz-Datenbank;
blastn – vergleicht eine Nukleotid-Suchsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Datenbank;
blastx – vergleicht die begrifflichen Translationsprodukte einer Nukleotid-Suchsequenz (beide Stränge) in den sechs Leserastern mit einer Proteinsequenz-Datenbank;
tblastn – vergleicht eine Protein-Suchsequenz mit einer Nukleotidsequenz-Datenbank, die dynamisch in alle sechs Leseraster (beide Stränge) translatiert wird;
tblastx – vergleicht die in den sechs Leserastern durchgeführten Translationen einer Nukleotid-Suchsequenz mit den in den sechs Leserastern durchgeführten Translationen einer Nukleotidsequenz-Datenbank.
BLAST verwendet die folgenden Suchparameter:
HISTOGRAM – zeigt ein Histogramm der Treffer für jede Suche an; Voreinstellung ist „ja" (siehe Parameter H im BLAST Handbuch).
DESCRIPTIONS – begrenzt die Anzahl der Kurzbeschreibungen angezeigter passender Sequenzen auf die eingestellte Zahl; voreingestellter Grenzwert ist 100 Beschreibungen (siehe Parameter V auf der Handbuchseite). Siehe auch EXPECT und CUTOFF.
ALIGNMENTS – begrenzt die Datenbanksequenzen hinsichtlich der festgelegten Zahl, für die die hochgradig übereinstimmenden Segmentpaare (HSPs) angezeigt werden; der voreingestellte Grenzwert ist 50. Wenn mehr Datenbanksequenzen als dies dem statistischen Signifikanz-Schwellenwert zur Anzeige (siehe EXPECT und CUTOFF unten) entsprechen, werden nur die Treffer angezeigt, denen die größte statistische Signifikanz zugeschrieben wird (siehe Parameter B im BLAST-Handbuch).
EXPECT – Schwellenwert der statistischen Signifikanz für die Anzeige von Treffern im Bezug auf Datenbanksequenzen; der voreingestellte Wert ist 10, d.h. man erwartet, dass sich gemäß dem stochastischen Modell (Karlin und Altschul, 1990, Proc Natl Acad Sci. U.S.A. 87(6), 2264-8) 10 Treffer alleine durch Zufall ergeben. Wenn die statistische Signifikanz, die einem Treffer zugeschrieben wird, größer als der EXPECT-Schwellenwert ist, so wird der Treffer nicht angezeigt. Niedrigere EXPECT-Schwellenwerte sind stringenter, d.h. führen zu einer geringeren Aussicht auf angezeigte Treffer. Bruchwerte werden akzeptiert (siehe Parameter E im BLAST-Handbuch).
CUTOFF – Ausschlusswert für die Anzeige hohe Trefferraten aufweisender Segment-Paare („high-scoring segment pairs", HSPs). Der voreingestellte Wert wird ausgehend von dem EXPECT-Wert (siehe oben) berechnet. Bei einer Datenbanksequenz werden HSPs nur dann angezeigt, wenn die ihnen zugeordnete statistische Signifikanz wenigstens ebenso groß ist, wie die Signifikanz, die einem einzelnen HSP zugeordnet würde, das eine Trefferrate gleichwertig dem CUTOFF-Wert besitzt. Höhere CUTOFF-Werte sind stringenter, d.h. führen zu einer geringeren Chance, dass Treffer angezeigt werden (siehe Parameter S im BLAST-Handbuch). Typischer Weise können Signifikanz-Schwellenwerte bei der Verwendung von EXPECT intuitiver gehandhabt werden.
MATRIX – Spezifiziert eine alternative Rechenmatrix für BLASTP, BLASTX, TBLASTN und TBLASTX. Die voreingestellte Matrix ist BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(22): 10915-9). Die gültigen alternativen Auswahlmöglichkeiten beinhalten: PAM40, PAM120, PAM250 und IDENTITY. Für BLASTN sind keine alternativen Rechenmatrizes verfügbar; eine Spezifizierung der MATRIX-Vorgabe in BLASTN-Abfragen ergibt eine Fehlermeldung.
STRAND – Beschränkt eine TBLASTN-Suche auf nur den oberen oder unteren Strang der Datenbanksequenzen; oder beschränkt eine BLASTN-, BLASTX- oder TBLASTX-Suche alleine auf Leseraster im oberen oder unteren Strang der Suchsequenz.
FILTER – Blendet Segmente der Suchsequenz aus, die eine geringe Komplexität der Zusammensetzung besitzen, wie es durch das Programm SEG (Wootton & Federhen, 1993, Computers and Chemistry 17, 149-163) bestimmt wird, oder Segmente, die aus in kurzer Periodizität folgenden internen Wiederholungssequenzen bestehen, wie dies durch das Programm XNU (Claverie & States, 1993, Computers and Chemistry 17, 191-201) bestimmt wird, oder, für BLASTN, durch das Programm DUST von Tatusov und Lipman (siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Das Filtern kann statistisch signifikante, aber biologisch uninteressante Angaben aus dem BLAST-Bericht entfernen (z.B Treffer für häufig vorkommende saure, basische oder Prolin-reiche Regionen) und damit eine Beschränkung auf die biologisch interessanteren Regionen der Suchsequenz vornehmen, die für die spezifische Paarung mit Datenbanksequenzen verfügbar ist.
Von einem Filterprogramm gefundene niedrigkomplexe Sequenzen werden in der Nukleotidsequenz unter Verwendung des Buchstabens „N" (z.B „NNNNNNNNNNNNN") und in Proteinsequenzen unter Verwendung des Buchstabens „X" (z.B „XXXXXXXXX") ersetzt.
Die Filterung wird nur auf die Suchsequenz (oder deren Translationsprodukte) angewendet, nicht jedoch auf Datenbank-Sequenzen. Die voreingestellte Filterung ist DUST bei BLASTN und SEG bei anderen Programmen.
Es ist keineswegs ungewöhnlich, dass eine Maskierung durch SEG, XNU oder beide erfolgt, wenn dies auf Sequenzen in SWISS-PROT angewendet wird; es sollte daher nicht erwartet werden, dass das Filtern stets eine Wirkung zeigt. Weiterhin können in einigen Fällen Sequenzen in ihrer Gesamtheit maskiert werden, was anzeigt, dass die statistische Signifikanz jedes angezeigten Treffers gegen die nicht mit einem Filter belegte Suchsequenz mit Vorsicht zu genießen ist.
NCBI-gi bewirkt die Anzeige von NCBI gi-Identifikatoren in der Ausgabe zusätzlich zu der Zugangsnummer und/oder dem Namen des Locus.
Am bevorzugtesten werden Sequenzvergleiche unter Verwendung des einfachen BLAST-Suchalgorithmus durchgeführt, der unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST zur Verfügung steht.
Falls Lückenstrafen bei der Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden, so werden bevorzugt die folgenden Parameter verwendet:
Weitere Computerprogramm-Verfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit zwischen den beiden Sequenzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, das GCG-Programm-Paket (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research, 12: 387, und FASTA (Altschul of al., 1990, J. Molec Biol., 215, 403-410).
Polypeptidvarianten und Derivate
Die Begriffe „Variante" oder Derivat" im Bezug auf die Aminosäuresequenzen beinhalten jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition von einer (oder mehreren) Aminosäuren von oder an die Sequenz, unter der Maßgabe, dass die resultierende Aminosäuresequenz SPPase-Aktivität besitzt, wobei sie bevorzugt wenigstens die gleiche Aktivität besitzt wie irgendeines der Polypeptide, die in den Sequenzlisten gezeigt sind.
Die Sequenzen können zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Typischer Weise werden Modifikationen durchgeführt, die die Signalpeptidpeptidase-Spaltungsaktivität der Sequenz aufrechterhalten. Die Aminosäuresubstitutionen können z.B. bei 1, 2 oder 3 bis hin zu 10, 20 oder 30 Substitutionen durchgeführt werden, unter der Maßgabe, dass die modifizierte Sequenz die Signalpeptidpeptidase-Spaltungsaktivität behält.
Aminosäuresubstitutionen können die Verwendung nicht-natürlich vorkommender Analoga beinhalten, z.B zur Steigerung der Halbwertszeit im Blutplasma bei einem therapeutisch verabreich ten Polypeptid, unter der Maßgabe, dass die modifizierte Sequenz wenigstens 25% bis 50% der relevanten Aktivität oder weitgehend die gleiche relevante Aktivität beibehält.
Jedoch können bei einer alternativen Ausführungsform Modifikationen an den Aminosäuresequenzen der Polypeptide bewusst durchgeführt werden, um die biologische Aktivität des Polypeptids zu reduzieren. Beispielsweise können trunkierte Polypeptidsequenzen, die die Fähigkeit behalten, an Zielmoleküle zu binden, denen jedoch funktionale Effektordomänen fehlen, als Inhibitoren/Kompetitoren der biologischen Aktivität des Moleküls voller Länge nützlich sein.
Im allgemeinen werden bevorzugt weniger als 20%, 10% oder 5% der Aminosäurereste einer Variante oder eines Derivats verändert, wobei die entsprechende Region in den Sequenzlisten dargestellt ist.
Konservative Substitutionen können z.B gemäß der Tabelle 1 unten durchgeführt werden. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und bevorzugt in derselben Zeile in der dritten Spalte können gegeneinander ausgetauscht werden:
Polypeptide beinhalten außerdem Fragmente der oben genannten Polypeptide voller Länge und von deren Varianten, einschließlich Fragmenten der Sequenzen, wie sie in der SEQ ID No: 1 dargestellt sind. Bevorzugte Fragmente beinhalten solche, die ein Epitop enthalten. Geeignete Fragmente werden wenigstens etwa 5, z.B 10, 12, 15 oder 20 Aminosäuren lang sein. Sie können auch weniger als 200, 100 oder 50 Aminosäuren lang sein. Polypeptidfragmente der Proteine und allelischen Varianten und Spezies-Varianten hiervon können ein oder mehrere (z.B 2, 3, 5 oder 10) Substitutionen, Deletionen oder Insertionen, einschließlich konservierter Substitutionen, enthalten. Dort, wo Substitutionen, Deletionen und/oder Insertionen vorgenommen wurden, z.B mittels rekombinanter Technologie, sind bevorzugt weniger als 20%, 10% oder 5% der in den Sequenzlisten angegebenen Aminosäurereste verändert.
Polypeptide können als Ergebnis von Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können – mit oder ohne Verzweigung – zyklisch sein. Zyklische, verzweigte und verzweigte zyklische Polypeptide können aus posttranslationalen natürlichen Prozessen resultieren, oder sie können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifikationen beinhalten Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anheftung von Flavin, kovalente Anheftung einer Häm-Gruppierung, kovalente Anheftung eines Nukleotids oder Nukleotidderivats, kovalente Anheftung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Anheftung von Phosphatidylinositol, Vernetzung, Zyklisierung, Ausbildung von Disulfidbindung(en), Demethylierung, Ausbildung kovalenter Vernetzungen, Erzeugung von Cystin, Erzeugung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Anker-Ausbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, die von Transfer-RNA vermittelte Anfügung von Aminosäuren an Proteine, wie etwa Arginylierung, und Ubiquitinierung. Siehe hierzu z.B Proteins – Structure and Molecular Properties, 2. Auflage, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993, und Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, Seiten 1-12 in Posttranslational Covalent Modificafion of Proteins, B.C. Johnson, Herausgeber, Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., 1990, "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646 und Rattan et al., 1992, "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci 668, 48-62.
Wie oben angegeben, werden Proteine typischerweise durch rekombinante Mittel hergestellt, z.B wie hier beschrieben, und/oder durch Verwendung synthetischer Mittel unter Verwendung von Fachleuten wohlbekannten Techniken, wie etwa Festphasensynthese. Varianten und Derivate solcher Sequenzen beinhalten Fusionsproteine, wobei die Fusionsproteine wenigstens die Aminosäuresequenz umfassen, die (direkt oder indirekt) mit einer anderen Aminosäuresequenz verbunden ist. Diese anderen Aminosäuresequenzen, die manchmal als Fusionsproteinpartner bezeichnet werden, werden typischer Weise eine günstige Funktionalität, wie etwa eine Unterstützung bei der Extraktion und Reinigung der Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, verleihen. Beispiele für Fusionsproteinpartner beinhalten Glutathion-S-Transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNA-Bindungs- und/oder Transkriptionsaktivierungsdomäne) und β-Galactosidase. Es kann auch günstig sein, eine proteolytische Spaltstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der Proteinsequenz der vorliegenden Erfindung einzufügen, um so eine Ablösung letzterer zu erlauben. Vorzugsweise wird der Fusionsproteinpartner die Funktion des Proteins nicht behindern.
Therapeutische Peptide
Peptide können Patienten in therapeutischer Weise verabreicht werden. Es ist bevorzugt, Peptide zu verwenden, die nicht allein aus natürlich vorkommenden Aminosäuren bestehen, sondern die modifiziert wurden, z.B um die Immunogenität zu reduzieren, um die zirkulatorische Halbwertszeit im Körper des Patienten zu steigern, um die Bioverfügbarkeit zu steigern, und/oder um die Wirksamkeit und/oder die Spezifität zu erhöhen.
Es ist eine Reihe von Ansätzen verwendet worden, um Peptide für therapeutische Anwendungen zu modifizieren. Ein Ansatz besteht darin, die Peptide oder Proteine mit einer Vielzahl von Polymeren, wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und Polypropylenglykol (PPG), zu verbinden – siehe z.B US-Patente der Nummern 5,091,176, 5,214,131 und US 5,264,209 .
Der Austausch natürlich vorkommender Aminosäuren durch eine Vielzahl nicht codierter oder modifizierter Aminosäuren, wie etwa D-Aminosäuren und N-Methylaminosäuren, kann ebenfalls verwendet werden, um Peptide zu modifizieren.
Ein weiterer Ansatz besteht darin, bifunktionelle Vernetzungsmittel zu verwenden, wie etwa N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat, Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoat und Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido]hexanoat (siehe US-Patent 5,580,853).
Es kann erstrebenswert sein, Derivate der Peptide zu verwenden, die konformativ eingeschränkt sind. Konformative Einschränkung bezieht sich auf die Stabilität und bevorzugte Konformation der dreidimensionalen Form, die von einem Peptid angenommen wird. Konformative Einschränkungen beinhalten lokale Einschränkungen, einschließlich der Begrenzung der konformativen Beweglichkeit eines Einzelrestes in einem Peptid, regionale Einschränkungen, einschließlich der Einschränkung der konformativen Mobilität einer Gruppe von Resten, wobei die Reste eine bestimmte Sekundärstruktureinheit ausbilden können, und allgemeine Einschränkungen, die die gesamte Peptidstruktur einschließen.
Die aktive Konformation des Peptids kann durch eine kovalente Modifikation, wie etwa eine Zyklisierung oder durch den Einbau von β-Lactam oder anderer Typen von Brücken stabilisiert werden. Beispielsweise können Seitenketten an das Rückgrat zyklisiert werden, um so eine L-β-Lactam-Gruppierung an jeder Seite der Interaktionsstelle zu erzeugen. Siehe hierzu allgemein Hruby et al., „Applications of Synthetic Peptides", in Synthetic Peptides: A User's Guide: 259-345 (W.H. Freeman & Co. 1992). Zyklisierung kann beispielsweise auch erreicht werden durch die Ausbildung von Cystinbrücken, die Kopplung von Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen entsprechender terminaler Aminosäuren oder die Kopplung der Aminogruppe eines Lys-Restes oder eines verwandten Homologen mit einer Carboxygruppe von Asp, Glu oder eines verwandten Homologen. Die Kopplung der alpha-Aminogruppe eines Polypeptids mit der epsilon-Aminogruppe eines Lysinrestes unter Verwendung von Iodessigsäure-Anhydrid kann auch unternommen werden. Siehe Wood und Wetzel, 1992, int'l J. Peptide Protein Res. 39, 533-39.
Ein anderer Ansatz, der in der US 5,891,418 beschrieben ist, besteht darin, ein Metallionenkomplexierendes Rückgrat in die Peptidstruktur einzubeziehen. Typischer Weise basiert das bevorzugte Metall-Peptid-Rückgrat auf der erforderlichen Anzahl bestimmter koordinierender Gruppen, die vom Koordinationsraum eines gegebenen Komplexmetallions benötigt werden. Im Allgemeinen besitzen die meisten der Metallionen, die sich als nützlich erweisen könnten, eine Koordinationszahl von vier bis sechs. Die Natur der koordinierenden Gruppen in der Peptidkette beinhaltet Stickstoffatome mit Amin, Amid, Imidazol oder Guanidino-Funktionalitäten; Schwefelatome von Thiolen oder Disulfiden; und Sauerstoffatome von Hydroxy-, Phenol-, Carbonyl- oder Carboxyl-Funktionalitäten. Zusätzlich können die Peptidkette oder individuelle Aminosäuren chemisch verändert werden, um eine koordinierende Gruppe einzubeziehen, wie etwa z.B Oxim, Hydrazino, Sulfhydryl, Phosphat, Cyano, Pyridino, Piperidino oder Morpholino. Das Peptidkonstrukt kann entweder linear oder zyklisch sein, jedoch wird ein lineares Konstrukt typischerweise bevorzugt. Ein Beispiel eines kleinen linearen Peptids ist Gly-Gly-Gly-Gly, das vier Stickstoffatome im Rückgrat aufweist (ein N₄-Komplexierungssystem), die mit einem Metallion mit einer Koordinationszahl von vier komplexieren können.
Eine weitere Technik zur Verbesserung der Eigenschaften therapeutischer Peptide ist die Verwendung von Nicht-Peptid-Peptidomimetika. Es kann eine breite Vielzahl nützlicher Techniken verwendet werden, um die genaue Struktur eines Peptids aufzuklären. Diese Techniken beinhalten Aminosäuresequenzierung, Röntgen-Kristallographie, Massenspektroskopie, kernmagnetische Resonanzspektroskopie, Computer-gestütztes molekulares Modellieren, Peptidkartierung und Kombinationen hiervon. Die Strukturanalyse eines Peptids liefert allgemein eine große Menge an Daten, die die Aminosäuresequenz des Peptids ebenso beinhalten wie die dreidimensionale Positionierung von dessen atomaren Komponenten. Ausgehend von dieser Information können Nicht-Peptid-Peptidomimetika entworfen werden, die die erforderlichen chemischen Funktionalitäten für die therapeutische Aktivität besitzen, jedoch stabiler sind, z.B weniger empfindlich gegenüber biologischem Abbau. Ein Beispiel dieses Ansatzes wird in der US 5,811,512 bereitgestellt.
Techniken zur chemischen Synthese therapeutischer Peptide der Erfindung sind in den obigen Referenzen beschrieben und sind außerdem von Borgia und Fields, 2000, Tib Tech 18, 243-251 übersichtsartig dargestellt worden und detailliert in den darin enthaltenen Referenzen beschrieben.
Polynukleotidvarianten und Derivate
Polynukleotide der Erfindung (oder zur Verwendung bei der Erfindung) umfassen Nukleinsäuresequenzen, die für die Sequenzen der Erfindung codieren. Es wird dem Fachmann verständlich sein, dass zahlreiche verschiedene Polynukleotide als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes das gleiche Polypeptid codieren können. Zusätzlich versteht es sich, dass Fachleute unter Verwendung von Routinetechniken Nukleotidsubstitutionen durchführen können, die die von den Polynukleotiden der Erfindung codierte Polypeptidsequenz nicht beeinflussen, um die Codon-Nutzung jedes bestimmten Wirtsorganismus, in dem die Polypeptide der Erfindung exprimiert werden sollen, widerzuspiegeln.
Polynukleotide der Erfindung können DNA oder RNA umfassen. Sie können einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Sie können auch Polynukleotide sein, die synthetische oder modifizierte Nukleotide in sich enthalten. Eine Anzahl verschiedener Typen der Modifikation von Oligonukleotiden ist in der Technik bekannt. Diese beinhalten Methylphosphonat- und Phosphorothioat-Rückgrate, und die Anfügung von Acridin- oder Polylysin-Ketten an das 3'- und/oder 5'-Ende des Moleküls. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zu verstehen, dass die hier beschriebenen Polynukleotide durch jedwedes in der Technik verfügbare Verfahren modifiziert werden können. Solche Modifikationen können durchgeführt werden, um die in vivo-Aktivität oder Lebensdauer von Polynukleotiden der Erfindung zu steigern.
Die Begriffe „Variante", „Homologes" oder „Derivat" im Bezug auf die Nukleotidsequenzen beinhalten jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition von einem (oder mehreren) Nukleotiden von oder an die Sequenz, unter der Maßgabe, dass die resultierende Nukleotidsequenz für ein Polypeptid codiert, das Signalpeptidpeptidase-Aktivität besitzt, bevorzugt wenigstens die gleiche Aktivität wie die Polypeptidsequenzen, die in den Sequenzlisten dargestellt sind.
Wie oben angegeben, gibt es im Hinblick auf die Sequenzhomologie bevorzugt wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu den in den zugehörigen Sequenzlisten dargestellten Sequenzen. Noch bevorzugter gibt es wenigstens 95%, bevorzugter wenigstens 98% Homologie. Die Vergleiche der Nukleotidhomologie können, wie oben beschrieben, durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Sequenzvergleichsprogramm ist das oben beschriebene GCG-Wisconsin Bestfit Programm. Die Default-Bewertungsmatrix besitzt einen Trefferwert von 10 für jedes identische Nukleotid und von –9 für jede Fehlpaarung. Die Defaultstrafe der Lückenerzeugung beträgt –50 und die Defaultstrafe der Lückenerweiterung beträgt –3 für jedes Nukleotid.
Es werden Nukleotidsequenzen beschrieben, die befähigt sind, selektiv mit den hier dargestellten Sequenzen zu hybridisieren, oder mit einer beliebigen Variante, einem Fragment oder Derivat hiervon, oder mit dem komplementären Gegenstück einer beliebigen der obigen Sequenzen. Die Nukleotidsequenzen sind bevorzugt wenigstens 15 Nukleotide lang, bevorzugter sind sie wenigstens 20, 30, 40 oder 50 Nukleotide lang.
Der Begriff „Hybridisierung", wie er hier verwendet wird, soll den „Prozess, durch den ein Nukleinsäurestrang sich durch Basenpaarung mit einem Komplementärstrang verbindet" ebenso bein halten wie den Prozess der Amplifikation, wie er bei Techniken der Polymerasekettenreaktion durchgeführt wird.
Polynukleotide, die befähigt sind, selektiv mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen oder deren komplementären Gegenstück zu hybridisieren, werden im Allgemeinen zu wenigstens 70%, bevorzugt zu wenigstens 80% oder 90%, und bevorzugter zu wenigstens 95% oder 98% homolog zu den hier dargestellten entsprechenden Nukleotidsequenzen sein, und zwar über eine Region von wenigstens 20, bevorzugt von wenigstens 25 oder 30, z.B von wenigstens 40, 60 oder 100 oder mehr zusammenhängenden Nukleotiden. Bevorzugte Polynukleotide werden Regionen umfassen, die homolog zu den Nukleotiden aus SEQ ID No. 2 sind, bevorzugt zu wenigstens 80% oder 90%, und die bevorzugter zu wenigstens 95% homolog im Bezug auf SEQ ID No. 2 sind.
Der Ausdruck „selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass das als Sonde verwendete Polynukleotid unter Bedingungen verwendet wird, bei denen gefunden wird, dass ein Zielpolynukleotid an die Sonde in einem signifikant über dem Hintergrund liegenden Niveau hybridisiert. Die Hintergrundhybridisierung kann aufgrund des Vorliegens anderer Polynukleotide erfolgen, z.B in der durchmusterten cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek. Bei diesem Ereignis beinhaltet der Hintergrund ein Signalniveau, das durch die Interaktion zwischen der Sonde und einem nicht-spezifischen DNA-Mitglied der Bibliothek erzeugt wird, und das im Bezug auf die Intensität der spezifischen Interaktion, die mit der Ziel-DNA-beobachtet wird, weniger als dem 10-fachen, bevorzugt weniger als dem 100-fachen Bruchteil der Intensität entspricht. Die Intensität der Interaktion kann beispielsweise gemessen werden, indem man die Sonde radioaktiv markiert, z.B mit ³²P.
Die Hybridisierungsbedingungen basieren auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäurebindungskomplexes, wie gelehrt in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, 152, Academic Press, San Diego, CA) und verleihen eine definierte „Stringenz", wie unten beschrieben.
Eine maximale Stringenz ergibt sich typischerweise bei etwa Tm-5°C (5°C unter der Tm der Sonde), eine hohe Stringenz bei etwa 5°C bis 10°C unterhalb von Tm, eine mittlere Stringenz bei etwa 10°C bis 20°C unterhalb von Tm, und eine niedrige Stringenz bei etwa 20°C bis 25°C unterhalb von Tm. Wie von Fachleuten verstanden werden wird, kann eine maximal stringente Hybridisierung verwendet werden, um identische Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren, während eine mittel- (oder niedrig-) stringente Hybridisierung verwendet werden kann, um ähnliche oder verwandte Polynukleotidsequenzen zu identifizieren oder zu detektieren.
Nukleotidsequenzen, die an die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung unter stringenten Bedingungen hybridisieren können (z.B 65°C und 0,1x SSC {1xSSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Na₃-Citrat pH 7,0}), werden beschrieben.
Dort, wo das Polynukleotid der Erfindung doppelsträngig ist, sind beide Stränge der Duplex, entweder einzeln oder in Kombination, von der vorliegenden Erfindung abgedeckt. Dort, wo das Polynukleotid einzelsträngig ist, versteht es sich, dass die komplementäre Sequenz dieses Polynukleotids ebenfalls in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einbezogen ist.
Polynukleotide, die nicht zu 100% homolog zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung sind, können auf eine Vielzahl von Weisen erhalten werden. Weitere Varianten der hier beschriebenen Sequenzen können z.B erhalten werden durch Sondenbehandlung von DNA-Bibliotheken, die aus einer Bandbreite von Individuen hergestellt wurden, z.B aus Individuen unterschiedlicher Populationen. Zusätzlich können andere virale/bakterielle oder zelluläre Homologe, insbesondere zelluläre Homologe, die sich in Säugerzellen finden (z.B in Ratten-, Maus-, Rind- und Primatenzellen), erhalten werden, und solche Homologe und Fragmente hiervon werden im Allgemeinen zur selektiven Hybridisierung an die in der vorliegenden Sequenzliste gezeigten Sequenzen befähigt sein. Solche Sequenzen können erhalten werden, indem man cDNA-Bibliotheken oder genomische DNA-Bibliotheken aus Tierspezies mit Sonden behandelt, und indem man solche Bibliotheken unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz mit Sonden behandelt, die die Gesamtheit oder einen Teil von SEQ ID No. 2 umfassen. Ähnliche Überlegungen gelten für den Erhalt von Spezieshomologen und allelischen Varianten der Polypeptid- oder Nukleotidsequenzen von SPPase.
Varianten und Stamm-/Spezies-Homologe können auch unter Verwendung degenerierter PCR erhalten werden, die Primer verwenden wird, die dafür erstellt wurden, um auf Sequenzen in den Varianten und Homologen abzuzielen, die innerhalb der Sequenzen der vorliegenden Erfindung für konservierte Aminosäuresequenzen codieren. Konservierte Sequenzen können z.B vorhergesagt werden, indem man die Aminosäuresequenzen aus verschiedenen Varianten/Homologen einem Alignment unterzieht. Sequenzalignments können unter Verwendung von in der Technik bekannter Computersoftware durchgeführt werden. Beispielsweise wird das GCG-Wisconsin PileUp Programm in breitem Umfang verwendet.
Die bei der degenerierten PCR verwendeten Primer werden eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden bei Stringenzbedingungen verwendet werden, die niedriger sind als diejenigen, die für die Klonierung von Sequenzen mit einzelnen Sequenzprimern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
Alternativ können solche Polynukleotide durch positionsspezifische Mutagenese charakterisierter Sequenzen, wie etwa der SEQ ID No. 2, erhalten werden. Dies kann z.B dort nützlich sein, wo stille Codon-Veränderungen an Sequenzen benötigt werden, um die Codon-Präferenzen für eine bestimmte Wirtszelle, in der die Polynukleotidsequenzen exprimiert werden sollen, zu optimieren. Andere Sequenzveränderungen können erstrebenswert sein, um Restriktionsenzymerkennungsstel len einzuführen, oder um die Eigenschaft oder Funktion der von den Polynukleotiden codierten Polypeptide zu verändern.
Polynukleotide können verwendet werden, um einen Primer, z.B einen PCR-Primer, einen Primer für eine alternative Amplifikationsreaktion, eine Sonde, z.B markiert mit einer aussagekräftigen Markierung durch konventionelle Mittel unter Verwendung radioaktiver oder nicht-radioaktiver Markierungen, zu erzeugen, oder die Polynukleotide kennen in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden wenigstens 15, bevorzugt wenigstens 20, z.B wenigstens 25, 30 oder 40 Nukleotide lang sein und sind ebenfalls von dem Begriff Polynukleotide der Erfindung, wie er hier verwendet wird, eingeschlossen. Bevorzugte Fragmente besitzen eine Länge von weniger als 5000, 2000, 1000, 500 oder 200 Nukleotiden.
Polynukleotide, wie etwa DNA-Polynukleotide und Sonden, können rekombinant, synthetisch oder durch jedes beliebige Mittel, das Fachleuten zugänglich ist, hergestellt werden. Sie können außerdem durch Standardtechniken kloniert werden.
Im Allgemeinen werden Primer durch synthetische Mittel hergestellt werden, was eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäuresequenz mit einem Nukleotid pro Zeiteinheit beinhaltet. Techniken hierfür unter Verwendung automatisierter Techniken sind in der Technik leicht verfügbar.
Längere Polynukleotide werden im Allgemeinen unter Verwendung rekombinanter Mittel hergestellt, z.B unter Verwendung von PCR-Klonierungstechniken. Dies wird die Herstellung eines Paars von Primern (z.B mit etwa 15 bis 30 Nukleotiden) beinhalten, die eine Region der Sequenz flankieren, die man klonieren möchte, das Inkontaktbringen der Primer mit mRNA oder cDNA, die aus einer tierischen oder menschlichen Zelle gewonnen wurde, das Durchführen einer Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die die Amplifikation der gewünschten Region mit sich bringen, das Isolieren des amplifizierten Fragments (z.B durch Auftrennen des Reaktionsgemischs auf einem Agarosegel) und die Wiedergewinnung der amplifizierten DNA. Die Primer können so ausgestaltet sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, sodass die amplifizierte DNA in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
Die Begriffe „Variante" oder „Derivat" im Bezug auf die hier beschriebenen Nukleotidsequenzen beinhalten jedwede Substitution, Variation, Modifikation, jedweden Austausch, jede Deletion oder Addition von einem (oder mehreren) Nukleotiden von oder an die Sequenz, unter der Maßgabe, dass die resultierende Nukleotidsequenz für ein Polypeptid codiert, das Signalpeptidpeptidase-Spaltungsaktivität besitzt, wobei es bevorzugt wenigstens die gleiche Aktivität besitzt wie die in den Sequenzlisten gezeigten Sequenzen.
Wie oben im Hinblick auf die Sequenzhomologie angezeigt, bestehen bevorzugt wenigstens 75%, bevorzugter wenigstens 85%, noch bevorzugter wenigstens 90% Homologie zu den in den hier vorliegenden Sequenzlisten dargestellten Sequenzen. Noch bevorzugter gibt es wenigstens 95%, bevorzugter wenigstens 98% Homologie. Die Vergleiche der Nukleotidhomologie können durchgeführt werden wie oben beschrieben. Bei einigen Anwendungen ist ein bevorzugtes Sequenzvergleichsprogramm das oben beschriebene GCG-Wisconsin Bestfit-Programm. Die Default-Bewertungsmatrix besitzt einen Trefferwert von 10 für jedes identische Nukleotid und von –9 für jede Fehlpaarung. Die Defaultstrafe der Lückenerzeugung beträgt –50 und die Defaultstrafe der Lückenerweiterung beträgt –3 für jedes Nukleotid.
Wie hier verwendet, umfassen die Begriffe „Variante", „Homologes", „Fragment" und „Derivat" allelische Variationen der Sequenzen.
Der Begriff „Variante" umfasst auch Sequenzen, die komplementär zu Sequenzen sind, die befähigt sind, mit den hier dargestellten Nukleotidsequenzen zu hybridisieren.
Regulatorische Sequenzen
Bevorzugt ist das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung funktionsfähig mit einer regulatorischen Sequenz verbunden, die befähigt ist, die Expression der codierenden Sequenz bereitzustellen, etwa durch die gewählte Wirtszelle. Beispielsweise wird ein Vektor, der das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung in funktionsfähiger Verbindung mit einer solchen regulatorischen Sequenz umfasst, d.h. ein Expressionsvektor, beschrieben.
Der Ausdruck „funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf eine benachbarte Anordnung, bei der die beschriebenen Komponenten in einer Beziehung stehen, die es ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Weise zu funktionieren. Eine regulatorische Sequenz, die „funktionsfähig verbunden" ist mit einer codierenden Sequenz, ist in einer solchen Weise anligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erreicht wird, die mit den Kontrollsequenzen kompatibel sind.
Der Begriff „regulatorische Sequenzen" beinhaltet Promotoren und Enhancer und andere Expressionsregulationssignale.
Der Begriff „Promotor" wird im normalen Sinne der Technik verwendet, z.B als eine Bindungsstelle für RNA-Polymerase.
Eine gesteigerte Expression des Polynukleotids, das für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, kann auch erreicht werden durch die Selektion heterologer regulatorischer Regionen, z.B von Promotor, Sekretions-Leader- und Terminator-Regionen, die dazu dienen, die Expression zu steigern, und, wenn gewünscht, auch die Sekretionsniveaus des interessierenden Proteins durch den gewählten Expressionswirt und/oder, um eine induzierbare Kontrolle der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitzustellen.
Bevorzugt kann die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung funktionsfähig mit wenigstens einem Promotor verbunden sein.
Neben dem Promotor, der für das Gen nativ ist, das das Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, können andere Promotoren verwendet werden, um die Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Der Promotor kann im Hinblick auf seine Effizienz bei der Steuerung der Expression des Polypeptids der vorliegenden Erfindung in dem gewünschten Expressionswirt ausgewählt werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann ein konstitutiver Promotor ausgewählt werden, um die Expression des gewünschten Polypeptids der vorliegenden Erfindung zu steuern. Ein solches Expressionskonstrukt kann zusätzliche Vorteile bereitstellen, da es die Notwendigkeit vermeidet, die Expressionswirte auf einem Medium zu kultivieren, das ein induzierendes Substrat beinhaltet.
Beispiele starker konstitutiver und/oder induzierbarer Promotoren, die für die Verwendung bei pilzlichen Expressionswirten bevorzugt sind, sind solche, die erhalten werden können aus den pilzlichen Genen für Xylanase (xlnA), Phytase, ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Triosephosphat-Isomerase (tpi), Alkohol-Dehydrogenase (AdhA), α-Amylase (amy), Amyloglukosidase (AG – aus dem Gen glaA), Acetamidase (amdS) und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (gpd)-Promotoren.
Beispiele starker Hefepromotoren sind solche, die aus den Genen für Alkohol-Dehydrogenase, Lactase, 3-Phosphoglyceratkinase und Triosephosphat-Isomerase erhalten werden können.
Beispiele starker bakterieller Promotoren sind die α-Amylase- und SP02-Promotoren, ebenso wie Promotoren aus extrazellulären Protease-Genen.
Hybrid-Promotoren können ebenfalls verwendet werden, um die induzierbare Regulation des Expressionskonstrukts zu verbessern.
Der Promotor kann zusätzlich Merkmale beinhalten, um die Expression in einem geeigneten Wirt sicherzustellen oder zu steigern. Das Merkmal kann beispielsweise in konservierten Regionen, wie etwa einer Pribnow-Box, Kozak-Sequenz oder einer TATA-Box, bestehen. Der Promotor kann sogar weitere Sequenzen enthalten, um die Expressionsniveaus der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung zu beeinflussen (so etwa, um diese aufrecht zu erhalten, zu steigern oder abzuschwächen). Beispielsweise können geeignete weitere Sequenzen das Sh1-Intron oder ein ADH-Intron beinhalten. Andere Sequenzen beinhalten induzierbare Elemente, wie etwa durch Temperatur, chemische Substanzen, Licht oder durch Stress induzierbare Elemente. Außerdem können ge eignete Elemente zur Steigerung der Transkription oder Translation vorliegen. Ein Beispiel für das letztgenannte Element ist die TMV 5'-Signalsequenz (siehe Sleat, 1987, Gene 217, 217-225; und Dawson, 1993, Plant Mol. Biol. 23, 97).
Sekretion
Oft ist es wünschenswert für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, dass es aus dem Expressionswirt in das Kulturmedium sekretiert wird, aus dem das Polypeptid der vorliegenden Erfindung leicht gereinigt werden kann. Die Sekretions-Leader-Sequenz kann auf Basis des gewünschten Expressionswirts ausgewählt werden. Zusätzlich können auch Hybridsignalsequenzen im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Typische Beispiele für heterologe Sekretions-Leader-Sequenzen sind solche aus dem pilzlichen Amyloglucosidase (AG)-Gen (glaA- beide 18- und 24-Aminosäure-Versionen, z.B aus Aspergillus), aus dem a-Faktor-Gen (Hefen, z.B Saccharomyces und Kluyveromyces) oder dem α-Amylasegen (Bacillus).
Konstrukte
Der Begriff „Konstrukt", der synonym mit Begriffen wie etwa „Konjugat", „Kassette" und „Hybrid" ist, beinhaltet die Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in direkter oder indirekter Anheftung an einen Promotor. Ein Beispiel für eine indirekte Anheftung ist die Bereitstellung einer geeigneten Spacer-Gruppierung, wie etwa einer Intronsequenz, wie etwa des Sh1-Introns oder des ADH-Introns, zwischen dem Promotor und der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung. Das gleiche gilt für den Begriff „fusioniert", der eine direkte oder indirekte Anheftung beinhaltet. In jedem Fall decken die Begriffe nicht die natürliche Kombination der für das Protein codierenden Nukleotidsequenz in der gewöhnlichen Assoziation mit dem wildtypischen Genpromotor und bei Vorliegen beider in ihrer natürlichen Umgebung ab.
Das Konstrukt kann sogar einen Marker enthalten oder exprimieren, der die Selektion des genetischen Konstrukts z.B in einem Bakterium, bevorzugt der Gattung Bacillus, wie etwa Bacillus subtilis, oder in Pflanzen, in die es übertragen wurde, erlaubt. Es existieren verschiedene Marker, die verwendet werden können, wie z.B diejenigen, die für Mannose-6-Phosphat-Isomerase (speziell für Pflanzen) codieren, oder solche Marker, die Antibiotikaresistenz bereitstellen, z.B Resistenz gegenüber G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin und Gentamycin.
Bevorzugt umfasst das Konstrukt wenigstens die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung in funktionsfähiger Verbindung mit einem Promotor.
Vektoren
Der Begriff „Vektor" beinhaltet Expressionsvektoren, Transformationsvektoren, Schaukelvektoren und Transduktionsvektoren.
Der Begriff „Expressionsvektor" bezeichnet ein Konstrukt, das zur in vivo- oder in vitro-Expression befähigt ist.
Der Begriff „Transformationsvektor" bezeichnet ein Konstrukt, das von einer Einheit auf eine andere Einheit übertragen werden kann, die von dieser Spezies oder von einer anderen Spezies sein kann. Wenn das Konstrukt von einer Spezies auf eine andere übertragen werden kann, wie etwa von einem E. coli-Plasmid auf ein Bakterium, wie etwa der Gattung Bacillus, so wird der Transformationsvektor manchmal als „Schaukelvektor" bezeichnet. Es kann sogar ein Konstrukt sein, das von einem E. coli-Plasmid auf ein Agrobacterium auf eine Pflanze übertragen werden kann.
Der Begriff „Transduktionsvektor" definiert einen Retrovirus-basierten Vektor, der genetisch manipuliert wurde, sodass er nicht replizieren und infektiöse Virusnachkommen-Partikel erzeugen kann, sobald das Virus in die Zielzelle eingetreten ist. Es gibt zahlreiche Retroviren, die für die Auslieferung von Genen sowohl unter Gewebekulturbedingungen als auch in lebenden Organismen in breitem Maße verwendet werden. Beispiele hierfür beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, murines Leukämievirus (MLV), humanes Immunschwächevirus (HIV), equines infektiöses Anämievirus (EIAV), Mausbrusttumorvirus (MMTV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Fujinami Sarcoma Virus (FuSV), murines Moloney-Leukämievirus (Mo-MLV), FBR murines Osteosarcoma-Virus (FBR MSV), murines Moloney-Sarcomavirus (Mo-MSV), murines Abelson-Leukämievirus (A-MLV), Vogel-Myelocytomatose-Virus-29 (MC29) und Vogel-Erythroblastose-Virus (AEV), sowie alle anderen Retroviridae, einschließlich Lentiviren.
Details über die genomische Struktur einiger Lentiviren sind in der Technik zu finden. Beispielsweise können Details über HIV und EIAV in der NCBI-Genbank-Datenbank gefunden werden (d.h. unter den Genom-Hinterlegungsnummern AF033819 bzw. AF033820). Details über HIV-Varianten sind auch zu finden unter http://hiv-web.lanl.gov. Details über EIAV-Varianten sind zu finden unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Lentivirus-Vektoren können so hergestellt werden, dass sie entweder Polynukleinsäuren tragen, die für ein einzelnes Gen codieren, oder bevorzugt kann ein einzelner Lentivirus-Vektor so hergestellt werden, dass er sowohl HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und Derivate hiervon als auch SPPase und Derivate hiervon trägt, wenn die Notwendigkeit einer Expression in derselben Zielzelle besteht. Als eine zusätzliche Ausführungsform ist es außerdem bevorzugt, dass nach der ersten codierenden Sequenz eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) einbezogen wird, um die Translation der zweiten codierenden Sequenz in einer poly-cistronischen Botschaft zu starten.
Eine detaillierte Liste von Retroviren ist zu finden in Coffin et al. („Retroviruses", 1997, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Herausgeber: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, S. 758-763).
Lentiviren gehören ebenfalls zur Familie der Retroviren, jedoch können sie vorteilhafter Weise sowohl sich teilende als auch sich nicht-teilende Zellen infizieren (Lewis of al., 1992, EMBO J., 8, 3053-3058).
Die Vektoren können z.B Plasmid-, Virus- oder Phagen-Vektoren sein, ausgestattet mit einem Replikationsursprung, optional einem Promotor für die Expression des Polynukleotids und optional einem Regulator des Pomotors oder einer IRES.
Alle Vektoren können spezifisch ausgestaltet werden, um bi-cistronische Polynukleotidsequenzen zu tragen, die für Proteine der vorliegenden Erfindung codieren, sowie einen aufspürbaren Marker, wie etwa GFP.
Die Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, wie unten unter „kontrollierte Bedingungen" beschrieben, um eine geeignete Umgebung für die Expression eines Polypeptids der vorliegenden Erfindung bereitzustellen. Somit wird außerdem ein Verfahren bereitgestellt, um Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen, dieses umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die transformiert, transfiziert oder transduziert ist mit einem Expressionsvektor gemäß obiger Beschreibung, unter Bedingungen, um eine durch den Vektor erfolgende Expression einer codierenden Sequenz bereitzustellen, die die Polypeptide codiert, und Gewinnen der exprimierten Polypeptide. Alternativ können Vektoren, die diejenigen Kontrollsequenzen umfassen, die natürlicher Weise mit dem SPPase-Gen assoziiert sind, und die hier in funktionsfähiger Verknüpfung mit einem Reportergen als Reporterkonstrukt vorliegen, in eine Wirtszelle transformiert, transfiziert oder transduziert werden, beispielsweise zur Verwendung in einem Test der Erfindung, der die Wirkung von Kandidatenmitteln auf die Transkription, ausgehend von dem Reporterkonstrukt, in zellulärer Umgebung misst (siehe Tests unten).
Kontrollsequenzen, die funktionsfähig mit Sequenzen verbunden sind, die für das Protein der Erfindung codieren, beinhalten Promotoren/Enhancer und andere Expressionsregulationssequenzen. Diese Kontrollsequenzen können so ausgewählt werden, dass sie mit der Wirtszelle, für die man den Expressionsvektor zu Verwendung mit selbiger ausgestaltet hat, kompatibel sind. Der Begriff „Promotor" ist in der Technik wohlbekannt, z.B als RNA-Polymerase-Bindungsstelle, und umfasst Nukleinsäureregionen, die in ihrer Größe und Komplexität von Minimalpromotoren bis hin zu Promotoren reichen, die stromaufwärtige regulatorische Sequenzen und Enhancer beinhalten.
Der Promotor wird typischerweise aus Promotoren ausgewählt, die in Säugerzellen funktionell sind, obwohl prokaryotische Promotoren und Promotoren, die in anderen Eukaryotenzellen funktionell sind, verwendet werden können. Der Promotor wird typischerweise von Promotorsequenzen viraler oder eukaryotischer Gene abgeleitet. Beispielsweise kann es ein Promotor sein, der von dem Genom einer Zelle abgeleitet ist, in der Expression stattfinden soll. Im Hinblick auf eukaryotische Promotoren können dies Promotoren sein, die in einer ubiquitären Weise funktionieren (wie etwa Promotoren von ⎕-Actin, ⎕-Actin, Tubulin), oder, alternativ, in einer gewebespezifischen Weise (wie etwa Promotoren der Gene für Pyruvat-Kinase). Gewebespezifische Promotoren, die für Leberzellen spezifisch sind, sind besonders bevorzugt, z.B Hepatitis B-Virus-Promotoren, Apolipoprotein AII-Promotoren, humane Serum-Amyloid-P-Komponente-Promotoren oder humane Protein C-Gen-Promotoren. Es können auch Promotoren verwendet werden, die auf spezifische Stimuli reagieren, z.B Promotoren, die Steroidhormon-Rezeptoren binden. Virale Promotoren können ebenfalls verwendet werden, z.B der murine Moloney Leukämievirus-Promotor der langen terminalen Sequenzwiederholungen (MMLV LTR), der Rous Sarcomavirus (RSV)-LTR-Promotor oder der humane Cytomegalievirus (CMV) IE-Promotor. Wie oben diskutiert, sind die SPPase-Promotoren besonders bevorzugt für die Verwendung in Reporterkonstrukten.
Es kann auch vorteilhaft für die Promotoren sein, induzierbar zu sein, sodass die Expressionsniveaus des heterologen Gens während der Lebensdauer der Zelle reguliert werden können. Induzierbar bedeutet, dass die Expressionsniveaus, die unter Verwendung des Promotors erhalten werden, reguliert werden können.
Zusätzlich kann jeder dieser Promotoren durch die Hinzufügung weiterer regulatorischer Sequenzen, z.B Enhancer-Sequenzen, modifiziert werden. Es können auch chimäre Promotoren verwendet werden, die Sequenzelemente aus zwei oder mehr der oben beschriebenen verschiedenen Promotoren umfassen.
Die Vektoren können ein oder mehrere selektierbare Markergene enthalten, z.B ein Ampicillin-Resistenzgen im Falle eines bakteriellen Plasmids oder ein Neomycin-Resistenzgen für Säuger-Expressionsvektoren.
Die bevorzugten Selektionssysteme für industrielle Mikroorganismen sind diejenigen, die durch die Gruppe von Selektionsmarkern gebildet werden, die keine Mutation im Wirtsorganismus erfordern. Beispiele für pilzliche Selektionsmarker sind die Gene für Acetamidase (amdS), ATP-Synthetase, Untereinheit 9 (oliC), Orotidin-5'-Phosphat-Decarboxylase (pvrA), Phleomycin- und Benomyl-Resistenz (benA). Beispiele für nicht-pilzliche Selektionsmarker sind das bakterielle G418-Resistenzgen (dieses kann auch in Hefe verwendet werden, nicht jedoch in filamentösen Pilzen), das Ampicillin-Resistenzgen (E. coli), das Neomycin-Resistenzgen (Bacillus) und das E. coli uidA-Gen, das für β-Glucuronidase (GUS) codiert.
Vektoren können in vitro verwendet werden, z.B für die Produktion von RNA, oder sie können verwendet werden, um eine Wirtszelle zu transfizieren, zu transformieren oder zu transduzieren.
Somit können Polynukleotide in einen rekombinanten Vektor eingebaut werden (typischerweise einen replizierbaren Vektor), z.B einen Klonierungs- oder Expressionsvektor. Der Vektor kann verwendet werden, um die Nukleinsäure in einer kompatiblen Wirtszelle zu replizieren. Somit wird ein Verfahren beschrieben, um Polynukleotide der vorliegenden Erfindung durch Einführen eines Polynukleotids der vorliegenden Erfindung in einen replizierbaren Vektor, Einführen des Vektors in eine kompatible Wirtszelle und Heranzüchten der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Replikation des Vektors mit sich bringen, herzustellen. Der Vektor kann aus der Wirtszelle wiedergewonnen werden. Geeignete Wirtszellen werden unten im Zusammenhang mit Expressionsvektoren beschrieben.
Genetisch manipulierte Wirtszellen, die ein SPPase-Protein oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat hiervon bei den Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung von Inhibitoren und Antagonisten der SPPase exprimieren, werden ebenfalls beschrieben. In einem weiteren Beispiel wird außerdem die Verwendung genetisch manipulierter Wirtszellen beschrieben, die ein SPPase-Protein oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat hiervon bei Durchmusterungsverfahren für die Identifizierung von Inhibitoren und Antagonisten (oder Kombinationen hiervon) der SPPase exprimieren, wobei diese Inhibitoren und Antagonisten somit die Signalpeptidpeptidase-Spaltungsaktivität im Bezug auf HCV-Core modulieren und auch den Transport von Core zu den zytoplasmatischen Lipidkügelchen beeinflussen werden. Solche genetisch manipulierten Wirtszellen könnten verwendet werden, um Peptidbibliotheken oder einen Array organischer Moleküle zu durchmustern, die befähigt sind, die SPPase-Aktivität zu modulieren. Antagonisten und Inhibitoren von SPPase, wie etwa Antikörper, Peptide oder kleine organische Moleküle, werden die Basis für pharmazeutische Zusammensetzungen für die Behandlung von mit HCV assoziierten Erkrankungen bereitstellen, indem sie auf die katalytische Aktivität von SPPase abzielen. Solche Inhibitoren oder Antagonisten können alleine oder in Kombination mit anderen Therapeutika für die Behandlung solcher Erkrankungen verabreicht werden.
Es werden Expressionsvektoren und Wirtszellen beschrieben, die Polynukleotidsequenzen umfassen, die für SPPase oder eine Variante, ein Homologes, ein Fragment oder Derivat hiervon codieren, für die in vivo- oder in vitro-Produktion des SPPase-Proteins oder zur Durchmusterung auf Mittel, die die SPPase-Expression oder -Aktivität beeinflussen können.
Der Begriff „Gewebe", wie hier verwendet, beinhaltet ein Gewebe als solches und ein Organ.
Der Begriff „Wirtszelle" beinhaltet jedwede Zelle, die die Nukleotidsequenz umfassen kann, die für das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, und/oder für Produkte, die hieraus erhalten werden, wobei ein Promotor die Expression der Nukleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung, wenn diese in einer Wirtszelle vorliegt, erlauben kann. Weiterhin können Vektoren und Polynukleotide (die oben beschriebenen Reportergen-Konstrukte) auch in Wirtszellen eingeführt werden, um den Vektor/das Polynukleotid zu replizieren.
Das gram-negative Bakterium E. coli wird als Wirt für die heterologe Genexpression in breitem Maße verwendet. Jedoch neigen große Mengen an heterologem Protein dazu, im Inneren der Zelle in Form unlöslicher Einschlusskörper zu akkumulieren, was die Reinigung von Proteinen von Interesse aus der Masse der intrazellulären E. coli-Proteine problematisch machen kann.
Im Gegensatz zu E. coli sind die gram-positiven Bakterien der Gattung Bacillus aufgrund ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium zu sekretieren, sehr geeignet als heterologe Wirte. Andere Bakterienspezies, die als Wirte im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind die Gattungen Streptomyces und Pseudomonas.
Eine bevorzugte Wirtszelle für die Expression von Säuger-SPPase ist Saccharomyces cerevisiae, wie beschrieben in Science (2002), 296, S. 2215-2218.
Obwohl die Proteine der vorliegenden Erfindung unter Verwendung prokaryotischer Zellen, wie oben dargestellt, hergestellt werden können, macht das Bedürfnis nach weiterer posttranslationaler Modifikation des exprimierten Proteins die eukaryotischen Zellen, z.B Hefe-, Insekten-, Pilz- und insbesondere Säugerzellen, erstrebenswerter. Spezifische Beispiele geeigneter Expressionswirte sind Zellen, die wesentliche Mengen an intrazellulären Lipidablagerungen/-Kügelchen enthalten, z.B Adipozyten. Besonders bevorzugte Zellen sind diejenigen, die natürlicherweise von HCV angesteuert werden, was erwünscht ist, um beispielsweise Leberzellen (Hepatozyten) zu behandeln.
Die Verwendung geeigneter Wirtszellen – wie etwa von Hefe-, Pilz-, Pflanzen- und Säugerwirtszellen – wird eine geeignete Umgebung für posttranslationale Modifikationen (z.B Myristoylierung, Glycosylierung, Sumolierung, Acetylierung, Trunkierung, Lipid-Anbindung und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung) bereitstellen, wie dies benötigt werden kann, um den rekombinanten Expressionsprodukten der vorliegenden Erfindung optimale biologische Aktivität zu verleihen.
Dort, wo Vektoren/Polynukleotide an Tiere verabreicht werden sollen, sind verschiedene Techniken in der Technik bekannt, z.B die Infektion mit rekombinanten viralen Vektoren, wie etwa Herpes simplex-Viren, Adenoviren und Lentiviren, die direkte Injektion von Nukleinsäuren und biolistische Transformation.
Proteinexpression und Reinigung
Wirtszellen, die Polynukleotide der Erfindung umfassen, können verwendet werden, um Proteine der Erfindung zu exprimieren. Wirtszellen können unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, die die Expression der Proteine der Erfindung erlauben. Die Expression der Proteine der Erfindung kann konstitutiv sein, sodass diese kontinuierlich produziert werden, oder induzierbar, sodass ein Stimulus zum Induzieren der Expression benötigt wird. Im Fall der induzierbaren Expression kann die Proteinproduktion gestartet werden, wenn sie benötigt wird, z.B durch die Zugabe eines Induktors zu dem Kulturmedium, z.B von Dexamethason oder IPTG.
Die Proteine der Erfindung können durch eine Vielzahl in der Technik bekannter Techniken aus den Wirtszellen extrahiert werden, einschließlich enzymatischer, chemischer und/oder osmotischer Lyse und physikalischem Aufbrechen. Obwohl eine große Anzahl verschiedener Reinigungsprotokolle verwendet werden kann, ist es angesichts der Fähigkeit der HCV-Core-Proteine der Erfindung, interessierende Proteine zu Lipidkügelchen zu lenken so, dass ein bevorzugtes Extraktions-/Reinigungsprotokoll die Zentrifugation von Zellhomogenisaten bei hoher Geschwindigkeit (z.B 100.000 g für 60 min bei 2°C bis 4°C) und das Abnehmen der resultierenden Schicht schwimmender Lipide beinhaltet. Dies wird als primärer Reinigungsschritt fungieren. Die weitere Reinigung kann dann, wenn notwendig, z.B unter Verwendung von Säulenchromatographie, wie etwa Ionenaustausch- oder Affinitätschromatographie, erfolgen. Zellen, die zur Sekretion von Lipidtröpfchen befähigt sind, können praktischer Weise verwendet, und die Lipidtröpfchen können aus dem Kulturüberstand geerntet werden.
Proteine, die mit der Membran assoziiert sind, die die Fettkügelchen umgibt, können durch die Extraktion mit 1 % (w/v) Triton X-100/1,5 M NaCl/10 mM Tris (pH 7,0), durch die Extraktion mit 1,5% (w/v) Dodecyl-⎕-D-Maltosid/0,75 M Aminohexansäure/10 mM Hepes (pH 7,0) oder durch sequentielle Extraktion mit diesen beiden Detergens-haltigen Lösungen (Patton und Huston, 1986, Lipids, 21(2): 170-4) in lösliche und unlösliche Fraktionen aufgetrennt werden. Eine Suspension der Fettkügelchen-Komponenten in der Detergens-haltigen Lösung kann erreicht werden unter Verwendung eines Vollglas-Homogenisators und Halten auf Eis für 30 bis 60 min, wonach unlösliche und lösliche Materialien durch Zentrifugation für 60 min bei 2°C und 150.000 g voneinander getrennt werden können. Die obigen Bedingungen können modifiziert werden, um zu analysieren, ob Core-Protein oder ein Fusionsprotein, das Core als Komponente enthält, an Fettkügelchen angeheftet ist. Weitere Detergentien, sowohl ionisch als auch nicht-ionisch, zusammen mit Salzlösungen bei verschiedenen Konzentrationen, können verwendet werden, um das proteinöse Material aus den Fettkügelchen zu gewinnen. Die Inkubationszeiten und Temperaturen können durch empirische Mittel optimiert werden.
Immunmodulatoren
Immunmodulatoren, wie etwa Impfstoffe, können aus einem oder mehreren Polypeptiden oder sogar aus Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Die Herstellung von Immunmodulatoren, die (ein) immunogene(s) Polypeptid(e) als Wirkstoff(e) enthalten, ist Fachleuten bekannt. Typischerweise werden solche Immunmodulatoren als injizierbare Mittel hergestellt, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen; feste Formen, die für die Injektion zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann außerdem emulgiert werden, oder das Protein kann in Liposomen eingekapselt werden. Die aktiven immunogenen Bestandteile werden oft mit Hilfsstoffen gemischt, die pharmazeutisch verträglich und mit dem Wirkstoff kompatibel sind. Geeignete Hilfsstoffe sind z.B Wasser, Saline, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder dergleichen, sowie Kombinationen hiervon.
Zusätzlich, wenn gewünscht, können die Immunmodulatoren kleinere Mengen an Hilfsstoffen, wie etwa Befeuchtungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffermittel und/oder Hilfsstoffe, enthalten, die die Wirksamkeit der Immunmodulatoren verstärken. Beispiele dieser Hilfsstoffe, die wirksam sein können, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, bezeichnet als nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835A, bezeichnet als MTP-PE) und RIBI, das drei Komponenten enthält, die aus Bakterien extrahiert wurden, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalose-Dimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS), in einer 2% Squalen/Tween 80-Emulsion.
Weitere Beispiele von Adjuvanzien und anderen Mitteln beinhalten Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumkaliumsulfat (Alaun), Berylliumsulfat, Siliciumdioxid, Kaolin, Kohlenstoff, Wasser-in-Öl-Emulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Muramyldipeptid, bakterielles Endotoxin, Lipid X, Corynebacterium parvum (Propionobacterium acnes), Bordetella pertussis, Polyribonukleotide, Natriumalginat, Lanolin, Lysolecithin, Vitamin A, Saponin, Liposomen, Levamisol, DEAE-Dextran, geblockte Co-Polymere oder andere synthetische Hilfsstoffe. Solche Adjuvanzien sind kommerziell bei verschiedenen Quellen erhältlich, z.B Merck Adjuvans 65 (Merck und Company, Inc., Rahway, N.J.) oder Freunds unvollständiges Adjuvans und vollständiges Adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, Michigan).
Typischerweise werden Adjuvanzien, wie etwa Amphigen (Öl-in-Wasser), Alhydrogel (Aluminiumhydroxid) oder ein Gemisch aus Amphigen und Alhydrogel, verwendet. Für den menschlichen Gebrauch ist nur Aluminiumhydroxid zugelassen.
Das Mengenverhältnis von Immunogen und Adjuvans kann über einen breiten Bereich variiert werden, solange beide in wirksamen Mengen vorliegen. Beispielsweise kann Aluminiumhydroxid in einer Menge von etwa 0,5% des Immunmodulatoren-Gemischs vorliegen (Al₂O₃-Basis). Prakti scherweise werden die Immunmodulatoren so formuliert, dass sie eine Endkonzentration von Immunogen im Bereich von 0,2 bis 200 μg/ml, bevorzugt von 5 bis 50 μg/ml, am bevorzugtesten von 15 μg/ml, enthalten.
Nach der Formulierung können die Immunmodulatoren in einen sterilen Behälter eingebracht werden, der dann verschlossen und bei niedriger Temperatur gelagert wird, z.B bei 4°C, oder diese können einer Gefriertrocknung unterzogen werden. Die Gefriertrocknung erlaubt eine lange Lagerung in einer stabilisierten Form.
Die Wirksamkeit eines Adjuvans kann bestimmt werden durch Messen der Menge an Antikörpern, die gegen ein immunogenes Polypeptid gerichtet sind, das eine antigene SPPase-Sequenz enthält, resultierend aus der Verabreichung dieses Polypeptids in Immunmodulatoren, die ebenfalls aus den verschiedenen Adjuvanzien zusammengesetzt sind.
Die Immunmodulatoren werden konventionell parenteral verabreicht, durch Injektion, z.B entweder subkutan oder intramuskulär. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Formen der Verabreichung geeignet sind, beinhalten Zäpfchen, und, in einigen Fällen, orale Formulierungen. Für Zäpfchen können traditionelle Bindemittel und Träger z.B. Polyalkylenglykole oder Triglyceride beinhalten; solche Zäpfchen können aus Gemischen hergestellt werden, die den Wirkstoff in einem Mengenbereich von 0,5% bis 10% enthalten, bevorzugt von 1 % bis 2%. Orale Formulierungen beinhalten solche normalerweise verwendeten Hilfsstoffe, wie z.B pharmazeutische Qualitäten von Mannitol, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat und dergleichen. Diese Zusammensetzungen erhalten dann die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit anhaltender Freisetzung oder von Pulvern, und sie enthalten 10% bis 95% des Wirkstoffs, bevorzugt 25% bis 70%. Wenn die Zusammensetzung der Immunmodulatoren lyophilisiert wird, so kann das lyophilisierte Material vor der Verabreichung wiederhergestellt werden, z.B als Suspension. Die Wiederherstellung wird bevorzugt in Puffer durchgeführt.
Kapseln, Tabletten und Pillen für die orale Verabreichung an einen Patienten können mit einer enterischen Beschichtung versehen werden, die beispielsweise Eudragit „S", Eudragit „L", Celluloseacetat, Celluloseacetat-Phthalat oder Hydroxypropylmethyl-Cellulose umfasst.
Die Polypeptide der Erfindung können in neutraler Form oder in Salzform zu den Immunmodulatoren formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze beinhalten die Säureadditionssalze (ausgebildet mit den freien Aminogruppen des Peptids), welche ausgebildet werden mit anorganischen Säuren, wie z.B Salzsäure oder Phosphorsäure, oder mit solchen organischen Säuren wie z.B Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure und Maleinsäure. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen abgeleitet werden, wie z.B Natrium-, Kali um-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxiden, und von solchen organischen Basen wie etwa Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin und Procain.
Antikörper
Monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen Polypeptide der Erfindung oder Fragmente hiervon werden ebenfalls beschrieben. Somit wird auch ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen Polypeptide der Erfindung beschrieben.
Wenn polyklonale Antikörper gewünscht sind, wird ein ausgewähltes Säugetier (z.B Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd, etc.) mit einem immunogenen Polypeptid immunisiert, das (ein) SPPase-Epitop(e) trägt. Serum aus dem immunisierten Tier wird gesammelt und gemäß bekannten Verfahren behandelt. Wenn Serum, das polyklonale Antikörper gegen ein (bestimmtes Polypeptid)-Epitop enthält, auch Antikörper gegen andere Antigene enthält, so können die polyklonalen Antikörper durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt werden. Techniken zur Herstellung und Bearbeitung polyklonaler Antiseren sind in der Technik bekannt. Damit solche Antikörper hergestellt werden können, stellt die Erfindung auch Polypeptide der Erfindung oder Fragmente hiervon, die an andere Polypeptide „haptenisiert" sind, zur Verwendung als Immunogene bei Tieren oder Menschen bereit.
Monoklonale Antikörper, die gegen die Polypeptide der Erfindung gerichtet sind, können außerdem leicht von einem Fachmann hergestellt werden. Die allgemeine Methodik zur Herstellung monoklonaler Antikörper durch Hybridome ist wohlbekannt. Unsterbliche Antikörper-produzierende Zelllinien können durch Zellfusion erzeugt werden, und auch durch andere Techniken, wie etwa direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder durch die Transfektion mit Epstein Barr-Virus. Paletten monoklonaler Antikörper, die gegen SPPase-Epitope produziert werden, können auf verschiedene Eigenschaften hin durchgemustert werden, d.h. auf Isotyp- und Epitop-Affinität.
Eine alternative Technik beinhaltet die Durchmusterung von Phage Display-Bibliotheken, bei denen z.B der Phage scFv-Fragmente auf der Oberfläche seiner Hülle mit einer großen Vielzahl an Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) exprimiert. Diese Technik ist in der Technik wohlbekannt.
Antikörper, sowohl monoklonal als auch polyklonal, die gegen Epitope gerichtet sind, sind besonders nützlich für die Diagnose, und solche, die neutralisierend sind, sind nützlich bei der passiven Immuntherapie. Monoklonale Antikörper insbesondere können verwendet werden, um Anti-Idiotyp-Antikörper heranzuzüchten. Anti-Idiotyp-Antikörper sind Immunglobuline, die ein „inneres Bild" des Antigens des Mittels tragen, gegen das man Schutz haben möchte.
Techniken zur Erzeugung von Anti-Idiotyp-Antikörpern sind in der Technik bekannt. Diese Anti-Idiotyp-Antikörper können auch bei der Therapie nützlich sein.
Der Begriff „Antikörper", solange nicht gegenteilig spezifiziert, schließt Fragmente ganzer Antikörper, die ihre Bindungsaktivität für ein Ziel-Antigen behalten, ein. Solche Fragmente beinhalten Fv, F(ab') und F(ab')₂-Fragmente ebenso wie Einzelketten-Antikörper (scFv). Weiterhin können die Antikörper und Fragmente hiervon humanisierte Antikörper sein, z.B siehe Beschreibung in der EP-A-239400.
Antikörper können bei Verfahren zur Detektion von Polypeptiden der Erfindung, die in biologischen Proben vorhanden sind, verwendet werden, durch ein Verfahren, das Folgendes umfasst:

(a) Bereitstellen eines Antikörpers;
(b) Inkubieren einer biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die die Bildung eines Antikörper-Antigen-Komplexes erlauben; und
(c) Bestimmen, ob ein Antikörper-Antigen-Komplex, der diesen Antikörper umfasst, gebildet wird.

Geeignete Proben beinhalten Extrakte aus Geweben, wie etwa Gehirn, Brust, Eierstock, Lunge, Colon, Pankreas, Hoden, Leber, Muskel und Knochengewebe, oder aus Neoplasien, die von solchen Geweben stammen.
Die Antikörper können an einen festen Träger gebunden werden und/oder in Kits in einem geeigneten Behälter zusammen mit geeigneten Reagenzien, Kontrollen, Anweisungen und dergleichen, verpackt werden.
Ribozyme
Ribozyme sind enzymatische RNA-Moleküle, die befähigt sind, die spezifische Spaltung von RNA zu katalysieren. Der Mechanismus der Ribozymwirkung beinhaltet eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an komplementäre Ziel-RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Künstlich hergestellte Hammerkopfmotiv-Ribozymmoleküle, die spezifisch und effizient die endonukleolytische Spaltung von SPPase-RNA-Sequenzen katalysieren, werden beschrieben.
Spezifische Ribozymspaltungsstellen innerhalb jedes potentiellen RNA-Ziels lassen sich zu Beginn identifizieren, indem man das Zielmolekül auf Ribozymspaltungsstellen hin durchmustert, die die folgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC beinhalten. Sobald diese identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen mit zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die der Region des Zielgens entsprechen, die die Spaltstelle enthält, auf Sekundärstrukturmerkmale hin bewertet werden, die die Oligonukleotidsequenz funktionsunfähig machen könnten. Die Eignung von Kandidatenzielen kann auch bewertet werden, indem man die Zugänglichkeit gegenüber Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonuklease-Schutz-Assays testet.
Sowohl Antisense-RNA- als auch -DNA-Moleküle und Ribozyme können durch jedwedes Verfahren hergestellt werden, das in der Technik zur Synthese von RNA-, DNA- und Ribozym-Molekülen bekannt ist. Diese beinhalten Techniken zur chemischen Synthese von Oligonukleotiden, wie etwa chemische Festphasen-Phosphoramidit-Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch die in vitro- oder in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die das Antisense-RNA-Molekül codieren, erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in eine breite Vielzahl von Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, wie etwa T7 oder SP6, eingebaut werden. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, die Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingeführt werden.
Detektion
Die Gegenwart der codierenden Sequenz von SPPase-Polynukleotid kann durch DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung oder Amplifikation unter Verwendung von Sonden, Teilen oder Fragmenten der Sequenzen, die als beliebige der in den angehängten Sequenzlisten gezeigten Sequenzen dargestellt sind, detektiert werden. Auf Nukleinsäure-Amplifikation basierende Assays beinhalten die Verwendung von Oligonukleotiden oder Oligomeren, die auf der SPPase-codierenden Sequenz basieren, um Transformanten zu detektieren, die SPPase-DNA oder SPPase-RNA enthalten. Wie hier verwendet, können sich „Oligonukleotide" oder „Oligomere" auf eine Nukleinsäuresequenz von wenigstens etwa 10 Nukleotiden und immerhin etwa 60 Nukleotiden, bevorzugt von etwa 15 bis 30 Nukleotiden, und bevorzugter von etwa 20 bis 25 Nukleotiden beziehen, die als Sonde oder Amplimer verwendet werden kann. Bevorzugt werden Oligonukleotide von der 3'-Region der Nukleotidsequenz, die als irgendeine der in den angefügten Sequenzlisten dargestellten Sequenzen gezeigt ist, abgeleitet.
Eine Vielzahl von Protokollen zum Detektieren und Messen der Expression von SPPase-Polypeptid, wie etwa durch Verwendung entweder polyklonaler oder monoklonaler Antikörper, die für die Proteine der vorliegenden Erfindung spezifisch sind, sind in der Technik bekannt. Beispiele beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Enzym-gebundenen Immunosorptionstest (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortierung (FACS). Ein zweiseitiger, auf monoklonalen Antikörpern basierender Immunoassay, der monoklonale Antikörper verwendet, die reaktiv sind gegenüber zwei nicht miteinander wechselwirkenden Epitopen auf den SPPase-Polypeptiden, ist bevorzugt, obwohl ein kompetitiver Bindungstest verwendet werden kann. Diese und andere Tests sind unter anderem beschrieben in Hampton R. et al., (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul MN) und Maddox DE et al. (1983, J Exp Med, 15, 8:121 1).
Fachleuten ist eine breite Vielfalt von Markierungen und Konjugationstechniken bekannt, und diese können bei verschiedenen Nukleinsäure- und Aminosäure-Assays verwendet werden. Verfahren zur Herstellung markierter Hybridisierungs- oder PCR-Sonden zum Detektieren von SPPase-Polynukleotidsequenzen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Oligo-Markierung, Nick-Translation, End-Markierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotids. Alternativ kann die SPPase-codierende Sequenz oder jeder beliebige Teil hiervon in einen Vektor für die Herstellung einer mRNA-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind in der Technik bekannt, sind kommerziell erhältlich und können verwendet werden, um RNA-Sonden in vitro durch die Zugabe einer geeigneten RNA-Polymerase, wie etwa T7, T3 oder SP6, und markierten Nukleotiden zu synthetisieren.
Eine Anzahl von Firmen, wie etwa die Amersham-Pharmacia (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH), liefern kommerzielle Kits und Protokolle für diese Prozeduren. Geeignete Reportermoleküle oder Markierungen beinhalten diese Radionuklide, Enzyme, fluoreszente, chemilumineszente oder chromogene Mittel, ebenso wie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, die über die Verwendung solcher Markierungen unterrichten, beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, die US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 und US-A-4366241. Auch rekombinante Immunglobuline können hergestellt werden, wie in der US-A-4816567 gezeigt.
Zusätzliche Verfahren zur Quantifizierung der Expression eines bestimmten Moleküls beinhalten radioaktive Markierung (Melby PC et al., 1993, J. Immunol Methods, 159, 235-44) oder die Biotinylierung (Duplaa C et al., 1993, Anal Biochem 212, 229-36) von Nukleotiden, die Coamplifikation einer Kontrollnukleinsäure, sowie Standardkurven, auf denen die Versuchsergebnisse interpoliert werden. Die Quantifizierung mehrerer Proben kann beschleunigt werden, indem man den Assay in einem ELISA-Format laufen lässt, bei dem das Oligomer von Interesse in verschiedenen Verdünnungen präsentiert wird und eine spektrophotometrische oder kalorimetrische Antwort eine schnelle Quantifizierung ergibt.
Obwohl die Anwesenheit bzw. Abwesenheit von Markergenexpression nahelegt, dass das Gen von Interesse auch anwesend ist, so sollte seine Gegenwart und Expression bestätigt werden. Wenn die SPPase codierende Sequenz beispielsweise in eine Markergen-Sequenz inseriert wird, so können rekombinante Zellen, die die SPPase codierenden Regionen enthalten, durch die Abwesenheit von Markergenfunktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen im Tandem mit einer SPPase codierenden Sequenz unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors der Wahl angeordnet werden. Die Expression des Markergens als Antwort auf die Induktion oder Selektion zeigt dann für gewöhnlich auch die Expression der SPPase an.
Alternativ können Wirtszellen, die die codierende Sequenz für SPPase enthalten und die SPPase codierenden Regionen exprimieren, durch eine Vielzahl von Prozeduren identifiziert werden, die Fachleuten bekannt sind. Diese Prozeduren beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung und Proteinbioassay- oder Immunoassay-Techniken, die membranbasierte, lösungsbasierte oder chipbasierte Technologien für die Detektion und/oder Quantifizierung der Nukleinsäure oder des Proteins einbeziehen.
HCV kann detektiert werden:
HCV kann unter Verwendung eines Verfahrens detektiert werden, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Bereitstellen einer Probe – wie etwa einer biologischen Probe aus einem Säugetier; und (b) Detektieren eines oder mehrerer Spaltungsfragmente einer Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz in der Probe, wobei das Vorliegen eines oder mehrerer Spaltungsfragmente einer Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz in der Probe die Anwesenheit des HCV-Virus anzeigt.
Die Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz kann aus einem sekundären (oder 2°) Prozessierungs-/Spaltungsereignis des HCV-Polyproteins als Konsequenz einer proteolytischen Spaltung des HCV-Polyproteins durch SPPase abgeleitet werden. Dementsprechend kann die Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz ableitbar sein aus Hepatitis C-Virus (HCV)-Coreprotein oder einem Derivat, einer Variante oder einem Homologen hiervon.
Bevorzugt umfasst die Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz die Aminosäuren 173 bis 188 (SEQ ID No. 3) des HCV-Core-Proteins oder einer Mutante, Variante oder einem Homologen hiervon.
Ein oder mehrere Spaltungsfragmente einer Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz können unter Verwendung eines Antikörpers detektiert werden (z.B mittels eines monoklonalen oder eines polyklonalen Antikörpers, eines Einzelketten-Antikörpers, eines chimären Antikörpers und eines CDR-transplantierten Antikörpers). Insbesondere können ein oder mehrere Spaltungsfragmente einer Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz unter Verwendung von Western Blot detektiert werden.
Mittel
Ein oder mehrere Mittel können durch die Testverfahren der vorliegenden Erfindung identifizierbar sein.
Das Mittel kann z.B eine organische Verbindung oder eine anorganische Verbindung sein. Das Mittel kann z.B eine Nukleotidsequenz sein, die zu der Gesamtheit oder einem Teil der Sequenzen, die in den angefügten Sequenzlisten gezeigt sind, in Antisense-Orientierung vorliegt.
Das Mittel kann auch die SPPase-Aktivität beeinflussen (so etwa diese inhibieren, modulieren oder verstärken), z.B in einem beliebigen oder mehreren von Putamen, Nucleus caudatus des Gehirns, Okzipitallappen des Gehirns, Herz, Eierstöcken, Hypophyse, Niere, Leber, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Leukozytenregionen, Dorsalwurzelganglien, Uterus, Cochlea, Dünndarm (Zwölffingerdarm), Astrozytom und Blinddarm (siehe Beispiele).
Sonden
Nukleinsäurehybridisierungs- oder PCR-Sonden, die befähigt sind, Polynukleotidsequenzen, einschließlich genomischer Sequenzen, codierend für eine SPPase codierende Region oder nahe verwandte Moleküle, wie etwa Allele, zu detektieren, werden beschrieben. Die Spezifität der Sonde, d.h. ob sie von einer hochgradig konservierten, konservierten oder nicht-konservierten Region oder Domäne abgeleitet ist, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (hoch, mittel oder gering) werden bestimmen, ob die Sonde nur eine natürlich vorkommende SPPase codierende Sequenz oder auch verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden für die Detektion verwandter Nukleinsäuresequenzen werden ausgewählt aus konservierten oder hochgradig konservierten Nukleotidregionen von zyklischen Nukleotid-SPPase-Familienmitgliedern, wie etwa der 3'-Region, und solche Sonden können in einem Pool degenerierter Sonden verwendet werden. Für die Detektion identischer Nukleinsäuresequenzen oder dort, wo eine maximale Spezifität erwünscht ist, werden die Nukleinsäuresonden aus den nicht-konservierten Nukleotidregionen oder singulären Regionen von SPPase-Polynukleotiden ausgewählt. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „nicht-konservierte Nukleotidregion" auf eine Nukleotidregion, die singulär bei der hier offenbarten SPPase codierenden Sequenz ist und nicht bei verwandten Familienmitgliedern vorkommt.
PCR, wie sie beschrieben ist in der US-A-4683195, der US-A-4800195 und der US-A-4965188, stellt weitere Anwendungen für Oligonukleotide bereit, die auf der SPPase-Sequenz basieren. Solche Oligomere werden im allgemeinen chemisch synthetisiert, sie können jedoch auch enzymatisch oder aus einer rekombinanten Quelle erzeugt werden. Oligomere umfassen im allgemeinen zwei Nukleotidsequenzen, eine mit Sinn(Sense)-Orientierung (5'->3') und eine mit Gegensinn(Antisense)-Orientierung (3'<-5'), die unter optimierten Bedingungen verwendet werden, um ein spezifisches Gen oder eine Bedingung zu identifizieren. Die gleichen zwei Oligomere, verschachtelte Sets von Oligomeren („nested" Oligomere) oder sogar ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen für die Detektion und/oder Quantifizierung eng verwandter DNA- oder RNA-Sequenzen verwendet werden.
Die Nukleinsäuresequenz für SPPase kann auch verwendet werden, um Hybridisierungssonden zu erzeugen, wie zuvor beschrieben, um die endogene genomische Sequenz zu kartieren. Die Sequenz kann unter Verwendung wohlbekannter Techniken auf ein bestimmtes Chromosom oder auf eine spezifische Region des Chromosoms kartiert werden. Diese Techniken beinhalten in situ-Hybridisierung auf chromosomalen Quetschpräparaten (Verma et al., 1988, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), Durchfluss-sortierte Chromosomenpräparationen oder künstliche Chromosomen-Konstruktionen, wie etwa YACs, künstliche Bakterienchromosomen (BACs), bakterielle PI-Konstruktionen oder Einzelchromosomen-cDNA-Bibliotheken.
Die in sifu-Hybridisierung chromosomaler Präparationen und physikalische Kartierungstechniken, wie etwa die Verknüpfungsanalyse unter Verwendung etablierter chromosomaler Marker, sind unschätzbar bei der Erweiterung genetischer Karten. Beispiele genetischer Karten sind in Science (1995; 270: 410f und 1994; 265: 1981f) zu finden. Oft kann die Positionierung eines Gens auf dem Chromosom einer anderen Säuger-Spezies assoziierte Marker aufdecken, selbst wenn die Zahl oder der Arm eines bestimmten menschlichen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können durch physikalische Kartierung Chromosomenarmen oder Teilen davon zugeordnet werden. Dies liefert wertvolle Information für Forscher, die unter Verwendung positionaler Klonierung oder anderer Strategien der Genentdeckung nach Krankheitsgenen suchen. Sobald eine Krankheit oder ein Syndrom, wie etwa Ataxia felangiectasia (AT) durch genetische Verknüpfung grob einer bestimmten genomischen Region zugeordnet wurde, z.B AT auf 11q22-23 (Gatti et al., 1988, Nature 336: 577-580), so können alle Sequenzen, die in dieser Gegend kartieren, assoziierte oder regulatorische Gene für die weitere Untersuchung darstellen. Die Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um Unterschiede bei der chromosomalen Positionierung aufgrund von Translokation, Inversion, etc. zwischen normalen Individuen, Trägerindividuen und betroffenen Individuen zu detektieren.
Pharmazeutika
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung eines diese aufgrund von SPPase-Aktivität benötigenden Individuums, die Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Mittels umfasst, das die Aktivität beeinflusst (z.B inhibiert), und ein pharmazeutisch verträglicher Träger, ein Verdünnungsmittel, ein Hilfsstoff oder Adjuvans, werden beschrieben.
Pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen die hier beschriebenen Mittel (ein Mittel, das befähigt ist, das Expressionsmuster der Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung oder die Aktivität des Expressionsprodukts hiervon zu modulieren und/oder ein Mittel, das durch einen Test gemäß der vorliegenden Erfindung identifizierbar ist). In dieser Hinsicht und insbesondere für die Therapie beim Menschen, selbst, wenn die Mittel alleine verabreicht werden können, werden sie allgemein im Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel, das im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und pharmazeutische Standardpraxis ausgewählt wurde, verabreicht werden.
Beispielsweise können die Mittel in den pharmazeutischen Zusammensetzungen zusammen mit einem beliebigen bzw. beliebigen geeigneten Bindemittel(n), Gleitmittel(n), Suspendiermittel(n), Beschichtungsmittel(n), Lösungsvermittler(n) oder die Absorption steigernden Mittel(n) gemischt werden.
Im allgemeinen wird eine therapeutisch wirksame tägliche orale oder intravenöse Dosis der Mittel der vorliegenden Erfindung wahrscheinlich von 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht des zu behandelnden Individuums reichen, bevorzugt von 0,1 bis 20 mg/kg. Diese Mittel können auch durch intravenöse Infusion bei einer Dosis verabreicht werden, die wahrscheinlicher Weise von 0,001 bis 10 mg/kg/h reicht.
Tabletten oder Kapseln der Mittel können einzeln oder mit zwei oder mehr zu einem Zeitpunkt verabreicht werden, wie es angemessen ist. Es ist auch möglich, die Mittel in Formulierungen mit verlängerter Freisetzung zu verabreichen.
Somit wird ein Verfahren zum Behandeln eines Individuums, das dies aufgrund von SPPase-Aktivität benötigt, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung an das Individuum, beschrieben.
Typischerweise wird der Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für einen einzelnen Patienten am geeignetsten sein wird, und diese wird mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variieren. Die obigen Dosierungen sind beispielhaft für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich individuelle Gegebenheiten geben, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche günstig sind.
Dort, wo es passend ist, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in Form eines Zäpfchens oder Pessars, topisch in Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder als Stäubepuder, durch die Verwendung eines Hautpflasters, oral in Form von Tabletten, die Hilfsstoffe, wie etwa Stärke oder Laktose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovula, entweder alleine oder im Gemisch mit Hilfsstoffen, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, enthaltend Geschmacks- oder Farbstoffe, verabreicht werden, oder sie können parenteral injiziert werden, z.B intrakavernös, intravenös, intramuskulär oder subkutan. Für die parenterale Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet werden, die andere Mittel enthalten kann, z.B genug Salze oder Monosaccharide, um die Lösung gegenüber dem Blut isotonisch zu machen. Für die buccale oder sublinguale Verabreichung können die Zu sammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschtabletten, die in einer konventionellen Weise formuliert werden können, verabreicht werden.
Bei bestimmten Anwendungen ist die bevorzugte Verabreichung der Zusammensetzung oral in Form von Tabletten, die Hilfsstoffe, wie etwa Stärke oder Laktose, enthalten, oder in Kapseln oder Ovula, entweder alleine oder im Gemisch mit Hilfsstoffen, oder in Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Geschmacksstoffe oder Färbemittel enthalten.
Für die parenterale Anwendung werden die Zusammensetzungen am besten in Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, die andere Mittel enthalten kann, z.B genug Salze oder Monosaccharide, um die Lösung isotonisch mit Blut zu machen.
Für die buccale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von Tabletten oder Lutschtabletten, die in einer konventionellen Weise formuliert werden können, verabreicht werden.
Für die orale, parenterale, buccale und sublinguale Verabreichung an Individuen (wie etwa Patienten) kann das tägliche Dosierungsniveau der Mittel der vorliegenden Erfindung typischerweise von 10 bis 500 mg reichen (in einzelnen oder aufgeteilten Dosen). Somit und beispielhaft können die Tabletten oder Kapseln 5 bis 100 mg an Wirkstoff für die Verabreichung, einfach oder mit zweien oder mehr zu einem Zeitpunkt, wie es angemessen ist, enthalten. Wie oben angezeigt, wird der Arzt die tatsächliche Dosis bestimmen, die für einen individuellen Patienten am geeignetsten sein wird, und diese wird mit dem Alter, dem Gewicht und der Reaktion des bestimmten Patienten variieren. Es ist anzumerken, dass, obwohl die oben genannten Dosierungen beispielhaft für den Durchschnittsfall sind, es natürlich auch individuelle Umstände geben kann, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche günstig sind, und solche Dosisbereiche liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.
Bei einigen Anwendung allgemein bzw. beim Menschen, ist es so, dass die orale Verabreichung der Mittel der vorliegenden Erfindung die bevorzugte Route ist, die am praktischsten ist und in einigen Fällen Nachteile vermeiden kann, die mit anderen Verabreichungsrouten verbunden sind, wie etwa solchen, die mit intrakavernöser (i.c.) Verabreichung verbunden sind. Unter Bedingungen, bei denen der Empfänger unter einer Schluckstörung oder einer Beeinträchtigung der Arzneimittelabsorption nach der oralen Verabreichung leidet, kann das Arzneimittel parenteral verabreicht werden, z.B sublingual oder buccal.
Bei der veterinärmedizinischen Anwendung wird das Mittel typischerweise als geeignete akzeptable Formulierung in Übereinstimmung mit der normalen Veterinärpraxis verabreicht, und der Veterinärchirurg wird das Dosierungsschema und die Verabreichungsroute bestimmen, die für ein bestimmtes Tier am geeignetsten sind. Jedoch, ebenso wie bei der humanen Behandlung, kann es möglich sein, das Mittel für die veterinärmedizinischen Behandlungen alleine zu verabreichen.
Typischerweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen – die für die Anwendung beim Menschen oder beim Tier sein können – irgendeines oder mehrere von einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger, Hilfsstoff oder Adjuvans umfassen. Die Auswahl des pharmazeutischen Trägers, Hilfsstoffs oder Verdünnungsmittels kann im Hinblick auf die beabsichtigte Verabreichungsroute und die pharmazeutische Standardpraxis erfolgen. Wie oben angezeigt, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen als – oder zusätzlich zu – dem Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel jedweden oder sämtliche geeigneten Bindemittel, Gleitmittel, Suspendiermittel, Beschichtungsmittel und Lösungsvermittler umfassen.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden eines oder mehrere der folgenden umfassen: ein Mittel, das durch einen Assay der vorliegenden Erfindung durchmustert wurde; ein Mittel, das befähigt ist, mit irgendeiner der Sequenzen zu interagieren, die in den angehängten Sequenzlisten gezeigt sind, einschließlich Derivaten, Fragmenten, Homologen oder Varianten hiervon, oder mit Sequenzen, die mit irgendeiner der in den angehängten Sequenzlisten dargestellten Sequenzen hybridisieren können.
Es werden Oligonukleotidsequenzen, Antisense-RNA- und DNA-Moleküle und Ribozyme beschrieben, die die Funktion haben, SPPase-mRNA zu destabilisieren oder die Translation von SPPase-Protein zu inhibieren. Solche Nukleotidsequenzen können bei Bedingungen verwendet werden, bei denen es bevorzugt ist, die SPPase-Nukleotidspiegel zu erhöhen, wie etwa bei der HCV-Infektion.
Ein SPPase-Antisense-Molekül kann die Basis für die Behandlung verschiedener anomaler Bedingungen bereitstellen, die z.B mit einer gesteigerten SPPase-Aktivität in Zusammenhang stehen.
Ein SPPase-Nukleinsäure-Antisense-Molekül kann verwendet werden, um die Aktivität des SPPase-Enzyms bei Bedingungen zu blockieren, bei denen es bevorzugt wäre, die SPPase-Nukleotidspiegel zu erhöhen.
Expressionsvektoren, die von Retroviren, Adenoviren, Herpes- oder Vacciniaviren oder von verschiedenen bakteriellen Plasmiden abgeleitet sind, können verwendet werden, um rekombinante SPPase-Sense- oder Antisense-Moleküle an die als Ziel vorgesehene Zellpopulation auszuliefern. Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren, die SPPase enthalten. Alternativ kann rekombinante SPPase in Liposomen an Zielzellen ausgeliefert werden.
Die cDNA-Sequenz voller Länge und/oder deren regulatorische Elemente erlauben es Forschern, SPPase als Werkzeug bei Sense-Untersuchungen (Youssoufian H und HF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13: 98-104) oder Antisense-Untersuchungen (Eguchi et al., 1991, Annu Rev Biochem 60, 631-652) der Genfunktion zu verwenden. Oligonukleotide, erstellt ausgehend von der cDNA oder Kontrollsequenzen, die aus der genomischen DNA erhalten wurden, können in vitro oder in vivo verwendet werden, um die Expression zu inhibieren. Eine solche Technologie ist nun wohlbekannt in der Technik, und Sense- oder Antisense-Oligonukleotide oder größere Fragmente können ausgehend von verschiedenen Positionen entlang der codierenden Regionen oder der Kontrollregionen erstellt werden. Geeignete Oligonukleotide, die 20 Nukleotide lang sein können, können verwendet werden, um SPPase-Sequenzen oder nahe verwandte Moleküle aus humanen Bibliotheken zu isolieren.
Zusätzlich kann die SPPase-Expression moduliert werden, indem man eine Zelle oder ein Gewebe mit Expressionsvektoren transfiziert, die hohe Niveaus eines SPPase-Fragments bei Bedingungen exprimieren, bei denen es bevorzugt wäre, die Signalpeptidpeptidase-Aktivität zu blockieren und dadurch die Niveaus an HCV-Core in der ER-Membran zu erhöhen (siehe Ergebnisse). Solche Konstrukte können die Zellen mit untranslatierbaren Sense- oder Antisense-Sequenzen überschwemmen. Selbst in Abwesenheit einer Integration in die DNA, können solche Vektoren damit fortfahren, RNA-Moleküle zu transkribieren, bis alle Kopien des Vektors von endogenen Nukleasen außer Gefecht gesetzt wurden. Eine solche transiente Expression kann bei einem nicht-replizierenden Vektor wenigstens einen Monat oder länger dauern, und sogar länger, wenn geeignete Replikations- oder Integrationselemente Teil des Vektorsystems sind, wie etwa die Verwendung von Lentiviren, die die Fähigkeit besitzen, in das Wirtszellgenom integriert zu werden.
Modifikationen der Genexpression können erhalten werden, indem man Antisense-Sequenzen für die Kontrollregionen des SPPase-Gens erstellt, so etwa für Promotoren, Enhancer und Introns.
Oligonukleotide, die von der Transkriptionsstartstelle abgeleitet sind, z.B Regionen zwischen –10 und +10 der Leader-Sequenz, sind bevorzugt. Antisense-RNA- und DNA-Moleküle können auch erstellt werden, um die Translation von mRNA zu blockieren, indem sie das Transkript davon abhalten, an Ribosomen zu binden. Entsprechend kann eine Inhibition unter Verwendung der Hoogeboom-Basenpaarungs-Methodik, auch bekannt als „Tripel-Helix"-Basenpaarung, erreicht werden. Die Tripel-Helix-Paarung umfasst die Fähigkeit der Doppelhelix, sich hinreichend für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulatorischen Molekülen zu öffnen.
Somit wird eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, die ein Mittel (oder auch ein pharmazeutisch verträgliches Salz hiervon oder ein pharmazeutisch verträgliches Solvat hier von), zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Hilfsstoff oder Träger umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann für den veterinärmedizinischen (d.h. beim Tier stattfindenden) Gebrauch oder für den Gebrauch beim Menschen sein.
Es werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die wirksame Mengen an Inhibitoren oder Antagonisten des SPPase-Proteins (einschließlich Antisense-Nukleinsäuresequenzen) im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel, Träger, Hilfsstoff oder Adjuvans (einschließlich Kombinationen hiervon) umfassen.
Es werden pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die die Gesamtheit oder Teile von SPPase-Polynukleotidsequenzen, SPPase-Antisense-Moleküle, SPPase-Polypeptide, Protein-, Peptid- oder organische Modulatoren der SPPase-Bioaktivität, wie etwa Inhibitoren, Antagonisten (einschließlich Antikörpern) oder Agonisten, umfassen können, und zwar alleine oder in Kombination mit wenigstens einem anderen Mittel, wie etwa einem Stabilisator, und die in jedem beliebigen sterilen biokompatiblen pharmazeutischen Träger, einschließlich, ohne hierauf beschränkt zu sein, Saline, gepufferte Saline, Dextrose und Wasser, verabreicht werden können.
Allgemeine Assays
1. Assays für Mittel, die die Interaktion zwischen einer HCV-Core-Sianalpeptidpeptidase-Zielsequenz und einer SPPase aufbrechen
i. Kandidatenmittel
Ein Mittel, das die Interaktion zwischen der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und der SPPase aufbricht, kann dies auf verschiedene Weisen tun. Es kann direkt die Bindung der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz an die SPPase aufbrechen, z.B indem es an die HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz bindet und die Stelle der Interaktion mit SPPase maskiert oder verändert. Alternativ kann das Kandidatenmittel um die Bindungsstellen an der Oberfläche von SPPase wetteifern und die HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz verdrängen. Kandidatenmittel dieser Typen können praktischerweise durch in vitro-Bindungstests, z.B wie unten beschrieben, durchmustert werden. Die Kandidatenmittel können auch unter Verwendung eines „in vivo"-Ganzzell-Assays, wie unten beschrieben, durchmustert werden. Der Begriff „in vivo" soll Versuche mit Gewebekulturzellen unter Laborbedingungen ebenso wie Versuche mit intakten mehrzelligen Organismen umfassen.
Ein Mittel, das direkt an die HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz binden kann, kann die Interaktion zwischen der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und der SPPase auch inhibieren, indem es die subzelluläre Positionierung der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz verändert und somit die zwei Komponenten davon abhält, innerhalb der Zelle miteinander in Kontakt zu kommen. Dies kann auch in vivo getestet werden, z.B unter Verwendung der unten beschriebenen in vivo-Assays.
Alternativ, anstatt die Assoziation der Komponenten direkt zu verhindern, kann das Mittel die biologisch verfügbare Menge der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz drücken oder erhöhen. Dies kann erfolgen durch Inhibieren der Expression der HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz, z.B auf der Ebene der Transkription, Transkriptstabilität, Translation, posttranslationalen Prozessierung oder posttranslationalen Stabilität. Ein Beispiel für ein solches Mittel wäre eine Antisense-RNA, die die Menge an HCV-Core-Protein-mRNA, die zu Protein translatiert wird, unterdrückt.
Geeignete Kandidatenmittel beinhalten virale Peptide, die in einigen Fällen insbesondere eine Größe von etwa 5 bis 20 Aminosäuren haben können, auf Basis beispielsweise von HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielmotiven, die sich in dem HCV-Core-Protein finden, oder Varianten solcher Peptide, bei denen ein oder mehrere Reste substituiert wurden (siehe Sequenzlisten). Peptidfragmente von SPPase können ebenfalls verwendet werden, einschließlich modifizierter Varianten hiervon. Peptide aus Paletten von Peptiden, die Zufallssequenzen oder Sequenzen umfassen, die in konsistenter Weise variiert wurden, um eine maximal diverse Peptidpalette bereitzustellen, können verwendet werden.
Geeignete Kandidatenmittel beinhalten außerdem Antikörperprodukte (z.B monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimäre Antikörper und CDR-transplantierte Antikörper), die spezifisch für die HCV-Core-SPPase-Zielsequenz oder für Oberflächenbestandteile von SPPase sind. Weiterhin können kombinatorische Bibliotheken, Peptid- und Peptid-Mimetika, definierte chemische Einheiten, wie etwa organische und anorganische Verbindungen, Oligonukleotide und Naturproduktbibliotheken auf ihre Aktivität als Inhibitoren der Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und einer SPPase in Assays wie den unten beschriebenen durchmustert werden. Die Kandidatenmittel können in einer anfänglichen Durchmusterung in Chargen von z.B 10 Mitteln pro Reaktion verwendet werden, und die Mittel derjenigen Chargen, die eine Inhibition zeigen, können individuell getestet werden. Kandidatenmittel, die Aktivität bei in vitro-Durchmusterungen zeigen, wie etwa die unten beschriebenen, können dann in in vivo-Systemen getestet werden, wie etwa in Säugerzellen, die dem Inhibitor ausgesetzt und dann beispielsweise auf die Empfänglichkeit für virale Infektion hin getestet werden.
ii. Assays
Die Assays der Erfindung können in vitro-Assays oder in vivo-Assays sein, z.B unter Verwendung von Zelllinien oder einem Tiermodell, wie etwa Mäusen oder Schimpansen.
In vitro-Assay-Systeme
Ein Typ von in vitro-Assay zur Identifizierung von Mitteln, die eine Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und SPPase aufbrechen, beinhaltet das in Anwesenheit oder Abwesenheit eines Kandidatenmittels stattfindende Messen der Assoziation einer Zielsequenz mit SPPase, die in vitro erzeugt wird. Wie oben beschrieben, besteht ein definierendes Merkmal des Core-Proteins in Säugerzellen nach der Prozessierung aus dem HCV-Polyprotein in seiner Assoziation mit zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (Hope und McLauchlan, 2000, J Gen Virol. 81, 1913-25), und somit können identifizierende Mittel bestimmt werden, die eine Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und SPPase aufbrechen, indem das Ausmaß der Assoziation von HCV-Core mit in vitro ausgebildeten Lipidkügelchen getestet wird. Die Bindung von HCV-Core-SPPase-Zielsequenzen an SPPase kann bestimmt werden, indem man eine Zielsequenz zu einer Dispersion von Lipidkügelchen (wie etwa einem Gemisch von Phospholipid und Triacylglycerol) in einem wässrigen Lösungsmittel hinzu gibt, das Gemisch mit Ultraschall behandelt und durch Fraktionierung das Ausmaß der Auftrennung zwischen wässriger Phase und Lipidphase bestimmt. Typischerweise wird die Fraktionierung des Gemischs eine Erhöhung der Dichte der Lösung mit Sorbit oder Natriumbromid und Ultrazentrifugieren der Lösung beinhalten. Die Lipidkomplexe wandern zur Oberseite des Zentrifugenröhrchens, und diese obere Lipidschicht wird dann auf HCV-Core hin untersucht. Dies wird in Gegenwart oder in Abwesenheit des Kandidatenmittels, dessen inhibitorische Aktivität man testen möchte, durchgeführt. Typischerweise wird ein Kandidatenmittel als inhibierend für die HCV-Core-SPPase-Zielsequenz festgelegt, wenn es eine Reduzierung von wenigstens 50%, bevorzugt von wenigstens 60, 70, 80 oder 90% im Bezug auf diejenige Menge an HCV-Core-SPPase-Zielsequenz verursacht, die in Abwesenheit des Kandidatenmittels mit der Lipidphase assoziiert ist.
Das Kandidatenmittel kann mit der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz oder mit SPPase präinkubiert werden oder nach der Präinkubation der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz mit SPPase zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben werden.
Ein weiterer Typ des in vitro-Assays für die Identifizierung von Mitteln, die eine Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und der SPPase oder einer lipophilen Oberfläche aufbrechen, beinhaltet folgendes:
Proteine, die die SPPase-Zielsequenz beinhalten, z.B ein Fragment von HCV-Core-Protein, und optional SPPase, können in vitro ausgehend von RNA-Transkripten translatiert werden, die für diese Polypeptide codieren. Die Reaktionen werden mit Membranen supplementiert, die aus Gewe bekulturzellen und Geweben stammen (z.B vom ER erhaltene „raue" mikrosomale Membranen), oder mit einer lipophilen Oberfläche, die künstlich erzeugt wurde (z.B einem Liposom), an das die in vitro translatierten Proteine binden können. Die Bindung kann durch die Reinigung der Lipidkomponenten der Reaktionen (z.B durch Zentrifugation) bestimmt werden. Alternativ kann ein Chip-Format (z.B BIAcore^TM – BIAcore AB), bei dem der Chip eine Lipidoberfläche besitzt, verwendet werden, um die Bindung zu messen.
Alternativ können Proteine verwendet werden, die die SPPase-Zielsequenz einbeziehen, wie z.B Core-E1/100 oder SP-E1/100, dies unter Verwendung intakter Mikrosomen und einer Kombination mit einer Carbonatextraktion von Membranen, um zu bestimmen, ob SPPase das Core-Signalpeptid prozessiert hat. Die Carbonat-abhängige Freisetzung von Core in den Überstand erfordert, dass Core durch SPPase gespalten wird, was z.B durch Western Blot-Analyse detektiert werden kann (für Details, siehe Ergebnisse, Abschnitt 4).
Ein Hochdurchsatz-in vitro-Assay für die Identifizierung von Mitteln, die die Interaktion zwischen der HCV-Core-Zielsequenz und dem SPPase-Enzym aufbrechen, beinhaltet folgendes:
Durch Detergens solubilisiertes oder rekombinantes SPPase-Enzym wird mit kurzen, synthetisch erzeugten Proteinen, die HCV-Core-SPPase-Zielsequenzen mit Tags an den N- und C-Termini des Proteins tragen, inkubiert. Bevorzugt sind diese zwei Tags Tags in Form einer fluoreszenten Gruppierung, die Partner für einen Assay auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) darstellen. Der Assay wird in Anwesenheit und Abwesenheit von Kandidatenmittel durchgeführt. Somit würde FRET detektiert, wenn die SPPase das Polypeptidsubstrat nicht spaltet. (das Kandidatenmittel blockiert die Interaktion zwischen SPPase und dem Substrat), jedoch würde der Energietransfer bei Spaltung verloren gehen (das Kandidatenmittel ist unfähig, die SPPase-Spaltung des Substrats zu blockieren) (für Details, wie die Detergens-lösliche SPPase zu erhalten ist, siehe Abschnitte 10 und 11b in Materialien und Methoden und Abschnitt 5 in Ergebnisse).
Die Fähigkeit von Kandidatenmitteln, die Assoziation von HCV-Core-Signalpeptid und SPPase aufzubrechen, was die Assoziation von HCV-Core mit Lipidkügelchen beeinflusst, kann untersucht werden, indem man während der in vitro-Synthese der Proteine Kandidatenmittel zu den Reaktionen hinzugibt. Bevorzugt ist ein geeigneter Inhibitor der SPPase-Zielsequenz befähigt, die Bindung von HCV-Core-SPPase-Zielsequenzen an Lipidkügelchen zu inhibieren, indem er in spezifischer Weise die Interaktion zwischen SPPase und der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz beeinflusst.
Es ist bekannt, dass das Deletieren der HCV-Core-Reste 125 bis 144 (hydrophobe Region) die HCV-Core-Assoziation mit Lipidtröpfchen aufhebt und zu dessen Abbau durch das Proteasom im Zytosol bei der Freisetzung von Core-E1-E2 führt (Hope und McLauchlan, 2000, J Gen Virol. 2000 Aug; 81 Pt 8: 1913-25). Somit kann ein Blockieren der Spaltung von HCV-Core-E1-E2 durch SPPa se den Abbau reduzieren, da das unreife Core-Protein an der ER-Membran zurückgehalten würde (für eine detaillierte Beschreibung: siehe Beispiel 4). Daher besteht ein anderer in vitro-Typ-Assay zum Testen auf Inhibitoren der spezifischen Spaltung von HCV-Core-E1-E2 durch SPPase darin, die Akkumulation von HCV-Core-Protein zu messen, das in der ER-Membran festgehalten wird. Somit wird die Akkumulation von HCV-Core mit ER-Membranen in Abwesenheit des Kandidatenmittels und in Anwesenheit des Kandidatenmittels bestimmt, und die Ergebnisse werden verglichen. Geeignete Prozeduren sind in den Beispielen beschrieben.
SPPase – wie etwa rekombinante SPPase – kann auch unter Verwendung der Verfahren untersucht werden, die in Science (2002) 296, 2215-2218 beschrieben sind.
in vivo-Assay-Systeme
In vivo-Assays zur Identifizierung von Verbindungen, die eine Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und SPPase und somit den Transport von HCV-Core zu Lipidkügelchen unterbrechen, beinhalten typischerweise die Verabreichung eines Kandidatenmittels an eine Zelle, die die SPPase-Zielsequenz exprimiert, wobei diese bevorzugt aus HCV-Core-Protein oder einem Derivat hiervon stammt, und das Testen, ob die Modulation der Interaktion zwischen der SPPase-Zielsequenz und SPPase die Assoziation mit intrazellulären Lipidkügelchen verändern kann, z.B ob es diese reduzieren oder aufheben kann. Somit wird die Assoziation von HCV-Core mit intrazellulären Lipidkügelchen in Abwesenheit des Kandidatenmittels und in Anwesenheit des Kandidatenmittels bestimmt, und die Ergebnisse werden verglichen.
Die Assoziation der SPPase-Zielsequenz mit SPPase wird typischerweise durch Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Antikörpers bestimmt, der eine Sequenz erkennt, die sich vor der SPPase-Zielsequenz befindet, und unter Verwendung eines Antikörpers oder einer Färbung, die intrazelluläre SPPase oder eine Oberflächenkomponente der Lipidkügelchen erkennt. Da wir zeigen, dass die proteolytische Spaltung von HCV-Core-Protein durch SPPase entscheidend für den Transport von Core zu den Lipidkügelchen ist, kann auch die Co-Lokalisierung von gespaltenem Core mit Lipidkügelchen in Gegenwart oder Abwesenheit des Kandidatenmittels bestimmt werden.
Ein Kandidatenmittel wird generell als befähigt angesehen, die Interaktion zwischen der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und der intrazellulären SPPase zu unterbrechen, wenn, wie durch Immunfluoreszenzmikroskopie bestimmt, weniger als 50% des HCV-Core-Proteins mit intrazellulären Lipidkügelchen co-lokalisieren, bevorzugt weniger als 60%, bevorzugter weniger als 70, 80 oder 90%. Bevorzugt ist ein geeigneter Inhibitor der HCV-Core-SPPase-Zielsequenz befähigt, die Interaktion von Core-Zielsequenzen mit intrazellulärer SPPase aufzubrechen, ohne die Interaktion von Core mit intrazellulären Lipidkügelchen/Oberflächenkomponenten zu beeinflussen.
Es wird für den Fachmann ersichtlich sein, dass andere Techniken verfügbar sind, um die Lokalisation von Proteinen und Lipiden in intakten Zellen zu bestimmen, und dass diese Techniken auch auf die Assays der vorliegenden Erfindung anwendbar sind (z.B siehe auch Beschreibungen).
Das Kandidatenmittel, d.h. die Testverbindung, kann den Zellen auf eine oder mehrere Weisen verabreicht werden. Beispielsweise kann es dem Zellkulturmedium direkt zugesetzt werden, oder es kann unter Verwendung von Mikromanipulationstechniken in die Zelle injiziert werden. Alternativ, im Fall von Polypeptidkandidatenmitteln, kann die Zelle mit einem Nukleinsäurekonstrukt transfiziert werden, das die Expression des Polypeptids in der Zelle steuert. Bevorzugt steht die Expression des Polypeptids unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors, z.B derart, dass die Expression kurz vor der beabsichtigten Verabreichung des Kandidatenmittels induziert wird.
Ein anderer geeigneter Test kann das Einführen eines Polynukleotids beinhalten, das für eine Zielsequenz der Erfindung codiert, optional in Verbindung mit einem Protein von Interesse, in eine Milch-produzierende Zelle in Kultur und das Bestimmen, ob die Zielsequenz/das Protein der vorliegenden Erfindung in das Kulturmedium sekretiert wurde. Dies würde in Anwesenheit oder Abwesenheit des Kandidatenmittels durchgeführt.
2. Tests für Mittel, die befähigt sind, die SPPase-Expression in Zellen zu modulieren
i. Kandidatenmittel
Mittel, die die Expression von SPPase modulieren, bevorzugt die SPPase-Expression heraufregulieren, sodass die Spiegel von SPPase-Protein in einer Zelle gesteigert werden, können dies durch einen oder mehrere von verschiedenen Mechanismen bewirken. Beispielsweise kann ein Kandidatenmittel die Transkriptionsniveaus von endogenen SPPase-Genen erhöhen, die SPPase-mRNA-Spiegel stabilisieren und/oder SPPase-Protein stabilisieren. Die Transkription kann ausgehend von endogenen SPPase-Genen gesteigert werden, z.B durch die Verwendung eines Transkriptionsaktivators, der die Transkription von endogenen SPPase-Genen aktiviert, oder durch ein Mittel, das die Wirkung eines Transkriptionsinhibitors von endogenen SPPase-Genen modifiziert. Somit beinhalten Tests auf Modulation der SPPase-Expression die Bestimmung der Wirkung eines Kandidatenmittels auf die SPPase-mRNA-Spiegel und/oder die SPPase-Proteinspiegel.
Der Begriff „modulieren" im Zusammenhang mit der SPPase-Expression bedeutet einen Wechsel oder eine Veränderung bei den Niveaus von SPPase-mRNA und/oder SPPase-Protein.
Geeignete Kandidatenzusammensetzungen beinhalten Mittel, für die bekannt ist, dass sie die zelluläre Transkription und/oder den Lipidstoffwechsel modulieren. Beispiele von Mitteln, die die SPPase-Expression beeinflussen können, beinhalten nicht-steroidale antientzündliche Arzneimittel, wie etwa Ibuprofen und Indomethacin; und Arzneimittel, für die bekannt ist, dass sie den Lipidstoffwechsel beeinflussen, wie etwa Fibrate und Thiazolidindione. Weiterhin können kombinatorische Bibliotheken, Peptide und Peptidomimetika, insbesondere Peptide aus Paletten von Peptiden, die Zufallssequenzen oder Sequenzen, die konsistent variiert wurden, umfassen, um eine maximal diverse Palette von Peptiden bereitzustellen, definierte chemische Einheiten, wie etwa organische und anorganische Verbindungen, Oligonukleotide und Naturproduktbibliotheken auf eine Aktivität als Modulatoren der SPPase-Expression in Tests wie den unten beschriebenen durchmustert werden. Die Kandidatenmittel können in einem anfänglichen Screen von Chargen mit z.B 10 Mitteln pro Reaktion verwendet werden, und die Mittel, deren Chargen eine Inhibition zeigen, können einzeln getestet werden. Zusätzlich können Kandidatenmittel, die bei in vitro-Screens Aktivität zeigen, wie etwa die unten beschriebenen, dann in in vivo-Systemen getestet werden, wie etwa in Säugerzellen, die dem Inhibitor ausgesetzt werden und z.B auf eine Empfindlichkeit gegenüber viraler Infektion getestet werden.
ii. Assays
Die Assays der Erfindung können in vitro- oder in vivo-Assays sein, z.B unter Verwendung von Zelllinien oder einem Tiermodell.
In vitro-Assay-Systeme
Ein in vitro-Assay-System der Erfindung misst typischerweise die Wirkung auf die Transkription, ausgehend von einem Polynukleotidkonstrukt, das einen SPPase-Promotor in Verbindung mit einem Polynukleotid umfasst, dessen transkribiertes und optional translatiertes Produkt detektiert werden kann, z.B die natürlich vorkommende, für SPPase codierende Sequenz oder ein Reportergen, wie etwa Luciferase oder CAT. Techniken zur Detektion und Quantifizierung von Transkriptionsprodukten sind in der Technik wohlbekannt und beinhalten z.B die Hybridisierung an markierte Sonden, und die direkte Quantifizierung transkribierter Produkte durch die Verwendung markierter Nukleotide, die bei der Transkription eingebaut werden, außerdem quantitative PCR-Analyse und andere. Die translatierten Produkte können ebenfalls unter Verwendung wohlbekannter Techniken, wie etwa SDS-PAGE und Western Blot, detektiert und quantifiziert werden, oder im Fall biologisch aktiver Produkte durch geeignete Assays zum Detektieren dieser Aktivität wie etwa CAT-Assays oder Chemilumineszenz-Assays).
Ein geeigneter in vitro-Assay kann z.B unter Verwendung von Vollextrakten von Säugerzellen durchgeführt werden, die typischerweise mit Puffern und Nukleotidgemischen supplementiert sind. Reporterkonstrukte, die Polynukleotide umfassen, die SPPase-Promotor-Konstrukte enthalten, die mit einem Reportergen verbunden sind, können zu dem Gemisch hinzugegeben werden, oder es kann endogene genomische DNA verwendet werden.
Die Wirkung eines Kandidatenmittels auf die SPPase-Expression kann bestimmt werden, indem man die Transkriptionsniveaus von dem SPPase-Promotorkonstrukt (endogen oder anderweitig) in Gegenwart oder Abwesenheit des Kandidatenmittels misst und die Ergebnisse vergleicht. Bevorzugt sollte außerdem ein Kontroll-Promotor-Konstrukt getestet werden, um sicherzustellen, dass jedweder Effekt auf die SPPase-Expression für den SPPase-Promotor spezifisch ist und nicht einfach das Ergebnis einer allgemeinen Transkriptionshemmung ist. Ein Kandidatenmittel wird typischerweise so eingeschätzt, dass es die SPPase-Expression moduliert, wenn die Transkriptionsniveaus um wenigstens 30%, bevorzugt um wenigstens 50, 60, 70 80 oder 90% verändert werden. Jede Wirkung auf den Kontroll-Promotor wird bevorzugt Berücksichtigung finden, wenn Veränderungen der SPPase-Transkription berechnet werden.
in vivo-Assay-Systeme
Die Modulation der SPPase-Expression kann in praktischer Weise auch in vivo gemessen werden, typischer Weise unter Verwendung von Säugerzelllinien. Ebenso wie bei in vitro-Systemen können sowohl Reporterkonstrukte als auch endogene SPPase-Gene verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform verwendet der Assay Säugerzellen, die stabil mit einem Polynukleotid transformiert wurden, das ein Reporterkonstrukt umfasst, das einen SPPase-Promotor in funktionsfähiger Verbindung mit einem Reportergen beinhaltet, z.B Chloramphenicol-Transferase (CAT) oder Luciferase. Die Zelle umfasst bevorzugt auch eine stabil transfizierte Kontroll-Promotorsequenz in funktionsfähiger Verbindung zu einem zweiten Reportergen, das von dem ersten Reportergen unterscheidbar ist. Typischerweise werden die Transkriptionsniveaus von dem SPPase-Konstrukt und dem Kontrollkonstrukt in Abwesenheit eines Kandidatenmittels und dann in Anwesenheit eines Kandidatenmittels gemessen. Die Wirkung des Kandidatenmittels auf die Transkription von dem SPPase-Reporterkonstrukt (oder von dem endogenen SPPase-Gen) kann dann bestimmt werden, wobei jede allgemeine Wirkung auf die Transkription, wie angezeigt durch das für das Kontroll-Reporterkonstrukt erhaltene Ergebnis, berücksichtigt wird.
Bei einer anderen Ausführungsform wird die SPPase-Expression gemessen, indem man die Menge an SPPase-Protein in den Zellen bestimmt, bevor man das Kandidatenmittel verabreicht, und dann nach Verabreichung des Kandidatenmittels. Wie oben beschrieben, werden die Proteinspiegel typischerweise gemessen, indem man Zellextrakte mittels SDS-PAGE analysiert und das SPPase-Protein unter Verwendung von Western Blot-Analyse detektiert. Alternativ können die Zellen, die in dem Assay der Erfindung verwendet werden, ein Reporterkonstrukt umfassen, das einen SPPase-Promotor in funktionsfähiger Verbindung mit einer Nukleotidsequenz enthält, die für ein detektierbares Polypeptidprodukt, wie etwa CAT, codiert. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform codiert das detektierbare Produkt für ein Enzym, das ein zelluläres oder exogen hinzu gegebenes Mittel spalten kann, was eine detektierbare Veränderung im Absorptionsspektrum oder Emissionsspektrum der Zelle oder des Zellmediums bei einer bestimmten Wellenlänge verursacht. Dies wird die im Großmaßstab erfolgende Durchmusterung von Kandidatenmitteln, z.B in einem Mikrotiterplatten-Assay-Format, erleichtern.
Die Verabreichung von Kandidatenmitteln an Säugerzelllinien und die Erzeugung von Wirtssäugerzelllinien, die Reporterkonstrukte umfassen, können durchgeführt werden, wie oben beschrieben.
3. Testen von Kandidatenmitteln auf antivirale Aktivität
Kandidatenmittel, die durch das Verfahren der Erfindung dahingehend identifiziert werden, dass sie eine Interaktion zwischen einer HCV-Core-SPPase-Zielsequenz und SPPase und somit den Transport von HCV-Core zu Lipidkügelchen unterbrechen oder die SPPase-Expression modulieren, können auf ihre Fähigkeit hin getestet werden, z.B die Empfänglichkeit von Zellen gegenüber viraler Infektion zu reduzieren. Solche Verbindungen können therapeutisch verwendet werden, um eine virale Infektion zu beeinflussen, z.B um eine virale Infektion zu verhindern oder zu behandeln.
Typischerweise beinhaltet ein Assay zur Bestimmung der Wirkung eines durch ein Verfahren der Erfindung identifizierbaren Kandidatenmittels auf die Anfälligkeit von Zellen gegenüber viraler Infektion folgendes:

(a) Verabreichen eines Virus, z.B HCV, an eine Zelle in Abwesenheit von Kandidatenmittel;
(b) Verabreichen des Virus an die Zelle in Gegenwart des Kandidatenmittels; und
(c) Detektieren, ob das Kandidatenmittel die Anfälligkeit der Zelle gegenüber viraler Infektion reduziert oder aufhebt.

Das Kandidatenmittel kann vor oder gleichzeitig mit dem Virus verabreicht werden, um festzustellen, ob die Infektion verhindert wird. Alternativ kann das Kandidatenmittel nach der viralen Infektion verabreicht werden, um festzustellen, ob die virale Infektion unter Verwendung des Kandidatenmittels behandelt werden kann. Die Verabreichung von Kandidatenmitteln an Zellen kann durchgeführt werden wie oben beschrieben.
Der Assay wird typischerweise unter Verwendung von Säugerzelllinien durchgeführt, jedoch kann stattdessen ein Tiermodell verwendet werden, wie etwa Schimpansen im Fall von HCV. Das Virus wird mit den Zellen in Kontakt gebracht, typischerweise mit Zellen in Kultur. Die Zellen können eine Säugerzelllinie sein, insbesondere Säugerzellen, die gegenüber der Infektion durch das Virus in Abwesenheit des Kandidatenmittels anfällig sind, z.B im Fall von HCV Leberzellen.
Techniken zur Untersuchung der Infektiosität von Viren sind in der Technik wohlbekannt. Ebenso wie bei der Verwendung von Plaque-Assays können die Niveaus der viralen Infektion durch die Verwendung rekombinanter Viren bestimmt werden, die ein Reportergen, z.B lacZ, enthalten. Die Verwendung histochemisch detektierbarer Reportergene ist besonders bevorzugt, wenn Versuche mit Tieren durchgeführt werden. Im Fall von HCV können keine Plaque-Assays verwendet werden. Ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung des Niveaus der HCV-Produktion bei einem infizierten Tier ist die Durchführung quantitativer, semiquantitativer oder klassischer RT-PCR-Analyse zur Bestimmung der Menge an positiv-strängigem Nukleinsäurematerial in Zellen oder Serum. Zusätzlich wird die Gegenwart negativ-strängiger RNA in Zellen, wie bestimmt durch RT-PCR, herangezogen, um zu ermitteln, ob aktive virale Replikation vorliegt. Alternativ ist Northem Blotting eine weitere wohlbekannte Technik, die verwendet werden kann, um das Niveau der HCV-Produktion zu bestimmen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der oben beschriebenen Assays werden die HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und Derivate hiervon in einem experimentellen System verwendet, um normale zelluläre Interaktionen zu studieren. Beispielsweise können Derivate viraler Proteine, wie etwa von HCV-Core-Protein oder Derivate von SPPase, einschließlich Deletions-, Insertions- und Substitutions-Mutanten hiervon, verwendet werden, um eine Interaktion zwischen HCV-Core und SPPase und somit Lipidkügelchen aufzubrechen. Dies kann in vitro oder in vivo unter Verwendung der oben beschriebenen Assays getestet werden. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Derivats des Proteaseinhibitors (Z-LL)₂-Keton, bezeichnet als TBL₄K, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Beeinflussung einer viralen Infektion, bevorzugt einer HCV-Infektion, bereit.
HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenzen und Derivate hiervon können unter Verwendung der oben beschriebenen Techniken in die Zellen eingeführt werden, z.B mittels Transfektion von Nukleinsäurekonstrukten, die für HCV-Core-Zielsequenzen codieren, oder unter Verwendung viraler Vektoren. Der Effekt des Aufbrechens kann bestimmt werden wie oben beschrieben. Sämtliche erhaltenen in vitro-Daten können verwendet werden, um die rationale Erstellung von HCV-Core-Zielsequenzen zur Verwendung bei den in vivo-Studien zu unterstützen. Zusätzlich, da die Aminosäurereste von HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenzen, die an SPPase binden, genau kartiert wurden (siehe Sequenzliste), wird dies die rationale Erstellung von HCV-Core-Zielsequenz-Derivaten zur Verwendung bei den in vivo-Studien unterstützen. Für Details wird auf die folgenden Beispiele verwiesen.
Somit können HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenzen, die sich problemlos von zellulären Bestandteilen unterscheiden lassen, als Werkzeug verwendet werden, um intrazelluläre SPPase-Zielproteine zu untersuchen, und um unser Verständnis von deren Funktion in der Zelle zu vertiefen.
F. Therapeutische Verwendungen
Mittel, die befähigt sind, eine Interaktion zwischen einer HCV-Core-Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz und einem SPPase-Enzym aufzubrechen, können verwendet werden, um eine virale Infektion bei einem Menschen oder Tier zu beeinflussen, insbesondere, um eine virale Infektion zu verhindern oder zu behandeln. Solche Mittel können durch die Testverfahren der Erfindung oder anderweitig identifiziert worden sein.
Mittel, die befähigt sind, die SPPase-Expression zu modulieren, können ebenfalls verwendet werden, eine virale Infektion bei einem Menschen oder Tier zu beeinflussen, insbesondere, um eine virale Infektion zu behandeln oder zu verhindern. Solche Mittel können durch die Testverfahren der Erfindung oder anderweitig identifiziert worden sein. Die Verwendung eines Derivats des Proteaseinhibitors (Z-LL)₂-Keton, bezeichnet als TBL₄K, für die Herstellung eines Medikaments zur Verwendung für die Beeinflussung einer viralen Infektion, bevorzugt einer HCV-Infektion, wird beschrieben.
G. Zusammensetzungen/Verabreichung
Die Proteine der Erfindung und Mittel, die durch die Assay-Verfahren der Erfindung identifiziert wurden oder identifizierbar sind, können bevorzugt mit verschiedenen Komponenten kombiniert werden, um Zusammensetzungen herzustellen. Bevorzugt werden die Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen (die für die Anwendung beim Menschen oder Tier sein kann). Geeignete Träger und Verdünnungsmittel beinhalten isotonische Salinelösungen, z.B Phosphat-gepufferte Saline. Die Zusammensetzung kann durch direkte Injektion verabreicht werden. Die Zusammensetzung kann für die parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Verabreichung formuliert werden. Typischerweise kann jedes Protein bei einer Dosis von 0,01 bis 30 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt von 0,1 bis 10 mg/kg, bevorzugter von 0,1 bis 1 mg/kg Körpergewicht, verabreicht werden.
Polynukleotide/Vektoren, die Polypeptidkomponenten zur Verwendung bei der Beeinflussung viraler Infektionen codieren, können direkt als nacktes Nukleinsäurekonstrukt verabreicht werden, wobei ein solches bevorzugt außerdem flankierende Sequenzen beinhaltet, die zum Wirtszellgenom homolog sind. Wenn die Polynukleotide/Vektoren als nackte Nukleinsäure verabreicht werden, kann die Menge an verabreichter Nukleinsäure typischerweise im Bereich von 1 μg bis 10 mg liegen, bevorzugt von 100 μg bis 1 mg.
Die Aufnahme nackter Nukleinsäurekonstrukte durch Säugerzellen wird durch verschiedene bekannte Transfektionstechniken, wie z.B solche, die die Verwendung von Transfektionsmitteln einschließen, verstärkt. Beispiele dieser Mittel beinhalten kationische Mittel (z.B Calciumphosphat und DEAE-Dextran) und Lipofektionsmittel (z.B Lipofectam^TM und Transfectam^TM). Typischerweise werden die Nukleinsäurekonstrukte mit dem Transfektionsmittel gemischt, um eine Zusammensetzung zu erzeugen.
Bevorzugt wird das Polynukleotid oder der Vektor mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu erzeugen. Geeignete Träger und Verdünnungsmittel beinhalten isotonische Salinelösungen, z.B Phosphatgepufferte Saline. Die Zusammensetzung kann durch parenterale, intramuskuläre, intravenöse, subkutane, intraokulare oder transdermale Applikation verabreicht werden.
Die beschriebenen Verabreichungsrouten und Dosierungen sind nur als Richtlinie gedacht, da der begabte Praktiker in der Lage sein wird, problemlos die optimale Verabreichungsroute und Dosierung für jeden bestimmten Patienten und jeden Zustand zu bestimmen.
BEISPIELE
Die Erfindung wird im Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben, die als rein veranschaulichend und nicht als einschränkend gedacht sind. Die Beispiele beziehen sich auf die folgenden Figuren.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. Zielsteuerung und Translokation, vermittelt durch die Signalsequenz an der Verbindungsstelle von Core-E1.

A. in vitro-Translation von mRNA, die für SP-E1/100 codiert, in Gegenwart von vom ER abgeleiteten rauen Mikrosomen.
B. in vitro-Translation von mRNA, die für Core-E1/100 codiert, in Gegenwart von vom ER abgeleite ten rauen Mikrosomen.

2. Auswirkungen von Mutationen in der Transmembranregion auf die Signalpeptid-Prozessierung im Kontext von N-terminal deletiertem Core-Protein.

A. In vitro-Translation von mRNA, die für SP-E1/100 codiert, und den mutanten Derivaten MUTI, MUTII und MUTIII.
B. Quantifizierung der Signalpeptid-Prozessierung, die mit SP-E1/100-Konstrukten erhalten wird.

3. Auswirkungen von Mutationen in der Transmembranregion auf die Signalpeptidprozessierung im Kontext des gesamten Core-Proteins.

A. Autoradiographie und Western Blot-Analyse von in vitro-Translationen mit mRNA, die für Core-E1/100-Konstrukte codiert (Wt und Mutanten MUTI, MUTII und MUTIII).
B. Quantifizierung der Core-Prozessierung durch SPPase, erhalten in vitro mit Core-E1/100-Konstrukten.

4. Intrazelluläre Lokalisation von Core- und Hüllproteinen.

A. Konfokalbilder der intrazellulären Verteilung von Core- und E2-Proteinen.
B. Glykosylierung und relative Molekulargewichte von E1-Protein.

5. Konfokalbilder der intrazellulären Lokalisierung von Core-Proteinen und Lipidtröpfchen.
6. Auswirkung der SPPase-Prozessierung auf die Freisetzung von Core vom ER.
7. Auswirkung von Signalpeptidmutationen auf den Abbau einer Core-Variante.

A. Konfokalbilder der intrazellulären Verteilung von Core- und E2-Proteinen.
B und C. Häufigkeit von Core- und E2-Proteinen in Gegenwart und Abwesenheit von MG132.

8. Überblick über die Synthesestufen von TBL₄K.
9. Inhibition der Signalpeptidpeptidase-Prozessierung durch TBL₄K.
10. Photomarkierung von Proteinen mit TBL₄K.
11. Reinigungsschema von Protein, auf das mit TBL₄K abgezielt wurde.
12. Aminosäuresequenzen von Peptiden, bestimmt durch Massenspektrometrie.
13.

A. Vorhergesagte Polypeptidsequenz des humanen Proteins (Zugangsnummer gi 14772424) mit Sequenzidentität zu den Peptiden in 12.
B. Motive, die in humaner SPPase identifiziert wurden.
C. cDNA-Sequenz der vorhergesagten Polypeptidsequenz, die in A gezeigt ist.

14. Alignment von SPPase-Homologen aus niederen und höheren Eukaryoten.
Detaillierte Beschreibung der Figuren
1. Zielsteuerung und Translokation, vermittelt durch die Signalsequenz an der Verbindungsstelle von Core-E1.

A. In vitro-Translation von mRNA, die für SP-E1/100 codiert, in Gegenwart von vom ER abgeleiteten rauen Mikrosomen (Spuren 2-4), Akzeptor-Tripeptid zur Inhibition der N-Glykosylierung (Spuren 3 und 4) und SPPase-Inhibitor, (Z-LL)₂-Keton (Spur 4). Die Punkte zeigen glykosyliertes E1 mit 1-, 2- und 3-gekoppelten Oligosacchariden. Spur 5 zeigt ein Referenzprotein, das in vitro translatiertem Signalpeptid (SP) entspricht.
B. In vitro-Translation von mRNA, die für Core-E1/100 codiert, in Gegenwart von vom ER abgeleiteten rauen Mikrosomen (Spuren 2-5), Akzeptor-Tripeptid zur Inhibition der N-Glykosylierung (Spuren 3 und 5) und SPPase-Inhibitor, (Z-LL)₂-Keton (Spuren 4 und 5). E1/100g zeigt die Position von N-glykosyliertem E1/100 an.

A. In vitro-Translation von mRNA, die für SP-E1/100 codiert, und den mutanten Derivaten MUTI, MUTII und MUTIII. In den Spuren 2 und 3 enthielten die Proben sowohl das Glykosylierungs-Akzeptortripeptid als auch vom ER abgeleitete raue Mikrosomen. Der SPPase-Inhibitor (Z-LL)₂-Keton war in den in Spur 3 gezeigten Reaktionen zugegen. Spur 4 zeigt ein Referenzprotein, das in vitro translatiertem Signalpeptid (SP) entspricht.
B. Quantifizierung der Signalpeptid-Prozessierung, die mit SP-E1/100-Konstrukten erhalten wird. Die Mengen an Signalpeptid, die sich in der Membranfraktion finden, wurden in Proben mit und ohne SPPase-Inhibitor verglichen. Die Quantifizierung für das wildtypische SP-E1/100-Protein wird aus 1A abgeleitet.

A. Autoradiographie und Western Blot-Analyse von in vitro-Translationen mit mRNA, die für Core-E1/100-Konstrukte codiert (Wt und Mutanten MUTI, MUTTI und MUTIII; Spuren 4 und 5). In den Spuren 4 und 5 enthielten die Reaktionen Akzeptortripeptid und vom ER abgeleitete raue Mikrosomen. Der SPPase-Inhibitor, (ZLL)₂-Keton, war in den Reaktionen in Spur 5 enthalten. Die Proben in Spur 3 stammen aus Extrakten von BHK-Zellen, die mittels Elektroporation mit RNA aus dem entsprechenden pSF-Vektor für jedes der Core-Konstrukte versehen worden waren. Die Spuren 1, 2 und 6 zeigen in vitro-translatierte Referenzpeptide, die den N-terminalen 182, 179 und 191 Aminosäureresten von Core entsprechen.
B. Quantifizierung der Core-Prozessierung durch SPPase, erhalten in vitro mit Core-E1/100-Konstrukten. Die Menge an prozessiertem Core (179 Aminosäurereste) wurde in Beziehung zur Gesamtmenge an Core gesetzt (Core₁₉₁ + Core₁₇₉). Core₁₇₉ wurde in Proben, die SPPase-Inhibitor enthalten, nicht erzeugt.

4. Intrazelluläre Lokalisation von Core- und Hüllproteinen.
BHK C13-Zellen wurden 15 Stunden nach der Elektroporation mit RNA aus pSF/CE1E2- und pSF/MUT-Plasmiden geerntet und entweder mit Methanol für die indirekte Immunfluoreszenz fixiert (A) oder lysiert, um Zellextrakte für die Western Blot-Analyse zu erzeugen (B).

A. Konfokalbilder der intrazellulären Verteilung von Core- und E2-Proteinen. Die indirekte Immunfluoreszenz wurde mit R308- und ALP98-Antikörpern durchgeführt (spezifisch für Core bzw. E2).
B. Glykosylierung und relative Molekulargewichte von E1-Protein, das durch pSF/MUT-Konstrukte erzeugt wurde. Die Extrakte wurde entweder mit Endo H behandelt (Spuren 6-9) oder nicht behandelt (Spuren 1-5). Nach der Elektrophorese durch SDS-PAGE und Transfer der Proteine auf eine PVDF-Nitrocellulosemembran wurde die Western Blot-Analyse mit R528, einem E1-spezifischen Antiserum, durchgeführt. Die Proben waren wie folgt: Spur 1, pSF/1-195; Spuren 2 und 6, pSF/CE1E2; Spuren 3 und 7, pSF/MUTI; Spuren 4 und 8, pSF/MUTII; Spuren 5 und 9, pSF/MUTIII. Die Positionen von glykosyliertem und deglykosyliertem E1 (E1 bzw. E1^endoH) sind angezeigt.

5. Konfokalbilder der intrazellulären Lokalisierung von Core-Proteinen und Lipidtröpfchen.
BHK C13-Zellen wurden 15 Stunden nach der Elektroporation mit RNA aus pSF/CE1E2- und pSF/MUT-Plasmiden geerntet und mit 4% Paraformaldehyd, 0,1% Triton X-100 fixiert. Es wurde indirekte Immunfluoreszenz mit dem Antikörper JM122 und einem sekundären Anti-Maus-Antikörper, der mit FITC konjugiert war, durchgeführt. Die Lipidtröpfchen wurden mit Oil-Red-Öl (ORO) gefärbt.
6. Auswirkung der SPPase-Prozessierung auf die Freisetzung von Core vom ER.
BHK C13-Zellen wurden 15 Stunden nach der Elektroporation mit RNA aus den angegebenen pSF-Plasmiden geerntet. Die Zellen wurden homogenisiert und Membran- (P1) und Überstandfraktionen (SN1) wurden hergestellt. Die Membranen wurden mit Na₂CO₃ behandelt, und die extrahierten Proteine (SN2) wurden von dem nicht-extrahierten Material (P2) abgetrennt. Nach der Elektrophorese durch SDS-PAGE und die Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Nitrocellulosemembran erfolgte die Western Blot-Analyse mit R308, einem für Core spezifischen Antiserum. Die Proben auf den Gelen waren für jedes pSF-Konstrukt wie folgt: Spuren 1, Gesamtzellextrakt; Spuren 2, SN1; Spuren 3, P1; Spuren 4, P2; Spuren 5, SN2. Die Positionen von Core-Protein sind angezeigt.
7. Auswirkung der Signalpeptidmutationen auf den Abbau einer Core-Variante, erzeugt mit pSF/CE1E2.
BHK-Zellen wurden einer Elektroporation mit RNA unterzogen, und 5 Stunden nach der Inkubation bei 37°C wurden sie mit MG132 für 12 Stunden bei 37°C behandelt. Die Zellen wurden entweder mit Methanol für die indirekte Immunfluoreszenz fixiert (A), oder es wurden Extrakte für die Western Blot-Analyse (B und C) hergestellt.

A. Konfokalbilder der intrazellulären Verteilung von Core- und E2-Proteinen. Es wurde eine indirekte Immunfluoreszenz mit R308 und ALP98-Antikörpern (spezifisch für Core bzw. E2) durchgeführt.
B und C. Häufigkeit von Core- und E2-Proteinen in Gegenwart und Abwesenheit von MG132. Nach der Elektrophorese durch SDS-PAGE und Übertragung auf PVDF-Membranen wurden die Proben einer Sondenmarkierung mit JM122- und ALP98-Antikörpern unterzogen (B, bzw. C). Die Proben in B und C waren wie folgt: Spur 1, pSF/CE1E2; Spuren 2 und 7, pSF/1-124, 145-169; Spuren 3 und 4, pSF/ CE1E2; Spuren 5 und 6, pSF/ MUTIII; Spuren 8, pSF/ 125-144. Die Proben in den Spuren 4 und 6 wurden nur mit MG132 behandelt. Die Positionen für Core- und E2-Proteine sind angezeigt.

8. Überblick über die Synthesestufen von TBL₄K.
9. Inhibition der Signalpeptidpeptidase-Prozessierung durch TBL₄K.
Radioaktiv markiertes p-Prl^PP/29-Signalpeptid wurde durch in vitro-Translation in Weizenkeimextrakt, der [³⁵S]-Methionin enthält, erzeugt. Die Peptide wurden zu CHAPS-solubilisierten Membranen in Anwesenheit oder Abwesenheit von TBL₄K (mit den angezeigten Endkonzentrationen) hinzugegeben und für 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Die Proteine wurden mit 10% Trichloressigsäure präzipitiert und mittels SDS-PAGE analysiert, wobei hierfür Tris-Bicin-Harnstoff-Acrylamidgele verwendet wurden. Banden, die dem Signalpeptidsubstrat (ps) und dem Fragment des Signalpeptids, das nach der SPPase-Prozessierung verbleibt (SPF), entsprechen, sind angezeigt.
10. Photomarkierung von Proteinen mit TBL₄K.
CHAPS-solubilisierte ER-Membranproteine wurden mit 50 nM TBL₄K (gelöst in DMSO) gemischt, und die Proben wurden bei 30°C für 1 Stunde inkubiert. (Z-LL)₂-Keton, mit variierenden Konzentrationen, wurde ebenfalls zu den in der Figur angezeigten Reaktionen hinzugegeben. Dort, wo es angezeigt ist, wurden die Proben mit UV-Licht bestrahlt, bevor eine Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure erfolgte. Die Proteine wurden auf Tris-Glycin-Acrylamidgelen aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen, und die biotinylierten Proteine wurden durch Western Blot mit polyklonalem Anti-Biotin-Antikörper sichtbar gemacht.
11. Reinigungsschema von Protein, auf das mit TBL₄K abgezielt wurde.
12. Aminosäuresequenzen von Peptiden, bestimmt durch Massenspektrometrie. Reste, die in der humanen Sequenz nicht konserviert sind, sind in Fettdruck hervorgehoben und unterstrichen.
13.

A. Vorhergesagte Polypeptidsequenz des humanen Proteins (Zugangsnummer gi 14772424) mit Sequenzidentität zu den Peptiden in 12. Peptide, die mittels Massenspektrometrie sequenziert wurden (12) sind in Fettdruck gezeigt und unterstrichen. Motive, die denen entsprechen, die in B beschrieben sind, sind in Fettdruck und Kursivschrift gezeigt.
B. Motive, die in humaner SPPase identifiziert wurden. Die Positionen vorgeschlagener N-Glykosylierungsstellen basieren auf der vorhergesagten Topologie von SPPase im Hinblick auf Regionen, die entweder auf der zytosolischen oder der Lumenseite der ER-Membran vorhanden sind.
C. cDNA-Sequenz der vorhergesagten Polypeptidsequenz, die in A gezeigt ist.

14. Alignment von SPPase-Homologen aus niederen und höheren Eukaryoten.
MATERIALIEN UND METHODEN
1. Konstruktion von Plasmiden
a) pGEM-Plasmide.
Plasmide, die die codierende Region des Core-Proteins des HCV-Stamms Glasgow enthalten, wurden erhalten, indem man Fragmente aus zwei Konstrukten kombiniert, die als core.pTZ18 und 5'-NS2 bezeichnet werden (bereitgestellt durch M. McElwee und R. Elliott). core.pTZ18 besitzt die Nukleotidreste 337-915 des HCV-Stamm Glasgow-Genoms, und 5'-NS2 enthält die Reste 1-2895. 5'-NS2 wurde für Klonierungszwecke modifiziert, sodass die Sequenzen, die sich unmittelbar stromaufwärts von Rest 337 befinden, die Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzymstellen von Bgl II und Kpn I enthielten, und unmittelbar stromabwärts von Rest 2895 wurde ein Oligonukleotid inseriert, das für ein translationales Stopcodon codiert, gefolgt von Sequenzen für die Restriktionsenzymstellen für Bgl II und Hind III. Das resultierende Konstrukt, 5'-NS2/Bgl II, enthielt einen G zu A-Nukleotidaustausch an Position 663, der auch im ursprünglichen 5'-NS2-Plasmid vorhanden war, und der ein Stopcodon in die codierende Sequenz einführte. Um diesen Defekt zu beseitigen, wurde ein Kpn I/Bst EII-DNA-Fragment (enthaltend die HCV-Nukleotide 337 bis 841) aus core.pTZ18 in 5'- NS2/Bgl II inseriert, das mit den gleichen Enzymen geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid wurde als 5'- NS2/corr bezeichnet. Um pgHCV/CE1E2 zu erzeugen, wurde ein Bgl II/Hind III-DNA-Fragment aus 5'-NS2/corr, das ein partiell verdautes Fragment war, das Core, E1, E2, p7 und einen Teil der NS2-Sequenzen enthält, in die Stellen Bam HI und Hind III von pGEM1 inseriert. Das resultierende Plasmid wurde weiter modifiziert, indem man eine Bgl II-Enzymstelle an der Eco RI-Stelle in das pGEM-Rückgrat einführte, um pgHCV/CE1E2 zu erzeugen. Somit enthält pgHCV/CE1E2 die Nukleotidreste 337-2895 des HCV-Stamm Glasgow-Genoms und codiert Core, E1, E2, p7 und eine anteilige codierende Region von NS2.
Die Konstruktion eines Derivatplasmids, pgHCV/1-195, aus pgHCV/CE1E2 wurde erreicht durch das Inserieren eines Oligonukleotids (GCTGAGATCTA), das sowohl ein translationales Stopcodon als auch die Sequenzen für eine Bgl II-Enrymstelle zwischen einer Fsp I-Enzymstelle am Nukleotidrest 925 im HCV-Genom und einer Hind III-Enzymstelle im pGEM-Rückgrat aufweist. Somit codiert pgHCV/1-195 die N-terminalen 195 Aminosäuren (AS) des HCV-Stamms Glasgow. Ausgehend von pgHCV/1-195 wurde die folgende Reihe von Konstrukten hergestellt, bei der verschiedene Regionen der HCV-codierenden Region entfernt (i-iv unten) oder mutiert wurden (v unten).
Die auf pgHCV/folgenden Zahlen stellen die Aminosäurereste des HCV-Stamms Glasgow dar, die von jedem Konstrukt codiert werden:

i) pgHCV/1-169 wurde konstruiert durch Inserieren eines Oligonukleotids, GTAACCTTTGAGATCTA, zwischen den Enzymstellen Bst EII (am Nukleotidrest 841 im HCV-Stamm Glasgow-Genom) und Hind III (positioniert im pGEM-Rückgrat) in pgHCV/1-195.
ii) pgHCV/125-144 wurde konstruiert durch Inserieren des Oligonukleotids CGATAGAGGCGCTGCCAGGGCC zwischen die Stellen Cla I und Bst XI (an den Nukleotidresten 710 bzw. 792 im HCV-Stamm Glasgow-Genom) in pgHCV/1-195.
iii) pgHCV/1-124,145-169 wurde hergestellt durch Inserieren des zur Erzeugung von pgHCV/125-144 verwendeten Oligonukleotids zwischen die Stellen ClaI und BstXI (an den Nukleotidresten 710 bzw. 792 im HCV-Stamm Glasgow Genom) in pgHCV/1-169.
iv) pgHCV/CE1E2 wurde hergestellt durch Ersetzen eines BssHII/BstEII-Fragments (zwischen den Nukleotidresten 480 und 841 im HCV-Stamm Glasgow-Genom) in pSFV/CE1E2 durch das korrespondierende DNA-Fragment aus pgHCV/ 125-144.

b) pSV-SPORT1-Plasmide und Signalsequenzmutanten
Für in vitro-Transkriptions- und Translationsreaktionen wurde das Eco RI/Hind III-Fragment von pgHCV/CE1E2 in den Vektor pSV-Sport1 (Life Technologies) inseriert, der mit dem gleichen Enzym geschnitten worden war, um das Plasmid pSV/CE1E2 zu ergeben. In diesem Plasmid war das HCV-Fragment so orientiert, dass es unter der Kontrolle des SP6-Promotors steht. Die Signal sequenzmutanten pSV/MUTI, pSV/MUTII und pSV/MUTIII (Tabelle 1) wurden durch überlappende Extensions-Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von pSV/CE1E2 als Matrize erzeugt.
c) pSF-Plasmide
Für die Expression in Gewebekulturzellen wurden Bgl II-DNA-Fragmente, die die relevanten HCV-Sequenzen tragen, aus den pgHCV-Plasmidreihen in a) oben hergestellt und in die Bam HI-Stelle des Semliki Forest Virusvektors pSFV1 (Life Technologies) inseriert. Die resultierenden Plasmide wurden als pSF/-Reihe bezeichnet (z.B pSF/1-195). Für jedes der pSF/MUT-Plasmide (siehe Tabelle 2) wurden die Bst EII/Nru I-Fragmente (Nukleotidreste 841 bis 1034) aus den pSV/MUT-Konstrukten zunächst in pgHCV/CE1E2 und dann in pgHCV/CE1E2 (nur für MUTIII) übertragen, um pg/MUT-Plasmide zu ergeben, und danach aus diesen Konstrukten in pSFV1, wie oben für die pgHCV-Plasmide beschrieben. Tabelle 2. Details der Plasmidkonstrukte
2. Antikörper
Die Antikörper, die verwendet wurden, um HCV-Core (monoklonaler Antikörper [MAb] JM122 und Kaninchen-Antiserum R308), E1-Protein (Kaninchen-Antiserum R528) und E2-Protein (MAb ALP98) zu detektieren, sind zuvor beschrieben worden (Hope und McLauchlan, 2000, J Gen Virol, 81, 1913-1925; Patel et al., 2001, Virology 279, 58-68).
3. In vitro-Transkription, Translation und Signalpeptidprozessierung
Um mRNA herzustellen, die für Core-E1/100-Vorläufer codiert (Wt und Signalpeptidmutanten), wurde die entsprechende codierende Region aus dem geeigneten pSV-Plasmid (Tabelle 1) zunächst mittels PCR unter Verwendung von Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene), SP6-Primer und einem reversen Primer, der mit 5'-NNNNNNNNNCTA-beginnt, amplifiziert, um ein TAG-Stopcodon an der AS-Position 101 der E1-Sequenz einzuführen. Die mittels PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden dann in vitro mit SP6-RNA-Polymerase bei 42°C in Gegenwart von 500 μM m⁷G(5')ppp(5')G CAP-Analogon (Nilsson und von Heijne, 1993, J Biol Chem 268, 5798-5801) transkribiert. Entsprechend wurde mRNA, die für SP-E1/100 (Wt und Signalpeptidmutanten) codiert, aus PCR-amplifizierten DNA-Fragmenten hergestellt, die dann durch SP6-RNA-Polymerase transkribiert wurden. Für die letztere PCR dienten die pSV-Plasmide (Tabelle 2) als Matrizen, und der Vorwärtsprimer codierte den SP6-Promotor, die Kozak-Startsequenz und die Codons 161-167 von HCV Core.
Die mRNAs werden in 25 μl Kaninchen-Retikulozytenlysat (Promega) translatiert, das [³⁵S]-Methionin (Amersham-Pharmacia), und, wo angezeigt, wurden 2 Äquivalente an Nuklease-behandelten rauen Mikrosomen, die aus Hunde-Pankreas erzeugt worden waren (Martoglio et al., 1998, Cell Biology: A Laboratory Handbook. Academic Press, San Diego, CA, Band 2, 265-274), enthielt. Um die Signalpeptidpeptidase (SPPase)-Prozessierung zu inhibieren, wurden 10 μM (Z-LL)₂-Keton zu den Reaktionen hinzugegeben (Weihofen et al., 2000, J Biol Chem, 275, 30951-30956), und die Reaktionen wurden mit 30 μM N-Benzoyl-Asn-Leu-Thr-Methyamid supplementiert, um die N-Glykosylierung der translatierten Produkte zu verhindern (Martoglio et al., 1998, Cell Biology: A Laboratory Handbook. Academic Press, San Diego, CA, Band 2, 265-274). Die Proben wurden für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Reaktionen, die Mikrosomen enthalten, wurden dann mit 25 μl an RM-Puffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 1 mM DTT, 250 mM Sucrose) verdünnt, und die Salzkonzentration wurde auf 500 mM KOAc erhöht. Nach der Inkubation für 5 min auf Eis wurden die Membranen mittels Zentrifugation durch ein 100 μl Sucrose-Kissen (RM-Puffer mit 500 mM KOAc und 500 mM Sucrose) bei 48.000 rpm für 3 min bei 4°C in einem Beckman TLA100 Rotor abgetrennt. Die Membran-Pellets wurden für die SDS-PAGE vorbereitet, wie beschrieben (Weihofen et al., 2000 J Biol Chem, 275, 30951-30956).
4. In vitro-Transkription von pSF-Konstrukten
Vor der Elektroporation wurde die RNA in vitro ausgehend von dem geeigneten pSFV-Plasmid, das an einer Spe I-Enzymstelle linearisiert worden war, transkribiert. Typische Reaktionen wurden in einem Volumen von 20 μl durchgeführt und enthielten 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl₂, 2 mM Spermidin, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 0,5 mM GTP, 1 mM m⁷G(5')ppp(5')G CAP-Analogon, 50 Units RNasin, 50 Units SP6-RNA-Polymerase und 2 μg linearisierte DNA. Die Reaktionen wurden für 2 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert, um die Qualität und Menge an synthetisierter RNA vor der Verwendung bei der Elektroporation zu untersuchen.
5. Haltung von Gewebekulturzellen und Behandlung mit MG132
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung züchtete man die aus Babyhamsternieren stammenden (BHK) C13-Kulturzellen heran und hielt sie in Glasgow Minimal Eagle's Medium, das mit 10% Neugeborenen-Kälberserum (CS), 4% Tryptosephosphatbrühe und 100 IU/ml Penicillin/Streptomycin (ETC10) supplementiert war. Um die Zellen mit MG132 (Boston Biochem) zu behandeln, wurden die kultivierten Zellen nach der Elektroporation für 5 Stunden bei 37°C inkubiert, und das BHK-Medium wurde durch frisches Medium ersetzt, das den Proteaseinhibitor mit einer Endkonzentration von 2,5 μg/ml enthielt. Die Inkubation wurde bei 37°C für weitere 12 Stunden fortgesetzt, bevor die Zellen entweder für die Western Blot-Analyse geerntet wurden oder für die indirekten Immunfluoreszenzstudien fixiert wurden.
6. Elektroporation der Zellen
Die BHK-Zellen wurden gewaschen und für die Ablösung von den Gewebekulturbehältern mit Trypsin behandelt. Die abgelösten Zellen wurden in 20 ml Wachstumsmedium suspendiert und bei 100 g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellpellets wurden in 50 ml PBSA (PBS-Lösung ohne Ca²⁺- und Mg²⁺-Salze) suspendiert und wie zuvor zentrifugiert. Die Pellets wurden in PBSA mit einer Endkonzentration von etwa 2 × 10⁷ Zellen/ml suspendiert. 0,8 ml der kompetenten BHK-Zellen wurden in einer Elektroporationsküvette (0,4 cm Lücke) mit in vitro transkribierter RNA gemischt und einem Puls bei 1,2 kV, 25 F unterzogen. Nach der Elektroporation wurden die Zellen in Wachstumsmedium verdünnt und entweder auf Gewebekulturschalen oder Deckgläsern in 24-Well-Gewebekulturplatten ausgesät und dann für 12 Stunden bei 37°C inkubiert.
7. Präparation von Zellextrakten und Deglykosylierung von Proteinen
Die Zellen wurden in PBS abgekratzt und durch Zentrifugation bei 100 g für 5 min bei 4°C pelletiert. Das Zellpellet wurde in Probenpuffer gelöst, der aus 160 mM Tris-HCl (pH 6,7), 2% SDS, 700 mM β-Mercaptoethanol, 10% Glycerol und 0,004% Bromphenolblau bestand. Alternativ wurde Probenpuffer direkt zu Zellen hinzugegeben, die mit PBS gewaschen worden waren. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von etwa 4 × 10⁶ Zelläquivalenten pro ml Probenpuffer solubilisiert. Die Pro ben wurden für 5 Minuten auf 100°C erhitzt, um die Proteine und Nukleinsäuren vollständig zu denaturieren.
Für die Deglykosylierung wurden die Zellen in 0,5% SDS, 1 % β-Mercaptoethanol bei 100°C für 10 min bei einer Konzentration von etwa 6 × 10⁶ Zelläquivalenten pro ml gelöst. Es wurde Natriumcitrat bis auf 50 mM hinzugegeben, gefolgt von 2000 Units an Endo H, und die Reaktionsansätze wurden bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Es wurde Probenpuffer hinzugegeben, um den Extrakt bis auf etwa 4 × 10⁶ Zelläquivalente pro ml zu verdünnen, und die Proben wurden gemäß obiger Beschreibung auf 100°C erhitzt.
8. Carbonat-Extraktion von Gewebekulturzellen
150 mm Gewebekulturschalen von BHK-Zellen, die einer Elektroporation mit RNA aus den relevanten pSF-Konstrukten unterzogen worden waren, wurden bei 37°C für 15 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und in PBS abgekratzt. Nach Pelletbildung bei 300 g und 4°C für 5 min ließ man die Zellen für 10 min bei 4°C in 600 μl Puffer A (10 mM HEPES-KOH, pH 7,9, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT) quellen und pelletierte wie zuvor. Die Zellpellets wurden in 600 μl Puffer A resuspendiert und durch 10-fache Passage durch eine 0,45 Eichmaß-Nadel homogenisiert. Intakte Zellen, die die Homogenisierung überlebten, sowie die Zellkerne wurden durch Zentrifugation bei 1000 g für 10 min bei 4°C pelletiert. Der resultierende Überstand wurde bei 100.000 g für 15 min bei 4°C zentrifugiert. Dies erzeugte die Fraktionen der Membran (Pellet, P1) und des Zytosols (Überstand, SN1). Das Pellet P1 wurde in 100 μl frisch hergestellter 100 mM Na₂CO₃-Lösung (pH 11,3) resuspendiert und für 15 min auf Eis inkubiert. Lösliches und unlösliches Material wurde durch Zentrifugation durch 200 μl eines Sucrosekissens (100 mM Na₂CO₃, 250 mM Sucrose) bei 130.000 g für 15 min bei 4°C voneinander getrennt. Das resultierende Pellet (P2) und die Überstandfraktionen (SN2) repräsentieren nicht-extrahiertes bzw. durch Na₂CO₃ extrahiertes Material. Vor der Elektrophorese wurden die Lipide in SN1 und SN2 durch die Zugabe von Aceton auf 25% solubilisiert, und die Proteine wurden präzipitiert, indem man Trichloressigsäure bis auf 15% hinzugab. Die präzipitierten Proteine wurden durch Zentrifugation bei 13.000 g für 5 min zurückgewonnen, mit Aceton gewaschen, getrocknet und in Probenpuffer resuspendiert, bevor eine Elektrophorese auf Acrylamidgelen erfolgte.
9. SDS-PAGE und Western Blot-Analyse
Die Proteine und Peptide wurden durch SDS-PAGE analysiert, wobei entweder Tris-Glycin-Acrylamidgele (13% T, 2,7% C) (Laemmli, 1970, Nature 227, 570-574) oder Tris-Bicin-Harnstoff- Acrylamidgele (15% T oder 10% T, 5% C; 8 M Harnstoff) (Wiltfang et al., 1997, Electrophoresis, 18, 527-532) verwendet wurden. Die markierten Proteine wurden durch einen „STORM Phosphoimager" (Molecular Dynamics) sichtbar gemacht. Für die Western Blot-Analyse wurden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran übertragen. Es wurden zwei Sets von Bedingungen verwendet, um die Membranen mit Antikörpern und Antiseren einer Sondenmarkierung zu unterziehen. Ein Set bestand aus dem Blockieren der Membranen in 3% Gelatine, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Danach wurden Inkubationen mit den primären Antikörpern oder Antiseren in 1 % Gelatine, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl, 0,05% Tween 20 entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C für etwa 3-4 Stunden durchgeführt. Nach ausgedehntem Waschen mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 500 mM NaCl, 0,05% Tween 20 wurden die Membranen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem passenden sekundären Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert war, inkubiert, bei einer Verdünnung von 1/1000 und in der gleichen Lösung wie für den primären Antikörper. Für das zweite Set von Bedingungen wurde die Membran mit 5% BSA in TBST (20 mM Tris-HCl [pH 7,6], 140 mM NaCl, 0,1% Tween 20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur geblockt, gefolgt von einer Übe nacht-Inkubation mit primärem Antikörper oder Antiserum in Blocking Lösung bei 4°C. Nach ausgedehntem Waschen mit TBST wurde die Membran für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem passenden sekundären Antikörper (konjugiert mit Meerrettichperoxidase) in TBST bei einer Verdünnung von 1/10-50000 inkubiert. Gebundener Antikörper wurde durch verstärkte Chemilumineszenz (Amersham-Phamtacia) detektiert. Die primären Antikörper und Antiseren und ihre Verdünnungen waren wie folgt: monoklonale Antikörper JM122 und ALP98 (beide auf 1/500 verdünnt), Kaninchen-Antiseren R528 und R308 (beide verdünnt auf 1/1000).
10. Indirekte Immunfluoreszenz und Anfärbung von Lipiden
Zellen auf 13 mm-Deckgläschen wurden entweder in Methanol bei –20°C oder mit 4% Paraformaldehyd, 0,1% Triton X-100 (hergestellt in PBS) bei 4°C für 30 min fixiert. Nach dem Waschen mit PBS und dem Blocken mit PBS/CS (PBS mit 1% Neugeborenen-Kälberserum) wurden die Zellen mit primärem Antikörper (verdünnt in PBS/CS bei 1/200 für JM122 und ALP98 MAbs, 1/1000 für R308- und R528-Antiseren) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden ausgiebig mit PBS/CS gewaschen und dann mit konjugiertem sekundärem Antikörper (entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG, erzeugt in der Ziege) für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden ausgiebig in Lösungen von PBS/CS, gefolgt von PBS und schließlich mit Wasser gewaschen, bevor sie unter Verwendung von Citifluor auf Objektträger gebracht wurden. Die Proben wurden unter Verwendung eines Zeiss LSM Konfokalmikroskops analysiert.
Nach der Inkubation mit beiden Antikörpern und Waschen wurden die Lipidtröpfchen in mit Paraformaldehyd fixierten Zellen angefärbt, indem man die Deckgläschen kurz in 60% Propan-2-ol abspülte, gefolgt von der Inkubation mit 0,5 ml 60% Propan-2-ol, enthaltend Oil Red O, für 1,5-2 min bei Raumtemperatur. Die Deckgläschen wurden kurz mit 60% Propan-2-ol gespült, mit PBS und H₂O gewaschen und aufgelegt, wie zuvor beschrieben. Die Oil Red O-Färbelösung wurde aus einem gesättigten Stammansatz mit etwa 1 % Oil Red O, das in Propan-2-ol gelöst war, hergestellt. Vor der Färbung wurde der Stammansatz mit H₂O verdünnt und dann gefiltert.
11. Präparation von mit CHAPS solubilisierten ER-Membranproteinen
a) Herstellung von vom ER abgeleiteten rauen Mikrosomen (RMs) aus Hundepankreas
Hunde (z.B Beagle oder Fox) wurden von pharmazeutischen Firmen erhalten, und die Pankreas wurde innerhalb von 10 min nach dem Tod entnommen. Die Pankreas (20-30 g) wurde chirurgisch ausgeschnitten, und Bindegewebe und Fett wurden entfernt. Das verbleibende Pankreasgewebe wurde in kleine Stückchen geschnitten, gefroren und in flüssigem Stickstoff gelagert. Für die Herstellung von RMs wurden die gefrorenen Stücke einer Pankreas in 120 ml Homogenisierungspuffer (250 mM Sucrose, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 6 mM Mg(OAc)₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 30 μg/ml PMSF) aufgetaut. Das Gewebe wurde durch eine Gewebepresse mit einem 1 mm Maschengröße aufweisenden Stahlsieb geleitet, gefolgt von der Homogenisierung in einem 60 ml Glas/Teflon-Potter mit 5 Stößen bei voller Geschwindigkeit (1500 rpm). Das Homogenisat wurde auf 30 ml-Polypropylenröhrchen überführt und bei 3.000 rpm für 10 min bei 4°C in einem Sorvall SS34-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt, wobei man die schwimmenden Lipide vermied, und das Pellet wurde wiederum in 50 ml Homogenisierungspuffer gemäß obiger Beschreibung homogenisiert. Die Überstände aus beiden Extraktionen wurden vereint, auf 30 ml Polypropylenröhrchen übertragen und bei 9500 rpm für 10 min bei 4°C in einem Sorvall SS34-Rotor zentrifugiert. Die Überstände wurden auf frische Röhrchen übertragen, und die Zentrifugation wurde wiederholt. Der resultierende Überstand wurde vorsichtig über 25 ml eines Sucrosekissens (1,3 M Sucrose, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 6 mM Mg(OAc)₂, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 μg/ml PMSF) in vier 70 ml-Polycarbonatröhrchen appliziert und bei 35.000 rpm für 1 Stunde bei 4°C in einem Beckmann Ti 45-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Membranpellet, das aus rauen Mikrosomen (RMs) bestand, wurde in 15 ml RM-Puffer (250 mM Sucrose, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 1 mM DTT, 10 μg/ml PMSF) unter Verwendung eines Dounce Homogenisators resuspendiert. Die Absorption bei 260 nm und 280 nm wurde für eine 1:1000-Verdünnung der RM-Suspension in 0,5% (w/v) SDS gemessen. Typischerweise wurden eine Absorption von 0,05-0,1 A₂₈₀/ml und ein Verhältnis von A₂₆₀/A₂₈₀ von ~1,6 erhalten. Es wurden Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –70°C gelagert.
b) Extraktion von Ribosomen, naszierenden Polypeptiden und Proteinen, die peripher mit der zytosolischen Oberfläche von Mikrosomen assoziiert sind
10-20.000 Äquivalente (500-1000 A₂₈₀) RMs, suspendiert in RM-Puffer, wurden bei 36.000 rpm für 1 Stunde bei 4°C in einem Beckmann Ti 70-Rotor zentrifugiert. Das resultierende RM-Pellet wurde in 15 ml Hochsalzpuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 500 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 250 mM Sucrose, 1 mM DTT, 10 μg/ml PMSF) unter Verwendung eines Dounce Homogenisators resuspendiert. Puromycin und GTP (Endkonzentration von 2 mM bzw. 0,33 mM) wurden hinzugegeben, und die Probe wurde für 20 min bei Raumtemperatur rotiert. 13,8 g Sucrose (Endkonzentration 1,8 M) wurde dann hinzugegeben, und man setzte die Inkubation bei Raumtemperatur fort, bis sich die Sucrose gelöst hatte (etwa 15 min). Die Probe wurde auf vier Polycarbonatröhrchen aufgeteilt (6 ml pro Röhrchen) und mit 3 ml eines 1,5 M Sucrosekissens (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 500 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 1,5 M Sucrose, 1 mM DTT, 10 μg/ml PMSF) überschichtet. Die Röhrchen wurden mit RM-Puffer aufgefüllt, und die Proben wurden bei 36.000 rpm für 16-18 Stunden bei 4°C in einem Beckman SW41-Rotor zentrifugiert. Mit Puromycin/Hochsalz gewaschene RMs (PK-RMs) wurden an der Oberseite des 1,5 M Sucrosekissens gesammelt und unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators in RM-Pufter resuspendiert (Gesamtvolumen etwa 25 ml).
c) Verminderung luminaler Proteine
25 ml einer PK-RM-Suspension (hergestellt aus 10.-20.000 Äquivalenten von RMs) wurden mit 250 ml an Verminderungspuffer (50 mM HEPES, 50 mM CAPS, mit KOH auf pH 9,6 eingestellt) verdünnt und für 30 min auf Eis inkubiert. Die Membranen (PKX-RMs) wurden durch Zentrifugation in einem Beckmann Ti 45-Rotor bei 40.000 rpm für 1 Stunde bei 4°C wiedergewonnen.
d) Solubilisierung von Membranproteinen mit CHAPS
Pelletierte PKX-RMs wurden in 15 ml Solubilisierungspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 125 mM Sucrose, 1 mM DTT, 10 μg/ml PMSF, 2% CHAPS) unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators resuspendiert. Man ließ die Probe für 1 Stunde bei 4°C rotieren. Proteine, die sich in Gegenwart von Detergens nicht lösten, wurden durch Zentrifugation entfernt (Beckman TLA100.4-Rotor, 75.000 rpm, 1 Stunde, 4°C). Der Überstand enthielt durch CHAPS solubilisierte ER-Membranproteine.
12. Photoaffinitätsmarkierung von SPPase
a) Chemische Synthese von TBL₄K
Ein Schema für die Synthese von TBL₄K wird in 7 dargestellt. TBL₄K wurde synthetisiert, indem man zunächst einen Überschuss an kommerziell erhältlichem BOC-LL-OH (Bachem) unter Verwendung des Kopplungsreagenz HATU und Collidin an Diaminoaceton koppelte. Das resultierende Produkt wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie isoliert und mittels kernmagnetischer Resonanzspektrometrie identifiziert. Das mit BOC geschützte Derivat wurde durch kurze Behand lung mit Trifluoressigsäure entschützt, gefolgt von Präzipitation in Hexan. Die zwei freien Aminotermini von (H₂N-LL)₂-Keton wurden dann mit 1 Äquivalent an TDBAOSu (ein Geschenk von Prof. Brunner, ETH, Zürich) und 1 Äquivalent an Biotin-X-OSu (Molecular Probes) modifiziert. (TDBA-LL)(Biotin-X-LL)-Keton (= TBL₄K) wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie isoliert und durch Massenspektrometrie identifiziert.
b) Inhibition von SPPase mit TBL₄K
Die inhibitorische Wirkung von TBL₄K auf SPPase wurde mittels CHAPS-solubilisierten ER-Membranproteinen und in vitro translatiertem Peptidsubstrat untersucht. Das Substrat war ein 29 AS-Reste langes mutantes Signalpeptid von Prä-Prolactin (p-Prl^PP/29; MDSKGSSQKGSRLLLLLWSNLLLCQGPP). Die W→PP-Mutation am Ende des Signalpeptids verhindert die Spaltung durch Signalpeptidase, die das Peptid an der kryptischen Spaltungsstelle bei G27 spalten kann, wenn sie in CHAPS solubilisiert ist (B.M., unveröffentlicht). Um in vitro translatiertes Peptid herzustellen, wurde die codierende Region für p-Prl^PP/29 zunächst aus pGEM3Z/p-Prl (Weihofen et al., 2000, J Biol Chem 275, 30951-30956) mittels PCR amplifiziert, wofür Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene), ein SP6-Oligonukleotidprimer und ein reverser Primer mit der Nukleotidsequenz 5'-NNNNNNNNNCTACGGCGG-3' verwendet wurden, um einen Translationsstop bei Codon 30 und die Mutationen für die Reste 28 und 29 zu inserieren. RNA, die für dieses Peptid codiert, wurde in vitro aus dem PCR-amplifizierten Produkt transkribiert (siehe Abschnitt 3, Materialien und Methoden). Die Translation von RNA zur Herstellung von radioaktiv markiertem p-Prl^PP/29-Peptid wurde in vitro durchgeführt, wie in Abschnitt 3 beschrieben, mit dem Unterschied, dass Weizenkeimextrakt (Promega) verwendet wurde.
2 μl des Translationsgemischs (enthaltend radioaktiv markiertes p-Prl^PP/29-Peptid) wurden mit 35 μl SPPase-Puffer (25 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 100 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 1 mM DTT) verdünnt und 0,8 μl an SPPase-Inhibitor TBL₄K, gelöst als 50x Stammansatz in DMSO, wurden hinzugegeben. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 2 μl an CHAPS-solubilisierten Membranproteinen gestartet, und die Proben wurden für 1 Stunde bei 30°C inkubiert. Die Proteine wurden durch die Zugabe von 4 μl 100% Trichloressigsäure präzipitiert und durch SDS-PAGE unter Verwendung von Tris-Bicin-Harnstoff-Acrylamidgelen (15% T oder 10% T, 5% C; 8 M Harnstoff) (Wiltfang et al., 1997, Electrophoresis 18, 527-532) analysiert.
c) Markierung von Protein mit TBL₄K
Für die analytische Markierung wurden 2 μl an CHAPS-solubilisierten ER-Membranproteinen mit 16 μl an SPPase-Puffer (25 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 100 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)₂, 1 mM DTT) verdünnt und mit 50 nM TBL₄K (gelöst in DMSO) supplementiert. Die Proben wurden bei 30°C für 1 Stunde inkubiert und anschließend mit UV-Licht bestrahlt (30 Sekunden, 350 W Hochdruckquecksilberlampe mit einem Pyrex-Filter, 10 cm Distanz zur Lampe). Die Proteine wurden mit 10% Trichloressigsäure präzipitiert und jeweils auf Tris-Glycin-Acrylamidgelen (10% T, 2,7% C) (Laemmli, 1970, Nature, 227, 570-574) aufgetrennt. Die biotinylierten Proteine wurden durch Western Blot mit einem polyklonalen Anti-Biotin-Antikörper (Bethyl) sichtbar gemacht. Die Western Blot-Analyse wurde durchgeführt, wie in Abschnitt 3, Materialien und Methoden, für R308-Antiseren beschrieben.
Für die präparative Markierung setzte man Membranproteine im Großmaßstab mit TBL₄K um. 15 ml an CHAPS-solubilisierten ER-Membranproteinen wurden mit 120 ml an SPPase-Puffer verdünnt und mit 20 μl an 500 μM TBL₄K in DMSO supplementiert. Die Probe wurde bei 30°C für 1 Stunde inkubiert. Für die Bestrahlung mit UV-Licht wurde die Probe zwischen vier 50 ml Polypropylenröhrchen (Falcon) aufgeteilt, und für 30 Sekunden bestrahlt. Die Aliquots wurden dann vereint, und die Proteine wurden durch Säulenchromatographie aufgetrennt.
13. Säulenchromatographie
a) ConA-Sepharose-Chromatographie
Mittels CHAPS solubilisierte ER-Membranproteine (135 ml), die TBL₄K-markierte Spezies beinhalten, wurden mit 15 ml an 5 M NaCl und 2,6 ml an 20% reduziertem Triton X-100 (Sigma) supplementiert. Die Probe wurde auf eine 1 ml-Concanavalin A-Sepharose-Säule (Amersham Pharmacia) appliziert, die mit EQ-Puffer I (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 500 mM NaCl, 20 mM Sucrose, 1 mM DTT, 0,35% reduziertes Triton X-100) äquilibriert worden war. Man ließ die Probe mit 0,2 ml/min und bei 4°C 5-mal über die Säule zirkulieren. Die Säule wurde dann mit 5 ml EQ-Puffer I gewaschen, und die gebundenen Proteine, die TBL₄K-markierte Spezies beinhalteten, wurden bei Raumtemperatur mit 15 ml Elutionspuffer (1 M Methyl-D-glucopyranosid, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,35% reduziertes Triton X-100) eluiert.
b) Hydroxylapatit-Chromatographie
Eluat (15 ml) von der ConA-Säule wurde 10-mal mit 50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 1 mM DTT, 0,35% reduziertem Triton X-100 verdünnt, um die Salzkonzentration zu reduzieren. Die Probe wurde auf eine 2,5 ml-Hydroxylapatitsäule (BioRad) appliziert, die mit EQ-Puffer II (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 50 mM KOAc, 1 mM DTT, 0,35% reduziertes Triton X-100) bei 0,2 ml/min und 4°C äquilibriert worden war. Die Säule wurde danach mit 12,5 ml EQ-Puffer II gewaschen, und gebundene Proteine, die TBL₄K-markierte Spezies beinhalten, wurden bei Raumtemperatur mit 3 ml Elutionspuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,6, 500 mM KOAc, 200 mM KP_i, 1 mM DTT, 0,35% reduziertes Triton X-100) eluiert.
c) Reversphasen-HPLC
Eluat (3 ml) von der Hydroxylapatitsäule wurde mit 300 μl an 100% Trichloressigsäure supplementiert, um die Proteine zu präzipitieren. Nach der Zentrifugation (Eppendorf-Zentrifuge, 14.000 rpm, 4°C, 5 min) wurde das Proteinpellet mit Aceton gewaschen und in 50% Ameisensäure in H₂O resuspendiert. Die Probe wurde auf eine RP4-Reversphasen-HPLC-Säule (Machery Nagel, CC 125/4 Nucleosil 300-5 C4) appliziert, die mit 50% Ameisensäure äquilibriert worden war. Die Flussrate betrug 1 ml/min. Die Proteine wurden zunächst mit einem linearen Gradienten von 50% Ameisensäure in H₂O bis zu 50% Ameisensäure in Acetonitril eluiert. Die Säule wurde dann mit 50% Ameisensäure in H₂O erneut äquilibriert und verbleibende Proteine, die TBL₄K-markierte Spezies beinhalten, wurden mit einem linearen Gradienten aus 50% Ameisensäure in H₂O bis zu 50% Ameisensäure in Propan-2-ol eluiert.
d) SDS-PAGE
Fraktionen, die die TBL₄K-markierten Spezies enthalten, wurden vereint, und die Proteine wurden unter Verwendung eines Tris-Glycin-Acrylamidgels (10% T, 2,7% C) (Laemmli, 1970, Nature, 227, 570-574) durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden durch Färbung mit Coomassie-Brillantblau sichtbar gemacht, und es verblieben nur 5 gut aufgelöste Proteine in dieser Fraktion. Das Western Blotting unter Verwendung von Anti-Biotin-Antikörper identifizierte das TBL₄K-markierte Protein. Die entsprechende, mit Coomassie gefärbte Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und der Sequenzierung durch Massenspektrometrie unterzogen.
13. Sequenzierung durch Massenspektrometrie
Die Peptidsequenzen wurden durch die Proteinanalyseeinheit (Universität von Zürich) identifiziert.
DISKUSSION
1. Die Signalsequenz an der HCV-Core-E1-Verbindungsstelle ist ein Substrat für die Spaltung durch Signalpeptidase und Signalpegtidgegtidase
Zuvor erfolgte in vitro-Studien haben Belege dafür geliefert, dass die Signalsequenz, die Core und E1-Proteine von einander trennt, in Gegenwart mikrosomaler Membranen gespalten wird, was eine Proteolyse durch Signalpeptidase nahelegt. Dieses Prozessierungsereignis wurde in einem in vitro-Translations-/Translokations-System erneut untersucht. Es wurden zwei RNA-Substrate verwendet, die in vitro transkribiert worden waren. Eines enthielt die E1-Signalsequenz und die N-terminalen 100 AS von E1 (SP-E1/100), das zweite bestand aus dem gesamten Core-Protein einschließlich der Signalsequenz plus den N-terminalen 100 AS von E1 (Core-E1/100). Die se Substrate wurden in einem Retikulozyten-Lysat in Gegenwart rauer Mikrosomen, die vom endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitet waren, sowie von [³⁵S]-Methionin, translatiert. Die Mikrosomen wurden nachfolgend isoliert und auf das Zurückhalten radioaktiv markierter Translationsprodukte hin analysiert.
Die Protein-Zielsteuerungs- und Membran-Insertionsfunktionen der internen Signalsequenz zwischen Core und E1-Proteinen wurde zunächst mit einem Vorläufer, SP-E1/100, untersucht, der die HCV-AS-Reste 161 bis 291 codierte, wobei ein Translationsstartcodon voranging. Die Translation von SP-E1/100-mRNA in Gegenwart von Mikrosomen erbrachte N-glykosyliertes E1/100 (E1/100g), was die Translokation des Proteins in die Mikrosomen anzeigt (1A, Spur 2). Die Inhibition der N-Glykosylierung durch die Zugabe von Akzeptortripeptid resultierte in der Erzeugung von E1/100, welches wiederum die Entfernung des Signalpeptids durch Signalpeptidase an Rest 191 offenbarte (1A, Spur 3). Das freigesetzte Signalpeptid sollte ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 4 kDa besitzen und mit einem Referenzpeptid co-migrieren (1A, Spur 5). Jedoch war ein Produkt dieser Größe in der Membranfraktion kaum detektierbar, was nahelegt, dass es weiter prozessiert und von der Membran freigesetzt wurde (1A, Spuren 2 und 3).
Es ist vorgeschlagen worden, dass die Prozessierung des Signalpeptids entweder durch Signalpeptidase oder eine unbekannte SPPase-Aktivität in mikrosomalen Membranen durchgeführt werden könnte (Hüssy et al., 1996, Virology, 224, 93-104). In vorherigen Studien haben wir gezeigt, dass (Z-LL)₂-Keton ein spezifischer Inhibitor von Säuger-SPPase ist, die Spaltung durch Signalpeptidase jedoch nicht beeinflusst (Weihofen et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 30951-30956). Bei Zugabe von (Z-LL)₂-Keton zu den Reaktionen, war das Signalpeptid, das von SP-E1/100 erzeugt wurde, leicht zu detektieren und wanderte zusammen mit dem Referenzpeptid, was anzeigt, dass die Spaltung durch SPPase blockiert worden war (1A, Spuren 4 und 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass N-terminal eines Prä-Proteins die interne Signalsequenz an der Verbindungsstelle der Funktionen Core-E1 als ein typisches ER-Zielsteuerungssignal fungiert und ein Substrat nicht nur für Signalpeptidase sondern auch für SPPase darstellt.
Die Funktion der Signalsequenz an der Verbindungsstelle von Core-E1 wurde danach im Kontext des gesamten Core-Proteins untersucht. Die Translation von Core-E1/100 in Gegenwart von Mikrosomen erbrachte mehrere Produkte, einschließlich unprozessiertem Vorläuferprotein und einem 12 kDa-Produkt, das unglykosyliertem E1 (E1/100) entsprach, das durch Signalpeptidasespaltung des Vorläuferproteins erzeugt worden war (1B, Spur 2). Die zwei anderen Hauptbanden wanderten mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 21 kDa und 19 kDa. Die ein höheres Molekulargewicht aufweisende Spezies umfasste zwei Proteine, die glykosylierte Form von E1 (E1/100g) und Core-Protein, welches das N-terminale Produkt der Signalpeptidasespaltung des Vorläuferproteins bei Rest 191 war. Um zu bestätigen, dass die 21-kDa-Spezies beide dieser Proteine enthielt, wurde Akzeptortripeptid zu den Reaktionen hinzugegeben, um die N-Glykosylierung von E1 zu blockieren. Entsprechend wurde die Intensität der 21 kDa-Bande reduziert, während es eine gesteigerte Menge an unglykosyliertem E1 gab (1B, Spur 3). Die 19 kDa-Spezies ist zuvor beobachtet worden und entspricht Core-Protein, das an der Region, die das Signalpeptid enthält, weiter prozessiert wurde. Diese Spezies wanderte außerdem zusammen mit einem Referenzpeptid von 179 AS und mit reifem Core-Protein, das in Gewebekulturzellen durch ein Plasmid pSF/CE1E2 erzeugt worden war, welches die N-terminalen 837 AS von HCV-Polyprotein exprimierte (3A, Wt, Spuren 2-4). Die Zugabe von (Z-LL)₂-Keton zu den Reaktionen blockierte die Produktion der 19 kDa-Spezies, nicht jedoch des 21 kDa-Proteins, das dem von Signalpeptidase erzeugten Core entspricht (1B, Spuren 4 und 5). Zusammen mit den oben dargestellten Ergebnissen liefern diese Daten überwältigende Belege dafür, dass das Signalpeptid an der Verbindungsstelle der Core-E1-Sequenzen in HCV zunächst durch Signalpeptidase gespalten und anschließend durch SPPase prozessiert wird.
2. Die Prozessierung von Core erfordert Helix-brechende Reste in der Transmembranregion der Signalpegtidsequenz
SPPase fördert die Intramembran-Proteolyse an Helix-brechenden Resten im Zentrum der hydrophoben Region einer Signalsequenz (Weihofen et al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 30951-30956). Basierend auf diesen Kriterien enthält die Signalsequenz zwischen Core und E1 zwei potentielle SPPase-Spaltungsstellen, Leu₁₇₉/Ala₁₈₀ (Stelle 1, eine geringfügigere Helixbeugung im Zentrum der hydrophoben Region) oder Leu₁₈₂/Ser₁₈₃-Cys₁₈₄ (Stelle 2, der wesentliche Helixbruch in der Transmembranregion). Das Ersetzen der Helix-brechenden Reste in der hydrophoben Region einer Signalsequenz durch Aminosäuren mit langen hydrophoben Seitenketten reduziert die Empfindlichkeit des Signalpeptids gegenüber SPPase-Prozessierung, beeinflusst jedoch nicht die Funktion der Signalsequenz bei der Protein-Zielsteuerung, der Translokation und der Spaltung durch Signalpeptidase (M. Lemberg und B. Martoglio, unveröffentlichte Daten). Bei einem Versuch, die SPPase-Spaltstelle(n) in der HCV-Core-Signalsequenz zu bestimmen, wurde die Prozessierung bei drei Mutanten untersucht (Tabelle 1). Zwei Mutanten besaßen Substitutionen an einer der beiden vorhergesagten Stellen (Ala₁₈₀→Val₁₈₀ [MUTI] und Ser₁₈₃/Cys₁₈₄→Leu₁₈₃/Val₁₈₄ [MUTII]), und eine Doppelmutante kombinierte Mutationen an beiden Stellen (Ala₁₈₀/Ser₁₈₃/Cys₁₈₄→Val₁₈₀/Leu₁₈₃/Val₁₈₄ [MUTIII]).
In vitro-Translations-/Translokations-Assays mit SP-E1/100-Vorläufern zeigten, dass weniger als 5% Prozessierung des Signalpeptids durch SPPase bei pSP/MUTIII erfolgten (2A, MUTIII, vergleiche Spuren 2 und 3; 2B). Die Analyse von Konstrukten mit Mutationen an jeweils einer der beiden Erkennungsstellen zeigte, dass die Spaltung des Signalpeptids bei beiden Mutanten reduziert wurde, jedoch in einem größeren Maße bei pSP/MUTII als im Vergleich bei pSP/MUTI ( 2A, MUTI und MUTII, Spuren 2 und 3; 2B). Bei den entsprechenden Vorläufern von mutantem Core-E1/100 (Tabelle 1) besaßen die Daten ein ähnliches Muster, obwohl die Wirkungen merklicher waren. Entsprechend reduzierte die Mutation der Stelle 1 die Effizienz der Prozessierung von 40% auf 12% (3A, vergleiche WT und MUTI, Spuren 4; 3B). Die zwei anderen Vorläufer, C-MUTII und C-MUTIII, erzeugten keinerlei detektierbares Produkt, das durch SPPase gespalten worden war (3A, MUTII und MUTIII, Spuren 4; 3B).
Bei Übertragung der Signalpeptidmutanten in das SFV-Konstrukt, pSF/CE1E2, testeten wir die Auswirkung dieser Mutationen auf das Ausmaß der Prozessierung von Core in Gewebekulturzellen. Die Konstrukte wurden als pSF/MUTI, pSF/MUTII und pSF/MUTIII (Tabelle 1) bezeichnet. Extrakte aus Zellen, die einer Elektroporation mit RNA aus diesen Konstrukten unterzogen worden waren, wurden nebeneinander in entsprechenden in vitro-Reaktionen durch Western Blot-Analyse untersucht (3A). Die Daten zeigten, dass die Mutation an der Stelle 1 die Menge an reifem Coreprotein, das durch SPPase erzeugt wurde, reduzierte (3A, MUTI, Spur 3), jedoch in einem geringeren Ausmaß als in vitro detektiert. Bei pSF/MUTII und pSF/MUTIII wanderten die Core-Proteine, die durch diese Konstrukte hergestellt wurden, zusammen mit den in vitro translatierten Produkten von 191 AS. Dies repräsentiert Spaltung durch Signalpeptidase, jedoch gab es keinen Anhaltspunkt über prozessierte Formen, die durch SPPase erzeugt worden waren (3A, MUTII und MUTIII, Spuren 3). Wir schlussfolgern daraus, dass die Mutation an den Helix-brechenden Positionen 183 und 184 (Stelle 2) eine weit größere Wirkung auf die SPPase-Prozessierung von Core ausübt als im Vergleich dazu die Veränderung an Position 180 (Stelle 1). Unter der Annahme, dass das reife Core-Protein mit einem Referenzpeptid von 179 AS und nicht von 182 AS wandert, ist es wahrscheinlich, dass der Helix-Bruch an Stelle 2 nicht die Spaltungsstelle für SPPase darstellt, aber entscheidend für die Prozessierung durch die Protease ist.
3. Mutation an den Signalpeptidpeptidase-Stellen im Core-E1-Signalpeptid blockiert die Bewegung von Core zu den Lipidtröpfchen
Ein definierendes Merkmal von Core-Protein in Säugerzellen nach der Prozessierung aus dem HCV-Polyprotein ist seine Assoziation mit zytoplasmatischen Lipidtröpfchen (Hope und McLauchlan, 2000, J Gen Virol, 81, 1913-1925). Um zu testen, ob die Prozessierung durch SPPase im Core-E1-Signalpeptid die Eigenschaften der Proteine in Gewebekulturzellen beeinflusste, wurden die unter Verwendung des in vitro-Systems analysierten Mutationen unter Verwendung der pSF-Reihen von Plasmiden untersucht. Die Western Blot-Analyse von Zellextrakten zeigte, dass pSF/CE1E2 und jedes der pSF/MUT-Konstrukte glykosyliertes E1 mit identischem scheinbarem Molekulargewicht erzeugte (4B, Spuren 2-5). Bei dem Endo H-Verdau der Proben besaßen die nativen Formen von E1 (4B, Spuren 6-9) ebenfalls die gleichen Mobilitäten auf Gelen. Darüber hinaus gab es kein Anzeichen dafür, dass ungespaltene Core-E1-Spezies entweder durch Core-Antikörper (Daten nicht gezeigt) oder durch E1-Antikörper (4B) detektiert werden können. Schließlich zeigte die Immunfluoreszenzanalyse keinerlei Unterschied bei der Lokalisation von E1 (Daten nicht gezeigt) und E2, das von beliebigen der Konstrukte hergestellt wurde, und dies ist konsistent mit der Assoziation mit dem ER (4A). Wir schlussfolgern aus diesen Daten, dass Mutationen die in das Signalpeptid eingeführt wurden, die Translokation und die Spaltung der HCV-Vorläufermoleküle durch Signalpeptidase nicht beeinflussen. Dies steht in Übereinstimmung mit den in vitro-Daten, die in den 1-3 präsentiert werden.
Das von pSF/CE1E2 produzierte Core-Protein kann an der Oberfläche zytoplasmatischer Lipidtröpfchen detektiert werden, indem man indirekte Immunfluoreszenz und eine spezifische Anfärbung dieser Speicherstrukturen kombiniert (5; Hope und McLauchlan, 2000, J. Gen Virol 81, 1913-1925). Eine identische Lokalisierung wurde für die Core-Spezies beobachtet, die durch pSF/MUTI hergestellt worden waren (5). Im Gegensatz dazu erzeugten die Konstrukte pSF/MUTII und pSF/MUTIII Core-Proteine, die in einem netzartigen Muster über das Zytoplasma verteilt waren, und zeigten keine Co-Lokalisation mit Lipidtröpfchen (5). Die Verteilungen dieser mutanten Formen von Core waren nicht unterscheidbar von denen für E1 und E2 (4A), was eine Lokalisierung am ER anzeigte. Die Western Blot-Analyse von Core, erzeugt von pSF/CE1E2, identifizierte ein Produkt, das mit einem 179 AS-Referenz-Coreprotein und Core-Protein, das in vitro durch SPPase erzeugt wurde, co-migrierte (3B, Wt, Spuren 1-4). Das durch pSF/MUTI hergestellte Haupt-Core-Produkt besaß außerdem eine identische Größe gegenüber dem, das durch das Wt-Konstrukt erzeugt wurde (3B, I, Spuren 1-4). Jedoch wurde eine kleine Menge von Protein mit einer Größe von 191 AS und konsistent mit einer Spaltung allein durch Signalpeptidase, ebenfall in den Zellextrakten detektiert. Dies steht in Übereinstimmung mit den in vitro-Daten, die anzeigen, dass die Prozessierung an dem Signalpeptid durch eine Mutation am AS-Rest 180 reduziert wird. Im Gegensatz dazu ergaben pSF/MUTII und pSF/MUTIII ausschließlich Core-Proteine von 191 AS, was die Prozessierung durch Signalpeptidase alleine anzeigt (3B, II und III, Spuren 1-4). Diese Daten unterstreichen, dass die Mutation an den Positionen 183 und 184 (Stelle 2) in dem Signalpeptid einen ausgeprägten inhibitorischen Effekt auf die Prozessierung durch SPPase besitzt. Wir postulieren, dass ein Inhibieren der Spaltung in der Transmembranregion des Signalpeptids die Freisetzung von Core-Protein von der ER-Membran und die nachfolgende Assoziation mit Lipidtröpfchen aufhebt.
4. Die Freisetzung von Core-Protein von dem ER erfordert die Spaltung durch SPPase
Die Lipidtröpfchen, die im Zytoplasma vorhanden sind, sind nicht an das ER gebunden und somit sollten Proteine, die an die Tröpfchen angehaftet sind, wie etwa Core nach seiner Prozessierung durch SPPase, von Membran-assoziierten Spezies abgegrenzt sein. Zusätzlich besitzen die Lipidtröpfchen-bindenden Sequenzen in Core die Fähigkeit, das Protein zum ER zu lenken, um eine Prozessierung des Signalpeptids durch Signalpeptidase und SPPase zu erlauben (Hope und McLauchlan, 2000, J. Gen. Virol. 81, 1913-1925). Jedoch sind die Lipidtröpfchen-bindenden Sequenzen in Core weniger hydrophob als diejenigen im Signalpeptid und könnten somit mit dem ER in einer von dem Signalpeptid verschiedenen Weise assoziieren. Um die relativen Eigenschaften von Wildtyp-Core und den Signalpeptidmutanten zu untersuchen, wurde die Fähigkeit bestimmt, Core-Protein in zytosolischen Fraktionen sowohl vor als auch nach der Extraktion der Membranen mit Na₂CO₃ zu detektieren. Die Resultate zeigten, dass Core-Proteine, die durch das Wildtyp-Konstrukt pSF/CE1E2 und durch pSF/MUTI erzeugt wurden, die Substrate für SPPase sind, in den zytosolischen Fraktionen nach der Abtrennung von Membranen detektiert werden konnten (6, CE1E2 und MUTI, Spuren 2). In Anbetracht der intrazellulären Verteilung des Proteins repräsentiert dies an Lipidtröpfchen angeheftetes Core-Protein. Im Gegensatz dazu waren die Core-Proteine, die sowohl durch pSF/MUTII als auch durch pSF/MUTIII produziert werden, und die nicht durch SPPase prozessiert werden, in solchen Fraktionen nicht vorhanden (6, MUTII und MUTIII, Spuren 2). Nach der Behandlung der Membranen mit Na₂CO₃ konnte ein Teil von Core, das durch pSF/CE1E2 und pSF/MUTI erzeugt wurde, extrahiert werden (6, CE1E2 und MUTI, vergleiche Spuren 4 und 5). Im Fall von pSF/MUTII und pSF/MUTIII löste Na₂CO₃ Core in keinem nennenswerten Ausmaß von den Membranen ab, und es wurde nahezu kein Protein in den Überstandfraktionen detektiert (6, MUTII und MUTIII, vergleiche Spuren 4 und 5). Da die von pSF/MUTII und pSF/MUTIII produzierten Core-Proteine allein durch Signalpeptidase gespalten werden, zeigen die Ergebnisse folglich, dass die Freisetzung von Core vom ER, die eine Assoziation mit Lipidtröpfchen erlauben soll, die Prozessierung durch SPPase erfordert. Darüber hinaus ist Core, das mit Membranen über die Lipidtröpfchen-Bindungssequenzen assoziiert ist, weniger stark an die Membranen angeheftet im Vergleich zu Core, das sowohl die Lipidtröpfchen-Bindungssequenzen als auch das Core-E1-Signalpeptid enthält.
5. Die Ablösung von der ER-Membran und der Abbau einer instabilen Form von Core wird durch die Aufhebung der Signalpeptidpeptidasespaltung inhibiert
Um zu testen, ob die Inhibition von SPPase die Freisetzung von Core von der ER-Membran verhindert, machten wir Gebrauch von Varianten von Core, denen AS zwischen den Resten 125 und 144 fehlen. Ohne diese hydrophobe Region assoziiert Core nicht mit Lipidtröpfchen und wird durch das Proteasom im Cytosol bei Freisetzung von dem Core-E1-E2-Polyprotein abgebaut (Hope und McLauchlan, 2000, J. Gen. Virol., 81, 1913-1925). Wir stellten die Hypothese auf, dass das Blockieren der Spaltung durch SPPase den Abbau reduzieren kann, da das unreife Core-Protein an der ER-Membran zurückgehalten werden würde. Folglich wurde ein Konstrukt, pSF/ MUTIII (Tabelle 1), hergestellt, dem Sequenzen zwischen den Resten 125 und 144 fehlten, und das alle drei Mutationen in der Signalsequenz aufwies. Der Vergleich der Mengenniveaus an Protein, das durch dieses Konstrukt und durch pSF/CE1E2 (ebenso wie durch pSF/CE1E2) erzeugt wurde, offenbarte keine Unterschiede bei der Menge an E1 (Daten nicht gezeigt) und E2 (7C, Spuren 1 und 3-6), das jeweils in den Zellextrakten vorhanden war. Es gab jedoch einen beträchtlichen Unterschied bei den relativen Mengen an Core-Protein. Im Fall von pSF/CE1E2 wurde Core-Protein kaum detektiert, während es bei Zellextrakten von pSF/ MUTIII (7B, Spuren 3 und 5) problemlos erkannt wurde. Um zu bestätigen, dass pSF/CE1E2 Core-Protein produzierte, wurden die Zellen in Gegenwart des Proteasominhibitors MG132 inkubiert. In Übereinstimmung mit unserer vorherigen Analyse (Ho pe und McLauchlan, 2000, J. Gen. Virol, 81, 1913-1925), wurden bei Behandlung der Zellen mit MG132 erhöhte Niveaus von durch pSF/ CE1E2 produziertem Core detektiert (7B, Spuren 3 und 4). Dieser Unterschied bei den detektierbaren Mengen von Core ist auch aus der indirekten Immunfluoreszenzanalyse ersichtlich (7A). Im Gegensatz dazu beeinflusste MG132 nicht die Menge an Core, die in Zellen beobachtet wurde, die einer Elektroporation mit pSF/ MUTIII-RNA unterzogen worden waren (7B, Spuren 5 und 6). Diese Ergebnisse stimmen mit der Spaltung von Core überein, die bei pSF/ MUTIII mit Signalpeptidase, jedoch nicht mit SPPase erfolgt, was zu einer Verankerung des unreifen Proteins an der ER-Membran führt. Das Ausbleiben der Ablösung von Core von der Membran durch SPPase katalysierte Proteolyse setzt das Protein nicht den abbauenden Prozessen aus, die auf Core einwirken, das von pSF/CE1E2 erzeugt wird.
6. Inhibition der SPPase-Aktivität durch TBL₄K
Wie oben offenbart, deckten die Daten eine Inhibition der Signalpeptidprozessierung durch SPPase-Aktivität unter Verwendung des symmetrischen Proteaseinhibitors (Z-LL)₂-Keton auf. Dies veranlasste die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu der Vorhersage, dass der Inhibitor auf den Rest der aktiven Stelle von SPPase abzielt. Um das Proteinziel zu identifizieren, solubilisierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Membranproteine aus Hundepankreas-Mikrosomen und markierten die Proteine nachfolgend mit einem Derivat von (Z-LL)₂-Keton, das als TBL₄K bezeichnet wird (8). Um zu testen, ob TBL₄K die SPPase-Aktivität inhibieren könnte, wurden Signalpeptid-Prozessierungsreaktionen mit einem Substrat, p-Prl^PP/29, durchgeführt, das einem mutierten Signalpeptid von Prä-Prolaktin entspricht, sowie mit CHAPS-solubilisierten ER-Membran-Proteinen, die SPPase-Aktivität enthalten. Die Zugabe von TBL₄K zu den Reaktionen führte zu einer progressiven Inhibition der SPPase-Aktivität, wenn die Konzentration des ersteren anstieg (IC₅₀ ~ 50 nM; 9, Spuren 3-7). Bei der höchsten verwendeten Konzentration (1 M) wurde die SPF-Produktion durch TBL₄K aufgehoben. Diese Konzentration und der IC₅₀-Wert liegen im Größenbereich der Inhibition von SPPase durch (Z-LL)₂-Keton (Weiofen of al., 2000, J. Biol. Chem., 275, 30951-30956) und zeigen an, dass die Modifikationen in TBL₄K nicht dessen Fähigkeit beeinflussen, auf SPPase abzuzielen.
7. Photo-Markierung des Proteinziels für TBL₄K
Die chemischen Eigenschaften von TBL₄K und (Z-LL)₂-Keton legen nahe, dass sie beide in reversibler Weise den Rest der aktiven Stelle der schwer greifbaren SPPase über ihre zentrale Keton-Gruppierung angreifen. Wenn jedoch eine Aktivierung mit UV-Licht (364 nm) erfolgt, so wird die Diazirin-Gruppierung von TBL₄K zu einem hochreaktiven Carben umgesetzt, das in Nanosekunden irreversibel mit seinem unmittelbaren Nachbarmolekül unabhängig von dessen chemischer Natur reagieren wird. Somit markiert TBL₄K in einer Proteinlösung bevorzugt das Protein, zu dem es eine hohe Affinität besitzt. Um das an TBL₄K gebundene Protein zu identifizieren, wurden CHAPS- solubilisierte Membranproteine mit dem Inhibitor gemischt und UV-Licht ausgesetzt. Die Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Biotin-Antikörper zur Detektion der Biotin-Gruppierung in TBL₄K offenbarte die Markierung eines Hauptprodukts von etwa 42 kDa; ein geringfügigeres Produkt mit einer etwas größeren Mobilität (~ 40 kDa) wurde ebenfalls detektiert (10, Spur 3). Um die Spezifität von TBL₄K für diese Spezies zu bestätigen, wurde (Z-LL)₂-Keton vor der UV-Aktivierung zu den Reaktionen hinzugegeben. Eine progressive Erhöhung der Konzentration von (Z-LL)₂-Keton reduzierte die Häufigkeit der mit TBL₄K markierten Proteine, und bei der höchsten Konzentration von (Z-LL)₂-Keton wurde die Markierung durch TBL₄K nahezu vollständig aufgehoben (10, Spuren 4-8). Dies zeigt, dass das hauptsächliche 42 kDa-Protein ebenso wie die geringfügigere 40 kDa-Spezies sowohl von TBL₄K als auch von (Z-LL)₂-Keton angesteuert werden. Die Behandlung mit Endoglykosidase H verschob beide Proteine in eine einzige Bande von ~38 kDa, was nahelegt, dass diese identisch, jedoch unterschiedlich glykosyliert sind (Daten nicht gezeigt).
8. Identifizierung des Proteinziels von TBL₄K
Um die 42 kDa-Spezies zu identifizieren, wurde eine Photomarkierung mit TBL₄K in einem präparativen Maßstab durchgeführt, und das markierte Protein wurde durch Chromatographie weiter gereinigt (Schema in 11 dargestellt). In jedem Stadium der Reinigung wurde die Gegenwart von TBL₄K-markiertem Protein in der jeweiligen Fraktion durch Western Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Biotin-Antikörper bestätigt. Nach der letzten Stufe der Abtrennung durch Reversphasen-HPLC zeigten die SDS-PAGE-Analyse vereinter Fraktionen, die TBL₄K-markiertes Protein enthalten, und die nachfolgende Coomassie-Färbung nur 5 gut aufgetrennte Proteine. Unter den gefärbten Banden wurde das mit TBL₄K markierte Protein durch Western Blot-Analyse identifiziert. Diese Bande wurde aus einem präparativen Gel ausgeschnitten und durch Massenspektrometrie analysiert. Es wurden Sequenzen für 6 Peptide erhalten (12), die mit den vorhergesagten translatierten Produkten in Datenbanken verglichen wurden. Mit Ausnahme von 2 AS-Resten, die in den Peptiden 2 und 4 hervorgehoben sind (12), stimmten alle Peptidsequenzen mit einem humanen Protein unbekannter Funktion überein (Zugangsnummer gi 14772424, Homo sapiens). Das vorhergesagte humane Protein (13, SEQ ID No: 1 und No: 2) enthält 7 putative Transmembranregionen, 2 N-Glykosylierungsstellen nahe dem N-Terminus (mit zwei weiteren N-Glykosylierungsstellen, für die vorhergesagt wird, dass sie in zytosolischen Schleifen liegen) und ein C-terminales ER-Auffindungs-Signal, KKEK. Zusätzlich enthält das Protein die charakteristischen Aspartyl-Protease-Motive (YD und LGLGD) in gegenüberliegenden Transmembranregionen, wie es zu finden ist in Präsenilin, der putativen γ-Sekretase, die eine Schlüsselfunktion bei der Entwicklung der Alzheimer-Krankheit besitzt.
Es wird geschlussfolgert, dass das identifizierte Protein mit SPPase identisch ist.
In Ermangelung jedweder früheren formalen Definition der Aktivität, die Signalpeptide spaltet, schlagen wir vor, dass SPPase eine mit Präsenilin verwandte, am ER lokalisierte Aspartyl-Protease ist, die die Intramembran-Proteolyse von Signalpeptiden unterstützt. Weitere Vergleiche mit Datenbanken haben angezeigt, dass es Proteine unbekannter Funktion gibt, die Sequenzidentität mit humaner SPPase besitzen und codiert werden von den Genomen von Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces pombe und Saccharomyces cerevisiae.
Dies deutet darauf hin, dass SPPase bei allen eukaryotischen Organismen konserviert ist.
9. In vitro-Bindungsassay zum Testen der Wirkungen von Kandidatenmitteln. In vitro-Synthese von HCV-Core-Pegtidpegtidase-Zielsequenzen und exogen hergestelltem rekombinantem SPPase-Protein
Konstrukte, die für die in vitro-Synthese von mRNA geeignet sind, werden hergestellt, indem man Nukleotidsequenzen, die für Core-Protein (z.B pgHCV/CE1 E2) oder irgendein ein anderes Protein mit HCV-Core-Peptidpeptidase-Zielsequenzen (z.B pgHCV CE1E2) codieren, unter die Kontrolle eines geeigneten bakteriellen oder Bakteriophagen-RNA-Polymerase-Promotors, z.B SP6 oder T7, stellt. Die RNA-Transkripte werden aus jedem dieser Konstrukte unter Verwendung von Standard-Verfahren hergestellt, und die Ausbeuten an RNA werden bestimmt. Rekombinantes SPPase-Protein kann in einer Detergens-löslichen Form erhalten werden (siehe Abschnitte 10 und 11 b in Materialien und Methoden und Abschnitt 5 in Ergebnisse).
Um in vitro translatiertes Protein zu erzeugen, wird die in vitro synthetisierte RNA zu einem Extrakt hinzugegeben, der zur Synthese von Polypeptiden befähigt ist, z.B einem Retikulozyten-Lysat, das aus Kaninchen hergestellt wird, oder einem Extrakt aus Weizenkeim; die Proteine können radioaktiv markiert werden, indem man eine Isotopen-markierte Aminosäure, wie etwa ³⁵S-Methionin, einbezieht.
Untersuchung der Bindung von Proteinen an Lipid
Aus Tierzellen hergestelltes Membranmaterial (z.B mikrosomale Membranen) oder synthetisch hergestellte Gemische von Triacylglycerol oder Cholesterol und Phospholipid werden mit den translatierten Proteinen gemischt und inkubiert. Die Lipidfraktionen werden dann durch Zentrifugation zurückgewonnen. Der Einbau von Proteinen in die Lipidfraktionen kann entweder direkt durch die SDS-PAGE radioaktiv markierter Proteine oder indirekt durch die Verwendung von Antikörpern bestimmt werden, die in Western Blot und/oder ELISA-Prozeduren funktionell sind.
Kombinationen von RNA von Core-Protein und SPPase können im gleichen Reaktionsansatz in verschiedenen Mengenverhältnissen gemischt werden, um die relative Affinität jedes Proteins für Lipid zu testen. Ein Beispiel für eine Kombination wären 9 Teile pgHCV/CE1E2-RNA mit 1 Teil SPPase-RNA.
Kandidatenmittel in Konzentrationsbereichen von z.B 1 μM bis 100 mM werden zu den Reaktionen hinzugegeben, und die Wirkung dieser Mittel auf die Proteinbindung an Lipid wird unter Verwendung der oben angegebenen Verfahren analysiert. Ein geeignetes Kandidatenmittel ist typischerweise ein Mittel, das die Lipidassoziation von Core verstärkt oder nicht wesentlich beeinträchtigt, das jedoch die Bindung von Core an SPPase reduziert oder aufhebt.
10. In vivo-Bindungstests zum Testen der Wirkungen von Kandidatenmitteln
BHK C13-Zellen werden einer Elektroporation mit SFV, das HCV Core-Protein codiert (z.B SFV.1-195) gemäß obiger Beschreibung unterzogen. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Elektroporation werden Kandidatenmittel zu den Zellen in Konzentrationen hinzu gegeben, die nicht zytotoxisch sind (wie beispielsweise an Zellen bestimmt, die einer Blind-Elektroporation unterzogen wurden). Nach der Inkubation bei 37°C werden die Zellen geerntet und Zellextrakte hergestellt. Die Extrakte werden durch Western Blot-Analyse (Antikörper JM122) analysiert, um die Häufigkeit von Core-Protein zu untersuchen und die Wirksamkeit der Spaltung an der internen Prozessierungsstelle zu bestimmen. Die relative Häufigkeit von Core-Protein in behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen könnte auch mittels ELISA quantifiziert werden.
Zusätzlich werden die Zellen fixiert und durch eine Kombination aus indirekter Immunfluoreszenz (für die Core- und SPPase-Proteine) und Oil Red-Öl-Färbung (für Lipidtröpfchen) untersucht, wie oben beschrieben. Dies kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob die intrazelluläre Verteilung und Häufigkeit von Core und SPPase durch die Anwesenheit der Kandidatenmittel verändert wurden. Die Western Blot-Analyse kann auch verwendet werden, um zu bestätigen, ob das Kandidatenmittel irgendeine Wirkung auf die SPPase-Spiegel besitzt.
Ein geeignetes Kandidatenmittel ist typischerweise ein Mittel, das die Core-Assoziation mit Tröpfchen verhindert oder reduziert, verringerte Spiegel an Core-Protein verursacht und/oder die Spaltung an der internen Prozessierungsstelle beeinträchtigt. Im Gegensatz dazu sollte das Kandidatenmittel bevorzugt die intrazelluläre Verteilung von SPPase nicht beeinflussen, und sein Vorliegen ist typischerweise entweder ähnlich oder höher als bei Zellen, die das Core-Protein nicht exprimieren.
11. Bestimmung antiviraler Wirkungen von Kandidatenmitteln in trangenen Tieren, die Core exprimieren, oder in Schimpansen
Bei transgenen Tieren, die leberspezifisches Core-Protein exprimieren, oder bei Tieren (Schimpansen), die mit HCV infiziert sind, werden Testmittel in Konzentrationen zugegeben, die für den Wirt nicht toxisch sind.
i) Transgene Tiere, die Core-Protein in einer leberspezifischen Weise exprimieren
Transgene Mäuse, die eine leberspezifische Expression von Core-Protein verwirklichen, sind in der Technik bekannt. Die Expression von Core-Protein ist mit der Entwicklung von Steatose und Leberzellkarzinom in zwei Linien solcher Tiere assoziiert (Moriya, K. et al., 1998, Nature Medicine, 4, 1065-1067; Moriya, K. of al., 1997, J Gen Virol, 78, 1527-1531); beide Pathologien sind mit HCV-Infektion assoziiert. Ähnliche transgene Mäuse können mit ähnlichen Phänotypen erzeugt werden, und verwendet werden, um die Wirkung von Mitteln zu testen, die die Core-Assoziation mit Lipidtröpfchen bei diesen pathologischen Veränderungen verhindern.
Die Wirkung von Kandidatenmitteln auf die Lokalisation von Core-Protein und dessen Spiegel können in transgenen Tieren bestimmt werden, indem man Zellen verwendet, die aus Leberbiopsien erhalten wurden, und unter Verwendung der in Beispiel 8 beschriebenen Techniken testet. Alternativ oder zusätzlich kann die Wirkung eines Kandidatenmittels auf die Entwicklung von Steatose und Leberzellkarzinom bei diesen Tieren bestimmt werden. Die Wirksamkeit von Kandidatenmitteln kann durch eine Verringerung der pathologischen Veränderungen, die auftreten, gemessen werden, z.B eine reduzierte Leber-Steatose und signifikante Verzögerungen oder eine Verhinderung des Einsetzens eines Karzinoms.
ii) Mit HCV infizierte Schimpansen
Die Wirksamkeit eines Mittels auf die HCV-Replikation bei infizierten Schimpansen wird durch die RT-PCR-Analyse von Seren bestimmt, die in regelmäßigen Intervallen bei dem Tier entnommen werden. Biopsiematerial aus der Leber kann auch auf Gegenwart negativ-strängiger HCV-RNA durch RT-PCR unter Verwendung von Standard-Techniken getestet werden (siehe Conry-Cantilena, 1997, Tibtech, 15, 71-76 für einen Übersichtsartikel und die darin enthaltenen Referenzstellen). Die Wirksamkeit des Kandidatenmittels wird getestet durch die Reduktion der Spiegel von HCV-RNA, wie in einem der beiden oder beiden Assays gemessen. Die Verringerung des Virustiters um einen Faktor von wenigstens 2 bis 3 log-Einheiten zeigt eine antivirale Wirkung an. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Identifizieren eines Kandidatenmittels, welches eine virale Infektion beeinflussen kann, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: (a) Bereitstellen einer ersten Komponente, welche eine Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz umfaßt, (b) Bereitstellen einer zweiten Komponente, welche eine Signalpeptidpeptidase umfaßt, (c) Inkontaktbringen der beiden Komponenten mit einem zu testenden Mittel unter Bedingungen, die eine Wechselwirkung der beiden Komponenten in Abwesenheit des Mittels gestatten, und (d) Bestimmen, ob das Mittel die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert, wobei die Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz von Hepatitis C-Virus-(HCV-)Core-Protein oder einem Homologen davon mit wenigstens 60% Identität dazu ableitbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Kandidatenmittel an eine Zelle verabreicht wird und wobei die Signalpeptidpeptidase-Spaltungszielsequenz in der Zelle exprimiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Signalpeptidpeptidase eine rekombinante Signalpeptidpeptidase oder ein natürlicher Bestandteil der Zelle ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, welches weiterhin folgendes umfaßt: (a) Verabreichen eines Virus an eine Zelle in Abwesenheit des Kandidatenmittels, von dem festgestellt wurde, daß es die Wechselwirkung zwischen der ersten und der zweiten Komponente moduliert, (b) Verabreichen des Virus an die Zelle in Gegenwart des Mittels und (c) Bestimmen, ob das Mittel die Anfälligkeit der Zelle für eine virale Infektion oder die Auswirkungen einer viralen Infektion reduziert oder beseitigt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz SEQ ID NO:3 des HCV-Core-Proteins oder ein Homologes davon mit wenigstens 60% Identität dazu umfaßt.
Verfahren zum Identifizieren eines Mittels zur Behandlung oder Prävention einer Hepatitis-Infektion oder einer anderen viralen Infektion der menschlichen oder tierischen Leber, wobei das Verfahren umfaßt, daß man bestimmt, ob das Mittel die Expression oder die Aktivität eines Signalpeptidpeptidaseenzyms in einer Säugerzelle modulieren kann.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zelle eine Leberzelle ist.
Proteinfragment, bestehend aus einer Signalpeptidpeptidase-Zielsequenz, wobei das Fragment aus SEQ ID NO:3 des HCV-Core-Proteins besteht oder aus SEQ ID NO:4, 5 oder 6 besteht.
Proteinfragment nach Anspruch 8 zur Verwendung bei der Prävention oder Behandlung einer viralen Infektion.
Polynukleotid, welches das Proteinfragment nach Anspruch 8 codiert, zur Verwendung bei der Behandlung einer viralen Infektion.
Verwendung des Proteinfragments nach Anspruch 8 oder des Polynukleotids nach Anspruch 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung einer viralen Infektion.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die virale Infektion eine Hepatitis-Infektion oder eine andere virale Infektion der menschlichen oder tierischen Leber ist.