WO1992003559A2 - Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen - Google Patents

Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen Download PDF

Info

Publication number
WO1992003559A2
WO1992003559A2 PCT/EP1991/001595 EP9101595W WO9203559A2 WO 1992003559 A2 WO1992003559 A2 WO 1992003559A2 EP 9101595 W EP9101595 W EP 9101595W WO 9203559 A2 WO9203559 A2 WO 9203559A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
proteinase
hrv2
proteinases
dna molecule
fragment
Prior art date
Application number
PCT/EP1991/001595
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO1992003559A3 (de
Inventor
Wolfgang Sommergruber
Hans-Dieter Liebig
Timothy Skern
Marion Luderer
Dieter Blass
Ernst KÜCHLER
Heinrich Kowalski
Ljerka Frasel
Herbert Auer
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19904027153 external-priority patent/DE4027153A1/de
Priority claimed from DE19914112952 external-priority patent/DE4112952A1/de
Application filed by Boehringer Ingelheim International Gmbh filed Critical Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority to JP91513892A priority Critical patent/JPH05506999A/ja
Publication of WO1992003559A2 publication Critical patent/WO1992003559A2/de
Publication of WO1992003559A3 publication Critical patent/WO1992003559A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22029—Picornain 2A (3.4.22.29)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to an in vivo color test system for checking the activity of viral proteases.
  • proteolytic enzymes involved in replication are highly substrate-specific and usually recognize a fission region - i.e. a structurally determined identifier - rather than a precisely defined amino acid pair, as is usually used as a recognition sequence.
  • a general overview of this topic is given by H.G. Herbal and ⁇ . Wimmer (1988, Ann. Rev. Biochem. 52, 701-751) and Kay, J. and Dünn, B.M. (1990, Biochim. Biophys. Acta 1048. 1-18).
  • the viral proteinases represent a good therapeutic target due to their substrate specificity and their catalytic mechanism (Johnston, MI et al., 1989, Trends Pharmacol. Sci. 10. 305-307).
  • Rous Sarcoma virus Leis, J. et al., 1990, ASM-News üü, 77-81
  • HIV I HIV I
  • it is possible to use computer-assisted molecular "designing" of highly specific inhibitors to perform (Meek, TD et al., 1990, Nature 343, 90-92).
  • Specific proteinase inhibitors could thus represent new antiviral substances which are directed, for example, against viruses, against which the development of a vaccine is not possible for purely technical reasons; For example, well over 115 serotypes which do not cross-react with one another are currently known in rhinoviruses, of which 90 have already been classified as defined serotypes (Cooney, MK et al., 1982, Infect. Immun. 22.642-647).
  • the substrate specificity of the viral enzymes could be analyzed in more detail by means of detailed studies such as point mutation analyzes, cleavage of peptide substrates "in vitro” and amino acid sequencing of the native cleavage products. It turned out that, as already mentioned above, it is less the gap point itself and a few positions “up” or “downstream” that play a major role in the gap point detection. However, that sequence heterogeneity of the cleavage signals or their immediate surroundings leads to a kind of "hierarchy" of the cleavage events in the polyprotein (Krausslich, HG et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. 86. 807-811; Pichuantes, S .
  • the variation of the individual cleavage regions in the polyprotein thus allows a precisely determined sequence from kinetically "favorable” to kinetically “unfavorable” cleavages, which subsequently enables differentiated proteolysis of the individual cleavage products.
  • the principle of recognizing a specific secondary structure in the region of the cleavage site is not limited to picornaviruses, but should represent a general principle of viral proteinases. These properties are, for example, in the adenovirus system (Webster, A. et al., 1989, J. Gen. Virol. 7_ ⁇ , 3225-3234; Webster, A. et al., 1989, J.
  • Rhinovirus infections are among the most common human diseases. Although the disease is usually harmless, secondary infections by other viruses or bacteria can occur due to a temporary weakening of the organism, which can then lead to serious illnesses.
  • RNA of the rhinoviruses is modified shortly after infection by cleavage of the oligopeptide VPg bound to the 5 'end and subsequently serves as mRNA for the synthesis of a polyprotein which encompasses the entire continuous reading frame of the nucleic acid sequence (Butterworth, BE, 1973, Virology 5ji / 439-453; Mc Lean, C. and Rueckert, RR, 1973, J. Virol. H, 341-344; Mc Lean, C. et al., 1976, J. Virol. £ 1 , 903-914; Agol, Vl, 1980, Prog. Med.
  • the primary cleavage separation of the capsid precursors from the growing polypeptide chain; 2.) the secondary cleavage: processing structural and non-structural precursor proteins and 3.) the maturation cleavage of the capsid.
  • the first step thus serves to cleave off the precursor of the envelope proteins and (in the case of entero and rhinoviruses) is carried out autocatalytically by proteinase 2A (“cis” activity).
  • proteinase 2A (“cis” activity).
  • sequence of proteinase 2A (hereinafter referred to as 2A) lies immediately behind the section coding for the envelope proteins. 2A is the first because of its location in the polyprotein detectable enzymatic function of the virus. The separation of the coat protein region from the section responsible for replication takes place during the translation of the polyprotein "into statu nascendi".
  • this primary cleavage at the P1-P2 region can be carried out intermolecularly, ie "in trans" by the mature proteinase 2A (Krausslich, HG and Wimmer, E., 1988, loc. Cit.).
  • the cleavage signal which is recognized by proteinase 2A, was determined on the one hand by direct amino acid sequence analysis of the N-terminus of 2A and / or the C-terminus of VP1, or on the other hand derived by comparing the primary structure on the basis of homology studies. This is a Tyr / Gly- in Polio (Pallansch, MA et al., 1984, J.
  • the course of infection in Picornaviruses depends crucially on the viral enzymes. Since these enzymes are particularly well preserved and their properties are very similar in the case of various rhinoviruses, they offer themselves as the target of a chemotherapeutic intervention, such as B. the viral enzyme 2A.
  • the chemotherapeutic approach is the inhibition of enzymatic activity by specific inhibitors. If the first proteolytic activity, 2A activity, is inhibited, any further maturation process of the viral system is prevented.
  • the 2A region of HRV2 shows pronounced homology not only with other rhinoviruses, but also with representatives of other groups of the Picornaviridae.
  • An inhibitor against HRV2 2A could therefore also be applicable to other Picornaviruses.
  • HIV I human immunodeficiency virus 1
  • deletion and point mutations in the proteinase region of this type of retroviruses the essential role of the proteinase in the maturation of this virus class could be recognized (Katoh, I. et al., 1985, Virol. 145 280-292; Kohl, NE et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85. 4686-4690; Crowford, S. and Goff, SP, 1985, J. Virol. 53, 899-907).
  • X-ray structure analyzes and molecular biological studies have also shown that the proteinase of HIV I belongs to the Asp type, can process itself on the precursor protein (also in recombinant prokaryotic systems), can cleave "into trans” specifically peptides and as an active proteinase in one homodimeric form (Navia, MA et al., 1989, loc. cit .; Meek, TD et al., 1989, loc. cit .; Katoh, I. et al., 1985, loc. cit.).
  • inorganic and organic compounds as well as peptide derivatives and proteins are known in the picornaviral system, which have an inhibitory effect on the proteolytic processing of these viruses.
  • the effect of these substances is based on the direct interaction with the proteinases (Kettner, CA et al., 1987, US Pat. No. 4,652,552; Korant, BD et al., 1986, J. Cell. Biochem. 22., 91-95 ) and / or by the indirect way of interaction with substrates of these proteinases (Geist, FC et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother.
  • Picornaviral proteases expand the understanding of the structure and function of these viral enzymes and thus enable step-by-step rational "designing" - starting from modified peptide substrates - up to highly specific and non-toxic peptidomimetics.
  • the object of the present invention was to provide such test systems.
  • the bacteriophage M13mpl8 (Yanish-Perron, C. et al., 1985, Gene 22, 103-119) - or also other M13 phages from the mp series - contains in its genome the gene segment for the amino-terminal part of the ⁇ -galactosidase from E. .coli.
  • the expression of this gene fragment which is under the control of the promoter of the lac operon, leads to a polypeptide, called ⁇ -fragment, which contains the first 146 amino acids of the ⁇ -galactosidase. This polypeptide is inactive.
  • ⁇ -fragment which contains the first 146 amino acids of the ⁇ -galactosidase. This polypeptide is inactive.
  • E.coli bacterial strains that can be infected by the M13 phages, for example the E.coli JM strains, in particular E.coli JM 101 and E.coli JM 109, also contain an inactive form of the ⁇ -galactosidase called ⁇ M15.
  • the ⁇ -galactosidase lacks amino acids 11-41 here. If these E.
  • coli bacteria which form the inactive ⁇ -galactosidase, are infected with M13 phages and both the expression of the host-coded, inactive ⁇ -galactosidase and the expression of the phage-coded, inactive ⁇ -galactosidase are induced via isopropylthiogalactoside (IPTG), the two inactive forms of the ⁇ -galactosidase can complement each other.
  • IPTG isopropylthiogalactoside
  • An active ⁇ -galactosidase is formed, which can either cleave its natural substrate, lactose or allolactose, or a synthetic substrate, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactopyranoside (X-Gal), whose cleavage product, an indoxyl derivative, is oxidized under the influence of 0 to the blue 5,5'-dibromo-4,4'-dichloroindigo.
  • the bacteria in which the two inactive forms of ß-galactosidase complement each other to form an active enzyme appear to be stained blue and can be easily distinguished from those bacteria in which no so-called ⁇ complementation, i.e.
  • the activities of the HRV-2A proteinase and also other proteinases preferably the 3C proteinases of the picornaviruses and the HIV proteinase, can be measured.
  • the recognition sites required for inserting these proteinases into the test system can be created, for example, by inserting the recognition sequence 5'GTCGAC3 'into the DNA section of the ⁇ -fragment of the ⁇ -galactosidase.
  • This recognition sequence is recognized by 3 different restriction endonucleases (Sall, Hindi, AccI), which cut differently. In this way, the appropriate reading frame can be selected individually for each desired proteinase.
  • Another possibility of checking the activity of the HRV2-2A in particular is to use modified vectors in connection with the polyclonal antiserum against the peptide PC20 (Sommergruber, W. et al, 1989, loc. Cit.).
  • the expression product of the pure 2A proteinase gene can be recognized by the polyclonal antiserum.
  • Examples 1-5 show that the M13 color test system can be used to distinguish between active and inactive 2A proteinase molecules. This system should also be suitable for making this distinction in a large number of cases to examine clones quickly and meaningfully.
  • the genome of the phage M13-2A (Example 5), the region which codes for the C-terminus of VP1 and for the 2A proteinase, was mutagenized in vitro. The mutagenesis was carried out with the aid of the polymerase chain reaction (PCR), since it is known that the Taq DNA polymerase makes errors relatively frequently because it has no "proofreading" activity (Leung, DW et al., 1989, Technique. A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology. 1, 11-15).
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR amplification was carried out according to standard methods (Torgersen et al., 1989, J. Gen. Virol., 70, 3111-3116).
  • the mutated DNA fragments thus obtained were transformed into E. coli. Around 1000 plaques were checked for their ability to complement ⁇ . 30 different plaques were analyzed in more detail.
  • the 2A gene of phages from the fourth light blue plaque shows only one silent mutation; since a free 2A is found in the immunoblot ( Figure 13B; H3), it is likely that a mutation in another area of the ⁇ -complementation system could be responsible for the reduced ⁇ -complementation. In fact, a point mutation was found in the Lac promoter region.
  • the analysis of 17 further phage genomes after PCR mutagenesis is described in Example 9; the associated immunoblots are shown in FIG. 19 and the mutations in the 2A genes in FIG. 20. Table 2 summarizes the results. All phage genomes derived from M13 phages from five examined colorless plaques show mutations in their VP1 / 2A regions.
  • a phage genome shows a nucleotide exchange that converts an amino acid codon into a stop codon, and two genomes have deletions in the 2A gene that lead to a loss of the reading frame for the 2A gene.
  • the M13 color test system can be used to distinguish inactive mutants from active proteinases, in this case the 2A proteinase from HRV2.
  • individual regions of the proteinase gene can be selected separately by selecting the oligonucleotides for the amplification; for example, one could only amplify the cleavage site or only the region coding for the catalytic center.
  • the system can also be used to regenerate an active form from an inactive proteinase by in vitro mutagenesis.
  • Examples 1 to 7 as well as 9 and 10 describe the M13 color test system as a method with which the so-called "ice” or intramolecular cleavage of the 2A proteinase can be studied.
  • the 2A proteinases of the polio and rhinoviruses also cleave a host protein; this reaction, which therefore takes place intermolecularly or in "trans", indirectly leads to the cleavage of the p220 protein and thereby to the inhibition of the translation of the host's own mRNAs provided with a so-called "cap” structure. Since neither the mechanism of this cleavage nor the amino acid pair that is cleaved are known, it is of interest to develop a system that can be used to study this intermolecular cleavage.
  • Such a system should also be used to test the effectiveness of inhibitors that prevent intermolecular cleavage.
  • the difference between the two cleavage processes can be seen in FIG. 15.
  • the M13 color test system was modified to allow an investigation of the intermolecular cleavage.
  • three phage constructs were created, which were named M13 / ⁇ lacZ2A, M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B and M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly.
  • the constructs M13 / ⁇ lacZ2A and M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B contain an active 2A proteinase while the construct M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly contains one contains inactive 2A proteinase.
  • the plasmid pBR2A ⁇ was constructed, which after transformation into E.
  • coli and induction of the expression block with IPTG results in a lacZ / ⁇ VPl / ⁇ 2A / 8F5 fusion protein.
  • substrate-providing plasmids are those which, after transformation into E. coli and induction of the expression block, result in a fusion protein from the so-called ⁇ -fragment and a polypeptide fraction which can be cleaved from an active proteinase in trans.
  • a plasmid is also to be used which results in a fusion protein lacZ / ⁇ VPl / ⁇ 2A, lacZ / ⁇ VPl / 2A (R134: Q) ⁇ 2B or lacZ / ⁇ VPl / ⁇ 2A ( ⁇ 3Gly).
  • the fusion proteins should also be used as such to investigate the trans activity.
  • the genomic DNA of the three above-mentioned phage constructions was transformed in the presence of IPTG and X-gal into E. coli JM101 bacteria which have the plasmid pBR / 2A ⁇ .
  • the resulting plaques are shown in FIG. 17. It can clearly be seen that those from the bacteriophages M13 / ⁇ lacZ2A and M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B plaques formed are dark blue; in contrast, the plaques formed by the bacteriophage M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly are colorless.
  • Figure 18 A shows an immunoblot with the 8F5 antibody.
  • a band of 26 kDa is visible in the protein extracts from bacteria that either have only the plasmid ⁇ BR2A ⁇ (lane 2) or have additionally been infected with the inactive variant M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly (lane 5), ie with M13 phages from colorless plaques ; in contrast, the extracts from bacteria infected with an active variant (ie with M13 phage from blue plaques) have an additional band of 20 kDa (lanes 3 and 4).
  • the 26 kDa band arises from the amino acids of the ⁇ fragment, ⁇ VP1, ⁇ 2A and the 8F5 binding site ( ⁇ VP2); the 20 kDa band arises from the 26 kDa band when an active 2A molecule processes the 2A cleavage site and thereby cleaves the ⁇ -fragment and the amino acids of ⁇ VP1.
  • the antiserum PC20 was used to check whether an active 2A molecule was found in the induced fusion proteins of blue plaques.
  • a band of 18 kDa was detected in proteins from a colorless plaque (ie of the variant M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly), which is a fusion protein from the remaining 8 amino acids of the ⁇ fragment, the 28 w amino acids of ⁇ VP1 and corresponds to the 142 amino acids of Figure 2A.
  • a band of 15 kDa which corresponds to a free 2A protease, was found in the induced fusion proteins of blue plaques (ie of the variant M13 / ⁇ lacZ2A). No signal was found with the construction M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B, since the antiserum only recognizes a 2A molecule that has a free C-terminus.
  • a system was developed with which the proteolytic "trans" activity of 2A proteinase from bacterial extracts can also be checked in vitro.
  • a plasmid was constructed from a rabbit ⁇ -globin sequence and an HRV2 sequence, with which any DNA fragment can be transcribed and translated in vitro.
  • HRV2 and HRV14 was expressed, which corresponds to the region ⁇ VPl / ⁇ 2A and ⁇ VP3 / VP1 / ⁇ 2A, respectively.
  • the translation product of HRV2 VP1 / ⁇ 2A could be cleaved with bacterial extracts of M13-2A or pBR2A / l and pBR2A / 2, which express a mature 2A.
  • no cleavage was found in bacterial extracts with M13-2A ⁇ 3Gly or pBR2A ⁇ that do not express a mature 2A protein.
  • This system can therefore be used to check the presence of active 2A molecules in bacterial extracts.
  • No cleavage of the HRV14 ⁇ VP3 / VP1 / ⁇ 2A region from bacterial extracts with HRV2 2A was found. It was concluded that the specificity of the
  • Color test system can surprisingly be used to intermolecular cleavage
  • the invention relates in detail to the vectors characterized in the claims, the DNA molecules, the fusion proteins, the host organisms transformed with the vectors and the use of the vectors and the fusion proteins as test systems.
  • Effective inhibitors of viral proteinase activity influence the ⁇ -complementation more or less strongly when using the in vivo color test systems according to the invention, which is shown by more or less strongly colored bacteria.
  • Figure 1 shows the construction of M13-18521R and M13-18521Q.
  • Figure 2 shows the extent of ⁇ complementation with M13-18521R and M13-18521Q.
  • FIG. 3 shows the construction of M13-I-18521R and M13-I-18521Q as well as M13-I-18521R-MluI and M13-I-18521Q-M1UI.
  • FIG. 4 shows the mutation oligonucleotides used.
  • Figure 5 shows the extent of ⁇ complementation of M13-18521Q and of the return mutants to M13-18521R.
  • the arrow with the letter Q indicates a "plaque” with M13-18521Q phage and the arrow with the letter R indicates a "plaque” with M13-18521R phage.
  • FIG. 6 shows the extent of the ⁇ complementation after introduction of the Sall cleavage at amino acid position 44/45 of the ⁇ -galactosidase in M13-I-18521R-MluI (A) and M13-I-18521Q-MluI (B) and after introduction at amino acid position 42/43 at M13-I-18521R-MluI (C) and M13-I-18521Q-MluI (D).
  • Figure 7 shows the construction of M13-I-18521R-MluI / SalI and M13-I-18521Q-MluI / SalI once for (44/45) and (42/43).
  • Figure 8 shows the construction of M13-2A and M13- ⁇ 3Gly.
  • FIG. 9 shows the immunoblot of a 15% denaturing protein gel with induced 2A proteinase from various M13 clones.
  • the 2A proteinase is detected via the polyclonal antiserum against the peptide PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. Cit.)
  • Lane 1.4 * induced 2A proteinase from M13-2A
  • Lane 2 induced 2A proteinase from M13- ⁇ 3Gly
  • Lane 3.5 induced 2A proteinase from M13-I-18521R-Mlul / Sall
  • the numbers (unit: kilodalton) with a small arrow indicate selected molecular size markers.
  • the numbers (unit: kilodalton) with a large arrow indicate the processed, active 2A proteinase (15) and - the unprocessed, inactive 2A proteinase (24).
  • the 2A proteinase from M13-I-18521R-MluI / SalI has no free carboxy terminus and is therefore not recognized by the anti-PC20.
  • FIG. 10 schematically shows the creation of restriction enzyme recognition sites around the cleavage site of HRV2-2A and in the coding part of HRV2-2A.
  • Restriction enzymes that are not printed in bold represent the recognition sequences originally present in pEx2A; Framed in bold print indicate the newly introduced detection sequences in p ⁇ x2A / 21 and pEx2A / II.
  • AS means amino acids.
  • FIG. 11 shows the double-stranded oligonucleotide for the production of pEx2A / 21, a restriction-modified variant of pEx2A.
  • the oligonucleotide is flanked by an Acc I or a Bst ⁇ II site; the restriction sites in bold were introduced into the DNA with the aid of the modified nucleotide sequence of the mutation oligo while maintaining the original amino acid sequence.
  • FIG. 12 shows the PCR amplification oligonucleotides used (1987: 5 • GTTACCCAACTTAATCG3 'and 1988: 5'GTTACGTTGGTGTAGATG3') and their position on the genome of the phage M13-2A.
  • Figure 13 shows immunoblots of phage expression proteins from 30 selected plaques.
  • the proteins induced with IPTG were separated on 15% denaturing polyacryamide gels; the resulting blots were incubated with the antiserum against the peptide PC20 (Sommergruber, W., et al., 1989, loc. cit.).
  • part A the IPTG-induced proteins from 20 phages that showed colorless plaques were examined.
  • the closed arrow indicates the position of the band that corresponds to a fusion protein from the ⁇ fragment and an inactive 2A molecule (24 kD), the open arrow indicates the position of the mature 2A molecule (15 kD).
  • the ⁇ -fragment / inactive 2A fusion protein can be seen in 15 of the 20 proteins. No fusion protein of this size can be seen in samples W1, W5, W12, W17 and W18; these samples are deletion mutants (WI, W5, W12, W17) or mutants (W18) that have an early stop codon. In such cases, the amino acid sequence recognized by the PC20 antiserum is not translated.
  • Figure 14 shows the amino acid changes found by DNA analysis of the mutants.
  • Part A shows the amino acid exchanges that can be attributed to a single nucleotide exchange in the bacteriophage genome.
  • the exchanges were found in the genomes of bacteriophages, which were derived as follows: blue plaques, closed circles; light blue plaques, crossed circles; colorless plaques, open circles.
  • Part B shows the amino acid exchanges based on multiple nucleotide exchanges in the phage genome.
  • Mutant 1 gave blue plaques, all other phage mutants led to colorless plaques.
  • the individual mutations are: mutant 1, Met 5: Val and Ile 127: Arg; Mutant 2, Ile-4: Väl and Phe 130: Ser; Mutant 3, His 8: Tyr and Lys 109: Glu; Mutant 4, Ile 28: Thr and Cys 112: Arg; Mutant 5, Asn 65: His and His 114: Arg; Mutant 6, Ile 70: Thr and Gly 99: Ser; Mutant 7, Cys 106: Arg and Lys 109: Glu; Mutant 8, Val 7: Ala, Glu 102: Gly and Phe 130: Ser.
  • Figure 15 shows the difference between intramolecular cleavage (in “ice”) and intermolecular cleavage (in “intra-trans”).
  • the ⁇ fragment is shown as a black block and the active proteinase as an open block; an inactive proteinase is shown with a block filled with slashes. Proteinase cleavage sites are identified by a thick black line.
  • FIG. 16 shows the constructions M13 / ⁇ lacZ2A, M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B, M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly and pBR2A ⁇ as used for the investigation of the intermolecular cleavage.
  • the manufacture of the four constructions is described in detail in the text.
  • E. coli JM101 bacteria in which the plasmid pBR2A ⁇ had previously been introduced were transfected with the construction M13 / ⁇ lacZ2A or M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B, ⁇ -complementation could be observed. These are marked with a plus. However, no ⁇ complementation was found after transfection with the construction M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly, characterized by - signs.
  • FIG. 17A shows the extent of ⁇ complementation in E. coli JM101 without pBR2A ⁇ (pictures 1 and 4) and with pBR2A ⁇ (pictures 2 and 3) after transfection with:
  • FIG. 17B shows the extent of ⁇ complementation in E. coli JM101 with pBR2A ⁇ after transfection with:
  • Image 1 M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B
  • Image 2 M13 / ⁇ lacZ2A
  • Image 3 M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly
  • FIG. 18 shows the immunoblot of two 15% denaturing polyacryamide gels, on which the proteins induced with IPTG from JM101 cells are separated.
  • Immunoblot A was incubated with the antibody anti 8F5 (Skern et al, J. Gen. Virol., 68, 315-323, 1987), immunoblot B with the antiserum against the peptide PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit).
  • Lane 1 E. coli JM101 bacteria without plasmid
  • Lane 2 E. coli JM101 bacteria with pBR2A ⁇
  • Lane 3 E. coli JM101 bacteria with pBR2A ⁇ transfected with M13 / ⁇ lacZ2A
  • Lane 4 E. coli JM101 bacteria with pBR2A ⁇ transfected with M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B
  • Lane 5 E. coli JM101 bacteria with pBR2A ⁇ transfected with M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly
  • the numbers on the left indicate the proteins expressed by pBR2A ⁇ : the processed ⁇ 2A / ⁇ VP2-8F5 substrate (20) and the unprocessed lacZ / ⁇ VPl / ⁇ 2A / ⁇ 2B-8F5 substrate (26 ).
  • the numbers on the right indicate the processed, active 2A proteinase (15) and the unprocessed, inactive 2A proteinase (18).
  • the 2A proteinase of the construction M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B has no free carboxy terminus and is therefore not recognized by the anti-PC20.
  • Figure 19 shows immunoblots of phage expression proteins from the 17 plaques selected in Example 9. The proteins induced with IPTG were separated on 15% denaturing polyacrylamide gels; the resulting blots were incubated with the antiserum against the peptide PC20 (W. Sommergruber, loc. cit.).
  • the closed arrow indicates the position of the band, which corresponds to a fusion protein from the ⁇ fragment and an inactive 2A molecule (24 kD).
  • the open arrow indicates the position of the mature 2A molecule (15 kD).
  • Part A shows the proteins of 5 M13 phages induced with IPTG, which cause colorless plaques.
  • the ⁇ -fragment / inactive 2A fusion protein can be seen in samples W21 and W28 (closed arrow). No fusion protein of this size can be seen in samples W24, W29 and W30; these are deletion herbants or mutants that have an early stop codon. In such cases, the amino acid sequence recognized by the PC20 antiserum is not translated.
  • Part B shows the phage proteins induced with IPTG from 7 different light blue plaques. Only the ⁇ -fragment / inactive 2A fusion protein is visible in five of the seven proteins. No fusion protein of this size can be seen in samples H15 and H16; these samples are deletion mutants or mutants that have an early stop codon. For samples H6, H7, H9, H13 and H14 only one ⁇ fragment / inactive 2A fusion protein found. In these cases it is assumed that enough ⁇ -fragment is released to be able to detect an ⁇ -complementation, but the amount of mature proteinase 2A is below the detection limit of the immunoblot.
  • Part C shows the IPTG-induced phage progeny proteins from 5 different blue plaques. A mature 2A molecule is detected in all cases.
  • Figure 20 shows the amino acid changes found by DNA analysis of the mutants.
  • Part A shows the amino acid exchanges that can be attributed to a single nucleotide exchange in the bacteriophage genome.
  • the bacteriophage genomes are symbolized as follows: closed circles, phage genomes from blue plaques; crossed circles, phage genomes of light blue plaques; open circles, white plaques.
  • Part B shows the amino acid exchanges based on multiple nucleotide exchanges in the phage genome.
  • the individual mutations are: Mutant 1, Glyl: Ala and Ile 96: Thr; Mutant 2, Gly97: Val and Ilell9: Val. Both mutants gave light blue plaques.
  • Part C shows the amino acid exchanges that can be traced back to a single nucleotide exchange in the bacterophage genome and which reactivate the mutant Phel30: Tyr. All revertants have a blue phenotype.
  • FIG. 21 shows immunoblots of expression proteins from phages from 4 of those described in Example 10 Plaques.
  • the proteins induced with IPTG were separated on 15% denaturing polyacryamide gels; the resulting blots were incubated with the antiserum against the peptide PC20 (W. Sommergruber, loc. cit.).
  • the closed arrow indicates the position of the band, which corresponds to a fusion protein of the ⁇ fragment and an inactive 2A molecule (24 kD), the open arrow indicates the position of the mature 2A molecule (15 kD).
  • Phel30 Tyr
  • a mature 2A molecule was detected in the expressed proteins of the three revertants, which cause reactivation of 2A.
  • FIG. 22 shows a schematic representation of the HRV2 genome and a summary of the rabbit ⁇ -globin 5 * UTR / HRV2 hybrids described in the text.
  • the open rhombus represents the 5 'UTR of rabbit ß-globin and the closed arrows the ATG codons at 449 and 611.
  • the black block represents the translated region of HRV2; the block filled with oblique lines represents the additional translatable section that results from the initiation of translation at ATG codon 449.
  • S shows the promoter of T7 RNA polymerase.
  • Figure 23 shows the constructions GR1, GR2, GR5 and GR6.
  • the following restriction sites are given: A, AccI; B, BamHI; H, HincII; H3, Hindlll; N, Ncol; P, PstI; RI, Eco RI; RV, EcoRV; Sa, Sall; Sm, Smal.
  • the other symbols are identical to those in FIG. 22.
  • the first and last nucleotides of the respective HRV2 cDNA insert are given.
  • Figure 24 shows the oligonucleotides used.
  • Figure 25 shows constructions pß + 611 and pß-611.
  • the nucleotide sequence of the rabbit ⁇ -globin 5 'UTR in the positive orientation (pß + 611; Fig. 25A) and in the negative orientation (pß-611; Fig. 25 B) as well as the first two codons of VP4 of HRV2 are shown.
  • the other symbols are identical to those in FIG. 22.
  • Figure 26 shows constructions p20, pl, pß + 449 and pß-449.
  • the plasmid p20 is shown in part Ai; the nucleotide sequence of the rabbit ⁇ -globin 5 'UTR (open rhombus) is in the positive orientation (the sequence is identical to that of pß + 611 in Figure 25). The first 15 codons resulting from the initiation of translation at ATG codon 449 are shown. Part Aii shows the introduction of the 1.0 kb PstI fragment of GR6 in ⁇ 20; this results in the plasmid pß + 449.
  • the plasmid pl is shown in part Bi; the nucleotide sequence of the rabbit ⁇ -globin 5 'UTR (open rhombus) is in the negative orientation (the sequence is identical to that of pß-611 in Figure 25). The first 15 codons resulting from the initiation of translation at ATG codon 449 are shown. Part Bii shows the introduction of the 1.0 kb PstI fragment from GR6 in pl; this results in the plasmid pß-449.
  • Figure 27 shows the fluorogram of a 12.5% protein gel with translation products of RNAs of the four plasmids pß + 449, pß-449, pß + 611 and pß-611.
  • Lane C is the result of a translation without the addition of RNA.
  • the numbers (unit: kilodalton) indicate selected molecular markers.
  • the open arrow indicates the 35 kD translation product from ATG codon 449 and the closed arrow indicates the 30 kD translation product from ATG codon 611.
  • 8F5 the result of an immunoprecipitation of the translation products of pß + 611 RNA with the antibody 8F5 is shown; the 39kD gang was specifically felled.
  • Figure 28 shows the fluorogram of a 12.5% protein gel with translation products of RNAs of the two plasmids pßHRV14 / sub (lane 1) and pßHRV2 / sub (lane 2).
  • Track C shows the result of a translation without the addition of RNA.
  • the numbers on the left indicate selected molecular markers.
  • the open arrow points to the 40 kD translation product of the RNA of pßHRV2 / sub and the closed arrow to the 66 kD translation product of the RNA of pßHRV14 / sub.
  • Figure 29 shows fluorograms of three 12.5% protein gels with translation products of RNAs of the two plasmids pßHRV2 / sub and pßHRV14 / sub after incubation with bacterial extracts.
  • Part A shows the fluorogram the result of the incubation of the translation product of the RNA of pßHRV2 / sub with the following bacterial extracts: lane 1, no incubation; Lane 2, M13-2A; Lane 3, M13-2A ⁇ 3Giy; Lane 4, plasmid pBR2A / l; Lane 5, plasmid PBR2A / 2; Lane 6, plasmid pBR2A ⁇ .
  • the left numbers (unit: kilodalton) show selected molecular markers.
  • the closed one Arrow indicates the 40 kD translation product from the RNA of pßHRV2 / sub; the arrow marked S indicates the 32 kD cleavage product and the arrow marked SE indicates the 30 kD cleavage product. These cleavage products can only be detected after incubation with extracts containing an active 2A proteinase.
  • Part Bi shows an immunoblot of expression proteins from extracts precipitated with ammonium sulphate in Example 11.
  • the proteins were separated on 15% denaturing polyacryamide gels; the resulting blots were incubated with the antiserum against the peptide PC20 (W. Sommergruber, loc. cit).
  • the extracts are as follows: Lane 1, M13-2A; Lane 2, pBR2A / l; Lane 3, PBR2A / 2.
  • the numbers on the left indicate selected molecular size markers.
  • the open arrow indicates the position of the mature 2A molecule (15 kD).
  • Part Bii shows the fluorogram of the products of the incubation of the translation product of the RNA of pßHRV2 / sub with the following bacterial extracts: lane 1, no incubation; Lane 2, M13-2A; Lane 3, pBR2A / l; Lane 4, pBR2A / 2.
  • the right numbers indicate selected molecular markers.
  • the closed arrow shows the 40 kD translation product of the RNA of pßHRV2 / sub; the arrow marked with S the 32 kD fission product. The 30 kD fission product is no longer visible.
  • the fluorogram of the products of the incubation of the translation product of the RNA of pßHRV14 / sub shows with the following bacterial extracts. Lane 1, M13-2A; Lane 2, pBR2A / l; Lane 3, pBR2A / 2.
  • the left numbers show selected molecular markers.
  • the closed arrow points to the 66 kD translation product from the RNA of pßHRV14 / sub. No cleavage is evident after incubation with the three extracts.
  • Example 1 Development of an in vivo color test system for checking the cis activity of 2A proteinase from HRV2
  • the circular, double-stranded (RF) form of the bacteriophage genome M13mpl8 was linearized by the restriction endonuclease Pvul and the overhanging 3 'ends were removed with S1 nuclease.
  • pExl8521 and pExl8521Q are mutant of p ⁇ xl8521, whereby the triplet for Argl34 was replaced by a triplet for gin
  • an AccI- was Fragment isolated and the AccI ends filled with DNA polymerase I (Klenow enzyme).
  • the AccI fragment from pExl8521 contains the information for the last 28 carboxy-terminal amino acids of 1D (VP1), for the entire 2A proteinase, for the first 39 amino-terminal amino acids of 2B and for 19 plasmid-encoded amino acids (FIG. 1).
  • the AccI fragment from pExl8521Q contains the same information, only two nucleotide exchanges have been carried out in the gene of 2A proteinase. Codon AGA, which codes for the amino acid arginine at position 134 in FIG. 2A, has been replaced by CAA, which codes for glutamine. This amino acid exchange inactivates 2A.
  • the respective AccI fragments were ligated with the linearized M13 DNA using standard methods and transformed into E.
  • JL, 309-321) showed that after the triplet for the 45th amino acid of ⁇ -galactosidase in the same reading frame, the codons for the 28 carboxy-terminal amino acids of VP1 follow, followed by the nucleotide sequence for 2A, for the amino terminus of 2B and for the plasmid-coded amino acids (the numbering of the amino acids of the ⁇ -galactosidase does not take into account the amino acids which are encoded by the multilinker region in the coding region of the ⁇ -galactosidase).
  • the phage progeny whose recombinant genome contains the active 2A proteinase gene from pExl8521, show a clearly visible ⁇ complementation in the presence of IPTG and X-Gal. In comparison, the ability for ⁇ complementation in phage progeny with an inactive 2A proteinase from ⁇ Exl8521Q is reduced (FIG. 2).
  • the amino acids of the ⁇ fragment should remain fused to the 28 amino acid carboxy terminus of VP1; in the case of the inactive proteinase, an additional 200 amino acids from 2A, 2B and parts of the plasmid should follow, since the inactive proteinase cannot be released via a cleavage at its amino terminus.
  • the 228 amino acid long polypeptide chain remaining on the ⁇ fragment therefore leads to a reduction in ⁇ complementation.
  • the phages that can form an active 2A proteinase are called M13-18521R, and those that form an inactive proteinase are called M13-18521Q.
  • lacZ / ⁇ VPl / 2A / ⁇ 2B lacZ / ⁇ VPl / 2A (R134: Q) / ⁇ 2B.
  • Example 2 Creation of singular interfaces in the vicinity of the 2A gene
  • FIG. 5 shows the difference in the ⁇ complementation between inactive proteinase and proteinase which is active again by back mutation.
  • Figure 2 in Example 1 shows that the ⁇ -fragment from phages M13-18521Q is still able to convert X-Gal to a certain extent even after fusion with an inactive 2A.
  • the singular nucleotide sequence 5'GTCGAC3 ' was introduced in M13-I-18521R-Mlul and M13-I-18521Q-MluI by directed mutagenesis (FIG. 4), which is from the isoschizomers Sall, AccI and HincII and Hindll is recognized. This recognition sequence was used at two different positions: 1.
  • the codon sequence ACC GAT which codes for the 44th and 45th amino acid of the ⁇ -galactosidase, was converted into ACG TCG. This made the 45th Amino acid of ß-galactosidase changed from aspartic acid to serine.
  • the base sequence AC from the next codon ACT completes the sequence 5'GTCGAC3 '.
  • Figure 6 shows that the ability to complement ⁇ is not affected by this mutation.
  • the introduction of the recognition sequence 5'GTCGAC3 ' also offers the possibility of fusing other cis-active proteinases, such as 3C proteinases from Picornaviruses or the HIV proteinase, at this point with the ⁇ -fragment of the ⁇ -galactosidase, since this recognition sequence is different from 3 different ones Restriction endonucleases are recognized that cut differently. In this way, the appropriate reading frame can be selected individually for each desired proteinase.
  • the new, recombinant phages or phage genomes are given the names M13-I-18521R-MluI / SalI and M13-I-18521Q-MluI / SalI (FIG. 7).
  • the active 2A proteinase is distinguished from the inactive form on the basis of a color test system.
  • An additional possibility of distinguishing the two forms of proteinase directly at the protein level is that in the recombinant phage genomes M13-I-18521R-MluI / SalI or M13-I-18521Q-MluI / SalI the gene sequences are deleted which correspond to the carboxy terminus of FIG. 2A follow proteinase.
  • the expression product of a pure 2A proteinase gene can be recognized by the polyclonal antiserum PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. Cit.).
  • the BstEII / HindIII fragment from pEx2A / 21 contains the gene section of the active 2A proteinase; the BstEII / Hindlll fragment from pEx ⁇ 3Gly contains the gene sequence of an inactive 2A proteinase since the triplets for the three glycine amino acids at positions 104, 107 and 108 have been deleted.
  • ⁇ Ex ⁇ 3Gly can be prepared from the DNA of pEx2A / 21 by deleting the codons for Gly 104, 107 and 108.
  • the new recombinant phage genomes are named M13-2A (active proteinase) and M13- ⁇ 3Gly (inactive proteinase).
  • the fusion proteins that can be expressed by these constructions are called lacZ / ⁇ VPl / 2A or lacZ / ⁇ VPl / ⁇ 2A (3Gly). Both forms of proteinase can be clearly identified in Western blots be distinguished from one another (FIG. 9).
  • the gene product of M13- ⁇ 3Gly shows no ⁇ -complementation in the color test system; in the case of M13-2A an ⁇ complementation is visible.
  • AccI fragment (approx. 700 bp) was isolated under standard conditions. This fragment includes the C-terminus of VP1, the entire coding region of HRV2-2A (including the stop codons after the last amino acid for HRV2-2A), as well as parts of the vector DNA (see Fig. 10).
  • the purified AccI fragment from pEx2A was then cut with BstEII. The larger BstEII / AccI fragment (approx. 635 bp) was separated from the smaller AccI / BstEII fragment (approx.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Amplification was carried out with the oligonucleotides 1987 and 1988; the sequences of these oligonucleotides and their orientation relative to the rhinoviral sequences can be seen in FIG.
  • the amplified DNA was cut with the restriction enzymes Mlul and Hindlll, the 450bp fragment released thereby isolated from an agarose gel, ligated with the 7.0kb Mlul / Hindlll fragment from M13-2A and transformed in the presence of IPTG and X-Gal into E.coli JM101 .
  • Around 1000 plaques were checked for their ability to complement ⁇ .
  • about 5% of the phage progeny showed no ⁇ -complementation in this case and around 1% showed a reduced ⁇ -complementation.
  • nucleotide sequences of the ⁇ VP1 / 2A genes of these 30 phages were determined by DNA sequencing and compared with the wild-type sequence.
  • Example 8 Adaptation of the M13 color test system to investigate the intermolecular cleavage of the HRV22A proteinase
  • the M13 color test system was modified in such a way that it enables an investigation of the intermolecular cleavage.
  • a 1063bp Aval / HindIII DNA fragment was isolated from the genome of the M13-2A construction (Example 5); this fragment contains the entire lacZ / 2A expression block.
  • DNA polymerase I Klenow fragment
  • the DNA fragment was cloned into the 4282b ⁇ Clal / Sall fragment of the plasmid pBR328 (Boehringer Mannheim).
  • Two plasmids, pBR2A / l and pBR2A / 2 were isolated, which encode the entire lacZ / 2A expression block in each case opposite orientation included.
  • a 444bp Rsal DNA fragment which codes for amino acids 120 to 193 of the capsid protein VP2 (1B) of HRV2 and therefore the binding site for the antibody 8F5 was ligated into the unique Apal site of the plasmid pBR2A / l, which had been blunt-ended with Sl nuclease; the resulting plasmid is referred to as pBR2A ⁇ ( Figure 16).
  • the plasmid was transformed into E.
  • This fusion protein serves as a substrate for an active 2A molecule that is encoded by an M13 bacteriophage.
  • the genome of this bacteriophage was constructed in such a way that the genomic DNA of M13-2A was cut with the restriction enzymes EcoRI, which cuts right at the beginning of the polylinker, and AccI. After a replenishment reaction with DNA polymerase I (Klenow fragment), the larger of the two restriction fragments formed was religated. This treatment eliminates the amino acids of the polylinker and amino acids 7 to 43 of the ⁇ fragment; however, the reading frame remains intact. The construction is called M13 / ⁇ lacZ2A.
  • M13 / 2A ⁇ 2B corresponds to M13-I-18521R-MluI / SalI
  • the resulting construction is called M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 2B.
  • M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly a variant with an inactive 2A proteinase (named M13 / ⁇ lacZ2A ⁇ 3Gly) was constructed; M13 / ⁇ 3Gly served as the initial construction. All three constructions are shown schematically in FIG. 16.
  • the genomic DNA of the three above-mentioned phage constructions was transformed in the presence of IPTG (0.1mM) and X-gal (0.16mM) into E.
  • FIG. 16 Figure 18 A shows an immunoblot with the 8F5 antibody.
  • the PC20 antiserum was used to check whether an active 2A molecule can be found in the induced fusion proteins of blue plaques. As can be seen in FIG.
  • the bacteria were then centrifuged off, washed with 1 ml washing solution (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA), centrifuged again, resuspended in 200 ⁇ l washing solution and with 50 ⁇ l 5 ⁇ LSB (20% SDS, 725 mM TrisHCl , pH 6.8, 25% 2-mercaptoethanol, 50% glycerin and 1% bromophenol blue) 10 min. heated at 95 ° C.
  • the expressed proteins were then examined for immunoblots with the PC20 antiserum (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. Cit.). The result is shown in FIG. 19.
  • nucleotide sequences of the VP1 / 2A genes of these 17 phage genomes were determined by DNA sequencing and compared with the wild-type sequence. The evaluation of the sequence comparisons of these 17 different phage genomes coincides with the results from the protein studies. Table 2 and Figure 20 summarize the results.
  • the mutagenesis of the region coding for the C-terminus of VP1 and for the 2A proteinase was mutagenized using the polymerase chain reaction.
  • the PCR amplification was carried out according to standard methods. As described in Example 7 amplified the DNAs of the following inactive 2A mutants; M13-2A (Phel30: Tyr), M13-2A (Phel30: Ser), M13-2A (Phel30: Leu), (M13-I-18521Q-MluI / SalI (42/43).
  • the amplified DNA was as in the example 7, and finally ligated to the vector, a 7.0 kb Mlul / Hindlll fragment of M13-2A, and approximately 0.4% of the phage progeny turned blue again, indicating the presence of an active 2A molecule.
  • mutant M13-2A (Phel30: Tyr)
  • sequence analysis of 2 blue progeny showed the exchange Ser27: Pro, of 4 further blue progeny the exchange Hisl35: Arg and of 4 further progeny the exchange Hisl37: Arg; another blue plaque was found to be a jerk mutant or uncut M13 * 2A vector DNA.
  • An examination of the proteins induced with IPTG with the antiserum PC20 (as described in Example 7) showed that a mature 2A molecule was again present in these cases.
  • the protein studies are shown in FIG. 21 and the location of the mutations which lead to the reactivation of the inactive 2A mutant M13-2A (Phel30: Tyr) in FIG. 20.
  • mutant M13-2A (Phel30: Leu) * no "second-site" revertants could be found either; all blue plaques examined were reverse mutations or uncut M13-2A vector DNA.
  • mutant (M13-I-18521Q-MluI / SalI (42/43), which has Arg: Glu (AGA: CAA) at amino acid position 134, deletions were detected by sequence analysis in 2 blue progeny, which increased by reading frame shift Stop codons in the anterior part of the VPl / 2A gene resulted in ⁇ complementation, and a further mutation Glul34: Arg (CAA: CGA) was detected in 10 other blue offspring.
  • Example 11 In vitro translation of rhinoviral cDNA fragments to check the activity of viral proteinases
  • VP1 / ⁇ 2A gene fragments of HRV2 and HRV14 are expressed in rabbit reticulocyte lysates; the resulting protein (sulfur, 35S) is then labeled with bacterial
  • Extracts containing the IPTG-induced proteins from various M13-2A or pBR2A clones are incubated. If the cleavage site is processed, the labeled, in vitro translated protein is cleaved; the result can be on a
  • the plasmid GR6 (FIG. 23) served as the cloning vector for the 5 'UTR of the rabbit ⁇ -globin; it contains the HRV2 nucleotides 19-1400 in the plasmid pGEM2 (Promega). Nucleotide 19 of the HRV2 sequence is approximately 30 base pairs away from the start of transcription for the T7 RNA polymerase. After in vitro transcription, this results in an RNA that corresponds to the orientation of the genomic RNA.
  • p773 HRV2 nucleotides 562-1012; Skern, T. et al., 1985, loc. Cit.
  • Pl9 HRV2 nucleotides 19-5100
  • p860 Skern, T. et al., 1985, loc. cit.
  • p860 contains the HRV2 nucleotides 660 to 1400 in the PstI site of pUC9; the orientation is such that nucleotide 1400 is adjacent to the EcoRI site of the polylinker.
  • the plasmid ⁇ GEM2 was cut with the restriction enzymes Hindlll and BamHI and dephosphorylated with calf intestine using alkaline phosphatase; plasmid p773 was also cut with HindIII and BamHI.
  • the HRV2 insert released by this was eluted from an agarose gel and ligated with the pGEM2 vector linearized with HindIII / BamHI.
  • GR1 was isolated, the structure of which is shown in FIG. 23.
  • GR1 was then treated with the Hindlll and Ncol restriction enzymes and with alkaline phosphatase; the plasmid pl9 was also cut with HindIII and Ncol.
  • the resulting 680 bp fragment from the EcoRI site at nucleotide 743 of the HRV2 gene map to the EcoRI site of the pUC9 polylinker (ie to nucleotide 1400 of the HRV2 gene map) was isolated and ligated with the GR2 vector cut with EcoRI and treated with alkaline phosphatase.
  • a plasmid, GR5 was isolated, the structure of which is shown in FIG. 23.
  • the plasmid GR5 in turn was cut with the restriction enzyme Hindlll and dephosphorylated with alkaline phosphatase from calf intestine; plasmid pl9 was also treated with HindIII.
  • the 240 bp fragment formed from the HindIII interface in the polylinker to the HindIII interface at nucleotide 248 of the HRV2 gene map was ligated with the linearized GR5 vector.
  • a plasmid was isolated, the structure of which is shown in FIG. 23 (called GR6).
  • the interfaces for the restriction enzymes EcoRV and EcoRI in the plasmid pl9 between the HindIII site and the nucleotide 19 of the HRV2 gene map can naturally also be found in the plasmid GR6.
  • the plasmid GR6 was digested with EcoRV and Ncol, the larger fragment was eluted from an agarose gel and with alkaline Treated phosphatase from calf intestine.
  • EBI 1264 and 1250 FIGG. 24; the oligonucleotides were brought together briefly to 65 ° C. and then slowly cooled to 4 ° C.
  • RNA is formed which comprises 18 nucleotides from the transcription site to the EcoRV site, the beginning of the ß-globin 5 * UTR, followed by the 52 nucleotides of the entire ß-globin 5'UTR and Nucleotides 611 to 1400 of the HRV2 sequence.
  • a plasmid ( Figure 25) was constructed which has the ⁇ -globin 5 'UTR in the reverse orientation.
  • the plasmid GR6 was again digested with Ncol. After the overlapping ends had been filled in with the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase I, EcoRV was digested, the larger fragment was eluted from an agarose gel and ligated with the 5 'phosphorylated oligonucleotides EBI 1264 and 2497 (FIG. 24; the oligonucleotides were brought together briefly to 65 ° C and then slowly cooled to 4 ° C). After transformation into competent E. coli cells, a plasmid was isolated, the structure of which is shown in FIG. 25.
  • RNA After in vitro transcription with T7 RNA polymerase, an RNA is formed which comprises 18 nucleotides from the transcription site to the EcoRV interface, followed by the 52 nucleotides of the inverse 5 'UTR of the ⁇ -globin gene and the nucleotides 611-1400 from HRV2.
  • plasmid which contains the 5 'UTR of the ⁇ -globin gene before the ATG at nucleotide 449 of the HRV2 sequence was carried out as follows: First, plasmid GR6 was digested with EcoRV and PstI and treated with alkaline phosphatase. This DNA was then analyzed with the 5 'phosphorylated oligonucleotide pairs EBI 1264/2497 (which corresponds to the sequence of the 5' UTR of the ⁇ -globin gene (FIG. 24)) and UKCC 1660/1661 (which corresponds to the HRV2 sequence 448-471 (FIG.
  • plasmid p20 a plasmid was isolated in which the cloned 1st okb PstI fragment had the same orientation to the T7 RNA promoter has as in plasmid GR6 (in Figure 27a); it was called pß + 449.
  • an RNA is formed which comprises 18 nucleotides from the transcription initiation site to the EcoRV site, followed by the 52 nucleotides of the ß-globin 5 * UTR and the nucleotides 448-1400 of the HRV2 sequence.
  • RNA is formed, which in turn comprises 18 nucleotides from the transcription initiation site to the EcoRV site, 52 nucleotides of the inverse ⁇ -globin 5 'UTR and nucleotides 449-1400 from HRV2.
  • RNA polymerase In vitro transcription of these plasmids after linearization with BamHI using T7 RNA polymerase was carried out as described (Düchler et al, 1989; EPA 0 356 695). At the end of the reaction time, the DNA was digested by adding DNase I (RNAse-free, Pharmacia) and the RNA was precipitated with ethanol after adding a third volume of 8M ammonium acetate. After reprecipitation with ethanol, the RNA was then taken up in water and its quality was checked by agarose gel electrophoresis. The running buffer contained 1% SDS. 1 ⁇ g of these RNAs were used for in vitro translation.
  • DNase I RNAse-free, Pharmacia
  • reaction was stopped by adding 1 .mu.l 200 mM methionine and is applied, an aliquot (1 .mu.l) on a SDS-polyacrylamide gel. The gel was fluorographed after the run was completed.
  • Figure 27 shows the translation products of the RNAs transcribed from the four plasmids (pß + 449, pß-449, pß + 611 and pß-611) after electrophoretic separation.
  • Translation products are only found when the ⁇ -globin 5'UTR is in the positive orientation (pß + 449 and pß + 611), surprisingly the translation of the ATG 449 (probably not used in vivo) is stronger than the translation of ATG 611, which is believed to be used in vivo.
  • the translational products behave in their gel electrophoretic properties in accordance with the molecular masses predicted from the amino acid sequence.
  • the translation product obtained with the RNA from pB611 + could be precipitated with the antibody 8F5. This antibody recognizes an amino acid sequence of the VP2 protein. (Skern, T., et al. (1987) J. Gen. Virol., Loc. Cit). This result supports the assumption that translation actually starts at the ATG 611.
  • the plasmid p20 is very suitable for such purposes because it has a number of interfaces which are suitable for the Insertion of fragments can be used.
  • the three enzymes AccI, Hindll and Sall recognize the sequence 5 'GTCGAC 3'; the position of the enzymatic cleavage is different for these restriction enzymes.
  • Sall cuts after the first G, AccI after the T and HindII after the first C. Therefore, after appropriate manipulation, each fragment can be brought into the correct reading frame.
  • the other interfaces can be used to linearize the plasmid prior to in vitro transcription.
  • the plasmid p20 was cut with HindII and each with cDNA fragments of HRV2 and an HRV14 acid-resistant mutant, HRV14-as3 (Skern, T., Torgersen, H., Auer, H., Kuechler, E. and Blaas, D. (1991 ), Virology, 183, 757-763).
  • HRV2 an SspI / XmnI fragment comprising nucleotides 2368-3752 was used; in the case of the acid-resistant mutant of HR14, an Hpal fragment with the nucleotides 1810-3560 was used.
  • the SspI / XmnI fragment of HRV2 was excised from plasmid pl9 (Duechler, M., et al. 1989, loc. Cit.); the Hpal fragment of the acid-resistant mutant of HRV14 was excised from the plasmid pHRV14-as3 (Skern, T. et al., 1991, Virology, loc. cit.). After transformation in E. coli 5K cells, plasmids were isolated in both cases, in which the orientation of the HRV insert enables translation of the HRV amino acid sequences. The plasmids were named pßHRV2 / sub and pßHRV14 / s * ub.
  • the plasmid pßHRV2 / sub was cut with Apal so that only up to amino acid glycine 99 was transcribed.
  • the plasmid pHRV14 / sub was with BamHI (the interface is in the polylinker of p20) cut; in this case, the HRV14 insert was transcribed until the end, ie up to the amino acid leucine 122. As a result, both 2As are inactive in the cis cleavage.
  • the translation products of the RNAs transcribed in vitro by these plasmids are shown in FIG. 28.
  • the 40 kD product corresponds to a translation of the VP1 / ⁇ 2A region of HRV2, which is contained in the plasmid pßHRV2 / sub;
  • the 66 kD product corresponds to a translation of the ⁇ VP3 / VP1 / ⁇ 2A region of HRV14, which is contained in the plasmid pßHRVl4 / sub.
  • the pßHRV2 / sub translation product was then incubated with E. coli extracts containing native 2A expressed either from an M13 genome or from a plasmid. This is to check to what extent the ⁇ VP1 / ⁇ 2A region can be cleaved by the HRV2 2A proteinase expressed in bacteria. For this purpose, the proteins were induced with IPTG as described above and the cells were worked up.
  • the cells of 1.5 ml culture for plasmid constructions or 3 ml for M13 constructions were taken up in 500 ⁇ i washing solution, disrupted with ultrasound and 15 ⁇ l (for M13 constructions) or 10 ⁇ l (for plasmid constructions) from the supernatant Incubate 1 ⁇ l of the translation product of pßHRV2 / sub for 3 hours at 30 ° C.
  • the result of the incubations is shown in Figure 29A; after incubation with extracts of M13-2A or pBR2A / l and pBR2A / 2, two further bands (32 kD and 30 kD) can be seen.
  • Extracts from M13-2A ⁇ 3Gly or pBR2A ⁇ no further bands to be seen since no active 2A was expressed.
  • the presence of two fission products allows two explanations; either the 2A protease cleaves the translation product of pßHRV2 / sub twice or the correct cleavage product is additionally processed by an E. coli protease.
  • bacterial extracts of M13-2A and pBR2A / l and pBR2A / 2 were partially purified by ammonium sulphate precipitation. The extracts were mixed with ammonium sulphate to a final concentration of 30%.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein in-vivo Farbtestsystem zur Überprüfung der Aktivität viraler Proteasen.

Description

TESTSYSTEM ZUR AKTIVITATSUBERPRUFUNG VIRALER PROTEINASEN
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein in vivo Farbtestsystem zur Überprüfung der Aktivität viraler Proteasen.
Viele tierische und pflanzliche Viren benötigen während ihres Replikationszyklus den Einsatz von viral-kodierten Proteinasen. Die Picornaviren, eine Familie von bedeutenden human- und animalpathogenen Viren, sind zum Beispiel vollständig von einem proteolytischen Prozessieren abhängig. Die bei der Replikation involvierten proteolytischen Enzyme sind hoch Substrat-spezifisch und erkennen meist eine Spaltregion - also ein strukturell determiniertes Erkennungsmerkmal - und weniger ein genau definiertes Aminosäurepaar, wie es üblicherweise als Erkennungssequenz dient. Einen generellen Überblick zu dieser Thematik geben H.G. Kräusslich und Ξ. Wimmer (1988, Ann. Rev. Biochem. 52, 701-751) und Kay, J. und Dünn, B. M. (1990, Biochim. Biophys. Acta 1048. 1-18).
Die viralen Proteinasen stellen aufgrund ihrer Substratspezifitat und ihres katalytischen Mechanismus einen guten therapeutischen Angriffspunkt dar (Johnston, M. I. et al., 1989, Trends Pharmacol. Sei. 10. 305-307) . Durch die Bereitstellung der dreidimensionalen Struktur der Proteinasen des Rous Sarcoma Virus (Leis, J. et al., 1990, ASM-News üü, 77-81) und von HIV I (Navia, M. A. et al., 1989, Nature 337. 615-620; Miller, M. et al., 1989, Science 246. 1149-1152) ist es möglich, ein Computer-unterstütztes molekulares "designing" hoch spezifischer Inhibitoren durchzuführen (Meek, T. D. et al., 1990, Nature 343. 90-92). Spezifische Proteinaseinhibitoren könnten somit neue antivirale Substanzen darstellen, welche beispielsweise gegen Viren gerichtet sind, gegen die die Entwicklung eines Vakzins aus rein technischen Gründen nicht möglich ist; z.B. sind bei Rhinoviren derzeit weit über 115 nicht miteinander kreuz reagierende Serotypen bekannt, wovon 90 bereits als definierte Serotypen klassifiziert wurden (Cooney, M. K. et al., 1982, Infect. Immun. 22. 642-647).
Proteolytisches Prozessieren des Polyproteins (Jacobson, M.F. und Baltimore, D., 1968, Proc. Natl. Acad. Sei. 82., 5392) durch viral kodierte Proteinasen ist bevorzugt bei (+)Strang RNA Viren (Hellen, C.U.T. et al., 1989, Biochemistry ä, 9881-9890) und Retroviren anzutreffen (Skalka, A. M. , 1989, Cell 56. 911-913). Mit Hilfe von molekularbiologischen Studien, Sequenzvergleichen und R ntgenstrukturanalysen stellte sich heraus, daß die von Viren kodierten Proteinasen zwei Gruppen von proteolytischen Enzymen zugeordnet werden können, nämlich den Pepsin-ähnlichen Aspartat-Proteinasen (Meek, T. D. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. ≤jL. 1841-1845) und den Cystein-Proteinasen mit Trypsin-ähnlicher Proteinkettenfaltung (Bazan, J. F. and Fletterick, R. J., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. £5., 7872-7876). Nicht immer sind beim proteolytischen Prozessieren des viralen Polyproteins ausschließlich viral-kodierte Proteinasen beteiligt, so z.B. sind bei der Reifungsspaltung des Polyproteins des "Yellow Fever Virus", welches zu den Flaviviridae gehört, zelluläre Proteinasen beteiligt (Ruiz-Linares, A. et al., 1989, J. Virol. £ä. 4199-4209). Die Substratspezifitat der viralen Enzyme konnte mittels detaillierter Studien wie Punktmutations¬ analysen, Spaltung von Peptidsubstraten "in vitro" und Aminosäure-Sequenzierung der nativen Spaltprodukte näher analysiert werden. Dabei stellte sich heraus, daß, wie oben bereits erwähnt, weniger die Spaltstelle selbst als einige Positionen "up"- oder "downstream" eine tragende Rolle bei der Spaltstellenerkennung spielen. Jene Sequenz-Heterogenität der Spaltsignale bzw. deren unmittelbarer Umgebung führt jedoch zu einer Art "Hierarchie" der Spaltereignisse im Polyprotein (Kräusslich, H. G. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. 86. 807-811; Pichuantes, S. et al., 1989, PROTEINS: Structure, Function and Genetics £, 324-337; Darke, P. L. et al., 1989, J. Biol. Chem. 264. 2307-2312; Nicklin, M. J. H. et al., 1988, J. Virol. £2, 4586-4593; Libby, R. T. et al., 1988, Biochemistry 22, 6262-C268; Sommergruber, W. et al., 1989, Viroloαv 169. 68-77) . Die Variation der einzelnen Spaltregionen im Polyprotein erlaubt so eine genau determinierte Abfolge von kinetisch "günstigen" bis zu kinetisch "ungünstigen" Spaltungen, die in weiterer Folge eine differenzierte Proteolyse der einzelnen Spaltprodukte ermöglicht. Dadurch kommt den viralen Proteinasen eine Art von regulatorischem Potential während des viralen Replikationszyklus zu. Das Prinzip der Erkennung einer spezifischen Sekundärstruktur im Spaltstellenbereich ist nicht auf Picornaviren beschränkt, sondern dürfte ein allgemeines Prinzip der viralen Proteinasen darstellen. So werden diese Eigenschaften z.B. im Adenovirussystem (Webster, A. et al., 1989, J. Gen. Virol. 7_α, 3225-3234; Webster, A. et al., 1989, J. Gen. Virol. Ifi., 3215-3223) und in pflanzenviralen Systemen ebenso angetroffen (Carrington, J.C. und Dougherty, W.G., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. 15, 3391-3395; Dougherty, W.G. et al., 1983, EMBO J. 2, 1281-1288). Kaum ein anderes virales System ist bei seiner Regulation des Infektionsablaufes dermaßen von einer kontrolliert limitierten Proteolyse abhängig, wie das der Picornaviridae. Diese Virenfamilie läßt sich in 4 verschiedene Genera unterteilen: Entero-, Rhino-, Aphto- und Cardioviren. Rhinoviren sind wie alle anderen Vertreter dieser Virenfamilie einzelsträngige (+)RNA-Viren (Cooper, P. D et al., 1978, Intervirology 10. 165-180; MacNaughton, M. R., 1982, Current Top. Microbiol. Immunol. 22., 1-26). Sie sind weit verbreitet, befallen den oberen respiratorischen Trakt des Menschen und verursachen akute Infektionen, die zu Schnupfen, Husten, Heiserkeit etc. führen und allgemein als Erkältungen bezeichnet werden (Stott, E. J. und Killington, R. A., 1972, Ann. Rev. Microbiol. 26. 503-524) . Infektionen durch Rhinoviren zählen zu den häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die Krankheit verläuft zwar meist harmlos, dennoch kommt es - bedingt durch eine vorübergehende Schwächung des Organismus - zu Sekundärinfektionen durch andere Viren oder Bakterien, die dann unter Umständen schwere Erkrankungen zur Folge haben. Von den insgesamt ca. 115 verschiedenen, bekannten Serotypen von humanen Rhinoviren sind bis jetzt 4 Serotypen (HRV 1B, 2, 14 und 89) kloniert und komplett sequenziert worden: Deutsche Patentanmeldung P 35 05 148.5; Skern, T. et al., 1985, Nucleic Acids Res. ü, 2111-2126; Düchler, M. et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA M. 2605-2609; Stanway, G. et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 7859-7877; Callahan, P. L. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA Q2., 732-736; Hughes, R. et al., 1988, J. Gen Virol. £ä, 49-58). Die genomische einzelsträngige (+)RNA der Rhinoviren wird kurz nach der Infektion durch Abspaltung des an das 5'Ende gebundenen Oligopeptids VPg modifiziert und dient in der Folge als mRNA für die Synthese eines Polyproteins, das den gesamten durchgehenden Leserahmen der Nukleinsäuresequenz umfaßt (Butterworth, B. E., 1973, Virology 5ji/ 439-453; Mc Lean, C. und Rueckert, R. R., 1973, J. Virol. H, 341-344; Mc Lean, C. et al., 1976, J. Virol. 1£, 903-914; Agol, V.l., 1980, Prog. med. Virol. 23., 119-157; Putnak, J.R. und Phillips, B.A., 1981, Microbiol. Rev. 4≤., 287-315). Die reifen viralen Proteine entstehen ausschließlich durch proteolytische Spaltung aus diesem Polyprotein, wobei - zumindest bei Entero- und Rhinoviren - die dabei wirksamen Proteinasen selbst Bestandteil dieses Ε „yproteins sind. Das Prozessieren erfolgt in 3 Stufen (Palmenberg, A., 19_I7, J. Cell." Biochem. 22., 191-198; Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.):
1.) Die Primärspaltung: Trennung der Kapsidvorläufer von der wachsenden Polypeptidkette; 2.) die Sekundärspaltung: Prozessieren struktureller und nicht-struktureller Vorläuferproteine und 3.) die Reifespaltung des Kapsids.
Der erste Schritt dient somit der Abspaltung der Vorstufe der Hüllenproteine und wird (bei Entero- und Rhinoviren) autokatalytisch durch die Proteinase 2A vorgenommen ("cis"-Aktivität) . In der Reihenfolge der Gene liegt die Sequenz der Proteinase 2A (in der Folge 2A genannt) unmittelbar hinter dem für die Hüllenproteine kodierenden Abschnitt. 2A ist somit aufgrund ihrer Lokalisation im Polyprotein die erste nachweisbare enzymatische Funktion des Virus. Die Trennung der Hüllenproteinregion von dem für die Replikation verantwortlichen Abschnitt findet bereits während der Translation des Polyproteins "in statu nascendi" statt. Bei Poliovirus kann diese primäre Spaltung an der P1-P2 Region intermolekular d.h. "in trans" von der reifen Proteinase 2A vorgenommen werden (Kräusslich, H.G. und Wimmer, E., 1988, loc. cit.). Das Spaltsignal, welches dabei von der Proteinase 2A erkannt wird, wurde einerseits durch direkte Aminosäuresequenzanalyse des N-Terminus von 2A und/oder des C-Terminus von VP1 bestimmt oder andererseits durch Vergleich der Primärstruktur aufgrund von Homologiestudien abgeleitet. Es ist dies bei Polio (Pallansch, M.A. et al., 1984, J. Virol., 42, 873-880), BEV und HRV14 (Callahan, P.L. et al., 1985, loc. cit.) ein Tyr/Gly-, bei HRV2 (Kowalski, H. et al., 1987, J. Gen. Virol. M. 3197-3200; Sommergruber, W. et al., 1989, Virology JLfiiL- 68-77) ein Ala/Gly-, bei HRV1B (Hughes, P.J. et al., 1988, J.Gen. Virol. £2., 49-58) und HRV89 (Düchler, M. et al., 1987, loc. cit.) ein Val/Gly-, sowie bei Cox Bl (Iizuka, N. et al., 1987, Virology 15£, 64-73), Cox B3 (Lindberg, A.M. et al., 1987, Virology 15 50-63) und Cox B4 (Jenkins, O. et al., 1987, J. Gen. Virol. 68. 1835-1848) ein Thr/Gly-Aminosäurepaar. Dieser Schritt ist für den weiteren Ablauf der viralen Infektion essentiell (Kompartimentierung von Replikation und Virus-assembly) . Bei Cardio- und Aphtoviren wird, im Gegensatz zu den Polioviren, diese Spaltung von der Proteinase 3C katalysiert (Kräusslich, H.-G. and Wimmer, E... 1988, loc. cit.). Vom Poliovirussystem weiß man, daß wahrscheinlich alle an dieser Reifungsspaltung beteiligten Enzyme viral kodiert sind (Toyoda, H. et al., 1986, Cell 45., 761-770). Im Poliovirus findet man drei Typen von Spaltsignalen; die Aminosäurepaare Q-G, welche von der viralen Proteinase 3C (im folgenden 3C genannt) erkannt werden, das oben erwähnte Y-G Paar, welches als 2A-ErkennungsSignal dient und das bei der Reifespaltung des Kapsids verwendete N-S Spaltsignal.
Wie bereits dargelegt wurde, ist der Infektionsablauf bei Picornaviren entscheidend von den viralen Enzymen abhängig. Da gerade diese Enzyme besonders gut konserviert und in ihren Eigenschaften bei verschiedenen Rhinoviren sehr ähnlich sind, bieten sie sich geradezu als Ziel eines chemotherapeutischen Eingriffs an, wie z. B. das virale Enzym 2A. Der chemotherapeutische Ansatz ist die Inhibierung der enzy atischen Aktivität durch spezifische Inhibitoren. Inhibiert man die erste proteolytische Aktivität, die 2A-Aktivität, so unterbindet man jeden weiteren Reifungsprozeß des viralen Systems.
Überraschenderweise weist die 2A-Region von HRV2 nicht nur zu anderen Rhinoviren, sondern auch zu Vertretern anderer Gruppen der Picornaviridae eine ausgeprägte Homologie auf. Ein Inhibitor gegen HRV2 2A könnte daher auch auf andere Picornaviren anwendbar sein.
Die generelle Bedeutung der Inhibierung von viral kodierten Proteinasen wurde nicht zuletzt durch Arbeiten mit der Proteinase des humanen Immundefizienz Virus 1 (HIV I) wieder in den Blickpunkt von möglichen antiviralen Therapieansätzen gerückt. Durch Deletions- und Punktmutationen in der Proteinaseregion dieser Art von Retroviren konnte die essentielle Rolle der Proteinase bei der Reifung dieser Virenklasse erkannt werden (Katoh, I. et al., 1985, Virol. 145 280-292; Kohl, N. E. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85. 4686-4690; Crowford, S. and Goff, S.P., 1985, J. Virol. 53., 899-907). Durch Rontgenstrukturanalysen und molekularbiologische Studien konnte weiterhin gezeigt werden, daß die Proteinase von HIV I dem Asp-Typ angehört, sich selbst am Vorlauferprotein prozessieren kann (auch in rekombinanten prokaryontischen Systemen), "in trans" spezifisch Peptide spalten kann und als aktive Proteinase in einer homodimeren Form vorliegt (Navia, M. A. et al., 1989, loc. cit.; Meek, T.D. et al., 1989, loc. cit.; Katoh, I. et al., 1985, loc. cit.). Aufgrund der Tatsache, daß die Proteinase von HIV I in ihrer aktiven Form als Dimer vorliegt, wurde von Wlodawer und Mitarbeitern auch die Entwicklung spezifischer Dimerisierungs-Inhibitoren vorgeschlagen (Wlodawer, A. et al., 1989, Science 245. 616-621) . Die Entwicklung von hochspezifischen kompetitiven Inhibitoren gegen die Proteinase von HIV I auf der Basis von modifizierten Peptidsubstraten wurde erst kürzlich von Tomasselli, und Mitarbeitern beschrieben (Tomasselli, A.G. et al., 1990, Biochem. 29. 264-269). Von einem fungiziden Antibiotikum, dem Cerulenin, war schon länger bekannt, daß es eine antiretrovirale Aktivität gegen Rous Sarcoma Virus und Murine Leukemia Virus besitzt (Goldfine, H. et al., 1978, Biochem. Biophys. Acta. 512. 229-240; Katoh, I. et al., 1986, Virus Res. 5/ 265-276; ). Im Fall des HIV I konnte die inhibitorische Wirkung von Cerulenin eindeutig mit der Inhibierung beim proteolytischen Prozessieren des Polyproteins von HIV I in Zusammenhang gebracht werden (Pal, R. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. £5, 9283-9286). Ausgehend von dieser Tatsache konnten Blumenstein und Mitarbeiter ein sehr schönes Beispiel bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren gegen die Proteinase HIV I auf der Basis von synthetischen Nicht-Peptid Inhibitoren liefern. Sie konnten nämlich die inhibitorische Wirkung des Cerulenin auf die Wechselwirkung des elektrophilen Epoxidrestes mit nukleophilen Regionen der Proteinase zurückführen. Außerdem konnte durch die Entwicklung von synthetischen Derivaten die ursprüngliche Toxizitat des Cerulenin vermindert werden (Blumenstein, J.J. et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 163. 980-987)
Auch im picornaviralen System sind derzeit verschiedenste anorganische und organische Verbindungen, sowie Peptidderivate und Proteine bekannt, die eine inhibitorische Wirkung auf das proteolytisehe Prozessieren dieser Viren besitzen. Der Effekt dieser Substanzen beruht auf der direkten Wechselwirkung mit den Proteinasen (Kettner, C. A. et al., 1987, US Patent Nr.: 4,652,552; Korant, B. D. et al., 1986, J. Cell. Biochem. 22., 91-95) und/oder auf dem indirekten Weg der Wechselwirkung mit Substraten dieser Proteinasen (Geist, F. C. et al., 1987, Antimicrob. Agents Chemother. 2 L, 622-624; Perrin, D. D. und Stünzi, H., 1984, Viral Chemotherapy 1, 288-189). Das Problem bei den meisten dieser Substanzen ist die relativ hohe Konzentration, die zur Inhibierung nötig ist und die zum Teil große Toxizitat dieser Verbindungen. Die bereits erfolgreiche Anwendung von modifizierten Peptiden unr" Peptidomimetica als Therapeutika in nicht-viralen Gebieten (Fauchere, J. L., 1986, Advanc. Drug Res. 15/ 29-69) und das "inhibitor designing" ausgehend von bekannten Strukturen (DesJarlais, R.L. et al., 1989, "Viral Proteinases as Targets for Chemotherapy", in Curr. Commun. Mol. Biol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 203-210) sowie die Zunahme an molekularbiologischen und physikalischen Daten über picornavirale Proteasen erweitert das Verständnis von Struktur und Funktion dieser viralen Enzyme und ermöglicht so ein schrittweises rationales "designing" - ausgehend von modifizierten Peptidsubstraten - bis hin zu hochspezifischen und nicht toxischen Peptidomimetica.
Die Überprüfung der Wirksamkeit solcher Substanzen macht effiziente, rasche und aussagekräftige Testsysteme erforderlich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, solche Testsysteme bereitzustellen.
Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde die sogenannte α-Komplementation im M13 Klonierungs- system (Messing, J. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. 3642-3646; Messing, J., 1983, in: Methods in Enzymology JJ21, Colowick, S. P., Kaplan, N. 0. (eds.), Aeademie Press, New York, pp. 20-78) verwendet. Unter α-Komplementation (Ulimann, A. et al., 1967, J. Mol. Biol. 24 339-343; Langley, K. E. et al., 1975, Proc. Natl. Acad. Sei. 22, 1254-1257) versteht man folgenden Vorgang:
Der Bakteriophage M13mpl8 (Yanish-Perron, C. et al., 1985, Gene 22, 103-119) - oder auch andere M13 Phagen der mp-Reihe - enthält in seinem Genom den Genabschnitt für den aminoterminalen Teil der ß-Galaktosidase aus E.coli. Die Expression dieses Genfragmentes, das unter der Kontrolle des Promotors des Lac-Operons steht, führt zu einem-Polypeptid, genannt α-Fragment, das die ersten 146 Aminosäuren der ß-Galaktosidase enthält. Dieses Polypeptid ist inaktiv. Die E. coli Bakterienstämme, die von den M13 Phagen infiziert werden können, beispielsweise die E.coli JM-Stämme, insbesondere E.coli JM 101 und E.coli JM 109, enthalten ebenfalls eine inaktive Form der ß-Galaktosidase, genannt ΔM15. Hier fehlen der ß-Galaktosidase die Aminosäuren 11-41. Wenn diese E. coli Bakterien, die die inaktive ß-Galaktosidase bilden, mit M13 Phagen infiziert werden und über Isopropylthiogalaktosid (IPTG) sowohl die Expression der wirtskodierten, inaktiven ß-Galaktosidase als auch die Expression der phagenkodierten, inaktiven ß-Galaktosidase induziert wird, können die beiden inaktiven Formen der ß-Galaktosidase einander komplementieren. Es wird eine aktive ß-Galaktosidase gebildet, die entweder ihr natürliches Substrat, Laktose bzw. Allolaktose, spalten kann oder ein synthetisches Substrat, 5-Brom-4-chlor-3-indolyl- ß-D-Galaktopyranosid (X-Gal), dessen Spaltprodukt, ein Indoxylderivat, unter 0,-Einfluß zum blauen 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlorindigo oxidiert wird. Die Bakterien, in denen die beiden inaktiven Formen der ß-Galaktosidase einander gegenseitig zu einem aktiven Enzym ergänzen, erscheinen demnach blau angefärbt und sind leicht von denjenigen Bakterien zu unterscheiden, in denen keine sogenannte α-Komplementation, also keine gegenseitige Komplementation der inaktiven Enzymformen stattgefunden hat. Die α-Komplementation kann gänzlich dadurch unterbunden werden, daß durch die Insertion von Fremd-DNA in den phagenkodierten Genabschnitt der ß-Galaktosidase das sogenannte α-Fragment nicht gebildet wird und daher ein Partner für die α-Komplementation fehlt. Diese Möglichkeit ist die gängige Verfahrensweise im Umgang mit dem M13-Klonierungssystem (Messing, J., 1983, loc. cit.).
Erfindungsgemäß wird die Komplementationsf higkeit des α-Fragmentes durch eine carboxyterminale Fusionierung mit unterschiedlich langen Polypeptidketten verschieden stark beeinflußt. Diese Variante führte überraschenderweise zur Entwicklung eines in vivo Farbtestes zur Überprüfung der Aktivität viraler Proteasen. Erfindungsgemäß lassen sich die Aktivitäten der HRV-2A Proteinase sowie auch anderer Proteinasen, vorzugsweise die 3C Proteinasen der Picornaviren sowie die HIV Proteinase messen. Die zur Einfügung dieser Proteinasen in das Testsystem erforderlichen Erkennungsstellen lassen sich beispielsweise durch die Einfügung der Erkennungssequenz 5'GTCGAC3' in den DNA-Abschnitt des α-Fragmentes der ß-Galaktosidase schaffen. Diese Erkennungssequenz wird von 3 verschiedenen Restriktionsendonukleasen (Sall, Hindi, AccI) erkannt, die unterschiedlich schneiden. Dadurch kann individuell für jede gewünschte Proteinase der entsprechende Leserahmen gewählt werden.
Eine weitere Möglichkeit der Aktivitätsüberprüfung speziell der HRV2-2A besteht in der Verwendung modifizierter Vektoren in Verbindung mit dem polyklonalen Antiserum gegen das Peptid PC20 (Sommergruber, W. et al, 1989, loc. cit.).
Hierzu ist es erforderlich, die Expression einer reinen 2A Proteinase zu gewährleisten. Das Expressionsprodukt des reinen 2A Proteinasegens kann durch das polyklonale Antiserum erkannt werden.
Die Ergebnisse in den Beispielen 1 - 5 zeigen, daß das M13 Farbtestsystem zur Unterscheidung von aktiven und inaktiven 2A Proteinasemolekülen verwendet werden kann. Ebenso sollte dieses System sich dazu eignen, diese Unterscheidung bei einer Vielzahl von zu untersuchenden Klonen rasch und aussagekräftig zu treffen. Hierzu wurde von dem Genom des Phagen M13-2A (Beispiel 5) der Bereich, der für den C-Terminus von VP1 und für die 2A Proteinase kodiert, in vitro mutagenisiert. Die Mutagenese wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt, denn es ist bekannt, daß die Taq DNA Polymerase relativ häufig Fehler macht, da sie keine "Proofreading"-Aktivität besitzt (Leung, D.W. et al., 1989, Technique. A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology. 1, 11-15). Die PCR-Amplifikation wurde nach Standardmethoden durchgeführt (Torgersen et al., 1989, J. Gen. Virol., 70, 3111-3116). Die so erhaltenen mutierten DNA-Fragmente wurden in E.coli transformiert. Rund 1000 Plaques wurden auf die Fähigkeit zur α-Komplementation überprüft. 30 verschiedene Plaques wurden näher analysiert.
Die DNA Analyse der VP1/2A Genregionen aus den 30 verschiedenen Phagengenomen deckt sich mit den Ergebnissen aus den Proteinstudien die in Fig. 13 gezeigt werden. Tabelle 1 und Figur 14 fassen die Ergebnisse der DNA Sequenzierung zusammen. Alle Phagengenome, die von M13 Phagen aus 20 farblosen Plaques stammen, zeigen Mutationen in ihren VP1/2A Regionen. 15 besitzen Nukleotidaustausche, die bei der Expression der 2A Proteinase zu einem oder mehreren Aminosäureaustauschen führen. Diese Aminosäure¬ änderungen bewirken offensichtlich eine Inaktivierung der 2A Proteinase, da in dem entsprechenden Immunoblot keine freie 2A Proteinase, sondern jeweils nur ein Fusionsprotein bestehend aus α-Fragment, C-Terminus von VP1 und 2A Proteinase zu erkennen ist (Figur 13). 2 Phagengenome zeigen Nukleotidaustausche, die Aminosäurekodons zu Stoppkodons umwandeln, und drei Genome haben im 2A Gen Deletionen von Nukleotiden, die zu einem Verlust des Leserahmens für das 2A Gen führen. Sowohl die Umwandlung eines Aminosäurekodons in ein Stoppkodon wie die Veränderung des 2A Leserahmens durch Deletion einzelner Nukleotide führt bei der Translation zu einem inaktiven Fusionsprotein, das im Immunoblot von dem Antiserum PC20 nicht erkannt wird (Figur 13A) . Von den 6 Genomen, die von Phagen aus den blauen Plaques isoliert worden sind, zeigen nur 2 eine Mutation im 2A Gen (Figur 14). Diese Mutationen beeinflussen die Aktivität der 2A Proteinase nicht, da im entsprechenden Immunoblot in allen 6 Fällen jeweils eine freie 2A Proteinase zu erkennen ist (Figur 13B) .
In drei der vier VP1/2A Genomabschnitten , die von Phagen aus hellblauen Plaques abgeleitet worden sind, finden sich Mutationen (Figur 14), die auf der Proteinebene kein freies 2A Protein erkennen lassen (Figur 13B); die schwache Bande bei der Probe H2 liegt nicht auf der richtigen Höhe von 2A. Wahrscheinlich sind die 2A Proteine nur sehr schwach aktiv; trotzdem wird offenbar genug freies α-Fragment gebildet, um eine α-Komplementation durchzuführen, nicht aber genug 2A Protein, um auf einem Immunoblot gesehen zu werden. Das 2A Gen von Phagen aus dem vierten hellblauen Plaque zeigt nur eine stille Mutation; da im Immunoblot ein freies 2A gefunden wird (Figur 13B; H3), ist es wahrscheinlich, daß eine Mutation in einem anderen Bereich des α-Komplementationsystems für die reduzierte α-Komplementation verantwortlich sein könnte. Tatsächlich wurde eine Punktmutation in der Lac-Promotorregion gefunden. Die Analyse von 17 weiteren Phagengenomen nach einer PCR-Mutagenese ist in Beispiel 9 beschrieben; die dazu gehörigen I munoblots sind in Figur 19 und die Mutationen in den 2A Genen in Figur 20 dargestellt. Tabelle 2 faßt die Ergebnisse zusammen. Alle Phagengenome, die von M13 Phagen aus fünf untersuchten farblosen Plaques stammen, zeigen Mutationen in ihren VP1/2A Regionen. Zwei besitzen Nukleotidaus ausche, die bei der Expression der 2A Proteinase zu einem oder mehreren Aminosäure¬ austauschen führen. Diese Aminosäureänderungen bewirken offensichtlich eine Inaktivierung der 2A Proteinase, da in dem entsprechenden Immunoblot keine freie 2A Proteinase, sondern jeweils nur ein Fusionsprotein bestehend aus α-Fragment, C-Terminus von VP1 und 2A Proteinase zu erkennen ist (Figur 19A) . Ein Phagengenom zeigt einen Nukleotidaustausch, der ein Aminosäurekodon in ein Stoppkodon umwandelt, und zwei Genome haben im 2A Gen Deletionen, die zu einem Verlust des Leserahmens für das 2A Gen führen. Sowohl die Umwandlung eines Aminosäurekodons in ein Stoppkodon wie die Veränderung des 2A Leserahmens durch Deletion einzelner Nukleotide, führt bei der Translation zu einem inaktiven Fusionprotein, das im Immmunoblot von dem Antiserum PC20 nicht erkannt wird (Figur 19A) . Von den 5 Genomen, die von Phagen aus blauen Plaques isoliert worden sind, zeigt nur einer eine Mutation im 2A Gen (Figur 20) . Diese Mutation beeinflusst die Aktivität der Proteinase nicht, da im entsprechenden Immunoblot in diesem Fall (BIO) eine freie 2A Proteinase zu erkennen ist (Figur 19C) .
In fünf der sieben VP1/2A Genomabschnitte, die von Phagen aus hellblauen Plaques abgeleitet worden sind. finden sich Mutationen (Figur 20), die auf der Proteinebene kein freies 2A Protein erkennen lassen (Figur 19B) . Wahrscheinlich sind die 2A Proteine nur sehr schwach aktiv; trotzdem wird offenbar genug freies α-Fragment gebildet, um eine α-Komplemen¬ tation durchzuführen, nicht aber genug 2A Protein, um auf einem Immunoblot nachgewiesen zu werden. Die übrigen zwei VP1/2A Genomabschnitte, die von Phagen aus hellblauen Plaques abgeleitet worden sind, zeigen im VP1 Teil jeweils eine Deletion, die in beiden Fällen zu einem Verlust des Leserahmens für das ΔVP1/2A Gen führt.
Diese Mutationsanalyse zeigt deutlich, daß das M13 Farbtestsystem dazu verwendet werden kann, inaktive Mutanten von aktiven Proteinasen, in diesem Fall der 2A Proteinase von HRV2, zu unterscheiden. Zudem können durch Selektion der Oligonukleotide für die Amplifikation einzelne Bereiche des Proteinasegens gesondert ausgewählt werden; man könnte zum Beispiel nur die Spaltstelle amplifizieren oder nur die Region, die für das katalytische Zentrum kodiert. Das System kann auch verwendet werden, um durch in vitro Mutagenese aus einer inaktiven Proteinase wieder eine aktive Form zu regenerieren.
Diese Anwendungsmöglichkeit wurde mit den mutierten 2A Proteinasen (Argl34:Glu; Beispiel 1), Phel30:Ser (M13-2A (Phel30:Ser); Beispiel 7), Phel30:Leu (M13-2A (Phel30:Leu); Beispiel 7), und Phel30:Tyr (M13-2A (Phel30:Tyr); Beispiel 9) überprüft, indem die VP1/2A Genregionen dieser drei inaktiven Proteinasen mittels der PCR Mutagenese analog in den Beispielen 7 und 9 erneut mutagenisert wurden. Wie im Beispiel 10 näher beschrieben wird, konnten nur im Fall der mutierten 2A Proteinase Phe:Tyrl30 Revertanten isoliert werden, die in ihrer Aktivität soweit wieder verbessert worden sind, daß ihre Expression sowohl blaue Plaques hervorruft, als auch in Immunoblot ein reifes 2A Molekül erkennen läßt.
Die Beispiele 1 bis 7 sowie 9 und 10 beschreiben das M13 Farbtestsystem als eine Methode, mit der die sogenannte "eis" oder intramolekulare Spaltung der 2A Proteinase studiert werden kann. Es ist aber bekannt, daß die 2A Proteinasen der Polio- und Rhinoviren auch ein wirtseigenes Protein spalten; diese Reaktion, die also intermolekular oder in "trans" erfolgt, führt indirekt zu der Spaltung des p220 Proteins und dadurch zu der Inhibierung der Translation der wirtseigenen, mit einer sogenannten "Cap"-Struktur versehenen mRNAs. Da weder der Mechanismus dieser Spaltung noch das Aminosäurepaar, das gespalten wird, bekannt sind, ist es von Interesse, ein System zu entwickeln, mit dem man diese intermolekulare Spaltung untersuchen kann.
Ein solches System ist weiterhin zu verwenden, um Inhibitoren, die die intermolekulare Spaltung verhindern, auf ihre Wirksamkeit hin zu untersuchen. Der Unterschied zwischen den zwei Spaltungsvorgängen wird aus Figur 15 ersichtlich.
Das M13 Farbtestsystem wurde modifiziert, um eine Untersuchung der intermolekularen Spaltung zu ermöglichen. Zu diesem Zweck wurden drei Phagenkonstrukte erstellt, die mit M13/ΔlacZ2A, M13/ΔlacZ2AΔ2B und M13/ΔlacZ2AΔ3Gly bezeichnet wurden. Die Konstrukte M13/ΔlacZ2A und M13/ΔlacZ2AΔ2B enthalten eine aktive 2A Proteinase während das Konstrukt M13/ΔlacZ2AΔ3Gly eine inaktive 2A Proteinase enthält. Als Substrat lieferndes Plasmid für ein aktives 2A Molekül wurde das Plasmid pBR2A~ konstruiert, das nach Transformation in E.coli und Induktion des Expressionsblocks mit IPTG ein lacZ/ΔVPl/Δ2A/8F5 Fusionsprotein ergibt. Auch verwendbar als Substrat liefernde Plasmide sind solche, die nach Transformation in E. coli und Induktion des Expressionsblocks ein Fusionsprotein aus dem sogenannten α-Fragment und einem Polypeptidanteil, der von einer aktiven Proteinase in trans abspaltbar ist, ergeben. So ist beispielsweise auch ein Plasmid zu verwenden, das ein Fusionsprotein lacZ/ΔVPl/Δ2A, lacZ/ΔVPl/2A(R134:Q)Δ2B oder lacZ/ΔVPl/Δ2A(Δ3Gly) ergibt.
Zur Untersuchung der trans-Aktivität sind auch die Fusionsproteine als solche zu verwenden. Bei diesem Testsystem werden die zur α-Komplementation erforderlichen Peptidbestandteile, die inaktive Form der ß-Galaktosidase, die Δ M15 ß-Galaktosidase, und die inaktive Form des sogenannten α-Fragments mit der zu untersuchenden Proteinase in Gegenwart eines spaltbaren Substrats der aktiven ß-Galaktosidase, dessen Spaltprodukt sich durch eine Farbreaktion zu erkennen gibt, beispielsweise das synthetische Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-Galaktopyranosid (X-Gal), zusammengebracht.
Die genomische DNA der drei oben genannten Phagenkonstruktionen wurde in Anwesenheit von IPTG und X-gal in E coli JM101 Bakterien, die das Plasmid pBR/2A~ besitzen, transformiert. Die daraus resultierenden Plaques zeigt Figur 17. Es ist deutlich zu sehen, daß die von den Bakteriophagen M13/ΔlacZ2A und M13/ΔlacZ2AΔ2B gebildeten Plaques dunkelblau sind; im Gegensatz dazu sind die von dem Bakteriophagen M13/ΔlacZ2AΔ3Gly gebildeten Plaques farblos. Es war daher anzunehmen, daß die 2A Proteinasen von M13/ΔlacZ2A und M13/ΔlacZ2AΔ2B die 2A Spaltstelle auf dem Fusionsprotein von pBR2A~ prozessieren und dadurch das α-Fragment freisetzen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden die Fusionsproteine von Bakteriophagen aus blauen und farblosen Plaques wie oben beschrieben induziert und aufgearbeitet. Die exprimierten Proteine wurden dann in Immunoblots mit dem Antikörper 8F5 (Skern et al., 1987, J. General Virology, 68, 315-332) und mit dem Antiserum PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.) behandelt. Die Bindungstellen dieser Antikörper auf den Fusionsproteinen sind in Figur 16 schematisch dargestellt. Figur 18 A zeigt einen Immunoblot mit dem 8F5 Antikörper. In den Proteinextrakten von Bakterien, die entweder nur das Plasmid ρBR2A~ besitzen (Spur 2) oder zusätzlich mit der inaktiven Variante M13/ΔlacZ2AΔ3Gly infiziert worden sind (Spur 5), d.h. mit M13 Phagen aus farblosen Plaques, wird eine Bande von 26 kDa sichtbar; im Gegensatz dazu weisen die Extrakte-von Bakterien, die mit einer aktiven Variante (also mit M13 Phagen aus blauen Plaques) infiziert worden sind, eine zusätzliche Bande von 20 kDa auf (Spur 3 und 4). Die 26 kDa Bande entsteht aus den Aminosäuren des α-Fragments, ΔVP1, Δ2A und der 8F5 Bindungstelle (ΔVP2); die 20 kDa Bande entsteht aus der 26 kDa Bande, wenn ein aktives 2A Molekül die 2A Spaltstelle prozessiert und dabei das α-Fragment und die Aminosäuren von ΔVP1 abspaltet.
it dem Antiserum PC20 wurde überprüft, ob ein aktives 2A Molekül in den induzierten Fusionsproteinen von blauen Plaques zu finden ist. Wie in Figur 18B zu ersehen ist, wurde eine Bande von 18 kDa in Proteinen von einem farblosen Plaque (d.h. von der Variante M13/ΔlacZ2AΔ3Gly) detektiert, die einem Fusionsprotein aus den verbliebenen 8 Aminosäuren des α-Fragmentes, den 28 wAminosäuren von ΔVP1 und den 142 Aminosäuren von 2A entspricht. In den induzierten Fusionsproteinen von blauen Plaques (d.h. von der Variante M13/ΔlacZ2A) wurde hingegen eine Bande von 15 kDa gefunden, die einer freien 2A Protease entspricht. Kein Signal wurde mit der Konstruktion M13/ΔlacZ2AΔ2B gefunden, da das Antiserum nur ein 2A Molekül erkennt, das einen freien C-Terminus besitzt.
Zur Erweiterung des Testsystems wurde ein System entwickelt, mit dem die proteolytisehe "Trans"-Aktivität der 2A Proteinase aus bakteriellen Extrakten auch in vitro überprüft werden kann. Wie in Beispiel 11 beschreiben wird, wurde ein Plasmid aus einer Kaninchen ß-Globin Sequenz und einer HRV2 Sequenz konstruiert, mit dem jedes beliebige DNA Fragment in vitro transkribiert und translatiert werden kann. In diesem Fall wurde jeweils ein cDNA-Fragment von HRV2 und HRV14 exprimiert, das der RegionΔVPl/Δ2A bzw.ΔVP3/VP1/Δ2A entspricht. Das Translationsprodukt der HRV2 VP1/Δ2A konnte mit bakteriellen Extrakten von M13-2A oder pBR2A/l und pBR2A/2, die ein reifes 2A exprimieren, gespalten werden. Im Gegensatz dazu wurde in bakteriellen Extrakten mit M13-2AΔ3Gly oder pBR2A~, die kein reifes 2A Protein exprimieren, keine Spaltung gefunden. Dieses System kann daher verwendet werden, die Anwesenheit aktiver 2A Moleküle in bakteriellen Extrakten zu überprüfen. Überraschenderweise konnte keine Spaltung der HRV14ΔVP3/VP1/Δ2A Region von bakteriellen Extrakten mit HRV2 2A gefunden werden. Es wurde daraus geschlossen, daß die Spezifizität der
HRV2 2A Proteinase nicht auf die Spaltsequenz von
HRV14 eingestellt ist.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, daß das M13
Farbtestsystem überraschenderweise verwendet werden kann, um die intermolekulare Spaltung
("trans"-Spaltung) von 2A Proteinasen zu untersuchen.
Gegenstand der Erfindung sind im einzelnen die in den Ansprüchen gekennzeichneten Vektoren, die DNA-Moleküle, die Fusionsproteine, die mit den Vektoren transformierten Wirtsorganismen sowie die Verwendung der Vektoren und der Fusionsproteine als Testsysteme.
Wirksame Inhibitoren der viralen Proteinase-Aktivität beeinflussen beim Einsatz der erfindungsgemäßen in vivo Farbtestsysteme die α-Komplementation mehr oder weniger stark, was sich durch mehr oder weniger stark gefärbte Bakterien zeigt.
LEGENDEN ZU DEN FIGUREN
Figur 1 zeigt die Konstruktion von M13-18521R und M13-18521Q.
Figur 2 zeigt das Ausmaß der α-Komplementation bei M13-18521R und M13-18521Q.
Figur 3 zeigt die Konstruktion von M13-I-18521R und M13-I-18521Q sowie von M13-I-18521R-MluI und M13-I-18521Q-M1UI. Figur 4 zeigt die verwendeten Mutationsoligo- nukleotide.
Figur 5 zeigt das Ausmaß der α-Komplementation von M13-18521Q und von den Rückmutanten zu M13-18521R. Der Pfeil mit dem Buchst.aben Q weist auf einen "Plaque" mit M13-18521Q Phagen hin und der Pfeil mit dem Buchstaben R auf einen "Plaque" mit M13-18521R Phagen.
Figur 6 zeigt das Ausmaß der α-Komplementation nach Einführung der Sall-Schnittstelle an die Aminosäureposition 44/45 der ß-Galaktosidase bei M13-I-18521R-MluI (A) und M13-I-18521Q-MluI (B) und nach Einführung an Aminosäureposition 42/43 bei M13-I-18521R-MluI (C) und M13-I-18521Q-MluI (D) .
Figur 7 zeigt die Konstruktion von M13-I-18521R-MluI/SalI und M13-I-18521Q-MluI/SalI einmal für (44/45) und (42/43).
Figur 8 zeigt die Konstruktion von M13-2A und M13- Δ3Gly.
Figur 9 zeigt den Immunoblot eines 15%-igen, denaturierenden Proteingels mit induzierter 2A Proteinase aus verschiedenen M13-Klonen. Der Nachweis der 2A Proteinase erfolgt über das polyklonale Antiserum gegen das Peptid PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.)
Spur M: Markerproteine
Spur 1,4: * induzierte 2A Proteinase aus M13-2A Spur 2: induzierte 2A Proteinase aus M13-Δ3Gly Spur 3,5: induzierte 2A Proteinase aus M13-I-18521R-Mlul/Sall Die Zahlen (Einheit: Kilodalton) mit kleinem Pfeil weisen auf ausgewählte molekulare Grδßenmarker. Die Zahlen (Einheit: Kilodalton) mit großem Pfeil weisen auf die prozessierte, aktive 2A Proteinase (15) und - auf die nicht prozessierte, inaktive 2A Proteinase (24). Die 2A Proteinase aus M13-I-18521R-MluI/SalI besitzt keinen freien Carboxyterminus und wird daher von dem anti-PC20 nicht erkannt.
Figur 10 zeigt schematisch die Neuschaffung von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme um die Spaltstelle von HRV2-2A und im kodierenden Teil von HRV2-2A.
Nicht fett gedruckte Restriktionsenzyme geben die ursprünglich schon in pEx2A vorhandenen Erkennungssequenzen wieder; eingerahmte, fettgedruckte weisen auf die neu eingeführten ErkennungsSequenzen in pΞx2A/21 und pEx2A/II hin. AS bedeutet Aminosäuren.
Figur 11 zeigt das doppelsträngige Oligonukleotid zur Herstellung von pEx2A/21, einer Restriktions-modifizierten Variante von pEx2A.
Das Oligonukleotid ist von einer Acc I bzw. einer BstΞ II Stelle flankiert; die fettgedruckten Restriktionsstellen wurden mit Hilfe der geänderten Nukleotidsequenz des Mutationsoligos unter Beibehaltung der ursprünglichen Aminosäuresequenz in die DNA eingebracht.
Kleinbuchstaben weisen auf die ursprüngliche Sequenz der HRV2-CDNA hin; Großbuchstaben zeigen die modifizierte Sequenz an. Mit einem Strich versehene Nukleotide geben die Erkennungssequenz für das jeweilige Restriktionsenzym an. Figur 12 zeigt die verwendeten PCR Amplifikations- oligonukleotide (1987: 5•GTTACCCAACTTAATCG3' und 1988: 5'GTTACGTTGGTGTAGATG3') und ihre Lage auf dem Genom des Phagen M13-2A.
Figur 13 zeigt Immunoblots von Expressionsproteinen aus Phagen von 30 ausgewählten Plaques. Die mit IPTG induzierten Proteine wurden auf 15%-igen, denaturierenden Polyacryamidgelen aufgetrennt; die daraus resultierenden Blots wurden mit dem Antiserum gegen das Peptid PC20 (Sommergruber, W. , et al., 1989, loc. cit.) inkubiert.
Im Teil A wurden die mit IPTG induzierten Proteine von 20 Phagen, die farblose Plaques zeigten, untersucht. Der geschlossene Pfeil gibt die Position der Bande an, die einem Fusionsprotein aus dem α-Fragment und einem inaktiven 2A Molekül entspräche (24 kD), der offene Pfeil gibt die Position von dem reifen 2A Molekül (15 kD) an. Bei 15 der 20 Proteine ist das α-Fragment/inaktive 2A Fusionsprotein zu sehen. Bei den Proben Wl, W5, W12, W17 und W18 ist kein Fusionsprotein dieser Größe ersichtlich; es handelt sich bei diesen Proben um Deletionsmutanten (Wl, W5, W12, W17) oder um Mutanten (W18) die ein vorzeitiges Stoppcodon besitzen. In solchen Fällen wird die Aminosäuresequenz, die von dem Antiserum PC20 erkannt wird, nicht translatiert. Im Fall der Probe W17 ist auch ein Signal für ein reifes 2A Molekül zu erkennen; weitere Versuche zeigten, daß es sich um eine Mischpopulation von M13 Phagen handelte, bestehend aus Wildtypphagen und der oben erwähnten Deletionsmutante (W17) . Im Teil B wurden die mit IPTG induzierten Proteine von 6 Phagen, die blauen Plaques zeigten, und von 4 Phagen, die hellblaue Plaques zeigten, untersucht. Der geschlossene Pfeil gibt die Position der Bande an, die einem Fusionsprotein aus dem α-Fragment und einem inaktiven 2A Molekül, entspräche (24 kD), der offene Pfeil gibt die Position des reifen 2A Molekül (15 kD) an. Bei allen 6 Phagen, die blauen Plaques zeigten, wurde ein reifes 2A Molekül detektiert; dies war auch der Fall bei dem Phagen H3. Bei den Phagen H2, H4 und H5 wurde nur ein α-Fragment/inaktive 2A Fusionsprotein gefunden. In diesen Fällen wurde angenommen, daß genug α-Fragment frei gesetzt wurde, um eine α-Komplementation zu bekommen, daß aber die Menge an reifer 2A unter der Nachweisgrenze lag.
Figur 14 zeigt die Aminosäureaustausche, die durch die DNA-Analyse der Mutanten gefunden worden sind.
Im Teil A sind die Aminosäureaustausche angegeben, die auf einem einzelnen Nukleotidaustausch im Bakteriophagengenom zurückzuführen sind. Die Austausche wurden in den Genomen von Bakteriophagen gefunden, die wie folgt abgeleitet worden sind: blaue Plaques, geschlossene Kreise; hellblaue Plaques, gekreuzte Kreise; farblose Plaques, offene Kreise.
Teil B zeigt die Aminosäureaustausche, die auf mehreren Nukleotidaustauschen im Phagengenom beruhen. Mutante 1 ergab blaue Plaques, alle anderen Phagenmutanten führten zu farblosen Plaques. Die einzelnen Mutationen sind: Mutante 1, Met 5:Val und Ile 127:Arg; Mutante 2, Ile-4:Väl und Phe 130:Ser; Mutante 3, His 8:Tyr und Lys 109:Glu; Mutante 4, Ile 28:Thr und Cys 112:Arg; Mutante 5, Asn 65:His und His 114:Arg; Mutante 6, Ile 70:Thr und Gly 99:Ser; Mutante 7, Cys 106:Arg und Lys 109:Glu; Mutante 8, Val 7:Ala, Glu 102:Gly und Phe 130:Ser. Figur 15 zeigt den Unterschied zwischen intramolekularer Spaltung (in "eis") und intermolekularer Spaltung (in "intra-trans") . Das α-Fragment ist als schwarzer Block und die aktive Proteinase als offener Block dargestellt; eine inaktive Proteinase ist mit einem durch Schrägstriche gefüllten Block dargestellt. Proteinasespaltstellen sind durch einen dicken, schwarzen Strich gekennzeichnet.
Figur 16 zeigt die Konstruktionen M13/ΔlacZ2A, M13/ΔlacZ2AΔ2B, M13/ΔlacZ2AΔ3Gly und pBR2A~, wie sie für die Untersuchung der intermolekularen Spaltung eingesetzt wurden. Die Herstellung der vier Konstruktionen ist im Text ausführlich beschrieben. Wenn E. coli JM101 Bakterien, in denen zuvor das Plasmid pBR2A~ eingeschleust worden war, mit der Konstruktion M13/ΔlacZ2A oder M13/ΔlacZ2AΔ2B transfiziert wurden, konnte eine α-Komplementation beobachtet werden. Diese sind mit Plus gekennzeichnet. Keine α-Komplementation wurde hingegen nach Transfektion mit der Konstruktion M13/ΔlacZ2AΔ3Gly gefunden, gekennzeichnet durch - Zeichen.
Figur 17A zeigt das Ausmaß der α-Komplementation in E. coli JM101 ohne pBR2A~ (Bilder 1 und 4) und mit pBR2A~ (Bilder 2 und 3) nach Transfektion mit:
Bild 1: M13/ΔlacZ2AΔ2B
Bild 2: M13/ΔlacZ2AΔ2B
Bild 3: M13/ΔlacZ2A
Bild 4: M13/ΔlacZ2A Figur 17B zeigt das Ausmaß der α-Komplementation in E. coli JM101 mit pBR2A~ nach Transfektion mit:
Bild 1: M13/ΔlacZ2AΔ2B Bild 2: M13/ΔlacZ2A Bild 3: M13/ΔlacZ2AΔ3Gly
Figur 18 zeigt den Immunoblot von zwei 15%-igen, denaturierenden Polyacryamidgelen, auf denen die mit IPTG induzierten Proteine von JM101 Zellen aufgetrennt sind. Immunoblot A wurde mit dem Antikörper anti 8F5 inkubiert (Skern et al, J. Gen. Virol., 68, 315-323, 1987), Immunoblot B mit dem Antiserum gegen das Peptid PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit).
Spur M: Markerproteine
Spur 1: E. coli JM101 Bakterien ohne Plasmid Spur 2: E. coli JM101 Bakterien mit pBR2A~ Spur 3: E. coli JM101 Bakterien mit pBR2A~ transfiziert mit M13/ΔlacZ2A Spur 4: E. coli JM101 Bakterien mit pBR2A~ transfiziert mit M13/ΔlacZ2AΔ2B Spur 5: E. coli JM101 Bakterien mit pBR2A~~ transfiziert mit M13/ΔlacZ2AΔ3Gly
Die linksstehenden Zahlen (Einheit: Kilodalton) weisen auf die Proteine hin, die von pBR2A~ exprimiert werden: das prozessierte Δ2A/ΔVP2-8F5-Substrat (20) und das nicht prozessierte lacZ/ΔVPl/Δ2A/Δ2B-8F5-Substrat (26) . Die rechts stehenden Zahlen kennzeichnen die prozessierte, aktive 2A Proteinase (15) und die nicht prozessierte, inaktive 2A Proteinase (18). Die 2A Proteinase von der Konstruktion M13/ΔlacZ2AΔ2B besitzt keinen freien Carboxyterminus und wird daher von dem anti-PC20 nicht erkannt. Figur 19 zeigt Immunoblots von Expressionsproteinen aus Phagen von den in Beispiel 9 ausgewählten 17 Plaques. Die mit IPTG induzierten Proteine wurden auf 15%-igen, denaturierenden Polyacrylamidgelen aufgetrennt; die daraus resultierenden Blots wurden mit dem Antiserum gegen das Peptid PC20 ( W. Sommergruber, loc. cit.) inkubiert.
Der geschlossene Pfeil gibt die Position der Bande an, die einem Fusionsprotein aus dem α-Fragment und einem inaktiven 2A Molekül entspricht (24 kD) . Der offene Pfeil gibt die Position von dem reifen 2A Molekül (15 kD) an.
Teil A zeigt die mit IPTG induzierten Proteine von 5 M13 Phagen, die farblose Plaques bewirken. Bei den Proben W21 und W28 ist das α-Fragment/inaktive 2A Fusionsprotein zu sehen (geschlossener Pfeil) . Bei den Proben W24, W29 und W30 ist kein Fusionsprotein dieser Größe ersichtlich; es handelt sich hierbei um Deletionsrautanten oder um Mutanten, die ein vorzeitiges Stoppkodon besitzen. In solchen Fällen wird die Aminosäuresequenz, die von dem Antiserum PC20 erkannt wird, nicht translatiert.
Teil B zeigt die mit IPTG induzierten Proteine von Phagen aus 7 verschiedenen, hellblauen Plaques. In fünf der sieben Proteine ist nur das α-Fragment/inaktive 2A Fusionsprotein sichtbar. Bei den Proben H15 und H16 ist kein Fusionsprotein dieser Größe ersichtlich; es handelt sich bei diesen Proben wiederum um Deletionsmutanten oder um Mutanten, die ein vorzeitiges Stoppkodon besitzen. Bei den Proben H6, H7, H9, H13 und H14 wurde nur ein α-Fragment/inaktive 2A Fusionsprotein gefunden. In diesen Fällen wird angenommen, daß genügend α-Fragment freigesetzt wird, um eine α-Komplementation nachweisen zu können, die Menge an reifer Proteinase 2A aber unter der Nachweisgrenze des Immunoblots liegt.
Teil C zeigt die mit IPTG induzierten Proteine von Phagennachkommen aus 5 verschiedenen blauen Plaques. In allen Fällen wird ein reifes 2A Molekül detektiert.
Figur 20 zeigt die Aminosäureaustausche, die durch die DNA-Analyse der Mutanten gefunden worden sind.
Im Teil A sind die Aminosäureaustausche angegeben, die auf einen einzelnen Nukleotidaustausch im Bakteriophagengenom zurückzuführen sind. Die Genome der Bakteriophagen werden wie folgt symbolisiert: geschlossene Kreise, Genome von Phagen aus blauen Plaques ; gekreuzte Kreise, Genome von Phagen aus hellblauen Plaques; offene Kreise, weisse Plaques.
Teil B zeigt die Aminosäureaustausche, die auf mehreren Nukleotidaus auschen im Phagengenom beruhen. Die einzelnen Mutationen sind: Mutante 1, Glyl:Ala und Ile 96:Thr; Mutante 2, Gly97:Val und Ilell9:Val. Beide Mutanten ergaben hellblaue Plaques.
Im Teil C sind die Aminosäureaustausche angegeben, die auf einen einzelnen Nukleotidaustausch im Bakterophagengenom zurückzuführen sind und eine Reaktivierung der Mutante Phel30:Tyr verursachen. Alle Revertanten zeigen einen blauen Phänotyp.
Figur 21 zeigt Immunoblots von Expressionsproteinen aus Phagen von 4 der im Beispiel 10 beschriebenen Plaques. Die mit IPTG induzierten Proteine wurden auf 15%-igen, denaturierenden Polyacryamidgelen aufgetrennt; die daraus resultierenden Blots wurden mit dem Antiserum gegen das Peptid PC20 ( W. Sommergruber, loc. cit.) inkubiert.
Der geschlossene Pfeil gibt die Position der Bande an, die einem Fusionsprotein aus dem α-Fragment und einem inaktiven 2A Molekül entspricht (24 kD), der offene Pfeil gibt die Position des reifen 2A Moleküls (15 kD) an. Im Gegensatz zu der Ausgangsmutante Phel30:Tyr wurde in den exprimierten Proteinen der drei Revertanten, die eine Reaktivierung der 2A verursachen, ein reifes 2A Molekül detektiert.
Figur 22 zeigt eine schematische Darstellung des HRV2 Genomes und eine Zusammenfassung der im Text beschriebenen Kaninchen ß-Globin 5* UTR/HRV2 Hybride. Der offene Rhombus stellt die 5' UTR von Kaninchen ß-Globin dar und die geschlossene Pfeile die ATG Kodons bei 449 und 611. Der schwarze Block stellt die translatierte Region von HRV2 dar; der mit schrägen Strichen gefüllte Block stellt den zusätzlich translatieten Abschnitt dar, der aus der Initiation der Translation am ATG Kodon 449 resultiert. S zeigt den Promoter der T7 RNA Polymerase.
Figur 23 zeigt die Konstruktionen GR1, GR2, GR5 und GR6. Die folgenden Restriktionsschnittstellen sind angegeben: A, AccI; B, BamHI; H, HincII; H3, Hindlll; N, Ncol; P, PstI; RI, Eco RI; RV, EcoRV; Sa, Sall; Sm, Smal. Die anderen Symbole sind mit denen in Figur 22 identisch. Die ersten und letzten Nukleotide des jeweiligen HRV2 cDNA Inserts sind angegeben. Figur 24 zeigt die verwendeten Oligonukleotide. Figur 25 zeigt die Konstruktionen pß+611 und pß-611. Die Nukleotidsequenz der Kaninchen ß-Globin 5' UTR in der positiven Orientierung (pß+611; Fig. 25A) und in der negativen Orientierung (pß-611; Fig. 25 B) sowie die ersten zwei Kodons von VP4 von HRV2 sind gezeigt. Die anderen Symbole sind mit denen in Figur 22 identisch.
Figur 26 zeigt die Konstruktionen p20, pl, pß+449 und pß-449.
Im Teil Ai ist das Plasmid p20 dargestellt; die Nukleotidsequenz der Kaninchen ß-Globin 5' UTR (offene Rhombus) ist in der positiven Orientierung (die Sequenz ist identisch mit der von pß+611 in Figur 25). Die ersten 15 Kodons, die aus der Initiation der Translation am ATG Kodon 449 resultieren, sind gezeigt. Im Teil Aii ist die Einführung des 1.0 kb PstI Fragments von GR6 in ρ20 gezeigt; daraus resultiert das Plasmid pß+449.
Im Teil Bi ist das Plasmid pl dargestellt; die Nukleotidsequenz der Kaninchen ß-Globin 5' UTR (offene Rhombus) ist in der negativen Orientierung (die Sequenz ist identisch mit der von pß-611 in Figur 25) . Die ersten 15 Kodons, die aus der Initiation der Translation am ATG Kodon 449 resultieren, sind gezeigt. Im Teil Bii ist die Einführung des 1.0 kb PstI Fragments von GR6 in pl gezeigt; daraus resultiert das Plasmid pß-449.
Figur 27 zeigt das Fluorogramm eines 12,5%-igen Proteingels mit Translationsprodukten von RNAs der vier Plasmide pß+449, pß-449, pß+611 und pß-611. In Spur C ist das Ergebnis einer Translation ohne Zugabe von RNA dargestellt. Die Zahlen (Einheit: Kilodalton) weisen auf ausgewählte molekulare Grossenmarker. Der offene Pfeil weist auf das 35 kD Translationsprodukt vom ATG Kodon 449 und der geschlossene Pfeil auf das 30 kD Translationsprodukt vom ATG Kodon 611 hin. In der mit 8F5 markierten Spur ist das Ergebnis einer Immunfällung der Translationsprodukte von pß+611 RNA mit dem Antikörper 8F5 gezeigt; die 39kD Bande wurde spezifisch gefällt.
Figur 28 zeigt das Fluorogramm eines 12,5%-igen Proteingeles mit Translationsprodukten von RNAs der zwei Plasmide pßHRV14/sub (Spur 1) und pßHRV2/sub (Spur 2). In Spur C ist das Ergebnis einer Translation ohne Zugabe von RNA dargestellt. Die Zahlen auf der linken Seite (Einheit: Kilodalton) weisen auf ausgewählte molekulare Grossenmarker. Der offene Pfeil zeigt auf das 40 kD Translationsprodukt der RNA von pßHRV2/sub und der geschlossene Pfeil auf das 66 kD Translationsprodukt der RNA von pßHRV14/sub.
Figur 29 zeigt Fluorogramme von drei 12,5%-igen Proteingelen mit Translationsprodukten von RNAs der zwei Plasmide pßHRV2/sub und pßHRV14/sub nach Inkubation mit bakteriellen Extrakten.
Teil A zeigt das Fluorogramm das Ergebnis der Inkubation des Translationsprodukts der RNA von pßHRV2/sub mit folgenden bakteriellen Extrakten: Spur 1, keine Inkubation; Spur 2, M13-2A; Spur 3, M13-2AΔ3Giy; Spur 4, Plasmid pBR2A/l; Spur 5, Plasmid PBR2A/2; Spur 6, Plasmid pBR2A~. Die linken Zahlen (Einheit: Kilodalton) zeigen ausgewählte molekulare Grossenmarker. Der geschlossene Pfeil weist auf das 40 kD Translationsprodukt von der RNA -von pßHRV2/sub hin; der mit S markierte Pfeil weist auf das 32 kD Spaltprodukt und der mit SE markierte Pfeil auf das 30 kD Spaltprodukt hin. Diese Spaltprodukte sind nur nach Inkubation mit Extrakten, die eine aktive 2A Proteinase enthalten, nachzuweisen.
Teil Bi zeigt einen Immunoblot von Expressionsproteinen von in Beispiel 11 mit Ammoniumsulphat gefällten Extrakten. Die Proteine wurden auf 15%-igen, denaturierenden Polyacryamidgelen aufgetrennt; die daraus resultierenden Blots wurden mit dem Antiserum gegen das Peptid PC20 (W. Sommergruber, loc. cit) inkubiert. Die Extrakte sind folgende: Spur 1, M13-2A; Spur 2, pBR2A/l; Spur 3, PBR2A/2.
Die linken Zahlen (Einheit: Kilodalton) weisen auf ausgewählte molekulare Gr ssenmarker hin. Der offene Pfeil gibt die Position des reifen 2A Moleküls (15 kD) an.
Teil Bii zeigt das Fluorogramm der Produkte der Inkubation des Translationsprodukts der RNA von pßHRV2/sub mit folgenden bakteriellen Extrakten: Spur 1, keine Inkubation; Spur 2, M13-2A; Spur 3, pBR2A/l; Spur 4, pBR2A/2.
Die rechten Zahlen (Einheit: Kilodalton) weisen auf ausgewählte molekulare Grossenmarker hin. Der geschlossene Pfeil zeigt das 40 kD Translationsprodukt der RNA von pßHRV2/sub; der mit S markiertem Pfeil das 32 kD Spaltprodukt. Das 30 kD Spaltprodukt ist nicht mehr ersichtlich. In Teil C zeigt das Fluorogramm der Produkte der Inkubation des Translationsprodukt der RNA von pßHRV14/sub mit folgenden bakteriellen Extrakten. Spur 1, M13-2A; Spur 2, pBR2A/l; Spur 3, pBR2A/2.
Die linken Zahlen (Einheit: Kilodalton) zeigen ausgewählte molekulare Grossenmarker. Der geschlossene Pfeil weist auf das 66 kD Translationsprodukt von der RNA von pßHRV14/sub. Nach Inkubation mit den drei Extrakten ist keine Spaltung ersichtlich.
TABELLE 1
Verteilung der Nukleotidaustausche in VP1/2A Genen von Bakteriophagen, die eine normale, eine reduzierte und keine α-Komplementation zeigen.
Zahl der Plaquefarbe Mutationen/2A Gen
Farblos Hellblau Blau
0 - - 3
1 (Still) - . 1 1
1 9 2 2 1 + 1 (Still) 4
2 6 1 -
3 1 - -
20
TABELLE 2
Verteilung der Nukleotidaustausche in VP1/2A Genen von Bakteriophagen, die eine normale, eine reduzierte und kein α-Komplementation zeigen (Beispiel 9).
Zahl der Plaquefarbe Mutationen/2A Gen
Weiß Hellblau Blau
0 4 (->=W
1 (Still) 1 4 1 1 + 1 (Still) 2 1 3
17
Beispiel 1: Entwicklung eines in-vivo Farbtestsystems zur Überprüfung der cis-Aktivität der 2A Proteinase aus HRV2
Die zirkuläre, doppelsträngige Form (RF) des Bakteriophagengenoms- M13mpl8 wurde durch die Restriktionsendonuklease Pvul linearisiert und die überhängenden 3'-Enden mit Sl-Nuklease entfernt. Aus den Expressionsplasmiden pExl8521 und pExl8521Q (Sommergruber, W. et al., 1989, Virology 33., 68-77; pExl8521Q ist eine Mutante des pΞxl8521, wobei das Triplett für Argl34 ersetzt wurde durch ein Triplett für Gin) wurde jeweils ein AccI-Fragment isoliert und die AccI-Enden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Enzym) aufgefüllt. Das AccI-Fragment aus pExl8521 enthält die Information für die letzten 28 carboxyterminalen Aminosäuren von 1D (VP1), für die gesamte 2A Proteinase, für die ersten 39 aminoterminalen Aminosäuren von 2B und für 19 plasmidkodierte Aminosäuren (Figur 1) . Das AccI-Fragment aus pExl8521Q enthält die gleiche Information, nur sind in dem Gen der 2A Proteinase zwei Nukleotidaustausche durchgeführt worden. Das Kodon AGA, das für die Aminosäure Arginin an Position 134 in 2A kodiert, ist durch CAA, das für Glutamin kodiert, ersetzt worden. Durch diesen Aminosäureaustausch wird 2A inaktiviert. Die jeweiligen AccI-Fragmente wurden nach Standardmethoden mit der linearisierten M13-DNA ligiert und in E.coli JM101 bzw. JM109 transformiert. Die Phagennachkommen wurden in E.coli JM101 angezüchtet und die Phagengenome anschließend isoliert. Dies geschah ebenfalls nach Standardmethoden. Die Überprüfung der neuen, rekombinanten Phagengenome durch DNA-Sequenzierung (Sanger, F. et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sei.. 24, 5463-5467; Messing, J. et al., 1981, Nucleic Acids Res. JL, 309-321) ergab, daß nach dem Triplett für die 45. Aminosäure der ß-Galaktosidase im selben Leserahmen sich die Kodons für die 28 carboxyterminalen Aminosäuren des VP1 anschließen, gefolgt von der Nukleotidfolge für 2A, für den Aminoterminus von 2B und für die plasmidkodierten Aminosäuren (Die Numerierung der Aminosäuren der ß-Galaktosidase berücksichtigt nicht die Aminosäuren, die durch die Multilinkerregion in der Kodierungsregion der ß-Galaktosidase kodiert werden.). Die Phagennachkommen, deren rekorαbinantes Genom das aktive 2A Proteinasegen aus pExl8521 enthält, zeigen in Anwesenheit von IPTG und X-Gal eine gut sichtbare α-Komplementation. Im Vergleich dazu ist die Fähigkeit zur α-Komplementation bei Phagennachkommen mit einer inaktiven 2A Proteinase aus ρExl8521Q reduziert (Figur 2) . Im Falle der aktiven Proteinase sollten die Aminosäuren des α-Fragmentes mit dem 28 Aminosäuren umfassenden Carboxyterminus von VP1 fusioniert bleiben; im Falle der inaktiven Proteinase sollten sich noch zusätzlich 200 Aminosäuren von 2A, 2B und Teilen des Plasmids anschließen, da die inaktive Proteinase sich nicht über eine Spaltung an ihrem Aminoterminus freisetzen kann. Die am α-Fragment verbleibende, 228 Aminosäuren lange Polypeptidkette führt demnach zur Reduktion der α-Komplementation. Die Phagen, die eine aktive 2A Proteinase ausbilden können, werden M13-18521R genannt, und diejenigen, die eine inaktive Proteinase bilden, M13-18521Q. Die Fusionsproteine, die von diesen Konstruktionen exprimiert werden können, werden lacZ/ΔVPl/2A/Δ2B bzw. lacZ/ΔVPl/2A(R134:Q)/Δ2B genannt. Beispiel 2: Schaffung von singulären Schnittstellen in der Umgebung des 2A Gens
In Figur 1 ist zu erkennen, daß in den rekombinanten Phagengenomen das Gen für die aktive bzw. inaktive 2A Proteinase von zwei Hindlll Restriktionsschnittstellen flankiert wird. Für einen schnellen und gerichteten Austausch von verschiedenen 2A Genen ist es erforderlich, daß vor und nach dem Proteinasegen jeweils singuläre Restriktionsschnittstellen vorliegen. Dazu wurde die RF-DNA der Phagen M13-18521R und M13-18521Q mit Smal und Axyl behandelt, das Axyl-Ende mit Hilfe von Klenow-Enzym aufgefüllt und jeweils das größere der beiden entstandenen DNA-Fragmente isoliert. Parallel dazu wurden die gleichen Phagengenome mit der Endonuklease Hindlll geschnitten, die Hindlll-Enden ebenfalls aufgefüllt und diesmal jeweils das kleinere der beiden entstandenen DNA-Fragmente isoliert. Die gereinigten DNA-Fragmente aus den verschiedenen
Restriktionsansätzen wurden miteinander ligiert und in E.coli JM101 transformiert. Die neuen, rekombinanten Phagengenome wurden mit Hilfe der DNA-Sequenzierung überprüft. Die Sequenzierung ergab, daß sowohl für M13-18521R als auch für M13-18521Q durch diese Umklonierung 33 Nukleotide aus der Multilinkerregion des Genabschnittes des α-Fragmentes und insgesamt 285 Nukleotide aus dem Bereich der
Plasmidsequenzen und des M13-Genoms deletiert worden sind. Gleichzeitig wurde dadi ;ch ohne Beeinflußung des Leserahmens die vordere
Hindlll-Restriktionsschnittstelle eliminiert. Die hintere Hindlll-Schnittstelle wurde jedoch regeneriert (Figur 3). Außerdem wurden im Translationsprodukt dieses Gönomabschnittes 13 plasmidkodierte Aminosäuren durch 70 M13 kodierte Aminosäuren ersetzt. In einem zweiten Schritt wurde durch gerichtete Mutagenese (Taylor, J. w. et al., 1985a, Nucleic Acids Res. 13., 8749 - 8764; Taylor, J. W. et al., 1985b, Nucleic Acids Res. 13., 8765 - 8785) in die rekombinanten Phagengenome M13-I-18521R und M13-I-18521Q eine Mlul-Erkennungssequenz an der gleichen Position wie bei pEx2A/21 (s. Beispiel 6) eingefügt. Dazu wurden durch das verwendete Mutationsoligonukleotid 3 Nukleotide ausgetauscht (Figur 4 zeigt das verwendete Mutationsoligo¬ nukleotid) . Die Basenaustausche haben keinen Einfluß auf die Aminosäureabfolge. Die erfolgreiche Mutagenese wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Die neuen, rekombinanten Phagengenome M13-I-18521R-MluI und M13-I-18521Q-MluI enthalten demnach vor dem 5'-Ende des 2A-Gens eine singuläre
Mlul-Restriktionsschnittstelle und nach dem 3'-Ende des 2A-Gens eine singuläre Hindlll-Schnittstelle (Figur 3) .
Beispiel 3: Umwandlung der inaktiven 2A Proteinase in die aktive Form
Aufgrund der Ergebnisse aus Beispiel 1 wird die Hypothese bestärkt, daß die Fähigkeit des α-Fragmentes zur α-Komplementation durch die Fusionierung mit einer inaktiven 2A Proteinase stärker reduziert wird als mit einer aktiven 2A Proteinase. Dieser Unterschied in der α-Komplementatiσn wird in den verschiedenen Mengen an gebildetem 5,5*-Dibrüm-4,4,-dichlorindigo sichtbar (Figur 2). Zur Überprüfung der Hypothese, daß das α-Fragment durch Fusionierung mit einer inaktiven 2A Proteinase in seiner α-Komplementation eingeschränkt wird, ist es erforderlich, die inaktive 2A Proteinase wieder in eine aktive Form zurückzuführen. Dazu wurde ein Mutationsoligonukleotid (Figur 4) verwendet, das das Kodon CAA für Glutamin (Beispiel 1) in das Kodon CGT für Arginin verwandelt und somit wieder die Aminosäure der aktiven 2A Proteinase hergestellt wird. Das Triplett CGT wurde gewählt, um das aktive Gen der Ruckmutante von dem aktiven Gen der Wildtyp-Proteinase zu unterscheiden, das in dieser Position das Kodon AGA besitzt. Die nach der Mutagenese isolierten, rekombinanten Phagengenome wurden durch DNA-Sequenzierung überprüft. Figur 5 zeigt den Unterschied in der α-Komplementation zwischen inaktiver Proteinase und durch Rückmutation wieder aktiver Proteinase.
Beispiel 4: Einführung der Erkennungssequenz
S'GTCGACS* in den DNA-Abschnitt des α-Fragmentes der ß-Galaktosidase
Figur 2 in Beispiel 1 zeigt, daß das α-Fragment aus den Phagen M13-18521Q immer noch in der Lage ist, auch nach Fusionierung mit einer inaktiven 2A bis zu einem gewissen Ausmaße X-Gal umzusetzen. Um diesen Grundumsatz weiter zu reduzieren, wurden bei M13-I-18521R-Mlul und M13-I-18521Q-MluI durch gerichtete Mutagenese die singuläre Nukleotidsequenz 5'GTCGAC3' eingeführt (Figur 4), die von den Isoschizomeren Sall, AccI und HincII bzw. Hindll erkannt wird. Diese Erkennungssequenz wurde an zwei verschiedenen Positionen eingesetzt: 1. Die Kodonfolge ACC GAT, die für die 44. und 45. Aminosäure der ß-Galaktosidase kodiert, wurde in ACG TCG umgewandelt. Dadurch wurde die 45. Aminosäure der ß-Galaktosidase von Asparaginsäure nach Serin geändert. Die Basenfolge AC aus dem nächstfolgenden Kodon ACT vervollständigt die Sequenz 5'GTCGAC3'. Figur 6 zeigt, daß die Fähigkeit zur α-Komplementation durch diese Mutation nicht beeinflußt wird.
2. Die Kodonfolge GCC CGC, die für die 42. und 43. Aminosäure der ß-Galaktosidase kodiert, wurde in GCG TCG umgewandelt. Dadurch ändert sich die 43. Aminosäure der ß-Galaktosidase von Arginin nach Serin. Die Basen AC aus dem sich anschließenden Triplett ACC vervollständigen die Sequenz 5'GTCGAC3'. Figur 6 zeigt, daß dadurch allgemein die Fähigkeit zur α-Komplementation reduziert wird. Im Falle einer aktiven Proteinase führt der Aminosäureaustausch Arginin zu Serin an Position 43 der ß-Galaktosidase zu einer Reduktion der α-Komplementation. Im Falle der inaktiven Proteinase ist keine X-Gal-Spaltung mehr detektierbar.
Die Einführung der Erkennungssequenz 5'GTCGAC3' bietet zudem die Möglichkeit, andere cis-aktive Proteinasen, wie 3C Proteinasen aus Picornaviren oder die HIV Proteinase, an dieser Stelle mit dem α-Fragment der ß-Galaktosidase zu fusionieren, da diese Erkennungssequenz von 3 verschiedenen Restriktions- endonukleasen erkannt wird, die unterschiedlich schneiden. Dadurch kann individuell für jede gewünschte Proteinase der entsprechende Leserahmen gewählt werden. Die neuen, rekombinanten Phagen bzw. Phagengenome erhalten die Bezeichnung M13-I-18521R-MluI/SalI und M13-I-18521Q-MluI/SalI (Figur 7) . Beispiel 5: Nachweis der aktiven und der inaktiven 2A Proteinase im M13 Farbtestsystem mit dem polyklonalen Antiserum PC20
In den Beispielen 1 - 4 wird die aktive 2A Proteinase von der inaktiven Form aufgrund eines Farbtestsystems unterschieden. Eine zusätzliche Möglichkeit der Unterscheidung der beiden Proteinaseformen direkt auf der Proteinebene besteht darin, daß in den rekombinanten Phagengenomen M13-I-18521R-MluI/SalI bzw. M13-I-18521Q-MluI/SalI die Gensequenzen deletiert werden, die dem Carboxyterminus der 2A Proteinase folgen. Denn das Expressionsprodukt eines reinen 2A Proteinasegens kann durch das polyklonale Antiserum PC20 (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.) erkannt werden. Daher wurde in einem Umklonierungsschritt das BstΞII/Hindlll Fragment aus den rekombinanten Phagengenomen M13-I-18521R-MluI/SalI bzw. M13-I-18521Q-MluI/SalI jeweils durch ein BstEII/Hindlll Fragment aus den rekombinanten Plasmiden pEx2A/21 bzw. pExΔ3Gly ersetzt (Figur 8). Das BstEII/Hindlll Fragment aus pEx2A/21 enthält den Genabschnitt der aktiven 2A Proteinase; das BstEII/Hindlll Fragment aus pExΔ3Gly enthält die Gensequenz einer inaktiven 2A Proteinase, da die Tripletts für die drei Glycin Aminosäuren an den Positionen 104, 107 und 108 deletiert worden sind. ρExΔ3Gly läßt sich durch Deletion der Kodone für Gly 104, 107 und 108 aus der DNA des pEx2A/21 herstellen. Die neuen rekombinanten Phagengenome werden mit M13-2A (aktive Proteinase) bzw. M13-Δ3Gly (inaktive Proteinase) bezeichnet. Die Fusionsproteine, die von diesen Konstruktionen exprimiert werden können, werden lacZ/ΔVPl/2A bzw. lacZ/ΔVPl/Δ2A(3Gly) genannt. Im Westernblot können beide Proteinaseformen eindeutig voneinander unterschieden werden (Figur 9). Im Farbtestsystem zeigt das Genprodukt von M13-Δ3Gly keine α-Komplementation; im Falle von M13-2A ist eine α-Komplementation sichtbar.
Beispiel 6: Herstellung des Expressionsplasmides pEx2A/21
Ausgehend vom Expressionsplasmid pEx2A (Sommergruber, W. et al, 1989, loc. cit.) wurde ein AccI Fragment (ca. 700 bp) unter Standardbedingungen isoliert. Dieses Fragment umfaßt den C-Terminus von VP1, die gesamte kodierende Region von HRV2-2A (inklusive der Stoppkodons nach der letzten Aminosäure für die HRV2-2A), sowie Teile der Vektor-DNA (siehe Fig. 10). Das gereinigte AccI-Fragment von pEx2A wurde anschließend mit BstEII nachgeschnitten. Das größere BstEII/AccI-Fragment (ca. 635 bp) wurde vom kleineren AccI/BstEII-Fragment (ca. 115 bp) abgetrennt, gereinigt und unter Standardbedingungen mit einem synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotid (ca. 115 bp; siehe Fig. 11), welches dem kleinen AccI/BstEII-Fragment entspricht aber eine modifizierte Nukleinsäuresequenz aufweist, ligiert. Das neu rekombinierte AccI-Fragment wurde mit AccI nachgeschnitten, um multimere Formen zu zerstören, und in den ursprünglichen mit AccI linearisierten pEx2A-Vektor ligiert und in kompetente E. coli W6(λ) transformiert. Einige 100 Ampicillin-resistente Klone wurden erhalten und aufgrund von Restriktions- enzymanalysen 3 Klone ausgewählt und sequenziert. Ein Klon pEx2A/21 wurde wie oben beschrieben in E. coli 537 transformiert und exprimiert, wobei das Expressionsprodukt von pEx2A/21 ein identes Verhalten auf einem Westernblot zeigt wie das von pEx2A. Beispiel 7: Verwendung des M13 Farbtestsystems zur Ermittlung inaktiver 2A Mutanten
Die Mutagenese des Bereichs, der für den C-Terminus von VP1 und für die 2A Proteinase kodiert, wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) in vitro mutagenisiert (Leung, D.W. et al. (1989) Technique. A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology 1, 11-15). Die PCR-Amplifikation wurde nach Standardmethoden durchgeführt (Torgersen et al., 1989 J. Gen. Virol., 70, 3111-3116).
Amplifiziert wurde mit den Oligonukleotiden 1987 und 1988; die Sequenzen dieser Oligonukleotide und ihre Orientierung relativ zu den rhinoviralen Sequenzen ist in Figur 12 zu sehen. Die amplifizierte DNA wurde mit den Restriktionsenzymen Mlul und Hindlll geschnitten, das dadurch freigesetzte 450bp Fragment aus einem Agarosegel isoliert, mit dem 7.0kb Mlul/Hindlll Fragment von M13-2A ligiert und in Anwesenheit von IPTG und X-Gal in E.coli JM101 transformiert. Es konnten rund 1000 Plaques auf die Fähigkeit zur α-Komplementation überprüft werden. Im Gegensatz zu einer Transformation mit nicht mutagenisierter M13-2A DNA zeigten in diesem Fall ungefähr 5% der Phagennachkommen keine α-Komplementation und rund 1% eine reduzierte α-Komplementation.
Zur näheren Analyse wurden 30 verschiedene Plaques ausgewählt. 20 zeigten keine α-Komplementation (farblos), vier eine reduzierte (hellblau) und sechs eine normale (blau) . M13 Phagen aus den verschiedenen Plaques wurden jeweils mit einem Zahnstocher gepickt und zusammen mit 50μl einer Übernachtkultur von E. coli JM101 in 3ml L-Broth und ImM IPTG 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien abzentrifugiert und ohne Ultraschallbehandlung direkt in Probenpuffer (4% SDS, 125 M TrisHCL pH=6,8, 10% 2-Mercaρtoethanol, 10% Glycerin und 0,02% Bromphenol Blau) resuspendiert und 4 min bei 95°C erhitzt. Die exprimierten Proteine wurden dann auf Immunoblots mit dem Antiserum PC20 untersucht (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.). Das Ergebnis ist in Figur 13 zu sehen.
Die Nukleotidsequenzen der ΔVP1/2A Gene dieser 30 Phagen wurden durch DNA-Sequenzierung ermittelt und mit der Wildtypsequenz verglichen.
Diese Analyse der 30 verschiedenen Phagengenome deckt sich mit den Ergebnissen aus den Proteinstudien. Tabelle 1 und Figur 14 fassen die Ergebnisse zusammen.
Beispiel 8: Adaptation des M13 Farbtestsystems zur Untersuchung der intermolekularen Spaltung der HRV22A Proteinase
Das M13 Farbtestsystem wurde derart modifiziert, daß es eine Untersuchung der intermolekularen Spaltung ermöglicht. Zuerst wurde ein 1063bp Aval/Hindlll DNA Fragment aus dem Genom der M13-2A Konstruktion (Beispiel 5) isoliert; dieses Fragment enthält den gesamten lacZ/2A Expressionsblock. Nachdem einzelstrangige Restriktionsenden mit DNA Polymerase I (Klenow Fragment) aufgefüllt worden waren, wurde das DNA-Fragment in das 4282bρ Clal/Sall Fragment des Plasmides pBR328 (Boehringer Mannheim) kloniert. Es wurden zwei Plasmide, pBR2A/l und pBR2A/2, isoliert, die den gesamten lacZ/2A Expressionsblock jeweils in entgegengesetzter Orientierung enthalten. Ein 444bp Rsal DNA Fragment, das für die Aminosäuren 120 bis 193 des Kapsidproteins VP2 (1B) von HRV2 kodiert und daher die Bindungsstelle für den Antikörper 8F5 (Skern, T. et al., 1987, J. Gen. Virol., 68, 315-332) enthält, wurde in die singuläre Apal-Stelle des Plasmides pBR2A/l, die mit Sl-Nuklease "blunt-ended" gemacht worden war, ligiert; das daraus resultierende Plasmid wird als pBR2A~ bezeichnet (Figur 16) . Das Plasmid wurde in E. coli JM101 transformiert; wegen der Anwesenheit der Bindungsstelle für den Antikörper 8F5 ist die 2A Proteinase inaktiv, so daß sich nach Induktion des Ξxpressionsblockes mit IPTG ein lacZ/ΔVPl/Δ2A/8F5 Fusionsprotein ergibt.
Dieses Fusionsprotein dient als Substrat für ein aktives 2A Molekül, das von einem M13 Bakteriophagen kodiert wird. Das Genom dieses Bakteriophagen wurde derart konstruiert, daß die genomische DNA von M13-2A mit den Restriktionsenzymen EcoRI, das gleich am Anfang des Polylinkers schneidet, und AccI geschnitten wurde. Nach einer Auffüllreaktion mit DNA Polymerase I (Klenow Fragment) wurde das größere der beiden entstandenen Restriktionsfragmente religiert. Durch diese Behandlung werden die Aminosäuren des Polylinkers und die Aminosäuren 7 bis 43 des α-Fragmentes eliminiert; der Leserahmen bleibt jedoch intakt. Die Konstruktion wird als M13/ΔlacZ2A bezeichnet. Der Vorgang wurde mit der Konstruktion M13/2AΔ2B (entspricht M13-I-18521R-MluI/SalI) wiederhol ; die resultierende Konstruktion wird M13/ΔlacZ2AΔ2B genannt. Auf ähnliche Weise wurde eine Variante mit einer inaktiven 2A Proteinase (mit der Bezeichnung M13/ΔlacZ2AΔ3Gly) konstruiert; als Ausgangskonstruktion diente M13/Δ3Gly. Alle drei Konstruktionen sind in Figur 16 schematisch abgebildet. Die genomische DNA der drei oben genannten Phagenkonstruktionen wurde in Anwesenheit von IPTG (0,lmM) und X-gal (0,16mM) in E.coli JM101 Bakterien, die das Plasmid pBR/2A~ besitzen, transformiert. Die Fusionsproteine von Bakteriophagen aus blauen und farblosen Plaques wurden wie oben beschrieben induziert und aufgearbeitet. Die exprimierten Proteine wurden dann in Immunoblots mit dem Antikörper 8F5 und mit dem Antiserum PC20 behandelt. Die Bindungstellen dieser Antikörper auf den Fusionsproteinen sind in Figur 16 schematisch dargestellt. Figur 18 A zeigt einen Immunoblot mit dem 8F5 Antikörper. Mit dem Antiserum PC20 wurde überprüft, ob ein aktives 2A Molekül in den induzierten Fusionsproteinen von blauen Plaques zu finden ist. Wie in Figur 18B zu sehen ist, wurde eine Bande von 18 kDa in Proteinen von einem farblosen Plaque (d.h. von der Variante M13/ΔlacZ2AΔ3Gly) detektiert, die einem Fusionsprotein aus den verbliebenen 8 Aminosäuren des α-Fragmentes, den 28 Aminosäuren von ΔVP1 und den 142 Aminosäuren von 2A entspricht. In den induzierten Fusionsproteinen von blauen Plaques (d.h. von der Variante M13/ΔlacZ2A) wurde hingegen eine Bande von 15 kDa gefunden, die einer freien 2A Protease entspricht. Kein Signal wurde mit der Konstruktion M13/ΔlacZ2AΔ2B gefunden, da das Antiserum nur ein 2A Molekül erkennt, das einen freien C-Terminus besitzt.
Beispiel 9: Verwendung des Farbtestsystems zur
Ermittlung weiterer inaktiver 2A Mutanten
Aus dem Mutageneseversuch, der im Beispiel 7 beschrieben wird, wurden weitere 17 Plaques näher analysiert. Fünf zeigten keine α-Komplementation (weiß) , sieben eine reduzierte (hellblau) und fünf eine normale (blau) α-Komplementation. M13 Phagen aus den verschiedenen Plaques wurden jeweils mit einem Zahnstocher gepickt und zusammen mit 50 μl einer Übernachtkultur von E.coli JM101 und 1,5 ml L-Broth und ImM IPTG 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Bakterien abzentrifugiert, mit 1 ml Waschlösung (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA) gewaschen, erneut abzentrifugiert, in 200 μl Wasch¬ lösung resuspendiert und mit 50 μl 5 x LSB (20 % SDS, 725 mM TrisHCl, pH 6,8, 25 % 2-Mercaptoethanol, 50 % Glycerin und 1 % Bromphenolblau) 10 min. bei 95°C erhitzt. Die exprimierten Proteine wurden dann auf Immunoblots mit dem Antiserum PC20 untersucht (Sommergruber, W. et al., 1989, loc. cit.). Das Ergebnis ist in Figur 19 dargestellt.
Die Nukleotidsequenzen der VP1/2A Gene dieser 17 Phagengenome wurden durch DNA Sequenzierung ermittelt und mit der Wildtypsequenz verglichen. Die Auswertung der Sequenzvergleiche dieser 17 verschiedenen Phagengenome deckt sich mit den Ergebnissen aus den Proteinstudien. Tabelle 2 und Figur 20 fassen die Ergebnisse zusammen.
Beispiel 10:
Verwendung des M13 Farbtestsystems zur Reaktivierung inaktiver 2A Mutanten
Die Mutagenese des Bereiches, der für den C-Terminus von VP1 und für die 2A Proteinase kodiert, wurde mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion mutagenisiert. Die PCR-Amplifikation wurde nach Standardmethoden durchgeführt. Wie im Beispiel 7 beschrieben, wurden die DNAs der folgenden inaktiven 2A Mutanten amplifiziert; M13-2A(Phel30:Tyr), M13-2A(Phel30:Ser) , M13-2A(Phel30:Leu), (M13-I-18521Q-MluI/SalI(42/43) . Die amplifizierte DNA wurde wie im Beispiel 7 beschrieben behandelt und schließlich mit dem Vektor, ein 7,0 kb Mlul/Hindlll-Fragment von M13-2A, ligiert. Ungefähr 0,4 % der Phagennachkommen zeigten wieder eine Blaufärbung, was auf die Anwesenheit eines aktiven 2A-Moleküls hinweist.
Im Fall der Mutante M13-2A (Phel30:Tyr) zeigte die Sequenzanalyse von 2 blauen Nachkommen den Austausch Ser27:Pro, von 4 weiteren blauen Nachkommen den Austausch Hisl35:Arg und von 4 weiteren Nachkommen den Austausch Hisl37:Arg; ein weiterer blauer Plaque erwies sich als Ruckmutante bzw. ungeschnittene M13*2A-Vektor DNA. Eine Untersuchung der mit IPTG induzierten Proteine mit dem Antiserum PC20 (wie im Beispiel 7 beschrieben) zeigte, daß in diesen Fällen wieder ein reifes 2A Molekül vorhanden war. Die Proteinuntersuchungen sind in Figur 21 und die Lage der Mutationen, die zu der Reaktivierung der inaktiven 2A Mutante M13-2A (Phel30:Tyr) führen, in Figur 20 dargestellt.
Im Fall der Mutante M13-2A (Phel30:Ser) konnten keine "second site"-Revertanten gefunden werden. Alle untersuchten blauen Plaques waren Rückmutationen bzw. ungeschnittene M13-2A-Vektor-DNA.
Auch im Falle der Mutante M13-2A (Phel30:Leu) konnten ebenfalls* keine "second-site"-Revertanten gefunden werden; alle untersuchten blauen Plaques waren Rückmutationen bzw. ungeschnittene M13-2A-Vektor-DNA. Im Falle der Mutante (M13-I-18521Q-MluI/SalI(42/43) , welche an der Aminosäureposition 134 Arg:Glu (AGA:CAA) aufweist, konnten durch Sequenzanalyse bei 2 blauen Nachkommen Deletionen nachgewiesen werden, die durch Leserahmenverschiebung zu Stoppkodons im vorderen Teil der VPl/2A-Gens führten, wodurch eine α-Komplementation ermöglicht wurde. Bei 10 weiteren blauen Nachkommen konnte eine Rückmutation Glul34:Arg (CAA:CGA) nachgewiesen werden.
Beispiel 11: In vitro Translation von rhinoviralen cDNA Fragmenten zur Überprüfung der Aktivität viraler Proteinasen
Um das Testsystem zu erweitern, ist es von Interesse, ein Substrat zu entwickeln, mit dem die Enzymaktivit t der 2A Proteinase auch in vitro überprüft werden kann. Dazu werden VP1/Δ2A Genfragmente von HRV2 und HRV14 in Kaninchenretikulocytenlysaten exprimiert; das jeweils daraus resultierende, mit (Schwefel, 35S) markierte Protein wird dann mit bakteriellen
Extrakten, welche die mit IPTG induzierten Proteine aus verschiedenen M13-2A oder pBR2A Klonen enthalten inkubiert. Sollte die Spaltstelle prozessiert werden, wird das markierte, in vitro translatierte Protein gespalten; das Ergebnis kann auf einem
SDS-Polyacrylamidgel untersucht werden.
Konstruktion der Translationsplasmide
Zur Entwicklung eines Vektors, mit dem in Kaninchen- reticulocytenlysaten beliebige DNA Fragmente exprimiert werden können, wurde die 5' nicht translatierten Region (UTR) des Kaninchen ß-Globingens benutzt (van Ooyen, A.J.J, van den Berg, J., Mantei, N. und Weissmann, C. (1979), Science 206, 337 - 344). Ein Oligonukleotid mit dieser Sequenz wurde vor das ATG 449 bzw. 611 der HRV2 Sequenz plaziert, wie aus Figur 22 ersichtlich. ist. Die Initiation der Trans¬ lation von diesen ATGs sollte zu Proteinen mit einem Molekulargewicht von 35 kD (ATG449) bzw. 30 kD (ATG611) führen.
Als Klonierungsvektor für die 5' UTR des Kaninchen ß-Globins diente das Plasmid GR6 (Figur 23); es enthält die HRV2 Nukleotide 19 - 1400 in dem Plasmid pGEM2 (Promega) . Das Nukleotid 19 der HRV2 Sequenz ist rund 30 Basenpaare vom Transkriptionstart für die T7 RNA Polymerase entfernt. Dadurch entsteht nach in vitro Transkription eine RNA, die der Orientierung der genomischen RNA entspricht.
Für die Herstellung des Plasmids GR6 wurden drei Plasmide herangezogen, nämlich p773 (HRV2 Nukleotide 562-1012; Skern, T. et al., 1985, loc. cit.), pl9 (HRV2 Nukleotide 19-5100) (Duechler, M. et al., 1989, Virology 168, 159-161) und p860 (Skern, T. et al., 1985, loc. cit.). p860 enthält die HRV2 Nukleotide 660 bis 1400 in der PstI Schnittstelle von pUC9; die Orientierung ist so, daß Nukleotid 1400 neben der EcoRI Schnittstelle des Polylinkers liegt.
Das Plasmid ρGEM2 wurde mit den Restriktionsenzymen Hindlll und BamHI geschnitten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert; ebenfalls mit Hindlll und BamHI wurde das Plasmid p773 geschnitten. Das dadurch freigesetzte HRV2 Insert wurde aus einem Agarosegel eluiert und mit dem mit Hindlll/BamHI linearisierten pGEM2 Vektor ligiert. Nach Transformation in kompetente E.coli-Zellen wurde ein Plasmid isoliert, genannt GR1, dessen Struktur in Fig. 23 abgebildet ist. GR1 wurde dann mit den Restriktionsenzymen Hindlll und Ncol und mit alkalischer Phosphatase behandelt; ebenfalls mit Hindlll und Ncol wurde das Plasmid pl9 geschnitten. Dadurch entsteht ein 361bρ Hindlll/Ncol Fragment mit den Nukleotiden 248 bis 609 der HRV2 Genkarte. Dieses Fragment wurde aus einem Agarosegel eluiert und mit dem wie oben beschrieben behandelten GR1 Plasmid ligiert. Nach Transformation in kompetente E.coli-Zellen wurde ein Plasmid, GR2, isoliert, dessen Struktur in Figur 23 abgebildet ist. GR2 wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI geschnitten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt; ebenso wurde das Plasmid p860 mit EcoRI geschnitten. Das dabei entstehende 680bp Fragment von der EcoRI Stelle bei Nukleotid 743 der HRV2 Genkarte bis zur EcoRI Stelle des pUC9 Polylinkers (d.h. zu Nukleotid 1400 der HRV2 Genkarte) wurde isoliert und mit dem mit EcoRI geschnittenen, mit alkalischer Phosphatase behandelten GR2 Vektor ligiert. Nach Transformation in kompetente E.coli-Zellen wurde ein Plasmid, GR5, isoliert, dessen Struktur in Figur 23 abgebildet ist. Das Plasmid GR5 wiederum wurde mit dem Restriktionsenzym Hindlll geschnitten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm dephosphoryliert; ebenso wurde das Plasmid pl9 mit Hindlll behandelt. Das gebildete 240bp Fragment von der Hindlll Schnittstelle im Polylinker bis zur Hindlll Schnittstelle bei Nukleotid 248 der HRV2 Genkarte (d.h. Nukleotid 19 der HRV2 Genkarte bis 248) wurde mit dem linearisiertem GR5 Vektor ligiert. Nach Transformation in kompetente E.coli-Zellen wurde ein Plasmid isoliert, dessen Struktur in Figur 23 abgebildet ist (genannt GR6) . Die im Plasmid pl9 zwischen der Hindlll Stelle und dem Nukleotid 19 der HRV2 Genkarte liegenden Schnittstellen für die Restriktionsenzyme EcoRV und EcoRI sind naturgemäß auch im Plasmid GR6 zu finden.
Zur Herstellung eines Plasmids, das die Kaninchen 5' UTR des ß-Globingens vor das ATG bei Nukleotid 611 der HRV2 Sequenz enthält, wurde folgendermaßen vorgegangen: Das Plasmid GR6 wurde mit EcoRV und Ncol verdaut, das größere Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Nach Ligation mit den 5* phosphorylierten Oligonukleotiden EBI 1264 und 1250 (Figur 24; die Oligonukleotide wurden zusammen kurz auf 65°C gebracht und dann langsam auf 4°C gekühlt) und Transformation in kompetente E. coli 5K Zellen wurde ein Plasmid isoliert, das in Figur 25 schematisch dargestellt ist (pß+611 genannt) . Nach in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase entsteht eine RNA, die von der Transkriptionsstelle bis zur EcoRV Stelle, dem Beginn der ß-Globin 5* UTR, 18 Nukleotide umfaßt, gefolgt von den 52 Nukleotiden der gesamten ß-Globin 5'UTR und den Nukleotiden 611 bis 1400 der HRV2 Sequenz.
Auf ähnliche Art und Weise wurde ein Plasmid (Figur 25) konstruiert, das die ß-Globin 5' UTR in der umgekehrten Orientierung besitzt. Wiederum wurde das Plasmid GR6 mit Ncol verdaut. Nachdem die über¬ lappenden Εnden mit dem Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase I aufgefüllt worden waren, wurde mit EcoRV verdaut, das größere Fragment aus einem Agarosegel eluiert und mit den 5' phosphorylierten Oligonukleotiden EBI 1264 und 2497 ligiert (Figur 24; die Oligonukleotide wurden zusammen kurz auf 65°C gebracht und dann langsam auf 4°C gekühlt). Nach Transformation in kompetente E. coli-Zellen wurde ein Plasmid isoliert, dessen Struktur in Figur 25 abgebildet ist. (genannt pß-611) . Nach in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase entsteht eine RNA, die 18 Nukleotide von der Transkriptionstelle bis zur EcoRV-Schnittstelle umfaßt, gefolgt von den 52 Nukleotiden der inversen 5' UTR des ß-Globingens und den Nukleotiden 611 - 1400 von HRV2.
Zur Konstruktion eines Plasmids, das die 5' UTR des ß-Globingens vor dem ATG bei Nukleotid 449 der HRV2 Sequenz enthält, wurde folgendermaßen vorgegangen: Zuerst wurde Plasmid GR6 mit EcoRV und PstI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Anschließend wurde diese DNA mit den 5' phophorylierten Oligonukleotidpaaren EBI 1264/2497 (das der Sequenz der 5' UTR des ß-Globingens entspricht (Figur 24)) und UKCC 1660/1661 (das der HRV2 Sequenz 448 - 471 entspricht (Figur 24)) ligiert, wobei im Ligationsansatz das Verhältnis des Oligonukleotidpaares EBI 1264/2497 zu dem Paar UKCC 1660/1661 10:1 betrug. Beide Oligonukleotidpaare wurden kurz auf 65 °C gebracht und dann langsam auf 4°C gekühlt. Nach Transformation in kompetente E. coli 5K Zellen wurden zwei Plasmide ausgewählt: ρ20, das der Sequenz in Figur 26a entspricht und pl, das der Sequenz in Figur 26b entspricht. Beide Plasmide wurden mit PstI verdaut und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Anschließend wurden sie mit dem l,0kb PstI Fragment von GR6 ligiert und in kompetente E.coli Zellen transformiert. Ausgehend vom Plasmid p20 wurde ein Plasmid isoliert, in dem das klonierte l.Okb PstI Fragment die gleiche Orientierung zum T7 RNA Promoter hat wie in Plasmid GR6 (in Figur 27a); es wurde pß+449 genannt. Nach in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase entsteht eine RNA, die 18 Nukleotide von der Transkriptioninitiationsstelle bis zur EcoRV Stelle umfaßt, gefolgt von den 52 Nukleotiden der ß-Globin 5* UTR und den Nukleotiden 448 - 1400 der HRV2 Sequenz. In ähnlicher Weise wurde das 1,0 kb PstI Fragment in das Plasmid pl kloniert (Figur 26b); es wurde pß-449 genannt. Nach in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase entsteht eine RNA, die wiederum 18 Nukleotide von der Transkriptionsinitiationsstelle bis zur EcoRV Stelle umfaßt, 52 Nukleotiden der inversen ß-Globin 5' UTR und den Nukleotiden 449 - 1400 von HRV2.
In vitro Transkription dieser Plasmide nach Linearisierung mit BamHI mittels T7 RNA Polymerase wurde wie beschrieben durchgeführt (Düchler et al, 1989; EPA 0 356 695). Am Ende der Reaktionszeit wurde die DNA, durch Zugabe von DNase I (RNAse-frei, Pharmacia) verdaut und die RNA nach Zugabe von einem Drittel Volumen 8M Ammoniumacetat mit Ethanol gefällt. Nach nochmaliger Fällung mit Ethanol wurde die RNA anschließend in Wasser aufgenommen und ihre Qualität durch Agarosegelelektrophorese überprüft. Der Laufpuffer enthielt 1% SDS. Für-die in vitro Translation wurde jeweils 1 μg dieser RNAs eingesetzt. Die Reaktion enthielt in 20 μl 90 mM KC1, 0.3mM MgCl2, lOmM Kreatin- phosphat, 2μl 35S-Trans-Label (ICN; lOμCi/μl, lOOOCi/mmol) und 11,5 μl Kaninchen- reticulocytenlysat, das mit Micrococcal Nuclease (Sigma) behandelt worden war. Das Kaninchenreticulocytenlysat wurde nach der Methode von Jackson, R. und Hunt, T. (Methods in Enzymology, (S. Fleischer und B. Fleischer, Eds., Volume 96, 50 - 74 (1983)) durch Behandlung mit Micrococcal Nuclease hergestellt. Nach 1 Stunde bei 30βC wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 μl 200mM Methionin gestoppt und ein Aliquot (1 μl) auf einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen. Das Gel wurde nach Beendigung des Laufes fluorographiert.
In Figur 27 sind die Translationsprodukte der RNAs, die von den vier Plasmiden (pß+449, pß-449, pß+611 und pß-611) transkribiert worden sind, nach einer elektrophoretischen Auftrennung gezeigt. Translationsprodukte werden nur gefunden, wenn die ß-Globin 5'UTR in der positiven Orientierung vorliegt (pß+449 und pß+611), wobei überraschenderweise die Translation von dem ATG 449 (wird vermutlich nicht in vivo verwendet) stärker ist als die Translation vom ATG 611, das vermutlich in vivo verwendet wird. Die Translationsprodukte verhalten sich in ihren gelelektrophoretischen Eigenschaften entsprechend den aus der Aminosäuresequenz vorhergesagten Molekülmassen. Wie in Figur 27 zu ersehen ist, konnte das Translationsprodukt, das mit der RNA vom pB611+ erhalten wurde mit dem Antikörper 8F5 gefällt werden. Dieser Antikörper erkennt eine Aminosäuresequenz des Proteins VP2. (Skern, T., et al. (1987) J. Gen. Virol.,loc. cit). Dieses Ergebnis unterstützt die Annahme, daß die Translation in der Tat bei dem ATG 611 startet.
Da die Translation vom ATG 449 aber wesentlich stärker ist, wurde dieses System für die Exprimierung von anderen Fragmenten herangezogen. Das Plasmid p20 eignet sich sehr gut für solche Zwecke, weil es eine Reihe von Schnittstellen besitzt, die für die Insertion von Fragmenten benutzt werden können. Zum Beispiel erkennen die drei Enzyme AccI, Hindll und Sall die Sequenz 5' GTCGAC 3'; die Position der enzymatischen Spaltung ist bei diesen Restriktionsenzymen aber verschieden. Sall schneidet nach dem ersten G, AccI nach dem T und Hindll nach dem ersten C. Daher kann jedes Fragment nach geeigneter Manipulation in den richtigen Leserahmen gebracht werden. Die weiteren Schnittstellen können verwendet werden, um das Plasmid vor der in vitro Transkription zu linearisieren.
Das Plasmid p20 wurde mit Hindll geschnitten und jeweils mit cDNA Fragmenten von HRV2 und einer HRV14 säureresistenten Mutante, HRV14-as3 (Skern, T., Torgersen, H., Auer, H., Kuechler, E. und Blaas, D. (1991), Virology, 183, 757 - 763), ligiert. Im Fall von HRV2 wurde ein SspI/XmnI-Fragment, das die Nukleotide 2368 - 3752 umfaßt, verwendet; im Fall der säureresistenten Mutante von HR14 wurde ein Hpal Fragment mit den Nukleotiden 1810 - 3560 verwendet. Das SspI/XmnI Fragment von HRV2 wurde vom Plasmid pl9 (Duechler, M. , et al. 1989, loc. cit.) herausgeschnitten; das Hpal fragment der saureresistanten Mutante von HRV14 wurde aus dem Plasmid pHRV14-as3 (Skern, T. et al., 1991, Virology, loc. cit.) herausgeschnitten. Nach Transformation in E. coli 5K Zellen wurden in beiden Fällen Plasmide isoliert, in denen die Orientierung des HRV Inserts eine Translation der HRV Aminosäurensequenzen ermöglicht. Die Plasmide wurden pßHRV2/sub und pßHRV14/s*ub genannt. Vor in vitro Transkription mit T7 RNA Polymerase wurde das Plasmid pßHRV2/sub mit Apal geschnitten, so daß nur bis Aminosäure Glycin 99 transkribiert wurde. Das Plasmid pHRV14/sub wurde mit BamHI (die Schnittstelle liegt im Polylinker von p20) geschnitten; in diesem Fall wurde also bis zum Ende vom HRV14 Insert transkribiert, d.h. bis zu Aminosäure Leucin 122. Dadurch sind beide 2As in der cis-Spaltung inaktiv.
Die Translationsprodukte der von diesen Plasmiden in vitro transkribierten RNAs zeigt Figur 28. Das 40 kD Produkt entspricht einer Translation der VP1/Δ2A Region von HRV2, die im Plasmid pßHRV2/sub enthalten ist; das 66 kD Produkt entspricht einer Translation von der ΔVP3/VP1/Δ2A Region von HRV14, die im Plasmid pßHRVl4/sub enthalten ist.
Das Translationsprodukt von pßHRV2/sub wurde ' anschließend mit E. coli Extrakten inkubiert, die ein natives 2A enthielten, das entweder von einem M13 Genom oder von einem Plasmid aus exprimiert worden war. Dadurch soll überprüft werden, inwieweit die ΔVP1/Δ2A Region von der in Bakterien exprimierten HRV2 2A Proteinase gespaltet werden kann. Hierzu wurden die Proteine wie oben beschrieben mit IPTG induziert und die Zellen aufgearbeitet. Die Zellen von 1.5 ml Kultur für Plasmid-Konstruktionen bzw. 3 ml für M13-Konstruktionen wurden in 500 μi Waschlösung aufgenommen, mit Ultraschall aufgeschlossen und 15 μl (für M13-Konstruktionen) bzw. 10 μl (für Plasmid-Konstruktionen) vom Überstand mit 1 μl vom Translationsprodukt von pßHRV2/sub 3 Stunden bei 30°C inkubiert. Das Ergebnis der Inkubationen ist in Figur 29A gezeigt; nach Inkubation mit Extrakten von M13-2A bzw. von pBR2A/l und pBR2A/2 sind zwei weitere Banden (32 kD und 30 kD) zu sehen. Im Gegensatz dazu sind mit Extrakten von M13-2AΔ3Gly oder pBR2A~ keine weiteren Banden zu sehen, da kein aktives 2A exprimiert wurde. Die Anwesenheit zweier Spaltprodukte läßt zwei Erklärungen zu; entweder spaltet die 2A Protease das Translationsprodukt von pßHRV2/sub zweimal oder das korrekte Spaltprodukt wird von einer E.coli Protease zusätzlich prozessiert. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden bakterielle Extrakte von M13-2A und pBR2A/l bzw. pBR2A/2 durch eine Ammoniumsulphatfällung teilgereinigt. Die Extrakte wurden mit Ammoniumsulphat bis zu einer Endkonzentration von 30% versetzt. Die dadurch unlöslich gewordenen Proteine wurden abzentrifugiert und in 70 μl Waschlösung aufgenommen. Das Translationsprodukt von pßHRV2/sub wurde abermals mit diesen gefällten Extrakten inkubiert; in diesem Fall ist nur eine Bande zu sehen (Figur 29Bii) . Ein Immunoblot der gefällten bakteriellen Extrakte (Figur 29Bi) mit dem Antiserum PC20 zeigte die Anwesenheit von 2A. Daher wurde angenommen, daß die Spaltung der Translationsprodukt von 2A durchgeführt wurde und daß das Spaltprodukt von 32 kD von einer bakteriellen Protease weiter zum 30 kD Produkt prozessiert wird. Das 32 kD Spaltprodukt stellt den VPl Teil dar; der 2A Anteil, der aus der Spaltung des Ausgangsproduktes resultiert, ist zu klein (8 kD) , um auf diesem Gel gesehen zu werden.
Die Analyse der Inkubation des Translationsproduktes von pßHRV14/sub mit bakteriellen Extrakten die HRV2 2A enthalten, ist in Figur 29C gezeigt; überraschenderweise ist keine Spaltung festzustellen. Vermutlich wird die Sequenz von HRV14 zwischen VPl und 2A nicht erkannt, da die Sequenzen zwischen VPl und 2A in diesen Serotypen verschieden sind (TRPIITTA'GPSDMYVH für HRV2 und RKGDIKSY'GLGPRYGG) .

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es für ein Fusionsprotein aus dem α-Fragment des M13 Klonierungssystems mit einem proteolytisch abspaltbaren Polypeptidanteil kodiert.
2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der proteolytisch abspaltbare Polypeptidanteil aus einem enzymatisch aktiven und einem von diesem autokatalytisch abspaltbaren Anteil zusammengesetzt ist.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatisch aktive Anteil eine virale Proteinase ist.
4. DNA-Molekül nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die virale Proteinase die Proteinase 2A, 3C oder die HIV Proteinase, besonders bevorzugt, die HRV/2-2A ist.
5. DNA-Molekül nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es für das Fusionsprotein lacZ/ΔVPl/Δ2A/8F5 kodiert.
6. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Fusionsprotein aus dem α-Fragment des M13 Klonierungssystems mit einem proteolytisch abspaltbaren Polypeptidanteil exprimiert.
7. Vektor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Fusionsprotein aus dem α-Fragment des M13 Klonierungssystems mit einem Polypeptid aus einem enzymatisch aktiven Anteil und einem von diesem autokatalytisch abspaltbaren Polypeptidanteil exprimiert.
8. Vektor gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatisch aktive Anteil eine virale Proteinase ist.
9. Vektor gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymatisch aktive Anteil die virale Proteinase 2A, 3C oder die HIV Proteinase, besonders bevorzugt die HRV2-2A ist.
10. Vektor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er der Phage M13-18521R, M13-18521Q, M13-I-18521R-Mlu I oder M13-I-18521Q-MluI ist.
11. Vektor gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Erkennungssequenz für verschiedene Restriktionsendonukleasen aufweist, vorzugsweise die Sequenz 5'GTCGAC 3'.
12. Vektor gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es M13-I-18521R-MluI/SalI (44/45), M13-I-18521R-MluI/SalI (42/43), M13-I-18521Q-MluI/SalI (44/45), M13-I-18521Q-MluI/SalI (42/43), M13-Δ3Gly, M13-2A, ρBR2A/l, pBR2A/2 oder pBR2A~ ist.
*
13. Vektor gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression einer Proteinase, insbesondere einer viralen Proteinase ermöglicht.
14. Vektor gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression einer HIV- oder HRV-Proteinase ermöglicht.
15. Vektor gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß er die Expression der HRV2-Proteinasen, insbesondere der HRV2 2A-Proteinase ermöglicht.
16. Vektor gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er M13-2A, M13-Δ3Gly, PBR2A/1 oder pBR2A/2 ist.
17. Vektor gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß er das DNA-Molekül gemäß Anspruch 5 enthält.
18. Verwendung der DNA oder der Vektoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Herstellung einer Proteinase, insbesondere von viralen Proteinasen.
19. Verwendung der DNA oder der Vektoren gemäß Anspruch 18 zur Herstellung der HIV- oder HRV-Proteinasen.
20. Verwendung der DNA oder der Vektoren gemäß Anspruch 19 zur Herstellung der HRV2 2A Proteinase.
21. Fusionsprotein, das durch ein DNA-Molekül oder durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 17 exprimiert wird.
22. Fusionsprotein gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es lacZ/ΔVPl/Δ2A78F5, lacZ/ΔVPl/2A (R134:Q)Δ2B, lacZ/ΔVPl/2A/Δ2B, lacZ/ΔVPl/2A oder lacZ/ΔVPl/2A (Δ3Gly) ist.
23. Protein, das durch ein DNA-Molekül oder durch einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 17 exprimiert und durch Abspaltung des α-Fragmentes des M13-Klonierungssystems gebildet wird.
24. Verfahren zur Teilreinigung der Proteine gemäß den Ansprüchen 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine fraktionierte Proteinfällung durchgeführt wird und die ausgefallenen Proteine nach Zentrifugation in einem geeigneten Puffer gelöst werden.
25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß Proteinextrakte der Wirtsorganismen mit Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 30% versetzt werden, die ausgefallenen Proteine abzentrifugiert und in einer geeigneten Pufferlösung aufgenommen werden.
26. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es die Sequenz einer Bindungsstelle für eine RNA-Polymerase, darauf folgend eine Sequenz für eine 5' nicht translatierte Region eines Strukturgens und darauf folgend ein für eine Schnittstelle einer Proteinase kodierendes Genfragment in positiver oder negativer Orientierung umfaßt.
27. DNA-Molekül gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz der Bindungsstelle der der Bindungsstelle für die T7-RNA-Polymerase entspricht.
28. DNA-Molekül gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die 5' nicht translatierte Region eines Gens der 5' nicht translatierten Region (UTR) des Kaninchen ß-Globingens entspricht.
29. DNA-Molekül gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das für die Schnittstelle eine Proteinase kodierende Genfragment aus einem viralen Genom stammt.
30. DNA-Molekül gemäß Anspruch 26, dadurch gekennezeichnet, daß das für die Schnittstelle einer Proteinase kodierende Genfragment aus dem HIV- oder HRV-Genom, insbesondere aus dem HRV2-Genom stammt.
31. DNA-Molekül gemäß Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das für die Schnittstelle eine Proteinase kodierende Genfragment einer Schnittstelle der HRV2 2A Proteinase entspricht.
32. DNA-Molekül, dadurch gekennzeichnet, daß es das Plasmid GR6, pß+611, pß-611, pß+449, pß-449, pl, p20, pßHRV2/sub oder pßHRV14/sub ist.
33. RNA-Molekül, gemäß den Ansprüchen 26 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß es durch in vitro Transkription hergestellt ist.
34. Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA-Molekül gemäß den Ansprüchen 26 bis 32 umfaßt.
35. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß den Ansprüchen 26,bis 34 zur Translation beliebiger subgenomischer Nukleinsäurefragmente.
36. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß den Ansprüchen 26 bis 34 zur Translation beliebiger subgenomischer viraler Nukleinsäurefragmente.
37. Verwendung der DNA-Moleküle gemäß Anspruch 33 zur Translation im Kaninchenretikulozytenlysat.
38. Verwendung der DNA-Moleküle gemäß den Ansprüchen 26 bis 32 und 34 zur in vitro Transkription.
39. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 als Testsystem zur Aktivitätsüberprüfung von Proteinasen, insbesondere viraler Proteinasen.
40. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 als Testsystem zur Unterscheidung inaktiver Mutanten von aktiven Proteinasen.
41. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 als Testsystem cis-aktiver Proteinasen, insbesondere der HRV2 2A-Proteinase.
42. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 zur Reaktivierung nichtaktiver Proteinasen, insbesondere viraler Proteinasen.
43. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 zur Reaktivierung inaktiver HIV- und HRV-Proteinasen, insbesondere der
HRV2-Proteinasen.
44. Verwendung der Nukleinsäure-Moleküle gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 und 26 bis 34 zur Reaktivierung einer inaktiven HRV2 2A-Proteinase.
45. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er mit einem der Vektoren gemäß einer der Ansprüche 6 bis 17 und 34 transformiert ist.
46. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 38, ausgewählt aus den E. coli JM Stämmen.
PCT/EP1991/001595 1990-08-28 1991-08-22 Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen WO1992003559A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP91513892A JPH05506999A (ja) 1990-08-28 1991-08-22 ウイルスプロティナーゼの活性をモニターするためのテスト系

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4027153.6 1990-08-28
DE19904027153 DE4027153A1 (de) 1990-08-28 1990-08-28 Testsystem zur aktivitaetsueberpruefung viraler proteinasen
DEP4112952.0 1991-04-20
DE19914112952 DE4112952A1 (de) 1991-04-20 1991-04-20 Testsystem zur aktivitaetsueberpruefung viraler proteinasen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1992003559A2 true WO1992003559A2 (de) 1992-03-05
WO1992003559A3 WO1992003559A3 (de) 1992-04-30

Family

ID=25896304

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP1991/001595 WO1992003559A2 (de) 1990-08-28 1991-08-22 Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0497949A1 (de)
JP (1) JPH05506999A (de)
CA (1) CA2072154A1 (de)
WO (1) WO1992003559A2 (de)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993011251A1 (en) * 1991-12-06 1993-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant viruses comprising artificial proteolytic cleavage site
WO1997027294A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Boehringer Mannheim Corporation CROSS-LINKED POLYPEPTIDE FRAGMENTS OF β-GALACTOSIDASE
US5763196A (en) * 1996-01-26 1998-06-09 Boehringer Mannheim Corporation Assays using cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
WO1999006072A1 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
US5965124A (en) * 1991-12-06 1999-10-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Replication-competent recombinant viral vaccines and method of producing same
US5976783A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Bis-maleimido cross-linking agents
EP1141419A1 (de) * 1998-12-24 2001-10-10 Small Molecule Therapeutics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zum identifizieren von modulatoren von protease
US8101373B2 (en) 2007-10-12 2012-01-24 Discoverx Corporation β-galactosidase donor fragments
US8541175B2 (en) 2006-03-13 2013-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions using a reduced affinity enzyme complementation reporter system
US8569057B2 (en) 2011-06-23 2013-10-29 Discoverx Corporation Monitoring protein trafficking using beta-galactosidase reporter fragment complementation

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
EP0321973A2 (de) * 1987-12-23 1989-06-28 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2
DE3819846A1 (de) * 1988-06-10 1989-12-14 Hans Prof Dr Dr Wolf Testsystem fuer die entwicklung von inhibitoren der protease von hiv
WO1990001061A1 (de) * 1988-07-25 1990-02-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh In vitro synthese einer infektiösen rna

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2712615A1 (de) * 1977-03-18 1978-09-21 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate
EP0321973A2 (de) * 1987-12-23 1989-06-28 BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GmbH Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2
DE3819846A1 (de) * 1988-06-10 1989-12-14 Hans Prof Dr Dr Wolf Testsystem fuer die entwicklung von inhibitoren der protease von hiv
WO1990001061A1 (de) * 1988-07-25 1990-02-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh In vitro synthese einer infektiösen rna

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Gene, Band 60, 1987, Amsterdam (NL), S. Jia et al.: "Carbohydrate-binding protein 35: molecular cloning and expression of a recombinant polypeptide with lectin activity", Seiten 197-204, siehe Zusammenfassung; Seite 201, unter d) *
J. Sambrook et al.: "Molecular cloning", 2. Ausgabe,1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press (US), Seiten 18.81 - 18.88, siehe Seite 18.81, 2. Absatz *
Proc. Natl. Acad. Sci., Band 88, Juli 1991, Washington (US), H.-D. Liebig et al.: "Proteinase trapping: Screening for viral proteinase mutants by alpha-complementation" Seiten 5979-5983, siehe das ganze Dokument *
Science, Band 206, 19. Oktober 1979, Lancaster (US), A. Van Ooyen et al.: "Comparison of total sequence of a cloned rabbit beta-globin ene and its flanking regions with a homologous mouse sequence", Seiten 337-344, siehe Abbildung 3, Position 1 (In der Anmeldung erw{hnt) *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993011251A1 (en) * 1991-12-06 1993-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Recombinant viruses comprising artificial proteolytic cleavage site
US5965124A (en) * 1991-12-06 1999-10-12 Whitehead Institute For Biomedical Research Replication-competent recombinant viral vaccines and method of producing same
US5976783A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Bis-maleimido cross-linking agents
WO1997027294A1 (en) * 1996-01-26 1997-07-31 Boehringer Mannheim Corporation CROSS-LINKED POLYPEPTIDE FRAGMENTS OF β-GALACTOSIDASE
US5763196A (en) * 1996-01-26 1998-06-09 Boehringer Mannheim Corporation Assays using cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
US5976857A (en) * 1996-01-26 1999-11-02 Boehringer Mannheim Corporation Cross-linked polypeptide fragments of β-galactosidase
WO1999006072A1 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Boehringer Mannheim Corporation Cyclized prodrugs
EP1141419A1 (de) * 1998-12-24 2001-10-10 Small Molecule Therapeutics, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zum identifizieren von modulatoren von protease
EP1141419A4 (de) * 1998-12-24 2002-03-20 Small Molecule Therapeutics In Verfahren und zusammensetzungen zum identifizieren von modulatoren von protease
US8541175B2 (en) 2006-03-13 2013-09-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions using a reduced affinity enzyme complementation reporter system
US8101373B2 (en) 2007-10-12 2012-01-24 Discoverx Corporation β-galactosidase donor fragments
US8569057B2 (en) 2011-06-23 2013-10-29 Discoverx Corporation Monitoring protein trafficking using beta-galactosidase reporter fragment complementation
US9388449B2 (en) 2011-06-23 2016-07-12 Discoverx Corporation Monitoring protein trafficking using beta-galactosidase reporter fragment complementation

Also Published As

Publication number Publication date
JPH05506999A (ja) 1993-10-14
CA2072154A1 (en) 1992-03-01
WO1992003559A3 (de) 1992-04-30
EP0497949A1 (de) 1992-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0321973B1 (de) Expression der viral kodierten Protease P2A des HRV2
Bernstein et al. Genetic complementation among poliovirus mutants derived from an infectious cDNA clone
Kasschau et al. Genome amplification and long-distance movement functions associated with the central domain of tobacco etch potyvirus helper component–proteinase
Nash Integrative recombination of bacteriophage lambda DNA in vitro.
Kuhn et al. Mutational analysis of the genome-linked protein VPg of poliovirus
WO1992003559A2 (de) Testsystem zur aktivitätsüberprüfung viraler proteinasen
Blair et al. Role for the P4 amino acid residue in substrate utilization by the poliovirus 3CD proteinase
Burns et al. Effects of mutations in poliovirus 3Dpol on RNA polymerase activity and on polyprotein cleavage
Martin et al. Identification and site-directed mutagenesis of the primary (2A/2B) cleavage site of the hepatitis A virus polyprotein: functional impact on the infectivity of HAV RNA transcripts
DE3600571A1 (de) Dna-sequenzen, die fuer proteine mit der biologischen aktivitaet der husi-typi-inhibitoren codieren, gentechnologische verfahren zur herstellung dieser proteine und diese proteine enthaltende arzneimittel
Cao et al. Replication of poliovirus RNA containing two VPg coding sequences leads to a specific deletion event
Semler et al. Site‐specific mutagenesis of cDNA clones expressing a poliovirus proteinase
Ventoso et al. A poliovirus 2A (pro) mutant unable to cleave 3CD shows inefficient viral protein synthesis and transactivation defects
EP1068301B1 (de) Bakterielle transglutaminasen
Mitsialis et al. An avian tumor virus promoter directs expression of plasmid genes in Escherichia coli
DE4112952A1 (de) Testsystem zur aktivitaetsueberpruefung viraler proteinasen
DE4027153A1 (de) Testsystem zur aktivitaetsueberpruefung viraler proteinasen
Chisholm et al. Expression and partial purification of recombinant tomato ringspot nepovirus 3C-like proteinase: comparison of the activity of the mature proteinase and the VPg-proteinase precursor
EP0410147B1 (de) Modifizierte VP1/P2A Regionen des rhinoviralen Systems
EP0405376B1 (de) Typisierung humaner Rhinoviren
Katz et al. Avian retrovirus nucleocapsid protein, pp12, produced in Escherichia coli has biochemical properties identical to unphosphorylated viral protein
DE4136443A1 (de) Expression der reifen proteinase 2a, ihre partielle reinigung und bereitstellung kompetitiv wirkender substrate
DE3743848A1 (de) Expression der viral kodierten protease p2a des hrv2
DE4206769A1 (de) Testsystem zur analyse des "host cell shut-offs" nach viraler infektion
EP0564801A1 (de) Analyse des "host cell shut-offs"

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2072154

Country of ref document: CA

AK Designated states

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A3

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1991914980

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1991914980

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1991914980

Country of ref document: EP