DE102008063234A1

DE102008063234A1 - Biotechnologische Herstellung von Riboflavin mit hoher Ausbeute

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Publication number: DE102008063234A1
Application number: DE102008063234A
Authority: DE
Original assignee: InSilico Biotechnology AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2008-12-15
Filing date: 2008-12-15
Publication date: 2010-06-17
Anticipated expiration: 2028-12-16
Also published as: WO2010075960A8; US8759024B2; DE102008063234B4; KR20110104955A; JP2012511898A; WO2010075960A2; US20110312026A1; EP2358893A2; CN102245781A; CN102245781B; JP5813512B2; KR101739147B1; WO2010075960A3

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur biotechnologisch fermentativen Herstellung von Riboflavin (Vitamin B2) sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens, besonders eine modifizierte mikrobielle Wirtszelle mit gesteigerter Riboflavinausbeute.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Mittel zur biotechnologisch fermentativen Herstellung von Riboflavin (Vitamin B2) sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens, besonders eine modifizierte mikrobielle Wirtszelle mit gesteigerter Riboflavinausbeute. Die Erfindung stellt somit neue Verfahren und Mittel zur Regulation der Expression von an der Riboflavinproduktion der Wirtszelle beteiligten Enzymaktivitäten bereit.
Stand der Technik
Riboflavin (Vitamin B2) ist ein Precursor Molekül von Flavinmononucleotiden (FMN) und Flavin-Adenin-Dinucleotiden (FAD). Dies sind essentielle Co-Faktoren für eine Vielzahl enzymatischer Redox-Reaktionen in biologischen Zellen und Organismen. Riboflavin ist somit ein wichtiger Zusatzstoff in der Lebens- und Futtermittelindustrie. In Mikroorganismen und Pflanzen wird Riboflavin in der Regel über sieben enzymatische Reaktionen aus Guanosintriphosphat (GTP) aus dem Purinmetabolismus und Ribulose-5-Phosphat aus dem Pentosephosphat-Weg synthetisiert.
Jährlich werden ca. 4000 Tonnen Riboflavin biotechnologisch in verschiedenen Mikroorganismen produziert. Wichtigste Wirtsorganismen sind Bazillen, besonders Bacillus subtilis. Daneben werden auch andere Mikrobenzellen, eingeschlossen niedere Eukaryoten, eingesetzt. Beispiele sind die Organismen Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypii und Candida famata.
Bekannte biotechnologische Verfahren zur Riboflavinsynthese sind verbesserungswürdig, vor allem in Bezug auf die Riboflavinausbeute beziehungsweise Riboflavinproduktionsrate. Es besteht daher der Bedarf, verbesserte Herstellverfahren und verbesserte Wirtszellen, besonders auf Basis des Mikroorganismus Bacillus subtilis bereitzustellen.
Aufgabenstellung
Der Erfindung liegt primär das technische Problem zugrunde, Verfahren und Mittel zur Durchführung der Verfahren bereitzustellen, wodurch Riboflavin in einer Wirtszelle, besonders in einer Wirtszelle der Gattung Bacillus, biotechnologisch in hoher Ausbeute und bevorzugt mit hoher volumetrischer Produktivität hergestellt werden können.
Ein damit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung von Mitteln, die eine besonders einfache und wirkungsvolle Steuerung der Stoffwechselaktivitäten und insbesondere Enzymaktivitäten, die im Zusammenhang mit der Riboflavinsynthese stehen, in der Wirtszelle ermöglichen.
Ein damit verbundenes technisches Problem ist die Bereitstellung von modifizierten Wirtzellen mit insbesondere im Vergleich zum Wildtyp gesteigerter Riboflavinsynthese.
Zusammenfassung der Erfindung
Das zugrundeliegende technische Problem wird in einem ersten Aspekt der Erfindung gelöst durch die Bereitstellung einer modifizierten Zelle oder Zelllinie, Prokaryoten- oder Eukaryotenzelle, insbesondere einer Mikrobenzelle, die speziell ausgebildet ist zur verbesserten Synthese von Riboflavin in hoher Ausbeute. Diese ist erfindungsgemäß vor allem dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivität oder Konzentration des in der Zelle vorhandenen und/oder exprimierten Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC und/oder eines Homologs oder Orthologs davon modifiziert und insbesondere reduziert ist.
Die Zelle ist bevorzugt modifiziert zur Suppression der Expression oder Unterexpression von CcpC. Die Zelle ist bevorzugt eine knock out-Mutante von mindestens einem Gen, kodierend für CcpC und/oder einem Homolog und/oder Ortholog davon. Die Zelle ist bevorzugt eine CcpC-depletierte Mutante oder Transformante.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung Mittel zur, insbesondere genetischen, Modifizierung von Wirtzellen zur Modulation, insbesondere Steigerung der Riboflavinproduktion. So stellt die Erfindung in einem zweiten Aspekt ein mutiertes Nucleinsäuremolekül oder eine Vielzahl davon bereit, welches vor allem im Sinne der Erfindung nicht-funktionale Strukturen oder Genprodukte codiert. Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein isoliertes mutiertes Nucleinsäuremolekül, das für einen „mutierten” Transkriptionsfaktor, der insbesondere von dem Typ CcpC oder seinem Homolog oder Ortholog abgeleitet ist, mit gegenüber dessen Wildtyp modifizierten, bevorzugt reduzierten Expression oder Aktivität kodiert, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleinsäuremoleküle, welche insbesondere für den CcpC-Wildtyp oder Fragmente davon codieren, bestehend aus:

a) Nucleinsäuremolekülen, welche die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 enthalten oder daraus bestehen,
b) Nucleinsäuremolekülen, welche ein Polyaminosäuremolekül (Protein) enthaltend die oder bestehend aus der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 kodieren, und
c) Fragmenten und/oder Analoga der Nucleinsäuremoleküle von a) oder b),

Gegenstand der Erfindung ist auch ein RNA-Transkript des erfindungsgemäßen mutierten Nucleinsäuremoleküls, das in die Wirtszelle eingeschleust werden kann. Gegenstand der Erfindung ist auch ein extern und insbesondere synthetisch hergestelltes DNA- oder RNA-Molekül mit erfindungsgemäß mutierter Nucleotidsequenz, das in die Wirtszelle einschleusbar ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Expressionskassette, enthaltend eine oder mehrere Kopien dieses erfindungsgemäß mutierten Nucleinsäuremoleküls, und zwar bevorzugt in Verbindung mit mindes tens einem Promotor, insbesondere zur Steuerung und Vermittlung der Expression des mutierten Konstrukts in einer Wirtszelle. Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, welcher eine oder mehrere Kopien des erfindungsgemäß mutierten Nucleinsäuremoleküls enthält. Gegenstand der Erfindung ist besonders ein Vektor, der alternativ oder bevorzugt zusätzlich, eine oder mehrere Kopien der vorstehend charakterisierten erfindungsgemäßen Expressionskassette enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines so mutierten Konstrukts, insbesondere Nucleinsäuremoleküls, zur Steigerung der Riboflavinsynthese in einer mikrobiellen Wirtszelle.
In einem dritten Aspekt stellt die Erfindung ein Nucleinsäuremolekül oder eine Vielzahl davon in Form eines antisense-Konstrukts bereit. Gegenstand der Erfindung ist besonders auch eine Expressionskassette, enthaltend eine oder mehrere Kopien eines Nucleinsäuremoleküls codierend für insbesondere den Wildtyp eines Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC oder eines Homologs oder Orthologs davon, sowie eines Fragments davon das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

a) Nucleinsäuremolekülen, die die Nucleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 enthalten oder daraus bestehen,
b) Nucleinsäuremoleküle, die ein Polyaminosäuremolekül enthaltend die oder bestehend aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodieren, und
c) Fragmenten und/oder Analoga mindestens eines der Nucleinsäuremoleküle gemäß a) oder b), die eine Transkriptionsfaktorfunk tion des Typs CcpC oder eines Homologs oder Orthologs davon kodieren,

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein bevorzugt als isoliertes Nucleinsäuremolekül vorliegende Molekül mit zu einem vorstehend charakterisierten Nucleinsäuremolekül komplementärer Nucleotidsequenz. In einer bevorzugten Variante ist dies ein RNA-Transkript mit komplementärer Sequenz, das in die Wirtszelle einschleusbar ist. Bevorzugt ist auch ein extern und insbesondere synthetisch hergestelltes DNA- oder RNA-Molekül, das in die Wirtszelle einschleusbar ist.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch ein bevorzugt als isoliertes Nucleinsäuremolekül vorliegende Molekül, das ein antisense-Konstrukt eines vorstehend charakterisierten Nucleinsäuremoleküls ist. In einer bevorzugten Variante ist dies ein RNA-Transkript eines erfindungsgemäßen antisense-Konstrukts, welches die Sequenz des ccpc-Gens wie hierin beschrieben, beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon, oder ein Fragment davon enthält. Das antisense-RNA-Molekül kann insbesondere in die Wirtszelle eingeschleust werden. Gegenstand der Erfindung ist ein extern und insbesondere synthetisch hergestelltes DNA- oder RNA-Molekül mit erfindungsgemäeßr Nucleotidsequenz in antisense-Orientierung, das in der Wirtszelle einschleusbar ist.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Vektor, der eine oder mehrere Kopien dieses Nucleinsäuremoleküls in antisense-Orientierung enthält. Gegenstand der Erfindung ist besonders ein Vektor, der alterna tiv oder bevorzugt zusätzlich, eine oder mehrere Kopien der vorstehend charakterisierten Expressionskassette mit antisense-Konstrukt enthält.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines so charakterisierten antisense-Konstrukts zur Steigerung der Riboflavinsynthese in einer mikrobiellen Wirtszelle.
In einem vierten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer modifizierten Wirtszelle die speziell ausgebildet ist zur Synthese von Riboflavin bereit, welches zumindest oder bevorzugt ausschließlich die Schritte umfasst:

– Bereitstellen einer Wirtszelle und
– genetisches Modifizieren der Wirtszelle, so dass die Expression des Transkriptionsfaktors CcpC oder eines Homologs oder Orthologs davon gegenüber dem Wildtyp modifiziert, bevorzugt reduziert und besonders bevorzugt ausgeschaltet ist.

Bevorzugt umfasst der Schritt des genetischen Modifizierens der Wirtszelle dabei zumindest das Transformieren der Zelle mit mindestens einem genetischen Konstrukt insbesondere Nucleinsäuremolekül oder einer Vielzahl davon, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

– mutierten Nucleinsäuremolekülen, Expressionskassetten und Vektoren gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung sowie
– antisense-Expressionskassetten und Vektoren gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung.

In einer bevorzugten Variante umfasst der Schritt des genetischen Modifizierens der Wirtszelle zumindest das insbesondere transiente oder temporäre Einbringen oder Einschleusen mindestens eines in den vorgenannten ersten, zweiten und dritten Aspekten der Erfindung genannten Konstrukten in die Zelle. Bevorzugte Verfahren sind die Desintegration der Zellwand und/oder – membran der Wirtszelle bevorzugt durch Elektroporation, Detergenzien oder analoge Mittel sowie alternativ oder bevorzugt zusätzlich durch ballistische Verfahren (z. B. ”gene gun”) oder analoge Verfahren, ohne dass die Erfindung auf diese Verfahren und Mittel beschränkt wäre.
Dieser Aspekt der Erfindung stellt auch eine modifizierte mikrobielle Zelle bereit, die speziell ausgebildet ist zur Synthese von Riboflavin und mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbar ist und insbesondere damit hergestellt wird. Bevorzugt ist die Zelle ausgewählt der Gruppe der Mikroorganismen, bestehend aus: Bacillus sp., Eremothecium sp.; Ashbya sp.; und Candida sp.
In einem fünften Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur biotechnologischen Synthese von Riboflavin bereit, welches zumindest oder bevorzugt ausschließlich die Schritte umfasst:

– Bereitstellen einer modifizierten Wirtszelle gemäß dem vorgenannten ersten und/oder vierten Aspekt der Erfindung;
– Kultivieren der modifizierten Wirtszelle in Kulturmedium, und zwar bevorzugt unter Bedingungen, welche die Synthese von Riboflavin in der Wirtszelle ermöglichen, und, bevorzugt zusätzlich,
– Isolieren des Riboflavins aus der modifizierten Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium.

In einem sechsten Aspekt stellt die Erfindung ein Kit (kit-of-parts) zur biotechnologischen Synthese von Riboflavin bereit, welches zumindest die Komponenten:

– modifizierte Wirtszelle gemäß erstem oder viertem Aspekt der Erfindung und
– Kulturmedium und bevorzugt Nährmedium mit verstoffwechselbarem Substrat, das die Synthese von Riboflavin in der modifizierten Wirtszelle ermöglicht, bevorzugt begünstigt, enthält oder daraus besteht.

Beschreibung der Figur
Die Figur zeigt die Riboflavinausbeute bei der Biosynthese, aufgetragen gegen die Biomasseausbeute, und zwar für eine erfindungsgemäß modifizierte Wirtszelle (ccpC knock out-Mutante), Punkt: CcpC, und für den Wildtyp, Punkt: WT.
Beschreibung der Sequenzen
Das Sequenzprotokoll enthält:
SEQ ID NO: 1: codierender Abschnitt der Nucleotidsequenz von ccpC oder ykuM (LysR family transcriptional regulator; NCBI-GI: 16078478; NCBI-GeneID: 939197; Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168):

SEQ ID NO: 2: CcpC oder YkuM Aminosäuresequenz:
SEQ ID NO: 3 bis SEQ ID NO: 7: Bindesequenzen (cis-Elemente) des Transkriptionsfaktors CcpC and die Operatorstrukturen in den Operons von ccpC (SEQ ID NO: 3), citB (SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5) und citZ (SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7)
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder fanden überraschend, dass der Transkriptionsfaktor CcpC, welcher bekanntermaßen Gene, kodierend für Enzymaktivitäten des Tricarbonsäurezyklus (TCA), vor allem citB und citZ reguliert, positiven Einfluss auf die Riboflavinproduktionsrate hat. Überraschenderweise ist die Riboflavinausbeute unmittelbar abhängig von der Aktivität und/oder intrazellulären Konzentration des Transkriptionsfaktors CcpC. Eine reduzierte Aktivität von CcpC führt zu einer Steigerung der Ausbeute. Dieser Effekt war überraschend und aus dem Stand der Technik nicht vorhersehbar, da die bekanntermaßen von CcpC regulierten Enzymaktivitäten im TCA in keinem direkten Zusammenhang mit den Stoffwechselwegen der Riboflavinsynthese stehen.
In diesem Zusammenhang wird unter ”reduziert” sowohl eine verminderte und insbesondere fehlende Aktivität des CcpC-Proteins, beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon, in der Funktion als Transkriptionsfaktor, als auch eine verminderte und insbesondere fehlende Expression ccpC-Gens beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon, die in Folge einer geringen Kopienzahl oder Konzentration des Genprodukts CcpC in der Zelle führt, verstanden, insbesondere eine CcpC-depletierte Zelle
In einer erfindungsgemäßen oder erfindungsgemäß modifizierten Zelle ist also vor allem das ccpC-Gen und/oder sein Genprodukt unterdrückt, ”ausgeschaltet” oder in seiner Funktion beeinträchtigt, insbesondere im Vergleich zum CcpC-Wildtyp, wie er beispielsweise im Organismus Bacillus subtilis exprimiert wird.
Weiter überraschend war, dass die Biomasseproduktion, das heißt insbesondere die Wachstumsrate der erfindungsgemäß modifizierten Zellen, insbesondere CcpC-depletierte Zellen, beispielsweise ccpC knock out-Transformanten von Bacillus subtilis, im Wesentlichen unverändert bleibt.
Die Erfindung betrifft mutierte und insbesondere nicht-funktionale Gene. Die Erfindung betrifft mutierte und insbesondere nicht-funktionale Transkripte daraus. Die Erfindung betrifft auch mutierte und insbesondere nicht-funktionale Polypeptide daraus. Solche mutierten Strukturen sind im Sinne der Erfindung besonders geeignet, um genetisch modifizierte Wirtszellen bereitzustellen, worin die Funktion des CcpC-Wildtyps oder eines Homologs oder Orthologs davon reduziert oder verhindert ist.
Wesentliches Element der erfindungsgemäßen Lehre ist es deshalb, zu Steigerung der Riboflavinbiosynthese in einer Wirtszelle die effektive, das heißt wirksame Konzentration des ccpC-Gens, des CcpC-Transkripts beziehungsweise des translatierten Transkriptionsfaktors in der Zelle zu reduzieren. Die Verminderung der Aktivität und/oder der intrazellulären Konzentration von CcpC bzw. seiner Homologe oder Orthologe kann in an sich bekannter Weise erreicht werden. Der Fachmann kennt dazu einschlägige biotechnologische Verfahren und Mittel, um so genannte CcpC-depletierte oder ccpC knock out Mutanten oder Transformanten zu erhalten. Die Erfindung ist daher nicht auf die hierin näher beschriebenen bevorzugten Varianten und Ausführungen beschränkt.
Unter dem Begriff „Mutation” wird gemäß der Erfindung jegliche genetische Modifikation, das heißt insbesondere Abwandlung auf molekularer Ebene, eines Nucleinsäuremoleküls, verstanden, welches zu einem nicht-funktionalen „mutierten” Genprodukt führt. Besonders wird darunter ein Veränderung im Genom eines Mikroorganismus verstanden, welche mit der Synthese des Genprodukts, das heißt vorliegend mit der Synthese des Transkriptionsfaktors vom Typ CcpC interferiert und/oder zur Expression eines „mutierten” oder modifizierten Polypeptids führt, welches eine veränderte „mutierte” Aminosäuresequenz aufweist und dessen Funktion im Vergleich zum CcpC-Wildtyp teilweise oder vollständig verloren gegangen ist. Eine erfindungsgemäße Mutation im Gen beziehungsweise im Genprodukt führt zu Veränderungen in mindestens einer Stufe der Expression ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Modifikation. Bevorzugt ist diese Mutation ausgewählt aus: Punktmutation, Deletion, Substitution, Insertion und Inversion mindestens eines Nucleotids innerhalb der Gensequenz. Die Maßnahmen der genetischen Mutation sind aber nicht auf diese bevorzugten Ausführungen beschränkt. Der Fachmann kennt weitere Möglichkeiten, Mutationen in einem Gen zu platzieren. Ziel der erfindungsgemäßen Mutationen ist die Suppression der Expression mindestens eines Gens kodierend für CcpC. Ein damit verbundenes Ziel ist die Expression eines modifizierten Transkriptionsfaktors, welcher gegenüber dem Wildtyp eine verminderte Aktivität, insbesondere regulatorische Aktivität in der Zelle aufweist.
Die „Mutation” betrifft nicht nur die unmittelbare Modifikation der codierenden Sequenz eines Gens, sondern auch die Modifikation anderer Strukturen oder Sequenzen, die mit der Expression in Zusammenhang stehen. Dazu zählen bevorzugt Strukturen des Operons des Gens, insbesondere regulierende Strukturen, bevorzugt ausgewählt aus Promotoren, Regulatoren, -operatoren, Transkriptionsfaktorbindestellen, Terminatoren und Co-faktoren dazu, ohne ausschließlich darauf beschränkt sein zu wollen.
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird und unter „Funktion”, besonders im Zusammenhang mit den Begriffen „funktionsrelevant”, „funktionsanalog” und „funktionierend”, die Transkriptionsfaktorfunkti on des CcpC-Wildtyps, beziehungsweise eines Homologs oder Orthologs davon zur Regulation der Expression von Operons oder Genen, die eine Operatorstruktur aufweist, woran der Transkriptionsfaktor bindet, verstanden. Die in der Tabelle angegebenen Zusammenhänge sind beispielhaft für die Funktion des Transkriptionsfaktors CcpC wie er in Bacillus subtilis vorkommt; die Funktion ist aber nicht darauf beschränkt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, welches das ccpC-Gen, insbesondere wie es im Organismus Bacillus subtilis vorkommt, repräsentiert, sowie dessen Homologe und Orthologe. Die Erfindung betrifft besonders dieses Gen wie es in der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 dargestellt ist. Die Erfindung betrifft auch dessen Genprodukt (CcpC-Protein) mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2. Das Gen ccpC ist insbesondere Teil eines Operons in Bacillus subtilis.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein bevorzugt als isoliertes Polyaminosäuremolekül (Protein) vorliegende Molekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polyaminosäuremolekülen, welche mindestens die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 enthalten oder daraus bestehen,
b) Polyaminosäuremolekülen, welche durch ein vorstehend charakterisiertes Nucleinsäuremolekül kodiert werden, und
c) Fragmenten und/oder Analoga mindestens eines der Polyaminosäuremoleküle von a) oder b)

Die Erfindung betrifft auch solche Nucleinsäuremoleküle beziehungsweise Proteine, welche gegenüber den in den Sequenzen SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 2 weitgehende Sequenzübereinstimmmungen, das heißt insbesondere weitgehende „Homologie” aufweisen. Darunter wird erfindungsgemäß eine Homologie von mindestens 70%, bevorzugt mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90%, mindestens 95% und mindestens 98% Sequenzübereinstimmung verstanden. Bevorzugt betrifft die Sequenz Übereinstimmungen wie SEQ ID NO: 1 beziehungsweise SEQ ID NO: 2 in gesamter Länge. In einer bevorzugten Variante betrifft die vorgenannte Sequenzübereinstimmung ausschließlich die funktionsrelevanten Abschnitte der Sequenzen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2.
Bezüglich der „Homologie” von Nucleinsäuremolekülen zueinander wird hierin das Kriterium der Hybridisierung unter „stringenten Bedingungen” verstanden. Unter „stringenten Bedingungen” wird auf die bekannten technischen Zusammenhänge, wie sie beispielsweise in Maniatis et al., 1989: „Molecular cloning, a laboratory manual", 2. Auflage, beschrieben sind, verwiesen. „Stringente Bedingungen” sind abhängig von der konkreten Sequenz. In der Regel wird darunter eine Hybridisierungstemperatur verstanden, welche 5 bis 10°K geringer ist als der Schmelzpunkt einer spezifischen Sequenz, bei dem 50% sequenzidentischer komplementärer Sonden an die Zielsequenz hybridisieren.
In einer bevorzugten Ausführung sieht die Erfindung zur Beeinflussung, insbesondere zur Reduktion der Aktivität, vor, die Bindungsaffinität des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise seines Homologs oder Orthologs, und/oder dessen Interaktion mit einem Operon des regulierten Gens, insbesondere der Transkriptionsfaktorbindestruktur, und/oder eines Co-Faktors davon zu beeinflussen, insbesondere zu reduzieren, so dass modifizierte oder „mutierte” von CcpC, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, abgeleitete Genprodukte, das heißt Proteine, mit verminderter oder ohne Bindungsaktivität und/oder Interaktion mit den Operatorstrukturen, die in Verbindung mit dem regulierten Gen oder Operon stehen, erhalten werden.
In einer bevorzugten Variante erfolgt dies durch unmittelbare genetische Modifikation des ursprünglichen ccpC-Gens bzw. seiner Homologe oder Orthologe, so dass ein Genprodukt mit veränderter „mutierter” Aminosäuresequenz und damit vor allem veränderter Proteinstruktur erhalten wird.
In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante erfolgt dies durch Beeinflussung mindestens eines Vorgangs, ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Prozessierung, bevorzugt vor allem von mindestens einer mit diesen Vorgängen verbundenen molekularen Struktur oder eines Co-Faktors dazu. Dies erfolgt insbesondere durch Verwendung mindestens einer Struktur oder eines Konstrukts, die oder das an mindestens eine an diesen Vorgängen beteiligte Struktur oder Sequenz bindet und/oder inaktiviert. Diese Struktur oder das Konstrukt ist bevorzugt ausgewählt aus antisense-Konstrukten und Antikörpern, ohne ausschließlich darauf beschränkt sein zu.
Bevorzugt wird unmittelbar die Aktivität und/oder Konzentration des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, mittels spezifischer Inhibitoren reduziert. Beispiele solcher spezifischer Inhibitoren sind Antisense-Konstrukte des CcpC-Gens, beziehungsweise dessen Homologe oder Orthologe, oder eines anderen erfindungsgemäßen damit strukturverwandten Nucleinsäuremoleküls welche transient oder stabil in die Wirtszelle in an sich bekannter Weise angebracht werden und dort exprimiert werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführung sieht die Erfindung zur Beeinflussung, insbesondere zur Reduktion der Konzentration, das heißt vor allem der Kopienanzahl, des Transkriptionsfaktors CcpC, beziehungsweise seines Homologs oder Orthologs, vor, dessen Expression und/oder gegebenenfalls die Expression eines Co-Faktors davon zu beeinflussen und insbesondere zu reduzieren oder vollständig zu unterdrücken. In einer bevorzugten Variante erfolgt dies durch unmittelbare genetische Modifikation des Operons des ccpC-Gens bzw. seiner Homologe oder Orthologe. In einer bevorzugten Variante ist dazu die Modifikation des die Expression des Gens steuernden Promotors vorgesehen, und zwar bevorzugt so, dass eine Unterexpression erfolgt oder die Expression bevorzugt vollständig ausbleibt, das heißt „abgeschaltet” ist.
In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante erfolgt dies durch Beeinflussung mindestens eines Vorgangs, ausgewählt aus Transkription, Translation und gegebenenfalls post-translationaler Prozessierung, bevorzugt vor allem von mindestens einer mit diesen Vorgängen verbundenen molekularen Struktur oder eines Co-Faktors dazu. Dazu zählen vor allem knock out-Mutationen, die beispielsweise mittels homologer Rekombination erhalten werden können, sowie der Einsatz von antisense-Konstrukten in an sich bekannter Weise.
Demgemäß ist ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung eine modifizierte mikrobielle Zelle, welche modifiziert ist zur Suppression der Expression von CcpC, beziehungsweise seiner Homologe oder Orthologe. In einer Variante ist die Zelle modifiziert zur Unterexpression von CcpC, beziehungsweise seiner Homologe oder Orthologe. In einer bevorzugten Ausführung ist die Zelle eine knock out-Mutante von mindestens einem Gen, welches für CcpC kodiert. Die Erfindung umfasst also auch modifizierte Zellen, die knock out-Mutanten von Homologen des CcpC kodierenden Gens von Bacillus subtilis sind. Die Erfindung umfasst also auch knock out Mutanten von Orthologen des CcpC kodierenden Gens von Bacillus subtilis. Die Erfindung umfasst auch knock out Mutanten anderer Funktionsanaloga von CcpC und deren Gen(e).
In einer alternativen oder bevorzugt zusätzlichen Variante der genetischen Modifikation der Wirtszelle findet die genetische Modifikation an mindestens einer und bevorzugt mehreren Bindungsstrukturen des CcpC Transkriptionsfaktors statt. Dies sind bevorzugt die Operatorstrukturen der durch CcpC regulierten Gene in der Wirtszelle. Regulierte Gene sind vor allem citB und citZ, ohne dass die Erfindung auf diese beschränkt sein soll. Durch die mindestens eine erfindungsgemäß bevorzugt vorgesehene Mutation nahe des Operator-Abschnitts des durch CcpC regulierten Gens soll erfindungsgemäß die Bindung des Transkriptionsfaktors an den Operator verhindert oder vermindert werden, so dass der regulierende Effekt bezüglich der Transkription des Gens nicht oder vermindert eintritt. Verfahren zur Modifikation der Operator-Abschnitte der durch Transkriptionsfaktoren regulierten Gene und insbesondere deren Bindesequenzen für Transkriptionsfaktoren sind dem Fachmann bekannt.
Die nachfolgende Tabelle listet die regulierten Gene und ihre Operons sowie die zugehörigen Bindungssequenzen auf. Unterstrichene Ab schnitte in den Sequenzen entsprechen den konkreten Bindungssequenzen (Quelle: dbtbs.hgc.jp): Tabelle:

* die unterstrichen dargestellten Bereiche der Sequenz sind die an sich bekannten exakten Bindesequenzen

Die Erfindung sieht demgemäß auch die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen vor, welche Nucleotidsequenzen, ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 sowie Fragmente davon, welche bevorzugt zumindest die in der Tabelle markierten bindenden Abschnitte enthalten, aufweisen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Transkripten davon und den daraus synthetisierbaren Polyaminosäuren (Proteine) sowie deren antisense-Konstrukte zur Regulation, insbesondere zu Steigerung der Riboflavinsynthese in Wirtszellen im Sinne der hierin beschriebenen Lehre.
Die Erfindung betrifft auch an die vorgenannten Moleküle und Strukturen bindende Moleküle. Solche Moleküle sind gemäß der Erfindung geeignet, die Funktion oder Aktivität von CcpC, beziehungsweise der Homologe oder Orthologe zu modifizieren, insbesondere zu unterdrücken. Bevorzugt binden solche Moleküle an mindestens eine der durch die Nucleotidsequenzen, ausgewählt aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 sowie durch Fragmente davon, welche bevorzugt zumindest die in der Tabelle markierten bindenden Abschnitte enthalten, definierbaren Strukturen oder Moleküle, insbesondere Operatorstrukturen. Bevorzugt sind die bindenden Moleküle spezifische Antikörper gegen die so definierbaren Strukturen.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein, monoklonaler oder polyklonaler Antikörper der spezifisch an eine gemäß den SEQ ID NO: 1 bis 7 definierbare Struktur oder Molekül binden kann.
Beispiel 1: Bereitstellen eines CcpC-defizienten Stamms von Bacillus subtilis
Zur Herstellung einer knock out Mutante für den Transkriptionsfaktor CcpC in der Wirtszelle Bacillus subtilis wurde ein mutiertes ccpC-Gen an den ursprünglichen ccpC-Lokus des Genoms von Bacillus subtilis markerfrei eingeführt.
Zwei DNA-Fragmente, welche mittel PCR aus der Sequenz SEQ ID NO: 1 hergestellt wurden, wurden mit einer Neomycin Resistenz Gen- Kassette kombiniert (Itaya et al., 1989, A neomycin restistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilis chromosome, Nucleic Acids Res. 17: 4410). Die beiden Fragmente des ccpC-Gens (SEQ ID NO: 1) weisen überlappende Abschnitte auf. Beide Fragmente werden zusammen mit der Neomycin-Resistenzgen-Kassette in einer herkömmlichen PCR amplifiziert (PCR Protokoll: 100 ng PCR-amplifiziertes Fragment A, 100 ng PCR-amplifiziertes Fragment B, 100 ng Neomycin-Resistenzgen-Kassette im Puffer der „proof-reading” DNA Polymerase (Fa. Stratagene, NL); Zyklus: 1: 3 min bei 95°, 2: 30 sek bei 95°, 3: 30 sek bei 50°C, 4: 25 min bei 72°C, 5: 5 min bei 72°C, 35 Wiederholungen der Schritte 2 bis 4).
Fünf assemblierende PCRs wurden gepoolt und mittels PCR-Aufreinigungskit („Qiagen PCR Purification Kit”; Fa. Qiagen, DE) aufgereinigt und in 50 μl Elutionspuffern eluiert. Das gewünschte PCR-Produkt wurde mittels Agarose-Gelelektorphorese bestätigt und für die Transformation von B. subtilis Stamm PY 79 eingesetzt. Die Herstellung kompetenter Zellen erfolgte gemäß Kuntz et al., 1989; Deduced polypeptides encoded by the Bacillus subtilis sacU locus share homology with component sensor-regulator systems. J. Bacteriology 170: 5093–5101).
Zwei Transformanten wurden in VY Medium (5 g/l Hefeextrakt (Firma Becton Dickinson, CH), 25 g/l veal broth (Firma Sigma; DE)) kultiviert. Aus einer der Transformanten wurde genomische DNA isoliert und die richtige Ersetzung des CcpC DNA Fragments durch die Neomycinresistenten Gen-Kassette mittels Standard PCR und den ursprünglichen Primern zur Amplifikation des Fragments bestätigt. Wie erwartet, zeigen die CcpC-defizienten Transformanten von Bacillus subtilis deutlich höhere Riboflavin Produktionsraten bei nahezu gleichbleiben der Biomasse-Produktion im Vergleich zum Bacillus subtilis Wildtyp Stamm.
Beispiel 2: Simulation der Riboflavinausbeute bei Aktivitätsänderung von CcpC
Um die Stoffflussverteilung bei der Riboflavinsynthese in einer Wirtszelle bei einer erfindungsgemäßen Aktivitätsänderung, insbesondere Verringerung der Aktivität, des Transkriptionsfaktors CcpC vorherzusagen, wird in einem ersten Schritt mit der ”Network Component Analysis” (NCA) und Genexpressionszeitreihen Aktivitätsänderungen von CcpC identifiziert und deren Einfluss auf die durch CcpC regulierten Gene quantifiziert. Zur Vorhersage des Einflusses der Transkriptionsfaktoraktivität werden regulierte Flüsse der Ausgangsflussverteilung ausgelenkt und anschließend über eine quadratische konvexe Optimierung eine neue Stoffflussverteilung berechnet. Die Simulation wurde am Beispiel des riboflavinproduzierenden Bacillus subtilis Stamm bei aerobem Wachstum auf Glucose durchgeführt.
Die Figur zeigt das Ergebnis der Analyse. Eine Mutante, worin die Aktivität CcpC kleiner als 1 ist (AF < 1, z. B. knock out Mutante), zeigt eine deutlich erhöhte Riboflavinausbeute gegenüber dem Wildtyp (AF = 1).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Maniatis et al., 1989: „Molecular cloning, a laboratory manual”, 2. Auflage [0039]
- Itaya et al., 1989, A neomycin restistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilis chromosome, Nucleic Acids Res. 17: 4410 [0053]
- Kuntz et al., 1989; Deduced polypeptides encoded by the Bacillus subtilis sacU locus share homology with component sensor-regulator systems. J. Bacteriology 170: 5093–5101 [0054]

Claims

Modifizierte mikrobielle Zelle, speziell ausgebildet zur Synthese von Riboflavin, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression und/oder Aktivität des Transkriptionsfaktors CcpC modifiziert ist im Vergleich zum Wildtyp.
Zelle nach Anspruch 1, modifiziert zur Suppression der Expression oder Unterexpression von CcpC.
Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, die eine knock out-Mutante von mindestens einem Gen, kodierend für CcpC und/oder einem Homolog und/oder Ortholog davon ist.
Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin mindestens ein Gen, welches für CcpC kodiert, und/oder ein Homolog und/oder Ortholog davon mindestens eine genetische Mutation aufweist.
Zelle nach Anspruch 4, wobei die genetische Mutation ausgewählt ist aus: Punktmutation, Deletion, Substitution, Insertion und Inversion.
Zelle nach einem der vorstehenden Ansprüche, ausgewählt der Gruppe der Mikroorganismen, bestehend aus: Bacillus sp., Eremothecium sp.; Ashbya sp.; und Candida sp.
Isoliertes mutiertes Nucleinsäuremolekül, das für einen Transkriptionsfaktor vom Typ CcpC mit gegenüber dem Wildtyp modifizierter Expression oder Aktivität kodiert, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der Nucleinsäuremoleküle, welche für den CcpC-Wildtyp codieren, bestehend aus: a) Nucleinsäuremoleküle, welche die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 enthalten oder daraus bestehen, b) Nucleinsäuremoleküle, welche ein Polyaminosäuremolekül mit enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 kodieren, und c) Fragmente und/oder Analoga mindestens eines der Nucleinsäuremoleküle von a) oder b), wobei das Nucleinsäuremolekül mindestens eine genetische Mutation aufweist.
Expressionskassette enthaltend eine oder mehrere Kopien des mutierten Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 7 in Verbindung mit mindestens einem Promotor.
Vektor, enthaltend eine oder mehrere Kopien des mutierten Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 7 und/oder eine oder mehrere Kopien der Expressionskassette nach Anspruch 8.
Expressionskassette, enthaltend eine oder mehrere Kopien eines Nucleinsäuremoleküls codierend für den Wildtyp des Transkriptionsfaktor vom Typ CcpC, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Nucleinsäuremoleküle, welche die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 enthalten oder daraus bestehen, b) Nucleinsäuremoleküle, welche ein Polyaminosäuremolekül mit enthaltend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 kodieren, und c) Fragmente und/oder Analoga mindestens eines der Nucleinsäuremoleküle von a) oder b), die eine Transkriptionsfaktorfunktion des Typs CcpC kodieren; in antisense-Orientierung in Verbindung mit mindestens einem Promotor.
Vektor, enthaltend eine oder mehrere Kopien des in Anspruch 10 charakterisierten antisense-Konstrukts.
Verfahren zur Herstellung einer Wirtszelle, die speziell ausgebildet ist zur Synthese von Riboflavin, enthaltend die Schritte: – Bereitstellen einer Wirtszelle und – genetisches Modifizieren der Wirtszelle, so dass die Expression des Transkriptionsfaktors CcpC gegenüber dem Wildtyp modifiziert ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das genetische Modifizieren der Wirtszelle das Transformieren der Zelle mit oder das Einbringen in die Zelle von mindestens einem Konstrukt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Nucleinsäuremolekülen nach Anspruch 7, Expressionskassetten nach Anspruch 8, Vektoren nach Anspruch 9, Expressionskassetten nach Anspruch 10 und Vektoren nach Anspruch 11, umfasst.
Modifizierte mikrobielle Zelle, speziell ausgebildet zur Synthese von Riboflavin, herstellbar mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13.
Verfahren zur biotechnologischen Synthese von Riboflavin, enthaltend die Schritte: – Bereitstellen einer modifizierten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 14; – Kultivieren der modifizierten Wirtszelle im Kulturmedium unter Bedingungen, welche die Synthese von Riboflavin in der Wirtszelle ermöglichen; und – Isolieren des Riboflavins aus der modifizierten Wirtszelle und/oder aus dem Kulturmedium.
Kit zur biotechnologischen Synthese von Riboflavin, enthaltend: – modifizierte Wirtszelle nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 14, und – Kulturmedium, welches die Synthese von Riboflavin in der modifizierten Wirtszelle ermöglicht.
Verwendung eines in den Ansprüchen 7 bis 11 charakterisierten Konstrukts zur Steigerung der Riboflavinsynthese in einer mikrobiellen Wirtszelle.