CN102245781A - 用于生产核黄素的方法 - Google Patents

用于生产核黄素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102245781A
CN102245781A CN2009801505157A CN200980150515A CN102245781A CN 102245781 A CN102245781 A CN 102245781A CN 2009801505157 A CN2009801505157 A CN 2009801505157A CN 200980150515 A CN200980150515 A CN 200980150515A CN 102245781 A CN102245781 A CN 102245781A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid molecule
nucleic acid
ccpc
riboflavin
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2009801505157A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102245781B (zh
Inventor
弗洛瑞娜·柯克纳
克劳斯·穆彻
卓阿克姆·施密德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM IP Assets BV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by DSM IP Assets BV filed Critical DSM IP Assets BV
Publication of CN102245781A publication Critical patent/CN102245781A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102245781B publication Critical patent/CN102245781B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术发酵生产核黄素(在下文中也称作维生素B2)的方法和手段，和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本发明因此公开了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。

Description

用于生产核黄素的方法
本发明涉及生物技术发酵生产核黄素(下文中也称作维生素B2)的方法和手段，和实施所述方法的手段，特别是具有提高的核黄素产率的经修饰的微生物宿主细胞。本发明因此提供了调节参与宿主细胞核黄素生产的酶活性的表达的新颖方法和手段。
核黄素是黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的前体分子。它们是生物细胞和生物体中大量酶促氧化还原反应的必需辅助因子。因此，核黄素是食物和动物饲料工业中重要的添加剂。在微生物和植物中，核黄素通常从三磷酸鸟苷(GTP)(来自嘌呤代谢)和5-磷酸核酮糖(来自磷酸戊糖途径)通过七个酶促反应合成。
每年约有4000吨核黄素在多种微生物中被以生物技术方式生产。最重要的宿主生物是杆菌(bacilli)，特别是Bacillus subtilis。除此之外也使用其他微生物细胞，包括低等真核生物。例子是生物Eremotheciumashbyii、Ashbya gossypii和Candida famata。
用于核黄素合成的已知生物技术方法需要改进，最重要的是改进核黄素的产率和生产。因此需要提供经改进的生产方法和经改进的宿主细胞，特别是以微生物Bacillus subtilis为基础来改进。这特别涉及下述手段的提供，所述手段使得能够特别简单和有效地控制宿主细胞中的代谢活性，特别是与核黄素合成相关的酶活性。另外，这涉及提供经修饰的宿主细胞，所述经修饰的宿主细胞特别是与野生型相比具有提高的核黄素合成。
本发明人惊讶地发现，转录因子CcpC对核黄素生产率(productionrate)具有积极影响。CcpC属于LysR转录因子家族，已知其能调节编码三羧酸循环(TCA)酶活性的基因，最重要的是citB和citZ。惊讶地发现核黄素产率直接依赖于转录因子CcpC的活性和/或细胞内浓度。降低的CcpC活性导致产率的提高。该效应是令人惊讶的，并且从现有技术不可预测，因为已知受CcpC调节的TCA中的酶活性与核黄素合成的代谢途径并无直接关联。
还令人惊讶的是生物量生产，特别是根据本发明被修饰的细胞(特别是CcpC-缺失的细胞，例如的ccpC敲除转化体)的生长率保持基本不变。
本发明因此涉及经修饰的生产核黄素的细胞或细胞系，原核细胞或真核细胞，特别是微生物细胞，其特征在于：CcpC型转录因子和/或在细胞中存在和/或表达的其同系物或直系同源物的活性或浓度被修饰，特别是被降低。通过所述修饰，细胞或细胞壁能够进行提高的核黄素生产。
特别地，要求保护下述经修饰的生产核黄素的微生物，其中与未经修饰的微生物或野生型微生物相比，CcpC型转录因子的表达和/或活性被降低，优选地降低至少25％。
优选地，上述细胞或细胞系被修饰，使得编码CcpC的基因完全不表达(表达的阻抑)或至少显示降低的表达(低表达(underexpression))，这导致所述细胞/细胞系中缺失或减少/降低的CcpC蛋白质活性。细胞/细胞系优选地是CcpC缺失的(CcpC-depleted)突变体或转化体，特别是编码CcpC的至少一个基因和/或其同系物和/或直系同源物的敲除突变体。
在该关联中，“降低的”被理解为表示在作为转录因子的功能方面，CcpC蛋白质或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的活性，以及ccpC基因或其同系物或直系同源物的减少的、特别是缺失的表达，结果，这使得细胞(特别是CcpC缺失的细胞)中基因产物CcpC拷贝数低或浓度低。降低的表达被理解为表示以未经修饰的(CcpC野生型)细胞/细胞系中ccpC基因的表达为基础至少25％的减少，优选地至少50％、75％、80％、90％、95％、98％或100％的减少。所述降低既涉及基因活性又涉及相应的基因产物。
因此，在根据本发明的细胞或根据本发明被修饰的细胞中，最重要地，当所述基因例如在杆菌中、优选地在生物Bacillus subtilis中表达时，ccpC基因和/或其基因产物被阻抑、“敲除”或其功能(活性)受损，特别是与CcpC野生型相比。
用于测量基因或蛋白质活性的多种方法是本领域技术人员已知的。合适的方法例如是Northern印迹，或用于测量ccpC基因活性的用途的“基因芯片”方法，和借助于针对CcpC的特异性抗体的Western印迹，或用于测定细胞中蛋白质浓度的定量“2-D SDS-PAGE凝胶”。转录因子(特别是CcpC)的活性也可以通过“凝胶迁移(gel shift)”实验来间接测定，其中测量在要被调节的基因(例如citB或citZ)的相应结合位点处结合的CcpC的量。通过减少ccpC的基因表达，结合的CcpC量也会降低，这可通过聚丙烯酰胺凝胶上信号的定量测量来分析。这些测量方法和其他测量方法是本领域技术人员已知的，并且可用于测定本发明意义上的CcpC活性。
用于实施本发明的合适细胞或细胞系(概括为宿主细胞)是所有已知的下述生产核黄素的细胞，其中ccpC基因或其同系物或直系同源物的表达可以被降低。例子是原核细胞或真核细胞，优选地是革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，特别是微生物细胞例如Bacillus、Corynebacterium或Pseudomonas。优选的是Bacillus属的细胞，例如Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus、Bacillus halodurans、Bacillusamyloliquifaciens或Bacillus subtilis，Bacillus subtilis是特别优选的，例如B.subtilis 168。
适用于本发明的一种特别优选的宿主细胞是B.subtilisRB50::[pRF69]n，其包含多个拷贝(例如约5到约20个拷贝)的质粒pRF69，所述质粒pRF69编码经修饰的核黄素(rib)操纵子，其中修饰在于强启动子Pspo15的插入，这导致核黄素基因转录的强化(菌株的构建和用于提高核黄素合成的培养条件见例如EP 405370和Perkins et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，22：8-18，1999)。B.subtilis RB50和质粒pRF69根据布达佩斯条约的规定，分别以编号(“保藏号”)B 18502保藏在“Agricultural Research Culture Collection”(NRRL)，Peoria，IL，USA，CultureCollection Division和以编号(“保藏号”)ATCC 68338保藏于“AmericanType Culture Collection”(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108USA。
在本发明的一个优选的方面，在Bacillus属的菌株(特别是Bacillussubtilis)中实现ccpC基因中的修饰。本文特别优选的是核黄素操纵子中脱调节的作为宿主细胞的Bacillus菌株，特别是subtilis菌株。脱调节的核黄素操纵子的例子是已知的，并且包括所谓的“ribO”和“ribC”突变。脱调节引起rib基因的强化的基因表达。特别优选的是下述宿主细胞，特别是Bacillus subtilis，其中编码转录调节子Spo0A的基因被(过)表达。因此在一个最优选的实施方案中，本发明在下述B.subtilis RB50中实现，所述B.subtilis RB50被突变，使得spo0A基因的活性形式被表达。
公众可通过例如以下的保藏位点获得适用于本发明的其他微生物：German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)，Inhoffenstrasse 7B，D-38124 Brunswick，德国，“NITE Biological ResourceCenter”，2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，日本(先前称作“Institute for Fermentation”，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka 532-8686，日本)或“Bacillus Genetic StockCenter”(BGSC)，The Ohio State University，Columbus，Ohio 43210 USA。
就本发明而言，前述微生物还包括“International Code of Nomenclatureof Prokaryotes”规定的具有相同生理特性的同物异名(synonyms)和基原异名(basonyms)。本发明中微生物的命名法是在优先权申请时被“InternationalCommittee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and AppliedMicrobiology Division of the International Union of Microbiological Societies”官方接受并被官方公开于“International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology”(IJSEM)中的命名法。
本发明涉及经突变的、特别是非功能性的基因。本发明涉及来自所述基因的经突变的、特别是非功能性的转录本。本发明还涉及来自所述基因的经突变的、特别是非功能性的多肽。此类经突变的结构在本发明的意义上特别合适用于提供经遗传修饰的宿主细胞，其中CcpC野生型或其同系物或直系同源物的功能被降低或抑制。
因此，根据本发明的教导的一个要素是降低细胞中ccpC基因、CcpC转录本或所翻译的转录因子的有效(有活性)浓度，从而提高宿主细胞中的核黄素生物合成。CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或细胞内浓度的降低可以通过本身已知的方式实现。本领域技术人员已知适用于获得所谓的CcpC缺失或ccpC敲除突变体或转化体的生物技术方法和手段。本发明因此不限于本文中更详细描述的优选的变体和实施方案。
根据本发明，术语“突变”被理解为表示核酸分子的任何遗传修饰，特别是在分子水平上的修饰，所述修饰导致非功能性的“经突变的”基因产物。其特别被理解为表示微生物基因组中的改变，所述改变干扰基因产物的合成，在本文中感染CcpC型转录因子的合成和/或导致“经突变的”或经修饰的多肽的表达，所述多肽具有被改变的“经突变的”氨基酸序列并且与CcpC野生型相比其功能已部分或完全丧失。基因或基因产物中根据本发明的突变在选自转录、翻译和(如果适用的话)翻译后修饰的表达中的至少一个步骤中导致改变。所述突变优选地选自：基因序列中至少一个核苷酸的点突变、缺失、取代、插入和倒位。然而，遗传突变的手段不限于这些优选的实施方案。本领域技术人员已知用于在基因中放置突变的其他可能性。根据本发明的突变的目的是阻抑编码CcpC的至少一个基因的表达。与之相关的一个目的是与野生型相比展示减小的活性、特别是调节活性的经修饰的转录因子在细胞中的表达。
“突变”不仅涉及基因编码序列的直接修饰，而且涉及与表达相关的其他结构或序列的修饰。这些优选地包括基因操纵子的结构，特别是调节结构，优选地选自启动子、调节子、操纵基因(operators)、转录因子结合位点、终止子及其辅因子，不希望仅限于这些。
就本发明而言，“功能”，特别是就术语“功能有关的”、“功能类似的”和“功能化”而言，被理解为表示CcpC野生型或其同系物或直系同源物用于调节操纵子或基因表达的转录因子功能，所述操纵子或基因具有与转录因子结合的操纵基因结构。蛋白质(特别是转录因子例如CcpC)的功能根据本发明也表述为活性，其中CcpC野生型的转录因子功能对应于100％的转录因子活性。用于测定活性的已知合适方法的选择如上文所述。
本发明的一个主题是经分离的核酸分子，其表示ccpC基因及其同系物和直系同源物。本发明特别涉及核苷酸序列SEQ ID No.：1中所示并且例如存在于生物Bacillus subtilis中的该基因。本发明还涉及其基因产物(CcpC蛋白质)，例如由氨基酸序列SEQ ID No.：2所示。基因ccpC特别是上述合适的宿主细胞之一、优选地Bacillus subtilis中操纵子的部分。寻找同源/直系同源CcpC序列的方法是本领域技术人员已知的，例如在合适的数据库如例如EMBL、Genbank、SwissProt等中进行“BLAST”搜索。这些序列发挥CcpC野生型的作用，所述CcpC野生型随后根据本发明被修饰，这在适当的宿主生物中导致核黄素生物合成的提高。就本发明而言，含有野生型序列的微生物被称作野生型微生物。
本发明因此涉及——优选地经分离的——经突变的(经修饰的)核酸分子，其编码“经突变的”转录因子，所述转录因子特别源自CcpC型或其同系物或直系同源物，其中未经突变的(野生型)核酸分子选自由以下组成的组：
a)包含核苷酸序列SEQ ID No.：1或由核苷酸序列SEQ ID No.：1组成的核酸分子；
b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No.：2或由氨基酸序列SEQ ID No.：2组成；
c)与a)或b)的核酸分子具有至少70％同源性的核酸分子；
d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和
c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/活性的蛋白质，
其中经突变的核酸分子显示至少一个遗传突变，所述遗传突变导致与CcpC野生型的活性相比降低的CcpC蛋白质活性。
如上文所述，在一个优选的实施方案中，ccpC基因被完全敲除(所谓的敲除突变)。
本发明的又一主题是多聚氨基酸分子(蛋白质或多肽)，优选地是以经分离形式存在的分子，其选自由以下组成的组：
a)包含氨基酸序列SEQ ID No.：2或由氨基酸序列SEQ ID No.：2组成的多聚氨基酸分子；
b)由上文表征的核酸分子编码的多聚氨基酸分子；
c)与a)或b)的分子具有至少70％同源性的多聚氨基酸分子；和
d)a)或b)的多聚氨基酸分子至少之一的片段和/或类似物，其具有CcpC型转录因子的功能，
其中a)到d)的蛋白质是如上文所述被修饰的野生型CcpC，这导致作为转录因子的活性的降低。
本发明还涉及与优选的SEQ ID No.：1或SEQ ID No.：2分别显示可观的序列同一性，特别是可观的“同源性”的此类核酸分子或蛋白质。根据本发明，这被理解为表示至少70％、优选地至少75％、特别优选地至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％的序列同一性。优选地，序列涉及在整个长度上分别对SEQ ID No.：1或SEQ ID No.：2的同一性。在一个优选的变体中，前述序列同一性排他地涉及SEQ ID No.：1和SEQ ID No.：2的功能相关区域。此类区域的例子是ccpC基因中的DNA结合结构域。本领域技术人员已知鉴定这些基因区域的程序。
考虑到核酸分子之间的“同源性”，“严格条件”下的杂交可以被理解为一种标准。对“严格条件”而言，参考例如在Maniatis et al.，1989：“Molecular cloning，a laboratory manual”，2nd Edition，Cold Spring HarboursLaboratory，N.Y中描述的已知技术内容。“严格条件”依赖于实际序列。通常这被理解为表示比特定序列的解链温度(melting point)低5K到10K的杂交温度，在所述解链温度下50％序列相同的互补探针与靶序列杂交。至少50％、60％、70％或特别优选地至少80％、最优选地至少85％到90％、特别是至少95％的核酸序列彼此同源的条件是优选的。
在作为例子给出的在严格条件下杂交的一个实施方案中，反应在约45℃下于6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行，随后在50℃、优选地55℃、特别优选地60℃、尤其优选地65℃下，于1x SSC，0.1％SDS中洗涤。
优选的是“高度严格条件”下的杂交，例如使用经标记的探针例如地高辛(DIG)标记的探针，于42℃下孵育若干天，例如2到4天，之后是室温下在2x SSC，0.1％SDS中一次或多次的洗涤步骤，和65到68℃下在0.5x SSC，0.1％SDS或0.1x SSC，0.1％SDS中至少一次的洗涤步骤。特别地，“高度严格条件”例如包括于42℃下，在溶液例如任选地添加100μg/ml鲑鱼精核酸的“DigEasyHyb溶液”(Roche DiagnosticsGmbH)，或者包含50％甲酰胺、5x SSC、0.02％SDS、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％“封闭试剂”(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用DIG-标记的探针(通过例如“DIG标记系统”制备，Roche Diagnostics GmbH，68298 Mannheim，德国)孵育2小时到4天，之后将滤纸于室温下在2xSSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次5到15分钟，然后于65-68℃下在0.5x SSC，0.1％SDS或0.1x SSC，0.1％SDS中洗涤两次，每次15-30分钟。
在本申请中，术语“同源性”或“同一性百分比”可互换使用。为了测定两条核酸或氨基酸序列彼此“同源”或“相同”的百分比，将两条序列就最适比较的目的对准(例如为了两条序列的最适比对，向一条序列中引入缺口)。然后比较相应的位置上的核苷酸。当第一核酸序列中的一个位置被与第二序列中相应位置上相同的核苷酸占据时，则两个分子在该位置上是相同的，这对应于100％的同源性或同一性。两条序列之间同一性的百分比数值(百分比同一性)可以被表示为所述序列共享的大量相同位置的函数(即％同一性＝相同位置数/位置总数(即重叠位置)x100)。优选被比较的序列有相同的长度。为了测定同源性，本领域技术人员可获得多种已知的计算机程序，例如作为GCG软件包组件的程序“GAP”(可在http://accelrys.com/获得)，所述程序根据Needleman and Wunsch(J.Mol.Biol.48，444-453，1970)的算法运作。
就本发明而言，术语“直系同源物”应当被理解为表示不同属的基因，所述基因均从一个共有的原始基因开始产生。通常这些直系同源基因的功能在进化期间是保守的。为了能够在先前未经测序的基因组中进行可靠的基因功能预测，直系同源物的鉴定是重要的。
与之相反，在本发明的意义上，实际源自一个共同基因、但是在进化过程中获得另一功能的多个基因被称作“类似物”。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了修饰(特别是降低其活性)转录因子CcpC或其同系物或直系同源物的亲合力和/或其与被调节的基因的操纵子、特别是转录因子结合结构和/或其辅助因子，从而使获得的源自CcpC或其同系物或直系同源物的经修饰或“经突变的”基因产物(即蛋白质)显示与下述操纵基因结构具有降低的结合活性和/或相互作用，或没有结合活性和/或相互作用，所述操纵基因结构与被调节的基因或操纵子相关。
在一个优选的变体中，这通过原始ccpC基因(野生型)或其同系物或直系同源物的直接遗传修饰进行，从而获得具有经修饰的“经突变的”氨基酸序列、特别是具有经修饰的蛋白质结构的基因产物。
在一个替代性或优选地额外的变体中，这通过修饰选自转录、翻译和(适用时)翻译后加工的至少一个过程来进行，特别优选地通过修饰与这些过程相关的至少一种分子结构或其辅因子来进行。这特别通过使用至少一种结构或构建体来实现，所述结构或构建体结合和/或失活涉及至少一种这些过程的结构或序列。所述结构或构建体优选地选择反义构建体和抗体，但不排他地仅限于此。
优选地，通过特异性抑制剂直接降低转录因子CcpC或其同系物或直系同源物的活性和/或浓度。此类特异性抑制剂的例子是CcpC基因或其同系物或直系同源物或根据本发明的其他结构相关的核酸分子的反义构建体，所述反义构建体以本身已知的方式被瞬时或稳定地引入宿主细胞中并在其中表达。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了转录因子CcpC及其同系物或直系同源物分别的表达和/或需要时其辅因子的表达的修饰，特别是浓度/活性的降低，即特别是拷贝数的降低，特别是为了降低或完全阻抑所述表达。在一个优选的变体中，这通过ccpC基因或其同系物或直系同源物操纵子的直接遗传修饰实现。在一个优选的变体中，为此提供控制基因表达的启动子的修饰，并优选地使得发生低表达或者完全不发生表达，也就是“敲除”。
在一个替代性或优选地额外的变体中，这通过调控选自转录、翻译和(适用时)翻译后加工的至少一个过程来实现，优选地特别通过调控与这些过程相关的至少一种分子结构或其辅因子来实现。这些特别包括敲除突变，所述敲除突变可例如通过同源重组以及使用反义构建体，以本身已知的方式获得。
可以通过普遍已知的方法将根据本发明的核酸或反义构建体引入宿主细胞中。优选的方法是通过电穿孔、洗涤剂或类似手段，替代性或优选额外地通过射击方法(例如“基因枪”)或类似方法，使细胞壁和/或宿主细胞膜崩解，本发明不限于这些方法和手段。
因此，本发明的一个方面是外部、特别是合成生产的DNA或RNA分子，其具有反义方向的根据本发明的核苷酸序列，所述分子可以被引入宿主细胞中。这特别包括以反义方向包含一个或多个拷贝的所述核酸分子的载体。
因此，本发明的一个优选的实施方案是经修饰的微生物细胞，所述微生物细胞被修饰以阻抑CcpC或其同系物或直系同源物的表达。在一个变体中，为了CcpC或其同系物或直系同源物的低表达而修饰细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是编码CcpC的至少一个基因的敲除突变体。本发明因此还包括经修饰的细胞，所述细胞是Bacillus subtilis的CcpC编码基因同系物的敲除突变体。本发明因此还包括Bacillus subtilis的CcpC编码基因的直系同源物的敲除突变体。本发明还包括CcpC及其基因的其他功能类似物的敲除突变体。
在宿主细胞遗传修饰的一个替代性或优选额外的变体中，遗传修饰发生在CcpC转录因子的至少一个和优选若干个结合结构及其片段上。这些优选地是宿主细胞中由CcpC调节的基因的操纵基因结构。被调节的基因特别是citB和citZ，本发明不旨在仅限于此。通过接近CcpC调节的基因操纵基因区段附近的根据本发明的至少一种优选地提供的突变，根据本发明转录因子与操纵基因的结合应当被阻止或减少，使得关于基因转录的调节效应发生至降低的程度，或完全不发生。用于修饰被转录因子调节的基因的操纵基因区段(特别是它们对转录因子的结合序列)的方法是本领域技术人员已知的。被调节的基因citB和citZ的结合序列和ccpC基因自身中的结合序列例如公开/参考于“Bacillus subtilis中的转录调节数据库”(DBTBS；见http://dbtbs.hgc.jp/)中。ccpC基因自身调节序列中已知结合序列的例子位于相对于起始密码子第-10到+15位(SEQ ID No.：3)处，特别是第-5到+10位(SEQ ID No.：8)处。citB的已知结合序列位于相对于起始密码子第-75到-52位(SEQ ID No.：4)处，特别是第-73到-68位(SEQ ID No.：9)处或第-64到-60位(SEQ ID No.：10)处，和第-35到-22位(SEQ ID No.：5)处或第-35到-17位(SEQ ID No.：11)处，特别是第-27到-22位(SEQ ID No.：12)处，citZ的已知结合序列位于相对于起始密码子第-11到+5位(SEQ IDNo.：6)处，特别是第-11到-8位(SEQ ID No.：13)位处，和第+21到+44位(SEQ ID No.：7)处，特别是第+23到+26位(SEQ ID No.：14)处或第+34到+37位(SEQ ID No.：15)处。前述已知结合序列和相应的操纵子列于表1中。
表1：被CcpC调节的已知基因及其操纵子的列表。“绝对位置”以“NCBI序列文件(登记号no.NC 000964)”中的位置为基础计算。精确的结合序列(顺式元件)加有下划线。来源：http://dbtbs.hgc.jp/。
Figure BPA00001389074100111
本发明因此涉及在ccpC基因中含有修饰/突变的经修饰的宿主细胞，所述修饰/突变导致所述基因降低的表达(见上文)。然而在其他实施方案中，宿主细胞也可以被修饰，使其在ccpC基因产物的结合序列中，优选地在上文所述根据SEQ ID No.：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的结合序列之一中包含修饰/突变，从而降低CcpC的结合。所述降低的结合应当被理解为降低的CcpC活性，如上文所述，优选与野生型活性相比降低至少25％的活性，这对应于被降低至少25％的结合。本发明还涉及其转录本和可由其合成的蛋白质及其反义构建体用于在本文所述教导的意义上调节、特别是提高宿主细胞中核黄素合成的用途。引入突变并随后测量亲合力的方法，例如“凝胶迁移”实验或“足迹”实验的完成(见例如Maniatis et al.，1989：“Molecular cloning，a laboratory manual”，2ndEdition，Cold Spring Harbours Laboratory，N.Y.)是本领域技术人员已知的。
本发明还涉及与上述分子和结构结合的分子。此类分子根据本发明适用于修饰、特别是阻抑CcpC或其同系物或直系同源物的功能或活性。优选地，此类分子与可由选自SEQ ID No.：1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和SEQ ID No.：15的核苷酸序列定义的至少一种结构或分子、特别是操纵基因结构结合。优选地，结合分子是针对所述结构的特异性抗体，并因此是可定义的。
因此，本发明的一个主题是能够与根据前述多聚氨基酸序列或分子之一特异性结合的单克隆抗体或多克隆抗体。通过抗体与CcpC的结合，阻止转录因子与要调节的基因(例如citB或citZ)中的操纵基因序列结合。
上述经修饰的核酸分子和经修饰的宿主细胞被用于提高核黄素合成。本发明因此还涉及生物技术合成核黄素的方法，所述方法特别包括以下步骤：
a)提供根据本发明的经修饰的宿主细胞，
b)在使得宿主细胞中能够合成核黄素的合适培养基中和合适培养条件下培养经修饰的宿主细胞，并任选地
c)将核黄素与经修饰的宿主细胞和/或培养基分离。
本发明的一个特别的方面是借助于上述经修饰的宿主细胞发酵生产核黄素。根据本发明，术语“核黄素”包括核黄素，黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，及其前体分子(“前体”)，核黄素、FMN或FAD的衍生物和盐。盐的例子特别是5-磷酸核黄素和5-磷酸核黄素钠。核黄素、FMN或FAD的前体分子和衍生物包括例如DRAPP，5-氨基-6-核糖氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸，2，5-二氨基-6-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5′-磷酸(2，5-diamino-6-ribitylamino-4(3H)-pyrimidinone-5′-phosphate)，5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸，5-氨基-6-核糖醇氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮，6，7-二甲基-8-核糖醇2，4-二氧蝶啶(6，7-dimethyl-8-ribityllumazine，DMRL)和黄素蛋白。
发酵合成核黄素的一般方法和涉及核黄素生物合成、特别是Bacillus中发酵合成的基因是已知的(见例如EP 405370或Ullman′s Encyclopediaof Industrial Chemistry，7th Edition，2007，Chapter Vitamins)。这些方法也可以用于借助于本文所述经修饰的宿主细胞的核黄素合成。
在根据本发明的用于核黄素合成的方法中可以使用多种底物作为碳源。特别合适的碳源可选自具有3、5或6个碳原子的化合物，例如D-葡萄糖、甘油、“稠果汁”、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖。优选地，碳源是D-葡萄糖。就本文所述方法而言，术语“碳源”、“底物”和“生产底物”可互换使用。
可以使用适用于核黄素合成的所有培养基作为借助于经修饰的宿主细胞进行核黄素合成的本发明方法的(培养)介质。培养基典型地是含有例如盐和底物，并具有特定pH的水性培养基。其中底物被转化成核黄素的培养基也被称作生产培养基。
就本发明而言，“发酵”或“生产”或“发酵方法”是指在本领域技术人员已知的条件下在培养基中使用生长中的细胞，以及在本领域技术人员已知的条件下在适当培养基中培养这些细胞后使用不再生长的细胞(所谓的“静息细胞”)。这些生长中的细胞或不再生长的细胞被用于在本领域技术人员已知的条件下将合适的底物转化成核黄素。
可以通过合适的方法从宿主细胞中获得/分离所合成的核黄素。这可例如表示将核黄素与生产培养基分离。任选地，获得的核黄素可随后被进一步加工，例如纯化。
就借助于经修饰的宿主细胞生产核黄素的上述方法而言，微生物的生长步骤通常在需氧条件下，在添加了适当营养物的水性培养基中进行。培养可以例如以分批、补料分批、半连续或连续方法进行，补料分批或半连续是优选的。
取决于宿主细胞、pH、温度和营养培养基，培养的持续时间可以是例如约10小时到约10天，优选地约4天到约7天，特别优选地约2天到约6天。技术人员知道对所选择的宿主细胞而言最佳的条件。
培养例如在约7.0、优选地在约6到约8之间、特别优选地在约6.5到7.5之间的pH下，和从约13℃到约70℃、优选地从约35℃到约39℃、特别优选地从约30℃到约39℃、特别优选地从约36℃到约39℃的合适温度下进行。培养基通常含有D-葡萄糖、甘油、“稠果汁”、右旋糖、淀粉、蔗糖或核糖作为碳源，氮源例如胨、酵母提取物或氨基酸。另外可存在盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钙或碳酸钙。借助于Bacillus subtilis细胞发酵生产核黄素的一个例子描述于WO 04/113510(VF培养基)中，所述WO 04/113510作为参考文献并入本文。所述方法可优选地被用于本发明。
通过上文所述转录因子CcpC活性的修饰，(经修饰的)宿主细胞能够进行提高的核黄素合成。与未经修饰的细胞或野生型细胞的核黄素产率相比，根据本发明的宿主细胞(特别是菌株Bacillus subtilis)的核黄素产率可以被提高至少10％。提高至少20％，特别是至少30％、40％、50％、60％、80％和更多是优选的。测定核黄素产率/生产力的分析方法是已知的。例子是HPLC或指示菌株的使用(见例如Bretzel et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22，19-26，1999)。发酵发生后，将生产的核黄素与其他组分(培养基、生物量等等)分离，纯化，并通过已知方法测定浓度，用野生型菌株进行对照反应。
术语例如“生产”或“制备”和“生产力”是本领域技术人员已知的，并且包括在给定时间和给定发酵体积内形成的核黄素的浓度(例如每小时每升的kg产物)。术语“产率”是本领域技术人员已知的，并且包括将碳源转化成产物(即核黄素)的效率。产率通常被描述成例如每kg碳源的kg产物。就本发明而言，“提高产率和/或生产力”表示在给定量的时间段中给定的培养物体积中获得的分子的量提高。
实施例
使用的但未列出的所有培养基描述于WO2007/051552中。
100X微量元素溶液A：12.5g MgCl2·6H2O；0.55g CaCl2；1.35gFeCl2·6H2O；0.1g MnCl2·4H2O；0.17g/l ZnCl2；0.043g CuCl2·2H2O；0.06g CoCl2·6H2O；0.06g Na2MoO4·2H2O；加H2O至1l，经高压灭菌。
5X最小盐溶液：0.057M K2SO4；0.31M K2HPO4·5H2O；0.22MKH2PO4；0.017M柠檬酸钠·7H2O；0.004M MgSO4.H2O，pH 7.0，经高压灭菌。
100X微量元素溶液B：0.55g CaCl2；0.17g ZnCl2；0.043gCuCl2·2H2O；0.06CoCl2·6H2O；0.06g Na2MoO4·2H2O；加H2O至1l，经高压灭菌。
核黄素筛选培养基(RSM)：200ml 10X Spizizen盐；10ml 100X微量元素溶液A；2ml 50％葡萄糖；36ml 25％棉子糖；10ml 10％酵母提取物；加H2O至1l。
Spizizen最小培养基(SMM)：100ml 10X Spizizen盐；10ml 50％葡萄糖；1ml 40％谷氨酸钠；10ml微量元素溶液A；加H2O至1l。
如下测试摇瓶中的核黄素生产：从冷冻甘油菌种开始接种5mL VY培养基中，在摇动(280rpm)下于37℃下培养6-8小时。用所述5ml培养物直接接种250ml烧瓶中的25ml RSM培养基。在39℃下摇动(220rpm)孵育48小时后，用35ml 4N NaOH处理500μl培养物液体，并剧烈摇动1分钟。用465μl 1M磷酸钾缓冲液(pH 6.8)处理样品，并在13200rpm下离心5分钟。通过HPLC测定核黄素、6，7-二甲基-8-核糖醇2，4-二氧四氢蝶啶(DMRL)和奥索马嗪(oxolumazine)的含量。对第二培养物样品离心(5分钟，13200rpm)，并使用上清液测定残余的葡萄糖和棉子糖。这些数值的测定使得能够计算产率。
通过HPLC分析摇瓶培养物样品。在装有平衡自动采样器、二极管阵列和荧光检测器的Agilent 1100HPLC系统上进行色谱。在装有4mm LC-8DB保护柱的Supelcosil LC-8DB-5μ柱(150mmx4.6mm)上进行分离。使用0.1M乙酸和甲醇的混合物作为移动相。通过梯度进行洗脱。在2％甲醇浓度下5分钟后，在15分钟内将甲醇浓度提高到50％。将柱在20℃下平衡。使用280nm下的UV信号用于检测。在15.2min后作为分离的峰检测到核黄素。使用来自Fluka的核黄素进行所述方法的校准，并且从10mg/l到1g/l是线性的。为了测定培养液中的葡萄糖和棉子糖，使用装有四元泵、自动采样器和折射指数检测器的Agilent 1100HPLC系统。分离在来自Shiseido的CAPCELL PAK NH2 UG80柱(4.6mmx250mm，5μ)上进行。最佳柱温度为35℃。移动相是乙腈和去离子水以65/35比例的混合物。流速被设定为1ml/min。注射体积为5μl。使用折射指数监测器信号用于检测。所述方法可针对0.5g/l到30g/l的浓度使用。
实施例1
模拟具有CcpC活性改变的核黄素产率
为了预测具有根据本发明的转录因子CcpC活性改变(特别是活性减小)的宿主细胞中核黄素合成中的代谢通量分布，在第一步中鉴定CcpC活性的改变，并通过“网络组分分析”(NCA)和基因表达时间序列(geneexpression time series)来定量它们对CcpC调节的基因的影响。为了预测转录因子活性的影响，将起始通量分布的被调节通量转换，然后通过二次凸优化(quadratic convex optimization)计算新的代谢流分布。采用需氧生长期间生产核黄素的Bacillus subtilis菌株作为例子进行模拟。
CcpC活性小于1的突变体(AF＜1，例如敲除突变体)显示与野生型(AF＝1)相比可观地提高的核黄素产率，即0.05与0.02相比的产率(每g葡萄糖的g核黄素)。
实施例2
生产CcpC-缺陷型菌株
为了在宿主细胞Bacillus subtilis中制备转录因子CcpC的敲除突变体，在B.subtilis基因组的原始ccpC基因座处引入抗生素抗性基因盒。
在第三次PCR中，用新霉素抗性基因组合通过PCR从B.subtilis 168的基因组DNA扩增的两条DNA片段(Itaya et al.，1989，A neomycinresistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilischromosome，Nucleic Acids Res.17：4410)。为了制备与基因ccpC的5′和3′区同源的两条片段，进行以下PCR：5′-同源性片段，100ng来自B.subtilis 168的基因组DNA，1μl 100μM的引物p436(SEQ ID No.：16)溶液，1μl 100μM的引物p439(SEQ ID No.：17)溶液，1μl 10mM的dNTP溶液，5μl 10x缓冲液，和0.5μl Pfu聚合酶(Stratagene)，总计50μl。PCR反应由35个循环组成：(i)94℃下变性30秒；(ii)52℃下退火30秒；(iii)72℃下扩增1分钟。在实际的PCR反应之前，将模板DNA在95℃下变性3分钟。在3′DNA片段的情况下，使用引物对引物p437(SEQ IDNo.：18)和引物p438(SEQ ID No.：19)。在相同条件下使用引物对p9(SEQID No.：20)和p10(SEQ ID No.：21)制备编码新霉素抗性基因盒的DNA片段。在第4次PCR中，三条DNA片段通过它们的同源、重叠区域被结合在一起。为此，使用通过琼脂糖凝胶电泳纯化的50ng每种DNA片段。与上文所述PCR条件相比，扩增时间被提高至2.5分钟。所有其他参数保持不变。使用引物p45和p51作为引物对。通过来自Qiagen的QiaQuickPCR纯化试剂盒纯化得到的PCR产物。用2μg经纯化的产物转化感受态B.subtilis 168细胞。在含有2mg/l新霉素的TBAB培养基上进行新霉素抗性菌落的选择。通过进一步的PCR(上述条件下引物对p45和p10)，证实所选择的新霉素抗性转化体的基因型。一个阳性转化体被命名为BS5878。
实施例3
将ccpC敲除转移进所选择的生产核黄素的菌株中
为了将ccpC敲除转移进所选择的过量生产核黄素的B.subtilis菌株中，使用用噬菌体PBS-1进行的转导(见WO 07/051552，实施例6)。制备菌株BS5878的PBS-1噬菌体裂解物。如下制备用于转导的核黄素生产者BS3914和BS3917：菌株BS3914和BS3917是过量生产核黄素的菌株BS3534(BS3534的构建见WO 2007/051552)的后代。BS3534以菌株B.subtilis RB50为基础，所述菌株B.subtilis RB50描述于专利EP 405370中并以编号NRRL B-18502保藏。在菌株BS3914和BS3917中，整合进核黄素基因座中的质粒pRF69被新霉素抗性基因盒代替。为了制备相应的PCR产物，使用上文所述PCR方法。PCR产物由B.subtilis 168的基因组DNA上来自核黄素操纵子启动子上游526bp长的3′区域(引物对p50；SEQ IDNo.：22和p51；SEQ ID No.：23)和B.subtilis 168的基因组DNA上ribD基因中502bp长的5′区域(引物对p44；SEQ ID No.：24和p45；SEQ IDNo.：25)组成，所述区域通过PCR与新霉素抗性基因盒(质粒pUB110上引物p9和p10)融合。精确的反应条件在上文描述。经纯化的PCR产物被用于转化感受态B.subtilis 168细胞。选择在含有100mg/l核黄素和2mg/l新霉素的TBAB平板上发生。通过PCR和测序证实生长的菌落的基因型。一个被证实、分离的转化体被命名为BS3813。制备BS3813的PBS-1噬菌体裂解物，用于将构建体转移进菌株BS3534中。由此制备的菌株被命名为BS3798。
在下一步中，再次用功能性核黄素操纵子代替核黄素营养缺陷型菌株BS3813的新霉素抗性盒。为了选择阳性转化体/转导体，使用最小培养基平板(2g/l葡萄糖，溶于1x矿物质盐溶液-微量元素溶液中)。在经修饰的启动子/mRNA前导序列中，用B.subtilis的veg基因的启动子代替天然启动子。另外，用胸苷代替前导区中的胞苷(SEQ ID No.：26)。用具有根据SEQ ID No.：26的序列的DNA片段转化菌株BS3813的感受态细胞。经转化的细胞再次具有在不添加核黄素的培养基上生长的能力。通过PCR和随后的测序证实生长的菌落的基因型。一种经证实的菌落被命名为BS3953。使用菌株BS3953的PBS-1噬菌体裂解物转导BS3798。如上文所述进行选择。分离两种类型的转导体。在第一种情况下，BS3798的被失活的spo0A基因未用野生型等位基因代替。一种被证实的转导体被命名为BS3914。在第二种情况下，由于转导期间更大片的DNA的转移，被灭活的spo0A基因已被活性野生型形式代替。一种经检验的、Spo0A-阳性的突变体被称作BS3917。
即用来自BS5878的裂解物转导BS3914和BS3917。选择再次发生于含有2mg/l新霉素的TBAB平板上。用上述PCR证实所选择的转导体的基因型。来自菌株BS3914转导的五种经证实的转导体被命名为BS5891、BS5893、BS5894和BS5895。源自BS3917的四种转导体被命名为BS5887到BS5890。
如上文所述在摇瓶中检验新产生的菌株的核黄素生产。48小时后，从培养物中采取500μl样品，用4N NaOH处理，中和并在离心后通过HPLC测定样品的核黄素浓度。为了计算产率，还测定了最终样品中的糖浓度。结果概括于表2A和2B中。
表2A：基于BS3914新制备的ccpC敲除菌株的摇瓶检验中的核黄素产率。新菌株的核黄素产率与宿主菌株BS3914的核黄素产率相比。
  菌株   核黄素产率[％]   提高[％]
  BS3914   4.67   100
  BS5891   4.77   102
  BS5893   4.78   102
  BS5894   4.66   100
  BS5895   4.76   102
表2B：基于BS3917新制备的ccpC敲除菌株的摇瓶检验中的核黄素产率。新菌株的核黄素产率与宿主菌株BS3917的核黄素产率相比。
  菌株   核黄素产率[％]   提高[％]
  BS3917   5.91   100
  BS5887   7.32   122
  BS5888   6.95   118
  BS5890   6.90   117
源自菌株(BS3914)的转导体以与宿主菌株BS3914相似的产率生产核黄素。Spo0A-plus菌株BS3917的ccpC敲除菌株以相对于宿主菌株BS3917被可观改进的产率生产核黄素。在所述条件下甚至BS3917自身也显示比Spo0A-minus菌株BS3914显著更好的产率(25％)。
可以得出结论，具有活性spo0A基因的生产核黄素的B.subtilis菌株中ccpC的失活实现了在摇瓶条件下至少20％的产率改进。
使用ccpC的部分失活，即向基因序列中引入导致转录功能减小(例如活性减小75％、50％或25％)的突变，并随后测定核黄素浓度时，可观察到与野生型菌株相比约10％到最大20％的提高。这些结果也可以如下实现：将突变插入CcpC的结合序列(见表1)中，从而依赖于亲合力的减小，可以实现核黄素浓度在约25％区域中的提高。上述突变根据标准方案被插入，之后可以借助于已知方法(见说明书)测定亲合力或亲合力的降低，并如上文所述测定核黄素的量。
Figure IPA00001389073600011
Figure IPA00001389073600021
Figure IPA00001389073600041
Figure IPA00001389073600051
Figure IPA00001389073600061
Figure IPA00001389073600071
Figure IPA00001389073600081

Claims (13)

1.经修饰的生产核黄素的微生物，其特征在于，与未经修饰的野生型微生物相比，CcpC型转录因子的表达和/或活性被降低，优选地被降低至少25％。
2.如权利要求1所述的微生物，其特征在于，其包含处于被CcpC型转录因子调节的至少一个基因的一个或多个结合序列中的至少一个突变，优选地处于citZ和/或citB基因的结合序列中的至少一个突变。
3.如权利要求2所述的微生物，其特征在于，其包含处于根据SEQID Nos.：3、4、5、6、7的序列或其片段中，特别是SEQ ID Nos.：8、9、10、11、12、13、14或15中的至少一个突变。
4.如权利要求1或2所述的微生物，其特征在于，编码Ccpc的基因被敲除。
5.如权利要求1或4所述的微生物，其特征在于，包含选自下组的核酸分子，所述组由以下组成：
a)包含核苷酸序列SEQ ID No.：1或由核苷酸序列SEQ ID No.：1组成的核酸分子；
b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No.：2或由氨基酸序列SEQ ID No.：2组成；
c)与a)或b)的核酸分子具有至少70％同源性的核酸分子；
d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和
c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/活性的蛋白质，
其中根据a)到c)的核酸分子具有至少一处下述遗传突变，所述遗传突变导致与CcpC野生型的活性相比降低的、优选地降低至少25％的CcpC蛋白质活性。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的微生物，其特征在于，与未经修饰的微生物或野生型微生物相比具有提高至少10％的核黄素产率。
7.根据前述权利要求中任一项所述的微生物，其特征在于，选自由以下组成的组：Bacillus、Corynebacterium和Pseudomonas，优选地Bacillusanthracis、Bacillus cereus、Bacillus stearothermophilus、Bacillushalodurans、Bacillus amyloliquifaciens或Bacillus subtilis。
8.根据前述权利要求中任一项所述的微生物用于与未经修饰的微生物或野生型微生物中的核黄素合成相比提高核黄素合成、特别是提高至少10％的用途。
9.编码CcpC型转录因子的经修饰的核酸分子的用途，其特征在于，所述修饰导致转录因子功能的降低，优选地导致至少25％的降低，特征在于要被修饰的核酸分子选自由以下组成的组：
a)包含核苷酸序列SEQ ID No.：1或由核苷酸序列SEQ ID No.：1组成的核酸分子；
b)编码下述多聚氨基酸分子(蛋白质)的核酸分子，所述多聚氨基酸分子包含氨基酸序列SEQ ID No.：2或由氨基酸序列SEQ ID No.：2组成；
c)与a)或b)的核酸分子具有至少70％同源性的核酸分子；
d)在严格条件下与a)或b)的核酸分子之一杂交的核酸分子；和
c)根据a)或b)的核酸分子的片段和/或类似物，其编码具有CcpC型转录因子功能/活性的蛋白质。
10.经修饰的核酸分子的用途，其特征在于，所述修饰导致CcpC型转录因子功能的降低，优选地导致至少25％的降低，特征在于要被修饰的核酸分子选自所述转录因子的结合序列。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述经修饰的核酸分子选自由SEQ ID Nos.：3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15组成的组。
12.用于生产核黄素的方法，其特征在于所述方法包括培养根据权利要求1到7中任一项的微生物。
13.用于生产核黄素的方法，其特征在于包括步骤：
a)提供根据权利要求1到7中任一项所述的合适的宿主细胞，
b)在适用于核黄素生产的发酵条件下培养，和
c)将核黄素与培养基和/或经修饰的宿主细胞分离。
CN200980150515.7A 2008-12-15 2009-12-15 用于生产核黄素的方法 Active CN102245781B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102008063234.1 2008-12-15
DE102008063234A DE102008063234B4 (de) 2008-12-15 2008-12-15 Biotechnologische Herstellung von Riboflavin mit hoher Ausbeute
PCT/EP2009/008987 WO2010075960A2 (de) 2008-12-15 2009-12-15 Verfahren zur herstellung von riboflavin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102245781A true CN102245781A (zh) 2011-11-16
CN102245781B CN102245781B (zh) 2015-11-25

Family

ID=42025765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980150515.7A Active CN102245781B (zh) 2008-12-15 2009-12-15 用于生产核黄素的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8759024B2 (zh)
EP (1) EP2358893A2 (zh)
JP (1) JP5813512B2 (zh)
KR (1) KR101739147B1 (zh)
CN (1) CN102245781B (zh)
DE (1) DE102008063234B4 (zh)
WO (1) WO2010075960A2 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102629304A (zh) * 2012-04-05 2012-08-08 天津大学 基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法
CN107922464A (zh) * 2015-08-28 2018-04-17 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 经改进的维生素生产
CN108588108A (zh) * 2018-05-04 2018-09-28 湖北大学 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
CN113015811A (zh) * 2018-11-15 2021-06-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改善的核黄素生产

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816823B (zh) * 2012-09-18 2014-10-22 江南大学 利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法
KR20230168477A (ko) * 2022-06-07 2023-12-14 씨제이제일제당 (주) 리보플라빈 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈을 생산하는 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0821063A2 (en) * 1996-07-24 1998-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved riboflavin production
CN1639339A (zh) * 2002-02-27 2005-07-13 Dsmip资产有限公司 发酵方法
CN101124242A (zh) * 2004-12-22 2008-02-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 与糖异生作用有关的新颖的基因

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1066486C (zh) 1989-06-22 2001-05-30 霍夫曼-拉罗奇有限公司 高产核黄素的细菌菌株
WO2004113510A2 (en) 2003-06-18 2004-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Production of pantothenate using microorganisms incapable of sporulation
EP1957640B1 (en) * 2005-11-02 2013-05-29 DSM IP Assets B.V. Modified transketolase and use thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0821063A2 (en) * 1996-07-24 1998-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved riboflavin production
CN1639339A (zh) * 2002-02-27 2005-07-13 Dsmip资产有限公司 发酵方法
CN101124242A (zh) * 2004-12-22 2008-02-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 与糖异生作用有关的新颖的基因

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CECILE JOURLIN-CASTELLI ET AL.,: ""CcpC, a novel regulator of the LysR family required for glucose repression of the citB gene in Bacillus subtilis"", 《JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY》 *
HYUN-JIN KIM: ""Regulation of the Bacillus subtilis ccpC gene by CcpA and CcpC"", 《MOLECULAR MICROBIOLOGY》 *
SCANLAN,E. AND DEVIN,K.M.: ""GenBank Accession No：AJ222587.1"", 《GENBANK》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102629304A (zh) * 2012-04-05 2012-08-08 天津大学 基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法
CN102629304B (zh) * 2012-04-05 2015-02-04 天津大学 基于基因组尺度代谢网络模型的代谢工程设计预测方法
CN107922464A (zh) * 2015-08-28 2018-04-17 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 经改进的维生素生产
CN107922464B (zh) * 2015-08-28 2022-03-15 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 经改进的维生素生产
CN108588108A (zh) * 2018-05-04 2018-09-28 湖北大学 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
CN108588108B (zh) * 2018-05-04 2021-06-01 湖北大学 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
CN113015811A (zh) * 2018-11-15 2021-06-22 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改善的核黄素生产

Also Published As

Publication number Publication date
JP5813512B2 (ja) 2015-11-17
KR101739147B1 (ko) 2017-05-23
US20110312026A1 (en) 2011-12-22
WO2010075960A8 (de) 2011-06-23
DE102008063234A1 (de) 2010-06-17
JP2012511898A (ja) 2012-05-31
CN102245781B (zh) 2015-11-25
DE102008063234B4 (de) 2011-06-22
EP2358893A2 (de) 2011-08-24
KR20110104955A (ko) 2011-09-23
WO2010075960A3 (de) 2010-09-10
WO2010075960A2 (de) 2010-07-08
US8759024B2 (en) 2014-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101950141B1 (ko) 신규 아데닐로석시네이트 신세타아제 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 생산방법
CN101679490B (zh) 通过mRNA的稳定化提高目标产物的生产
CN102209780B (zh) 经改进的核黄素生产
KR101166027B1 (ko) 5'-이노신산 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 핵산의 생산방법
KR101956510B1 (ko) 신규 5'-이노신산 디하이드로게나아제 및 이를 이용한 5'-이노신산 제조방법
KR20190090657A (ko) 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법
CN102245781A (zh) 用于生产核黄素的方法
CN107922464B (zh) 经改进的维生素生产
CN102171346B (zh) 产生嘌呤核糖核苷和核糖核苷酸的方法
AU5777701A (en) Process for producing a target fermentation product
CN101104865B (zh) 属于芽孢杆菌属的肌苷生产细菌和生产肌苷的方法
CN110964769A (zh) 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素收率的方法
CN101120090B (zh) 用属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌通过发酵制备嘌呤核苷和核苷酸的方法
KR101334169B1 (ko) 글루코스신생합성에 관련된 신규 유전자
JPH08168383A (ja) 核酸関連物質の製造法
RU2403286C2 (ru) Мутантная фосфорибозилпирофосфатсинтетаза, днк, кодирующая ее, бактерия, содержащая указанную днк, способ продукции пуриновых нуклеозидов и cпособ продукции пуриновых нуклеотидов

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant