CN101120090B - 用属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌通过发酵制备嘌呤核苷和核苷酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了产生嘌呤碱基类似物、嘌呤核苷和嘌呤核苷酸如肌苷和5’-肌苷酸的方法，其包括使用属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌，其中通过提高YdhL蛋白的活性而增强了所述细菌的嘌呤产率。还公开了来自解淀粉芽孢杆菌的YdhL蛋白的氨基酸序列以及编码该蛋白的基因。

Description

用属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌通过发酵制备嘌呤核苷和核苷酸的方法

技术领域

本发明涉及产生嘌呤核苷的方法，嘌呤核苷是5’-肌苷酸和5’-鸟苷酸合成中的重要原料。本发明还涉及该产生方法中所使用的新的微生物。本发明还涉及新的DNA和蛋白质种类，其赋予表达所述新DNA的细菌对嘌呤碱基类似物和嘌呤核苷的抗性。

背景技术

按常规，核苷如肌苷通过利用腺嘌呤营养缺陷型菌株，或者利用被赋予了针对多种药物如嘌呤类似物和磺胺胍(sulfaguanidine)的药物抗性的菌株的发酵方法来工业化产生。这些菌株的例子包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)(日本专利公开号54-17033(1979)，55-2956(1980)，和55-45199(1980)，日本专利申请公开(laid-open)No.56-162998(1981)，日本专利公开Nos.57-14160(1982)和57-41915(1982)，以及日本专利申请公开No.59-42895(1984))，或者短杆菌属(Brevibacterium)(日本专利公开Nos.51-5075(1976)和58-17592(1972)，以及Agric.Biol.Chem.，42,399(1978))，或者埃希氏菌属(Escherichia)(WO9903988)等的菌株。

这些突变菌株的获得通常包括对微生物进行诱变处理如紫外照射(UVirradiation)或亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理，并通过适当的选择培养基选择所需的菌株。在另一方面，用遗传工程技术培养这些突变菌株也已应用于属于芽孢杆菌属(日本专利申请公开58-158197(1983)，58-175493(1983)，59-28470(1984)，60-156388(1985)，1-27477(1989)，l-174385(1989)，3-58787(1991)，3-164185(1991)，5-84067(1993)，和5-192164(1993))，或短杆菌属(日本专利申请公开63-248394(1988))，或埃希氏菌属(WO9903988)的菌株。

这些产肌苷菌株的产生能力可以通过增强肌苷分泌能力来进一步得到提高。目前，一般公认代谢物穿过胞质细胞膜的渗透通常由特定的流出(efflux)转运蛋白所介导(Pao，S.S.等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62(1)，1-34，(1998)；Paulsen，I.T.等，J.Mol.Biol.，277，573-592(1998)；Saier，M.H.等，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，257-279(1999))。本发明人先前已公开了属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的产肌苷或黄苷菌株，其具有增强的由rhtA(ybiF)基因编码的RhtA蛋白的活性、增强的由yijE基因编码的YijE蛋白的活性、增强的由ydeD基因编码的YdeD蛋白的活性，与各自的亲本株相比，其产生更多的肌苷或黄苷(分别为俄罗斯专利申请Nos.2002101666，2002104463和2002104464)。最近，发现来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的YdhL降低对嘌呤类似物2-氟腺嘌呤的敏感性。此外，间接证据显示YdhL减少次黄嘌呤(hypoxanthine)的内部聚集量(Johansen等，J.Bacteriol.，185，5200-5209，2003)。然而，尚未显示YdhL过表达对核苷分泌和/或核苷产生的影响。

另外，既没有来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的YdhL的报道，也没有显示YdhL过表达对核苷分泌和/或核苷产生的影响。

发明内容

本发明的目的是用产肌苷菌株提高肌苷的产量，还提供了用这些菌株产生肌苷和5’-肌苷酸的方法。

该目的通过鉴定编码推定的膜蛋白的枯草芽孢杆菌的ydhL基因而实现，当置于多拷贝载体上的所述基因的野生型等位基因被导入大肠杆菌(E.coli)菌株中时，所述膜蛋白赋予对嘌呤碱基类似物如8-氮杂腺嘌呤、6-甲基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和嘌呤核苷如肌苷和鸟苷的抗性。而且，从解淀粉芽孢杆菌中分离了先前未知的ydhL基因，并测定了其核苷酸序列。此外，确认了当向分别属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的产肌苷菌株的细胞导入来自枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的ydhL基因的额外拷贝时，该基因能够增加核苷的产量。由此完成了本发明。

因此，本发明提供了属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属且具有肌苷产生能力的微生物。

本发明的目的是提供来自解淀粉芽孢杆菌的选自下组的YdhL蛋白：

(A)蛋白质，其包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列；和

(B)蛋白质，其包含在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列，且当所述蛋白质的所述活性在所述细菌中增强时，其具有使属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌抵抗选自嘌呤碱基类似物、肌苷、和鸟苷的嘌呤的活性。

本发明的另一目的是提供编码上述蛋白质的DNA。

本发明的另一目的是提供上述的DNA，其中所述DNA选择下组：

(a)包含SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA。

(b)DNA，其在严格条件下与SEQ ID No.1的核苷酸序列或可由SEQ IDNO：1的核苷酸序列制备的探针杂交，且当所述蛋白质的活性在所述细菌中增强时，该DNA编码蛋白，该蛋白具有使属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌抵抗选自嘌呤碱基类似物、肌苷、和鸟苷的嘌呤的活性。

本发明的另一目的是提供如上所述的细菌，其中所述的严格条件包含1x SSC，0.1％SDS，60℃。

本发明的又一目的是提供芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌，所述细菌具有嘌呤产生能力，且所述细菌具有增强的选自下组的蛋白质的活性：

(A)由来自解淀粉芽孢杆菌的ydhL基因所编码的蛋白质，

(B)由来自枯草芽孢杆菌的ydhL基因所编码的蛋白质，和

(C)由(A)或(B)中所述ydhL基因的直向同源物(ortholog)所编码的蛋白质。

本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述嘌呤为肌苷或鸟苷。

本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述蛋白质的活性通过增加编码所述蛋白质的基因的拷贝数，或者通过改变细菌染色体上所述DNA的表达调控序列而得到增强。

本发明的又一目的是提供上述的细菌，其中所述转化用低拷贝数载体进行。

本发明的又一目的是提供产生嘌呤核苷的方法，包括在培养基中培养上述的细菌，允许所述的嘌呤核苷分泌到所述的培养基中，和从培养基中收集所述的嘌呤核苷。

本发明的又一目的是提供上述的方法，其中所述的嘌呤核苷是肌苷、黄苷、或鸟苷。

本发明的又一目的是提供上述的方法，其中所述细菌经修饰以具有增强的嘌呤核苷生物合成基因的表达。

本发明的又一目的是提供产生嘌呤核苷酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌，将所述嘌呤核苷磷酸化以产生嘌呤核苷酸，允许所述嘌呤核苷酸分泌到所述的培养基中，和收集嘌呤核苷酸。

本发明的又一目的是提供上述的方法，其中所述嘌呤核苷酸为5’-肌苷酸、5’-黄苷酸、或5’-鸟苷酸。

本发明的又一目的是提供上述的方法，其中所述细菌经修饰以具有增强的嘌呤核苷酸生物合成基因的表达。

本发明的又一目的是提供产生5’-鸟苷酸的方法，包括在培养基中培养权利要求5所述的细菌，将黄苷磷酸化产生5’-黄苷酸，胺化5’-黄苷酸产生5’-鸟苷酸，和收集5’-鸟苷酸。

附图简述

图1显示由pYDHL4质粒中包含的DNA片段所编码的解淀粉芽孢杆菌YdhL蛋白(YDHL_BA；SEQ ID NO：2)与由pYDHL1质粒中包含的DNA片段所编码的枯草芽孢杆菌YdhL蛋白(YDHL BS；SEQ ID NO：4)的比对。符号“*”指YDHL_BA与YDHL_BS之间的共有氨基酸。符号“：”指YDHL_BA与YDHL_S之间氨基酸的相似性。

图2显示pMWMX1质粒的结构。

优选实施方案描述

I.本发明的蛋白质

本发明的蛋白质包含具有SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列的蛋白质，以及具有在SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列中包含一个或几个氨基酸缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质，而且其具有使属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌抵抗嘌呤碱基类似物或嘌呤核苷如肌苷或鸟苷的活性。

具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质是来自解淀粉芽孢杆菌的YdhL蛋白。该蛋白的氨基酸序列和ydhL基因的核苷酸序列在本发明公开之前是未知的。

来自枯草芽孢杆菌的YdhL蛋白不包括在嘌呤核苷酸的生物合成途径中，其属于主要易化蛋白超家族(Major Facilitator Superfamily)(Pao，S.S.，等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.62(1)：1-32，(1998))并属于阿拉伯糖流出透性酶直向同源组簇(arabinose efflux permease cluster of orthologous group)(COG)2814(Tatusov，R.L.等，Nucleic Acids Res.，29：22-28(2001))。属于该家族的大肠杆菌蛋白AraJ和YdeA也与阿拉伯糖输出(export)相关(Bost，S.等，J.Bacteriol.，181：2185-2191(1999))。枯草芽孢杆菌基因组包含另外5个编码ydhL基因同源物的基因：ybcL，yceJ，yfhI，ytbD，ywfA。枯草芽孢杆菌YdhL蛋白是由388个氨基酸组成的高度疏水性蛋白，包含12种推定的具有未知功能的跨膜片段。YdhL蛋白由ydhL基因所编码。枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)菌株168的ydhL基因(GenBank登录号CAB12399.2；GI：32468705中编号624675至625838)位于染色体上ydhK和ydhM之间53.50°。

在本发明的蛋白质中“几个”氨基酸的数目可以改变，其差异依赖于蛋白质三维结构中氨基酸残基的位置和/或类型。对于如SEQ ID No.2或4所示的蛋白质，可以是2至40、优选2至20、并且更优选2至5。这归因于一些氨基酸相互之间高度同源的事实，因此，三维结构或活性不受此变化的影响。因此，具有在SEQ ID NO：2或4所示序列中包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质可以是与YdhL蛋白的全部氨基酸序列相比具有不少于30至50％、优选50至70％、并最优选70至90％同源性的蛋白质，而且其也保留了该蛋白的活性。

与SEQ ID NO：2或4所示氨基酸序列有不少于90％、优选不少于95％、更优选不少于98％同源性，并且保留了YdhL蛋白活性的蛋白质包括在本发明中，并且是最优选的。

为了评估同源程度，可以使用几种熟知的计算方法，如BLAST检索、FASTA检索和CrustalW。

BLAST(基本位置比对检索工具，Basic Local Alignment Search Tool)是blastp，blastn，blastx，megablast，tblastn，和tblastx程序所使用的拭探式(heuristic)检索算法；这些程序采用Karlin，Samuel和Stephen F.Altschul的统计学方法(“Methods for assessing the statistical significance of molecularsequence features by using general scoring schemes”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：2264-68(1990)；“Applications and statistics for multiple high-scoringsegments in molecular sequences”.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-7(1993))赋予其结果以显著性。W.R.Pearson描述了FASTA检索方法(＂Rapidand Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA＂，Methods inEnzymology，183：63-98(1990))。Thompson J.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述了ClustalW方法(＂CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressivemultiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gappenalties and weight matrix choice＂，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994))。

对本发明蛋白质进行的如上所述的改变通常为保守性改变，以保留蛋白质的活性。取代改变包括其中去除氨基酸序列中的至少一个残基并在此位置插入不同残基的改变。可以取代上述蛋白质中原有氨基酸并视为保守性取代的氨基酸的例子包括：Ala由ser或thr所取代；arg由gln，his，或lys所取代；asn由glu，gln，lys，his，asp所取代；asp由asn，glu，或gln所取代；cys由ser或ala所取代；gln由asn，glu，lys，his，asp，或arg所取代；glu由asn，gln，lys，或asp所取代；gly由pro所取代；his由asn，lys，gln，arg，tyr所取代；ile由leu，met，val，phe所取代；leu由ile，met，val，phe所取代；lys由asn，glu，gln，his，arg所取代；met由ile，leu，val，phe所取代；phe由trp，tyr，met，ile，或leu所取代；ser由thr，ala所取代；thr由ser或ala所取代；trp由phe，tyr所取代；tyr由his，phe，或trp所取代；以及val由met，ile，leu所取代。

所提到的本发明蛋白质的“活性”指使包含该蛋白质的细菌抵抗嘌呤碱基类似物如8-氮杂腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、和/或抵抗核苷如肌苷和鸟苷的活性。

短语“抵抗嘌呤碱基类似物和/或嘌呤核苷”指细菌在包含一定浓度的嘌呤碱基类似物如8-氮杂腺嘌呤、6-甲基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤，或嘌呤核苷如肌苷或鸟苷的基本培养基上中生长，而野生型或亲本菌株不能在相似条件下生长的特性，或者指细菌在含有嘌呤碱基类似物或嘌呤核苷的培养基中的生长比其野生型或亲本菌株更快的特性。上述嘌呤碱基类似物的浓度为8-氮杂腺嘌呤300μg/ml；2，6-二氨基嘌呤400μg/ml；6-巯基嘌呤400μg/ml；而对于嘌呤碱基核苷为肌苷300μg/ml，优选1000μg/ml；和鸟苷10μg/ml。

II.本发明的细菌

本发明的细菌为通过提高蛋白质的活性而增加了嘌呤核苷的产量的细菌。更具体地，本发明的细菌为通过提高所述细菌中的本发明的蛋白质的活性而增强了嘌呤核苷产量的细菌。还更具体地，本发明的细菌在其染色体或质粒上含有ydhL基因或其直向同源物的DNA。ydhL基因或其直向同源物的DNA被过表达，并导致所述细菌具有产生更大量嘌呤核苷的能力。

可以如下所述来确定ydhL基因表达的增强：通过northern杂交或RT-PCR(Molecular cloning：Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold springHarbor(USA)，2001)测定本发明细菌中由ydhL基因表达的RNA的量，并将其与野生型或非修饰型菌株的表达相比较。在本发明的微生物中，ydhL基因表达的增强超过野生型或非修饰型菌株的情况，优选不低于野生型或非修饰型菌株的1.5倍，更优选不低于2倍，最优选不低于3倍。

本发明的细菌为属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌。可用于本发明的埃希氏菌属微生物的例子为大肠杆菌(E.coli)。可用于本发明的芽孢杆菌属微生物的例子包括枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168(B.subtilis168)或解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

属于芽孢杆菌属细菌的例子还包括以下的细菌：

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)

短芽孢杆菌(Bacillus brevis)

Bacillus polymixa

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。

可以采用Neidhardt等(Neidhardt，F.C.等，Escherichia coli and SalmonellaTyphimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1208，Table1)报道的埃希氏菌属的细菌如大肠杆菌。大肠杆菌野生菌株的例子包括但不限于K12菌株及其衍生物，大肠杆菌MG1655菌株(ATCC No.47076)，和W3110菌株(ATCC No.27325)。这些菌株可由美国典型培养物保藏中心(ATCC，地址：P.O.Box1549，Manassas，VA20108，美国)获得。

除了已经提到的特性，本发明的细菌还可以具有其他特殊的性质，例如不同的营养需求、药物抗性、药物敏感性以及药物依赖性，而不背离本发明的范围。

此处所用短语“嘌呤核苷”包括肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷，优选肌苷。

此处所用短语“嘌呤核苷产生能力”指产生并导致嘌呤核苷在培养基中积累的能力。短语“具有嘌呤产生能力”指属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物能够产生并导致嘌呤如嘌呤核苷在培养基中积累，其所产生并积累的量大于大肠杆菌野生型菌株如大肠杆菌W3110和MG1655菌株，或枯草芽孢杆菌野生型菌株如枯草芽孢杆菌168所产生或积累的量。优选该短语指所述微生物能够产生并导致肌苷、黄苷、鸟苷或/和腺苷在培养基中积累，其量不低于10mg/l，更优选不低于50mg/l。

如此处所使用的，当细菌中本发明蛋白质的活性增强时，这是指细胞中该蛋白的分子数目增加，或者每个蛋白分子本身的活性增加。

术语“直向同源基因”或“直向同源物”指来自一个物种的基因，其与通过共同的祖先物种相关联的另一物种中的基因(同源基因)相对应，但已经进化为与其它物种的基因不同的基因。直向同源基因可以具有相同的功能也可以不具有相同的功能。如果对生物体的完整基因组进行测序，可以使用以下的技术来检索直向同源物。可以使用来自一种生物体的基因进行BLAST检索以找出另一生物中的最佳同源物。然后使用在第一轮BLAST检索中发现的另一生物体的最佳同源物进行第二次回溯BLAST检索，以找出第一种生物体中的最佳同源物或直向同源物。如果第一轮中所使用的基因与第二轮结果中所发现的基因一致，则来自第一种生物的基因与另一生物中的最佳同源物为直向同源物。在BLAST检索过程中，确定了由目标基因所编码的蛋白质的同源性。

为实现本发明的目的，由直向同源基因所编码的蛋白质为具有相同活性的同源蛋白质。通过测定基因和蛋白质的序列以及蛋白质的活性来进行所述直向同源物的检索(参见，例如图1和实施例2)。

本发明人已经测定了编码解淀粉芽孢杆菌的YdhL蛋白的基因ydhL基因的序列(SEQ ID NO：1)。编码来自枯草芽孢杆菌的YdhL蛋白的基因，枯草芽孢杆菌枯草亚种菌株168的ydhL基因也已被阐明(EMBL登录号Z99107中13042位至14208位)(SEQ ID NO：3)。枯草芽孢杆菌的ydhL基因位于染色体上ydhK和ydhM基因之间53.50°。因此，所述的ydhL基因可利用基于该基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR(聚合酶链式反应；参考White，T.J.等，TrendsGenet.，5，185(1989))获得。编码来自其他微生物的YdhL蛋白的基因可以以类似的方式获得(见实施例2)。

也可以用编码本发明蛋白质的DNA例示源于解淀粉芽孢杆菌的ydhL基因，例如具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，和/或具有在SEQID NO：2所示氨基酸序列中包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有使属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌抵抗嘌呤碱基类似物、肌苷和鸟苷的活性，并且在所述细菌中该蛋白质的所述活性提高。

源于枯草芽孢杆菌的ydhL基因包含编码本发明蛋白质的DNA，所述蛋白质包括具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的蛋白质，和/或具有在SEQID NO：4所示氨基酸序列中包括一个或几个氨基酸的缺失、取代、插入或添加的氨基酸序列的蛋白质，且所述蛋白质具有使属于芽孢杆菌属或埃希氏菌属的细菌抵抗嘌呤碱基类似物、肌苷和鸟苷的活性。

可以通过例如修饰编码YdhL蛋白的DNA的核苷酸序列来获得编码与上述YdhL蛋白基本相同的蛋白质的DNA，例如，以定点突变的方式修饰，以至于在特定位点缺失、取代、插入、或添加一个或多个氨基酸残基。可以通过通常已知的突变处理获得上述经修饰的DNA。这样的处理包括对编码本发明的蛋白质的DNA进行羟胺处理，或者用紫外照射或用试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸处理包含所述DNA的细菌。

可以通过在合适的细胞中表达具有上述突变的DNA并研究任何表达产物的活性来获得编码与源于解淀粉芽孢杆菌的YdhL蛋白基本相同的蛋白质的DNA。也可以通过从编码YdhL蛋白的突变DNA中或者从包含突变的细胞中分离来获得编码与YdhL蛋白基本相同的蛋白质的DNA，所分离的DNA可在严格条件下与具有包含例如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核苷酸序列的探针杂交、并编码具有YdhL蛋白的活性的蛋白质。所述“严格条件”在本文指这样的条件，在此条件下，形成所谓的特异性杂交体而不形成非特异性杂交体。使用任何的数值来清楚地表述该条件都是困难的。然而，例如，所述严格条件包括在该条件下，高度同源的DNA，例如具有不低于50％的同源性，优选不低于70％的同源性，更优选不低于90％的同源性，再优选不低于95％的同源性的DNA能够互相杂交，而同源性低于上述同源性程度的DNA不能互相杂交。或者，严格条件可以例如DNA能够在等同于Southern杂交中的常规洗涤条件的盐浓度下杂交的条件，即大约1xSSC，0.1％SDS，优选0.1x SSC，0.1％SDS，60℃。洗涤持续时间依赖于印迹所使用的膜的类型，通常依厂商推荐。例如，在严格条件下洗涤Hybond^TMN+尼龙膜(Amersham)推荐的持续时间为15分钟。优选地，可以进行2至3次洗涤。

也可以使用SEQ ID NO：1的核苷酸序列的部分序列作为探针。可以用基于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的引物、以包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR制备探针。当长约300bp的DNA片段用作探针时，对于洗涤来说，杂交条件可以是例如50℃，2x SSC和0.1％SDS。

上述所有内容均可应用于源于枯草芽孢杆菌的YdhL蛋白。

增强本发明蛋白质的活性的技术，尤其是增加细菌细胞中蛋白质分子数目的技术，包括改变编码本发明蛋白质的DNA的表达调控序列，增加基因的拷贝数，但不限于此。

改变编码本发明蛋白质的DNA的表达调控序列可以通过将编码本发明蛋白质的DNA置于强启动子的控制之下来实现。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、λ噬菌体的P_L启动子均为已知的用于大肠杆菌的强启动子。具体地，veg启动子、spac启动子、xylE启动子为已知的用于芽孢杆菌的强启动子。或者，可以通过例如向启动子中导入突变以提高位于该启动子下游的基因的转录水平来增强启动子的活性(WO00/18935)。此外，可以通过向核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的间隔区导入突变来增强mRNA的可翻译性(translatability)。例如，根据起始密码子前三个核苷酸的性质发现了表达水平中20倍的变化范围(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等，EMBO J.，3，623-629，1984)。

另外，为了提高基因的转录水平，可以新导入增强子(enhancer)。例如，日本专利申请Laid-Open No.1-215280(1989)中描述了向染色体DNA中导入包含基因或启动子的DNA。

或者，可以通过将基因插入到多拷贝载体中形成重组DNA，然后将重组DNA导入微生物中来增加基因的拷贝数。可在大肠杆菌中自主复制的载体的例子包括pUC19，pUC18，pHSG299，pHSG399，pHSG398，pACYC184，(pHSG和pACYC可由Takara Bio获得)，RSF1010，pBR322，pMW219(pMW可由Nippon Gene获得)等等。可在芽孢杆菌属细菌中自主复制的载体的例子包括pUB110，pC194，pE194。优选使用低拷贝载体。低拷贝载体的例子包括但不限于pSC101，pMW118，pMW119等。术语“低拷贝载体”用于指产生多达每个细胞5个拷贝的拷贝数的载体。转化的方法包括任何本领域已知的方法。例如，对于大肠杆菌K-12，已经报导了用氯化钙处理受体(recipient)细胞以提高细胞对DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))，该方法可用于本发明。

基因表达的增强也可以经由例如同源重组、Mu整合等，通过将多拷贝基因导入细菌染色体来实现。例如，一次Mu整合允许向细菌染色体中导入多至3个拷贝的基因。

上述使用强启动子或增强子的技术可以与基于增加基因拷贝数或增强基因表达的技术相组合。

本领域已知的制备染色体DNA、杂交、PCR、制备质粒DNA、消化并连接DNA、转化、选择作为引物的寡核苷酸等的常用方法可用于本发明。Sambrook，J.，和Russell D.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual，ThirdEdition”，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等描述了这些方法。

为了培养属于芽孢杆菌属的微生物以得到增强的编码本发明蛋白质的基因的表达，可以通过PCR(聚合酶链式反应)来获得基因的必需区域，主要基于枯草芽孢杆菌基因的可获得的信息。例如，看起来编码转运蛋白的ydhL基因，可以用PCR从枯草芽孢杆菌菌株的染色体DNA克隆得到。用于该目的的染色体DNA可以来自枯草芽孢杆菌的其他任何菌株。

本发明的蛋白质包括YdhL蛋白的突变体和变体，突变体和变体的存在归因于天然多样性，还包括存在于不同细菌中的YdhL的同源蛋白质，只要这些突变体、变体或同源蛋白显示YdhL蛋白的功能特性，即赋予对嘌呤碱基类似物、肌苷或鸟苷的抗性。

可以通过将前述编码本发明蛋白质的DNA导入本身具有产生嘌呤核苷如肌苷能力的细菌来获得本发明的细菌。或者，可以通过赋予已经含有所述DNA的细菌产生嘌呤核苷如肌苷的能力来获得本发明的细菌。

可用于本发明的属于芽孢杆菌属的亲本菌株的例子为枯草芽孢杆菌KMBS16-1菌株。该菌株是产肌苷菌株枯草芽孢杆菌KMBS16的衍生物，其中purA：：erm突变改变为purA::cat突变。反过来，枯草芽孢杆菌KMBS16是已知的枯草芽孢杆菌trpC2的衍生物，其具有导入到编码琥珀酰-AMP合成酶(pur A::erm)的purA基因、编码嘌呤阻遏物(purR::spc)的purR基因和编码嘌呤核苷磷酸化酶(deoD::kan)的deoD基因中的突变(US2004-0166575A)。其他可用于本发明的属于芽孢杆菌属的亲本菌株包括枯草芽孢杆菌AJ12707(FERM P-12951)菌株(日本专利申请JP6113876A2)，枯草芽孢杆菌AJ3772(FERM P-2555)菌株(日本专利申请JP62014794A2)，6-乙氧基嘌呤-抗性菌株AJ13937(FERM BP-18665)(US2004-0166575)等。

属于大肠杆菌属的产肌苷菌株的例子为FADRaddedd(pMWKQ)。该菌株是已知菌株W3110的衍生物，其具有导入到以下基因中的突变：编码PRPP酰胺转移酶(amidotransferase)的purF基因、编码嘌呤阻遏物的purR基因、编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因、编码琥珀酰-AMP合成酶的purA基因、编码腺苷脱氨酶的add基因、编码6-磷酸葡糖酸脱水酶的edd基因(WO9903988)，并含有pMWKQ质粒，其包含编码PRPP酰胺转移酶的purFKQ基因并对GMP不敏感(WO9903988)。

此外，例子还包括肌苷生物合成中所涉及的酶的释放调节，特别是消除这种酶的反馈抑制的方法(WO99/03988)。消除对上述肌苷生物合成中所涉及的酶的调节手段的例子包括，例如，去除嘌呤阻遏物(美国专利No.6,284,495)。去除嘌呤阻遏物的方法的例子包括破坏编码嘌呤阻遏物的基因(purR，GenBank登录号Z99104)。

另外，也可以通过阻断由肌苷生物合成分支的(branching off)并生成另一代谢产物的反应而增强肌苷产生能力(WO99/03988)。由肌苷生物合成分支并生成另一代谢产物的反应的例子包括由例如琥珀酰-腺苷单磷酸(AMP)合酶、肌苷-鸟苷激酶、6-磷酸葡糖酸脱水酶、磷酸葡萄糖异构酶等催化的反应。琥珀酰-腺苷单磷酸(AMP)合酶由purA(GenBank登录号为Z99104)所编码。

此外，也可以通过弱化肌苷向细胞的掺入来增强肌苷产生能力。可以通过阻断与肌苷向细胞的掺入有关的反应来弱化肌苷向细胞的掺入。前述与肌苷向细胞的掺入有关的反应的例子包括由例如核苷透性酶催化的反应。为提高本发明蛋白质中每个蛋白分子的活性，向蛋白的结构基因导入突变以增强蛋白的活性也是可能的。为了向基因导入突变，位点特异性突变(Kramer，W.和Frits，H.J.，Methods in Enzymology，154，350(1987))、重组PCR(PCR Technology，Stockton Press(1989))、DNA特定部分的化学合成、目的基因的羟胺处理、用UV照射或化学试剂如亚硝基胍或亚硝酸处理含有目的基因的微生物菌株等方法均可使用。可以选择其中的蛋白质活性增强的微生物，作为在含有表1(参见如下)所示浓度的8-氮杂腺嘌呤、或6-甲基嘌呤、或2，6-二氨基嘌呤、或6-巯基嘌呤、或8-氮杂鸟嘌呤、或肌苷的基本培养基中生长的菌株。

可以通过增强一个或多个参与嘌呤合成的基因的表达来进一步改良本发明的细菌。这样的基因包括大肠杆菌的pur调节子(Escherichia coli andSalmonella，Second Edition，Editor in Chief：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。已描述了这样的产肌苷的大肠杆菌菌株，其具有编码PRPP酰胺转移酶的突变purF基因，以及编码嘌呤核苷酸生物合成系统中的阻遏物的已灭活purR基因，所述PRPP氨基转移酶由ADP和GMP的反馈抑制所释放(WO9903988)。

III.产生嘌呤核苷的方法

本发明的方法包括产生嘌呤核苷的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、使细菌产生并分泌嘌呤核苷、从培养基中收集嘌呤核苷的步骤。此外，本发明的方法包括产生肌苷的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、使细菌产生并分泌肌苷、从培养基中收集肌苷的步骤。此外，本发明的方法包括产生黄苷的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、使细菌产生并分泌黄苷、从培养基中收集黄苷的步骤。此外，本发明的方法包括产生鸟苷的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、使细菌产生并分泌鸟苷、从培养基中收集鸟苷的步骤。

本发明中，从培养基中培养、收集和纯化嘌呤核苷等可以以与常规发酵方法相似的方式进行，其中嘌呤核苷使用微生物产生。用于产生嘌呤核苷的培养基可以是根据需要含有碳源、氮源、无机离子和其他有机成分的典型培养基。作为碳源，可使用糖类如葡萄糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、果糖、阿拉伯糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解产物；醇类如丙三醇、甘露醇和山梨醇；有机酸如葡萄糖酸、富马酸、柠檬酸和琥珀酸等。

作为氮源，可使用无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、以及磷酸铵；有机氮如大豆水解产物；氨气；氨水等等。适量地作为痕量有机营养物包含维生素如维生素B1、所需物质，例如核酸如腺嘌呤和RNA、或者酵母提取物等也是需要的。除了这些，需要的话可以添加少量的磷酸钙、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

培养优选在有氧条件下进行16至72小时，培养期间的培养温度控制在30至45℃，pH在5和8之间。可以用无机或有机酸性或碱性物质以及氨气调节pH。

培养后，可通过离心或膜过滤从液体培养基去除固体如细胞，然后可以用常规技术如离子交换树脂和沉淀(precipitation)的任何组合从发酵液中回收目标嘌呤核苷。

4.产生嘌呤核苷酸的方法

本发明的方法包括产生嘌呤核苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、磷酸化所需的嘌呤核苷得到与嘌呤核苷对应的嘌呤核苷酸、允许细菌将嘌呤核苷酸分泌到培养基中、和收集嘌呤核苷酸的步骤。此外，本发明的方法包括产生5’-肌苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、磷酸化肌苷得到5’-肌苷酸、使细菌将5’-肌苷酸分泌到培养基中、和收集5’-肌苷酸的步骤。此外，本发明的方法包括产生5’-黄苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、磷酸化黄苷得到5’-黄苷酸、使细菌将5’-黄苷酸分泌到培养基中、和收集5’-黄苷酸的步骤。此外，本发明的方法包括产生5’-鸟苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、磷酸化鸟苷得到5’-鸟苷酸、使细菌将5’-鸟苷酸分泌到培养基中、和收集5’-鸟苷酸的步骤。而且本发明的方法包括产生5’-鸟苷酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明的细菌、磷酸化黄苷得到5’-黄苷酸、使细菌将5’-黄苷酸分泌到培养基中、氨化5’-黄苷酸以产生5’-鸟苷酸、和收集5’-鸟苷酸的步骤。

本发明中，从培养基中培养、收集和纯化肌苷等可以以与常规发酵方法相似的方式进行，其中肌苷用微生物产生。此外，本发明中，磷酸化肌苷、使细菌分泌到培养基中、和收集5’-肌苷酸的步骤可以以与常规发酵方法类似的方式进行，其中嘌呤核苷酸如5’-肌苷酸由嘌呤核苷如肌苷产生。

嘌呤核苷的磷酸化可以用不同的磷酸酶、核苷激酶或核苷磷酸转移酶以酶学方式进行，或者用磷酸化试剂如POCl₃等以化学方式进行。可以使用能够催化焦磷酸盐的磷酰基至核苷的C-5’-位置选择性转移的磷酸酶(Mihara等，Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatasefrom Morganellamorganii.Appl.Environ.Microbiol.，66：2811-2816(2000))，或者利用多聚磷酸(盐)、苯基磷酸(盐)或氨甲酰基磷酸(盐)等作为磷酸供体(WO9637603A1)等的酸性磷酸酶。同样作为磷酸酶的例子，可以使用能够利用对硝基苯基磷酸酯(Mitsugi，K.，等，Agric.Biol.Chem.，28，586-600(1964))、无机磷酸盐(日本专利申请Nos或日本专利申请Laid-Open No.JP42-1186)或乙酰磷酸(acetyl phosphate)(日本专利申请Nos或日本专利申请Laid-Open No.JP61-41555)等作为底物催化磷酰基向核苷的C-2’、3’、或5’位置转移的磷酸酶等等。作为核苷激酶的例子，可以使用来自大肠杆菌的鸟苷/肌苷激酶(Mori，H.等，Cloning of a guanosine-inosine kinase gene ofEscherichia coli and characterization of the purified gene product.J.Bacteriol.177：4921-4926(1995)；WO9108286)等。作为核苷磷酸转移酶的例子，可以使用由Hammer-Jespersen，K.(Nucleoside catabolism，p.203-258.In AMunch-Petesen(ed.)，Metabolism of nucleotides，nucleosides，and nucleobasesin microorganism.1980，Academic Press，New York)所描述的核苷磷酸转移酶等。核苷的化学磷酸化可以用磷酸化试剂如POCl₃(Yoshikawa，K.等，Studiesof phosphorylation.III.Selective phosphorylation of unprotected nucleosides.Bull.Chem.Soc.Jpn.42：3505-3508(1969))等来进行。

5’-黄苷酸的氨化可以用例如来自大肠杆菌的GMP合成酶以酶学方式进行(Fuj io等，High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli andits application for the industrial production of5’guanylic acid.Biosci.Biotech.Biochem.1997，61：840-845；EP0251489B1)。

实施例

以下将参考下述的非限制性实施例更具体地解释本发明。

实施例1.枯草芽孢杆菌ydhL基因的克隆

已经测定了枯草芽孢杆菌枯草亚种168菌株的全部核苷酸序列(Kunst等，Nature390，249-256(1997))。根据所报导的核苷酸序列，合成了引物ydhL_N(SEQ ID No.5)和ydhL_C(SEQ ID NO：6)，用于通过PCR扩增来自枯草芽孢杆菌菌株168的ydhL基因。引物ydhL_N与ydhL基因起始密码子上游489至467bp的序列一致，并具有在其5’-末端导入的限制性酶SalI识别位点。引物ydhL_C与ydhL基因终止密码子下游58至80bp序列互补，并具有在其5’-端导入的限制性酶BglII识别位点。

枯草芽孢杆菌168菌株的染色体DNA用一般方法制备。在“Perkin ElmerGeneAmp PCR System2400”上依照下述条件进行PCR：94℃30秒，61℃45秒，72℃3分钟，以PfuI聚合酶(Fermentas)的方式进行25个循环。用BglI和SalI处理所得的PCR片段，所述PCR片段包含带有其自身启动子的ydhL基因，将处理后的片段插入低拷贝数载体pMW118，该载体之前已用BamHI和SalI酶处理。如此获得质粒pYDHL1。

以标准技术用pYDHL1质粒和所述载体转化大肠杆菌菌株TG1(Amersham Pharmacia Biotech)。在含100μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤(broth)琼脂平板上选择转化体。如此获得大肠杆菌菌株TG1(pYDHL1)和TG1(pMW118)。然后在含分级浓度的抑制剂的M9葡萄糖基本琼脂平板上测定这些菌株在嘌呤碱基类似物存在下的生长能力。用来自生长于基本培养基(添加100μg/ml氨苄青霉素)中的过夜培养物的10⁵至10⁶个细胞点样平板。37℃温育44h后评估生长。

结果列于表1。

表1

注.DAP：2，6-二氨基嘌呤；MP：6-巯基嘌呤；AzaA：8-氮杂腺嘌呤；+：生长良好；-：不生长。生长良好指生长于含嘌呤类似物的培养基上的菌落大小与生长于不含嘌类似物的培养基上的对照菌株的菌落大小没有显著差异。

由表1可以看出，ydhL基因的扩增增强了细菌对2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤、和8-氮杂腺嘌呤的抗性。

也将pYDHL1质粒和pMW118载体转化到大肠杆菌菌株TG1deoDgsk3。大肠杆菌菌株TG1deoDgsk3是具体被构建用于检测对肌苷和鸟苷抗性的亲本菌株。该菌株通过利用噬菌体P1介导的转导来向已知菌株TG1(VKPM B-5837)顺序导入如PCT申请WO9903988所述的deoD突变和Petersen C.(J.Biol.Chem.，274，5348-5356，1999)所述的gsk3突变而获得，所述菌株由于其降解嘌呤的能力而具有对肌苷和鸟苷的抗性。由于deoD突变，菌株TG1deoD gsk3不能降解鸟苷和肌苷(WO9903988)，并且，由于gsk3突变，其对核苷敏感(Petersen C.J.Biol.Chem.，274，5348-5356，1999)。由此获得TG1deoD gsk3(pYDHL1)和TG1deoD gsk3(pMW118)菌株。然后如上述测定了这些菌株在肌苷和鸟苷存在下生长的能力。

结果列于表2。

表2

注.+：生长良好；-：不生长。

由表2可知，ydhL基因过表达赋予对肌苷高水平的抗性和对鸟苷低水平的抗性。因此，可以推测ydhL基因与嘌呤核苷的分泌有关，更具体地，与肌苷的分泌有关。

实施例2.解淀粉芽孢杆菌ydhL基因的克隆

实施例1中显示的数据表明，当被同时导入M9葡萄糖基本琼脂时(表1)，枯草芽孢杆菌ydhL基因(以后称为ydhL_Bs)的过表达赋予细胞对2，6-二氨基嘌呤和6-巯基嘌呤的抗性。基于这个事实，克隆了来自解淀粉芽孢杆菌ydhL_Bs基因的直向同源物(以后称为ydhL_Ba)。用一般方法制备了解淀粉芽孢杆菌菌株BA1(IAM1523)的染色体DNA。用EcoRI酶切割该染色体DNA，与之前已经用相同的酶处理过的pMW118载体连接。所得的DNA用于转化大肠杆菌菌株TG1。在含有400μg/ml2，6-二氨基嘌呤、400μg/ml6-巯基嘌呤和100μg/ml氨苄青霉素的基本琼脂上选择转化体。从转化体分离质粒DNA并分析。由此，发现了含有约1.6kb的最小插入DNA片段的杂交质粒pYDHL2。与ydhL_Bs基因相对比，它不含EcoRI位点。由通用引物对插入的片段进行测序，发现其与ydhL_Bs基因高度同源(超过90％)(图1)。来自解淀粉芽孢杆菌的新基因命名为ydhL基因(此后也称为ydhL_Ba基因)。当导入到TG1和TG1deoD gsk3菌株时，pYDHL2质粒以与pYDHL1质粒同样的方式赋予细胞分别对嘌呤碱基类似物和核苷的抗性。断定pYDHL2质粒事实上包含ydhL_Ba基因。

实施例3.ydhL_Bs和ydhL_Ba基因的扩增对大肠杆菌产肌苷菌株的肌苷产量的影响

分别用pMW18载体，以及YDHL1和pYDHL2质粒转化产肌苷大肠杆菌菌株FADRaddedd(pMWKQ)。在含有100mg/l氨苄青霉素和75mg/l卡那霉素的L-琼脂上选择转化体。如此获得菌株FADRaddedd(pMWKQ，pMW18)，FADRaddedd(pMWKQ，pYDHL1)和FADRaddedd(pMWKQ，pYDHL2)。将这些菌株在分别含100mg/l氨苄青霉素和75mg/l卡那霉素的L-肉汤中、于37℃培养18小时，将0.3ml的所得培养物接种到3ml含100mg/l氨苄青霉素和75mg/l卡那霉素的发酵培养基中，所述发酵培养基置于20x200mm试管中，并用旋转摇床于37℃培养72小时。

发酵培养基的组成(g/l)：

葡萄糖                      40.0

(NH₄)₂SO₄                   16.0

K₂HPO₄                      0.1

MgSO₄·7H₂O                 1.0

FeSO₄·7H₂O                 001

MnSO₄·5H₂O                 0.01

酵母提取物                  8.0

CaCO₃                       30.0

对葡萄糖和硫酸镁分别进行灭菌。CaCO₃于180℃干燥-加热灭菌2小时。pH调至7.0。灭菌后向培养基中加入抗生素。

培养后，用HPLC测定累积于培养基中的肌苷的量。培养基样品(500μl)于15,000rpm离心5分钟，用H₂O稀释上清4倍，并通过HPLC分析。

HPLC分析的条件：

柱子：Luna C18(2)250x3mm，5u(Phenomenex，USA)。缓冲液：2％v/vC₂H₅OH；0.8％v/v三乙胺；0.5％v/v醋酸(冰冷的)；pH4.5。温度：30℃。流速：0.3ml/min。注射体积：5μl。检测：UV250nm。

保留时间(min)：

黄苷                13.7

肌苷                9.6

次黄嘌呤            5.2

鸟苷                11.4

腺苷                28.2

结果列于表3。

表3

 

菌株	OD540	肌苷，g/l
			大肠杆菌FADRaddedd(pMWKQ，pMW118)大肠杆菌FADRaddedd(pMWKQ，pYDHL1)大肠杆菌FADRaddedd(pMWKQ，pYDHL2)	9.08.68.4	1.5±0.22.3±0.22.2±0.2

由表3可见，ydhL_Bs和ydhL_Ba基因的过表达提高了FADRaddedd(pMWKQAp)菌株的肌苷生产率(productivity)。

实施例4.将ydhL_Bs基因克隆至低拷贝数穿梭载体pMWMX1

用BglI和SalI处理包含处于其自身启动子控制之下的ydhL_Bs基因的PCR片段(实施例1得到的)，将其插入到低拷贝数穿梭载体pMWMX1，该载体已预先用BamHI和SalI酶处理。如此得到质粒pYDHL3。pMWMX1载体(图2)是两个低拷贝数质粒：pMW118和pMX30的衍生物。反过来，pMX30质粒(Rabinovich等，Mol.Biol(Moscow)，18，189-196，1984)又是inc18家族广-宿主-范围质粒pSM19035的缺失衍生物(Brantl等，NucleicAcids Res.，18，4783-4790)。pMW118和pMX30质粒均用EcoRI酶切割并连接。由此得到pMWMX1载体。

实施例5.构建含ydhL_Ba基因的低拷贝数穿梭质粒pYDHL3

用EcoRI部分酶切割pYDHL2质粒得到单一片段，并与用相同酶切割的pMX30连接。如此得到含ydhL_Ba基因的穿梭质粒pYDHL4。因此，除了用ydhL_Ba基因代替了pMWMX1载体所包含的ydhL_Bs基因之外，pYDHL4质粒与pYDHL3质粒相同。

实施例6.ydhL_Bs基因或ydhL_Ba基因的扩增对于枯草芽孢杆菌168菌株对嘌呤碱基类似物的抗性的影响

通过标准技术，使用pYDHL3、pYDHL4质粒和pMWMX1载体转化野生型枯草芽孢杆菌168菌株。在含10μg/ml红霉素的L-肉汤琼脂平板上选择转化体。如此得到菌株枯草芽孢杆菌168(pMWMX1)、枯草芽孢杆菌168(pYDHL3)和枯草芽孢杆菌168(pYDHL4)。然后在含分级浓度的嘌呤类似物的M9葡萄糖基本琼脂平板(基本培养基M9，葡萄糖-2％，维生素测定酪蛋白氨基酸(vitamin assay casamino acid)(Difco)-0.1％，色氨酸-100μg/ml)上测定这些菌株在嘌呤碱基类似物存在下的生长能力。用来自过夜培养物的10⁵至10⁶个细胞点样琼脂板，所述培养物培养于不含所述类似物的上述琼脂平板。34℃温育48h后评估生长。

结果列于表4。

表4

注：AzaG-8-氮杂鸟嘌呤；MePur-6-甲基嘌呤；AzaA-8-氮杂腺嘌呤；n.d.-无数据；+：生长良好；-：无生长。生长良好指生长于含嘌呤类似物的培养基上的菌落大小与生长于不含嘌类似物的培养基上对照菌株的菌落大小没有显著差异。

由表4可见，ydhL_Bs或ydhL_Ba基因的扩增增强了细菌对8-氮杂鸟嘌呤、6-甲基嘌呤和8-氮杂腺嘌呤的抗性。

实施例7：ydhL_Bs和ydhL_Ba基因的扩增对枯草芽孢杆菌产肌苷菌株的肌苷产量的影响

用pMWMX1载体、pYDHL3或pYDHL4质粒转化产肌苷枯草芽孢杆菌KMBS16-1菌株。由此得到菌株枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pMWMX1)、枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pYDHL3)和枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pYDHL4)。37℃下，将这些菌株都在含10mg/l红霉素的L-肉汤中培养18小时。将0.3ml的所得培养物接种到3ml的芽孢杆菌发酵培养基中，该发酵培养基含10mg/l红霉素，置于20x200mm试管中，并用旋转摇床于37℃培养72小时。

该发酵培养基的组成(g/l)：

葡萄糖                      80.0

KH₂PO₄                      1.0

MgSO₄                       0.4

FeSO₄·7H₂O                 0.01

MnSO₄·5H₂O                 0.01

Mameno                      1.35的TN(总氮)

(大豆水解产物)

DL-甲硫氨酸                 0.3

NH₄Cl                       32.0

腺嘌呤                      0.1

色氨酸                          0.02

CaCO₃                       50.0

培养后，如上述用HPLC测定积累于培养基中的肌苷的量。该结果列于表5。

表5

 

菌株	OD540	肌苷，g/l
			枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pMWMX1)枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pYDHL3)枯草芽孢杆菌KMBS16-1(pYDHL4)	8.48.28.0	1.4±0.11.6±0.2.1.7±0.2

由表5可见，ydhL_Bs基因或ydhL_Ba基因的扩增均提高了枯草芽孢杆菌KMBS16-1的肌苷生产率。

实施例8.解淀粉芽孢杆菌ydhL基因的调控区的修饰

已知枯草芽孢杆菌ydhL调控区的修饰，即5’-非翻译RNA区的G-盒的修饰，可以增强基因的表达(Mandal，M.和Breaker，R.R.，Nat.Struct.Mol.Biol.，11(1)，29-35(2004))。因此，为了增强ydhL基因的表达水平，使用QuickChange^TM定点突变(Stratagene)向解淀粉芽孢杆菌ydhL基因的调控区(自该基因起点的“-77”位置)导入同样的突变(C取代T)。为达到此目的，基于解淀粉芽孢杆菌ydhL基因调控区的DNA序列设计了两个引物1和2(分别为SEQ ID NO：7和8)。DNA质粒pYDHL2(pMW118-ydhL_BA)用作模板。用前述的引物扩增了整个质粒，并且得到几个含ydhL基因的质粒。用引物3(SEQ ID NO：9)对这些质粒测序，并确定所需的T变为C的取代的存在。新的pMW118-衍生质粒命名为pYDHL5，该质粒包含来自解淀粉芽孢杆菌的带有调控区突变的ydhL基因。用EcoRI限制酶切割pYDHL5质粒使之线性化，并与先前已用相同的限制酶线性化的pMX30连接。这样得到包含ydhL_Ba基因的穿梭质粒pYDHL6，所述ydhL_Ba基因带有增强其表达水平的突变。

实施例9.增强ydhL_Ba基因的表达对解淀粉芽孢杆菌肌苷产生株的肌苷产量的影响

pYDHL6质粒和pMWMX1穿梭载体均用熟知的方法(Spizizen，J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，44，1072-1078(1958))转化到枯草芽孢杆菌168菌株中。所得的菌株枯草芽孢杆菌(pYDHL6)和枯草芽孢杆菌(pMWMX1)在噬菌体E40-介导的转导中用作供体，以将pYDHL6和pMWMX1质粒导入产生肌苷和鸟苷的菌株枯草芽孢杆菌G1136A(AJ1991，VKPM B-8994，ATCC19222)(美国专利3,575,809)。全俄罗斯国家工业微生物保藏中心(All-RussianNational Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(俄罗斯，113545Moscow，1st Dorozhny proezd，1)将菌株枯草芽孢杆菌G1136A重新鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并以登录号(VKPM B-8994)保藏。因此，以后将把该菌株称为解淀粉芽孢杆菌G1136A。噬菌体E40为PBS1样噬菌体(Takanishi，R.，J.Gen.Microbiol.，31，211-217，(1963))，其能够在枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌细胞中繁殖。转导后，获得菌株解淀粉芽孢杆菌G1136A(pMWMX1)和解淀粉芽孢杆菌G1136A(pYDHL6)。

这些菌株均在37℃在含10mg/l红霉素的L-肉汤中培养18小时。然后，将0.3ml的所得培养物接种到3ml的芽孢杆菌发酵培养基中，该发酵培养基含10mg/l红霉素，置于20x200mm试管中，并用旋转摇床于37℃培养72小时。

该发酵培养基的组成：(g/l)

葡萄糖                  80.0

KH₂PO₄                  1.0

MgSO₄                   0.4

FeSO₄·7H₂O             0.01

MnSO₄·5H₂O             0.01

NH₄Cl                   15.0

腺嘌呤                  0.3

总氮(以Mameno形式)      0.8

CaCO₃                   25.0

培养后，如上述通过HPLC测定积累于培养基中的肌苷和鸟苷的量。结果列于表6。

表6

 

菌株	OD540	肌苷，g/l
			解淀粉芽孢杆菌G1136A(pMWMX1)解淀粉芽孢杆菌G1136A(pYDHL6)	16.716.1	1.8±0.13.2±0.1

由表6可见，由于调控突变导致ydhL_Ba基因表达的增强提高了解淀粉芽孢杆菌菌株G1136A的肌苷生产率。

虽然已参考优选实施方案详细描述了本发明，但对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明范围的前提下可作出许多改变并使用等同物。上述每一篇文献全部在此全文并入作为参考。

Claims (6)

1.制备选自由肌苷、黄苷和鸟苷组成的组的嘌呤核苷的方法，包括：

(a)在培养基中培养细菌，其为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，和

(b)允许所述的嘌呤核苷分泌到所述的培养基中，

(c)从所述的培养基收集所述的嘌呤核苷，

其中所述细菌具有产生嘌呤核苷的能力，而且其中所述细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的YdhL蛋白的活性：增加ydhL基因的拷贝数，修饰ydhL基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合，

其中所述ydhL基因是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA。

2.权利要求1的方法，其中所述细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的嘌呤核苷生物合成基因的表达：增加嘌呤核苷生物合成基因的拷贝数，修饰嘌呤核苷生物合成基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合。

3.制备选自由5’-肌苷酸、5’-黄苷酸和5’-鸟苷酸组成的组的嘌呤核苷酸的方法，包括：

(a)在培养基中培养细菌，其为枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，以产生嘌呤核苷，和

(b)磷酸化所述嘌呤核苷以产生嘌呤核苷酸，

(c)允许所述的嘌呤核苷酸分泌到所述的培养基中，

(d)从培养基中收集所述的嘌呤核苷酸，

其中所述细菌具有产生嘌呤核苷的能力，而且其中所述细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的YdhL蛋白的活性：增加ydhL基因的拷贝数，修饰ydhL基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合，

其中所述ydhL基因是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA。

4.权利要求3的方法，其中所述的细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的嘌呤核苷酸生物合成基因的表达：增加嘌呤核苷生物合成基因的拷贝数，修饰嘌呤核苷生物合成基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合。

5.制备5’-鸟苷酸的方法，包括

(a)在培养基中培养枯草芽孢杆菌或大肠杆菌以产生黄苷，

(b)磷酸化黄苷以产生5’-黄苷酸，

(c)氨化5’-黄苷酸以产生5’-鸟苷酸，和

(d)收集5’-鸟苷酸，

其中所述细菌具有产生嘌呤核苷的能力，而且其中所述细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的YdhL蛋白的活性：增加ydhL基因的拷贝数，修饰ydhL基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合，

其中所述ydhL基因是由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的DNA。

6.权利要求5的方法，其中所述的细菌通过选自下组的方法进行修饰而具有增强的黄苷生物合成基因的表达：增加黄苷核苷生物合成基因的拷贝数，修饰黄苷核苷生物合成基因的表达调控序列，和使用强启动子或增强子与增加所述基因的拷贝数或表达的组合。

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