JP2003508405A - ２−アザプリン化合物及びその使用 - Google Patents

２−アザプリン化合物及びその使用

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Abstract

(57)【要約】 オリゴヌクレオチド内の2-アザプリン及び特に2-アザアデニン塩基は、グアニンと特異的塩基対を形成する。この塩基対は、アデニン-チミン同様の安定性を有するが、グアニン-シトシン塩基対よりも不安定である。従って、2-アザアデニン残基をシトシンの代わりにオリゴヌクレオチドへ組入れることは、特に相同な安定性を伴う核酸との複合体のハイブリダイゼーションにつながる。これは、例えばオリゴマーチップ技法のような、あらゆる種類のハイブリダイゼーション技法における様々なオリゴヌクレオチド配列の安定性の改造に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、2-アザプリンを含有する核酸結合化合物、そのような化合物の調製
に有用な化合物、この核酸結合化合物と核酸との結合生成物、該化合物を使用す
る核酸の決定法、及び2-アザプリン化合物のいくつかの用途に関する。 いくつかの2-アザプリン化合物が当該技術分野において公知である。Chemistr
y of Nucleosides and Nucleotides(第2巻、288-297頁及び319頁)に、2-アザプ
リンヌクレオシドの例がいくつか示されている。しかし7-デアザ-2-アザプリン
ヌクレオシドについては記されていない。
【０００２】 Biochimica et Biophysica Acta(520:441-451(1978))には、2-アザアデノシン
-5’-二リン酸及び2-アザイノシン-5’-二リン酸の酵素合成及びそれらのE.coli
ポリヌクレオチドホスホリラーゼを用いるホモポリマーへの重合が明らかにされ
ている。この方法は複雑であり、かつ混合配列を形成することが不可能である。
更にこのホモポリマーの他のポリマーとの2-及び3-本鎖複合体を形成する能力が
報告されている。塩基として2-アザアデノシンのみを含むこれらの化合物は、UV
感受性がありかつ不安定であることが証明されている。
【０００３】 J. Org. Chem.(60:6262-6269(1995))は、2-アザ-2’-デオキシイノシンを含有
するオリゴヌクレオチドの合成並びに生物物理学的及び生物学的特性を明らかに
している。ここでは、環の窒素原子のひとつが特定の光化学的に切断可能な保護
基により修飾された2-アザイノシンヌクレオシドが明らかにされている。しかし
、6266頁の表1に認められるように、IAZは、天然の核酸塩基(nucleobase)間と余
り異ならない。更にわかるように、塩基対IAZ/Gの安定性は、通常の塩基対C/Gよ
りも13°小さく、かつ塩基対A/Tよりも9°小さい。従ってCのIAZによる置換は、
A/T塩基対の安定性を模倣するには適していない。
【０００４】 Liebigs Ann. Chem.(647-651(1990))において、2-アザアデニン及びメチルチ
オイミダゾトリアジンのヌクレオシドに加え、対応するメトキシ化合物が明らか
にされている。リン酸又はホスホロアミダイトは明らかにされていない。更にい
かにして特定の位置に2-アザ-アデノシンを含むオリゴヌクレオチドを調製する
かも明らかにされていない。それらのハイブリダイゼーション挙動は明らかにさ
れていない。更に、2-アザ-2’-デオキシアデノシン三リン酸に関しても明らか
にされていない。
【０００５】 本発明は特に、特に医療分野における、例えば分析物中の核酸の決定において
有用である。核酸は、ヒト体液、食品又は環境中の遺伝子又は微生物の有無を決
定するための有用な分析物であることがわかっている。核酸分析は、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR、米国特許第4,683,202号参照)のような核酸増幅の導入後に、広
範に使用されることがわかった。従って十分量の核酸が各試料から入手可能であ
る。これらの核酸は具体的な目的に応じ、多種多様な技術を用いて、この前処理
された試料から決定することができる。ほとんどのアッセイは、固定されたもし
くは固定可能なプローブ、又は1種以上のレポーター基の結合により標識される
プローブのいずれかの使用を必要としている。レポーター基は、それ自身決定さ
れることが可能であるか、又は該レポーター基を介して決定可能なプローブを形
成するような試薬と反応することができることを特徴としている。従って例えば
レポーター基で標識されたプローブは、プローブ及び決定されるべき核酸を含む
ハイブリッドであり得るので、決定することができる。固定されたプローブの場
合、プローブ及び決定されるべき核酸の間のハイブリッドが、該プローブが結合
されるような固相で決定される。特定のアッセイ形において、特異的配列を有す
る1個の核酸のみならず、異なる配列の多数の核酸も決定することができる。こ
の目的のためには、プローブが、ガラスチップのような平らな表面上のアレイの
小さいスポットに固定される(欧州特許出願第0 476 014号及びTIBTECH、15:465-
469(1997))。
【０００６】 オリゴヌクレオチドアレイを使用する基本的原理は最初に、オリゴヌクレオチ
ドの包括的セットへのハイブリダイゼーション(SBH、ハイブリダイゼーションに
よる配列決定)によりDNA配列を決定する概念が開発された、1980年代後半に提唱
された。
【０００７】 天然の核酸塩基の代わりに、修飾された又は非-天然のヘテロ環式基を含む提
案も多数ある。このような非-天然の基の例は、7-デアザ-dGTPがあり、これはdG
TPの代わりに核酸に導入された際には、配列決定ゲルにおいてバンドのコンプレ
ッション現象を低下する(欧州特許第0 476 014号)。
【０００８】 核酸の決定は、一般に天然の塩基A及びT並びにC及びGの間の塩基対形成の可能
性は異なる安定性を有するという問題により損なわれる。これは、水素結合を形
成する塩基の異なる可能性に起因する。従ってdA-dT-塩基対は2個の水素橋を有
する一方で、dG-dC-塩基対は3個の水素橋を有する。このことは、GC含量によっ
て左右されるハイブリッドの異なる融解温度(Tm)を生じる。GC含量が高くなると
、Tmが高くなる。しかし通常の核酸分析において、すべてのアッセイについて同
様のハイブリダイゼーション条件をある位置で適用するために、同じ長さの核酸
のTmを均一にするか、又は核酸もしくは結合領域の長さとは無関係であることさ
えもが望ましい。これは特に、アレイを使用するアッセイに必要であり、その理
由はこのようなアレイ上では各プローブのハイブリダイゼーション条件は同一で
なければならないからである。
【０００９】 ある溶液に、低いハイブリダイゼーション温度を使用した。このような条件下
では、低い塩基配列の相補性を有する多くの核酸はプローブと結合するであろう
。これは類似した配列間の識別をもたらさない非特異的結合と称されている。
【００１０】 別の提案は、ハイブリダイゼーション混合液中での化学試薬、例えばテトラメ
チルアンモニウムクロリド(TMAC)などの使用に関する。この試薬は、dG-dC及びd
A-dT塩基対間の安定性の差異を小さくするが、この作用は短いオリゴヌクレオチ
ドでは不十分である。更にTMACのような塩の添加は、アッセイの最適化を複雑に
するので歓迎されない。 別の提案は、ひとつのアッセイにおける各々異なる(固定された)プローブの様
々な濃度での使用に関する。これは、チップ表面で不可能でないとしても、技術
的に困難であることがわかった。
【００１１】 更なる選択肢として、Hoheisel(Nucleic Acids Res.、24:430-432(1996))は、
デオキシリボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチド内のリボヌクレオチ
ドの置換、及びその逆を、DNA安定性の改造に使用した。 現時点でわかっているすべての提案は、何らかの欠点を有している。従って依
然、TmがそれらのGC含量に応じて余り変動しないようなプローブを提供すること
が必要である。
【００１２】 本発明の主題は、骨格を有する核酸結合化合物であり、この骨格は、天然の核
酸塩基との塩基対形成が可能であるヘテロ環式基に結合しており、該ヘテロ環式
基の少なくともひとつは、少なくとも1個の別の該ヘテロ環式基が一般式Iの基で
あることを特徴とする天然の核酸塩基のひとつである：
【００１３】
【化１７】
【００１４】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され： −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、-シアノ、
及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハ
ロゲン、-SH、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-OH、-NR5R6、-COR 11 、-NH-CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択さ
れた1個以上の部分により置換されている。)。
【００１５】 例として、以下に、2’-デオキシグアノシン(dG)と特に安定な塩基対を形成す
るが、2’-デオキシチミジン(dT)、2’-デオキシシチジン(dC)及び2’-デオキシ
アデノシン(dA)とははるかに安定していない塩基対を形成するような、2-アザ-2
’-デオキシアデノシン(2,z2Ad)の例を示すことにより、本発明の化合物の有利
な特性の説明を示す。この新規塩基対(z2Ad-dG)は、通常のdA-dT塩基対と同様の
安定性である。
【００１６】 Tmを測定するために、核酸結合化合物において、決定されるべき核酸のGと相
補的な鎖の1個以上のCを、z2Adと置き換える。その後このオリゴヌクレオチドは
、z2Adと相対するdGを含む標的配列とは特異的に結合するが、dA-dT塩基対の安
定性は伴い及びdG-dC塩基対の安定性は伴わない。この経過の一般的原理は、z2A d に限定されず、その理由は6-員環において同じ特徴を示す塩基は、それらが2-
アザプリン構造を含むために、前述の説明を基に同じ特性を持つと予想されるか
らである。特に、塩基対形成に参加している部分からヘテロ環式基の部分が遠ざ
かると、そのオリゴマーは化学構造の修飾、例えばヘテロ環のこの部分への基の
結合などについてより寛容(tolerant)となる。下記のように、(本発明の)修飾さ
れた塩基を参照し、一般式Iのヘテロ環式基を参照とすることができる。
【００１７】 式Iの破線は、X、Y及びZの定義に応じて、二重結合に局在にいくつかの可能性
があることを示している。Zの具体的な定義の選択により、ZとYの間又はXとYの
間のいずれかに二重結合が必要となることは当業者には明らかであろう。更にX
とY及びYとZの間に各々二重結合が存在しないことも明らかである。 ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素基を意味する。最も好ましいハ
ロゲン基は-Cl及び-Brである。
【００１８】 アルキル基は、線状、分枝した又は環状のいずれかの配置の炭素原子1〜10個
を含むアルキル基から選択されることが好ましい。実際のアルキル基の長さは、
アルキル基が位置する特定の位置の立体状況に応じて決まるであろう。立体的制
約がある場合、アルキル基は概して小さく、メチル及びエチル基が最も好ましい
。アルキル、アルケニル及びアルキニル基は全て、置換又は未置換のいずれかで
あることができる。前述のようなヘテロ原子による置換は、水溶液への溶解度の
増大を助けるであろう。
【００１９】 アルケニル基は、2〜10個の炭素原子を含むアルケニル基から選択されること
が好ましい。選択については、アルキル基と同様の考察が適用される。これらも
、線状、分枝した又は環状であることができる。最も好ましいアルケニル基はエ
チレン基である。 アルキニル基は、2〜10個の炭素原子を有することが好ましい。同じく、これ
らの炭素原子も、線状、分枝した又は環状の様式で配置することができる。更に
、アルキニル基には1個よりも多い三重結合が存在することができる。最も好ま
しいアルキニル基は3-プロパルギル基である。
【００２０】 アルコキシ基は、1〜6個の炭素原子を有することが好ましく、かつ酸素原子を
介してその残余部分に結合されている。アルコキシ基に含まれるアルキル基につ
いて、アルキル基と同じ考察が適用される。最も好ましいアルコキシ基はメトキ
シ基である。 アリールオキシ基は、6〜20個の炭素原子を有することが好ましい。これらの
炭素原子は、1個以上の芳香環に、かつ更には芳香部分に結合した側鎖(例えばア
ルキル鎖)に含まれることができる。好ましいアリールオキシ基は、フェノキシ
及びベンゾキシ基である。
【００２１】 好ましいR14のO-保護基は、アロイル基、アシル基及びシリル基である。これ
らの中で最も好ましいのは、ベンゾイル基である。 好ましいシリル基は、トリエチルシリルのような、トリアルキルシリル基であ
る。
【００２２】 本願明細書に記した式の定義の原子はいずれも、特定の同位体に限定されるも
のではない。従ってリン原子(P)は、通常の31Pもしくは放射性32Pのいずれか又
はそれらの混合物を意味することができる。同じことが水素(H/D/T)、炭素(C)、
ヨウ素(iodide)(Cl、Br、I)及び窒素(N)にも当てはまる。
【００２３】 R2、R3及びR4の定義の好ましい基-NR5R6は、-NH2基である。この場合、このよ
うな式Iの基を含む化合物の化学合成の間、このアミノ基の水素原子の1個は、適
当なアミノ保護基により保護されていることは明らかである。このような保護基
は一般に当業者に公知である。 同じことがR1の定義にも当てはまる。
【００２４】 化学合成の間、-OH、-SH及び-NH2の基のいずれか(レポーター基の中のこれら
の基を含む)は、適当な保護基により保護されなければならない。更に化学合成
の間、これらの化合物は便宜上固相に結合されるであろう。このような場合、先
に示されたこれらの置換基の定義が状況に応じて選択されるであろう。 保護基は、望ましくない経路の反応から官能基を保護するために、官能性部分
(例えば、水素に代わって、ヒドロキシル基の酸素へ)に結合した化学基である。
保護基は更に、生成された分子の生物学的活性、ここでは核酸結合化合物の核酸
への結合を破壊することなく取除くことができるという事実により定義される。
適当な保護基は当業者に公知である。特に好ましい保護基は、例えばヌクレオチ
ド又はオリゴヌクレオチドの5’-末端のヒドロキシル基については、トリチル基
、例えばジメトキシトリチルから選択される。
【００２５】 式Iの環外のアミノ基の好ましい保護基は、アシル基であり、最も好ましくは
ベンゾイル基(Bz)、フェノキシアセチル基もしくはアセチル基又はホルミル基、
及びN,N-ジアルキルホルムアミジン基であり、優先的にはジメチル-、ジイソブ
チル-、及びジ-n-ブチルホルムアミジン基である。
【００２６】 本発明の核酸結合化合物は、好ましくは長さ100サブユニット未満を有し、よ
り好ましくは10〜30サブユニットを含む。核酸結合化合物として有効であるため
には、この置換基は、結合される核酸のヘテロ環式基への水素結合が可能なよう
に、好ましくはワトソンクリック塩基対形成及び／又は図1に示されたように選
択されなければならない。置換基がこのような好ましい水素結合ができないよう
な化合物は、核酸結合化合物の調製のための中間体として有用であることができ
る。好ましい本発明の核酸結合化合物は、化学的に合成されるものである。
【００２７】 核酸結合化合物が、核酸を決定するためのプローブとして使用されるか、又は
いずれか他の化合物もしくは核酸の同定が意図されているならば、いずれかの置
換基がレポーター基を含むように選択される。多くのレポーター基は、十分に核
酸化合物を標識するのに有用であるように結合され得るが、限定数のレポーター
基のみが単独のサブユニットに結合することが好ましく、その結果核酸の認識、
核酸への親和性及び溶解度は影響されず、従って該プローブはハイブリダイゼー
ションアッセイにおいて有用ではない。非常に好ましい場合において、各核酸結
合化合物中には、わずかに1〜4個の、最も好ましくは1又は2個の、もしくは最も
好ましくはわずかに1個のレポーター基が存在するであろう。プローブに結合し
た1個よりも多いレポーター基を必要とする核酸決定の様式がある。このような
様式の例は、国際公開公報第92/02638号に開示されている。この場合、レポータ
ー基のひとつは、蛍光発光基であり、他方が蛍光消光基であろう。
【００２８】 レポーター基は一般に、核酸結合化合物に加え、液体、すなわち試料中の他の
ものから識別可能なそれに結合したいずれかの核酸を生成する基である(レポー
ター基に結合している核酸結合化合物は、標識された核酸結合化合物、標識され
たプローブ又は単にプローブとも称される)。この区別は、レポーター基を、直
接的又は間接的に検出可能基の群から、又は固定されたもしくは固定可能な基の
群のいずれかから選択することにより達成することができる。直接的に検出可能
な基は、蛍光化合物、例えばフルオレセイン並びにヘキサクロロフルオレセイン
及びヘキサフルオロフルオレセインなどのその誘導体、ローダミン、ソラレンス
クアライン(psoralenes squaraines)、ポルフィリン、蛍光粒子、アクリジンエ
ステル及びルミノールのような生物発光化合物、又はCy-5のようなシアニン色素
がある。このような化合物の例は、欧州特許第0 680 969号に開示されている。
更に、TEMPOのようなスピン標識、電気化学的に検出可能な基、フェロセン、ビ
オロゲン、重金属キレート剤及び電気化学発光標識物、例えばルテニウムビスピ
リジル錯体、並びにナフトキノン、ダブシルのような消光色素(quencherdye)、
並びに例えばFe及びCuのようなヌクレアーゼ活性複合体が、有用な検出可能な基
である。間接的に検出可能な基は、直接的又は間接的に標識された別の部分によ
り認識され得る基である。このような間接的に検出可能な基の例は、例えばジゴ
キシゲニン又はビオチンのようなハプテンがある。例えばジゴキシゲニンは、ジ
ゴキシゲニンに対する抗体により認識される。これらの抗体は、直接標識される
か、又は(抗ジゴキシゲニン)抗体に対する標識された抗体により認識されるかす
る。ジゴキシゲニンの認識を基にした様式は、欧州特許第0 324 474号に開示さ
れている。ビオチンは、アビジン及びストレプトアビジンのような類似化合物並
びに他のビオチン結合化合物により認識することができる。同じくこれらの化合
物は、直接的又は間接的に標識することができる。
【００２９】 これらのレポーター基は、更に試料中の他のヌクレオチド配列により妨害され
ないようなヌクレオチド配列であることができる。従ってこの配列は、相補的配
列を含むヌクレオチドにより特異的に認識され得る。このヌクレオチド配列は、
直接的又は間接的に標識されるか、又は固定可能であるかもしくは固定され得る
。 レポーター基は更に固相であることができる。核酸結合化合物の固相への結合
は、検出可能な基について先に指摘したように、直接的又は間接的のいずれかで
あることができる。
【００３０】 直接的標識は、核酸結合化合物の固相上の反応基への共有結合により、すなわ
ち好ましくリンカーを介して達成することができる。間接的標識は、先に検出可
能な基について明らかにしたものと同様に行うことができる。好ましくは、間接
的結合は、例えばハプテン-抗体、ビタミン-受容体及び核酸-相補的核酸の群か
ら選択されたもののように、生体特異的相互作用により、非-共有的である。同
じく、これらの相互作用及びそれらの核酸アッセイにおける用途は当業者に公知
である。
【００３１】 本発明のプローブの固定に有用な固相は、好ましくはポリスチレン、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ガラス及びTiO2の群から選択される。このような固相の
様式は、器具使用の必要性及びアッセイ様式に応じて選択することができる。例
えば、固相はビーズ又は容器の形状を想定することができる。
【００３２】 用語「レポーター基」及び具体的実施態様は、好ましくは使用が意図された部
分(実際の固相又は発蛍光部分)が、レポーター基としての結合部位に接続するよ
うに使用されるリンカーを含む。このリンカーは、核酸結合化合物が固相による
大きい妨害を伴うことなく決定される核酸配列に結合することができるような柔
軟性を提供するであろう。例えば独国特許第3943522号に開示された、連続する
エチレンオキシユニットを基にした例のような、リンカー、特に疎水性でないも
のは、当業者に公知である。
【００３３】 前記説明から、該プローブの骨格が厳密な意味でオリゴヌクレオチドでなくと
も、本発明は依然機能することが明らかになる。昨年、オリゴヌクレオチドと同
様の特性を有するが、それらの骨格とは異なるような核(酸)結合化合物が明らか
にされた。その骨格は一般に、主として線状の形で、同じ又は異なるサブユニッ
トに結合した、塩基を生じるような核酸結合化合物の一部と見なされている。最
も一般的な骨格は、天然の核酸の糖リン酸骨格(リボヌクレオシドサブユニット(
RNA)、デオキシリボヌクレオシドサブユニット(DNA)又はペプチド核酸サブユニ
ット(PNA))のいずれかである。従って、好ましい実施態様において、骨格は、糖
部分及びリン酸部分を含む。更に好ましい実施態様において、糖の立体配置は、
α-D-、β-D-、α-L-及びβ-L-立体配置からなる群より選択され、最も好ましく
は該化合物は少なくとも1個の2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル部分
又は1個のβ-D-リボフラノシル部分を含む。 好ましくは、Dは、本発明の化合物の糖部分のグリコシドC-1である。好ましい
式VIの化合物は、式中R1はNH2で、WはNで、ZはNで、YはCで、XはNで、かつR14は
Hであるものである。
【００３４】 更に好ましい核酸結合化合物は、式Iの基を少なくとも1個含み、式中、R1は基
-NR20R21であり、これは2-アザ-アデノシン又はその誘導体のいずれかである。2
-アザ-アデニンの誘導体として、本発明の核酸結合化合物に結合した核酸のG及
びdGへ2-アザ-アデニンと同じ原子を介して水素結合を提供する化合物が、ここ
で考察されている。最も好ましい式Iの基は、N9原子を介して骨格に結合した2-
アザ-アデニンである。これらの基は、天然の核酸塩基間で明確に区別され、加
えてA-T塩基対と非常によく似た安定性も提供する。
【００３５】 この核酸結合化合物は、決定されるべき核酸又は塩基対形成により結合される
ことが意図されているような核酸と実質的に相補的である核酸塩基配列を含むよ
うに構築される。これらの核酸は通常天然の核酸塩基Ade、Cyt、Gua及びThy又は
Uraのいずれかを少なくとも1個含むので、本発明の核酸結合化合物もこれら4種
の塩基のいずれかを含むであろう。しかし本発明において、核酸結合化合物に位
置する少なくとも1個のヘテロ環式基は、式Iのヘテロ環式塩基による置換のため
に、決定される核酸のGと相対して位置する。核酸結合化合物が該核酸にハイブ
リダイズすることが意図されているような配列中に1個よりも多いGが存在するな
らば、好ましくは核酸結合化合物中のCと同数が、意図されたTmを提供するのに
必要なものとして式Iのヘテロ環式基が選択される。
【００３６】 しかし、本発明の核酸結合化合物は、式Iの基が例えばc7Gd、z8c7Gd及びz8Gd
のような、特にGの誘導体に対して位置しているような、核酸結合化合物の相対
する位置に位置した他のヘテロ環式基にも対する、同じ塩基対形成の選択性を示
す。これら列記したものにおいて、c7は7-位に炭素原子があることを意味し、並
びにz8はこれと同じく8-位に窒素原子があることを意味している。更に本発明に
より認識され得るGの誘導体は、検出可能な基の結合により標識された核酸塩基G
、並びにisoGdである。
【００３７】 この核酸は、式Iのヘテロ環式基それ自身を含むこともできる。核酸結合化合
物上の対応する塩基は、この基と塩基対形成するように選択されることが好まし
く、例えばdGである。この核酸は、例えば7-デアザ-dGTPのように、天然及び／
又は非-天然の塩基を含むことができる。従って用語「核酸」は、本発明におい
て非常に広い意味を持つであろう。混合された塩基配列を有する核酸が好ましい
。
【００３８】 本発明の核酸結合化合物は、好ましくは逆平行様式で核酸に結合するであろう
。しかし核酸及び／又は核(酸)結合化合物の核酸塩基を慎重に選択することによ
り、この結合は強制的に平行様式とすることができる。iso-C及びiso-Gを含む核
酸の平行ハイブリダイゼーションは、例えば欧州特許第0624 161号に開示されて
いる。
【００３９】 好ましい核酸結合化合物は、骨格が一般式IIの1個以上の部分を含むもの：
【００４０】
【化１８】
【００４１】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 Lは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-からなる群より選択され、 Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-S-レポーター基、-SeH、-(C1-C10)-アルコ
キシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10 )-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25から
なる群より選択され、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であるこ
とができ、 Vは、オキシ、スルファンジイル又は-NR22-からなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロ
ゲン、-アジド、-O-アリル、-O-アルキニル、及び-NH2からなる群より選択され
、 R22は、独立して、-H及び-(C1-C10)-アルキルの群から選択され、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27及び
レポーター基からなる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 cは、2〜6の整数であり、 dは、0〜6の整数であり、及び Bは、式Iの部分であり、 ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換である
ことができる。) 並びにそれらのいずれかの塩である。 式Iで定義された好ましい基の定義は、特に記さない限りは、式II及びそれ以降
の式に適用される。
【００４２】 従って好ましい本発明の主題は、前述の核酸結合化合物であり、ここでその骨
格は、一般式IIIの部分を1個以上含む：
【００４３】
【化１９】
【００４４】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 Mは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
O-からなる群より選択され、 R22は、-H、-(C1-C10)-アルキル、保護基及びレポーター基から選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C10)-アルキルメルカ
プト及び-NH2からなる群より選択され、 R15は、-H、-(C1-C6)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル
、-(C2-C10)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、固相及
び式IVの基からなる群より選択され、
【００４５】
【化２０】
【００４６】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-ア
ルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R 24 及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され
、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、 Bは、式Iの部分への結合価である。)、 並びにそれらの塩である。 定義及び優先について、式I及びIIの置換基について述べられた詳細は、特に記
さない限りは、式IIIに適用される。
【００４７】 式IIの化合物において、R14は水素が好ましい。好ましいLの定義はオキシであ
る。好ましいUの定義は、-OH及び-O-レポーター基である。好ましいVの定義はオ
キシである。好ましいcの定義は2〜4の整数であり、かつdのそれは0〜2の整数で
ある。 式IIの化合物は特に、本発明のヘテロ環部分を該核酸結合化合物の一体化され
た部分(好ましくは一方の末端ではない)として含むのに適している。
【００４８】 基-NR23R24は、ジアルキルアミノ基からなる群より選択されることが好ましい
。この基が5-又は6-員のヘテロ環と一緒である場合、ピロリジニル又はピペリジ
ニルの定義が好ましいと仮定する。 好ましいアリール基は、未置換又は1個以上のアミノ、-アミノアルキル、-O-(
C1-C10)-アルキル、-S-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C10)-アルキル、スルホニル、
スルフェニル、スルフィニル、ニトロ及びニトロソで置換されたかのいずれかの
、フェニル又はナフチル部分である。最も好ましいアリール基はフェニル基であ
る。好ましいアリールアルキル基はベンジル基である。好ましいアルキルアミノ
基はエチルアミノ基である。好ましい-COO(C1-C4)アルキル基は、アルキル部分(
メチル又はエチルエステル)に1又は2個の炭素原子を含む。
【００４９】 式Iの基が該化合物の3’-末端で、例えばヌクレオチドのようなサブユニット(
submit)に結合しているような核酸結合化合物は、より長い化合物のための出発
化合物及び／又は末端-標識したプローブのいずれかとして有用である。この化
合物の群は、プローブの末端位置が化学基の結合の観点から最も寛容があるので
、特に好ましい。
【００５０】 好ましい本発明の主題は、式Vの骨格部分を含む前述の核酸結合化合物である
：
【００５１】
【化２１】
【００５２】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M’は、オキシ、スルファネジル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
O-からなる群より選択され、 R22は、-H、保護基、レポーター基、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選
択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-S-(C1-C10)-アルキルメル
カプト及び-NH2からなる群より選択され、 R16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-アルキニル
、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基又
は式IVの化合物からなる群より選択され、
【００５３】
【化２２】
【００５４】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、ここで-NR23R24
はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができる。)、 並びにそれらの塩のいずれかである。
【００５５】 これらの化合物は、5’-末端が標識されたプローブとして使用することができ
る化合物である。これらの置換基に関する定義について、特に記さない限り、前
述の定義が適用される。 非常に好ましい化合物は、MがOであり、R16がHであり、かつR14は水素及びヒ
ドロキシル基からなる群より選択されるような式Vの化合物である。
【００５６】 核酸結合化合物の骨格は、該化合物が相補配列を有する核酸に結合することが
できるように、塩基対形成したヘテロ環を生じる機能を有する。好ましくは、天
然の塩基中の相補性の程度は、結合に作用する領域の塩基の伸展において、結合
した核酸領域における同じ長さの伸展と比較して、70％〜100％までの範囲であ
ろう。そのため各配列におけるサブユニットの欠失及び挿入は、この計算におい
て、次の合致する塩基までのギャップとして数えられ、その結果ギャップが含む
のと同数の塩基分だけ相補性が低下するであろう。 好ましい骨格は、糖-リン酸部分を含む。これらから、骨格を含むデオキシ糖
がより好ましい。
【００５７】 本発明の部分を含む、相補配列の核酸との塩基対形成が可能な部分を生じる骨
格の各部分は、サブユニットと称される。異なる種類のサブユニットが混合した
骨格を有する化合物が公知である。最近、新たな種類の非天然核酸結合化合物が
説明された。これらは、サブユニット間に少なくとも1個のペプチド結合を含む
ので、「ペプチド核酸(PNA)」と称される(国際公開公報第92/20702号)。本発明
の核酸結合化合物は、あらゆる長さを有することができる。しかし、化学合成の
便宜上、例えばヌクレオシドのような、長さ100個未満の、より好ましくは10〜3
0個のサブユニットの化合物が好ましい。
【００５８】 本発明の核酸結合化合物は、公知の方法に類似の方法で調製することができる
。 特に短い化合物に適している第一の選択肢において、化合物は、それらの少な
くとも1個は本発明の修飾された塩基を含むような、サブユニットの化学的に活
性化された誘導体(モノマー)を用い、化学合成により生成される(多行程オリゴ
マー化)。好ましくは、オリゴマー化反応の実際の反応行程には関与しないこれ
らのモノマー中の反応基は、適当な保護基を用いて保護されている。このような
保護基は、当該技術分野において周知であり、かつ本発明の基が使用される場合
の保護及び合成戦略に関する大きい変化はないであろう。
【００５９】 活性化されたサブユニットは、固相表面上又はサブユニットで構成されたオリ
ゴマー中における別のサブユニットの所定の置換基との化学反応に特に適した置
換基を含むサブユニットである。このような特に適したサブユニットは、好まし
くはホスホロアミダイト、ホスノネート(メチルホスホネートなど)、ホスホトリ
エステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、ボラノホスフェート(Chem.
Commun.、1517-1518(1999)参照)、リン酸メチルエステル、ホスホン酸フェニル
及びリン酸エチルエステルからなる群より選択される。 所定の置換基は、-NH2、-SH及び-OHの群から選択されることが好ましい。
【００６０】 本発明の更なる主題は、請求項1から13のいずれか1項の化合物の活性化された
サブユニットを用いる化学合成法であり、ここで該サブユニットは少なくとも1
個の式Iの基を含む。この化学合成に関するいくつかの方法が公知であり、例え
ばNarangら、Meth. Enzymol.、68:90-99(1979)のホスホトリエステル法；Brown
ら、Meth. Enzymol.、68:109-151(1979)のホスホジエステル法；Beaucageら、Te
trahedron Lett、22:1859-1862(1981)のジエチルホスホロアミダイト法；並びに
、米国特許第4,458,066号及びMethods in Molecular Biology、S. Agrawal編集
、第20巻、Humana Press社、Totowa、NJ、1993年に記された固相支持体法がある
。最も好ましい化学合成法は、ホスホロアミダイト法を使用する。特に好ましい
方法は、一般式VIIの1個以上の化合物の活性化されたサブユニットを使用する。
この方法は、非常に簡便であるという利点があり、かつ例えば式Iの基を含むホ
スホロアミダイトのような必要な試薬は容易に含むことが可能である。
【００６１】 更なる本発明の主題は、従って一般式VIIの化合物である：
【００６２】
【化２３】
【００６３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファネジル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキ
ル、又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、 Bは、式Iの基である。）。
【００６４】 式VIIの好ましい化合物は、式Iの基が2-アザ-ヒポキサンチンでないものであ
る。好ましい実施態様において、式VIIの中の式Iの基は、少なくとも1個のレポ
ーター基を含む。最も好ましくは、式Iの基は正確に1個のレポーター基を含む。 最も好ましいこのような化合物において、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6
は保護基である。
【００６５】 本発明の更なる主題は、一般式IXの化合物である：
【００６６】
【化２４】
【００６７】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルの群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、並びに
Bは、式Iの基であり、
【００６８】
【化２５】
【００６９】 (式中、Wは、N及びCR2からなる群のX、Y及びZから独立して選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個
以上の部分により置換されていて、 但し、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6は保護基である。）。)。 これらの化合物は、化学合成において式VIIのものと同様に使用することができ
る。
【００７０】 本発明の更なる主題は、一般式Xの化合物である：
【００７１】
【化２６】
【００７２】 (式中、M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C1 0 )-アルキル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並び
に-NR22-(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 Bは、式Iの基であり、
【００７３】
【化２７】
【００７４】 (式中、Wは、N及びCR2からなる群のX、Y及びZから独立して選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個
以上の部分により置換されている。)。）。 これらの化合物は、化学合成においても有用である。
【００７５】 長いオリゴマー及び天然の骨格を基にしたものにより適している別の選択肢に
おいて、オリゴマーは酵素により生成される。この場合、出発オリゴマーは、一
リン酸又は修飾された一リン酸が該オリゴマーの末端に結合されるように、ポリ
メラーゼ並びに三リン酸又は修飾された三リン酸と反応され、その結果該オリゴ
マーは伸張する。同じくこの方法に関して、当業者は、ニック−トランスレーシ
ョン法、又は単純プライマー伸張法のようないくつかの可能性のある様式を認め
るであろう(J. Sambrook、E.F. Fritsch、T. Maniatis、Molecular Cloning - A
laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)。 例えば、z2AdのDNA配列への組入れは、例えばz2Ad-5’-三リン酸(11)のポリメ
ラーゼ触媒式組入れのような、通常の方法を用いて行うことができる。
【００７６】 従って本発明の更なる主題は、プライマーの伸張のための鋳型として核酸を使
用する三リン酸サブユニットのプライマーとの反応を含む、本発明の核酸結合化
合物の酵素合成法であり、ここで三リン酸サブユニットは、式Iのヘテロ環式基
を含む。好ましくは、この三リン酸サブユニットは、式VIを有する：
【００７７】
【化２８】
【００７８】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-O-保護基、-S-保護基、-NH-保護基、
-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C6)-アルキルメ
ルカプト及び-NH2からなる群より選択され、 R15及びR16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-ア
ルキニル、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル
、-(C3-C19)-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、
保護基又は式IVの化合物からなる群より選択され、
【００７９】
【化２９】
【００８０】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、二リン酸及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、及び Bは、式Iの部分であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができ、かつここでR15及びR16の少なくとも1個は、下記の条件で式IVの基
ではない： R1が-NH2でありかつ下記のいずれかであるならば、 −W及びX及びY及びZは、Nであり、又は −W及びX及びZはNであり、かつYはCR4であり、又は −W及びY及びZはNであり、かつXはCR3であるか； MR16、MR15及びMR14は、各々-OHではない。)。
【００８１】 最も好ましいこれらの化合物では、-MR16は三リン酸基であり、かつ-MR15はOH
である。最も好ましい化合物はR14が-OHであるものである。 これらの化合物は特に、本発明のヘテロ環式部分が核酸結合化合物の末端位置
には含まれないような化合物である。 好ましい化合物は、Mがオキシ又はスルファンジイルであり、R16が式IVの化合
物(式中、Uは-OHであり、Tはオキソ又はチオキソであり、R29は-OR30であり、か
つR30は二リン酸基である。)及びそれらの塩である。
【００８２】 最も好ましい化合物は、式VIIIである：
【００８３】
【化３０】
【００８４】 (式中、PPPは、三リン酸基であり R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
、 Bは、式Iの基であり、 但し、Bが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。)。
【００８５】 別の好ましい実施態様において、式VIIの化合物の式Iの基は、 −WはNであり、ZはNであり、YはNであり及びXはCR3であるか、又は −WはNであり、ZはCであり、YはNであり、及びXはCR3であるか、又は −WはNであり、ZはNであり、YはNであり、及びXはNであるかのいずれかの式Iの
基からなる群より選択される。
【００８６】 本発明の更なる主題は、プライマー伸張のために核酸鋳型を使用する三リン酸
サブユニットのプライマーとの反応を含む、本発明の核酸結合化合物の酵素合成
法であり、ここで三リン酸サブユニットは、式Iのヘテロ環式基を含む。 より好ましくは、この方法は、三リン酸サブユニットとして、前記式VIIIの化
合物を使用する。
【００８７】 一般式VI、VII及びVIIIの化合物は、容易に入手できる化合物から調製するこ
とができる。第一の実施態様において、式VIの化合物は、2-位置(プリン番号)の
原子は、この位置に炭素原子を有する対応する化合物(好ましくは式中、MR15はO
Hであり、M’R16はOHでありかつR1はNH2である)を選択し、これを2-クロロアセ
トアルデヒドと反応し、ピリミジン環をアルカリ条件を用いて切断し、かつ再度
硝酸ナトリウムを用いて閉環し、その後アルデヒドにより導入されたイミダゾー
ル環を加水分解することにより調製されるという事実により特徴づけられる。こ
の反応は、2-位の炭素原子の窒素原子による置換を生じる。
【００８８】 その後この化合物を、試薬と反応し、ホスホロアミダイト又はリン酸のような
保護基及び／又は活性基を、オリゴマー化において使用されることが意図された
ヒドロキシル基と結合することができる。ジメトキシトリチル基のような保護基
の結合法は、一般に当業者に公知である。更に、一-、二-及び三リン酸基の結合
も当該技術分野において公知である。
【００８９】 好ましい実施態様において、式VIIの化合物(式中、R1は保護されたアミノ基で
あり、M’R31はO-保護基であり、及びMPR18NR32R17はO-ホスホロアミダイト基で
ある。)、式VIの化合物(式中、M’R16及びMR15は各々OHであり、及びR1はNH2で
ある。)の調製法は、好ましくは保護基ジアルキルアミノメチリデンによりアミ
ノ基を保護する条件に晒し、次に試薬と反応し、5’-ヒドロキシル基を保護し、
かつその後活性化されたリン酸と反応し、ホスホロアミダイトを生成する。得ら
れる式VIIの化合物は、直接的2-アザ-プリンを導入する化学合成において使用す
ることができる。R1の保護基は、この化学合成の間に除去される。 別の2-アザ-2'-デオキシアデノシンの合成については、N. Yamaji、M. Katoの
論文を参照のこと(Chemtry Lett.、311-314(1975))。
【００９０】 前述の方法により、原則として本発明の部分を含むわずかに1個のモノマーを
導入することが可能であるが、場合によってはその1個を超えることができる。
結合領域の全てのCが置換されるならば、Tmの最大低下が生じるであろう。これ
は、Tmの細かい整調を可能にする。当然、決定されるべき核酸との塩基対形成が
意図されないいずれかの領域においてCが残留することがある。
【００９１】 式IからVIIIの化合物(式中、置換基R1、R2、R3及びR4のいずれかは、 ハロゲ
ン、特にCl、シアノ又はSR19からなる群から選択される。)が、化合物(これらの
置換基は、-NR5R6及び-OR13からなる群より選択され、好ましく-NR5R6である。)
の合成の中間生成物として有用である。この中間生成物は、置換反応により最終
生成物に転換することができる。
【００９２】 本発明の更なる主題は、下記の工程を含む核酸の決定法である： −該核酸を含むと思われる試料を提供する工程； −該核酸の一部又は全てと本質的に相補的であるような、請求項1記載の核酸結
合化合物を提供する工程； −該試料を、該核酸結合化合物と、該核酸結合化合物が該核酸に結合する条件下
で接触する工程； −該核酸の存在の尺度として、該核酸及び該核酸結合化合物から形成された結合
生成物を決定する工程。
【００９３】 ハイブリダイゼーションにより核酸を決定する方法は、例えばSambrookらの論
文(前掲)から当該技術分野において一般に公知である。これらは、本発明のプロ
ーブの使用を容易に適合することができる。。好ましくは、この核酸結合化合物
は、溶液中で核酸に結合され、その理由はこの反応は固相上よりも迅速であるか
らである。当業者には、アッセイの構築前及びその全体の開始前に、決定される
べき核酸及びプローブのハイブリッドのTmをいかにして決定するかは明らかであ
る。一旦決定されると、当業者には同じ核酸分析物を使用する各アッセイにおい
て同様の条件を選択しなければならないことが明らかなはずである。
【００９４】 このような決定は、決定されるべき核酸を含むと思われる試料を提供すること
により始まる。例えば核酸が含まれるか、さもなければ決定される可能性はない
であろう細胞を溶解することにより、この試料に適当な形状の核酸をもたらす工
程を施す。更に試料を提供する工程はいずれも、決定に影響を及ぼすであろう当
初の試料の成分から決定されるべき核酸を精製する工程を含むことができる。こ
のような成分は、例えばRNaseのような、核酸が配置される場合に細胞から遊離
し、核酸を消化又は分解するであろう酵素であってよい。更には、核酸の増幅に
影響を及ぼすであろう当初の試料の核酸成分から除去することも好ましい。
【００９５】 本発明の核酸結合化合物を用いる核酸を決定する方法についてはいくつかの可
能性がある。第一の群において、核酸結合化合物は、検出可能なプローブとして
使用される。この場合、核酸結合化合物は、検出可能なレポーター基を含むであ
ろう。該核酸結合化合物及び核酸から形成されたあらゆるハイブリッドは、その
後この検出可能なレポーター基により決定される。この群のアッセイは、更に2
群に分けることができ、一方の群は均一系アッセイでありかつ他方は不均一系ア
ッセイである。不均一系アッセイにおいて、好ましくはハイブリッド(結合生成
物)は、固相に結合した場合に決定されるであろう。この実施態様は、いずれか
過剰なプローブ及び他の成分を、該ハイブリッドから容易に除去することができ
、その結果決定をより容易にすることができるという利点を有する。形成された
ハイブリッドは、共有、非共有、特異的又は非特異的のいずれかにより固相に捕
獲され得る。当業者が公知のいくつかの実施態様がある。
【００９６】 いわゆる均一系アッセイにおいて、形成されたハイブリッドは、固相には結合
しないが、溶液中において直接的又は間接的のいずれかで決定されるであろう。
このようなアッセイの好ましい例は、PCT/US第91/05571号に開示されており、こ
れは本願明細書に参照として組入れられている。本発明の核酸結合化合物はこの
アッセイにおいて特にプローブとして有用である。そこに開示されたアッセイは
これらのアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブの融解温度の細か
い整調を必要とするので、決定されるべき核酸又はそれらの増幅産物及びプロー
ブにより形成されたハイブリッドの融解温度の変調を使用する本発明が、特に有
用である。これは、Tmは、n-merオリゴヌクレオチドの代わりに(n-x)-merオリゴ
ヌクレオチドの選択により低下される場合、選択性が保存されるので、特に有用
である。
【００９７】 従って、更なる本発明の主題は、下記の工程を含む、試料中の核酸の有無、又
は量を決定する方法である： −プライマーとして、該核酸の第一の結合配列に本質的に相補的である第一のプ
ライマー、及びこの核酸の相補体の結合配列と本質的に相補的である第二のプラ
イマー、並びに核酸又は該プライマーの結合配列間のそれらの相補体と相補的で
あるプローブを提供し、かつ該プローブは少なくとも2種の異なるレポーター基
により異なるサブユニットで標識されるような工程； −試料を、該プライマー及び該プローブに、該プライマーの伸張に好ましい条件
下で晒し、かつ該レポーター基を該プローブを分解することにより互いに分離す
る工程、及び −少なくとも1種の該レポーター基により、プローブの分解の程度を決定する工
程、 ここで、該プライマー及び／又はプローブの少なくとも1種は、前述の核酸結
合化合物である。好ましくは、プライマー及びプローブの融解点は、それらのTm
が類似するように選択されるが、プローブのTmの方がプライマーのそれよりも高
い。
【００９８】 別の実施態様において、本発明の核酸結合化合物は、固相へのいずれかの核酸
の結合のために、固定可能であるか又は固定されているプローブのように使用す
ることができる。これらの化合物を固定する方法は、先に記されている。アッセ
イにおいて、化合物が試料に接触する前に又は固相への試料の接触時に化合物を
固定するか、又は試料の固相への接触後でさえものいずれかが可能である。これ
らの各場合において、決定されるべき核酸は、固相に結合され、かつ好ましくは
決定されない試料のいずれかの置換基は、この固相から洗浄除去される一方で、
該化合物及び核酸は結合し続けるであろう。その後、固相に結合したハイブリッ
ドは、例えば前述の検出可能な標識されたプローブの使用によるか、又は例えば
ハイブリッドと内部キレート可能な色素との接触及び固相における変化の測定に
よるようなハイブリッドの直接決定によるなどの、公知の方法により決定される
。
【００９９】 別の実施態様において、固定されたプローブが、核酸の単離又は精製のために
使用される。 別の好ましい実施態様は、固相に結合しかつ検出可能なレポーター基により標
識された両方の核酸結合化合物を使用する。この場合の標識は、好ましくは、決
定されるべき核酸が該プローブに結合された場合に変化を生じるであろう検出可
能な特性の基である。再度これらの化合物も、当該技術分野において公知である
。
【０１００】 当業者は、核酸結合化合物が結合することが意図された核酸の配列がわかって
いる場合には、核酸結合化合物の配列を設計することができるであろう。ほとん
ど全ての場合において、この核酸は、4種の天然の核酸塩基を含む配列を有する
であろう。この場合、特定の核酸ストレッチに結合した場合、核酸のC、A及びT
が、各々、G、T及びAに塩基対形成することが可能な位置に位置するような全て
の塩基を選択することが好ましい。しかし、これらの塩基は、核酸の言及した塩
基と塩基形成する同等の塩基に置き換えることができる。ここで核酸においてG
と塩基対形成することが可能な位置の塩基は、核酸結合化合物においてIの群に
より1回以上の置き換えられるであろう。本発明において概説したように、Iの基
は他の部分とも塩基対形成することができ、例えば逆平行(通常)様式から平行(
非天然)方向へ結合の配向を強制することができる。
【０１０１】 本発明の更なる主題は、特にその塩基がGのみからなるものではないような核
酸の結合のための、シトシンの置換基として核酸結合化合物中の2-アザプリンの
使用である。 本発明の更なる主題は、プローブの、核酸のGで塩基対形成するプローブの位
置での核酸とのハイブリダイゼーション反応における2-アザプリンの使用である
。
【０１０２】 本発明の更なる主題は、本発明の少なくとも1種の核酸結合化合物及び核酸の
結合生成物であり、この核酸結合化合物及び核酸は、平行又は逆平行方向で塩基
対形成することにより互いに結合される。この結合生成物は、核酸1分子及び核
酸結合化合物1分子を含むことができ、これは二重鎖を形成するか、もしくは結
合生成物は、3本の鎖を含み、従って三重鎖となることができる。この三重鎖は
、核酸結合化合物2分子及び核酸1本鎖、もしくは1個の核酸結合化合物及び2個の
核酸分子のいずれかを含むことができる。どのような種類の三重鎖が形成される
かは、核酸結合化合物及び核酸の濃度及び相補性に左右される。
【０１０３】 本発明は、異なる配列を有する多くのプローブについて類似したTmを選択する
可能性を提供する。従って、本発明の具体的主題は、異なる配列の核酸を同時に
単離又は決定する方法である。 第一の実施態様において、本方法は、いわゆる核酸の単離又は決定の複合法で
ある。この実施態様において、本発明で適合できるTmを有する核酸のひとつの配
列(例えば、HCV、HIV及びHBVのような様々なウイルス由来の核酸)と相補的な配
列を含む各プローブ(1個以上のプローブは式Iの基を有する)は、該核酸を含むと
思われる試料と接触される。様式に応じて、様々な核酸を、まとめて又は個別の
いずれかで、プローブにより形成されたハイブリッドにより決定することができ
る。
【０１０４】 第二の実施態様は、プローブのアレイを基にしている。特に、本発明の主題は
、下記の工程を含む、試料中の各々特定の配列を含む核酸の有無を決定する方法
である： −該試料を、その表面に各々該核酸の該特定の配列のひとつに相補的配列を含む
核酸結合化合物が固定された固相と接触する工程； −該固相上で、特定の配列伴う核酸及び相補的配列を含む核酸結合化合物を含む
ハイブリッドの形成を決定する工程； ここで少なくとも1種の該核酸結合化合物は、骨格を含む化合物であり、該骨
格は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能な結合したヘテロ環式基を有し、該ヘ
テロ環式基の少なくとも1個は、該ヘテロ環式基の他の少なくとも1種は一般式I
の基であることを特徴とする天然の核酸塩基のひとつであることを特徴とする。
【０１０５】 この種の方法はいずれも、例えば様々な細菌種のパネルについて、核酸の有無
について試料を同時に試験する場合に有用である。この方法においては、ひとつ
の種を互いにバッチ様(batchwise)処理後に試験することができるのみではなく
、同時に様々な核酸に関する配列情報を受けることも可能である。この型の方法
は、概して当該技術分野において公知である。しかし本発明は、本発明の核酸結
合化合物が、融解温度を、異なる配列及び／又は長さの核酸結合化合物について
非常に類似するように調節することができるので、このようなアッセイにおいて
特に有用であることがわかった。当業者は、各核酸結合化合物が類似した融解温
度を有するようにするためには、これらの様々な化合物の全てが本発明に従い修
飾される必要はないが、例えば同じ固相上の他の化合物の融解温度よりも非常に
高い融解温度を有することにより、他方のようには挙動しないような該化合物の
みを修飾することは明らかである。本発明に従い置換された各Cにより、Tmは、3
〜6℃、好ましくは4〜5℃低下することがある。この点で、当業者は、現在公知
のチップ技術と比較して、様々な核酸の結合に使用される特定の配列の選択に関
して、はるかに大きい柔軟性を有するであろう。例えば今までは決定されるべき
核酸のこのような領域の高G-C含量は、これらの領域が、これらの領域に相補的
なプローブを基にしたこのようなアッセイの標的領域として有用であることを妨
げていた。本発明に従うと、例え決定されるべき核酸に高度に特異的であるよう
なこのような領域であっても、このようなアッセイを使用することができる。
【０１０６】 アレイ技術を使用するアッセイは、一般に当業者に公知であり、例えば欧州特
許出願第0 476 014号に開示されている。これらの固相は、好ましくは平板担体
である。純粋な表面により分割されたそれらの表面上において、各アレイが異な
る配列のプローブに結合しているようなアレイは、核酸の特異的な特定の配列に
対して示された。実際のアッセイの必要性に応じて、このプローブの配列は、該
決定されるべき核酸に含まれた特定の配列のひとつ(又はそれ以上)に本質的に相
補的である。このアッセイ時に、各核酸は、それが結合し得る表面上のプローブ
を検出するであろう。固相上の各アレイ中でのハイブリッド形成の決定は、この
特異的アレイ中の特性の変化を基に特定の配列を含む核酸の有無を決定すること
ができる。好ましくはこれらの変化の評価は、コンピュータプログラムの助けを
借りることができ、これにより特定の配列が存在するようなアレイがいずれであ
るかがわかる。ひとつのチップは、2個から数千個の、又は数百万個でさえもの
アレイを含むことができ、各々は、独自であり得る特異的配列を有する核酸結合
化合物に結合している。しかし、単に余り特異的でなく、従って様々な配列と結
合する核酸結合化合物を使用することにより、もしくは、異なる核酸上に存在す
る配列に対する核酸結合化合物の配列を選択することにより、各々共通の配列を
有する様々な核酸の基の存在を決定することさえも可能である。
【０１０７】 第二のわずかに異なる方法において、このようなアレイは、いわゆる「ハイブ
リダイゼーションによる配列決定」に従い、核酸の配列を決定するために使用す
ることができる。この様式において、試料は、同一配列のほとんどの核酸を含む
ことが好ましいであろう。これは、それらが含まれる混合液からの配列の単離に
より、もしくはそれらのin-vitro又はin-vivo増幅における濃縮により、達成す
ることができる。固相に結合された核酸結合化合物の配列は、それらが全部で核
酸中の決定されるべき配列を扱う配列を含むように選択されるであろう。この配
列において、各核酸結合化合物の配列は、1個以上の塩基により重複するであろ
う。この方法の決定工程において、これらの部分配列のどれに該核酸が結合し、
配列が決定されるべき核酸に含まれる部分配列に対して相補的である場合、どれ
が生じる(理想的)かが検出されるであろう。好ましくは、このアッセイの結果の
評価は、コンピュータで行われる。従ってコンピュータは、決定されるべき配列
に明らかに含まれる部分配列から決定され、その一連においてこれらは核酸全体
に配置されなければならない。特にこの種のアッセイにおいて、この方法は表面
に固定された多数の核酸結合化合物を必要とし、これは常に高いG-C含量により
生じる問題を考慮することができないので、本発明は非常に助けとなる。本発明
において、従って、同時に低い及び高いG-C含量の配列を有する核酸であっても
配列決定が可能である。
【０１０８】 当業者には、本願明細書に記した化合物はいずれも、ある程度は互変異性体及
び塩として存在することができることは明らかであろう。これらの互変異性体及
び塩、好ましくはアルカリ塩、最も好ましくはナトリウム塩は、本発明の式及び
主題の定義内である。 本発明は、下記の実施例によりより詳細に説明される：
【０１０９】 (実施例)概略 モノマー：フラッシュクロマトグラフィー(FC)：シリカゲル60(Merck、ダルム
シュタット、独国)上、0.5barで。FC及びTLCのための溶媒システム：CH2Cl2−Me
OH 85:15 (A)、EtOAc−MeOH 3:1 (B)、CH2Cl2−MeOH 80:20 (C)、CH2Cl2−HOAc
−MeOH 17:1:3 (D)、CH2Cl2−MeOH 9:1 (E)、CH2Cl2−アセトン 85:15 (F)。試
料は、UltroRac IIフラクションコレクター(LKB Instruments、スウェーデン)に
より収集した。融点：Buchi SMP-20装置(Buchi、スイス)。UVスペクトル：U-320
0分光光度計(日立、日本)。NMRスペクトル：AC-250及びAMX-500分光光度計(Bruk
er、独国)；δ値を、内部標準Me4Si又は外部標準H3PO4について相対化した。蛍
光スペクトルは、F-4500蛍光光度計において、H2O中で記録した(日立、日本)。
微量分析は、Mikroanalytisches Laboratorium Beller (ゲッティンゲン、独国)
で行った。
【０１１０】 オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、標準のプロトコールに従い、AB
I 392 DNA合成装置(Appied Biosystems、独国)により、「トリチルオフ(trityl-
off)」モードを用い合成したが、但し未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドは「
トリチルオン(trityl-on)」モードを用い合成した。修飾したホスホロアミダイ
トのカップリング収量は、一般に平均95％(トリチル伝導度のモニタリング(trit
yl conductivity monitoring))である。脱トリチル化し修飾したオリゴマーは、
Dionex Nucleopac PA-100 HPLCカラム(4 x 250mm、P/N 043010、Dionex GmbH、I
dstein、独国)上で、以下の勾配を用い、イオン交換クロマトグラフィー精製し
た：0.01M NaOH(Y)中の5％ 0.01M NaOH/1.5M水性LiCl(X)で5分；5〜30％のＸ中
のYで25分；30〜5％のＸ中のYで10分；5％ のX中のYで5分。イオン交換HPLC装置
：L-4250 UV/VIS検出器、L-6250 Intelligentポンプ及びD-2500インテグレータ
ー(Merck-Hitachi、独国)。トリチル化した未修飾のオリゴヌクレオチドは、下
記の装置及び手段を用い、RP-18 HPLCで精製した：250 x 4mm RP-18カラム(Merc
k、独国)；655A可変波長UVモニター及びD-2000 Chromato-Integrator (Merck-Hi
tachi、ダルムシュタット、独国)を伴う655 A-12液体クロマトグラフィーからな
る、Merck-Hitachi HPLC装置；0.1M (Et3NH)OAc (pH7.0)/MeCN 95:5(U)及びMeCN
(V)の勾配；勾配I：0〜50％のU中Vで0〜50分、流量1mL/分；勾配II：0〜20％の
U中Vで0〜20分；20〜40％のU中Vで20〜40分、流量1mL/分。脱トリチル化を、精
製したオリゴマーを、CH2Cl2(1mL)を溶媒とする2.5％ジクロロ酢酸溶液で5分間
処理することにより行った。Et3Nで中和した後、蒸発乾固し、その後、MeOHと共
沸(co-evaporation)し、このオリゴマーを前述の装置を用いRP-18 HPLCで再精製
した。勾配：0〜20％のU中Vで0〜30分、20％のU中Vで30〜35分、20〜0％のU中V
で35〜40分、0％のU中Vで40〜45分。引き続き全てのオリゴヌクレオチドの脱塩
を、RP-19 HPLCカラム(4 x 100mm)上で前述の装置を使用し行った。吸着用溶媒
：H2O、脱着用溶媒：MeOH-H2O 3:2。全般的流量：1mL/分。オリゴヌクレオチド
のMALDI-TOF質量スペクトルは、自作の装置において、UVレーザー光337nmを3秒
間照射し測定した。
【０１１１】 オリゴマーの酵素による加水分解は、Helv. Chim. Acta、81:1139-1155 (1998
)に記されたように、しかし流量0.6 mL/分を用いて行った。成分の定量は、ピー
ク面積を基に行い、これを、ヌクレオシドの吸光係数で除算した(ε260値：dA 1
5400、dC 7300、dG 11400、dT 8800、z2Ad 8200)。オリゴヌクレオチドの酵素に
よる加水分解に使用したヘビ毒ホスホジエステラーゼ(EC 3.1.15.1、Crotallus
durissus)及びアルカリホスファターゼ(EC 3.1.3.1、E. coli)は、Roche Diagno
stics GmbHから得た。
【０１１２】 融解曲線及び熱力学の測定：吸光度対温度のプロフィールを、Cary熱電コント
ローラーを装備したCary 1又は1E分光光度計(Varian、オーストラリア)で測定し
た。Tm値は、Pt-100レジスターにより参照セルにおいて測定し、かつ熱力学デー
タ(ΔH°、ΔS°、ΔG°298)は、MeltWin 3.0プログラムにより計算した。円偏
光二色性(CD)スペクトルは、1cmキュベット中で Jasco600 (Jasco、日本)分光偏
光計上、恒温槽(Lauda RCS-6)中で測定した。
【０１１３】実施例１ 3-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-3H-イミダゾ[2,1-i]プリン(1
,N6-エテノ-2’-デオキシアデノシン、5) 2’-デオキシアデノシン一水和物(1) (5.0g, 20mmol)を、1M酢酸ナトリウム緩
衝水溶液(pH4.5〜5.0、110mL)に、40〜50℃で加熱溶解した。この溶液に、クロ
ロアセトアルデヒド(50％水溶液、7.7mol/L、25mL)を添加し、かつ反応混合液を
室温で70時間攪拌した。黄色溶液を、蒸発乾固し、残査をMeOHに溶解し、かつ濾
過し、無機塩を除去した。一緒にした濾液をMeOHで洗浄した後、洗浄液を40〜50
℃で減圧濃縮した。残査を、FC (シリカゲル60H、カラム：20 x 6cm)にかけた。
CH2Cl2−MeOH (85:15)で溶離し、大きい画分を生じ、これを溶媒蒸発し、かつ引
き続きMeOH-EtOAcで再結晶し、化合物5(3.86g、70％)を、無色の結晶として単離
した。M.p. 138〜141℃。TLC (シリカゲル、EtOAc-MeOH、3:1)：Rf 0.4。UV (Me
OH)：λmax 275 (7300), 265 (7600), 258 (6600), 229nm (35700)。1H-NMR ([D 6 ]DMSO)δ2.39 (m, 1H, Hα-C(2'))；2.70 (m, 1H, Hβ-C(2'))；3.57 (t, 1H,
Ha-C(5’))；3.67 (m, 1H, Hb-C(5’))；3.88 (m, 1H, H-C(4’))；4.43 (m, 1H
, H-C(3’))；4.99 (t, 1H, 3J(H,H) = 5.2Hz, 5’-OH)；5.38 (d, 1H, 3J(H, H
), = 3.8Hz, 3’-OH)；6.47 (pt, 1H, 3J(H, H), =6.2Hz, H-C(1'))；7.55 (s,
1H, H-C(11))；8.07 (s, 1H, H-C(10)；8.53 (s, 1H, H-C(2))；9.29 (s, 1H, H
-C(8))。
【０１１４】実施例２ 1-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-5-アミノ-4-(イミダゾール-2
”-イル)-イミダゾール(6) 化合物5 (3.85g, 14mmol)を、1N NaOH水溶液 (60mL)で室温で一晩処理した。
反応混合液を、2N HCl水溶液を添加し、pH7に調節し、かつシロップ状となるま
で濃縮した。これを無水MeOHに溶解し、かつ沈殿したNaClを濾過し、MeOHで洗浄
した。濾液及び洗浄液を一緒にし、かつ蒸発した。残査を、FC(シリカゲル60H、
カラム：20 x 6cm)にかけた。CH2Cl2−MeOH (C)で溶離し、大きいゾーンを生じ
、これより無色の泡状の化合物6(2.70g, 73％)を得、これを更に精製することな
く次反応に用いた。分析用試料は、MeOH−EtOAcから結晶化し、無色の球状晶を
得た；m.p. 91〜93℃(分解)。TLC(シリカゲル、CH2Cl2−HOAc−MeOH, 17:1:3)：
Rf 0.22。UV (MeOH)：λmax 271nm(12800)。1H-NMR ([D6]DMSO)δ2.21 (m, 1H,
Hα-C(2’))；2.47 (m, 1H, Hβ-C(2’))；3.57 (m, 2H, H2-C(5'))；3.84 (m,
1H, H-C(4'))；4.36 (m, 1H, H-C(3’))；6.00 (pt, 1H, 3J(H, H) =6.5Hz, H-C
(1’))；6.60 (br. s, NH2)；7.13 (s, 2H, H-C(4) + H-C(5))；7.55 (s, 1H, H
-C(2))；8.16 (s, NH)。
【０１１５】実施例３ 3(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-1H-ジイミダゾ[1,2-c:4’5’-
e] [1,2,3]-トリアジン(1,N6-エンテノ-2-アザ-2'-デオキシアデノシン、7) 80％HOAc水溶液を溶媒とする化合物6(4.50g, 17mmol)溶液を、氷浴中で、硝酸
ナトリウム(1.17g, 17mmol)により1時間処理した。この反応混合液を蒸発し、シ
ロップ状とした。これをH2Oに溶解し、繰り返し蒸発し、HOAcを除去した。残査
を、FC(シリカゲル60H、カラム、20 x 6cm)にかけた。CH2Cl2−MeOH (85:15)で
溶離し、蒸発し化合物7(2.50g, 53％)を得た。M.p. 151〜152℃(decomp.)。TLC(
シリカゲル、CH2Cl2−MeOH、4:1)：Rf 0.5。UV (MeOH)：λmax 282 (3100), 268
(3200), 238nm (37900)。1H-NMR ([D6]DMSO)δ2.54 (m, 1H, Hα-C(2'))；2.85
(m, 1H, Hβ-C(2'))；3.97 (m, 2H, H2-C(5'))；4.00 (m, 1H, H-C(4'))；4.50
(m, 1H, H-C(3'))；4.96 (t, 1H, 3J(H, H)= 5.4Hz, 5’-OH)；5.41 (d, 1H, 3 J(H,H)= 4.3 Hz, 3’-OH)；6.69 (pt, 1H, 3J(H, H) = 6.3 Hz, H-C(1’))；7.8
5 (d, 1H, 3J(H,H)= 1.1 Hz, H-C(11))；8.75 (d, 1H, 3J(H,H)= 1.1Hz, H-C(10
))；8.95 (s, 1H, H-C(8))。C11H12N6O3(276.25)分析についての計算値：C 47.8
3、H 4.38、N 30.42；実測値：C 47.71、H 4.32、N 30.32。
【０１１６】実施例４ 4-アミノ-7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-イミダゾ[4,5-d
]-[1,2,3]-トリアジン(2-アザ-2'-デオキシアデノシン、2) 化合物7(0.56g、2mmol)を、40〜50℃に暖めながら、1M酢酸ナトリウム緩衝水
溶液(pH4.0〜4.5、120mL)中に溶解した。この溶液に、N-ブロモスクシンイミド(
2.8g, 16mmol)を添加し、かつこの反応混合液を室温で一晩攪拌した。反応混合
液を蒸発し、かつDowex 1x8イオン交換カラム(3 x 12cm、OH-型)にかけた。H2O(
250mL)で溶離し、無色針状晶化合物2(0.19g、38％)を得、これは185℃以上で分
解した。この反応生成物は全ての点で真の試料と同じであった。
【０１１７】実施例５ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-イミダゾ-[4,5-d][1,2,3]
-トリアジン-4-オン(2-アザ-2’-デオキシイノシン、3) 化合物2 (19mg、0.076 mmol)を、H2Oに溶解し、アデノシン脱アミノ酵素(2μg
、ウシ小腸、グリセロールに溶解)を添加した。この反応混合液を、室温で18時
間、2種が完全に消失するまで(UVモニタリング)攪拌し、その後SpeedVac濃縮装
置において蒸発乾固した。UV (H2O)：λmax 247 (5500)、290nm (6200)。1H-NMR
(D2O)：2.49 (m, 1H, Hα-C(2))；2.75 (m, 1H, Hβ-C(2’)；3.41, 3.50 (2m,
2H, H2-C(5'))；4.03 (m, 1H, H-C(4’))；4.51 (m, 1H, H-C(3’))；6.43 (pt
, 1H, 3J(H, H) = 3.2 Hz, H-C(1’))；8.31 (s, 1H, H-C(8))。
【０１１８】実施例６ 4-(ベンゾイルアミノ)-7- (2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-
イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(8) 化合物2(125mg, 0.5mmol)を、無水ピリジンと2回共沸した。残査を、無水ピリ
ジン中に懸濁し、かつ塩化トリメチルシリル(0.5mL, 4mmol)で処理した。数分間
攪拌した後、透明な溶液が生じた。この反応混合液を室温で2時間攪拌した。次
に塩化ベンゾイル(0.25mL, 2mmol)を添加し、かつ連続して更に2時間攪拌した。
この反応混合液を氷浴中で冷却し、かつH2O (1mL)を添加した。10分後、反応混
合液を、濃NH3水溶液(0.8mL)で処理し、更に30分間放置した。次にこの混合液を
蒸発乾固し、H2Oで処理し、かつEtOAc (3 x 20mL)で抽出した。一緒にした抽出
液を乾燥し(Na2SO4)、かつシリカゲルカラム(3 x 15cm)にかけた。溶離を、CH2C
l2 (150mL)、その後CH2Cl2−MeOH (9: 1)で行った。ヌクレオシド-含有画分を蒸
発乾固し、かつ化合物8を、MeOH-H2Oから結晶化し、無色針状晶を得た(135mg, 7
6％)。M.p. 208〜210℃ (分解＞170℃)。TLC (シリカゲル、CH2Cl2−MeOH 9:1)
：Rf 0.31。UV：(水中10％ MeOH)：λmax 233 (15600), 276nm (16400)。1H-NMR
([D6] DMSO)：δ 2.97 (2m, 2H, H2-C(2’))；3.69 (m, 2H, H2-C(5'))；4.00
(m, 1H, H-C(4'))；4.57 (m, 1H, H-C(3'))；5.07 (t, 1H, 3J(H, H) =4.8Hz, 5
’-OH)；5.49 (d, 1Ｈ, 3J(H, H) =4.0Hz, 3’-OH)；6.72 (t, 1H, 3J(H, H) =6
.5Ｈz, H-C(1’))；7.61-7.78 (m,4H, 芳香族-H), 8.16 (d, 2H, 芳香族-H)；9.
09 (s, 1H, H-C(8))；11.84 (s, 1H, N-H)。C16H16N6O4 (356.3)分析についての
計算値：C 52.93、H 4.41、N 23.38；実測値：C 52.68、H 4.39、N 23.07。
【０１１９】実施例７ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジメチルアミノ)メチリ
デン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(9a) MeOH (5mL)を溶媒とする化合物2 (63mg, 0.25mmol)の攪拌している懸濁液に、
N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(120mg, 0.5mmol)を添加した。攪
拌を室温で2時間継続した。この反応混合液を蒸発乾固し、残査をシリカゲル上
に吸着した。シリカゲルカラム(3 x 10cm)上でCH2Cl2 (100mL)、それに続くCH2C
l2−MeOH (9:1)によるフラッシュクロマトグラフィーは、無色針状晶を生じた(M
eOH−H2O, 65 mg, 85％)。M.p. 173〜175℃。TLC (シリカゲル、CH2Cl2−MeOH,
9:1)：Rf 0.28。UV：(水中10％ MeOH)：λmax 234 (13250), 319nm (29500)。1H
-NMR ([D6] DMSO)：δ2.84 (2m, 2H, H-C(2’))；3.17, 3.25 (2s, 2H, N-CH3);
3.60 (m, 2H, H2-C(5’))；3.92 (m, 1H, H-C(4'))；4.47 (m, 1H, H-C(3'))；
5.05 (t, 1H, 3J(H, H) =4.9Hz, 5'-OH)；5.39 (d, 1H, 3J(H, H) = 4.0Hz, 3'-
OH)；6.55 (t, 1H, 3J(H, H) = 6.6Hz, H-C(1’))；8.79 (s, 1H, N=CH)；9.08
(s, 1H, H-C(8))。C12H17N7O3 (307.3)分析についての計算値：C 46.90、H 5.58
、N 31.90；実測値：C 46.55、H 5.68、N 31.66。
【０１２０】実施例８ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジ-イソブチルアミノ)
メチリデン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d] [1,2,3]-トリアジン(9b) 化合物9aについて記したように、しかしN,N-ジ-イソブチルホルムアミドジメ
チルアセタールを使用し行った。無色の結晶(72％)。M.p. 138〜140℃。TLC(シ
リカゲル、CH2Cl2-MeOH, 9:1)：Rf 0.40。UV (水中10％ MeOH)：λmax 236 (101
00), 325nm (25850)。1H-NMR ([D6]DMSO)：δ0.88, 0.94 (2d, 12 H, CH3)；1.9
5, 2.20 (2m, 2H, CH)；2.80 (2m, 2H, H2-C(2'))；3.30-3.74 (m, 6H, H2-C(5
’)及び2 CH2)；4.00 (m, 1H, H-C(4'))；4.45 (m, 1H, H-C(3'))；5.03 (t, 1H
, 3J(H, H) =4.9Hz, 5'-OH)；5.37 (d, 1H, 3J(H, H) =4.0Hz, 3'-OH)；6.54 (t
, 1H, 3J(H, H) =6.4Hz, H-C(1’))；8.78 (s, 1H, N=CH)；9.10 (s, 1H, H-C(8
))。C18H29N7O3・1/2H2O(400.5)分析についての計算値：C 53.99、H 7.55、N 24
.28；実測値：C 53.65、H 7.62、N 24.11。
【０１２１】実施例９ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジ-n-ブチルアミノ)メ
チリデン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(9c) 化合物9aについて記したように、しかしN,N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチ
ルアセタールを使用し行った。無色の針状晶(75％)。M.p. 107〜109℃。TLC(シ
リカゲル、CH2Cl2-MeOH, 9:1)：Rf 0.42。UV (水中10％ MeOH)：λmax 235 (102
00), 325nm (25700)。1H-NMR ([D6]DMSO)：δ0.93 (t, 6H, CH3), 1.33, 1.64,
3.70 (3m, 12H, -CH2-)；2.45, 2.80 (2m, 2H, H2-C(2'))；3.60 (m, 2H, H2-C(
5'))；3.92 (m, 1H, H-C(4'))；4.48 (m, 1H, H C(3'))；5.04 (t, 1H, 3J(H, H
) =5.8Hz, 5'-OH)；5.39 (d, 1H, 3J(H, H) =4.0Hz, 3'-OH)；6.55 (pt, 1H, 3J
(H, H) =6.3Hz, H-C(1'))；8.78 (s, 1H, N=CH)；9.08 (s, 1H, H-C(8))。C18H2 9 N7O3 (391.5)分析についての計算値：C 55.23、H 7.47、N 25.05；実測値：C 5
5.36、H 7.66、N 24.97。
【０１２２】実施例10 7-[2-デオキシ-5-0- (4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル) -β-D-エリスロ-
ペンタフラノシル]-4-{[(ジ-n-ブチルアミノ)メチリデン]アミノ}-7H-イミダゾ[
4,5-d] [1,2,3]-トリアジン(10a) 化合物9c (390mg, 1mmol)を、ピリジンと2回共沸し、かつ油状の残査を、無水
ピリジン(6mL)に溶解した。次に、4,4-ジメトキシトリフェニル-メチルクロリド
(450mg, 1.3mmol)を添加し、かつこの反応混合液を室温で2時間攪拌した。その
時点で、MeOH (0.2mL)を添加し、かつ15分間攪拌を継続した。反応混合液を、15
mLの5％ NaHCO3水溶液に注ぎ込み、かつこれをCH2Cl2 (各々30mL)で2回抽出した
。一緒にした抽出液を、Na2SO4上で乾燥し、蒸発し、かつ残査をシリカゲルに吸
収した。これを、シリカゲル 60H -カラム(4 x 14cm)に乗せ、CH2Cl2−アセトン
勾配(0→25％アセトン、総容量600mL)でクロマトグラフィーを行った。このヌク
レオシド-含有画分を一緒にし、かつ蒸発し、化合物10aを固形泡状物として得た
(560mg, 81％)。TLC：(シリカゲル、CH2Cl2-アセトン, 85:15)：Rf 0.15。1H-NM
R ([D6]DMSO)：0.93 (t, 6H, CH3)；1.34, 1.63, 3.75 (3m, 12H, -CH2-)；2.95
(2m, 2H, H-C(2'))；3.51 (m, 2H, H2-C(5'))；3.63, 3.69 (2s, 6H, OCH3)；4
.01 (m, 1H, H-C(4'))；4.59 (m, 1H, H-C(3'))；5.45 (d, 1H, 3J(H, H) =4.1H
z, 3'-OH)；6.57 (pt, 1H, 3J(H, H) =6.2Hz, H-C(1'))；6.60-7.30 (m, 13H,
フェニル-H)；8.71 (s, 1H, N=CH), 9.07 (s, 1H, H-C(8))。C39H47N7O5 (693.8
)分析についての計算値：C 67.51、H 6.83、N 14.13；実測値：C 67.15、H 6.82
、N 14.13。
【０１２３】実施例11 7-[2-デオキシ-5-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-β-D-エリスロ-ペン
トフラノシル]-4-{ [(ジ-n-ブチルアミノ)メチリデン]アミノ}-7H-イミダゾ[4,5
-d] [1,2,3]-トリアジン-3'-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロア
ミダイト] (10b) 無水CH2Cl2 (20mL)を溶媒とする化合物10aの溶液(300mg, 0.43mmol)に、N,N-
ジイソプロピルエチレンアミン(145μL, 0.88mmol)及びクロロ-(2-シアノエトキ
シ)-N,N-ジイソプロピルアミノホスフィン(143μL, 0.62mmol)を、Ar大気下で添
加した。室温で20分間攪拌した後、5％NaHCO3水溶液(15 mL)を添加し、かつこの
混合液をCH2Cl2 (2 x 30mL)で抽出した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過しかつ
蒸発した。FC(シリカゲル、カラム5 x 10cm、CH2Cl2/アセトン、85:15)は、表題
化合物のジアステレオマーの混合液(300mg、78％)を生じた。TLC (シリカゲル、
CH2Cl2/アセトン、85:15)：Rf 0.71, 0.80。31P-NMR (CDCl3)：149.962, 150.22
3。
【０１２４】実施例12 5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-6-N-((ジ-n-ブチルアミノ)メチレン)-2-アザ-
2'-デオキシアデノシン3'-[(2-シアノエチル)-N,N-(ジイソプロピル)]ホスホロ
アミダイト(12) 無水CH2Cl2 (20mL)を溶媒とする5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-6-N-((ジ-n
-ブチルアミノ)メチレン)-2-アザ-2'-デオキシアデノシン(300mg, 0.43mmol)溶
液に、(i-Pr)2EtN (145μL, 0.88mmol)及びクロロ-(2-シアノエトキシ)(ジイソ
プロピルアミノ)ホスフィン(143μL, 0.62mmol)を添加した。室温で20分間攪拌
した後、5％NaHCO3水溶液(15ml)を添加し、この混合液をCH2Cl2 (2 x 30ml)で抽
出した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過し蒸発した。FC(シリカゲル、カラム5 x
10cm、CH2Cl2/アセトン、85:15)は、ジアステレオマーの混合液NR-411 (300mg
、77％)を生じた。TLC (シリカゲル、CH2Cl2/アセトン、85:15)：Rf 0.71, 0.80
。31P-NMR (CDCl3)：149.962, 150.223。
【０１２５】実施例13 実施例12のモノマーを用いる核酸結合化合物の合成 この合成は、「概略」に記したように行った。
【０１２６】実施例14 実施例13のプローブを用いる核酸の決定 表1. 2-アザ-2’-デオキシアデノシンを含有するオリゴヌクレオチドの2本鎖形
成のTm-値及び熱力学的パラメータ
【表１】
【０１２７】 5'-d(TAGGTCAATACT)及び5’-d(AGTATTGACCTA)の2個のオリゴヌクレオチドを構
築し、Tm値47℃を有する安定したハイブリッドを作出した。この二重鎖を標準と
して用い、この二重鎖構造及び安定性に対する塩基修飾の影響を試験した。表1
に示したように、1個の中央のdA - dTをz2Ad- dT 塩基対で置換すると、この二
重鎖のTmが5°低下し；これら2個の塩基対の交換は、Tmを10°低下することが明
らかである。二重鎖の安定性の低下は、塩基対交換の位置とは無関係に明らかで
あり；これらの二重鎖は、2個の連続するz2Ad- dT対を有し、これは、修飾され
た塩基対が3個の通常のものから隔てられているような二重鎖と同じTmを示した
。更に二重鎖の安定性は、z2Ad- dT塩基対の数が増大した場合、直線的に低下し
；4個の修飾された対を有するオリゴヌクレオチドは、わずかに28℃のTmを示し
ている。この結果は、dA残基を8-アザ-2’ -デオキシアデノシンで交換したオリ
ゴヌクレオチドに関する所見と著しく対照的であり；ここで、dAの代わりの4個
ものz2Ad残基の導入は、二重鎖の安定性に何ら影響を及ぼしていない。
【０１２８】 表1からわかるように、位置7にG-C塩基対を有するオリゴヌクレオチド(表1の
最終行)のTmは、Tm 54℃である。これらの塩基対の2個のCの2-アザアデニンとの
交換は、Tm 46℃を生じる(第七の二重鎖)。これらの人工的塩基対が天然の塩基
対A-Tにより交換された場合(第一の二重鎖)も、同じTmを示す。更に混合された2
-アザアデニン/G及びA-T塩基対を有する二重鎖にも該当する(第三の二重鎖)。表
1から、1個のG-C塩基対の本発明の人工的塩基対との交換は、そのTmを3〜5℃、
好ましくは4℃低下することがわかる。
【０１２９】 前述の結果は、逆平行の鎖方向の二重鎖についてわかったことである。しかし
同じ結果が、平行鎖の極性を伴うオリゴヌクレオチド二重鎖についても認められ
た。天然のDNA鎖の方向は、逆平行(aps)である。この方向は、二重鎖がisoGd -
dC及び／又はisoMe5Cd - dG塩基対を含む場合には、平行に転換することができ
る(Helv. Chim. Acta.、80:73-85(1997))。dAのdTとの対形成はあいまい(ambigo
us)であるので、天然のDNAは、この第二鎖がイソグアニン、イソシトシン、アデ
ニン及びチミンの塩基を含む場合には、平行様式でハイブリダイズすることがで
きる。例として、1個の二重鎖を表 1に示した。この二重鎖において2個のdA - d
T塩基対がz2Ad- dTで交換された場合、Tm値の10℃の低下が、どの対応する逆平
行オリゴヌクレオチド二重鎖に関する結果と同じであるかを決定する。
【０１３０】 表1に列記したTmデータは、z2Adの塩基対形成特性の別の興味深い特徴を示し
ている(2)。不安定な中央のz2Ad- dT塩基対のz2Ad- dGによる交換は該オリゴマ
ーのTm値の非修飾二重鎖の値(Tm 46℃)への回復を増強するという所見に刺激さ
れ、本発明者らは、ミスマッチを含むオリゴマーの二重鎖の安定性を調べた。
【０１３１】 この目的のために、2個の中央z2Ad残基が2個のdT、dA、dC又はdG残基のいずれ
かと相対したオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。全ての場合において、z2 Ad- dG-含有する二重鎖以外は、Tm値が有意に低下し、これは2個のz2Ad- dC対を
有するオリゴマーについて最も顕著であった。しかし先のオリゴヌクレオチドは
、修飾されていない二重鎖とほぼ同じ値を示した。これは本発明者らに、図1及
び図6に示されたようなz2Ad- dG塩基対を提唱することを促した(部分I)。従って
、本発明は更に、核酸がミスマッチを用いて識別されるようなアッセイにおいて
も使用することができる。
【０１３２】 2-アザ-2'-デオキシアデノシンの特定の塩基対形成に関する所見は、このヌク
レオシドが2-デオキシイソグアノシン(isoGd)と同様の対形成特性を示し、2'-デ
オキシイソグアノシンからのケト/H-N(3)互変異性体を仮定する場合、更には両
方が同様の水素結合のドナー−アクセプターパターンを示すことを暗示している
(図6、部分II)。実際、後者は、逆平行鎖極性を伴うオリゴデオキシヌクレオチ
ド中の2’-デオキシグアノシンとプリン-プリン塩基対を形成するが、dC及びdT
との、特にdAとの塩基対は著しく弱い。
【０１３３】 これらの結果を基に、本発明者らは、平行方向のオリゴヌクレオチドにおいて
、2-アザ-2’-デオキシアデノシンは、天然の条件下でisoGd(図7、部分III)と塩
基対を形成し、更には逆平行に配列された二重鎖においてプロトン化されたdC(
図7、部分V)と塩基対を形成するであろうと予想している。他方で、プロトン化
された2’-デオキシイソシチジンとは、図7に示した構造部分VIに従い逆平行塩
基対が形成される。
【図面の詳細な説明】
【図１】 核酸の別の鎖のdGとz2Adがいかにして塩基対形成が可能であるかを示している
。
【図２】 2-アザ-2’-デオキシアデノシン(2)、対応する三リン酸(11)、通常の化学的自
動化された合成時に2-アザ-2’-デオキシアデノシンのオリゴヌクレオチドへの
導入のためのホスホロアミダイト(10b)、及びH-ホスホネート(12)のような、本
発明の様々な化合物を示している。
【図３】 本発明において有用な化合物を示している。化合物2のプリン番号及び化合物3
の全体の番号を示す。
【図４】 2-アザ-2’-デオキシ-アデノシンの合成経路を示す。
【図５】 本発明の化合物を示す。
【図６】 逆平行結合におけるz2AdのdGとの結合及びdGのisoGdとの結合の比較を示す。
【図７】 z2AdがisoGdと平行様式でも結合するが、プロトン化された場合にはdCと平行
様式で結合することができ、かつプロトン化された場合には逆平行様式でisoGd
と結合することを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月１日（２００２．４．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】 2-アザプリン化合物及びその使用
【特許請求の範囲】
【化１】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 ZはN及びCからなる群より選択され：ただし、 −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、そして Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、-シアノ
、及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、 Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして 該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハ
ロゲン、-SH、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-OH、-NR5R6、-COR 11 、-NH-CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択さ
れた1個以上の部分により置換されている。)。
【化２】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 Lは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-からなる群より選択され、 Tは、オキソ、チオキソ及びセレノキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-Sレポーター基、-SeH、-(C1-C10)-アルコキ
シ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-
アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からな
る群より選択され、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であること
ができ、 Vは、オキシ、スルファンジイル又は-NR22-からなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロ
ゲン、-アジド、-O-アリル、-O-アルキニル、及び-NH2からなる群より選択され
、 R22は、独立して、-H及び-(C1-C10)-アルキルの群から選択され、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27及び
レポーター基からなる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 cは、2〜6の整数であり、 dは、0〜6の整数であり、及び Bは、式Iの一部であり、 ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換である
ことができる。)。
【化３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 Mは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
O-からなる群より選択され、 R22は、-H、-(C1-C10)-アルキル、保護基及びレポーター基から選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C10)-アルキルメルカ
プト及び-NH2からなる群より選択され、 R15は、-H、-(C1-C6)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル
、-(C2-C10)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、固相及
び式IVの基からなる群より選択され、
【化４】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-ア
ルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R 24 及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され
、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、 Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換であ
ることができる。)。
【化５】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M’は、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-
C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキ
ル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、保護基、レポーター基、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選
択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-S-(C1-C6)-アルキルメルカ
プト及び-NH2からなる群より選択され、 R16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-アルキニル
、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基又
は式IVの基からなる群より選択され、
【化６】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができる。)。
【化７】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-O-保護基、-S-保護基、-NH-保護基、
-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C6)-アルキルメ
ルカプト及び-NH2からなる群より選択され、 R15及びR16は、独立して、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C 2 -C18)-アルキニル、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-
カルボニル、-(C3-C19)-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-
アルキル、保護基又は式IVの化合物からなる群より選択され、
【化８】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、二リン酸塩及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに
M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され Bは、式Iの部分であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができ、かつ ここでR15及びR16の少なくともひとつは式IVの基ではなく：但し R1が-NH2でありかつ下記のいずれかであるならば： −W及びX及びY及びZは、Nであり、又は −W及びX及びZは、Nであり、かつYはCR4であり、又は −W及びY及びZはNであり、かつXはCR3である； MR16、MR15及びR14は、各々-OHではない。）。
【化９】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、 Bは、式Iの基であり：
【化１０】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、N及びCからなる群より選択され：但し、 −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、そして Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
CONR5R6、-NH-CSNR5R6、-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
の部分により置換され、 但し-NR5R6のR5及びR6の少なくとも1個は保護基である。)。）。
【化１１】 (式中、PPPは三リン酸基であり； R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
； Bは、式Iの基であり、 但しBが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。）。
【化１２】 (式中、PPPは三リン酸基であり； R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
； Bは、式Iの基であり、 但しBが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。）。
【化１３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルの群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、並びに
Bは、式Iの基であり、
【化１４】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、
及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハロ
ゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-CONR 5 R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
の部分により置換されていて、 但し、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6は保護基である。)。）。
【化１５】 (式中、M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C1 0 )-アルキル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並び
に-NR22-(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 Bは、式Iの基であり、
【化１６】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、
及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハロ
ゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-CONR 5 R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
の部分により置換されている。)。）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、2-アザプリンを含有する核酸結合化合物、そのような化合物の調製
に有用な化合物、この核酸結合化合物と核酸との結合生成物、該化合物を使用す
る核酸の決定法、及び2-アザプリン化合物のいくつかの用途に関する。 いくつかの2-アザプリン化合物が当該技術分野において公知である。Chemistr
y of Nucleosides and Nucleotides(第2巻、288-297頁及び319頁)に、2-アザプ
リンヌクレオシドの例がいくつか示されている。しかし7-デアザ-2-アザプリン
ヌクレオシドについては記されていない。
【０００２】 Biochimica et Biophysica Acta(520:441-451(1978))には、2-アザアデノシン
-5’-二リン酸及び2-アザイノシン-5’-二リン酸の酵素合成及びそれらのE.coli
ポリヌクレオチドホスホリラーゼを用いるホモポリマーへの重合が明らかにされ
ている。この方法は複雑であり、かつ混合配列を形成することが不可能である。
更にこのホモポリマーの他のポリマーとの2-及び3-本鎖複合体を形成する能力が
報告されている。塩基として2-アザアデノシンのみを含むこれらの化合物は、UV
感受性がありかつ不安定であることが証明されている。
【０００３】 J. Org. Chem.(60:6262-6269(1995))は、2-アザ-2’-デオキシイノシンを含有
するオリゴヌクレオチドの合成並びに生物物理学的及び生物学的特性を明らかに
している。ここでは、環の窒素原子のひとつが特定の光化学的に切断可能な保護
基により修飾された2-アザイノシンヌクレオシドが明らかにされている。しかし
、6266頁の表1に認められるように、IAZは、天然の核酸塩基(nucleobase)間と余
り異ならない。更にわかるように、塩基対IAZ/Gの安定性は、通常の塩基対C/Gよ
りも13°小さく、かつ塩基対A/Tよりも9°小さい。従ってCのIAZによる置換は、
A/T塩基対の安定性を模倣するには適していない。
【０００４】 Liebigs Ann. Chem.(647-651(1990))において、2-アザアデニン及びメチルチ
オイミダゾトリアジンのヌクレオシドに加え、対応するメトキシ化合物が明らか
にされている。リン酸又はホスホロアミダイトは明らかにされていない。更にい
かにして特定の位置に2-アザ-アデノシンを含むオリゴヌクレオチドを調製する
かも明らかにされていない。それらのハイブリダイゼーション挙動は明らかにさ
れていない。更に、2-アザ-2’-デオキシアデノシン三リン酸に関しても明らか
にされていない。
【０００５】 本発明は特に、特に医療分野における、例えば分析物中の核酸の決定において
有用である。核酸は、ヒト体液、食品又は環境中の遺伝子又は微生物の有無を決
定するための有用な分析物であることがわかっている。核酸分析は、ポリメラー
ゼ連鎖反応(PCR、米国特許第4,683,202号参照)のような核酸増幅の導入後に、広
範に使用されることがわかった。従って十分量の核酸が各試料から入手可能であ
る。これらの核酸は具体的な目的に応じ、多種多様な技術を用いて、この前処理
された試料から決定することができる。ほとんどのアッセイは、固定されたもし
くは固定可能なプローブ、又は1種以上のレポーター基の結合により標識される
プローブのいずれかの使用を必要としている。レポーター基は、それ自身決定さ
れることが可能であるか、又は該レポーター基を介して決定可能なプローブを形
成するような試薬と反応することができることを特徴としている。従って例えば
レポーター基で標識されたプローブは、プローブ及び決定されるべき核酸を含む
ハイブリッドであり得るので、決定することができる。固定されたプローブの場
合、プローブ及び決定されるべき核酸の間のハイブリッドが、該プローブが結合
されるような固相で決定される。特定のアッセイ形において、特異的配列を有す
る1個の核酸のみならず、異なる配列の多数の核酸も決定することができる。こ
の目的のためには、プローブが、ガラスチップのような平らな表面上のアレイの
小さいスポットに固定される(欧州特許出願第0 476 014号及びTIBTECH、15:465-
469(1997))。
【０００６】 オリゴヌクレオチドアレイを使用する基本的原理は最初に、オリゴヌクレオチ
ドの包括的セットへのハイブリダイゼーション(SBH、ハイブリダイゼーションに
よる配列決定)によりDNA配列を決定する概念が開発された、1980年代後半に提唱
された。
【０００７】 天然の核酸塩基の代わりに、修飾された又は非-天然のヘテロ環式基を含む提
案も多数ある。このような非-天然の基の例は、7-デアザ-dGTPがあり、これはdG
TPの代わりに核酸に導入された際には、配列決定ゲルにおいてバンドのコンプレ
ッション現象を低下する(欧州特許第0 476 014号)。
【０００８】 核酸の決定は、一般に天然の塩基A及びT並びにC及びGの間の塩基対形成の可能
性は異なる安定性を有するという問題により損なわれる。これは、水素結合を形
成する塩基の異なる可能性に起因する。従ってdA-dT-塩基対は2個の水素橋を有
する一方で、dG-dC-塩基対は3個の水素橋を有する。このことは、GC含量によっ
て左右されるハイブリッドの異なる融解温度(Tm)を生じる。GC含量が高くなると
、Tmが高くなる。しかし通常の核酸分析において、すべてのアッセイについて同
様のハイブリダイゼーション条件をある位置で適用するために、同じ長さの核酸
のTmを均一にするか、又は核酸もしくは結合領域の長さとは無関係であることさ
えもが望ましい。これは特に、アレイを使用するアッセイに必要であり、その理
由はこのようなアレイ上では各プローブのハイブリダイゼーション条件は同一で
なければならないからである。
【０００９】 ある溶液に、低いハイブリダイゼーション温度を使用した。このような条件下
では、低い塩基配列の相補性を有する多くの核酸はプローブと結合するであろう
。これは類似した配列間の識別をもたらさない非特異的結合と称されている。
【００１０】 別の提案は、ハイブリダイゼーション混合液中での化学試薬、例えばテトラメ
チルアンモニウムクロリド(TMAC)などの使用に関する。この試薬は、dG-dC及びd
A-dT塩基対間の安定性の差異を小さくするが、この作用は短いオリゴヌクレオチ
ドでは不十分である。更にTMACのような塩の添加は、アッセイの最適化を複雑に
するので歓迎されない。 別の提案は、ひとつのアッセイにおける各々異なる(固定された)プローブの様
々な濃度での使用に関する。これは、チップ表面で不可能でないとしても、技術
的に困難であることがわかった。
【００１１】 更なる選択肢として、Hoheisel(Nucleic Acids Res.、24:430-432(1996))は、
デオキシリボヌクレオチドで構成されたオリゴヌクレオチド内のリボヌクレオチ
ドの置換、及びその逆を、DNA安定性の改造に使用した。 現時点でわかっているすべての提案は、何らかの欠点を有している。従って依
然、TmがそれらのGC含量に応じて余り変動しないようなプローブを提供すること
が必要である。
【００１２】 本発明の主題は、骨格を有する核酸結合化合物であり、この骨格は、天然の核
酸塩基との塩基対形成が可能であるヘテロ環式基に結合しており、該ヘテロ環式
基の少なくともひとつは、少なくとも1個の別の該ヘテロ環式基が一般式Iの基で
あることを特徴とする天然の核酸塩基のひとつである：
【００１３】
【化１７】
【００１４】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され： −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、-シアノ、
及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハ
ロゲン、-SH、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-OH、-NR5R6、-COR 11 、-NH-CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択さ
れた1個以上の部分により置換されている。)。
【００１５】 例として、以下に、2’-デオキシグアノシン(dG)と特に安定な塩基対を形成す
るが、2’-デオキシチミジン(dT)、2’-デオキシシチジン(dC)及び2’-デオキシ
アデノシン(dA)とははるかに安定していない塩基対を形成するような、2-アザ-2
’-デオキシアデノシン(2,z2Ad)の例を示すことにより、本発明の化合物の有利
な特性の説明を示す。この新規塩基対(z2Ad-dG)は、通常のdA-dT塩基対と同様の
安定性である。
【００１６】 Tmを測定するために、核酸結合化合物において、決定されるべき核酸のGと相
補的な鎖の1個以上のCを、z2Adと置き換える。その後このオリゴヌクレオチドは
、z2Adと相対するdGを含む標的配列とは特異的に結合するが、dA-dT塩基対の安
定性は伴い及びdG-dC塩基対の安定性は伴わない。この経過の一般的原理は、z2A d に限定されず、その理由は6-員環において同じ特徴を示す塩基は、それらが2-
アザプリン構造を含むために、前述の説明を基に同じ特性を持つと予想されるか
らである。特に、塩基対形成に参加している部分からヘテロ環式基の部分が遠ざ
かると、そのオリゴマーは化学構造の修飾、例えばヘテロ環のこの部分への基の
結合などについてより寛容(tolerant)となる。下記のように、(本発明の)修飾さ
れた塩基を参照し、一般式Iのヘテロ環式基を参照とすることができる。
【００１７】 式Iの破線は、X、Y及びZの定義に応じて、二重結合に局在にいくつかの可能性
があることを示している。Zの具体的な定義の選択により、ZとYの間又はXとYの
間のいずれかに二重結合が必要となることは当業者には明らかであろう。更にX
とY及びYとZの間に各々二重結合が存在しないことも明らかである。 ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素基を意味する。最も好ましいハ
ロゲン基は-Cl及び-Brである。
【００１８】 アルキル基は、線状、分枝した又は環状のいずれかの配置の炭素原子1〜10個
を含むアルキル基から選択されることが好ましい。実際のアルキル基の長さは、
アルキル基が位置する特定の位置の立体状況に応じて決まるであろう。立体的制
約がある場合、アルキル基は概して小さく、メチル及びエチル基が最も好ましい
。アルキル、アルケニル及びアルキニル基は全て、置換又は未置換のいずれかで
あることができる。前述のようなヘテロ原子による置換は、水溶液への溶解度の
増大を助けるであろう。
【００１９】 アルケニル基は、2〜10個の炭素原子を含むアルケニル基から選択されること
が好ましい。選択については、アルキル基と同様の考察が適用される。これらも
、線状、分枝した又は環状であることができる。最も好ましいアルケニル基はエ
チレン基である。 アルキニル基は、2〜10個の炭素原子を有することが好ましい。同じく、これ
らの炭素原子も、線状、分枝した又は環状の様式で配置することができる。更に
、アルキニル基には1個よりも多い三重結合が存在することができる。最も好ま
しいアルキニル基は3-プロパルギル基である。
【００２０】 アルコキシ基は、1〜6個の炭素原子を有することが好ましく、かつ酸素原子を
介してその残余部分に結合されている。アルコキシ基に含まれるアルキル基につ
いて、アルキル基と同じ考察が適用される。最も好ましいアルコキシ基はメトキ
シ基である。 アリールオキシ基は、6〜20個の炭素原子を有することが好ましい。これらの
炭素原子は、1個以上の芳香環に、かつ更には芳香部分に結合した側鎖(例えばア
ルキル鎖)に含まれることができる。好ましいアリールオキシ基は、フェノキシ
及びベンゾキシ基である。
【００２１】 好ましいR14のO-保護基は、アロイル基、アシル基及びシリル基である。これ
らの中で最も好ましいのは、ベンゾイル基である。 好ましいシリル基は、トリエチルシリルのような、トリアルキルシリル基であ
る。
【００２２】 本願明細書に記した式の定義の原子はいずれも、特定の同位体に限定されるも
のではない。従ってリン原子(P)は、通常の31Pもしくは放射性32Pのいずれか又
はそれらの混合物を意味することができる。同じことが水素(H/D/T)、炭素(C)、
ヨウ素(iodide)(Cl、Br、I)及び窒素(N)にも当てはまる。
【００２３】 R2、R3及びR4の定義の好ましい基-NR5R6は、-NH2基である。この場合、このよ
うな式Iの基を含む化合物の化学合成の間、このアミノ基の水素原子の1個は、適
当なアミノ保護基により保護されていることは明らかである。このような保護基
は一般に当業者に公知である。 同じことがR1の定義にも当てはまる。
【００２４】 化学合成の間、-OH、-SH及び-NH2の基のいずれか(レポーター基の中のこれら
の基を含む)は、適当な保護基により保護されなければならない。更に化学合成
の間、これらの化合物は便宜上固相に結合されるであろう。このような場合、先
に示されたこれらの置換基の定義が状況に応じて選択されるであろう。 保護基は、望ましくない経路の反応から官能基を保護するために、官能性部分
(例えば、水素に代わって、ヒドロキシル基の酸素へ)に結合した化学基である。
保護基は更に、生成された分子の生物学的活性、ここでは核酸結合化合物の核酸
への結合を破壊することなく取除くことができるという事実により定義される。
適当な保護基は当業者に公知である。特に好ましい保護基は、例えばヌクレオチ
ド又はオリゴヌクレオチドの5’-末端のヒドロキシル基については、トリチル基
、例えばジメトキシトリチルから選択される。
【００２５】 式Iの環外のアミノ基の好ましい保護基は、アシル基であり、最も好ましくは
ベンゾイル基(Bz)、フェノキシアセチル基もしくはアセチル基又はホルミル基、
及びN,N-ジアルキルホルムアミジン基であり、優先的にはジメチル-、ジイソブ
チル-、及びジ-n-ブチルホルムアミジン基である。
【００２６】 本発明の核酸結合化合物は、好ましくは長さ100サブユニット未満を有し、よ
り好ましくは10〜30サブユニットを含む。核酸結合化合物として有効であるため
には、この置換基は、結合される核酸のヘテロ環式基への水素結合が可能なよう
に、好ましくはワトソンクリック塩基対形成及び／又は図1に示されたように選
択されなければならない。置換基がこのような好ましい水素結合ができないよう
な化合物は、核酸結合化合物の調製のための中間体として有用であることができ
る。好ましい本発明の核酸結合化合物は、化学的に合成されるものである。
【００２７】 核酸結合化合物が、核酸を決定するためのプローブとして使用されるか、又は
いずれか他の化合物もしくは核酸の同定が意図されているならば、いずれかの置
換基がレポーター基を含むように選択される。多くのレポーター基は、十分に核
酸化合物を標識するのに有用であるように結合され得るが、限定数のレポーター
基のみが単独のサブユニットに結合することが好ましく、その結果核酸の認識、
核酸への親和性及び溶解度は影響されず、従って該プローブはハイブリダイゼー
ションアッセイにおいて有用ではない。非常に好ましい場合において、各核酸結
合化合物中には、わずかに1〜4個の、最も好ましくは1又は2個の、もしくは最も
好ましくはわずかに1個のレポーター基が存在するであろう。プローブに結合し
た1個よりも多いレポーター基を必要とする核酸決定の様式がある。このような
様式の例は、国際公開公報第92/02638号に開示されている。この場合、レポータ
ー基のひとつは、蛍光発光基であり、他方が蛍光消光基であろう。
【００２８】 レポーター基は一般に、核酸結合化合物に加え、液体、すなわち試料中の他の
ものから識別可能なそれに結合したいずれかの核酸を生成する基である(レポー
ター基に結合している核酸結合化合物は、標識された核酸結合化合物、標識され
たプローブ又は単にプローブとも称される)。この区別は、レポーター基を、直
接的又は間接的に検出可能基の群から、又は固定されたもしくは固定可能な基の
群のいずれかから選択することにより達成することができる。直接的に検出可能
な基は、蛍光化合物、例えばフルオレセイン並びにヘキサクロロフルオレセイン
及びヘキサフルオロフルオレセインなどのその誘導体、ローダミン、ソラレンス
クアライン(psoralenes squaraines)、ポルフィリン、蛍光粒子、アクリジンエ
ステル及びルミノールのような生物発光化合物、又はCy-5のようなシアニン色素
がある。このような化合物の例は、欧州特許第0 680 969号に開示されている。
更に、TEMPOのようなスピン標識、電気化学的に検出可能な基、フェロセン、ビ
オロゲン、重金属キレート剤及び電気化学発光標識物、例えばルテニウムビスピ
リジル錯体、並びにナフトキノン、ダブシルのような消光色素(quencherdye)、
並びに例えばFe及びCuのようなヌクレアーゼ活性複合体が、有用な検出可能な基
である。間接的に検出可能な基は、直接的又は間接的に標識された別の部分によ
り認識され得る基である。このような間接的に検出可能な基の例は、例えばジゴ
キシゲニン又はビオチンのようなハプテンがある。例えばジゴキシゲニンは、ジ
ゴキシゲニンに対する抗体により認識される。これらの抗体は、直接標識される
か、又は(抗ジゴキシゲニン)抗体に対する標識された抗体により認識されるかす
る。ジゴキシゲニンの認識を基にした様式は、欧州特許第0 324 474号に開示さ
れている。ビオチンは、アビジン及びストレプトアビジンのような類似化合物並
びに他のビオチン結合化合物により認識することができる。同じくこれらの化合
物は、直接的又は間接的に標識することができる。
【００２９】 これらのレポーター基は、更に試料中の他のヌクレオチド配列により妨害され
ないようなヌクレオチド配列であることができる。従ってこの配列は、相補的配
列を含むヌクレオチドにより特異的に認識され得る。このヌクレオチド配列は、
直接的又は間接的に標識されるか、又は固定可能であるかもしくは固定され得る
。 レポーター基は更に固相であることができる。核酸結合化合物の固相への結合
は、検出可能な基について先に指摘したように、直接的又は間接的のいずれかで
あることができる。
【００３０】 直接的標識は、核酸結合化合物の固相上の反応基への共有結合により、すなわ
ち好ましくリンカーを介して達成することができる。間接的標識は、先に検出可
能な基について明らかにしたものと同様に行うことができる。好ましくは、間接
的結合は、例えばハプテン-抗体、ビタミン-受容体及び核酸-相補的核酸の群か
ら選択されたもののように、生体特異的相互作用により、非-共有的である。同
じく、これらの相互作用及びそれらの核酸アッセイにおける用途は当業者に公知
である。
【００３１】 本発明のプローブの固定に有用な固相は、好ましくはポリスチレン、ポリエチ
レン、ポリプロピレン、ガラス及びTiO2の群から選択される。このような固相の
様式は、器具使用の必要性及びアッセイ様式に応じて選択することができる。例
えば、固相はビーズ又は容器の形状を想定することができる。
【００３２】 用語「レポーター基」及び具体的実施態様は、好ましくは使用が意図された部
分(実際の固相又は発蛍光部分)が、レポーター基としての結合部位に接続するよ
うに使用されるリンカーを含む。このリンカーは、核酸結合化合物が固相による
大きい妨害を伴うことなく決定される核酸配列に結合することができるような柔
軟性を提供するであろう。例えば独国特許第3943522号に開示された、連続する
エチレンオキシユニットを基にした例のような、リンカー、特に疎水性でないも
のは、当業者に公知である。
【００３３】 前記説明から、該プローブの骨格が厳密な意味でオリゴヌクレオチドでなくと
も、本発明は依然機能することが明らかになる。昨年、オリゴヌクレオチドと同
様の特性を有するが、それらの骨格とは異なるような核(酸)結合化合物が明らか
にされた。その骨格は一般に、主として線状の形で、同じ又は異なるサブユニッ
トに結合した、塩基を生じるような核酸結合化合物の一部と見なされている。最
も一般的な骨格は、天然の核酸の糖リン酸骨格(リボヌクレオシドサブユニット(
RNA)、デオキシリボヌクレオシドサブユニット(DNA)又はペプチド核酸サブユニ
ット(PNA))のいずれかである。従って、好ましい実施態様において、骨格は、糖
部分及びリン酸部分を含む。更に好ましい実施態様において、糖の立体配置は、
α-D-、β-D-、α-L-及びβ-L-立体配置からなる群より選択され、最も好ましく
は該化合物は少なくとも1個の2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル部分
又は1個のβ-D-リボフラノシル部分を含む。 好ましくは、Dは、本発明の化合物の糖部分のグリコシドC-1である。好ましい
式VIの化合物は、式中R1はNH2で、WはNで、ZはNで、YはCで、XはNで、かつR14は
Hであるものである。
【００３４】 更に好ましい核酸結合化合物は、式Iの基を少なくとも1個含み、式中、R1は基
-NR20R21であり、これは2-アザ-アデノシン又はその誘導体のいずれかである。2
-アザ-アデニンの誘導体として、本発明の核酸結合化合物に結合した核酸のG及
びdGへ2-アザ-アデニンと同じ原子を介して水素結合を提供する化合物が、ここ
で考察されている。最も好ましい式Iの基は、N9原子を介して骨格に結合した2-
アザ-アデニンである。これらの基は、天然の核酸塩基間で明確に区別され、加
えてA-T塩基対と非常によく似た安定性も提供する。
【００３５】 この核酸結合化合物は、決定されるべき核酸又は塩基対形成により結合される
ことが意図されているような核酸と実質的に相補的である核酸塩基配列を含むよ
うに構築される。これらの核酸は通常天然の核酸塩基Ade、Cyt、Gua及びThy又は
Uraのいずれかを少なくとも1個含むので、本発明の核酸結合化合物もこれら4種
の塩基のいずれかを含むであろう。しかし本発明において、核酸結合化合物に位
置する少なくとも1個のヘテロ環式基は、式Iのヘテロ環式塩基による置換のため
に、決定される核酸のGと相対して位置する。核酸結合化合物が該核酸にハイブ
リダイズすることが意図されているような配列中に1個よりも多いGが存在するな
らば、好ましくは核酸結合化合物中のCと同数が、意図されたTmを提供するのに
必要なものとして式Iのヘテロ環式基が選択される。
【００３６】 しかし、本発明の核酸結合化合物は、式Iの基が例えばc7Gd、z8c7Gd及びz8Gd
のような、特にGの誘導体に対して位置しているような、核酸結合化合物の相対
する位置に位置した他のヘテロ環式基にも対する、同じ塩基対形成の選択性を示
す。これら列記したものにおいて、c7は7-位に炭素原子があることを意味し、並
びにz8はこれと同じく8-位に窒素原子があることを意味している。更に本発明に
より認識され得るGの誘導体は、検出可能な基の結合により標識された核酸塩基G
、並びにisoGdである。
【００３７】 この核酸は、式Iのヘテロ環式基それ自身を含むこともできる。核酸結合化合
物上の対応する塩基は、この基と塩基対形成するように選択されることが好まし
く、例えばdGである。この核酸は、例えば7-デアザ-dGTPのように、天然及び／
又は非-天然の塩基を含むことができる。従って用語「核酸」は、本発明におい
て非常に広い意味を持つであろう。混合された塩基配列を有する核酸が好ましい
。
【００３８】 本発明の核酸結合化合物は、好ましくは逆平行様式で核酸に結合するであろう
。しかし核酸及び／又は核(酸)結合化合物の核酸塩基を慎重に選択することによ
り、この結合は強制的に平行様式とすることができる。iso-C及びiso-Gを含む核
酸の平行ハイブリダイゼーションは、例えば欧州特許第0624 161号に開示されて
いる。
【００３９】 好ましい核酸結合化合物は、骨格が一般式IIの1個以上の部分を含むもの：
【００４０】
【化１８】
【００４１】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 Lは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-からなる群より選択され、 Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-S-レポーター基、-SeH、-(C1-C10)-アルコ
キシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10 )-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25から
なる群より選択され、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であるこ
とができ、 Vは、オキシ、スルファンジイル又は-NR22-からなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロ
ゲン、-アジド、-O-アリル、-O-アルキニル、及び-NH2からなる群より選択され
、 R22は、独立して、-H及び-(C1-C10)-アルキルの群から選択され、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27及び
レポーター基からなる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 cは、2〜6の整数であり、 dは、0〜6の整数であり、及び Bは、式Iの部分であり、 ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換である
ことができる。) 並びにそれらのいずれかの塩である。 式Iで定義された好ましい基の定義は、特に記さない限りは、式II及びそれ以降
の式に適用される。
【００４２】 従って好ましい本発明の主題は、前述の核酸結合化合物であり、ここでその骨
格は、一般式IIIの部分を1個以上含む：
【００４３】
【化１９】
【００４４】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 Mは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
O-からなる群より選択され、 R22は、-H、-(C1-C10)-アルキル、保護基及びレポーター基から選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C10)-アルキルメルカ
プト及び-NH2からなる群より選択され、 R15は、-H、-(C1-C6)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル
、-(C2-C10)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、固相及
び式IVの基からなる群より選択され、
【００４５】
【化２０】
【００４６】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-ア
ルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R 24 及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され
、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、 Bは、式Iの部分への結合価である。)、 並びにそれらの塩である。 定義及び優先について、式I及びIIの置換基について述べられた詳細は、特に記
さない限りは、式IIIに適用される。
【００４７】 式IIの化合物において、R14は水素が好ましい。好ましいLの定義はオキシであ
る。好ましいUの定義は、-OH及び-O-レポーター基である。好ましいVの定義はオ
キシである。好ましいcの定義は2〜4の整数であり、かつdのそれは0〜2の整数で
ある。 式IIの化合物は特に、本発明のヘテロ環部分を該核酸結合化合物の一体化され
た部分(好ましくは一方の末端ではない)として含むのに適している。
【００４８】 基-NR23R24は、ジアルキルアミノ基からなる群より選択されることが好ましい
。この基が5-又は6-員のヘテロ環と一緒である場合、ピロリジニル又はピペリジ
ニルの定義が好ましいと仮定する。 好ましいアリール基は、未置換又は1個以上のアミノ、-アミノアルキル、-O-(
C1-C10)-アルキル、-S-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C10)-アルキル、スルホニル、
スルフェニル、スルフィニル、ニトロ及びニトロソで置換されたかのいずれかの
、フェニル又はナフチル部分である。最も好ましいアリール基はフェニル基であ
る。好ましいアリールアルキル基はベンジル基である。好ましいアルキルアミノ
基はエチルアミノ基である。好ましい-COO(C1-C4)アルキル基は、アルキル部分(
メチル又はエチルエステル)に1又は2個の炭素原子を含む。
【００４９】 式Iの基が該化合物の3’-末端で、例えばヌクレオチドのようなサブユニット(
submit)に結合しているような核酸結合化合物は、より長い化合物のための出発
化合物及び／又は末端-標識したプローブのいずれかとして有用である。この化
合物の群は、プローブの末端位置が化学基の結合の観点から最も寛容があるので
、特に好ましい。
【００５０】 好ましい本発明の主題は、式Vの骨格部分を含む前述の核酸結合化合物である
：
【００５１】
【化２１】
【００５２】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M’は、オキシ、スルファネジル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
O-からなる群より選択され、 R22は、-H、保護基、レポーター基、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選
択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-S-(C1-C10)-アルキルメル
カプト及び-NH2からなる群より選択され、 R16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-アルキニル
、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基又
は式IVの化合物からなる群より選択され、
【００５３】
【化２２】
【００５４】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、ここで-NR23R24
はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができる。)、 並びにそれらの塩のいずれかである。
【００５５】 これらの化合物は、5’-末端が標識されたプローブとして使用することができ
る化合物である。これらの置換基に関する定義について、特に記さない限り、前
述の定義が適用される。 非常に好ましい化合物は、MがOであり、R16がHであり、かつR14は水素及びヒ
ドロキシル基からなる群より選択されるような式Vの化合物である。
【００５６】 核酸結合化合物の骨格は、該化合物が相補配列を有する核酸に結合することが
できるように、塩基対形成したヘテロ環を生じる機能を有する。好ましくは、天
然の塩基中の相補性の程度は、結合に作用する領域の塩基の伸展において、結合
した核酸領域における同じ長さの伸展と比較して、70％〜100％までの範囲であ
ろう。そのため各配列におけるサブユニットの欠失及び挿入は、この計算におい
て、次の合致する塩基までのギャップとして数えられ、その結果ギャップが含む
のと同数の塩基分だけ相補性が低下するであろう。 好ましい骨格は、糖-リン酸部分を含む。これらから、骨格を含むデオキシ糖
がより好ましい。
【００５７】 本発明の部分を含む、相補配列の核酸との塩基対形成が可能な部分を生じる骨
格の各部分は、サブユニットと称される。異なる種類のサブユニットが混合した
骨格を有する化合物が公知である。最近、新たな種類の非天然核酸結合化合物が
説明された。これらは、サブユニット間に少なくとも1個のペプチド結合を含む
ので、「ペプチド核酸(PNA)」と称される(国際公開公報第92/20702号)。本発明
の核酸結合化合物は、あらゆる長さを有することができる。しかし、化学合成の
便宜上、例えばヌクレオシドのような、長さ100個未満の、より好ましくは10〜3
0個のサブユニットの化合物が好ましい。
【００５８】 本発明の核酸結合化合物は、公知の方法に類似の方法で調製することができる
。 特に短い化合物に適している第一の選択肢において、化合物は、それらの少な
くとも1個は本発明の修飾された塩基を含むような、サブユニットの化学的に活
性化された誘導体(モノマー)を用い、化学合成により生成される(多行程オリゴ
マー化)。好ましくは、オリゴマー化反応の実際の反応行程には関与しないこれ
らのモノマー中の反応基は、適当な保護基を用いて保護されている。このような
保護基は、当該技術分野において周知であり、かつ本発明の基が使用される場合
の保護及び合成戦略に関する大きい変化はないであろう。
【００５９】 活性化されたサブユニットは、固相表面上又はサブユニットで構成されたオリ
ゴマー中における別のサブユニットの所定の置換基との化学反応に特に適した置
換基を含むサブユニットである。このような特に適したサブユニットは、好まし
くはホスホロアミダイト、ホスノネート(メチルホスホネートなど)、ホスホトリ
エステル、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、ボラノホスフェート(Chem.
Commun.、1517-1518(1999)参照)、リン酸メチルエステル、ホスホン酸フェニル
及びリン酸エチルエステルからなる群より選択される。 所定の置換基は、-NH2、-SH及び-OHの群から選択されることが好ましい。
【００６０】 本発明の更なる主題は、請求項1から13のいずれか1項の化合物の活性化された
サブユニットを用いる化学合成法であり、ここで該サブユニットは少なくとも1
個の式Iの基を含む。この化学合成に関するいくつかの方法が公知であり、例え
ばNarangら、Meth. Enzymol.、68:90-99(1979)のホスホトリエステル法；Brown
ら、Meth. Enzymol.、68:109-151(1979)のホスホジエステル法；Beaucageら、Te
trahedron Lett、22:1859-1862(1981)のジエチルホスホロアミダイト法；並びに
、米国特許第4,458,066号及びMethods in Molecular Biology、S. Agrawal編集
、第20巻、Humana Press社、Totowa、NJ、1993年に記された固相支持体法がある
。最も好ましい化学合成法は、ホスホロアミダイト法を使用する。特に好ましい
方法は、一般式VIIの1個以上の化合物の活性化されたサブユニットを使用する。
この方法は、非常に簡便であるという利点があり、かつ例えば式Iの基を含むホ
スホロアミダイトのような必要な試薬は容易に含むことが可能である。
【００６１】 更なる本発明の主題は、従って一般式VIIの化合物である：
【００６２】
【化２３】
【００６３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファネジル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキ
ル、又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、 Bは、式Iの基である。）。
【００６４】 式VIIの好ましい化合物は、式Iの基が2-アザ-ヒポキサンチンでないものであ
る。好ましい実施態様において、式VIIの中の式Iの基は、少なくとも1個のレポ
ーター基を含む。最も好ましくは、式Iの基は正確に1個のレポーター基を含む。 最も好ましいこのような化合物において、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6
は保護基である。
【００６５】 本発明の更なる主題は、一般式IXの化合物である：
【００６６】
【化２４】
【００６７】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルの群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
-(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、並びに
Bは、式Iの基であり、
【００６８】
【化２５】
【００６９】 (式中、Wは、N及びCR2からなる群のX、Y及びZから独立して選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個
以上の部分により置換されていて、 但し、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6は保護基である。）。)。 これらの化合物は、化学合成において式VIIのものと同様に使用することができ
る。
【００７０】 本発明の更なる主題は、一般式Xの化合物である：
【００７１】
【化２６】
【００７２】 (式中、M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C1 0 )-アルキル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並び
に-NR22-(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 Bは、式Iの基であり、
【００７３】
【化２７】
【００７４】 (式中、Wは、N及びCR2からなる群のX、Y及びZから独立して選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、及び Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
あり、かつ −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個
以上の部分により置換されている。)。）。 これらの化合物は、化学合成においても有用である。
【００７５】 長いオリゴマー及び天然の骨格を基にしたものにより適している別の選択肢に
おいて、オリゴマーは酵素により生成される。この場合、出発オリゴマーは、一
リン酸又は修飾された一リン酸が該オリゴマーの末端に結合されるように、ポリ
メラーゼ並びに三リン酸又は修飾された三リン酸と反応され、その結果該オリゴ
マーは伸張する。同じくこの方法に関して、当業者は、ニック−トランスレーシ
ョン法、又は単純プライマー伸張法のようないくつかの可能性のある様式を認め
るであろう(J. Sambrook、E.F. Fritsch、T. Maniatis、Molecular Cloning - A
laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989)。 例えば、z2AdのDNA配列への組入れは、例えばz2Ad-5’-三リン酸(11)のポリメ
ラーゼ触媒式組入れのような、通常の方法を用いて行うことができる。
【００７６】 従って本発明の更なる主題は、プライマーの伸張のための鋳型として核酸を使
用する三リン酸サブユニットのプライマーとの反応を含む、本発明の核酸結合化
合物の酵素合成法であり、ここで三リン酸サブユニットは、式Iのヘテロ環式基
を含む。好ましくは、この三リン酸サブユニットは、式VIを有する：
【００７７】
【化２８】
【００７８】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-O-保護基、-S-保護基、-NH-保護基、
-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C6)-アルキルメ
ルカプト及び-NH2からなる群より選択され、 R15及びR16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-ア
ルキニル、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル
、-(C3-C19)-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、
保護基又は式IVの化合物からなる群より選択され、
【００７９】
【化２９】
【００８０】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
、保護基、二リン酸及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、及び Bは、式Iの部分であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
ことができ、かつここでR15及びR16の少なくとも1個は、下記の条件で式IVの基
ではない： R1が-NH2でありかつ下記のいずれかであるならば、 −W及びX及びY及びZは、Nであり、又は −W及びX及びZはNであり、かつYはCR4であり、又は −W及びY及びZはNであり、かつXはCR3であるか； MR16、MR15及びMR14は、各々-OHではない。)。
【００８１】 最も好ましいこれらの化合物では、-MR16は三リン酸基であり、かつ-MR15はOH
である。最も好ましい化合物はR14が-OHであるものである。 これらの化合物は特に、本発明のヘテロ環式部分が核酸結合化合物の末端位置
には含まれないような化合物である。 好ましい化合物は、Mがオキシ又はスルファンジイルであり、R16が式IVの化合
物(式中、Uは-OHであり、Tはオキソ又はチオキソであり、R29は-OR30であり、か
つR30は二リン酸基である。)及びそれらの塩である。
【００８２】 最も好ましい化合物は、式VIIIである：
【００８３】
【化３０】
【００８４】 (式中、PPPは、三リン酸基であり R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
、 Bは、式Iの基であり、 但し、Bが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。)。
【００８５】 別の好ましい実施態様において、式VIIの化合物の式Iの基は、 −WはNであり、ZはNであり、YはNであり及びXはCR3であるか、又は −WはNであり、ZはCであり、YはNであり、及びXはCR3であるか、又は −WはNであり、ZはNであり、YはNであり、及びXはNであるかのいずれかの式Iの
基からなる群より選択される。
【００８６】 本発明の更なる主題は、プライマー伸張のために核酸鋳型を使用する三リン酸
サブユニットのプライマーとの反応を含む、本発明の核酸結合化合物の酵素合成
法であり、ここで三リン酸サブユニットは、式Iのヘテロ環式基を含む。 より好ましくは、この方法は、三リン酸サブユニットとして、前記式VIIIの化
合物を使用する。
【００８７】 一般式VI、VII及びVIIIの化合物は、容易に入手できる化合物から調製するこ
とができる。第一の実施態様において、式VIの化合物は、2-位置(プリン番号)の
原子は、この位置に炭素原子を有する対応する化合物(好ましくは式中、MR15はO
Hであり、M’R16はOHでありかつR1はNH2である)を選択し、これを2-クロロアセ
トアルデヒドと反応し、ピリミジン環をアルカリ条件を用いて切断し、かつ再度
硝酸ナトリウムを用いて閉環し、その後アルデヒドにより導入されたイミダゾー
ル環を加水分解することにより調製されるという事実により特徴づけられる。こ
の反応は、2-位の炭素原子の窒素原子による置換を生じる。
【００８８】 その後この化合物を、試薬と反応し、ホスホロアミダイト又はリン酸のような
保護基及び／又は活性基を、オリゴマー化において使用されることが意図された
ヒドロキシル基と結合することができる。ジメトキシトリチル基のような保護基
の結合法は、一般に当業者に公知である。更に、一-、二-及び三リン酸基の結合
も当該技術分野において公知である。
【００８９】 好ましい実施態様において、式VIIの化合物(式中、R1は保護されたアミノ基で
あり、M’R31はO-保護基であり、及びMPR18NR32R17はO-ホスホロアミダイト基で
ある。)、式VIの化合物(式中、M’R16及びMR15は各々OHであり、及びR1はNH2で
ある。)の調製法は、好ましくは保護基ジアルキルアミノメチリデンによりアミ
ノ基を保護する条件に晒し、次に試薬と反応し、5’-ヒドロキシル基を保護し、
かつその後活性化されたリン酸と反応し、ホスホロアミダイトを生成する。得ら
れる式VIIの化合物は、直接的2-アザ-プリンを導入する化学合成において使用す
ることができる。R1の保護基は、この化学合成の間に除去される。 別の2-アザ-2'-デオキシアデノシンの合成については、N. Yamaji、M. Katoの
論文を参照のこと(Chemtry Lett.、311-314(1975))。
【００９０】 前述の方法により、原則として本発明の部分を含むわずかに1個のモノマーを
導入することが可能であるが、場合によってはその1個を超えることができる。
結合領域の全てのCが置換されるならば、Tmの最大低下が生じるであろう。これ
は、Tmの細かい整調を可能にする。当然、決定されるべき核酸との塩基対形成が
意図されないいずれかの領域においてCが残留することがある。
【００９１】 式IからVIIIの化合物(式中、置換基R1、R2、R3及びR4のいずれかは、 ハロゲ
ン、特にCl、シアノ又はSR19からなる群から選択される。)が、化合物(これらの
置換基は、-NR5R6及び-OR13からなる群より選択され、好ましく-NR5R6である。)
の合成の中間生成物として有用である。この中間生成物は、置換反応により最終
生成物に転換することができる。
【００９２】 本発明の更なる主題は、下記の工程を含む核酸の決定法である： −該核酸を含むと思われる試料を提供する工程； −該核酸の一部又は全てと本質的に相補的であるような、請求項1記載の核酸結
合化合物を提供する工程； −該試料を、該核酸結合化合物と、該核酸結合化合物が該核酸に結合する条件下
で接触する工程； −該核酸の存在の尺度として、該核酸及び該核酸結合化合物から形成された結合
生成物を決定する工程。
【００９３】 ハイブリダイゼーションにより核酸を決定する方法は、例えばSambrookらの論
文(前掲)から当該技術分野において一般に公知である。これらは、本発明のプロ
ーブの使用を容易に適合することができる。。好ましくは、この核酸結合化合物
は、溶液中で核酸に結合され、その理由はこの反応は固相上よりも迅速であるか
らである。当業者には、アッセイの構築前及びその全体の開始前に、決定される
べき核酸及びプローブのハイブリッドのTmをいかにして決定するかは明らかであ
る。一旦決定されると、当業者には同じ核酸分析物を使用する各アッセイにおい
て同様の条件を選択しなければならないことが明らかなはずである。
【００９４】 このような決定は、決定されるべき核酸を含むと思われる試料を提供すること
により始まる。例えば核酸が含まれるか、さもなければ決定される可能性はない
であろう細胞を溶解することにより、この試料に適当な形状の核酸をもたらす工
程を施す。更に試料を提供する工程はいずれも、決定に影響を及ぼすであろう当
初の試料の成分から決定されるべき核酸を精製する工程を含むことができる。こ
のような成分は、例えばRNaseのような、核酸が配置される場合に細胞から遊離
し、核酸を消化又は分解するであろう酵素であってよい。更には、核酸の増幅に
影響を及ぼすであろう当初の試料の核酸成分から除去することも好ましい。
【００９５】 本発明の核酸結合化合物を用いる核酸を決定する方法についてはいくつかの可
能性がある。第一の群において、核酸結合化合物は、検出可能なプローブとして
使用される。この場合、核酸結合化合物は、検出可能なレポーター基を含むであ
ろう。該核酸結合化合物及び核酸から形成されたあらゆるハイブリッドは、その
後この検出可能なレポーター基により決定される。この群のアッセイは、更に2
群に分けることができ、一方の群は均一系アッセイでありかつ他方は不均一系ア
ッセイである。不均一系アッセイにおいて、好ましくはハイブリッド(結合生成
物)は、固相に結合した場合に決定されるであろう。この実施態様は、いずれか
過剰なプローブ及び他の成分を、該ハイブリッドから容易に除去することができ
、その結果決定をより容易にすることができるという利点を有する。形成された
ハイブリッドは、共有、非共有、特異的又は非特異的のいずれかにより固相に捕
獲され得る。当業者が公知のいくつかの実施態様がある。
【００９６】 いわゆる均一系アッセイにおいて、形成されたハイブリッドは、固相には結合
しないが、溶液中において直接的又は間接的のいずれかで決定されるであろう。
このようなアッセイの好ましい例は、PCT/US第91/05571号に開示されており、こ
れは本願明細書に参照として組入れられている。本発明の核酸結合化合物はこの
アッセイにおいて特にプローブとして有用である。そこに開示されたアッセイは
これらのアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブの融解温度の細か
い整調を必要とするので、決定されるべき核酸又はそれらの増幅産物及びプロー
ブにより形成されたハイブリッドの融解温度の変調を使用する本発明が、特に有
用である。これは、Tmは、n-merオリゴヌクレオチドの代わりに(n-x)-merオリゴ
ヌクレオチドの選択により低下される場合、選択性が保存されるので、特に有用
である。
【００９７】 従って、更なる本発明の主題は、下記の工程を含む、試料中の核酸の有無、又
は量を決定する方法である： −プライマーとして、該核酸の第一の結合配列に本質的に相補的である第一のプ
ライマー、及びこの核酸の相補体の結合配列と本質的に相補的である第二のプラ
イマー、並びに核酸又は該プライマーの結合配列間のそれらの相補体と相補的で
あるプローブを提供し、かつ該プローブは少なくとも2種の異なるレポーター基
により異なるサブユニットで標識されるような工程； −試料を、該プライマー及び該プローブに、該プライマーの伸張に好ましい条件
下で晒し、かつ該レポーター基を該プローブを分解することにより互いに分離す
る工程、及び −少なくとも1種の該レポーター基により、プローブの分解の程度を決定する工
程、 ここで、該プライマー及び／又はプローブの少なくとも1種は、前述の核酸結
合化合物である。好ましくは、プライマー及びプローブの融解点は、それらのTm
が類似するように選択されるが、プローブのTmの方がプライマーのそれよりも高
い。
【００９８】 別の実施態様において、本発明の核酸結合化合物は、固相へのいずれかの核酸
の結合のために、固定可能であるか又は固定されているプローブのように使用す
ることができる。これらの化合物を固定する方法は、先に記されている。アッセ
イにおいて、化合物が試料に接触する前に又は固相への試料の接触時に化合物を
固定するか、又は試料の固相への接触後でさえものいずれかが可能である。これ
らの各場合において、決定されるべき核酸は、固相に結合され、かつ好ましくは
決定されない試料のいずれかの置換基は、この固相から洗浄除去される一方で、
該化合物及び核酸は結合し続けるであろう。その後、固相に結合したハイブリッ
ドは、例えば前述の検出可能な標識されたプローブの使用によるか、又は例えば
ハイブリッドと内部キレート可能な色素との接触及び固相における変化の測定に
よるようなハイブリッドの直接決定によるなどの、公知の方法により決定される
。
【００９９】 別の実施態様において、固定されたプローブが、核酸の単離又は精製のために
使用される。 別の好ましい実施態様は、固相に結合しかつ検出可能なレポーター基により標
識された両方の核酸結合化合物を使用する。この場合の標識は、好ましくは、決
定されるべき核酸が該プローブに結合された場合に変化を生じるであろう検出可
能な特性の基である。再度これらの化合物も、当該技術分野において公知である
。
【０１００】 当業者は、核酸結合化合物が結合することが意図された核酸の配列がわかって
いる場合には、核酸結合化合物の配列を設計することができるであろう。ほとん
ど全ての場合において、この核酸は、4種の天然の核酸塩基を含む配列を有する
であろう。この場合、特定の核酸ストレッチに結合した場合、核酸のC、A及びT
が、各々、G、T及びAに塩基対形成することが可能な位置に位置するような全て
の塩基を選択することが好ましい。しかし、これらの塩基は、核酸の言及した塩
基と塩基形成する同等の塩基に置き換えることができる。ここで核酸においてG
と塩基対形成することが可能な位置の塩基は、核酸結合化合物においてIの群に
より1回以上の置き換えられるであろう。本発明において概説したように、Iの基
は他の部分とも塩基対形成することができ、例えば逆平行(通常)様式から平行(
非天然)方向へ結合の配向を強制することができる。
【０１０１】 本発明の更なる主題は、特にその塩基がGのみからなるものではないような核
酸の結合のための、シトシンの置換基として核酸結合化合物中の2-アザプリンの
使用である。 本発明の更なる主題は、プローブの、核酸のGで塩基対形成するプローブの位
置での核酸とのハイブリダイゼーション反応における2-アザプリンの使用である
。
【０１０２】 本発明の更なる主題は、本発明の少なくとも1種の核酸結合化合物及び核酸の
結合生成物であり、この核酸結合化合物及び核酸は、平行又は逆平行方向で塩基
対形成することにより互いに結合される。この結合生成物は、核酸1分子及び核
酸結合化合物1分子を含むことができ、これは二重鎖を形成するか、もしくは結
合生成物は、3本の鎖を含み、従って三重鎖となることができる。この三重鎖は
、核酸結合化合物2分子及び核酸1本鎖、もしくは1個の核酸結合化合物及び2個の
核酸分子のいずれかを含むことができる。どのような種類の三重鎖が形成される
かは、核酸結合化合物及び核酸の濃度及び相補性に左右される。
【０１０３】 本発明は、異なる配列を有する多くのプローブについて類似したTmを選択する
可能性を提供する。従って、本発明の具体的主題は、異なる配列の核酸を同時に
単離又は決定する方法である。 第一の実施態様において、本方法は、いわゆる核酸の単離又は決定の複合法で
ある。この実施態様において、本発明で適合できるTmを有する核酸のひとつの配
列(例えば、HCV、HIV及びHBVのような様々なウイルス由来の核酸)と相補的な配
列を含む各プローブ(1個以上のプローブは式Iの基を有する)は、該核酸を含むと
思われる試料と接触される。様式に応じて、様々な核酸を、まとめて又は個別の
いずれかで、プローブにより形成されたハイブリッドにより決定することができ
る。
【０１０４】 第二の実施態様は、プローブのアレイを基にしている。特に、本発明の主題は
、下記の工程を含む、試料中の各々特定の配列を含む核酸の有無を決定する方法
である： −該試料を、その表面に各々該核酸の該特定の配列のひとつに相補的配列を含む
核酸結合化合物が固定された固相と接触する工程； −該固相上で、特定の配列伴う核酸及び相補的配列を含む核酸結合化合物を含む
ハイブリッドの形成を決定する工程； ここで少なくとも1種の該核酸結合化合物は、骨格を含む化合物であり、該骨
格は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能な結合したヘテロ環式基を有し、該ヘ
テロ環式基の少なくとも1個は、該ヘテロ環式基の他の少なくとも1種は一般式I
の基であることを特徴とする天然の核酸塩基のひとつであることを特徴とする。
【０１０５】 この種の方法はいずれも、例えば様々な細菌種のパネルについて、核酸の有無
について試料を同時に試験する場合に有用である。この方法においては、ひとつ
の種を互いにバッチ様(batchwise)処理後に試験することができるのみではなく
、同時に様々な核酸に関する配列情報を受けることも可能である。この型の方法
は、概して当該技術分野において公知である。しかし本発明は、本発明の核酸結
合化合物が、融解温度を、異なる配列及び／又は長さの核酸結合化合物について
非常に類似するように調節することができるので、このようなアッセイにおいて
特に有用であることがわかった。当業者は、各核酸結合化合物が類似した融解温
度を有するようにするためには、これらの様々な化合物の全てが本発明に従い修
飾される必要はないが、例えば同じ固相上の他の化合物の融解温度よりも非常に
高い融解温度を有することにより、他方のようには挙動しないような該化合物の
みを修飾することは明らかである。本発明に従い置換された各Cにより、Tmは、3
〜6℃、好ましくは4〜5℃低下することがある。この点で、当業者は、現在公知
のチップ技術と比較して、様々な核酸の結合に使用される特定の配列の選択に関
して、はるかに大きい柔軟性を有するであろう。例えば今までは決定されるべき
核酸のこのような領域の高G-C含量は、これらの領域が、これらの領域に相補的
なプローブを基にしたこのようなアッセイの標的領域として有用であることを妨
げていた。本発明に従うと、例え決定されるべき核酸に高度に特異的であるよう
なこのような領域であっても、このようなアッセイを使用することができる。
【０１０６】 アレイ技術を使用するアッセイは、一般に当業者に公知であり、例えば欧州特
許出願第0 476 014号に開示されている。これらの固相は、好ましくは平板担体
である。純粋な表面により分割されたそれらの表面上において、各アレイが異な
る配列のプローブに結合しているようなアレイは、核酸の特異的な特定の配列に
対して示された。実際のアッセイの必要性に応じて、このプローブの配列は、該
決定されるべき核酸に含まれた特定の配列のひとつ(又はそれ以上)に本質的に相
補的である。このアッセイ時に、各核酸は、それが結合し得る表面上のプローブ
を検出するであろう。固相上の各アレイ中でのハイブリッド形成の決定は、この
特異的アレイ中の特性の変化を基に特定の配列を含む核酸の有無を決定すること
ができる。好ましくはこれらの変化の評価は、コンピュータプログラムの助けを
借りることができ、これにより特定の配列が存在するようなアレイがいずれであ
るかがわかる。ひとつのチップは、2個から数千個の、又は数百万個でさえもの
アレイを含むことができ、各々は、独自であり得る特異的配列を有する核酸結合
化合物に結合している。しかし、単に余り特異的でなく、従って様々な配列と結
合する核酸結合化合物を使用することにより、もしくは、異なる核酸上に存在す
る配列に対する核酸結合化合物の配列を選択することにより、各々共通の配列を
有する様々な核酸の基の存在を決定することさえも可能である。
【０１０７】 第二のわずかに異なる方法において、このようなアレイは、いわゆる「ハイブ
リダイゼーションによる配列決定」に従い、核酸の配列を決定するために使用す
ることができる。この様式において、試料は、同一配列のほとんどの核酸を含む
ことが好ましいであろう。これは、それらが含まれる混合液からの配列の単離に
より、もしくはそれらのin-vitro又はin-vivo増幅における濃縮により、達成す
ることができる。固相に結合された核酸結合化合物の配列は、それらが全部で核
酸中の決定されるべき配列を扱う配列を含むように選択されるであろう。この配
列において、各核酸結合化合物の配列は、1個以上の塩基により重複するであろ
う。この方法の決定工程において、これらの部分配列のどれに該核酸が結合し、
配列が決定されるべき核酸に含まれる部分配列に対して相補的である場合、どれ
が生じる(理想的)かが検出されるであろう。好ましくは、このアッセイの結果の
評価は、コンピュータで行われる。従ってコンピュータは、決定されるべき配列
に明らかに含まれる部分配列から決定され、その一連においてこれらは核酸全体
に配置されなければならない。特にこの種のアッセイにおいて、この方法は表面
に固定された多数の核酸結合化合物を必要とし、これは常に高いG-C含量により
生じる問題を考慮することができないので、本発明は非常に助けとなる。本発明
において、従って、同時に低い及び高いG-C含量の配列を有する核酸であっても
配列決定が可能である。
【０１０８】 当業者には、本願明細書に記した化合物はいずれも、ある程度は互変異性体及
び塩として存在することができることは明らかであろう。これらの互変異性体及
び塩、好ましくはアルカリ塩、最も好ましくはナトリウム塩は、本発明の式及び
主題の定義内である。 本発明は、下記の実施例によりより詳細に説明される：
【０１０９】 (実施例)概略 モノマー：フラッシュクロマトグラフィー(FC)：シリカゲル60(Merck、ダルム
シュタット、独国)上、0.5barで。FC及びTLCのための溶媒システム：CH2Cl2−Me
OH 85:15 (A)、EtOAc−MeOH 3:1 (B)、CH2Cl2−MeOH 80:20 (C)、CH2Cl2−HOAc
−MeOH 17:1:3 (D)、CH2Cl2−MeOH 9:1 (E)、CH2Cl2−アセトン 85:15 (F)。試
料は、UltroRac IIフラクションコレクター(LKB Instruments、スウェーデン)に
より収集した。融点：Buchi SMP-20装置(Buchi、スイス)。UVスペクトル：U-320
0分光光度計(日立、日本)。NMRスペクトル：AC-250及びAMX-500分光光度計(Bruk
er、独国)；δ値を、内部標準Me4Si又は外部標準H3PO4について相対化した。蛍
光スペクトルは、F-4500蛍光光度計において、H2O中で記録した(日立、日本)。
微量分析は、Mikroanalytisches Laboratorium Beller (ゲッティンゲン、独国)
で行った。
【０１１０】 オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドは、標準のプロトコールに従い、AB
I 392 DNA合成装置(Appied Biosystems、独国)により、「トリチルオフ(trityl-
off)」モードを用い合成したが、但し未修飾のオリゴデオキシヌクレオチドは「
トリチルオン(trityl-on)」モードを用い合成した。修飾したホスホロアミダイ
トのカップリング収量は、一般に平均95％(トリチル伝導度のモニタリング(trit
yl conductivity monitoring))である。脱トリチル化し修飾したオリゴマーは、
Dionex Nucleopac PA-100 HPLCカラム(4 x 250mm、P/N 043010、Dionex GmbH、I
dstein、独国)上で、以下の勾配を用い、イオン交換クロマトグラフィー精製し
た：0.01M NaOH(Y)中の5％ 0.01M NaOH/1.5M水性LiCl(X)で5分；5〜30％のＸ中
のYで25分；30〜5％のＸ中のYで10分；5％ のX中のYで5分。イオン交換HPLC装置
：L-4250 UV/VIS検出器、L-6250 Intelligentポンプ及びD-2500インテグレータ
ー(Merck-Hitachi、独国)。トリチル化した未修飾のオリゴヌクレオチドは、下
記の装置及び手段を用い、RP-18 HPLCで精製した：250 x 4mm RP-18カラム(Merc
k、独国)；655A可変波長UVモニター及びD-2000 Chromato-Integrator (Merck-Hi
tachi、ダルムシュタット、独国)を伴う655 A-12液体クロマトグラフィーからな
る、Merck-Hitachi HPLC装置；0.1M (Et3NH)OAc (pH7.0)/MeCN 95:5(U)及びMeCN
(V)の勾配；勾配I：0〜50％のU中Vで0〜50分、流量1mL/分；勾配II：0〜20％の
U中Vで0〜20分；20〜40％のU中Vで20〜40分、流量1mL/分。脱トリチル化を、精
製したオリゴマーを、CH2Cl2(1mL)を溶媒とする2.5％ジクロロ酢酸溶液で5分間
処理することにより行った。Et3Nで中和した後、蒸発乾固し、その後、MeOHと共
沸(co-evaporation)し、このオリゴマーを前述の装置を用いRP-18 HPLCで再精製
した。勾配：0〜20％のU中Vで0〜30分、20％のU中Vで30〜35分、20〜0％のU中V
で35〜40分、0％のU中Vで40〜45分。引き続き全てのオリゴヌクレオチドの脱塩
を、RP-19 HPLCカラム(4 x 100mm)上で前述の装置を使用し行った。吸着用溶媒
：H2O、脱着用溶媒：MeOH-H2O 3:2。全般的流量：1mL/分。オリゴヌクレオチド
のMALDI-TOF質量スペクトルは、自作の装置において、UVレーザー光337nmを3秒
間照射し測定した。
【０１１１】 オリゴマーの酵素による加水分解は、Helv. Chim. Acta、81:1139-1155 (1998
)に記されたように、しかし流量0.6 mL/分を用いて行った。成分の定量は、ピー
ク面積を基に行い、これを、ヌクレオシドの吸光係数で除算した(ε260値：dA 1
5400、dC 7300、dG 11400、dT 8800、z2Ad 8200)。オリゴヌクレオチドの酵素に
よる加水分解に使用したヘビ毒ホスホジエステラーゼ(EC 3.1.15.1、Crotallus
durissus)及びアルカリホスファターゼ(EC 3.1.3.1、E. coli)は、Roche Diagno
stics GmbHから得た。
【０１１２】 融解曲線及び熱力学の測定：吸光度対温度のプロフィールを、Cary熱電コント
ローラーを装備したCary 1又は1E分光光度計(Varian、オーストラリア)で測定し
た。Tm値は、Pt-100レジスターにより参照セルにおいて測定し、かつ熱力学デー
タ(ΔH°、ΔS°、ΔG°298)は、MeltWin 3.0プログラムにより計算した。円偏
光二色性(CD)スペクトルは、1cmキュベット中で Jasco600 (Jasco、日本)分光偏
光計上、恒温槽(Lauda RCS-6)中で測定した。
【０１１３】実施例１ 3-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-3H-イミダゾ[2,1-i]プリン(1
,N6-エテノ-2’-デオキシアデノシン、5) 2’-デオキシアデノシン一水和物(1) (5.0g, 20mmol)を、1M酢酸ナトリウム緩
衝水溶液(pH4.5〜5.0、110mL)に、40〜50℃で加熱溶解した。この溶液に、クロ
ロアセトアルデヒド(50％水溶液、7.7mol/L、25mL)を添加し、かつ反応混合液を
室温で70時間攪拌した。黄色溶液を、蒸発乾固し、残査をMeOHに溶解し、かつ濾
過し、無機塩を除去した。一緒にした濾液をMeOHで洗浄した後、洗浄液を40〜50
℃で減圧濃縮した。残査を、FC (シリカゲル60H、カラム：20 x 6cm)にかけた。
CH2Cl2−MeOH (85:15)で溶離し、大きい画分を生じ、これを溶媒蒸発し、かつ引
き続きMeOH-EtOAcで再結晶し、化合物5(3.86g、70％)を、無色の結晶として単離
した。M.p. 138〜141℃。TLC (シリカゲル、EtOAc-MeOH、3:1)：Rf 0.4。UV (Me
OH)：λmax 275 (7300), 265 (7600), 258 (6600), 229nm (35700)。1H-NMR ([D 6 ]DMSO)δ2.39 (m, 1H, Hα-C(2'))；2.70 (m, 1H, Hβ-C(2'))；3.57 (t, 1H,
Ha-C(5’))；3.67 (m, 1H, Hb-C(5’))；3.88 (m, 1H, H-C(4’))；4.43 (m, 1H
, H-C(3’))；4.99 (t, 1H, 3J(H,H) = 5.2Hz, 5’-OH)；5.38 (d, 1H, 3J(H, H
), = 3.8Hz, 3’-OH)；6.47 (pt, 1H, 3J(H, H), =6.2Hz, H-C(1'))；7.55 (s,
1H, H-C(11))；8.07 (s, 1H, H-C(10)；8.53 (s, 1H, H-C(2))；9.29 (s, 1H, H
-C(8))。
【０１１４】実施例２ 1-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-5-アミノ-4-(イミダゾール-2
”-イル)-イミダゾール(6) 化合物5 (3.85g, 14mmol)を、1N NaOH水溶液 (60mL)で室温で一晩処理した。
反応混合液を、2N HCl水溶液を添加し、pH7に調節し、かつシロップ状となるま
で濃縮した。これを無水MeOHに溶解し、かつ沈殿したNaClを濾過し、MeOHで洗浄
した。濾液及び洗浄液を一緒にし、かつ蒸発した。残査を、FC(シリカゲル60H、
カラム：20 x 6cm)にかけた。CH2Cl2−MeOH (C)で溶離し、大きいゾーンを生じ
、これより無色の泡状の化合物6(2.70g, 73％)を得、これを更に精製することな
く次反応に用いた。分析用試料は、MeOH−EtOAcから結晶化し、無色の球状晶を
得た；m.p. 91〜93℃(分解)。TLC(シリカゲル、CH2Cl2−HOAc−MeOH, 17:1:3)：
Rf 0.22。UV (MeOH)：λmax 271nm(12800)。1H-NMR ([D6]DMSO)δ2.21 (m, 1H,
Hα-C(2’))；2.47 (m, 1H, Hβ-C(2’))；3.57 (m, 2H, H2-C(5'))；3.84 (m,
1H, H-C(4'))；4.36 (m, 1H, H-C(3’))；6.00 (pt, 1H, 3J(H, H) =6.5Hz, H-C
(1’))；6.60 (br. s, NH2)；7.13 (s, 2H, H-C(4) + H-C(5))；7.55 (s, 1H, H
-C(2))；8.16 (s, NH)。
【０１１５】実施例３ 3(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-1H-ジイミダゾ[1,2-c:4’5’-
e] [1,2,3]-トリアジン(1,N6-エンテノ-2-アザ-2'-デオキシアデノシン、7) 80％HOAc水溶液を溶媒とする化合物6(4.50g, 17mmol)溶液を、氷浴中で、硝酸
ナトリウム(1.17g, 17mmol)により1時間処理した。この反応混合液を蒸発し、シ
ロップ状とした。これをH2Oに溶解し、繰り返し蒸発し、HOAcを除去した。残査
を、FC(シリカゲル60H、カラム、20 x 6cm)にかけた。CH2Cl2−MeOH (85:15)で
溶離し、蒸発し化合物7(2.50g, 53％)を得た。M.p. 151〜152℃(decomp.)。TLC(
シリカゲル、CH2Cl2−MeOH、4:1)：Rf 0.5。UV (MeOH)：λmax 282 (3100), 268
(3200), 238nm (37900)。1H-NMR ([D6]DMSO)δ2.54 (m, 1H, Hα-C(2'))；2.85
(m, 1H, Hβ-C(2'))；3.97 (m, 2H, H2-C(5'))；4.00 (m, 1H, H-C(4'))；4.50
(m, 1H, H-C(3'))；4.96 (t, 1H, 3J(H, H)= 5.4Hz, 5’-OH)；5.41 (d, 1H, 3 J(H,H)= 4.3 Hz, 3’-OH)；6.69 (pt, 1H, 3J(H, H) = 6.3 Hz, H-C(1’))；7.8
5 (d, 1H, 3J(H,H)= 1.1 Hz, H-C(11))；8.75 (d, 1H, 3J(H,H)= 1.1Hz, H-C(10
))；8.95 (s, 1H, H-C(8))。C11H12N6O3(276.25)分析についての計算値：C 47.8
3、H 4.38、N 30.42；実測値：C 47.71、H 4.32、N 30.32。
【０１１６】実施例４ 4-アミノ-7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-イミダゾ[4,5-d
]-[1,2,3]-トリアジン(2-アザ-2'-デオキシアデノシン、2) 化合物7(0.56g、2mmol)を、40〜50℃に暖めながら、1M酢酸ナトリウム緩衝水
溶液(pH4.0〜4.5、120mL)中に溶解した。この溶液に、N-ブロモスクシンイミド(
2.8g, 16mmol)を添加し、かつこの反応混合液を室温で一晩攪拌した。反応混合
液を蒸発し、かつDowex 1x8イオン交換カラム(3 x 12cm、OH-型)にかけた。H2O(
250mL)で溶離し、無色針状晶化合物2(0.19g、38％)を得、これは185℃以上で分
解した。この反応生成物は全ての点で真の試料と同じであった。
【０１１７】実施例５ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-イミダゾ-[4,5-d][1,2,3]
-トリアジン-4-オン(2-アザ-2’-デオキシイノシン、3) 化合物2 (19mg、0.076 mmol)を、H2Oに溶解し、アデノシン脱アミノ酵素(2μg
、ウシ小腸、グリセロールに溶解)を添加した。この反応混合液を、室温で18時
間、2種が完全に消失するまで(UVモニタリング)攪拌し、その後SpeedVac濃縮装
置において蒸発乾固した。UV (H2O)：λmax 247 (5500)、290nm (6200)。1H-NMR
(D2O)：2.49 (m, 1H, Hα-C(2))；2.75 (m, 1H, Hβ-C(2’)；3.41, 3.50 (2m,
2H, H2-C(5'))；4.03 (m, 1H, H-C(4’))；4.51 (m, 1H, H-C(3’))；6.43 (pt
, 1H, 3J(H, H) = 3.2 Hz, H-C(1’))；8.31 (s, 1H, H-C(8))。
【０１１８】実施例６ 4-(ベンゾイルアミノ)-7- (2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-7H-
イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(8) 化合物2(125mg, 0.5mmol)を、無水ピリジンと2回共沸した。残査を、無水ピリ
ジン中に懸濁し、かつ塩化トリメチルシリル(0.5mL, 4mmol)で処理した。数分間
攪拌した後、透明な溶液が生じた。この反応混合液を室温で2時間攪拌した。次
に塩化ベンゾイル(0.25mL, 2mmol)を添加し、かつ連続して更に2時間攪拌した。
この反応混合液を氷浴中で冷却し、かつH2O (1mL)を添加した。10分後、反応混
合液を、濃NH3水溶液(0.8mL)で処理し、更に30分間放置した。次にこの混合液を
蒸発乾固し、H2Oで処理し、かつEtOAc (3 x 20mL)で抽出した。一緒にした抽出
液を乾燥し(Na2SO4)、かつシリカゲルカラム(3 x 15cm)にかけた。溶離を、CH2C
l2 (150mL)、その後CH2Cl2−MeOH (9: 1)で行った。ヌクレオシド-含有画分を蒸
発乾固し、かつ化合物8を、MeOH-H2Oから結晶化し、無色針状晶を得た(135mg, 7
6％)。M.p. 208〜210℃ (分解＞170℃)。TLC (シリカゲル、CH2Cl2−MeOH 9:1)
：Rf 0.31。UV：(水中10％ MeOH)：λmax 233 (15600), 276nm (16400)。1H-NMR
([D6] DMSO)：δ 2.97 (2m, 2H, H2-C(2’))；3.69 (m, 2H, H2-C(5'))；4.00
(m, 1H, H-C(4'))；4.57 (m, 1H, H-C(3'))；5.07 (t, 1H, 3J(H, H) =4.8Hz, 5
’-OH)；5.49 (d, 1Ｈ, 3J(H, H) =4.0Hz, 3’-OH)；6.72 (t, 1H, 3J(H, H) =6
.5Ｈz, H-C(1’))；7.61-7.78 (m,4H, 芳香族-H), 8.16 (d, 2H, 芳香族-H)；9.
09 (s, 1H, H-C(8))；11.84 (s, 1H, N-H)。C16H16N6O4 (356.3)分析についての
計算値：C 52.93、H 4.41、N 23.38；実測値：C 52.68、H 4.39、N 23.07。
【０１１９】実施例７ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジメチルアミノ)メチリ
デン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(9a) MeOH (5mL)を溶媒とする化合物2 (63mg, 0.25mmol)の攪拌している懸濁液に、
N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール(120mg, 0.5mmol)を添加した。攪
拌を室温で2時間継続した。この反応混合液を蒸発乾固し、残査をシリカゲル上
に吸着した。シリカゲルカラム(3 x 10cm)上でCH2Cl2 (100mL)、それに続くCH2C
l2−MeOH (9:1)によるフラッシュクロマトグラフィーは、無色針状晶を生じた(M
eOH−H2O, 65 mg, 85％)。M.p. 173〜175℃。TLC (シリカゲル、CH2Cl2−MeOH,
9:1)：Rf 0.28。UV：(水中10％ MeOH)：λmax 234 (13250), 319nm (29500)。1H
-NMR ([D6] DMSO)：δ2.84 (2m, 2H, H-C(2’))；3.17, 3.25 (2s, 2H, N-CH3);
3.60 (m, 2H, H2-C(5’))；3.92 (m, 1H, H-C(4'))；4.47 (m, 1H, H-C(3'))；
5.05 (t, 1H, 3J(H, H) =4.9Hz, 5'-OH)；5.39 (d, 1H, 3J(H, H) = 4.0Hz, 3'-
OH)；6.55 (t, 1H, 3J(H, H) = 6.6Hz, H-C(1’))；8.79 (s, 1H, N=CH)；9.08
(s, 1H, H-C(8))。C12H17N7O3 (307.3)分析についての計算値：C 46.90、H 5.58
、N 31.90；実測値：C 46.55、H 5.68、N 31.66。
【０１２０】実施例８ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジ-イソブチルアミノ)
メチリデン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d] [1,2,3]-トリアジン(9b) 化合物9aについて記したように、しかしN,N-ジ-イソブチルホルムアミドジメ
チルアセタールを使用し行った。無色の結晶(72％)。M.p. 138〜140℃。TLC(シ
リカゲル、CH2Cl2-MeOH, 9:1)：Rf 0.40。UV (水中10％ MeOH)：λmax 236 (101
00), 325nm (25850)。1H-NMR ([D6]DMSO)：δ0.88, 0.94 (2d, 12 H, CH3)；1.9
5, 2.20 (2m, 2H, CH)；2.80 (2m, 2H, H2-C(2'))；3.30-3.74 (m, 6H, H2-C(5
’)及び2 CH2)；4.00 (m, 1H, H-C(4'))；4.45 (m, 1H, H-C(3'))；5.03 (t, 1H
, 3J(H, H) =4.9Hz, 5'-OH)；5.37 (d, 1H, 3J(H, H) =4.0Hz, 3'-OH)；6.54 (t
, 1H, 3J(H, H) =6.4Hz, H-C(1’))；8.78 (s, 1H, N=CH)；9.10 (s, 1H, H-C(8
))。C18H29N7O3・1/2H2O(400.5)分析についての計算値：C 53.99、H 7.55、N 24
.28；実測値：C 53.65、H 7.62、N 24.11。
【０１２１】実施例９ 7-(2-デオキシ-β-D-エリスロ-ペントフラノシル)-4-{[(ジ-n-ブチルアミノ)メ
チリデン]-アミノ}-7H-イミダゾ[4,5-d][1,2,3]-トリアジン(9c) 化合物9aについて記したように、しかしN,N-ジ-n-ブチルホルムアミドジメチ
ルアセタールを使用し行った。無色の針状晶(75％)。M.p. 107〜109℃。TLC(シ
リカゲル、CH2Cl2-MeOH, 9:1)：Rf 0.42。UV (水中10％ MeOH)：λmax 235 (102
00), 325nm (25700)。1H-NMR ([D6]DMSO)：δ0.93 (t, 6H, CH3), 1.33, 1.64,
3.70 (3m, 12H, -CH2-)；2.45, 2.80 (2m, 2H, H2-C(2'))；3.60 (m, 2H, H2-C(
5'))；3.92 (m, 1H, H-C(4'))；4.48 (m, 1H, H C(3'))；5.04 (t, 1H, 3J(H, H
) =5.8Hz, 5'-OH)；5.39 (d, 1H, 3J(H, H) =4.0Hz, 3'-OH)；6.55 (pt, 1H, 3J
(H, H) =6.3Hz, H-C(1'))；8.78 (s, 1H, N=CH)；9.08 (s, 1H, H-C(8))。C18H2 9 N7O3 (391.5)分析についての計算値：C 55.23、H 7.47、N 25.05；実測値：C 5
5.36、H 7.66、N 24.97。
【０１２２】実施例10 7-[2-デオキシ-5-0- (4,4’-ジメトキシトリフェニルメチル) -β-D-エリスロ-
ペンタフラノシル]-4-{[(ジ-n-ブチルアミノ)メチリデン]アミノ}-7H-イミダゾ[
4,5-d] [1,2,3]-トリアジン(10a) 化合物9c (390mg, 1mmol)を、ピリジンと2回共沸し、かつ油状の残査を、無水
ピリジン(6mL)に溶解した。次に、4,4-ジメトキシトリフェニル-メチルクロリド
(450mg, 1.3mmol)を添加し、かつこの反応混合液を室温で2時間攪拌した。その
時点で、MeOH (0.2mL)を添加し、かつ15分間攪拌を継続した。反応混合液を、15
mLの5％ NaHCO3水溶液に注ぎ込み、かつこれをCH2Cl2 (各々30mL)で2回抽出した
。一緒にした抽出液を、Na2SO4上で乾燥し、蒸発し、かつ残査をシリカゲルに吸
収した。これを、シリカゲル 60H -カラム(4 x 14cm)に乗せ、CH2Cl2−アセトン
勾配(0→25％アセトン、総容量600mL)でクロマトグラフィーを行った。このヌク
レオシド-含有画分を一緒にし、かつ蒸発し、化合物10aを固形泡状物として得た
(560mg, 81％)。TLC：(シリカゲル、CH2Cl2-アセトン, 85:15)：Rf 0.15。1H-NM
R ([D6]DMSO)：0.93 (t, 6H, CH3)；1.34, 1.63, 3.75 (3m, 12H, -CH2-)；2.95
(2m, 2H, H-C(2'))；3.51 (m, 2H, H2-C(5'))；3.63, 3.69 (2s, 6H, OCH3)；4
.01 (m, 1H, H-C(4'))；4.59 (m, 1H, H-C(3'))；5.45 (d, 1H, 3J(H, H) =4.1H
z, 3'-OH)；6.57 (pt, 1H, 3J(H, H) =6.2Hz, H-C(1'))；6.60-7.30 (m, 13H,
フェニル-H)；8.71 (s, 1H, N=CH), 9.07 (s, 1H, H-C(8))。C39H47N7O5 (693.8
)分析についての計算値：C 67.51、H 6.83、N 14.13；実測値：C 67.15、H 6.82
、N 14.13。
【０１２３】実施例11 7-[2-デオキシ-5-O-(4,4'-ジメトキシトリフェニルメチル)-β-D-エリスロ-ペン
トフラノシル]-4-{ [(ジ-n-ブチルアミノ)メチリデン]アミノ}-7H-イミダゾ[4,5
-d] [1,2,3]-トリアジン-3'-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロア
ミダイト] (10b) 無水CH2Cl2 (20mL)を溶媒とする化合物10aの溶液(300mg, 0.43mmol)に、N,N-
ジイソプロピルエチレンアミン(145μL, 0.88mmol)及びクロロ-(2-シアノエトキ
シ)-N,N-ジイソプロピルアミノホスフィン(143μL, 0.62mmol)を、Ar大気下で添
加した。室温で20分間攪拌した後、5％NaHCO3水溶液(15 mL)を添加し、かつこの
混合液をCH2Cl2 (2 x 30mL)で抽出した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過しかつ
蒸発した。FC(シリカゲル、カラム5 x 10cm、CH2Cl2/アセトン、85:15)は、表題
化合物のジアステレオマーの混合液(300mg、78％)を生じた。TLC (シリカゲル、
CH2Cl2/アセトン、85:15)：Rf 0.71, 0.80。31P-NMR (CDCl3)：149.962, 150.22
3。
【０１２４】実施例12 5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-6-N-((ジ-n-ブチルアミノ)メチレン)-2-アザ-
2'-デオキシアデノシン3'-[(2-シアノエチル)-N,N-(ジイソプロピル)]ホスホロ
アミダイト(12) 無水CH2Cl2 (20mL)を溶媒とする5'-O-(4,4'-ジメトキシトリチル)-6-N-((ジ-n
-ブチルアミノ)メチレン)-2-アザ-2'-デオキシアデノシン(300mg, 0.43mmol)溶
液に、(i-Pr)2EtN (145μL, 0.88mmol)及びクロロ-(2-シアノエトキシ)(ジイソ
プロピルアミノ)ホスフィン(143μL, 0.62mmol)を添加した。室温で20分間攪拌
した後、5％NaHCO3水溶液(15ml)を添加し、この混合液をCH2Cl2 (2 x 30ml)で抽
出した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、濾過し蒸発した。FC(シリカゲル、カラム5 x
10cm、CH2Cl2/アセトン、85:15)は、ジアステレオマーの混合液NR-411 (300mg
、77％)を生じた。TLC (シリカゲル、CH2Cl2/アセトン、85:15)：Rf 0.71, 0.80
。31P-NMR (CDCl3)：149.962, 150.223。
【０１２５】実施例13 実施例12のモノマーを用いる核酸結合化合物の合成 この合成は、「概略」に記したように行った。
【０１２６】実施例14 実施例13のプローブを用いる核酸の決定表1. 2-アザ-2’-デオキシアデノシン
を含有するオリゴヌクレオチドの2本鎖形成のTm-値及び熱力学的パラメータ
【０１２７】
【表１】
【０１２８】 5'-d(TAGGTCAATACT)及び5’-d(AGTATTGACCTA)の2個のオリゴヌクレオチドを構
築し、Tm値47℃を有する安定したハイブリッドを作出した。この二重鎖を標準と
して用い、この二重鎖構造及び安定性に対する塩基修飾の影響を試験した。表1
に示したように、1個の中央のdA - dTをz2Ad- dT 塩基対で置換すると、この二
重鎖のTmが5°低下し；これら2個の塩基対の交換は、Tmを10°低下することが明
らかである。二重鎖の安定性の低下は、塩基対交換の位置とは無関係に明らかで
あり；これらの二重鎖は、2個の連続するz2Ad- dT対を有し、これは、修飾され
た塩基対が3個の通常のものから隔てられているような二重鎖と同じTmを示した
。更に二重鎖の安定性は、z2Ad- dT塩基対の数が増大した場合、直線的に低下し
；4個の修飾された対を有するオリゴヌクレオチドは、わずかに28℃のTmを示し
ている。この結果は、dA残基を8-アザ-2’ -デオキシアデノシンで交換したオリ
ゴヌクレオチドに関する所見と著しく対照的であり；ここで、dAの代わりの4個
ものz2Ad残基の導入は、二重鎖の安定性に何ら影響を及ぼしていない。
【０１２９】 表1からわかるように、位置7にG-C塩基対を有するオリゴヌクレオチド(表1の
最終行)のTmは、Tm 54℃である。これらの塩基対の2個のCの2-アザアデニンとの
交換は、Tm 46℃を生じる(第七の二重鎖)。これらの人工的塩基対が天然の塩基
対A-Tにより交換された場合(第一の二重鎖)も、同じTmを示す。更に混合された2
-アザアデニン/G及びA-T塩基対を有する二重鎖にも該当する(第三の二重鎖)。表
1から、1個のG-C塩基対の本発明の人工的塩基対との交換は、そのTmを3〜5℃、
好ましくは4℃低下することがわかる。
【０１３０】 前述の結果は、逆平行の鎖方向の二重鎖についてわかったことである。しかし
同じ結果が、平行鎖の極性を伴うオリゴヌクレオチド二重鎖についても認められ
た。天然のDNA鎖の方向は、逆平行(aps)である。この方向は、二重鎖がisoGd -
dC及び／又はisoMe5Cd - dG塩基対を含む場合には、平行に転換することができ
る(Helv. Chim. Acta.、80:73-85(1997))。dAのdTとの対形成はあいまい(ambigo
us)であるので、天然のDNAは、この第二鎖がイソグアニン、イソシトシン、アデ
ニン及びチミンの塩基を含む場合には、平行様式でハイブリダイズすることがで
きる。例として、1個の二重鎖を表 1に示した。この二重鎖において2個のdA - d
T塩基対がz2Ad- dTで交換された場合、Tm値の10℃の低下が、どの対応する逆平
行オリゴヌクレオチド二重鎖に関する結果と同じであるかを決定する。
【０１３１】 表1に列記したTmデータは、z2Adの塩基対形成特性の別の興味深い特徴を示し
ている(2)。不安定な中央のz2Ad- dT塩基対のz2Ad- dGによる交換は該オリゴマ
ーのTm値の非修飾二重鎖の値(Tm 46℃)への回復を増強するという所見に刺激さ
れ、本発明者らは、ミスマッチを含むオリゴマーの二重鎖の安定性を調べた。
【０１３２】 この目的のために、2個の中央z2Ad残基が2個のdT、dA、dC又はdG残基のいずれ
かと相対したオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。全ての場合において、z2 Ad- dG-含有する二重鎖以外は、Tm値が有意に低下し、これは2個のz2Ad- dC対を
有するオリゴマーについて最も顕著であった。しかし先のオリゴヌクレオチドは
、修飾されていない二重鎖とほぼ同じ値を示した。これは本発明者らに、図1及
び図6に示されたようなz2Ad- dG塩基対を提唱することを促した(部分I)。従って
、本発明は更に、核酸がミスマッチを用いて識別されるようなアッセイにおいて
も使用することができる。
【０１３３】 2-アザ-2'-デオキシアデノシンの特定の塩基対形成に関する所見は、このヌク
レオシドが2-デオキシイソグアノシン(isoGd)と同様の対形成特性を示し、2'-デ
オキシイソグアノシンからのケト/H-N(3)互変異性体を仮定する場合、更には両
方が同様の水素結合のドナー−アクセプターパターンを示すことを暗示している
(図6、部分II)。実際、後者は、逆平行鎖極性を伴うオリゴデオキシヌクレオチ
ド中の2’-デオキシグアノシンとプリン-プリン塩基対を形成するが、dC及びdT
との、特にdAとの塩基対は著しく弱い。
【０１３４】 これらの結果を基に、本発明者らは、平行方向のオリゴヌクレオチドにおいて
、2-アザ-2’-デオキシアデノシンは、天然の条件下でisoGd(図7、部分III)と塩
基対を形成し、更には逆平行に配列された二重鎖においてプロトン化されたdC(
図7、部分V)と塩基対を形成するであろうと予想している。他方で、プロトン化
された2’-デオキシイソシチジンとは、図7に示した構造部分VIに従い逆平行塩
基対が形成される。
【図面の詳細な説明】
【図１】 核酸の別の鎖のdGとz2Adがいかにして塩基対形成が可能であるかを示している
。
【図２】 2-アザ-2’-デオキシアデノシン(2)、対応する三リン酸(11)、通常の化学的自
動化された合成時に2-アザ-2’-デオキシアデノシンのオリゴヌクレオチドへの
導入のためのホスホロアミダイト(10b)、及びH-ホスホネート(12)のような、本
発明の様々な化合物を示している。
【図３】 本発明において有用な化合物を示している。化合物2のプリン番号及び化合物3
の全体の番号を示す。
【図４】 2-アザ-2’-デオキシ-アデノシンの合成経路を示す。
【図５】 本発明の化合物を示す。
【図６】 逆平行結合におけるz2AdのdGとの結合及びdGのisoGdとの結合の比較を示す。
【図７】 z2AdがisoGdと平行様式でも結合するが、プロトン化された場合にはdCと平行
様式で結合することができ、かつプロトン化された場合には逆平行様式でisoGd
と結合することを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ロゼメイヤー，ヘルムート ドイツ連邦共和国，デー−49076 オスナ ブルエック，リュルマンシュトラーセ 39 (72)発明者 ジュバインベルガー，エンノ ドイツ連邦共和国，デー−34399 オベル ベザー，イン デル クラッペ ９ (72)発明者 ハインドル，ディエター ドイツ連邦共和国，デー−82327 トッツ ィンク，バルドシュミッドシュトラーセ １ (72)発明者 ベルグマン，フランク ドイツ連邦共和国，デー−82393 イッフ ェルドルフ，ファルテルガッター ５ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 FA10 HA14 4B063 QA13 QQ41 QR32 QR42 QR56 QR58 QR62 QS34 QX02 4B064 AF27 CA21 CD12 CD16 DA13 4C057 BB02 BB04 BB05 CC03 LL03

Claims (35)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨格を含む核酸結合化合物であり、該骨格が、天然の核酸塩
    基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基に結合し、少なくとも1個の該ヘテロ環式
    基が天然の核酸塩基のひとつであり、別の該ヘテロ環式基の少なくとも1個が一
    般式Iの基であることを特徴とする、核酸結合化合物： 【化１】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 ZはN及びCからなる群より選択され：ただし、 −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
    あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、そして Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
    あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
    キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、-シアノ
    、及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
    群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
    ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、 Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして 該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハ
    ロゲン、-SH、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-OH、-NR5R6、-COR 11 、-NH-CONR5R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択さ
    れた1個以上の部分により置換されている。)。
  2. 【請求項２】 骨格が糖及びリン酸部分を含む、請求項１記載の核酸結合化
    合物。
  3. 【請求項３】 糖の立体配置が、α-D-、β-D-、α-L-及びβ-L-立体配置か
    らなる群より選択される、請求項２記載の核酸結合化合物。
  4. 【請求項４】 糖部分が、2’-デオキシ-β-D-エリスロペントフラノシル部
    分である、請求項３記載の核酸結合化合物。
  5. 【請求項５】 R1が、-SH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C2-C6)-アルキルメル
    カプト、-NR5R6、F及びNO2からなる群より選択される、請求項１記載の核酸結合
    化合物。
  6. 【請求項６】 R1が、-NR5R6である、請求項５記載の核酸結合化合物。
  7. 【請求項７】 骨格が一般式IIの1個以上の部分を含む、請求項１〜６のい
    ずれか1項記載の核酸結合化合物： 【化２】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 Lは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-からなる群より選択され、 Tは、オキソ、チオキソ及びセレノキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-Sレポーター基、-SeH、-(C1-C10)-アルコキ
    シ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-
    アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からな
    る群より選択され、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であること
    ができ、 Vは、オキシ、スルファンジイル又は-NR22-からなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロ
    ゲン、-アジド、-O-アリル、-O-アルキニル、及び-NH2からなる群より選択され
    、 R22は、独立して、-H及び-(C1-C10)-アルキルの群から選択され、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27及び
    レポーター基からなる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
    NH2及び-COO(C1-C4)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
    C1-C6)-アルキル及びレポーター基からなる群より選択され、 cは、2〜6の整数であり、 dは、0〜6の整数であり、及び Bは、式Iの一部であり、 ここでアルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換である
    ことができる。)。
  8. 【請求項８】 R1がNH2である、請求項１記載の核酸結合化合物。
  9. 【請求項９】 少なくとも1個のレポーター基を含む、請求項１記載の核酸
    結合化合物。
  10. 【請求項１０】 骨格が一般式IIIの部分を含む、請求項１記載の核酸結合
    化合物： 【化３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 Mは、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-C1 0 )-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキル-
    O-からなる群より選択され、 R22は、-H、-(C1-C10)-アルキル、保護基及びレポーター基から選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C10)-アルキルメルカ
    プト及び-NH2からなる群より選択され、 R15は、-H、-(C1-C6)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル
    、-(C2-C10)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、固相及
    び式IVの基からなる群より選択され、 【化４】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-O-レポーター基、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-ア
    ルキル、-(C6-C22)-アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R 24 及び-O-(C1-C10)-アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され
    、又はここで-NR23R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
    なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
    NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
    C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
    、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、 Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルのいずれも、置換又は未置換であ
    ることができる。)。
  11. 【請求項１１】 前記骨格が式Vの部分を含む、請求項１、５及び６のいず
    れか１項記載の核酸結合化合物： 【化５】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M’は、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アルキル又は-O-(C1-
    C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-(C1-C6)-アルキ
    ル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、保護基、レポーター基、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選
    択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-S-(C1-C6)-アルキルメルカ
    プト及び-NH2からなる群より選択され、 R16は、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C2-C18)-アルキニル
    、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-カルボニル、-(C3-C 19 )-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-アルキル、保護基又
    は式IVの基からなる群より選択され、 【化６】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
    -アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
    -アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
    なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
    NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
    C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
    、保護基、固相及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに Bは、式Iの部分への結合価であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
    ことができる。)。
  12. 【請求項１２】 M’がOであり、R16がHであり、及びR14が-H及び-OHからな
    る群より選択される、請求項11記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 式VIの化合物： 【化７】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-O-保護基、-S-保護基、-NH-保護基、
    -(C2-C10)-アルケニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、-SH、-(C1-C6)-アルキルメ
    ルカプト及び-NH2からなる群より選択され、 R15及びR16は、独立して、-H、-(C1-C8)-アルキル、-(C2-C18)-アルケニル、-(C 2 -C18)-アルキニル、-(C2-C18)-アルキル-カルボニル、-(C3-C19)-アルケニル-
    カルボニル、-(C3-C19)-アルキニル-カルボニル、-(C6-C14)-アリール-(C1-C8)-
    アルキル、保護基又は式IVの化合物からなる群より選択され、 【化８】 (式中、Tは、オキソ、チオキソ及びセレンオキソからなる群より選択され、 Uは、-OH、-SH、-SeH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C1-C10)-アルキル、-(C6-C22)
    -アリール、-(C6-C14)-アリール-(C1-C10)-アルキル、-NR23R24及び-O-(C1-C10)
    -アルキル-O-(C1-C10)-アルキル-R25からなる群より選択され、又はここで-NR23 R24はNと共に5〜6-員のヘテロ環であることができ、 R23及びR24は、独立して、-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C20)-アリール、-(C6-C14 )-アリール-(C1-C10)-アルキル、-(C1-C6)-アルキル-[NH(CH2)c]d-NR26R27から
    なる群より選択され、 R25は、-H、-OH、-ハロゲン、-アミノ、-(C1-C18)-アルキルアミノ、-COOH、-CO
    NH2及び-COO(C1-C4)-アルキルからなる群より選択され、 R26及びR27は、独立して、-H、-(C1-C6)-アルキル、及び-(C1-C4)-アルコキシ-(
    C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 R29は、-OR30及び-SR30からなる群より選択され、 R30は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C6-C22)-アリール
    、保護基、二リン酸塩及びレポーター基からなる群より選択される。）、並びに
    M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
    キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
    (C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され Bは、式Iの部分であり、 ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルはいずれも置換又は未置換である
    ことができ、かつ ここでR15及びR16の少なくともひとつは式IVの基ではなく：但し R1が-NH2でありかつ下記のいずれかであるならば： −W及びX及びY及びZは、Nであり、又は −W及びX及びZは、Nであり、かつYはCR4であり、又は −W及びY及びZはNであり、かつXはCR3である； MR16、MR15及びR14は、各々-OHではない。）。
  14. 【請求項１４】 式VIIの化合物： 【化９】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
    キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
    (C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
    より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
    -(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
    又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
    基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、 Bは、式Iの基であり： 【化１０】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、N及びCからなる群より選択され：但し、 −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
    あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、そして Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
    あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アルキ
    ル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、及
    び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
    群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C 10 )-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポ
    ーター基からなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、かつ 前記アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-
    ハロゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-
    CONR5R6、-NH-CSNR5R6、-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
    の部分により置換され、 但し-NR5R6のR5及びR6の少なくとも1個は保護基である。)。）。
  15. 【請求項１５】 R1はOR31でない、請求項14記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 前記式Iの基が少なくとも1個のレポーター基を含む、請求
    項14記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 前記式Iの基が、下記のいずれかの式Iの基からなる群より
    選択される、請求項14及び15のいずれか１記載の化合物： −WがNであり、ZがNであり、YがNであり、及びXがCR3であるか、又は −WはNであり、ZがCであり、YがNであり、及びXがCR3であるか、又は −WがNであり、ZがNであり、YがNであり、かつXがNである。
  18. 【請求項１８】 R31がHでない、請求項５記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 請求項１〜11のいずれか１項記載の核酸結合化合物の少な
    くともひとつと核酸との結合生成物であり、この核酸結合化合物及び核酸が、平
    行又は逆平行方向での塩基対形成により互いに結合している、結合生成物。
  20. 【請求項２０】 下記の工程： −該核酸を含むと思われる試料を用意する工程； −該核酸の一部又は全てと本質的に相補的である請求項1記載の核酸結合化合物
    を用意する工程； −該試料を、該核酸結合化合物と、該核酸結合化合物が該核酸に結合する条件下
    で接触する工程； −該核酸の存在の尺度として、該核酸及び該核酸結合化合物から形成された結合
    生成物を決定する工程； を含む、核酸の決定法。
  21. 【請求項２１】 請求項１記載の核酸結合化合物の式Iの任意の基が、該核
    酸のG部分と塩基対形成するように該化合物中に配置される、請求項20記載の方
    法。
  22. 【請求項２２】 シトシンの置換体としての核酸結合化合物中の2-アザプリ
    ンの使用。
  23. 【請求項２３】 核酸のGと塩基対形成するプローブの位置の塩基としての
    核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応における2-アザプリンの使用。
  24. 【請求項２４】 活性化したサブユニットを使用し、ここで該サブユニット
    が少なくとも1個の式Iの基を含む、請求項１〜13のいずれか1項記載の化合物の
    化学合成法。
  25. 【請求項２５】 少なくとも1個のサブユニットが、請求項13〜21のいずれ
    か１項記載の化合物である、請求項24記載の方法。
  26. 【請求項２６】 核酸をプライマー伸張の鋳型として用い三リン酸サブユニ
    ットとプライマーとを反応させる工程を含み、ここで三リン酸サブユニットが式
    Iのヘテロ環式基を含む、請求項１〜13のいずれか１記載の化合物の酵素合成法
    。
  27. 【請求項２７】 前記三リン酸サブユニットが、式VIIIを有する、請求項26
    記載の方法： 【化１１】 (式中、PPPは三リン酸基であり； R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
    ； Bは、式Iの基であり、 但しBが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。）。
  28. 【請求項２８】 下記の工程を含む、試料中の各々が特定の配列を含む核酸
    の有無の決定法： −該試料を、その表面に、各々該核酸の該特定の配列のひとつと相補的な配列を
    含む核酸結合化合物が固定された固相と接触させる工程； −該固相上での、特定の配列を有する核酸及び相補配列を含む核酸結合化合物を
    含むハイブリッドの形成を決定する工程、 ここで少なくとも1種の該核酸結合化合物が、請求項１〜13のいずれか１項記載
    の化合物であることを特徴とする、方法。
  29. 【請求項２９】 下記の工程を含む、試料中の核酸の有無、又は量を決定す
    る方法： −プライマーとして、該核酸の第一の結合配列に本質的に相補的である第一のプ
    ライマー、及びこの核酸の相補体の結合配列と本質的に相補的である第二のプラ
    イマー、並びに核酸又は該プライマー類の結合配列間のそれらの相補体と相補的
    であるプローブを提供し、かつ該プローブは少なくとも2種の異なるレポーター
    基により異なるサブユニットで標識されているような工程； −試料を、該プライマー及び該プローブに、該プライマーの伸張に好ましい条件
    下で晒し、かつ該プローブを分解することにより、互いに該レポーター基を分離
    する工程、及び −少なくとも1種の該レポーター基により、プローブの分解の程度を決定する工
    程、 ここで、少なくとも1種の該プライマー及び／又はプローブは、請求項１〜13の
    いずれか１項記載の核酸結合化合物であることを特徴とする、方法。
  30. 【請求項３０】 一般式VIIIの化合物： 【化１２】 (式中、PPPは三リン酸基であり； R14は、-H、-OH、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2-C 10 )-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジド、及び-NH2からなる群より選択され
    ； Bは、式Iの基であり、 但しBが2-アザアデニンであるならば、R14はOHではない。）。
  31. 【請求項３１】 -M-R16が三リン酸であり、かつMR15が-OHである、請求項3
    0記載の化合物。
  32. 【請求項３２】 R14が-OHである、請求項31記載の化合物。
  33. 【請求項３３】 R14が、-HでありかつR1がOHでない、請求項30記載の方法
    。
  34. 【請求項３４】 下記一般式IXの化合物： 【化１３】 (式中、Aは、O、S及びN-(C1-C6)-アルキルからなる群より選択され、 M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C10)-アル
    キル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並びに-NR22-
    (C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルの群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
    より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 R32及びR17は、独立して、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケニル及び
    -(C6-C22)-アリールからなる群より選択され、 R18は、置換又は未置換の-(C1-C6)-アルキル、未置換の-(C1-C6)-アルコキシ、
    又は-ハロゲン、p-ニトロアリールオキシ及び-シアノからなる群より選択される
    基で1回以上の置換された-(C1-C6)-アルコキシからなる群より選択され、並びに
    Bは、式Iの基であり、 【化１４】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
    あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
    あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
    キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、
    及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
    群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
    ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
    らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハロ
    ゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-CONR 5 R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
    の部分により置換されていて、 但し、-NR5R6の少なくとも1個のR5及びR6は保護基である。)。）。
  35. 【請求項３５】 下記一般式Xの化合物： 【化１５】 (式中、M及びM’は、独立して、オキシ、スルファンジイル及び-NR22-、-(C1-C1 0 )-アルキル又は-O-(C1-C10)-アルキル-O-、及び-S-(C1-C10)-アルキル-O-並び
    に-NR22-(C1-C6)-アルキル-O-からなる群より選択され、 R22は、-H、及び-(C1-C10)-アルキルからなる群より選択され、 R14は、-H、-OR31、-(C1-C10)-アルコキシ、-(C2-C10)-アルケニルオキシ、-(C2 -C10)-アルキニルオキシ、-ハロゲン、-アジドNHR31、-SR31及び-NH2からなる群
    より選択され、 R31は、保護基又はレポーター基であり、 Bは、式Iの基であり、 【化１６】 (式中、WはX、Y及びZから独立して、N及びCR2からなる群から選択され、 Zは、下記の条件で、N及びCからなる群より選択され −ZがNであるならば、 Xは、W及びYから独立して、N及びCR3からなる群より選択され、そして Yは、W及びXから独立して、N及びCR4からなる群より選択され、 そして、X及びYの間の結合は二重結合であり、かつY及びZの間の結合は単結合で
    あり、そして −ZがCであるならば、 Xは、NR33であり、及び Yは、N及びCR4からなる群より選択され、 並びに、Z及びYの間の結合は二重結合であり、かつX及びYの間の結合は単結合で
    あり、 R1、R2、R3及びR4は、独立して-H、-ハロゲン、-OR13、-SR19、-(C1-C10)-アル
    キル、-(C2-C10)-アルケニル、-(C2-C10)-アルキニル、-NO2、-NR5R6、シアノ、
    及び-C(=O)R11からなる群より選択され、 R11は、-OH、-(C1-C6)-アルコキシ、-(C6-C22)-アリールオキシ、NHR12からなる
    群より選択され、 R5、R6、R12、R13、R19及びR33は、-H、-(C1-C10)-アルキル、-(C2-C10)-アルケ
    ニル、-(C2-C10)-アルキニル、-(C6-C22)-アリール、保護基及びレポーター基か
    らなる群より選択され、 r及びsは、各々独立して1〜18の整数であり、並びに Dは、この基の核酸結合化合物の残余への結合位置であり、そして アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換されていないか、もしくは-ハロ
    ゲン、-S-(C1-C6)-アルキル、-(C1-C6)-アルコキシ、-NR5R6、-COR11、-NH-CONR 5 R6、-NH-CSNR5R6、及び-[O-(CH2)r]s-NR5R6からなる群より選択された1個以上
    の部分により置換されている。)。）。
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