KR20100123904A - 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 포함하는 프라이머를 이용한 표적증폭 및 서열분석 - Google Patents

삼중나선구조 형성 단량체 단위를 포함하는 프라이머를 이용한 표적증폭 및 서열분석 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 올리고뉴클레오티드에 도입하면 놀랍게도 상기 올리고뉴클레오티드에 다수의 유리한 특성이 제공됨을 발견하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 융점 조절이 가능하고 향상된 서열 특이성을 가지며 이중가닥의 핵산과의 후그스틴 또는 역-후그스틴 염기쌍에 의해 삼중나선구조를 형성할 수 있어 유리하다. 게다가 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 일부는 유용한 형광특성을 가지며, 삼중나선구조 형성 단량체를 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드는 프라이머 연장과 같은 효소 조작을 위한 기질로서 사용할 수 있다

Description

삼중나선구조 형성 단량체 단위를 포함하는 프라이머를 이용한 표적증폭 및 서열분석{TARGET AMPLIFICATION AND SEQUENCING WITH PRIMERS COMPRISING TRIPLEX FORMING MONOMER UNITS}
본 발명은 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 포함하는 프라이머를 이용한 표적증폭 및 서열분석에 관한 것이다.
핵산의 검출, 표적증폭 및 서열분석은 분자생물학, 연구뿐 아니라 임상 진단에서도 중추적인 방법들로, 이러한 방법들에서 중요한 분석용 물질은 프라이머 및/또는 탐침으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드이다.
프라이머와 탐침에 있어 중요한 주요 특징에는 이들의 서열 특이성과 또한 상보적 핵산에 대한 친화성이 있다. 이들 특징은 올리고뉴클레오티드의 내인성 인자와 외인성 인자에 의해 조절될 수 있다. 내인성 인자의 예를 들면 올리고뉴클레오티드의 길이와 핵산 서열조성이 있다. 합성 뉴클레오티드 또는 주쇄 변형의 사용 또한 내인성 인자이다. 그러나 이용가능한 합성 뉴클레오티드와 주쇄 단위의 수는 제한되어 있다. 따라서 분자 생물학 방법에서 사용할 수 있는 신규한 변형부를 갖는 올리고뉴클레오티드가 요구되고 있다.
특허출원 WO 2006/125447은 화학식 Z의 삼중나선구조(triplex) 형성 단량체 단위(후술됨)를 기재하고 이중가닥의 핵산을 가진 삼중나선구조 형성과 관련하여 삼중나선구조 형성 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 유리한 특성을 설명하였다. 상기 삼중나선구조 형성 특성을 근거로 상기 특허출원의 발명자들은 상기 올리고뉴클레오티드를 검출, 진단 및 치료용으로 사용하는 것을 제안하고 있다. 이러한 용도에 대한 상세한 설명 또는 데이터는 제공하지 않았다.
필리체프 등(Filichev VV, 2005)은 WO 2006/125447과 동일한 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 기재하였고 상기 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 도입하면 평행형 이중나선구조(duplex)와 평행형 삼중나선구조를 안정화시킨다는 것을 발견하였다. 게다가 이들은 삼중나선구조 형성 단량체 단위를 올리고뉴클레오티드에 삽입시켰을 때 천연 올리고뉴클레오티드에 비해 왓슨-크릭형(Watson-Crick type) RNA/DNA와 DNA/DNA 이중나선구조를 불안정화시킨다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 삼중나선구조 형성 단량체 단위(본 명세서에서는 TINA 단량체라고도 함)를 올리고뉴클레오티드에 도입하면 놀랍게도 상기 올리고뉴클레오티드에 다수의 유리한 특성이 제공됨을 발견하였다. 게다가 본 발명자들은 삼중나선구조 형성 단량체를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 프라이머 연장과 같은 효소 조작을 위한 기질로서 사용할 수 있음을 발견하였다.
이에 본 발명의 제1 양태는 화학식 Z의 하나 이상의 TINA 단량체를 포함하는 길이가 5 내지 60 nt(뉴클레오티드)인 올리고뉴클레오티드로서 상기 TINA 단량체(들)는 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어진 위치에 있는 올리고뉴클레오티드이다.
이러한 뉴클레오티드는 다양한 분자 생물학적 방법에서 사용될 수 있다.
이에 본 발명의 제2 양태는, a. 주형(template) 핵산을 제공하는 단계와, b. 제1 프라이머를 제공하는 단계와, c. 중합효소를 제공하는 단계와, d. 뉴클레오티드 삼인산(triphosphate)을 제공하는 단계와, e. 단계 a-d의 성분들을 혼합하고 상기 프라이머가 상기 주형에 결합(anneal)될 수 있는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 방법으로서 상기 프라이머는 바람직하게는 본 발명의 올리고뉴클레오티드인 방법이다.
상기 단계들은 서열분석 반응, 전사 반응 또는 핵산 표적증폭법(NAT)-예를 들면 중합효소 연쇄반응(PCR), 핵산서열 기반 증폭(NASBA), 전사 매개 증폭(TMA), 가닥 치환 증폭(SDA) 또는 리가아제 연쇄반응(LCR)-과 같은 분자 생물학 기술의 일부일 수 있다. 상기 단계가 NAT 반응의 일부인 경우, 이 NAT 반응을 수행하여 상기 주형 핵산의 표적 영역을 간단히 증폭시킬 수 있다. 이와 달리, NAT를 수행하여 상기 주형 핵산의 표적 영역의 양을 정량적으로 측정할 수 있다. 정량 NAT(예. PCR) 반응은 본 발명의 올리고뉴클레오티드일 수 있는 검출 탐침을 포함할 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 융점 조절이 가능하고 향상된 서열 특이성을 가지며 이중가닥의 핵산과의 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역-후그스틴 염기쌍에 의해 삼중나선구조를 형성할 수 있어 유리하다. 게다가 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 일부 실시형태는 유용한 형광특성을 갖는다.
도 1: IH-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기를 함유하는 중간삽입 핵산 단량체의 합성.
도 2: 소노가시라형(Sonogashira type) 변형부를 함유하는 중간삽입 핵산 단량체의 합성.
(i) Pd(PPh3)4, CuI, DMF/Et3N, Ar을 이용하는 8과 3의 반응 또는 9와 2의 반응, (ii) 32% NH4OH 또는 트리스(2-아미노에틸)아민의 50% 에탄올 용액, 상온에서 2시간 후 55℃에서 밤새, (iii) RP-HPLC; 80% AcOH 수용액, 3 M AcONa 수용액, 99% EtOH.
도 3: (R)-l-O-페닐메틸글리세롤의 파라- 및 오르토-위치로 2- 및 4-에티닐피렌의 합성 및 이들을 올리고뉴클레오티드로 도입
합성 시약과 조건: i) H2(160atm), 10% Pd/C, EtOAc, 6O℃, 24시간; ii) Ac2O2, AlCl3, CH2Cl2, 5℃; iii) 2,3-디클로로-5,6-디시아노-l,4-벤조퀴논(DDQ), 톨루엔, 110℃, 1시간; iv) DMF, POCl3; v) KOH, 디옥산, 환류, 2시간.
도 4: lH-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기.
본 발명의 올리고뉴클레오티드
제1 양태에서, 본 발명은 화학식 Z의 하나 이상의 TINA 단량체를 포함하는 길이가 5 내지 60 nt이며 상기 TINA 단량체는 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어진 위치에 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
길이가 8 내지 50 nt인 것이 더 더욱 바람직하고 10 내지 40 nt인 것이 가장 바람직하다.
삼중나선구조 형성 단량체 단위 Z
Z는 하기 일반구조에 의해 기재될 수 있다:
X-L- I 1 -C- I 2
상기 식에서 X는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 PNA 또는 PNA 유사체의 주쇄에 도입될 수 있는 주쇄 단량체 단위이고, L은 링커이며, I1은 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기(nucleobase)와 함께 적층(co-stacking)할 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계(conjugated system)를 포함하는 제1 중간삽입기이고, C는 선택적인 공액기이며, I2는 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기와 적층할 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계를 포함하는 제2 중간삽입기이다.
연성 염기적층(basestacking) 단량체(Z)는 필요한 구조적 강성과 꼬임 연성을 제공하는 공액기 C에 의해 연결되는 2개 이상의 삽입계 I1 및 I2를 포함한다. 꼬임 연성은 핵산 나선구조 내부의 적절한 위치에 중간삽입기가 위치되도록 돕는 중요한 특성인 것으로 판단된다.
바람직한 실시형태에서, 주쇄 X는 DNA, RNA, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2'-NH)-TNA, (3'-NH)-TNA, α-L-리보-LNA, α-L-크실로-LNA, β-D-리보-LNA, β-D-크실로-LNA, [3.2.1]-LNA, 비시클로-DNA, 6-아미노-비시클로-DNA, 5-에피-비시클로-DNA, α-비시클로-DNA, 트리시클로-DNA, 비시클로[4.3.0]-DNA, 비시클로[3.2.1]-DNA, 비시클로[4.3.0]아미드-DNA, β-D-리보피라노실-NA, α-L-릭소피라노실-NA, 2'-R-RNA, 2'-OR-RNA, 2'-AE-RNA, α-L-RNA, β-D-RNA과 이들의 조합체 및 변형체의 올리고뉴클레오티드로 도입될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 주쇄 단량체 단위 X는 경우에 따라 글리콘과 같은 고리계에 부분적으로 포함되는 알킬렌디올을 갖는 에틸렌글리콜 또는 1-O-메틸렌글리세롤과 같은 알킬렌디올을 포함한다. 예를 들면, 주쇄 단량체 X는 결과적으로 질소, 황, 인과 산소로부터 선택되는 헤테로원자를 갖는 4, 5 또는 6원 고리의 일부일 수 있다. 바람직하게는, 상기 알킬렌디올은 상기 올리고뉴클레오티드의 인접한 단량체 단위를 직접 연결하며, 이 실시형태에서는 상기 알킬렌디올이 여전히 예를 들면 글리콘과 같은 고리계의 일부일 수 있음은 물론이다.
일 실시형태에서, 상기 연성 염기적층 단량체의 링커 L은 0-60 개의 원자를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, L은 사슬 또는 고리 또는 이들의 조합체 및/또는 이들의 치환체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, L은 알킬 사슬 또는 옥사알킬 사슬 또는 아자알킬 사슬 또는 티아알킬 사슬 또는 카복사미드기 또는 티오카복사미드기 또는 설폰아미드기 또는 이들의 조합체를 포함한다.
X와 L의 조합은 핵산 염기와 적층할 수 있는 능력에 의해 I1-C-I2의 중간삽입계를 핵산 나선구조의 중심부에 위치시키는 계를 제공한다.
상기 연성 염기적층 단량체의 I1은 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기와 함께 적층될 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계를 포함하는 제1 중간삽입기이다.
일 실시형태에서, I1은 경우에 따라 벤젠, 나프탈렌, 아줄렌, 비시클릭 헤테로방향족 고리계 및 이들의 치환체로 이루어진 군으로부터 선택되는 모노시클릭 또는 폴리시클릭 방향족 고리계이다.
바람직한 실시형태에서, I1은 상기 모노시클릭 또는 폴리시클릭 방향족 고리계의 1,2 위치에 L과 C가 있도록 위치된다.
또 다른 실시형태에서, I1은 상기 모노시클릭 또는 폴리시클릭 방향족 고리계의 1,3 위치에 L과 C가 있도록 위치된다.
또 다른 실시형태에서, I1은 상기 모노시클릭 또는 폴리시클릭 방향족 고리계의 1,4 위치에 L과 C가 있도록 위치된다.
보다 바람직한 실시형태에서, I1은 오르토- 또는 파라-위치에 L과 C가 있는 벤젠고리이다.
상기 연성 염기적층 단량체의 C는 선택적인 공액기이다. C가 선택적이지 않은 바람직한 실시형태에서, C는 1 내지 12개의 탄소를 가진 알킬, 2 내지 12개의 탄소를 가진 알케닐, 2 내지 25개의 탄소를 가진 알키닐 또는 디아조 또는 길이가 25개 이하의 탄소 및/또는 질소 원자인 이들의 조합체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 연성 염기적층 단량체는 공액기를 함유하지 않는다. 따라서 I1과 I2는 예를 들면 공액계를 통해 직접 연결될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, C는 결과적으로 질소, 황, 인과 산소로부터 선택되는 헤테로원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 또는 모노시클릭 방향족 고리 및 이들의 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시형태에서, C의 알케닐은 아세틸렌 또는 아세틸렌이 반복되는 알케닐이다.
바람직한 실시형태에서, 인 원자를 포함하는 주쇄 단량체 단위 X의 단위 길이는 상기 주쇄 단위 길이를 1개의 단량체로부터 다음 단량체에 이르는 가장 짧은 거리라 할 때 6개 미만의 원자이다.
바람직한 실시형태에서, 연결기 L은 2 이상의 원자의 길이를 가지며 최종적으로는 질소, 황, 인과 산소로부터 선택되는 헤테로원자를 갖는다. 연결기 L의 길이는 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개 원자의 길이를 갖는다. 가장 바람직한 실시형태에서, 상기 연결기는 X와 I1 사이에 5개 결합에 해당하는 3개 원자의 길이를 갖는다.
상기 연성 염기적층 단량체의 I2는 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기와 함께 적층될 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계를 포함하는 제2 중간삽입기이다.
바람직한 실시형태에서, I2는 비시클릭 방향족 고리계, 트리시클릭 방향족 고리계, 테트라시클릭 방향족 고리계, 펜타시클릭 방향족 고리계 및 이들의 헤테로방향족 유사체 및 이들의 치환체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, I2는 lH-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기 또는 피렌이다(도 4).
바람직한 실시형태에서, 상기 연성 염기적층 단량체는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 일부이다.
바람직한 또 다른 실시형태에서, 상기 연성 염기적층 단량체는 올리고뉴클레오티드로 도입되기에 적합하다.
바람직한 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드로 도입되기에 적합한 상기 연성 염기적층 단량체는 포스포로아미다이트, 포스포르디아미다이트, 포스포르디에스테르, 포스포르트리에스테르, 포스포네이트, H-포스포네이트, 포스파이트, 클로로포스파이트, 클로로포스포르아미다이트, 포스폰아미다이트, 포스폰클로리다이트, 트리포스페이트, 디포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
가장 바람직한 실시형태에서, 상기 연성 염기적층 단량체(Z)는 하기 식으로 기재될 수 있다:
Figure pct00001
상기 식에서 R은 아릴에티닐, 피렌에티닐 및 IH- 페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 벤젠의 오르토, 메타 또는 파라 위치에 치환될 수 있다. 오르토와 파라 위치가 보다 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 실시형태들
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 놀랍게도 각종 유익한 용도를 갖는다는 것은 본 발명의 다른 양태와 실시예로부터 명백할 것이다. 이러한 뉴클레오티드의 주용도는 핵산 표적증폭(예. PCR) 또는 핵산 서열분석과 같은 분자 생물학 기술에서의 프라이머 연장이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7개의 TINA 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수 개의 TINA 단량체를 포함하며 상기 TINA 단량체는 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어진 위치에 있다. 즉, 상기 뉴클레오티드의 제1단량체는 TINA 단량체가 아니다.
바람직하게는, 상기 TINA 단량체는 서로 인접하여 위치하지 않는 바, 즉 상기 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드 단량체에 의해 분리된다. 2 또는 3개의 뉴클레오티드 단량체 단위에 의해 분리되는 것이 더 더욱 바람직하다. 각각 1/2 나선 회전 또는 1 나선 회전에 해당하는 5 또는 6 또는 10, 11 또는 12개의 뉴클레오티드 단량체 단위에 의해 분리되는 것이 보다 바람직하다.
중합효소는 전형적으로 상기 주형에 결합된 프라이머의 특성을 감지하므로 상기 TINA 단량체는 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어져 위치한다. 그렇지 않은 경우, 중합효소는 프라이머로서 상기 올리고뉴클레오티드를 수용하지 않을 것이다. 허용가능한 위치는 중합효소 마다 다를 수 있다.
이에 따라 바람직한 실시형태에서, 상기 TINA 단량체는 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 2개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 3개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 4개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 5개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 6개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 7개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 8개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 9개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 10개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 11개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 12개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 13개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치, 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 14개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치 및 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 15개 이상의 단량체만큼 떨어진 위치로 이루어진 군으로부터 선택되는 위치에 있다.
상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 6개 이상의 단량체만큼 떨어져 위치하는 것이 가장 바람직하다.
또 다른 실시형태에서, 상기 TINA 단량체 단위는 상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단으로부터 4, 3, 2 및 1개의 단량체만큼 떨어진 위치와 같이 상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단으로부터 5개 이하의 단량체만큼 떨어진 위치에 있다. 일 실시형태에서, 상기 TINA 단량체는 상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 위치한다.
바람직하게는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 DNA 단위, RNA 단위, LNA 단위와 2'-OH-변형 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는 단량체 단위를 더 포함한다. 단량체 단위라는 용어가 올리고뉴클레오티드의 반복단위, 즉 전형적으로 뉴클레오티드에 대해 사용됨을 이해할 것이다. 단량체 단위는 PNA 단량체(펩티드 핵산 단량체)일 수도 있다.
LNA 단량체, PNA 단량체 또는 2-OH-변형 단위와 같은 합성 단량체 단위를 도입하여 상보 주형 가닥에 혼성화된(hybridized) 상기 올리고뉴클레오티드의 융점을 증가시키는 것이 바람직할 것이다. 상보 주형 가닥에 혼성화된 상기 뉴클레오티드의 융점을 감소시키기 위해 일부 단량체 단위가 사용될 수도 있다. 세포 추출물에서 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하고자 하는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드의 효소 분해를 예방하거나 감소시키기 위해 변형 단량체 단위를 사용할 수도 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 미변형 RNA 단량체 단위를 포함하지 않는다. 올리고뉴클레오티드 내 RNA 단량체 단위가 존재하면 안정성을 저하, 즉 핵산분해에 의한 상기 올리고뉴클레오티드의 분해를 보다 쉽게 할 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3'말단에서 인접한 3개의 데옥시뉴클레오티드로 이루어진 연장부를 포함하여 적절한 중합반응이 개시되도록 한다. 이러한 중합반응 개시는 일부 DNA와 RNA 중합효소가 상기 프라이머의 3' 영역 말단에서 DNA 단량체에 대한 요건을 갖기 때문에 바람직하다. 그러나 대부분의 중합효소는 이 요건을 갖지 않는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 제한 부위를 포함할 수 있다. 제한 부위는 제한 효소가 상기 올리고뉴클레오티드를 개열(cleavage)할 수 있는 서열이다. 상기 제한 서열은 전형적으로 회문식(palindromic) 서열이고 상기 제한 효소는 전형적으로 이중 가닥의 핵산을 개열시키므로 상기 뉴클레오티드 제한효소 분해에 대한 상보적 올리고뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하여야 한다. 일부 제한 효소는 단일가닥 핵산을 효소분해할 수도 있다. 제한 효소의 예로는 EcoRI, BamHI와 XhoI가 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 중합효소 연쇄반응(PCR)을 위해 사용되는 경우, 제한 부위는 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 도입되어 PCR-산물의 복제를 용이하게 할 수 있다. 상기 제한 부위는 정상적으로는 상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단에 존재할 것이다.
표지
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포터 염료(reporter dye)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 리포터 염료는 FAMTM, TETTM, JOETM, VICTM, SYBR® Green, 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, Fluorescein, Cy3, Cy5, Cy5.5, Texas Red, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red, 6-CarboxyRhodamine 6G, Alexa Fluor, Oregon Green 488, Oregon Green 500과 Oregon Green 514로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드는 또한 소멸 염료(quenching dye)를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 소멸 염료는 TAMRATM, Black Hole QuencherTM, DABCYL, BHQ-I, BHQ-2, DDQ I, DDQ II 및 Eclipse Dark Quencher로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드가 프라이머로서 사용되는 경우와 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 NAT 과정 도중 또는 후에 검출 탐침으로서 사용되는 경우 리포터 염료와 소멸 염료의 사용은 다양한 종류의 정량화를 가능하게 하기 때문에 바람직하다.
전형적으로, 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에서 서로 근접 위치함으로써 상기 리포터 염료에 의해 방출되는 레이저-유도 형광이 상기 소멸 염료에 의해 소멸되도록 한다. 상기 올리고뉴클레오티드가 상보적 주형 가닥에 결합할 때 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 서로 분리되어 상기 소멸 염료가 더 이상 리포터 염료로부터의 신호를 소멸시키지 않는다.
이에 따라 일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 소멸 염료와 리포터 염료가 스템(stem)에 근접하는 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 소위 분자 비콘(molecular beacon)이라고 한다. 상기 분자 비콘이 주형 가닥과 염기쌍을 이루면 상기 소멸 염료와 리포터는 더 이상 근접하지 않는다. 따라서 상기 리포터 염료로부터의 레이저-유도 신호는 더 이상 소멸되지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 소위 전갈 프라이머(scorpion primer)라 한다. 상기 전갈 프라이머는 연장시 다시 접혀지는 스템-루프를 포함한다. 이에 의해 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 더 이상 근접하지 않게 되고 상기 리포터 염료로부터의 신호는 더 이상 소멸되지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 2개의 상이한 올리고뉴클레오티드에 존재한다. 이 실시형태에서, 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 상기 2개의 올리고뉴클레오티드가 주형 가닥의 인접한 부위와 염기쌍을 이루게 되면 근접하게 된다. 바람직하게는, 상기 2개의 올리고뉴클레오티드는 3개 이하의 뉴클레오티드를 사이에 두고 분리된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 소위 타크만 탐침(taqman probe)이라 한다. 상기 타크만 탐침은 상기 주형 핵산의 2개의 프라이머 결합 부위 사이의 영역에 대해 상보적이어서 이 영역과 염기쌍을 형성한다. 중합효소가 프라이머를 연장시키면 상기 타크만 탐침을 만나게 되고 5-3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 상기 타크만 탐침을 효소분해시킬 것이다. 이로 인해 상기 타크만 탐침의 리포터 염료와 소멸 염료는 서로 분리된다.
리포터 염료와 소멸 염료를 사용하는 대신에 공여 형광발색단(donor fluorophor)과 수용(acceptor) 형광발색단을 포함하는 소위 FRET(형광 공명 에너지 전이)쌍이 사용될 수 있다. 외부 광원에 의해 상기 공여 형광발색단의 여기시 상기 공여 형광발색단은 상기 수용 형광발색단을 여기시키는 파장의 빛을 방출하고 이어서 상기 수용 형광발색단은 검출 및 측정될 수 있는 상이한 파장의 빛을 방출한다. 상기 공여 형광발색단과 수용 형광발색단이 근접하는 경우에는 상기 공여 형광발색단으로부터 수용 형광발색단으로 에너지가 전이될 뿐이다.
바람직한 FRET 쌍은 BFP-YFP, CFP-YFP, GFP-DsRed, GFP-Cy3, GFP- mOrange, YFP-RFP, FAM-ROX, FAM-Cy5, FAM-Hex, FAM-TAMRA와 Cy3-Cy5을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열, T3 RNA 중합효소 프로모터 서열 또는 SP6 RNA 중합효소 프로모터 서열과 같은 RNA 프로모터 서열을 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 상기 상보적 주형 가닥에 혼성화되고 상기 주형 가닥의 RNA 중합효소 매개 RNA 전사를 지시할 수 있기 때문에 중요하다. 이에 따라 상기 올리고뉴클레오티드는 전사 매개 증폭(TMA) 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 방법
본 발명의 제2 양태는, a. 주형 핵산을 제공하는 단계와, b. 제1 프라이머를 제공하는 단계와, c. 중합효소를 제공하는 단계와, d. 뉴클레오티드 삼인산을 제공하는 단계와, e. 단계 a-d의 성분들을 혼합하고 상기 프라이머가 상기 주형에 결합될 수 있는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 방법이다.
제1 프라이머는 제1 양태의 실시형태에 기재한 올리고뉴클레오티드인 것이 바람직하다. 제2 양태의 방법에 대한 다양한 실시형태는 제1 양태에 기재한 올리고뉴클레오티드의 상이한 실시형태를 필요로 할 수 있거나 필요로 할 것임은 명백할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은:
f. 프라이머 연장이 가능한 조건하에서 상기 주형에 결합된 제1 프라이머를 연장하는 단계를 더 포함한다.
보다 상세히 후술되어 있는 또 다른 실시형태에서, 상기 프라이머는 연장되지 않는다. 대신에 상기 주형 핵산과 염기쌍을 형성하는 프라이머는 RNA 전사를 가능하게 한다. 따라서 상기 프라이머는 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함한다.
핵산 서열분석
바람직한 실시형태에서, 상기 프라이머는 형광 표지된다.
또 다른 실시형태에서, 상기 뉴클레오티드 삼인산의 일부는 디데옥시뉴클레오티드 삼인산으로 이루어진다. 바람직한 실시형태에서, 상기 포함된 디데옥시뉴클레오티드 삼인산은 형광 표지되고, 바람직하게는 상이한 형광 표지자로 형광 표지된다. 형광 프라이머 또는 형광 표지된 디데옥시뉴클레오티드의 사용은 핵산 서열분석에 유용하다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
관련 실시형태에서, 파이로 서열분석(pyrosequencing)에서는 표지가 불필요하므로 프라이머 또는 디데옥시뉴클레오티드 어느 것도 형광 표지하지 않는다.
표적증폭
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은,
g. 단계 f의 제1연장 산물에 대해 상보적인 제2 프라이머를 제공하는 단계와, h. 단계 f의 산물을 탈활성시키는 단계와, i. 프라이머 연장이 가능한 조건하에서 제1연장 산물에 결합된 제2 프라이머를 연장하는 단계를 더 포함한다.
따라서 단계 g-i는 제2가닥 합성이라 할 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 주형 핵산은 RNA이므로 상기 중합효소는 역전사효소이다.
바람직한 실시형태에서, 제2 프라이머는 본 발명의 올리고뉴클레오티드이고 또 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 프라이머는 모두 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다.
탈활성, 결합 및 연장 단계의 반복 순환주기는 표적 서열의 증폭을 가능하게 하며 PCR(중합효소 연쇄반응)로서 인식될 것이다.
바람직하게는, 탈활성, 결합 및 연장 단계는 10회 이상 반복 실시된다. 전형적으로는 30-45회 실시된다.
온도 순환시 상기 중합효소가 열안정한 것이 중요하다. 그렇지 않은 경우, 각 탈활성 단계 후 중합효소를 첨가하여야 할 것이다.
전사 매개 증폭(TMA)
언급한 바와 같이, 본 발명의 일 실시형태는 전사를 수반한다. 따라서 제1 또는 제2 프라이머는 전사를 가능하게 하는 RNA 프라이머 서열을 포함한다. 상기 주형 핵산은 DNA이거나 RNA일 수 있다. 상기 주형이 RNA인 경우, 제1가닥 합성을 위해 역전사가 이용될 것이다. 제1가닥 합성 이후, 제2가닥 합성을 실시하여 이중 가닥의 프라이머 서열을 생성할 수 있다. 이와 달리, 제1 프라이머의 RNA 프로모터 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드를 첨가하여 이중 가닥의 프로모터 서열을 생성할 수 있다.
가닥 치환 증폭(SDA)
바람직한 실시형태에서, 상기 NAT 과정은 등온 가닥 치환 증폭반응이다. 이 실시형태에서, 상기 방법은 제3 및 제4 프라이머와 제한효소를 포함한다. 제3 및 제4 프라이머는 상기 내부 프라이머(제1 및 제2 프라이머)의 연장 산물을 치환하기 위해 사용되는 소위 완충(bumper) 프라이머이다. 상기 내부 프라이머의 연장 산물은 주형 가닥으로부터 치환시 연장을 위해 또 다른 (내부) 프라이머를 결합할 수 있다. 이 프라이머가 연장된 경우라면, 상기 이중 가닥의 산물의 한 가닥이 상기 제한효소에 의해 닉(nick)이 형성된다. 상기 내부 프라이머가 제한 부위를 포함하므로 닉 형성(nicking)을 가능하게 한다. 그러나 상기 프라이머에 변형이 존재하거나 상기 제한효소를 이용하여 원래의 프라이머(미변형 뉴클레오티드를 함유하는)를 개열시키기만 하는 변형 뉴클레오티드(예. dCTPαS)를 함유하기 때문에 가닥들 중 한 가닥만이 개열될 것이다. 상기 변형은 예를 들면 포스포로티오에이트 결합의 존재일 수 있다. 이러한 방법으로, 기하급수적인 등온 핵산 증폭이 가능해진다. 상기 프라이머의 1, 2, 3 또는 4는 본 발명의 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 4개의 프라이머 모두 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다.
리가아제 연쇄반응(LCR)
리가아제 연쇄반응(LCR)은 PCR과 유사한 DNA 증폭 방법이다. LCR은 뉴클레오티드의 중합반응을 통한 증폭산물(amplicon)을 생산한다기 보다는 상기 탐침 분자를 증폭한다는 점에서 PCR과 다르다. DNA 가닥 당 2개의 탐침이 사용되고 함께 결찰되어 단일 탐침을 형성한다. LCR은 DNA 중합효소와 DNA 리가아제 효소를 둘 다 사용하여 상기 반응을 추진한다. PCR과 마찬가지로 LCR은 상기 반응을 추진하기 위해 열 순환기(thermal cycler)를 필요로 하며 각 순환주기 후에 상기 표적 핵산분자가 이중화된다. LCR의 특이성은 PCR에 비해 더 클 수 있다. 용어 LCR은 기존의 LCR, 갭 LCR, 비대칭 갭 LCR 및 이들의 변형 형태를 모두 포함한다.
일 실시형태에서, DNA 가닥 당 상기 LCR 탐침 중 하나 이상은 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 4개의 LCR 탐침은 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다.
정량 PCR
본 발명의 목적은 정량 PCR(qPCR)을 수행하는 방법을 제공하는데 있다. 이에 따라 일 실시형태에서, 상기 반응 혼합물은 제1 또는 제2 연장 산물의 제1 및 제2 프라이머 결합 부위 사이의 영역 또는 제1 또는 제2 프라이머 결합 부위에 대해 상보적인 서열을 포함하는 검출 탐침을 더 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 상기 탐침은 상기 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 분해 활성에 의해 효소분해될 2중 표지된 탐침이다. 이러한 탐침은 타크만 탐침이라고도 한다. 상술한 바와 같이, 상기 탐침의 표지자는 전형적으로 리포터 염료 및 소멸 염료이다. 이에 따라 상기 소멸 염료는 두 표지자가 동일한 탐침에 존재하는 경우 상기 리포터 염료로부터의 신호를 소멸시킨다. 상기 탐침이 효소분해되면 상기 리포터 염료로부터의 신호는 더 이상 소멸되지 않을 것이다. 따라서 상기 리포터 염료로부터의 신호는 상기 반응에서 주형 가닥의 양과 관계가 있을 것이다. 즉, 상기 신호는 상기 증폭반응 과정을 추적하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 탐침은 스템-루프 구조를 형성할 수 있다. 상술한 바와도 같이, 리포터 염료와 소멸 염료는 사기 시스템 내에 위치되어 상기 소멸 염료가 상기 리포터 염료로부터의 신호를 소멸시킬 수 있다. 상기 탐침이 주형 가닥과 염기쌍을 형성하는 경우, 상기 리포터 염료와 소멸 염료는 분리되어 상기 리포터 염료로부터의 신호는 더 이상 소멸되지 않는다. 이러한 탐침은 분자 비콘이라 하기도 한다.
관련 탐침의 유형은 이른바 전갈 탐침이다. 이들 탐침은 실제로 프라이머로서 작용하고 연장시 다시 접혀짐으로써 상기 소멸 염료가 상기 리포터 염료로부터 분리된다. 따라서 본 발명의 방법의 제1 또는 제2 프라이머는 용이한 qPCR을 위한 전갈 탐침일 수 있다.
탐침의 리포터 염료와 소멸 염료를 분리시키는 주형 가닥을 갖는 또 다른 일례로서, 상기 주형 가닥은 이들 염료를 근접하도록 할 수도 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 표지자는 2개의 분리된 탐침에 위치될 수 있다. 이에 따라 바람직한 실시형태에서, 상기 반응 혼합물은 제1 또는 제2 연장 산물의 제1 및 제2 프라이머 결합 부위 사이의 영역에 대해 상보적인 제2 탐침을 더 포함하며, 이때 제1 및 제2 탐침은 인접한 부위와 염기쌍을 형성함으로써 하나의 탐침의 3'말단을 다른 탐침의 5'말단에 근접하도록 한다.
위에서 언급한 바대로, 리포터 염료와 소멸 염료를 사용하는 대신에 공여 형광발색단과 수용 형광발색단을 포함하는 소위 FRET(형광 공명 에너지 전이)쌍을 사용할 수 있다.
상기 언급한 검출 탐침 중 일부는 본 발명의 올리고뉴클레오티드이므로 Z 단위를 포함할 수 있다.
상기 PCR 반응 산물을 검출하기 위해 탐침을 사용하지 않고, 이중 가닥 특이적 리포터 염료가 사용될 수 있다. 따라서 바람직한 실시형태에서, 상기 반응 혼합물은 SYBR green I, SYBR green II 및 SYBR Gold와 같은 이중 가닥의 특이적 리포터 염료를 더 포함한다.
삼중나선구조 검출 탐침
바람직한 실시형태에서, 상기 반응 혼합물은 상기 연장 산물(예. PCR 산물)과 삼중나선구조를 형성할 수 있는 삼중나선구조 형성 탐침(TFO)를 더 포함한다. 상기 삼중나선구조 형성 탐침이 Z 단량체 단위를 포함하는 경우, 레이저/외부 광원-여기된 발광에 의해 삼중나선구조 형성을 직접 측정할 수 있다.
그러나 FRET 쌍을 포함하는 상기 리포터 염료계 중 일부를 삼중나선구조 형성 검출 탐침과 관련하여 사용할 수 있다. 이에 따라 바람직한 실시형태에서, 상기 삼중나선구조 형성 탐침은 분자 비콘과 유사한 스템-루프 구조를 형성할 수 있다.
또한 상술한 검출 탐침과 유사하게, 상기 반응 혼합물은 제1 삼중나선구조 탐침에 의해 형성되는 삼중나선구조에 인접한 삼중나선구조를 형성하는 제2 삼중나선구조 형성 탐침을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 삼중나선구조 형성 탐침은 각각 리포터 염료와 소멸 염료를 포함한다. 이와 다르게, 이들 삼중나선구조 형성 탐침은 바람직하게는 FRET 쌍을 포함한다.
상기 2개의 삼중나선구조 형성 탐침은 C18 링커, PEG 링커, C9, C7, C6, 시클로헥산, 시클로옥탄, 에틸렌옥사이드 또는 이의 조합체에 의해 결합될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 2개의 분리된 올리고뉴클레오티드 검출 탐침과 상기 단일-가닥의 연장 산물에 의해 삼중나선구조가 형성된다: 하나의 올리고뉴클레오티드 검출 탐침은 제1 프라이머나 제 2프라이머로부터 단일-가닥의 연장 산물과 함께 반-평형 이중나선구조를 형성하고 제2 올리고뉴클레오티드 검출 탐침은 상기 단일-가닥의 연장 산물과 제1 올리고뉴클레오티드 검출 탐침으로 이루어진 역평행형 이중나선구조와 함께 평행형 삼중나선구조를 형성한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 TFO는 Ol과 O2가 올리고뉴클레오티드이고 L이 O1과 O2 사이의 링커(예를 들어 상술한 링커)인 Ol-L-O2로서 설계된다. Ol은 제1 또는 제2 프라이머로부터 단일-가닥의 연장 산물과 함께 역평행형 이중나선구조를 형성하고 O2는 상기 반-평형 이중나선구조에서 꺽여 접혀져 평행형 삼중나선구조를 형성한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 TFO는 상기 이중-가닥 연장 산물과 함께 평행형 삼중나선구조를 형성한다.
위에서 언급한 검출 탐침 중 일부는 본 발명의 올리고뉴클레오티드이므로 화학식 Z의 TINA 단량체를 포함하여 서열 특이성이 개선되고 상보적 서열과 염기쌍을 형성하는 검출 탐침의 융점이 증가된다. 일 실시형태에서, 상기 TINA 단량체는 상기 검출 탐침의 융점을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
상기 검출 탐침이 삼중나선구조 형성 탐침인 경우, 인접한 3개 이상의 피리미딘으로 이루어진 연장부, 바람직하게는 인접한 15개 이하의 피리미딘으로 이루어진 연장부를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 또 다른 실시형태에서, 상기 검출 탐침은 인접한 3개 이상의 퓨린으로 이루어진 연장부, 바람직하게는 인접한 15개 이하의 퓨린으로 이루어진 연장부를 포함한다.
프라이머 결합의 삼중나선구조 안정화
NAT 관련 바람직한 실시형태에서, 상기 반응은 주형 가닥과 염기쌍을 형성하는 제1 프라이머와 함께 또는 주형 가닥과 염기쌍을 형성하는 제2 프라이머와 함께 삼중나선구조를 형성할 수 있는 삼중나선구조 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함한다.
따라서 상기 삼중나선구조 형성 올리고뉴클레오티드는 상기 프라이머와 주형 사이의 염기쌍을 안정화할 것이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 프라이머의 3'말단은 삼중나선구조 형성에 관여하지 않은 5개 이상의 뉴클레오티드, 7개 이상의 뉴클레오티드, 10개 이상의 뉴클레오티드, 13개 이상의 뉴클레오티드 및 16개 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수의 뉴클레오티드를 갖는다.
바람직한 또 다른 실시형태에서, 삼중나선구조 형성에 관여하지 않은 뉴클레오티드의 수는 3개 이상 25개 이하의 nt, 바람직하게는 5개 이상 20개 이하의 nt, 보다 바람직하게는 7개 이상 18개 이하의 nt이다.
프라이머와 TFO를 사용하는 또 다른 일례로서, 2개의 기능성이 동일한 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 따라서 상기 올리고뉴클레오티드의 제1 부분은 상기 주형 핵산과 역평행형 이중나선구조를 형성하고 상기 올리고뉴클레오티드의 제2 부분은 접혀져 삼중나선구조를 형성한다. 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드의 제1 부분은 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단을 포함한다. 이 올리고뉴클레오티드는 Ol과 O2가 올리고뉴클레오티드이고 L이 O1과 O2 사이의 링커인 화학식 Ol-L-O2를 가질 수 있다.
참고문헌
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게치 I 등. Synthesis of twisted intercalating nucleic acids possessing acridine derivatives. Thermal stability studies. Bioconjug Chem. 2006 Jul-Aug; 17(4):950- 7.
실시예
실시예 1
꼬인 구조의 중간삽입 핵산(TINA)은 놀랍게도 PCR에서 Ta와 ΔTa를 증가시킨다.
소개:
꼬인 구조의 중간삽입 핵산(TINA)은 후그스틴 삼중나선구조 DNA를 안정화하도록 설계된 중간삽입체이지만, 의외로 특별한 조건에서는 왓슨-크릭 역평행형 이중나선구조 형성을 안정화시킬 수도 있다. 기대하지 않았지만, TINA-DNA 프라이머가 임의의 PCR 반응 또는 그의 변형 반응(예. 고전적("종말점") 정성 PCR/RT-PCR, 고전적("종말점") 정량 PCR/RT-PCR, 실시간 정성 PCR/RT-PCR, 실시간 정량 PCR/RT- PCR)의 결합 온도(Ta)와 델타 Ta(ΔTa)를 증가시킬 수 있는지 조사할 계획이었다. 이러한 Ta와 ΔTa의 증가 효과는 2배일 것이다: Ta 증가만으로 PCR 프라이머의 비특이적 결합 확률을 감소시키고 ΔTa 증가도 마찬가지로 비특이적 결합 확률을 감소시킬 것이다. 이러한 특이적 프라이머 결합 증가는 소정 분석법의 전체 특이성을 증가시키기 위해 활용될 수 있다. 이와 다르게, 프라이머 결합의 스트린전시(stringency)를 "완화"함으로써 TINA-DNA 없이 수행한 동일한 분석법과 비교하여 특이성 저하없이 선택성을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로 실시간 PCR 반응에서 내부 탐침에 대해서도 Ta 증가만으로 PCR 프라이머가 비특이적으로 결합할 일반 확률을 감소시키고 ΔTa 증가도 마찬가지로 비특이적 결합 확률을 감소시킬 것이다.
재료와 방법:
역평행형 이중나선구조 DNA / TINA - DNA 프라이머 PCR :
덴마크 코펜하게 히비도브레 병원 임상미생물학부 분자생물학과 내부 양성 대조계를 모델 PCR계로서 선정하였다. 바다표범(seal) 알파 헤르페스 바이러스, 바다표범 포시드종(phocid) 헤르페스바이러스 1형(PhHV-I)으로부터 핵산을 다음과 같이 추출하였다: 200㎕ 바이러스 배양 현탁액을 MagNA 순수 LC 인스트루먼트(로체, cat.no. 12236931001)와 MagNA 순수 LC 총 핵산 동정 키트(로체, cat.no. 03038505001)를 조합해서 제작자의 지침에 따라 "총 NA 혈청_혈장_혈액(Total NA Serum_Plasma_Blood)" 실험과정을 이용하여 정제하였다. (간단히 요약하면, 상기 샘플 재료를 샘플 카트리지의 웰에 위치시킨다 - 상기 샘플에 용해/결합 완충액을 첨가하여 세포를 완전히 용해시키고 핵산을 방출한다 - 뉴클레아제를 탈활성화한다 - 상기 샘플에 단백질분해효소 K를 첨가하고 단백질을 효소분해시킨다 - 핵산을 카오트로픽염(chaotropic salt) 조건, 이소프로판올과 용해/결합 완충액의 높은 이온 강도에 의해 첨가된 MGP의 실리카 표면에 결합한다 - 결합된 핵산과 함께 MGP를 잔류 용해된 샘플로부터 자기적으로 분리한다 - 결합된 핵산과 함께 MGP를 세척 완충액으로 반복 세척하여 단백질(뉴클레아제), 세포막, 헤파린 또는 헤모글로빈과 같은 PCR 억제제와 같이 미결합 물질을 제거하고 카오트로픽염 농도를 감소시킨다 - 재차 결합된 전체 핵산과 함께 MGP를 잔류 샘플 찌꺼기를 함유하는 세척액으로부터 자기적으로 분리한다 - 용리 카트리지의 웰에서 상기 MGP로부터 정제된 핵산을 70℃에서 용리시키는 반면, MGP는 반응 팁에 남겨둔 다음 버린다). 정제된 핵산을 약 300,000 바이러스 카피/ml의 농도에 해당하는 100㎕ 부피에서 용리한다.
1. DNA-PCR: 먼저, PhHV-I의 3,000 카피와 상기 2개의 프라이머의 상이한 농도를 이용하여 최적화하였다(프라이머 1: 5'GGGCGAATCACAGATTGAATCT3'(서열번호: 1), 프라이머 2: 5'GCGGTTCCAAACGTACCAA3'(서열번호: 2)), MgCl2와 TAQ 중합효소. 최적 PCR 변수를 선택한 후, 최대 결합온도(Ta)를 다음과 같은 PCR 매개변수를 가진 Eppendorf MasterCyder 구배 열순환기를 이용하여 확인하였다: 94℃에서 30초, 60-72℃ 구배 2분 및 4% 아가로오스 겔 상에서 50 ㎕ PCR 산물 중 7.5㎕를 3 V/cm로 30분간 전기영동하는 후속 시각화의 42 순환주기. 이어서, 단일점 돌연변이 프라이머를 제작하고(돌연변이 프라이머 1: 5 'GGGCGAATCACAGATTGAGTCT3', (서열번호: 3), 돌연변이 프라이머 2: 5'GCGGTTCCAAACGTATCAA3', (서열번호: 4), 굵은 표시 = 돌연변이) 상기 돌연변이에 대한 ΔTa를 측정하였다.
2. TINA-PCR: 상술한 바와 같이 고전 DNA-PCR에 대한 최적 PCR 조건을 이용하여 5'TINA-DNA 프라이머(TINA 변형 프라이머 1: 5'XGGGCGAATCACAGATTGAATCT3', (서열번호: 5), TINA 변형 프라이머 2: 5'XGCGGTTCCAAACGTACCAA3', (서열번호: 6), -X=TINA)의 최대 Ta를 측정하였다. 이어서, 단일점 돌연변이 프라이머를 제작하고(TINA 변형 돌연변이 프라이머 1: 5'XGGGCGAATCACAGATTGAGTCT3', (서열번호: 7), TINA 변형 돌연변이 프라이머 2: 5'XGCGGTTCCAAACGTATCAA3', (서열번호: 8), -X=TINA, 굵은 표시=돌연변이) 상기 돌연변이에 대한 ΔTa를 측정하였다.
결과:
최적 PCR 조건:
아가로오스 겔 전기이동의 세기에 의해, PhHV-1 PCR에 대한 다음과 같은 변수의 조합을 50 ㎕ 반응 부피에서 선정하였다:
1 x 타크만 Buffer A(어플라이드 바이오시스템스), 3.5 mM MgCl2, 각 200 μM dNTP, 1U/50 ㎕ AmpliTaq Gold(어플라이드 바이오시스템스)
Ta 와 Δ Ta :
역평행형 이중나선구조 PCR: DNA-프라이머에 대한 최대 Ta는 66.5℃이었고, 돌연변이에 대한 ΔTa는 1.6℃이었다. TINA-DNA-프라이머에 대한 최대 Ta는 71.6℃이었고, 돌연변이에 대한 ΔTa는 3.5℃이었다.
결론:
역평행형 이중나선구조 PCR: TINA를 도입하였더니 최대 Ta가 5.1℃ 증가되었고(66.5℃에서 71.6℃) 단일 돌연변이에 대한 ΔTa는 1.9℃ 증가되었다(1.6℃에서 3.5℃).
실시예 2
1H-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기를 함유하는 중간삽입 핵산 단량체의 합성
중간삽입 핵산 단량체(6a,b)의 합성 경로가 도 1에 도시되어 있다. 중요한 중간체 3a,b를 미쯔노부(Mitsunobu) 조건32(DEAD, THF와 Ph3P)하에서 4-히드록시벤즈알데히드(2a) 또는 4-히드록시-1-나프탈알데히드(2b)와의 반응에 의해 (S)-2-(2,2-디메틸-l,3-디옥솔란-4-일)에탄올(1)로부터 각각 81%와 92%의 고수율로 합성하였다(도 1). 뜨거운 빙초산에서 3a,b를 페난트렌-9,10디온(4)과 초산암모늄으로 후속처리하여 단량체 6a,b를 수득하였다. 3a로부터 출발하여 상기 생성물 혼합물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피법으로 분리하여 탈보호된 (S)-4-(4-(lH-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일)페녹시)부탄-l,2-디올(6a)을 72%의 수율로 수득하였고 여전히 이소프로필리덴기로 보호된 디올(5)을 소량 수득하였다. (5)의 1H NMR 스펙트럼에서는 이미다졸 양성자의 교환에 의해 선이 넓어지는 것이 관찰되었다. 이러로 인해 C-4와 C-11에서 페난트렌 고리에서 인접한 양성자에 대해 넓은 단일항으로 나타났다. 완전 탈보호된 상태의 화합물 (S)-4-(4-(lH-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일)나프탈렌-l-일옥시)부탄-l,2-디올(6b)을 크로마토그래피법에 의해 정제하지 않고 침전법에 의해 80%의 수율로 분리하였다. 상온과 N2 분위기에서 무수 피리딘 중 화합물(6a,b)의 1급 히드록시기를 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(DMT-Cl)와의 반응에 의해 보호하였다. 실리카 겔 정제에 의해 DMT-보호된 화합물 7a,b를 각각 79%와 56%로 수득하였다. 이들 화합물의 2급 히드록시기를 무수 CH2Cl2에서 활성화합물로서 디이소프로필 암모늄 테트라졸리드의 존재하에서 2-시아노에틸 N,N,N',N'-테트라이소프로필 포스포로디아미다이트로 밤새 포스피틸레이트화하여 8a,b를 각각 86%와 81%로 수득하였다(도 1).
1H-페난트로[9,10-d]이미다졸-2-일기를 함유한 중간삽입 핵산 단량체의 합성법은 오스만(Bioorganic &Medicinal Chemistry, 2008)에서 찾아볼 수 있다.
실시예 3
소노가시라형 변형부를 함유하는 중간삽입 핵산 단량체의 합성
고상에서 후-합성형 소노가시라형 변형을 위해, 중간과 5'-말단에 (R)-l-O-(4-요오도벤질)글리세롤(8) 또는 (R)-l-O-(4-에티닐벤질)글리세롤(9)이 삽입된 ONs를 사용하였다. DMT-on ONs 8 또는 9를 가진 CPG 지지체를 에티닐아크리딘 3 또는 요오도아크리딘 2를 갖는 새로이 제조한 소노가시라 커플링 시약으로 각각 처리하였다(도 2). 두 경우 모두에서, 고상 지지체 상 동일한 생성물 10을 얻었다. 그러나 방법 B가 화합물 9를 제조하기가 용이하기 때문에 바람직하다. CPG-결합 올리고뉴클레오티드를 새로이 제조한 소노가시라 혼합물로 이중 처리하면 커플링 효율가 증가한다는 것은 이전에 밝혀졌다.
소노가시라형 변형부를 함유하는 중간삽입 핵산 단량체의 합성은 게치 등(Bioconjugate Chem, 2006)에 논의되어 있다.
실시예 4
2- 및 4-에티닐피렌의 합성과 이들 화합물의 올리고뉴클레오티드 도입
피렌(도 3에서 8)에서 친전자 치환반응은 전자가 풍부한 위치 1과 관련이 있다는 사실 때문에 2- 및 4-치환된 피렌을 제조하기는 용이하지 않다. 위치 2와 4에 치환된 피렌 유도체는 각각 4,5,9,10-테트라히드로피렌(9)과 1,2,3,6,7,8-헥사히드로피렌(10)으로부터 친전자 치환반응 후 방향족화에 의해 제조할 수 있다. 비록 10이 시중에서 구입할 수 있지만, 더 고가이다. 테트라히드로피렌(9)은 반응 전에 실리카 칼럼 크로마토그래피법에 의해 정제하거나 라니 니켈(Raney nickel)을 이용하여 황을 제거하여야 하는 시판 중인 피렌을 Pd/C 수소분해하여 제조할 수 있다. 라니 니켈에 의해 황을 제거한 피렌의 수소분해하여 9와 10의 혼합물을 수득한다(도 3). 상기 혼합물은 산화알루미늄 크로마토그래피법에 의해 쉽게 분리할 수 있다. 화합물 9와 10은 후속 아세틸화, 방향족화, 빌스마이어-하크-아놀드(Vilsmeier-Haack-Arnold) 전환과 보덴도르프 단편화(Bodendorf fragmentation)을 이용하여 해당 2-에티닐피렌(11)과 4-에티닐피렌(12)으로 전환된다.
(R)-l-O-페닐메틸글리세롤의 파라- 및 오르토- 위치에서 2- 및 4-에티닐피렌을 합성하는 방법과 이들을 올리고뉴클레오티드로 도입하는 방법에 대한 보다 자세한 논의는 필리체프 등(Chem. Eur. J, 2008)에서 찾아볼 수 있다.
<110> Quantibact A/S Lisby, Gorm <120> Target amplification and sequencing with primers comprising triplex forming monomer units <130> DIP100137DK <150> PA 2008 00366 <151> 2008-03-10 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (primer 1) <400> 1 gggcgaatca cagattgaat ct 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (primer 2) <400> 2 gcggttccaa acgtaccaa 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (Mutprimer 1) <400> 3 gggcgaatca cagattgagt ct 22 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (Mutprimer 2) <400> 4 gcggttccaa acgtatcaa 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (TINA modified primer 1) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> TINA monomer <400> 5 ngggcgaatc acagattgaa tct 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (TINA modified primer 2) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> TINA monomer <400> 6 ngcggttcca aacgtaccaa 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (TINA modified mutprimer 1) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> TINA monomer <400> 7 ngggcgaatc acagattgag tct 23 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide (TINA modified mutprimer 2) <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> TINA monomer <400> 8 ngcggttcca aacgtatcaa 20

Claims (33)

  1. 화학식 Z의 TINA 단량체를 포함하는 길이가 5 내지 60 nt인 올리고뉴클레오티드로서, 상기 TINA 단량체가 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어진 위치에 있고 Z가 하기 일반 구조에 의해 기재되는 올리고뉴클레오티드:
    X-L- I 1 -C- I 2
    상기 식에서 X는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 PNA 또는 PNA 유사체의 주쇄에 도입될 수 있는 주쇄 단량체 단위이고, L은 링커이며, I1은 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기와 함께 적층될 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계를 포함하는 제1 중간삽입기이고, C는 선택적인 공액기이며, I2는 DNA, RNA 또는 이들의 유사체의 핵염기와 함께 적층될 수 있는 하나 이상의 실질적으로 평면인 공액계를 포함하는 제2 중간삽입기임.
  2. 제1항에 있어서,
    Z가 하기 식에 의해 기재될 수 있는 올리고뉴클레오티드.

    상기 식에서 R은 아릴에티닐의 군으로부터 선택됨.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    2, 3, 4, 5, 6 및 7개의 TINA 단량체로 이루어진 군으로부터 선택되는 다수 개의 TINA 단량체를 포함하고 상기 TINA 단량체가 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 하나 이상의 단량체만큼 떨어진 위치에 있는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 단위, RNA 단위, LNA 단위와 2'-OH-변형 단위로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형 뉴클레오티드 단량체 단위를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단이 3개의 데옥시뉴클레오티드로 이루어진 인접한 연장부를 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 TINA 단량체 단위가 상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단으로부터 3개 이하의 단량체만큼 떨어진 위치에 있는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    제한 부위를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    FAMTM, TETTM, JOETM, VICTM, SYBR® Green, 6 FAM, HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, Fluorescein, Cy3, Cy5, Cy5.5, Texas Red, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red, 6-CarboxyRhodamine 6G, Oregon Green 488, Alexa Fluor, Oregon Green 500 또는 Oregon Green 514로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광발색단을 더 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  9. 제8항에 있어서,
    TAMRATM, Black Hole QuencherTM, DABCYL, BHQ-I, BHQ-2, DDQ I, DDQ II 및 Eclipse Dark Quencher로 이루어진 군으로부터 선택되는 소멸 염료를 더 포함하는 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드의 5'말단으로부터 3 이상의 뉴클레오티드만큼 또한 상기 올리고뉴클레오티드의 3'말단으로부터 3 이상의 뉴클레오티드만큼 떨어져 위치한 C18 스페이서, PEG 스페이서, C9 스페이서, C7 스페이서, C6 스페이서, 시클로헥산 스페이서, 시클로옥탄 스페이서, 에틸렌옥사이드 스페이서 또는 이의 조합체와 같은 내부 스페이서를 함유하는 올리고뉴클레오티드.
  11. a. 주형 핵산을 제공하는 단계와,
    b. 제1 프라이머를 제공하는 단계와,
    c. 중합효소를 제공하는 단계와,
    d. 뉴클레오티드 삼인산을 제공하는 단계와,
    e. a-d 단계의 성분들을 혼합하고 상기 프라이머가 상기 주형에 결합되는 조건을 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    f. 프라이머 연장이 가능한 조건하에서 상기 주형에 결합된 제1 프라이머를 연장하는 단계를 더 포함하는 방법.
  13. 제11항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 프라이머가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드인 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 프라이머 또는 뉴클레오티드 삼인산이 형광 표지되는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뉴클레오티드 삼인산의 일부가 디데옥시뉴클레오티드 삼인산인 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    g. 단계 f의 제1연장 산물에 대해 상보적인 제2 프라이머를 제공하는 단계와,
    h. 단계 f의 산물을 탈활성시키는 단계와,
    i. 프라이머 연장이 가능한 조건하에서 제1연장 산물에 결합된 제2 프라이머를 연장하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제2 프라이머가 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 올리고뉴클레오티드인 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 탈활성, 결합 및 연장 단계가 10회 이상 반복 실시되는 것을 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 중합효소가 열적으로 안정한 방법.
  20. 제11항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 또는 제2 프라이머가 전사 매개 증폭을 가능하게 하는 RNA 프로모터 서열을 포함하는 방법.
  21. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이 제3 및 제4 프라이머와 등온 가닥 치환 증폭 반응을 가능하게 하는 제한효소를 포함하는 방법.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이 상기 제1 또는 제2 연장 산물의 제1 및 제2 프라이머 결합 부위 사이의 영역에 대해 상보적인 서열을 포함하는 검출 탐침을 더 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 탐침이 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이 상기 제1 또는 제2 연장 산물의 제1 및 제2 프라이머 결합 부위 사이의 영역에 대해 상보적인 제2 검출 탐침을 더 포함하고 상기 제1 및 제2 탐침이 인접한 부위와 염기쌍을 형성하여 하나의 탐침의 3'말단을 다른 탐침의 5'말단에 근접시키는 방법.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이 SYBR green I, SYBR green II 및 SYBR Gold와 같은 이중 가닥의 특이적 리포터 염료를 더 포함하는 방법.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이 이중 가닥의 연장 산물과 삼중나선구조를 형성할 수 있는 삼중나선구조 형성 탐침을 더 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 삼중나선구조 형성 탐침이 스템-루프 구조를 형성할 수 있는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    상기 반응 혼합물이 제1 삼중나선구조 탐침에 의해 형성되는 삼중나선구조에 인접한 삼중나선구조를 형성하는 제2 삼중나선구조 형성 탐침을 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 삼중나선구조 형성 탐침이 링커에 의해 결합되는 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 삼중나선구조 형성 탐침이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드인 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 삼중나선구조 형성 탐침이 3개 이상의 피리미딘으로 이루어진 인접한 연장부를 포함하는 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 삼중나선구조 형성 탐침이 3개 이상의 퓨린으로 이루어진 인접한 연장부를 포함하는 방법.
  33. 제11항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반응이 주형 가닥과 염기쌍을 형성하는 제1 프라이머 또는 주형 가닥과 염기쌍을 형성하는 제2 프라이머와 삼중나선구조를 형성할 수 있는 삼중나선구조 형성 올리고뉴클레오티드를 더 포함하여 상기 주형 가닥에 대한 상기 프라이머의 결합을 안정화시키는 방법.
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