CN102016076A

CN102016076A - 用含有三链形成单体单元的引物进行的靶扩增和测序

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Publication number: CN102016076A
Application number: CN2009801167150A
Authority: CN
Inventors: G·里斯贝
Original assignee: Quantibact AS
Current assignee: Quantibact AS
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2011-04-13
Also published as: BRPI0909063A2; CA2717994A1; US20110076728A1; NZ588041A; DK2265729T3; EP2265729B1; CA2717994C; AU2009225119B2; KR101289164B1; US8501441B2; JP2011512850A; WO2009112032A1; JP5285090B2; EP2265729A1; ES2434542T3; PT2265729E; AU2009225119A1; KR20100123904A

Abstract

本发明人已发现三链形成单体单元掺入到寡核苷酸中意料不到地使所述寡核苷酸具有若干有利特性。所述寡核苷酸的优点在于其使得寡核苷酸的解链温度可以改变，本发明寡核苷酸具有更高的序列特异性并且可通过与双链核酸的Hoogsteen碱基配对或反向Hoogsteen碱基配对形成三链。此外，某些本发明寡核苷酸还具有有用的荧光特性，并且所述包含三链形成单体的寡核苷酸可用作酶法操作例如引物延伸的底物。

Description

用含有三链形成单体单元的引物进行的靶扩增和测序

背景技术

核酸的检测、靶扩增和测序是分子生物学、研究以及临床诊断中的关键方法，这些方法中的关键试剂为用作引物和/或探针的寡核苷酸。

对于引物和探针最重要的是它们的序列特异性以及它们对互补核酸的亲和性。这些特性可通过核苷酸的内在因素和核苷酸的外在因素进行调整。内在因素为例如寡核苷酸的长度和核酸序列组成。非天然核酸的使用或骨架修饰也为内在因素。然而，可用的非天然核苷酸和骨架单元的数量是有限的。因此，存在对可用于分子生物学方法的含有新的修饰的寡核苷酸的需要。

专利申请WO 2006/125447描述了式Z(下文所述)的三链形成单体单元，并证明了包含三链形成单体单元的寡核苷酸在与双链核酸形成三链方面的有利特性。基于所述三链形成特性，前述专利申请的发明人建议将所述寡核苷酸用于检测、诊断和治疗。这些应用的细节或数据没有提供。

Filichev等人(Filichev VV，2005)描述了与WO 2006/125447相同的三链形成单体单元，并发现通过掺入所述三链形成单体单元可稳定平行双链和平行三链。此外，他们还发现当三链形成单体单元插入到寡核苷酸中时，与天然寡核苷酸相比，Watson-Crick型RNA/DNA和DNA/DNA双链会失去稳定性。

附图说明

图1：含有1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基团的嵌入核酸单体的合成。

图2：含有薗头(Sonogashira)型修饰的嵌入核酸单体的合成。

(i)8与3或9与2的反应都使用Pd(PPh3)4、CuI、DMF/Et₃N和Ar。(ii)32％的NH₄OH或50％的三(2-氨基乙基)胺的乙醇溶液，室温2小时，然后55℃过夜。(iii)RP-HPLC；80％的AcOH的水溶液，3M的AcONa的水溶液，99％EtOH。

图3：2-和4-乙炔基芘连接到(R)-1-O-苯基甲基甘油的对位和邻位上的合成以及它们在寡核苷酸中的掺入。合成的试剂和条件如下：i)H₂(160大气压)、10％Pd/C、EtOAc、60℃、24小时；ii)Ac₂O₂、AlCl₃、Ch₂Cl₂、5℃；iii)2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ)、甲苯、110℃、1小时；iv)DMF、POCL₃；v)KOH、二噁烷、回流、2小时。

图4：1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基团。

发明内容

本发明人已发现三链形成单体单元(本文也称为TINA单体)掺入到寡核苷酸中意料不到地使所述寡核苷酸具有若干有利特性。此外，他们还已发现含有三链形成单体的寡核苷酸可用作酶法操作例如引物延伸的底物。

因此，本发明的第一方面是长度在5到60nt(核苷酸)之间的寡核苷酸，其包含至少一个式Z的TINA单体单元，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3′末端至少1个单体的位置上。

所述寡核苷酸可用于多种分子生物学方法。

因此，本发明的第二方面为一种方法，包括如下步骤：

a.提供模板核酸

b.提供一种第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

e.混合步骤a-d的组分并提供使所述引物与所述模板退火的条件

其中所述引物优选本发明的寡核苷酸。

所述步骤可为例如如下的分子生物学技术的一部分：测序反应、转录反应或核酸靶扩增方法(NAT)——例如聚合酶链式反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)或连接酶链式反应(LCR)。如果所述步骤是NAT反应的一部分，可简单地进行NAT反应以扩增所述模板核酸的靶区域。或者，可定量进行NAT以测定所述模板核酸的靶区域的量。定量NAT(例如PCR)反应可包括可以是本发明寡核苷酸的检测探针。

本发明寡核苷酸的优点在于其使得寡核苷酸的解链温度可以改变，本发明寡核苷酸具有更高的序列特异性，并且可通过与双链核酸的Hoogsteen碱基配对或反向Hoogsteen碱基配对形成三链。此外，本发明寡核苷酸的某些实施方案还具有有用的荧光特性。

具体实施方式

本发明的寡核苷酸

本发明的第一方面提供长度在5到60nt之间的寡核苷酸，其包含式Z的TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上。

更优选的长度在8到50nt之间，最优选的长度在10到40nt之间。

三链形成单体单元，Z

Z可描述为如下通用结构：

X-L-I₁-C-I₂

其中X为可掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的骨架中的骨架单体单元；L为接头；I₁为包含至少一个基本为平面共轭体系的第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠；C为任选的连接部分(conjugator)；I₂为包含至少一个基本为平面共轭体系的第二嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠。

柔性碱基堆叠单体(Z)包含由连接部分C连接的至少两个嵌入体系I₁和I₂，所述连接部分C提供了必需的结构刚性和扭转柔性。扭转柔性被认为对帮助嵌入剂将它们自身调整到核酸螺旋内的合适位置具有重要作用。

在一个优选实施方案中，所述骨架X能够掺入到如下分子的寡核苷酸中：DNA、RNA、HNA、MNA、ANA、LNA、CAN、INA、CeNA、TNA、(2′-NH)-TNA、(3′-NH)-TNA、α-L-核糖-LNA、α-L-木糖-LNA、β-D-核糖-LNA、β-D-木糖-LNA、[3.2.1]-LNA、双环DNA、6-氨基双环DNA、5-epi-双环DNA、α-双环DNA、三环DNA、双环[4.3.0]-DNA、双环[3.2.1]-DNA、双环[4.3.0]酰胺DNA、β-D-吡喃核糖-NA、α-L-吡喃木糖-NA、2′-R-RNA、2′-OR-RNA、2′-AE-RNA、α-L-RNA、β-D-RNA以及它们的组合和变体。

在另一个实施方案中，所述骨架单体单元X包含亚烷基二醇例如乙二醇或1-O-亚甲基甘油，并任选地包含部分位于一个环系统例如糖基中的亚烷基二醇。例如，所述骨架单体X可为最终含有选自氮、硫、磷和氧的杂原子的4、5或6元环的一部分。优选地，所述亚烷基二醇直接连接相邻的寡核苷酸单体单元，应理解在此实施方案中，所述亚烷基二醇仍然可为一个环系统例如糖基的一部分。

在一个实施方案中，所述柔性碱基堆叠单体的接头L含有0-60个原子。

在另一个实施方案中，L包含一条链或一个环或者它们的组合和/或它们的取代物。

在另一个实施方案中，L包含一条烷基链或氧烷基链或氮烷基链或硫烷基链或者一个氨甲酰基团或硫代氨甲酰基团或磺酰胺基团或者它们的组合。

X和L的结合提供了一个具有与核酸碱基堆叠的能力的体系，所述体系将I₁-C-I₂的嵌入体系置于核酸螺旋中心。

所述柔性碱基堆叠单体的I₁为包含至少一个基本为平面的共轭体系的第一嵌入剂，所述系统能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠。

在一个实施方案中，I₁为任选地选自苯、萘、甘菊环烃、双环杂芳环体系和它们的取代物的单环或多环芳环体系。

在一个优选实施方案中，I₁在所述单环或多环芳香环体系的1、2位上与L、C连接。

在另一个优选实施方案中，I₁在所述单环或多环芳香环体系的1、3位上与L、C连接。

在另一个优选实施方案中，I₁在所述单环或多环芳香环体系的1、4位上与L、C连接。

在一个更优选的实施方案中，I₁为在邻位或对位具有L和C的苯环。

所述柔性碱基堆叠单体的C为一个任选的连接部分。在一个C为非任选的优选实施方案中，C选自1-12个碳原子的烷基、2-12个碳原子的烯基、2-25个碳原子的炔基或重氮基或者它们的长度不超过25个碳原子和/或氮原子的组合。

在另一个实施方案中，所述柔性碱基堆叠单体不含有任何连接部分。因此，I₁和I₂可直接连接，例如通过一个共轭体系直接连接。

在另一个实施方案中，C选自直链或支链烃基或单环芳环以及它们最终含有选自氮、硫、磷和氧的杂原子的取代物。

在另一个实施方案中，所述C的烯基为乙炔基或重复的乙炔基。

在一个优选的实施方案中，包含磷原子的骨架单体单元X的单元长度小于6个原子，其中所述骨架单元长度为从一个单体到下一个单体的最短距离。

在一个优选的实施方案中，所述连接部分L的长度为至少2个原子并最终具有选自氮、硫、磷和氧的杂原子。优选地，所述连接部分L的长度在2到10个原子之间，更优选地在2到5个原子之间。在一个最优选的实施方案中，所述连接部分的长度为3个原子，对应于X和I₁之间有5个键。

所述柔性碱基堆叠单体的I₂为包含至少一个基本为平面的共轭体系的第二嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠。

在一个优选实施方案中，I₂选自双环芳环体系、三环芳环体系、四环芳环体系、五环芳环体系，以及它们的杂芳环类似物和它们的取代物。

在一个具体实施方案中，I₂为1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基团或芘(图4)。

在一个优选实施方案中，所述柔性碱基堆叠单体是寡核苷酸或寡核苷酸类似物的一部分。

在另一个优选实施方案中，所述柔性碱基堆叠单体被改造以适合掺入到寡核苷酸中。

在一个优选实施方案中，所述被改造以适合掺入到寡核苷酸的柔性碱基堆叠单体选自亚磷酰胺(phosphoramidite)、亚磷酰二胺、磷酸二酯、磷酸三酯、膦酸酯、H-膦酸酯、亚磷酸酯、氯亚磷酸酯、氯亚磷酰胺、亚膦酰胺(phosphonamidite)、亚膦酰氯(phosphonchloridite)、三磷酸酯、二磷酸酯。

在最优选的实施方案中，所述柔性碱基堆叠单体(Z)可描述为下式：

其中R选自芳乙炔基(arylethynyl)、芘乙炔基和1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基。R可在苯的邻、间或对位上被取代。更优选邻位和对位。

寡核苷酸实施方案

本发明的寡核苷酸具有多种意料不到的和有益的用途，这将通过本发明的其他方面和实施例阐明。所述寡核苷酸的一个主要应用是用于分子生物学技术例如核酸靶扩增(例如PCR)或核酸测序中的引物延伸。

在一个优选实施方案中，所述寡核苷酸包含选自1、2、3、4、5、6个和7个的多个TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上，即所述寡核苷酸的第一个单体不是TINA单体。

优选地，所述TINA单体彼此不相邻，即它们被至少一个所述寡核苷酸的核苷酸单体分隔开。更优选的是被2或3个核苷酸单体单元分隔开。更优选的是被分别对应于1/2个螺旋或1个螺旋的5或6个或者10、11或12个单体分隔开。

由于聚合酶通常可检测到与模板退火的引物的特性，因此所述TINA单体优选地位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置。否则，所述聚合酶不会接受所述寡核苷酸作为引物。可允许的位置可随着聚合酶的不同而不同。

因此，在一个优选实施方案中，所述TINA单体位于选自如下的位置上：距离所述寡核苷酸的3′末端至少2个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少3个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少4个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少5个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少6个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少7个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少8个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少9个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少10个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少11个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少12个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少13个单体、距离所述寡核苷酸的3′末端至少14个单体，以及距离所述寡核苷酸的3′末端至少15个单体。

最优选的位置是距离所述寡核苷酸的3′末端至少6个单体。

在另一个实施方案中，所述TINA单体单元位于距离所述寡核苷酸的5′末端不超过5个单体的位置上，例如距离所述寡核苷酸的5′末端4、3、2、1个单体。在一个实施方案中，所述TINA单体位于所述寡核苷酸的5′末端。

优选地，本发明的寡核苷酸还包括选自DNA单元、RNA单元、LNA单元和2′-OH-修饰单元的单体单元。如会被理解的，术语单体单元用于指寡核苷酸的重复单元，即通常为核苷酸。单体单元也可为PNA单体(肽核酸单体)。

可能需要掺入非天然单体单元例如LNA单体、PNA单体或2-OH-修饰单元以增加与互补模板链杂交的寡核苷酸的解链温度。某些单体单元也可用于降低与互补模板链杂交的寡核苷酸的解链温度。如果要将所述寡核苷酸用于细胞提取物，那么修饰的单体单元还可用于防止或减少所述寡核苷酸的酶降解。

在一个优选实施方案中，本发明的寡核苷酸不包含任何未修饰的RNA单体单元。寡核苷酸中RNA单体单元的存在经常会降低稳定性，即，使得所述寡核苷酸更易于发生溶核降解。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸在3′末端含有一段3个脱氧核苷酸的连续片段以确保聚合反应的正确起始。这是需要的，因为某些DNA和RNA聚合酶要求引物的3’末端为DNA单体。然而，大多数聚合酶没有这种要求。

本发明的寡核苷酸可包括限制性酶切位点。限制酶性切位点是使限制性内切酶能够切开寡核苷酸的序列。通常所述限制性序列为回文结构，并且通常所述限制性内切酶切开双链核酸，因此限制性消化时寡核酸应与互补寡核苷酸碱基配对。某些限制性内切酶还可消化单链核酸。限制性内切酶的实例为EcoRI、BamHI和Xhol。当使用本发明的寡核苷酸进行聚合酶链式反应(PCR)时，可将限制性酶切位点掺入本发明的寡核苷酸中以帮助PCR产物的克隆。所述限制性酶切位点经常会位于所述寡核苷酸的5′末端。

标记

本发明的寡核苷酸可包括一种报告染料。优选的，所述报告染料选自FAM^TM、TET^TM、JOE^TM、VIC^TM、

绿(

Green)、6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、得克萨斯红、若丹明、若丹明绿、若丹明红、6-羧基若丹明6G、Alexa Fluor、俄勒冈绿(Oregon Green)488、俄勒冈绿500和俄勒冈绿514。

优选地，所述寡核苷酸还包含一种淬灭染料。在一个优选实施方案中，所述淬灭染料选自TAMRA^TM、Black Hole Quencher^TM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ I、DDQ II和Eclipse Dark Quencher。

报告染料和淬灭染料的使用是需要的，因为其在NAT过程中或过程后，当本发明寡核苷酸用作引物时以及当本发明寡核苷酸用作检测探针时都可进行多种定量。

通常，所述报告染料和淬灭染料在本发明寡核苷酸中的位置相邻近，从而使得由所述报告染料发出的激光诱导的荧光被所述淬灭染料淬灭。当所述寡核苷酸与互补模板链结合时，所述报告染料和所述淬灭染料相互分离从而所述淬灭染料不再淬灭由所述报告染料发出的信号。

因此，在一个实施方案中，所述寡核苷酸能够形成茎环结构，其中使所述报告染料和所述淬灭染料在茎上相靠近。在一个实施方案中，所述寡核苷酸为所谓的分子信标。当所述分子信标与一条模板链碱基配对时，所述报告染料和所述淬灭染料不再相靠近。因此由所述报告染料发出的激光诱导的信号不再淬灭。在另一个实施方案中，所述寡核苷酸为所谓的蝎状引物(scorpion primer)。所述蝎状引物包含一个在所述引物延伸时再折叠的茎环结构。因此，所述报告染料和所述淬灭染料不再紧密接近并且由所述报告染料发出的信号不再淬灭。

在另一个实施方案中，所述报告染料和所述淬灭染料位于两个不同的寡核苷酸上。在此实施方案中，当所述两个寡核苷酸与一条模板链上的相邻位点碱基配对时，所述报告染料和所述淬灭染料彼此靠近。优选地，所述两个寡核苷酸被不超过3个核苷酸分隔开。

在另一个实施方案中，所述寡核苷酸为所谓的taqman探针。所述taqman探针与模板核酸的两个引物结合位点之间的区域互补，并因此与此区域碱基配对。当聚合酶延伸引物时，它会遇到所述taqman探针并将借助它的5′-3′外切酶活性消化所述taqman探针。因此，所述taqman探针的报告染料和淬灭染料相互分离。

可以不使用报告染料和淬灭染料，而使用包含供体荧光团和受体荧光团的所谓的FRET(荧光共振能量转移)对。当所述供体荧光团被外部光源激发时，其发出某一波长的光，所述光激发所述受体荧光团，所述受体荧光团继而发出另一不同波长的光，此光可被检测和测量。如果所述供体荧光团和受体荧光团相互紧密靠近时，能量只由所述供体转移至所述受体上。

优选的FRET对包括BFP-YFP、CFP-YFP、GFP-DsRed、GFP-Cy3、GFP-mOrange、YFP-RFP、FAM-ROX、FAM-Cy5、FAM-Hex、FAM-TAMRA和Cy3-Cy5。

在另一个实施方案中，本发明的寡核苷酸包含RNA启动子序列例如T7RNA聚合酶启动子序列、T3RNA聚合酶启动子序列或SP6RNA聚合酶启动子序列。所述寡核苷酸受到关注，因为其可与互补模板链杂交并指导RNA聚合酶介导的所述模板链的RNA转录。因此，所述寡核苷酸可用于转录介导的扩增(TMA)。

本发明的方法

本发明的第二方面为一种方法，包括如下步骤：

a.提供模板核酸

b.提供一种第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

优选地，所述第一引物为第一方面的实施方案中所述的寡核苷酸。如将被阐明的，所述第二方面的本方法的各个实施方案将需要或可能需要第一方面中所述的寡核苷酸的不同实施方案。

在一个优选的实施方案中，所述方法还包括一个如下步骤：

f.在可使引物延伸的条件下，延伸与所述模板退火的第一引物。

在下面更详细描述的另一个实施方案中，所述引物不进行延伸。相反，与所述模板核酸碱基配对的引物促使RNA转录。因此，所述引物包含RNA聚合酶启动子序列。

核酸测序

在一个优选实施方案中，所述引物被荧光标记。

在另一个实施方案中，一部分核苷三磷酸由双脱氧核苷三磷酸组成。在一个优选实施方案中，所包括的双脱氧核苷三磷酸被荧光标记，优选地被不同的荧光标记物标记。如本领域技术人员会认识到的，荧光引物或荧光标记的双脱氧核苷酸可用于核酸测序。

在一个相关实施方案中，引物和双脱氧核苷酸都没有被荧光标记，因此标记对于焦磷酸测序并不是必需的。

靶扩增

在一个优选的实施方案中，所述方法还包括如下步骤：

g.提供一种第二引物，其与步骤f的第一延伸产物互补

h.使步骤f的产物变性

i.在可使引物延伸的条件下，延伸与所述第一延伸产物退火的第二引物

因此，步骤g-i可称为第二链合成。

在一个实施方案中，所述模板核酸为RNA，因此所述聚合酶为反转录酶。

在一个优选实施方案中，所述第二引物为本发明的寡核苷酸，在另一个实施方案中，所述第一引物和第二引物都为本发明的寡核苷酸。

如果重复所述变性、退火和延伸步骤，这些循环就能实现靶序列的扩增并被认为是PCR(聚合酶链式反应)。

优选地，将变性、退火和延伸重复进行至少10次。通常进行30-45个循环。

当循环所述温度时，重要的是所述聚合酶是热稳定的。否则，将必需在每个变性步骤后添加聚合酶。

转录介导的扩增(TMA)

如前文提到的，本发明的一个实施方案涉及转录。因此，所述第一引物或第二引物包含促成转录的RNA启动子序列。所述模板核酸可为DNA或RNA。如果所述模板为RNA，那么将会使用反转录酶进行第一链合成。第一链合成后，可进行第二链合成以生成双链启动子序列。或者，双链启动子序列可通过加入与所述第一引物的RNA启动子序列互补的寡核苷酸而生成。

链置换扩增(SDA)

在一个优选实施方案中，所述NAT方法是一种等温链置换扩增反应。在此实施方案中，所述方法包括第三引物和第四引物以及一种限制性内切酶。所述第三引物和第四引物是所谓的bumper引物，所述引物用于置换内引物(所述第一引物和第二引物)的延伸产物。当所述内引物的延伸产物被从模板链上置换下来之后，它们可结合另一种用于延伸的(内)引物。当此引物进行延伸时，所述双链产物的一条链被所述限制性内切酶切开一个切口。切开切口是可以实现的，因为所述内引物包含一个限制性酶切位点。然而，因为所述引物中存在修饰，或者因为所述延伸产物含有只允许限制性内切酶切开初始引物(其含有未修饰的核苷酸)的修饰核苷酸(例如dCTPαS)，因此所述链中只有一条链会被切开，所述修饰可为例如存在硫代磷酸酯键。以这种方式，可实现指数等温核酸扩增。所述引物中的1、2、3或4种引物可为本发明的寡核苷酸。

在一个优选实施方案中，全部所述四种引物都为本发明的寡核苷酸。

连接酶链式反应(LCR)

连接酶链式反应(LCR)是一种类似于PCR的DNA扩增方法。LCR与PCR的区别在于LCR通过核苷酸的聚合反应扩增所述探针分子而不是产生扩增子。对于每条DNA链使用两个探针，所述两个探针连接在一起形成单个探针。LCR既使用DNA聚合酶又使用DNA连接酶来驱动反应。与PCR类似，LCR需要热循环以驱动反应并且每个循环都导致靶核酸分子加倍。LCR可具有较PCR更高的特异性。

术语LCR涵盖常规LCR、缺口LCR、非对称缺口LCR和它们的变型。

在一个实施方案中，每条DNA链的一类LCR探针中的至少一种为本发明的寡核苷酸。

在本发明的一个具体实施方案中，四种LCR引物都为本发明的寡核苷酸。

定量PCR

本发明的一个目标是提供一种进行定量PCR(qPCR)的方法。因此，在一个实施方案中，所述反应混合物还包括一种检测探针，所述检测探针含有与所述第一延伸产物或第二延伸产物的第一引物结合位点和第二引物结合位点之间的一个区域互补或者与所述第一引物结合位点或第二引物结合位点互补的序列。

在一个优选实施方案中，所述探针是会被所述聚合酶的5′-3′核酸外切活性消化的双标记探针。所述探针通常称为Taqman探针。如上文所述，所述探针的标记物通常为报告染料和淬灭染料。因此，如果这两种标记物存在于同一探针上，那么所述淬灭染料会淬灭由所述报告染料发出的信号。如果所述探针被消化，那么由所述报告染料发出的信号不再被淬灭。因此，由所述报告染料发出的信号会与所述反应中模板链的量相关联。即所述信号可用于跟踪所述扩增反应的过程。

在另一个实施方案中，所述探针能够形成茎环结构。也如上文所述，报告染料和淬灭染料可位于所述茎上从而使得所述淬灭染料淬灭由所述报告染料发出的信号。当所述探针与模板链碱基配对时，所述报告染料和淬灭染料被分隔开，因此由所述报告染料发出的信号不再被淬灭。所述探针通常称为分子信标。

一种相关类型的探针为所谓的蝎型探针。这些探针实际上作为引物起作用，并且在延伸时重新折叠并从而使所述淬灭染料与所述报告染料分隔开。因此，本发明方法的第一引物或第二引物可为蝎型探针以有利于qPCR。

所述模板链除了导致探针的报告染料和淬灭染料分离以外，也可导致它们相互靠近。在这样一个实施方案中，所述标记物可位于两个独立的探针上。因此，在一个优选的实施方案中，所述反应混合物还包括与所述第一延伸产物或第二延伸产物的第一探针结合位点和第二种探针结合位点之间的一个区域互补的第二探针，并且其中所述第一探针和第二探针会与邻近位点碱基配对，从而使一种探针的3’末端与另一种探针的5’末端靠近。

如上面提到的，可以不使用报告染料和淬灭染料，而使用包含供体荧光团和受体荧光团的所谓的FRET(荧光共振能量转移)对。

上述检测探针的任何一个都可能为本发明的寡核苷酸并因此含有Z单元。

可以不使用探针来检测PCR反应的产物，而使用双链特异性报告染料。因此，在一个优选实施方案中，所述反应混合物还包括双链特异性报告染料，例如SYBR绿I(SYBR green I)、SYBR绿II(SYBRgreen II)和SYBR金(SYBR Gold)。

三链检测探针

在一个优选实施方案中，所述反应混合物还包括可与所述延伸产物(例如PCR产物)形成三链的三链形成探针(TFO)。如果所述三链形成探针包含Z单体单元，那么三链形成可通过激光/外部光源激发的光发射直接测量。

然而，任一包括FRET对的上述报告染料系统都可用于三链形成检测探针。因此，在一个优选实施方案中，三链形成探针能够形成类似于分子信标的茎环结构。

与上文所述检测探针类似，所述反应混合物也可包括第二种三链形成探针，其形成与第一种三链探针形成的三链毗邻的三链。优选地，所述第一种和第二种三链形成探针分别包含报告染料和淬灭染料。或者，它们优选地包含FRET对。

所述两种三链形成探针可通过例如以下接头连接：C18接头、PEG接头、C9接头、C7接头、C6接头、环己烷接头、环辛烷接头、环氧乙烷(ethylenoxid)接头或它们的任何组合。

在另一个实施方案中，所述三链形成是由两个独立的寡核苷酸检测探针和单链延伸产物实现的：一种寡核苷酸检测探针与由所述第一引物或第二引物产生的单链延伸产物形成反平行双链，然后第二种寡核苷酸检测探针与所述由所述单链延伸产物和所述第一种寡核苷酸检测探针构成的反平行双链形成平行三链。

在另一个实施方案中，所述TFO被设计为：O1-L-O2，其中O1和O2为寡核苷酸，L为O1和O2之间的接头(例如如上所述的接头)。O1与由所述第一种或第二种引物产生的单链延伸产物形成反平行双链，然后O2折叠回所述反平行双链上形成平行三链。

在另一个实施方案中，所述TFO与所述双链延伸产物形成平行三链。

上面提及的任一检测探针都可为本发明的寡核苷酸，并因此包含式Z的TINA单体以使所述与互补序列碱基配对的检测探针具有更高的序列特异性或更高的解链温度。在一个实施方案中，所述TINA单体可用于降低所述检测探针的解链温度。

当所述检测探针为三链形成探针时，其优选地包含一段至少3个嘧啶并优选地不超过15个嘧啶的连续片段。在另一个优选实施方案中，所述检测探针包含一段至少3个嘌呤并优选地不超过15个嘌呤的连续片段。

引物退火的三链稳定性

在一个涉及NAT的优选实施方案中，所述反应还包括可与所述与模板链碱基配对的第一引物或所述与模板链碱基配对的第二引物形成三链的三链形成寡核苷酸。

因此，所述三链形成寡核苷酸将会稳定所述引物与所述模板之间的碱基配对。

在一个优选实施方案中，所述引物的3’末端具有一定数量的不参与三链形成的寡核苷酸，该数量选自至少5个核苷酸、至少7个核苷酸、至少10个核苷酸、至少13个核苷酸和至少16个核苷酸。

在另一个优选实施方案中，不参与三链形成的核苷酸的数量为至少3nt个且不超过25nt，优选地至少5nt且不超过20nt，更优选地至少7nt且不超过18nt。

作为使用引物和TFO的替代方案，这两种功能可包括在同一寡核苷酸中。因此，所述寡核苷酸的第一部分与所述模板核酸形成反平行双链并且所述寡核苷酸的第二部分折叠以形成三链。优选地，所述寡核苷酸的第一部分包含所述寡核苷酸的3’末端。此寡核苷酸可具有下式：O1-L-O2，其中O1和O2为寡核苷酸，L为O1和O2之间的接头。

参考文献

Filichev V V，P.E.(2005).Stable and selective formation ofhoogsteen-type triplexes and duplexesusing twisted intercalatingnucleic acids(TINA)prepared via postsynthetic Sonogashirasolid-phasecoupling reactions.J Am Chem Soc，Oct 26；127(42)：14849-58.

Osman A.M.A.et al.Using an aryl phenanthroimidazole moietyas a conjugated flexible intercalator toimprove the hybridizationefficiency of a triplex-forming oligonucleotide.Bioorg Med Chem.2008 Dec l；16(23)：9937-47.Epub 2008 Oct 17.

Filichev VV.et al.1-，2-，and 4-ethynylpyrenes in the structure oftwisted intercalating nucleic acids：structure，thermal stability，andfluorescence relationship.Chemistry.2008；14(32)：9968-80.

Géci I et al.Synthesis of twisted intercalating nucleic acidspossessing acridine derivatives.Thermal stability studies.BioconjugChem.2006 Jul-Aug；17(4)：950-7.

实施例

实施例1

扭转嵌入核酸(TINA)意料不到地增加了PCR中的Ta和ΔTa

介绍：

扭转嵌入核酸(TINA)是一种被设计用于稳定Hoogsteen三链DNA的嵌入剂，但意料不到的是，其还可在特定条件下稳定Watson-Crick反平行双链形成物。尽管出人意料，但仍计划研究TINA-DNA引物是否能够提高任何PCR反应或其变型(例如经典(“终点”)定性PCR/RT-PCR、经典(“终点”)定量PCR/RT-PCR、实时定性PCR/RT-PCR、实时定量PCR/RT-PCR)的退火温度(Ta)和ΔTa。这种提高Ta和ΔTa的作用是双倍的：Ta的提高本身会降低PCR引物非特异性退火的一般概率，并且ΔTa的提高也同样会降低非特异性结合的概率。这种特异性引物退火的提高可用于提高给定测定法的总特异性。或者，通过“放松”引物退火的严格性，可获得更高的灵敏度而与无TINA-DNA的相同测定法相比不损害特异性。同样，对于实时PCR反应中的内部探针，Ta的提高本身会降低PCR探针非特异性退火的一般概率，并且ΔTa的提高也会降低非特异性结合的概率。

材料和方法：

反平行双链DNA/TINA-DNA引物PCR：

作为模型PCR系统，选择了丹麦哥本哈根维厄欧医院临床微生物学科分子生物学室的阳性内对照系统(Section for MolecularBiology.Department of Clinical Microbiology，Hvidovre Hospital，Copenhagen Denmark)。海豹α疱疹病毒(seal alpha herpesvirus)、1型phocid疱疹病毒(phocid herpesvirus type 1，PhHV-1)的核酸提取如下：使用MagNA Pure LC设备(Roche，商品目录号12236931001)以“Total NA Serum_Plasma_Blood”方案结合MagNA Pure LC总核酸分离试剂盒(Roche，商品目录号03038505001)根据厂商说明书纯化200ul病毒培养物悬液(简单地说，将样品材料置于样品盒的孔中——向所述样品中加入裂解/结合缓冲液，使得细胞完全裂解并释放出核酸——将核酸酶变性——向样品中加入蛋白酶K并使蛋白消化——核酸因离液盐(chaotropic salt)条件、异丙醇和裂解/结合缓冲液的高离子强度而结合于加入的MGP的硅表面——将MGP及结合的核酸与剩余的裂解样品磁性分离——用洗涤缓冲液反复洗涤MGP及结合的核酸以除去未结合的物质如蛋白(核酸酶)、细胞膜、PCR抑制剂例如肝素或血红色，以及降低离液盐浓度——再将MGP及结合的总核酸与含有样品残片的洗涤缓冲液磁性分离——在洗脱盒的孔中将纯化的核酸在70℃下从MGP上洗脱下来，而MGP留在反应器末端并被丢弃)。以对应于约300,000病毒拷贝/ml的浓度，将纯化的核酸洗脱为100μl体积。

1.DNA-PCR：首先，使用3000拷贝的PhHV-1和不同浓度的两种引物(引物1：5′GGGCGAATCACAGATTGAATCT3′(SEQ ID NO：1)，引物2：5′GCGGTTCCAAACGTACCAA3′(SEQ ID NO：2))、MgCl₂和TAQ聚合酶进行优化。选择优化的PCR变量后，使用Eppendorf MasterCyder梯度热循环仪以及下列PCR参数确定最大退火温度(Ta)：94℃30秒，60-72℃梯度2分钟，42个循环；然后通过将50μl PCR产物取7.5μl在4％琼脂糖凝胶上在3V/cm的电压下电泳30分钟显影。随后，构建单点突变引物(突变引物1：5′GGGCGAATCACAGATTGA

TCT3′(SEQ ID NO：3)，突变引物2：5′GCGGTTCCAAACGTA

CAA3′(SEQ ID NO：4)，加粗＝突变)并测定所述突变的ΔTa。

2.TINA-PCR：使用上述对典型DNA-PCR优化的PCR条件，测定5′TINA-DNA引物(TINA修饰引物1：5′GGGCGAATCACAGATTGAATCT3′(SEQ ID NO：5)，TINA修饰引物2：5′

GCGGTTCCAAACGTACCAA3′(SEQ ID NO：6)，X＝TINA)的最大Ta。随后，构建单点突变引物(TCNA修饰的突变引物1：5′

GGGCGAATCACAGATTGA

TCT3′(SEQ ID NO：7)，TCNA修饰的突变引物2：5′

GCGGTTCCAAACGTA

CAA3′(SEQID NO：8)，X＝TINA，加粗＝突变)并测定所述突变的ΔTa。

结果：

优化的PCR条件：

通过在琼脂糖凝胶电泳上的强度，为50μl反应体积中的PhHV-1PCR反应选择了以下变量组合：

1x TaqMan缓冲液A(Applied Biosystems)，3.5mM MgCl₂，200μM每种dNTP，

1U/50μl AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)

Ta和ΔTa：

反平行双链PCR：DNA引物的最大Ta为66.5℃，突变ΔTa为1.6℃。TINA-DNA引物的最大Ta为71.6℃，突变ΔTa为3.5℃。

结论：

反平行双链PCR：TINA的掺入使最大Ta增加了5.1℃(从66.5℃到71.6℃)，并且单点突变的ΔTa增加了1.9℃(从1.6℃到3.5℃)。

实施例2

含有1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基团的嵌入核酸单体的合成。

所述嵌入核酸单体(6a，b)的合成路线示于图1。关键中间体3a，b是由(S)-2-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环-4-基)乙醇(1)通过与4-羟基苯甲醛(2a)或4-羟基-1-萘甲醛(2b)在光延条件(Mitsunobu condition)32(DEAD、THF和Ph3P)下反应而合成的，收率分别高达81％和92％(图1)。随后在热的冰醋酸酸中用菲-9，10-二酮(4)和乙酸铵处理3a，b获得单体6a，b。当从3a起始时，通过硅胶柱色谱法分离产物混合物从而以72％的收率获得脱保护的(S)-4-(4-(1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基)苯氧基)丁-11，2-二醇(6a)和少量仍被异亚丙基基团保护的对应二醇(5)。由于咪唑质子的交换，在(5)的IH1H NMR谱图中观察到了谱线增宽。这导致了菲环中C-4和C-111上的相邻质子的宽单峰。通过沉淀而不进行色谱纯化以80％的收率分离了完全脱保护的对应化合物(S)-4-(4-(1H1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基)萘-11-基氧基)丁-11，2-二醇(6b)。化合物(6a，b)的伯羟基基团通过在氮气(N2)中在和室温下在元水吡啶中与4，4′-二甲氧基三苯甲基氯甲烷(4，4’-dimethoxytrityl chloride，DMT-Cl)反应而被保护。硅胶纯化分别以79％和56％的收率获得DMT保护的化合物7a，b。这些化合物的仲羟基基团在无水CH2Cl2中和在作为活化剂的四唑二异丙基铵(diisopropyl ammoniumtetrazolide)的存在下被2-氰基乙基-N，N，N′，N′-四异丙基亚磷二酰胺进行亚磷酰化过夜，分别以86％和81％的收率获得8a，b(图1)。含有1H-菲并[9，10-d]咪唑-2-基基团的嵌入核酸单体的合成可见Osman(Bioorganic & Medicinal Chemistry，2008)。

实施例3

含有薗头型修饰的嵌入核酸单体的合成。

对于固相上的合成后薗头型修饰，使用了在中间和5′末端插入(R)-1-O-(4-碘苄基)甘油(8)或(R)-1-O-(4-乙炔基苄基)甘油(9)的ONs。用新制备的分别含有乙炔基吖啶3或碘吖啶2的薗头偶联试剂混合物处理带有被DMT保护的Ons 8或9的CPG载体(图2)。在这两种情况下，都获得在固体载体上的相同产物10。然而，优选方法B，因为化合物9的制备容易。之前已经确定，用新制备的薗头混合物两次处理CPG结合的寡核苷酸增加了偶联效率。

Gèci等人(Bioconjugate Chem，2006)讨论了含有薗头型修饰的嵌入核酸单体的合成。

实施例4

2-和4-乙炔基芘的合成及其对寡核苷酸的掺入。

2-和4-取代的芘不容易得到，因为芘(图3中的8)上的亲电取代涉及富电子的1位。2位和4位取代的芘衍生物可分别由4，5，9，10-四氢芘(9)和1，2，3，6，7，8-六氢芘(10)通过亲电取代然后芳构化而制备。尽管10是市售的，但其相当昂贵。四氢芘(9)可通过对须在反应前进行硅胶柱色谱法纯化或者在兰尼镍(Raney nickel)上除硫的市售芘进行Pd/C氢解而制备。已用兰尼镍除硫的芘的氢解生成9和10的混合物(图3)。所述混合物易于通过在氧化铝上进行色谱法而分离。化合物9和10通过使用连续的乙酰化、芳构化、维尔斯迈尔-哈克-阿诺德转变(Vilsmeier-Haack-Arnold transformation)和Bodendorf片段化而转化为相应的2-乙炔基芘(11)和4-乙炔基芘(12)。

Filichev(等人Chem.Eur.J，2008)更详尽地讨论了2-和4-乙炔基芘连接到(R)-1-O-苯基甲基甘油的对位和邻位上的合成以及它们在寡核苷酸中的掺入。

Claims

1.一种长度在5到60nt之间的寡核苷酸，其包含式Z的TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上，并且其中Z表示为如下通用结构：

X-L-I₁-C-I₂

其中X为可掺入寡核苷酸或寡核苷酸类似物或者PNA或PNA类似物的骨架中的骨架单体单元；L为接头；I₁为包含至少一个基本为平面共轭体系的第一嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠；C为任选的连接部分；I₂为包含至少一个基本为平面共轭体系的第二嵌入剂，所述体系能够与DNA、RNA或其类似物的核苷碱基共堆叠。

2.权利要求1的寡核苷酸，其中Z可表示为下式：

-其中R选自芳乙炔基基团。

3.前述权利要求任一项的寡核苷酸，包含选自2、3、4、5、6和7个的多个TINA单体，其中所述TINA单体位于距离所述寡核苷酸的3’末端至少1个单体的位置上。

4.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包括选自DNA单元、RNA单元、LNA单元和2′-OH-修饰单元的修饰的核苷酸单体单元。

5.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的3’末端包含一段3个脱氧核苷酸的连续片段。

6.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其中所述TINA单体单元位于距离所述寡核苷酸的5’末端不超过3个单体的位置上。

7.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包含限制性酶切位点。

8.前述权利要求任一项的寡核苷酸，还包含一种选自如下的荧光团：FAM^TM、TET^TM、JOE^TM、VIC^TM、

绿；6FAM、HEX、TET、TAMRA、JOE、ROX、荧光素、Cy3、Cy5、Cy5.5、得克萨斯红、若丹明、若丹明绿、若丹明红、6-羧基若丹明6G、俄勒冈绿488、Alexa Fluor、俄勒冈绿500或俄勒冈绿514。

9.权利要求8的寡核苷酸，还包含一种选自如下的淬灭染料：TAMRA^TM；Black Hole Quencher^TM、DABCYL、BHQ-1、BHQ-2、DDQ I、DDQ II和Eclipse Dark Quencher。

10.前述权利要求任一项的寡核苷酸，其含有内部间隔基例如C18间隔基、PEG间隔基、C9间隔基、C7间隔基、C6间隔基、环己烷间隔基、环辛烷间隔基、环氧乙烷间隔基或它们的任何组合，并且所述间隔基位于距离所述寡核苷酸的5’末端至少3个核苷酸并距离所述寡核苷酸的3’末端至少3个核苷酸的位置上。

11.一种方法，包括如下步骤：

a.提供模板核酸

b.提供一种第一引物

c.提供聚合酶

d.提供核苷三磷酸

e.混合步骤a-d的组分并提供使所述引物可与所述模板退火的条件。

12.权利要求11的方法，还包括：

13.权利要求11或12的方法，其中所述第一种引物为权利要求1-10任一项中所述的寡核苷酸。

14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述引物或核苷三磷酸为荧光标记的。

15.权利要求11-14任一项的方法，其中所述核苷三磷酸的一部分为双脱氧核苷三磷酸。

16.权利要求11-15任一项的方法，还包括如下步骤：

g.提供一种第二引物，其与步骤f的第一延伸产物互补

h.使步骤f的产物变性

i.在可使引物延伸的条件下，延伸与所述第一延伸产物退火的第二引物。

17.权利要求16的方法，其中所述第二引物为权利要求1-10任一项中所述的寡核苷酸。

18.权利要求17的方法，包括将变性、退火和延伸重复进行至少10次。

19.权利要求18的方法，其中所述聚合酶是热稳定的。

20.权利要求11或13的方法，其中所述第一引物和第二引物包含能实现转录介导的扩增的RNA启动子序列。

21.权利要求11-13任一项的方法，其中所述方法包括第三引物和第四引物以及一种能实现等温链置换扩增反应的限制性内切酶。

22.权利要求16-21任一项的方法，其中所述反应混合物还包括一种检测探针，其含有与所述第一延伸产物或第二延伸产物的第一引物结合位点与第二引物结合位点之间的一个区域互补的序列。

23.权利要求22的方法，其中所述探针能够形成茎环结构。

24.权利要求22的方法，其中所述反应混合物还包括与所述第一延伸产物或第二延伸产物的第一引物结合位点与第二引物结合位点之间的一个区域互补的第二检测探针，其中所述第一探针和第二探针会与邻近位点碱基配对，从而使一种探针的3’末端与另一种探针的5’末端靠近。

25.权利要求11-24任一项的方法，其中所述反应混合物还包括双链特异性报告染料例如SYBR绿I、SYBR绿II和SYBR金。

26.权利要求11-25任一项的方法，其中所述反应混合物还包括可与所述双链延伸产物形成三链的三链形成探针。

27.权利要求26的方法，其中所述三链形成探针能够形成茎环结构。

28.权利要求26的方法，其中所述反应混合物还包括第二种三链形成探针，其形成与所述第一种三链探针形成的三链毗邻的三链。

29.权利要求28的方法，其中所述第一种和第二种三链形成探针通过接头连接。

30.权利要求26-29的方法，其中所述第一种和/或第二种三链形成探针为权利要求1-10任一项所述的寡核苷酸。

31.权利要求30的方法，其中所述第一种和/或第二种三链形成探针包含一段至少3个嘧啶的连续片段。

32.权利要求30的方法，其中所述第一种和/或第二种三链形成探针包含一段至少3个嘌呤的连续片段。

33.前述权利要求任一项的方法，其中所述反应还包括三链形成寡核苷酸，所述三链形成寡核苷酸可与所述与模板链碱基配对的第一引物或所述与模板链碱基配对的第二引物形成三链，从而稳定所述引物与所述模板链的结合。