CN102666480B - 芳香族化合物、低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中2个骨架的低聚核苷酸衍生物而且能够以少的工序数容易地合成的低聚核苷酸衍生物、以及作为用于制备其低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的前体的芳香族化合物。而且，本发明提供对细胞膜的透过性良好、具有优异的核酸酶耐受性的低聚核苷酸衍生物以及低聚核苷酸构建物，所述低聚核苷酸衍生物在3’末端悬空端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中的2个骨架。所述低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的特征在于，在载体上介由连接体化学修饰有下述结构式（a）表示的单元（其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫）。
Description
技术领域
本发明涉及芳香族化合物、以及使用其的低聚核苷酸衍生物合成用脲修饰型载体、低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物。
背景技术
近年来，DNA、RNA等各种低聚核苷酸逐渐用于治疗、诊断等用途。例如，在诊断用途中，可以举出DNA芯片、DNA微阵列，在治疗用途中可以举出治疗相关基因的导入、以及由疾病相关基因的敲减（knock down）而产生的表达抑制等。而且，也进行了将与特定分子特异性结合的核酸分子、作为多肽的适体用作治疗药的尝试。
作为备受注目的核酸技术，可以举出利用RNA干扰（RNAi）的特定基因敲减法。所谓RNAi是指通过双链RNA（dsRNA）的作用，抑制与其序列相同的基因的作用的现象。由RNAi产生的基因表达的抑制如下进行：dsRNA被作为RNaseⅢ家族之一的切酶识别并切断而形成21～23聚体的siRNAs（短干扰RNA，short interfering RNAs），该siRNAs嵌入到RISC（RNA诱导沉默复合物，RNA-induced silencingcomplex）中，相同的mRNA被继续嵌入的siRNA在中央部切断，从而降解。
但是，在生物体中，外源性的DNA、RNA暴露在各种核酸酶中，尤其是RNA容易被核酸酶降解，因此存在无法充分地获得需要的敲减效果、或难以稳定地维持敲减效果这方面的问题。
为了解决该问题，对化学修饰低聚核苷酸来使核酸酶耐受性提高的方案进行了研究（非专利文献1～3）。例如，如图1所示，对于siRNA也尝试了用各种取代基对糖、碱基、磷酸酯的部位进行化学修饰（非专利文献4）。
这种状况下，如专利文献1所记载，本发明人成功地在CPG树脂上修饰用于导入苯骨架、吡啶骨架的亚磷酰胺（amidite）试剂（例如参照图2和图3）、在核苷酸的3’末端导入两个具有苯骨架、吡啶骨架的单元。该技术是考虑如下所示的RNAi的3’末端悬空端的重要作用而开发出的，能够在不降低敲减效果的情况下使低聚核苷酸的核酸酶耐受性提高。
即，作为与RNAi的靶mRNA的降解过程相关的多结构域蛋白，已知有RISC，近年来，进行了RISC中的PAZ结构域与siRNA的共晶X射线晶体结构解析（J.B．Ma.，K.Ye and D.J．Patel.，Nature.，429，318-322(2004).）。其结果明确了：PAZ结构域识别siRNA的3’末端悬空端，3’末端悬空端的2个核苷酸进入PAZ结构域的疏水性口袋从而被识别（J.J．Song.，J．Liu.，N.H．Tolia.，J．Schneiderman.，S.K．Smith.，R.A．Martienssen.，G.J．Hannon and L．Joshua-Tor.，Nat．Struct．Biol.，10，1026-1032(2003)、K.S．Yan.，S．Yan.，A．Farooq.，A．Han.，L.Zeng and M.M．Zhou.，Nature.，426，468-474(2003)、Zhang.，F.A．Kolb.，L．Jaskiewicz.，E．Westhof and W.Filipowicz.，Cell.，118，57-68(2003)和A．Lingel.，B．Simon.，E．Izaurralde andM．Sattler.，Nature.，426，465-469(2003)）。因此，基于如果化学修饰2个具有疏水性的苯骨架、吡啶骨架来代替3’末端悬空端的2个核苷酸能否提高敲减的效果这个构思，开发出在专利文献1中记载的低聚核苷酸衍生物。
应予说明，作为与本发明相关的技术，本发明人等也成功地实现了：将siRNA的3’末端悬空端的磷酸二酯键部分转换成氨基甲酸酯键、脲键，由此消除键部分的负电荷，使细胞核对膜的透过性变得良好，由此提高siRNA的核酸酶耐受性与沉默活性（非专利文献5）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2007/094135
非专利文献
非专利文献1：L.Beigelman.,J.A McSwiggen.,K.G.Draper et al.,JBiolchem 270，25702-25708(1995)27
非专利文献2：S.P.Zinnen K.Domenico.,M.Wilson et al.,RNA 8,214-228(2002)
非专利文献3：S.Agrawaland E.R.KandimaIla.,Curr.CancerDrug Targets.,1,197-209(2001)
非专利文献4：H.Hoshi,FEBS Letters 521,197-199(2002)
非专利文献5：Y.Ueno,T.Naito,K.Kawada,A.Shibata,Hye-SookKim Y.Wataya,Y.Kidade,Biochem Biophys Res Commun 330,1168-1175(2005)
发明内容
但是，在合成上述专利文献1中所记载的在3’末端化学修饰有2个苯骨架或吡啶骨架的低聚核苷酸衍生物时使用的载体的制备中，必需很多的工序，极其费时费力（例如参照图2和图3）。另外，在该载体的制备中，必须使化学上不稳定的亚磷酰胺体与键合于介由连接体键合在载体上的苯骨架或吡啶骨架上的羟甲基反应，从而存在如下问题：为了使该一系列反应成功，高度训练过的技术人员必须小心谨慎地进行。
本发明是鉴于上述以往的实际情况而完成的，其目的在于，提供可以容易地合成在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中2个骨架的低聚核苷酸衍生物、而且能够以少的工序数容易地合成的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体、以及作为用于制备该低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的前体的芳香族化合物。
而且，本发明的目的在于，提供对细胞膜的透过性良好、具有优异的核酸酶耐受性的低聚核苷酸衍生物及低聚核苷酸构建物，所述低聚核苷酸衍生物在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中的2个骨架。
在合成上述专利文献1中所记载的在3’末端化学修饰有2个苯骨架或吡啶骨架的低聚核苷酸衍生物时使用的载体的制备中，采用与在DNA、RNA的合成中使用的亚磷酰胺体相同的方法，芳香族环彼此通过磷酸二酯键连接。因此，使用化学上不稳定的亚磷酰胺体作为中间体，这就是用于合成的工序数增加、合成困难的原因。因此，本发明人等不用磷酸二酯键连接芳香族环彼此，而是变为用脲键连接。这是由于，通过采用羰基二咪唑来进行偶联，能够使由脲键进行的芳香族环彼此的连接极其容易且定量地形成。另外，对于由硫脲键进行的连接，经由由相同原料对应的异硫氰酸酯，也能使硫脲键极其容易且定量地形成。
即，本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a）表示的单元（其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫）。在R1～R6中，作为氢以外的取代基，例如可以举出烷基、芳基、卤代烷基和卤素基团等。
本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体中，芳香族环彼此通过脲键或者硫脲键连接，在末端的芳香族环上键合着羟甲基。因此，通过使多用于合成DNA、RNA的亚磷酰胺体键合在该羟甲基上，能够连接任意序列的低聚核苷酸。另外，通过采用羰基二咪唑来进行偶联，能够使由该脲键进行的芳香族环彼此的连接极其容易且定量地形成。另外，对于由硫脲键进行的连接，经由由相同原料对应的异硫氰酸酯，也能使硫脲键极其容易且定量地形成。
在此，对于载体，只要具有能够与上述结构式（a）（化学式1）表示的单元、连接体键合的官能基，则没有特别限定。作为这种载体，例如可以举出微小多孔性玻璃、多孔性玻璃等玻璃、塑料（例如聚酯树脂、聚乙烯树脂、聚丙烯树脂、丙烯腈丁二烯苯乙烯树脂、尼龙、丙烯酸树脂、氟树脂、聚碳酸酯树脂、聚氨酯树脂、甲基戊烯树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、氯乙烯树脂）等。作为载体的形状，可以是珠粒状、板状（基板状）、丝状、球状、多角形状、粉末状等任何形状。
另外，对于连接体，只要能够介由连接体将上述结构式（a）（化学式1）表示的单元与载体化学键合，则没有特别限定，例如可以使用在DNA、RNA的自动合成中通常使用的连接体。更具体而言，可以使用以下所示的琥珀酸酯连接体、草酸酯连接体、硅烷二基连接体、甲硅烷基连接体等。
上述本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体能够将下述结构式（A）表示的芳香族化合物作为前体容易地制备（其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基）。
本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，可以在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a1）表示的单元（其中，式中的R1和R2各自独立地为烷基、芳基、卤代烷基及卤素基团中的任一种，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫）。在R1和R2中，特别优选的是烷基或者氟烷基等卤代烷基。本发明人等确认了：如果采用这种低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，则能够以少的工序数容易且高收率地合成低聚核苷酸衍生物。
该低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体能够将下述结构式（A1）表示的芳香族化合物作为前体容易地制备（其中，式中的R1和R2各自独立地为烷基、芳基、卤代烷基及卤素基团中的任一种，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。另外，Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基）。在R1和R2中，特别优选的是烷基或者氟烷基等卤代烷基。
本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，可以在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a2）表示的单元。本发明人等确认了：采用这种低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，也能够以少的工序数容易且高收率地合成低聚核苷酸衍生物。
该低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体能够将下述结构式（A2）表示的芳香族化合物作为前体容易地制备。
另外，本发明的低聚核苷酸衍生物的特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式（a）所示的单元（其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者氢以外的取代基。另外，式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫）修饰。
本发明的低聚核苷酸衍生物能够将本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体作为起始物质，采用一直以来用于合成DNA、RNA的低聚核苷酸的合成法容易地合成。另外，该低聚核苷酸衍生物在3’末端具有2个芳香族环，由脲键或者硫脲键连接着芳香族环彼此。因此，3’末端显示出疏水性，从而，对细胞膜的透过性良好，并且具有优异的核酸酶耐受性。因此，即使在将本发明的低聚核苷酸衍生物放入细胞内时，也能够更长时间地持续其效果。进而认为，在RNAi中利用时，容易进入到RISC中的PAZ结构域的疏水性口袋中，从而能够提高敲减的效果。
本发明的低聚核苷酸衍生物可以用下述结构式（a1）表示的单元修饰低聚核苷酸的3’末端（其中，式中的R1和R2各自独立地为烷基、芳基、卤代烷基及卤素基团中的任一种，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。另外，Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基）。在R1和R2中，特别优选的是烷基或者氟烷基等卤代烷基。本发明人等确认了：这种低聚核苷酸衍生物具有优异的核酸酶耐受性，从而在进入到细胞内时，能够更长时间地持续RNAi的敲减效果。
进而，本发明的低聚核苷酸衍生物也可以用下述结构式（a2）表示的单元修饰低聚核苷酸的3’末端。本发明人等确认了：这种低聚核苷酸衍生物具有优异的核酸酶耐受性，从而在进入到细胞内时，能够更长时间地持续RNAi的敲减效果。
另外，对于本发明的低聚核苷酸衍生物，低聚核苷酸部分可以具有规定的基因mRNA的部分序列或者其互补序列。另外，低聚核苷酸的链长可以为10～35。进而，低聚核苷酸也可以为寡核糖核苷酸。
本发明的低聚核苷酸构建物是基因表达调节用低聚核苷酸构建物，其特征在于，具有上述任一种低聚核苷酸衍生物。该低聚核苷酸构建物可以是选自单链和双链DNA、单链和双链RNA、DNA/RNA嵌合体以及DNA/RNA杂化物中的低聚核苷酸构建物，另外，从其功能方面考虑，可以选自反基因、反义、适体、siRNA、miRNA、shRNA及核酶（リポザイム）。
另外，根据本发明，能够形成具有上述任一种低聚核苷酸衍生物的基因诊断用低聚核苷酸构建物。进而，本构建物能够形成探针或者引物。
具体实施方式
（低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体）
本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体能够以下面的方式制备。应予说明，在此所说的核苷酸是可以被改变的核苷酸。
（低聚核苷酸衍生物）
要获得本发明的低聚核苷酸衍生物，可以采用如下方法：利用本发明的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，采用以亚磷酰胺法为代表的各种核酸合成法来形成低聚核苷酸衍生物。作为羟基的保护基，没有特别限定，可以使用以往公知的各种羟基保护基。作为这种保护基，具体地可以举出苄基、乙酰基、苯甲酰基等，特别优选的保护基是苄基。另外，作为氨基的保护基，具体地可以举出邻苯二甲酸基、苯甲酰基等，特别优选为邻苯二甲酸基。
另外，在利用本发明的低聚核苷酸衍生物构建反基因、反义、适体、miRNA及核酶时，使其具备式（a）表示的单元即可。另外，在探针被固定化在固相载体上时，能够使其在成为自由端侧的一侧具备式（a）表示的单元。进而，在引物中，也可以根据需要适宜地具备式（a）表示的单元。
在本说明书中，所谓低聚核苷酸意味着将一般构成低聚核苷酸、多核苷酸的单体即核苷酸作为单体单元并具有多个该单体单元的聚合物。另外，低聚核苷酸意味着将脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸作为单体单元。一般地，作为核苷酸，将以脱氧核糖核苷酸作为单体单元的聚合物称为DNA，将以核糖核苷酸作为单体单元的聚合物称为RNA，但本发明的低聚核苷酸衍生物除包含通常被插入的DNA和RNA以外，还包含这些单体单元的低聚物。另外，低聚核苷酸也包含RNA/DNA嵌合体。另外，所谓可以被改变的低聚核苷酸，除了仅由含有属于嘌呤和嘧啶的鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、尿嘧啶或者甲基胞嘧啶等天然碱基的核苷酸形成的低聚核苷酸之外，还包含在低聚核苷酸的各种部分、即在碱基、糖部分以及磷酸酯部分实施了任何化学修饰的具有1个或者2个以上核苷酸的低聚核苷酸。
本发明的低聚核苷酸衍生物可以具有规定基因的DNA的有义链、其反义链、或mRNA的部分序列或者其互补序列。通过具有这种互补性，能够使其与各种靶核酸杂化，由此能够使低聚核苷酸衍生物呈现需要的功能。在本发明的低聚核苷酸衍生物中，对于低聚核苷酸的长度没有特别限定，可以为与用途相对应的长度，但如果考虑低聚核苷酸的合成容易性和所期待效果的发挥，则优选为10～35。另外，在反义时，可以为10～30左右，在siRNA时，A和B的合计链长优选为15～35，更优选为30以下。另外，在引物时，优选为10～30，在探针时，优选为10～30。
在将本发明的低聚核苷酸衍生物用于例如siRNA、shRNA、反义、核酶及适体时，单体单元可以是可以被改变的寡核糖核苷酸。
（低聚核苷酸构建物）
本发明的低聚核苷酸构建物具有本发明的低聚核苷酸衍生物。根据本低聚核苷酸构建物中的本低聚核苷酸衍生物的种类，本构建物可以是单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA、DNA/RNA嵌合体以及DNA/RNA杂化物等的形式或者是其组合形式。应予说明，如已经说明地，构成本低聚核苷酸衍生物的低聚核苷酸部分含有已被改变的低聚核苷酸，因此在本低聚核苷酸构建物中有时也含有改变形式的低聚核苷酸。
对于本发明的低聚核苷酸构建物，由于提高了核酸酶耐受性，因此能够用于基因表达调节用、或者研究用、诊断用的各种用途。作为基因表达调节用途，可以举出反基因、反义、适体、siRNA、miRNA、shRNA以及核酶等。尤其是在siRNA和shRNA中，对3’末端悬垂部位的dT导入式（a）表示的单元，由此能够使核酸酶耐受性和沉默活性两者提高。
作为诊断用途或者研究用途，可以举出探针和引物。探针根据设计或者选择而具有对靶核酸特异性规定的序列，在规定的严格性下，它们是以杂化方式取得的低聚核苷酸。通过在探针中使用本低聚核苷酸衍生物，可以提高核酸酶耐受性，因此，可以抑制或者避免混杂在含有靶核酸的试样中的核酸酶的影响，从而即使核酸酶的除去程度低也能够制备试样，或者省略了核酸酶除去处理也能够制备试样。由此能够简易地进行基因诊断、检查。应予说明，这种探针与靶的杂化能够将探针固定化在适当的玻璃基板、塑料制基板、珠粒等固相载体上来进行。本发明中也包括将含有本低聚核苷酸衍生物的探针固定化而成的固相载体。
（低聚核苷酸衍生物的利用）
本发明的低聚核苷酸衍生物通过构建成作为siRNA、反义等起作用，能够作为基因表达抑制剂使用。另外，本发明的低聚核苷酸衍生物能够用作人类和非人类动物的疾病的预防·治疗用医药组合物的有效成分。例如，对于伴随着基因表达的疾病，作为基因表达抑制剂而构建的本发明的低聚核苷酸衍生物对这种疾病的预防、治疗是有效的。
进而，本发明的低聚核苷酸衍生物通过构建成使其杂化功能发挥，能够用作探针、引物等检查试剂、诊断试剂。进而，将这些低聚核苷酸构建物保持在芯片、珠粒等固体载体等而得的制品能够用作检查装置、诊断装置或者它们的一部分。进而，这种检查试剂、诊断剂也能够用作与其它试剂、诊断剂或者装置等组合而成的检查用或者诊断用试剂盒。
本发明的低聚核苷酸衍生物也能够用于利用了含有本发明的低聚核苷酸衍生物的低聚核苷酸构建物的基因表达抑制作用的基因表达抑制方法。进而，也能够用于利用了本发明的低聚核苷酸构建物的杂化功能的基因检测方法。
实施例
下面，将本发明具体化的实施例详细地示于以下。
应予说明，在下述实施例中使用的仪器如下。
（使用仪器）
NMR波谱仪 JEOL JNM-α400
GC/MS SHIMADZU GCMS-QP 2010A
吸光度计HITACHI U-2001分光光度计，GE Health Science Nano Vue
DNA/RNA synthesizer Applied Biosystems Model 3400
Tm测定仪 SHIMADZU UV 2400
HPLC SPD-10AVP，SCL-10AVP，LC-10AVP，DGU-10A,CTO-10AVP，C-R8A
MALDI-TOF/MS SHIMADZU AXIMA-CFR plus
发光测定用平板读取器 ATTO Luminescenser JNRII
另外，在本说明书的实施例的说明中，有时使用以下所示的缩写。
（缩略语）
APS 过氧化硫酸铵
CPG 可控孔度玻璃
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DMTrCl 4,4’-二甲氧基三苯甲基氯
EDC 1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺
EDTA 乙二胺-N,N,N’N’-四乙酸
MALDI-TOF 基质辅助激光解吸电离飞行时间
PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳
TBAF 四丁基氟化铵
TBE tris-硼酸-EDTA
TEAA 三乙基乙酸铵
TEMED N,N,N’,N’-四甲基乙二胺
Tm 熔解温度
Tris 三（羟甲基）氨基甲烷
（实施例1）
＜脲键连接苯环与吡啶环的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成＞
在实施例1中，按以下方式合成了将苯-吡啶骨架作为母核的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体。
采用2,6-吡啶二甲醇为起始原料，在氢化钠的存在下，使其与叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）反应，由此以49%的收率合成了用TBDMS基保护一个羟基而得的甲硅烷基体1。进一步使其与四溴化碳、叠氮化钠共存，在一个工序中进行溴化、叠氮化，从而以76%的收率获得叠氮体2后，利用5%钯乙二胺复合体催化剂叠氮选择性地进行氢催化还原反应，从而以80%的收率合成了吡啶衍生物3。
另一方面，如下式所示，以3-氰基苄醇为起始物质用4,4'-二甲氧基三苯甲基氯（DMTrCl）以91%的收率得到二甲氧基三苯甲基化物4后，用氢化铝锂还原氰基，以69%的收率获得苄基氨基体5。然后，用羰基二咪唑使上述吡啶衍生物3与苄基氨基体5偶联，以43%的收率获得脲衍生物6。应予说明，在此，经由由相同原料相对应的异硫氰酸酯，能够使对应的硫脲衍生物容易且定量地形成。于是，能够由该硫脲衍生物、与以下所示的具有脲键的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体同样地合成具有硫脲键的低聚核苷酸衍生物修饰载体。
用TBAF处理通过上述方式得到的脲衍生物6，以98%的收率获得如下所示的脱甲硅烷基体7后，按照以往方法用琥珀酸酐进行丁二酰化后，在脱水缩合剂的存在下使其与CPG树脂反应，由此以38.5μmol/g的活性获得实施例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体9。
以下示出更加详细的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（9）的合成步骤。
2-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]-6-羟甲基吡啶（1）的合成
将60%NaH（1.45g，35.9mmol）溶解在DMF（60mL）中，边在冰冷却下搅拌边滴加2,6-吡啶二甲醇（5.00g，35.9mmol）的DMF（30mL）溶液。在Ar气氛下于室温下搅拌1小时后，加入叔丁基二甲基氯硅烷（6.54g，43.3mmol）的DMF（40mL）溶液，进一步搅拌12小时。通过TLC确认原料消失后，用乙酸乙酯（EtOAc）与10%碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（Hex∶EtOAc=5∶1）精制残渣，从而获得为无色油的2-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]-6-羟甲基吡啶（1）（4.46g，49%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.66(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.39(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.10(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，4.80(2H，s，CH2O)，4.71(2H，s，CH2O)，0.95(9H，s，t-C4H9S i)，0.11(6H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100MHz)
δ＝160.3，157.9，157.9，137.3，118.5，65.8，63.9，25.9，18.3，-5.4
2-叠氮甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（2）的合成
将预先真空干燥好的2-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]-6-羟甲基吡啶（1）（2.14g，8.42mmol）、叠氮化钠（2.73g，42.0mmol）、三苯基膦（2.65g，10.10mmol）、四溴化碳（3.07g，9.29mmol）的混合物溶解在DMF（64mL）中，加入三乙胺（2.64mL），在Ar气氛下搅拌25小时。通过TLC确认原料消失后，用乙酸乙酯与水萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（Hex∶EtOAc=50∶1）精制残渣，从而获得为浅黄色油的2-叠氮甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（2）（1.77g，76%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.73(1H，t，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.47(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.20(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，4.83(2H，s，CH2O)，4.44(2H，s，CH2O)，0.96(9H，s，t-C4H9S i)，0.12(6H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝161.6，154.4，137.6，120.0，119.2，65.9，55.6，25.9，18.3，-5.4
2-氨基甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（3）的合成
使2-叠氮甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（2）（0.83g，2.98mmol）、5%Pd/C(en)（83.0mg，10wt%）悬浮于甲醇（20mL）中，在氢气氛下于室温下剧烈搅拌5小时。通过TLC确认原料消失后，用桐山漏斗抽滤除去催化剂。将滤液减压蒸馏后，采用硅胶色谱法（CHCl3∶MeOH=30∶1→10∶1）精制残渣，从而获得为黄色油的2-氨基甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（3）（603mg，80%）。
δ＝7.66(1H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.37(1H，d，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.13(1H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，4.82(2H，s，CH2O)，3.94(2H，s，CH2N)，0.96(9H，s，t-C4H9Si)，0.12(6H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝160.8，160.7，136.9，119.0，117.8，65.9，47.6，25.7，18.2，-5.4
3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苯甲腈（4）的合成
将3-羟甲基苯甲腈（1.12g，8.38mmol）与4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（3.41g，10.06mmol）悬浮于DMF（23mL）和吡啶（23mL）中，在Ar气氛下于室温下搅拌12小时。通过TLC确认原料消失后，加入冰水（20mL）后，用乙酸乙酯与水萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（Hex∶EtOAc=10∶1）精制残渣，从而获得为无色油的3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苯甲腈（4）（3.31mg，91%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.23-7.68(17H，m，Ar-H)，6.84(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，4.21(2H，s，CH2O)，3.79(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.3，144.4，135.4，130.5，130.4，129.5，128.9，128.5，126.9，118.6，113.7，112.1，111.9，111.8，86.4，56.9，55.5，54.0
3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄胺（5）的合成
将LiAlH4（238mg，6.28mmol）悬浮在二乙基醚（30mL）中，边在冰冷却下搅拌边滴加3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苯甲腈（4）（0.86g，1.98mmol）的二乙基醚（90mL）溶液。在Ar气氛下于室温下搅拌16小时。通过TLC确认原料消失后，加入水（1.2mL）和甲醇（7.2mL）。进一步搅拌30分钟后，抽滤除去盐。将滤液减压蒸馏后，采用硅胶色谱法（CHCl3∶MeOH=100∶1）精制残渣，从而获得为无色油的3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄胺（5）（0.58g，69%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.21-7.52(17H，m，Ar-H)，6.83(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，4.16(2H，s，CH2O)，3.86(2H，s，CH2N)，3.79(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.4，145.0，143.2，139.6，136.2，130.0，128.4，128.2，127.8，126.7，125.7，125.6，125.4，113.1，86.3，65.5，55.1，46.5
N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲（6）的合成
将3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄胺（5）（455mg，1.04mmol）、1,1’-羰基二咪唑（170mg，1.05mmol）悬浮在THF（52mL）中，在Ar气氛下于室温下搅拌24小时。通过TLC确认原料消失后，滴加2-氨基甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶（3）（593mg，2.35mmol）的THF（13mL）溶液后，进一步搅拌48小时。将反应溶液减压蒸馏后，采用硅胶色谱法（CHCl3∶MeOH=100∶1）精制残渣，从而获得为无色油的N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲（6）（406mg，54%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.61-7.07(16H，m，Ar-H)，6.85-6.83(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，4.71(2H，s，CH2)，4.43(2H，s，CH2)，4.37(2H，s，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，3.78(6H，s，CH3O)，0.95(9H，s，t-C4H9Si)，0.10(6H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝160.6，158.4，158.2，156.4，145.0，139.7，139.1，137.4，136.2，130.0，128.5，128.1，127.8，126.7，126.2，126.0，125.9，120.0，118.3，113.1，86.4，65.8，65.4，55.2，45.6，44.5，25.9，18.3，-5.4
Mass(El)m/z：717(M+)
N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲（7）的合成
将N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲（6）（410mg，0.57mmol）悬浮在THF（2.2mL）中，边搅拌边滴加TBAF-1.0M THF（0.64mL）溶液后，在Ar气氛下于室温下搅拌4小时。通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸馏。采用硅胶色谱法（三氯甲烷∶甲醇=20∶1）精制残渣，从而获得为无色晶体的N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲（7）（336mg，98%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.52-7.02(16H，m，Ar-H)，6.82-6.80(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，4.59(2H，s，CH2)，4.39(2H，s，CH2)，4.29(2H，s，CH2)，4.13(2H，s，CH2)，3.76(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.6，158.4，157.1，144.9，139.5，139.2，137.3，136.1，130.0，128.5，128.1，127.8，126.7，126.0，125.8，125.7，120.2，118.9，113.1，86.4，65.4，64.1，55.1，45.3，44.2
低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（9）的合成
将N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲（7）（290mg，0.47mmol）溶解在吡啶（4.7mL）中，加入DMAP（1.24mg，1.42mmol），在Ar气氛下于室温搅拌72小时。通过TLC确认原料消失后，用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂，从而获得丁二酰化合物（8）。将真空干燥了一夜的丁二酰化合物（8）溶解在DMF（12mL，相对于CPG为0.01M）中，加入CPG树脂（120μmol/g）（979mg，0.118mmol）调和成溶液。之后，加入EDC-HCl（90mg，0.47mmol），室温下振荡48小时。用吡啶洗涤反应溶液后，加入0.1M DMAP溶液（吡啶∶乙酸酐=9∶1）（15mL），进一步在室温下振荡12小时。用吡啶、乙醇、乙腈洗涤反应溶液，真空干燥12小时后，进行所得树脂的活性测定。活性测定按如下方式进行：将干燥好的CPG树脂6mg放在玻璃过滤器中，倒入HClO4∶EtOH=3∶2的溶液，求出其滤液在UV498nm波长（DMTr基的波长）的吸光度，代入到下面的算式中，由此计算出。其结果，活性值为38.5μmol/g。
（比较例1）
基于本发明人等以前开发出的、在专利文献1中记载的方法，按照下述化9的合成路线合成比较例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（19）。下面对其详细叙述。
（化合物11：1,3-双羟甲基苯的制造例）
在Ar气氛下在间苯二甲酸二甲酯(2.00g，10.30mmol）中加入干燥的THF（51.5mL，0.2M溶液），并加入硼氢化锂(1.12g，51.5mmol，5eq)。搅拌23小时后，在冰浴下加入几滴乙酸使反应液变成中性，终止反应。搅拌片刻后，用甲醇溶解析出来的晶体。在反应中的TLC（Hex∶EtOAc=1∶1）中生成物为1个点，但终止反应则分成2个点。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（仅为乙酸乙酯）分离，从而获得化合物（11）（1.36g，9.82mmol，95%）。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]：7.39-7.26(4H，m，aromatic protons)，4.71(4H，s，-CH2-O-)，1.70(2H，d，J＝76.8Hz，OH)
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]：139.28，129.62，128.47，63.90
Mass(El)m/z：138(M+)，120，107，79，65，51.
HRMS(El)Calcd for C8H10O2138.06808 Found 138.06765.
Anal.Calcd for C8H10O2：C，69.54；H，7.30.Found：C，69.45；H，7.23.
（化合物12：1-（4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基）甲基-3-羟甲基苯的制造例）
将预先真空干燥好的化合物（11）（0.5g，3.62mmol）溶解于吡啶（18mL）中，加入DMAP（22.1mg，0.18mmol，0.05eq）和4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（1.23g，3.62mmol，1eq)，在Ar气氛下搅拌17小时。通过TLC（Hex∶EtOAc=3∶1）确认原料消失。用乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（Hex∶EtOAc=4∶1）分离，从而获得化合物(12)（0.82g，1.86mmol，51%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]：7.52-6.82(17H，m，DMTr and aromatic protons)，4.70 and 4.18(4H，s，-CH2-O-)，3.80(6H，t，J＝4.0 Hz，H-methoxy)，1.62(2H，s，OH)
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]：158.42，145.00，140.76，139.68，136.24，130.06，128.50，128.16，127.83，126.73，126.31，125.71，125.55，113.10，86.39，65.43，55.20
Mass(El)m/z：440(M+)，303，273，227，138，121，107，79，45.
HRMS(El)Calcd for C29H28O4440.19876
Found 440.19806.Anal.Calcd for C29H28O4·1/5H2O：C，78.27；H，6.45.Found：C，78.33；H，6.59.
（化合物13：1-（4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基）甲基-3-O-[(2-氰基乙基）-（N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺甲基-羟甲基苯的制造例）
将预先真空干燥好的化合物（12）（0.35g，0.80mmol）溶解在干燥的THF（8mL）中，加入DIPEA(0.4mL，4.00mmol，5eq)和亚磷酸化试剂（0.29mL，1.60mmol，2eq)，在Ar气氛下搅拌1.5小时。通过TLC（仅为乙酸乙酯）确认原料消失。用乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用中性硅胶色谱法（Hex∶EtOAc=1∶1）分离，从而获得化合物(13)（0.48g，0.75mmol，94%)。
32P NMR(162MHz，CDCl3)δ[ppm]：148.8
Mass(FAB)m/z：641([M++H])，303，201，154.
HRMS(FAB)Calcd for C38H46N2O5P 641.31443 Found 641.31292.
（化合物15：2,6-双-羟甲基吡啶的制造例）
在Ar气氛下在吡啶-2,6-二羧酸二甲酯（14）（2.00g，10.25mmol）中加入无水THF（51.3mL，0.2M溶液），加入硼氢化锂(1.16g，51.3mmol，5eq)。搅拌16小时后，在冰浴下加入几滴乙酸使反应液变成中性，终止反应。搅拌片刻后，用甲醇溶解析出来的晶体。在反应中的TLC（三氯甲烷∶甲醇=3∶1）中，生成物为1个点，但终止反应则分成2个点。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（三氯甲烷∶甲醇=10∶1~3∶1）分离，从而获得化合物（15）(0.40g，2.88mmol，28%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]：7.72-7.00(3H，m，aromatic protons)，4.79
(4H，s，-CH2-)
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]：158.37，137.44，119.12，64.33
Mass(FAB)m/z：140([M++H])，277，185，93，57.
HRMS(FAB)Calcd for C7H10NO2
140.07115 Found 140.07054.
Anal.Calcd for C7H10NO2：
C，60.42；H，6.52；N，10.07.Found：C，60.28；H，6.50；N，9.95.
（化合物16：2-（4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基）甲基-6-羟甲基吡啶的制造例）
将预先真空干燥好的化合物（15）（0.5g，3.60mmol）溶解于吡啶（18mL）中，加入DMAP（22.1mg，0.18mmol，0.05eq）和4,4’-二甲氧基三苯甲基氯（1.22g，3.60mmol，1eq)，在Ar气氛下搅拌16小时。通过TLC（Hex∶EtOAc=1∶1）确认原料消失。用乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，采用硅胶色谱法（己烷∶乙酸乙酯=4∶1～3∶1）分离，从而获得化合物(16)（0.27g，0.61mmol，43%)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ[ppm]：7.76-6.82(16H，m，DMTr and aromatic protons)，4.69 and 4.34(4H，s，-CH2-O-)，3.79(6H，s，H-methoxy)，1.58(2H，s，OH)
13C NMR(100MHz，CDCl3)δ[ppm]：158.51，158.38，157.59，144.77，137.27，135.93，130.01，128.07，127.89，126.85，119.35，118.56，113.18，86.67，66.56，63.62，55.20
Mass(FAB)m/z：442([M++H])，303，277，185，93，57.
HRMS(FAB)Calcd for C28H28NO4
442.20183 Found 442.20332.
（化合物17、18：吡啶二羧酸二甲酯衍生物的CPG树脂的制造例）
将化合物(16)(0.20g，0.45mmmol)溶解在吡啶(4.5mL)中，向其中加入DMAP（1.1mg，0.009mmol，0.02eq）和琥珀酸酐（136mg，1.36mmol，3eq)并在Ar气氛下搅拌。搅拌17小时后，通过TLC（己烷∶乙酸乙酯=1∶1）确认反应进行。用乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水溶液萃取，用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，加入无水硫酸钠使其干燥。减压蒸馏除去溶剂后，使其真空干燥。向该浓缩物（17）(0.16g，0.30mmol，66%)中加入干燥的DMF（7.5mL)使其溶解，加入CPG（338mg，0.075mmol)静置30分钟，调和成反应液。之后，加入WSC（71mg，0.37mmol，4.9eq)于室温下使其振荡一天。作为后处理，在用吡啶洗涤后加入0.1M DMAP吡啶溶液：乙酸酐（9∶1）溶液（6mL），使其振荡16小时。这样获得了比较例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（18）。用甲醇、丙酮洗涤该物质，使其干燥，测定活性，结果活性为73.94μmol/g。
（实施例2）
＜硫脲键连接苯环与吡啶环的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成＞
在实施例2中，按照以下所示的合成路线合成了硫脲键连接苯环与吡啶环的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体。
3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基异硫氰酸酯(21)的合成
用乙醇（2mL）溶解3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄胺(5)(613mg，1.39mmol)、二硫化碳(0.85mL，13.9mmol，10eq)、三乙胺(0.20mL，1.39mmol)，脱气后，进行氩气置换并于室温下搅拌2小时。之后，在冰浴下滴加二碳酸二叔丁酯（3.06mg，1.40mmol）的乙醇（0.6mL）溶液、DMAP（6.12mg，6mol%)的乙醇（0.6mL）溶液，进一步于室温下搅拌。4小时后，通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸馏。采用柱色谱法（Hexane∶EtOAc=10∶1）分离精制残渣，从而获得为浅黄色油的3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基异硫氰酸酯(21)(640mg，96%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.23-7.68(17H，m，Ar-H)，6.84(4H，d，J＝8.8Hz，Ar-H)，4.67(2H，s，CH2)，4.15(2H，s，CH2)，3.79(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.3，144.4，135.4，130.5，130.4，129.5，128.9，128.5，126.9，118.6，113.7，112.1，111.9，111.8，86.4，56.9，55.5，54.0
N-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N'-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)吡啶-2-基]甲基}硫脲(22)的合成
用氘代氯仿(4.6mL)溶解3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基异硫氰酸酯(21)(332mg，0.69mmol)，加入2-氨基甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶(3)(63.10mg，0.39mmol)的氘代氯仿(3mL)溶液，脱气后，进行氩气置换并回流。5小时后通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸馏。采用硅胶色谱法（Hexane∶EtOAc=3∶1~2∶1）精制残渣，从而获得为黄色油的N-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N'-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)吡啶-2-基]甲基}硫脲(22)(316mg，62%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.08-7.69(17H，m，Ar-H)，6.82(4H，d，J＝6.8Hz，Ar-H)，4.69(4H，s，CH2)，4.51(2H，s，CH2)，4.16(2H，s，CH2)，3.78(6H，s，CH3O)，0.92(9H，s，t-C4H9Si)，0.05(6H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝160.6，158.3，154.3，144.8，140.0，137.7，136.0，129.9，128.5，128.0，127.7，126.6，126.3，126.2，126.1，120.3，118.8，113.0，86.3，65.3，65.2，55.1，49.3，25.7，18.1，-5.4
N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]硫脲(23)的合成
将N-[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N'-{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基甲基)吡啶-2-基]甲基}硫脲(22)(316mg，0.43mmol)悬浮在THF(2.2mL)中，脱气后，进行氩气置换并于室温下搅拌。滴加TBAF1.0M THF(0.48mL)，进一步搅拌。12小时后通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸馏。采用硅胶色谱法（CDCl3∶MeOH=200∶1~50∶1）精制残渣，从而获得为黄色晶体的N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]硫脲(13)(141mg，54%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.04-7.55(17H，m，Ar-H)，6.75(4H，d，J＝9.0Hz，Ar-H)，4.60(4H，s，CH2)，4.38(2H，s，CH2)，4.08(2H，s，CH2)，3.71(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝183.4，158.8，158.4，155.0，144.8，139.8，137.7，136.0，130.0，128.7，128.0，127.8，126.7，126.3，126.1，120.8，119.4，113.1，86.4，65.34，64.3，59.5，55.1，49.3
具有苯-吡啶骨架的硫脲型CPG树脂(25)的合成
将N-[3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧甲基)苄基]-N’-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]硫脲(23)(141mg，0.23mmol)溶解在吡啶(3mL)中后，加入琥珀酸酐(71mg，3eq)、DMAP(0.62mg，0.02eq)，于室温下搅拌。72小时后通过TLC确认原料消失后，用EtOAc×2、H2O×1、饱和碳酸氢钠水溶液×1萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂，从而获得丁二酰化合物(24)。将真空干燥了一夜的丁二酰化合物(14)溶解在DMF（6mL，相对于CPG为0.01M）中后，加入CPG树脂（119μmol/g）（480mg，0.058mmol）调和成溶液。之后，加入EDC-HCl（44mg，0.23mmol），振荡48小时。用吡啶×3洗涤反应溶液后，加入0.1M DMAP溶液(吡啶∶Ac2O=9∶1)(15mL)，在室温下振荡12小时。
用吡啶、乙醇、乙腈洗涤反应溶液，真空干燥12小时后，进行所得硫脲型CPG树脂(25)的活性测定。其活性值为48.3μmol/g。
将干燥好的CPG树脂6mg放在玻璃过滤器中，倒入HClO4∶EtOH=3∶2的溶液，求出其滤液在UV498nm波长（DMTr基的波长）的吸光度，代入到下面的算式中，由此计算出。
（实施例3）
＜吡啶环彼此通过硫脲键连接的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成＞
在实施例3中，按照下面所示的合成路线合成了吡啶环彼此通过硫脲键连接的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体31。
N,N’-双{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲(27)的合成
将2-氨基甲基-6-[(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基]吡啶(26)(380mg，1.50mmol)、1,1’-羰基二咪唑（150mg，0.92mmol）悬浮THF（10mL）中，脱气后，进行氩气置换并于室温下搅拌。24小时后，通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸馏。采用硅胶色谱法（CHCl3∶MeOH=50∶1）精制残渣，从而获得为黄色晶体的N,N’-双{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲(27)(384mg，96%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.66(2H，t，J＝8.0Hz，Ar-H)，7.38(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，7.14(2H，d，J＝7.2Hz，Ar-H)，4.78(4H，s，CH2O)，4.49(4H，s，CH2N)，0.96(18H，s，t-C4H9S i)，0.12(12H，s，(CH3)2Si)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝160.7，158.2，156.6，137.3，119.8，118.3，65.9，45.6，25.8，18.3，-5.4
N,N’-双{[6-(羟甲基)吡啶-2-基]甲基}脲(28)的合成
将N,N’-双{[6-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基吡啶-2-基]甲基}脲(27)(855mg，1.61mmol)悬浮在THF(8.1mL)中，脱气后，进行氩气置换并于室温下搅拌。滴加TBAF 1.0M THF(3.7mL)，进一步搅拌。5小时后通过TLC确认原料消失后，将反应溶液减压蒸留。将残渣抽滤，从而获得为白色晶体的N,N’-双{[6-(羟甲基)吡啶-2-基]甲基}脲(28)(812mg)。
1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)
δ＝7.73(2H，t，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.30(2H，d，J＝7.8Hz，Ar-H)，7.13(2H，d，J＝7.6Hz，Ar-H)，6.72(2H，t，J＝5.8Hz，NH)，5.38(2H，t，J＝5.8Hz，OH)，4.53(4H，d，J＝5.6Hz，CH2)，4.28(4H，d，J＝5.8Hz，CH2)
13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)
δ＝161.1，158.7，158.0，137.0，118.7，118.1，64.1，44.8
N-{[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)吡啶-2-基]甲基}-N'-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲(29)的合成
将N,N’-双{[6-(羟甲基)吡啶-2-基]甲基}脲（28）(812mg)、DMTrCl（271mg，0.8mmol)加入吡啶(6mL)、DMSO(1.2mL)中，通过加热（40℃）将其悬浮，脱气后，进行氩气置换并在室温下搅拌。12小时后，通过TLC确认反应几乎没有进行（原料大体上残留）之后，补加DMTrCl(405mg，1.2mmol)，继续搅拌。进而，12小时后，通过TLC确认反应进行，但不能确认原料消失。（生成物的点不浓，原料仍然残留。）进一步补加DMTrCl(405mg，1.2mmol)，继续搅拌。26小时后，由于确认反应进行，因而使反应终止。用饱和碳酸氢钠水溶液×1、乙酸乙酯×2、水×1、饱和氯化钠水溶液×1萃取反应溶液后，用无水硫酸钠使有机层干燥，减压蒸馏除去溶剂。采用硅胶柱色谱法（CHCl3∶MeOH=20∶1）分离精制残渣，从而获得为浅黄色晶体的N-{[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)吡啶-2-基]甲基}-N'-[(6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲(29)(424mg，43%)。
1H NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.62-6.96(m，15H，Ar-H)，6.74(d，4H，J＝9.0Hz，Ar-H)，4.52(s，2H，CH2)，4.33(d，4H，J＝5.6Hz，CH2)，4.20(s，2H，CH2)，3.70(s，6H，CH3O)
吡啶环彼此通过硫脲键连接的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体(31)的合成
将N-{[3-(4,4'-二甲氧基三苯甲基氧甲基)吡啶-2-基]甲基}-N'-[6-羟甲基吡啶-2-基)甲基]脲(29)(363mg，0.60mmol)溶解在吡啶(7.8mL)中后，加入琥珀酸酐(185mg，3eq)、DMAP(1.62mg，0.02eq)，在室温下搅拌。72小时后通过TLC确认原料消失后，用乙酸乙酯×2、水×1、饱和碳酸氢钠水溶液×1萃取。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，用无水硫酸钠进行干燥后，减压蒸馏除去溶剂，从而获得丁二酰化合物（24）。将真空干燥了一夜的丁二酰化合物（30）溶解在DMF（15.6mL，相对于CPG为0.01M）中后，加入CPG树脂（119μmol/g）（1.25g，0.15mmol）调和成溶液。之后，加入EDC-HCl（115mg，0.60mmol），振荡48小时。用吡啶×3洗涤反应溶液后，加入0.1M DMAP溶液（吡啶∶Ac2O=9∶1）（15mL），室温下振荡12小时。
用吡啶、乙醇、乙腈洗涤反应溶液，真空干燥12小时后，进行所得树脂的活性测定。其活性值为79.91μmol/g。
将干燥的CPG树脂6mg放在玻璃过滤器中，倒入HClO4∶EtOH=3∶2的溶液，求出其滤液在UV498nm波长（DMTr基的波长）的吸光度，由在实施例1中使用的上述算式1计算出活性值。
＜siRNA的合成＞
利用由以上得到的、实施例1～3和比较例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，采用固相亚磷酰胺法通过核酸自动合成合成了在3’末端具有疑似悬空端的、示于下述表1的序列（该序列将海肾荧光素酶作为靶）的低聚核苷酸衍生物。另外，在3’末端具有TT的天然型siRNA也同样地合成。将合成的低聚核苷酸的序列示于图4。
将siRNA的合成中的低聚核苷酸的合成法及精制法的详细内容示于以下。
在低聚核苷酸的合成中，采用核酸自动合成仪，采用以下所示的亚磷酰胺法。
1.用酸除去低聚核苷酸链(介由3’末端的连接基团固定在支撑固体CPG上)的3’末端保护基、二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
2.在新游离出来的5’末端上连接脱氧核苷酸的3’-亚磷酰胺衍生物。亚磷酰胺体活化剂采用四唑。
3.通过乙酰化将未反应的5’末端封端，阻止之后的偶联。认为由此错误的低聚核苷酸就不会延长。
4.如果将由偶联生成的亚磷酸三酯氧化而形成磷酸三酯，则可以形成核苷酸延长1个的链。
合成是按照亚磷酰胺法、在1μmol规格下进行的。利用3400DNA自动合成仪将AGCU的各亚磷酰胺溶解在乙腈溶液中并使其为0.1M，使合成的疑似悬空端树脂溶解在乙腈溶液中并使其为0.12M来调整。低聚核苷酸的5’末端在除去了DMTr基的状态下终止合成。通入氩气使CPG树脂干燥。合成完成后，将键合在CPG树脂上的低聚核苷酸转移到Eppendorf管中，加入EtOH∶NH4OH＝3∶1水溶液1.2mL于室温下振荡12小时，进行从树脂中的取出和苯甲酰基等的脱保护处理。之后，将溶液减压下干固。在残渣中加入1M TBAF的THF溶液1mL使其溶解，振荡12小时，进行甲硅烷基的脱保护。用(*1)0.1M TEAA缓冲液将该反应液稀释为30mL，使其通过已平衡化的C-18反相色谱柱(Sep-Pak)，使其吸附在色谱柱上。（最初作为调理使乙腈10mL、0.1MTEAA缓冲液15mL流过，最后使滤液流过。）
在此，用灭菌水洗涤色谱柱来除去盐，用50%乙腈水溶液3mL洗脱，减压下干固。在残渣中加入200μL加载溶液(1×TBE 90%甲酰胺)，进行(*2)20%PAGE电泳(500V，20mA)。将目标低聚核苷酸的某一部分的凝胶切下，浸渍在洗提液（加入2N TEAA缓冲液1mL、0.1mM EDTA水溶液0.2mL和水并使其为20mL）中，振荡一夜。使该滤液通过再一次平衡化的C-18反相色谱柱(Sep-Pak)来精制。
(*1)含有7M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶的调制
加入40%丙烯酰胺溶液(*1-1)45mL、尿素37.8g、10×TBE缓冲液(*1-2)8mL并使其溶解，加入水使其为80mL。最后加入APS 55mg使其溶解后，加入TEMED 40μL混合，流入到夹着垫片(1.5mm)而固定的2块玻璃板之间，静置1小时以上使其固化。将1×TBE缓冲液(*1-3)用作泳道流动用缓冲液。
(*1-1)40%丙烯酰胺：将丙烯酰胺190g、N,N’-双丙烯酰胺10g溶解在水中并使其为500mL。
(*1-2)10×TBE缓冲液：将Tris 108g、硼酸55g、EDTA·2Na 7.43g溶解在水中并使其为1L。
(*1-3)使用10×TBE缓冲液时稀释成10倍使用。
(*2)
·2N TEAA缓冲液(使三乙胺277.6mL溶解在水中，用乙酸调整为pH7.0并使其为1L。)
·0.1M TEAA缓冲液(使用2N TEAA缓冲液时稀释成20倍。)
·使用0.1M EDTA水溶液(用水将EDTA·4Na 1.81g调整成40mL。)时稀释成100倍。
将这样得到的各试样溶解在1mL的水中，测定该试样的稀释液在260nm的吸光度，求出其产量。
另外，通过MALDI－TOF/MASS确定各试样的分子量。将结果示于表1。
[表1]
然后，进一步通过HPLC分离精制。缓冲液如下，色谱柱采用C-18。
·缓冲液组成
A缓冲液：5%乙腈的0.1M TEAA(pH7.0)
B缓冲液：50%乙腈的0.1M TEAA(pH7.0)
＜siRNA的评价＞
（热稳定性）
将按上述方式利用实施例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（9）而合成的siRNA（以下称为“siRNA（BuP）”）链、及利用比较例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（18）而合成的siRNA链与互补链退火而组成两条链（TT-反义与TT-有义，BUP-反义与BUP-有义两组），测定两组的双链siRNA的50%熔解温度Tm（℃）。即，量取600pmol合成的低聚核苷酸的互补链彼此并使其干固，溶解在200μL测定用缓冲液(10mM NaH2PO4-Na2HPO4，100mM氯化钠(pH7.0))中并使其为3μM。然后，于90℃加热5分钟后，放置1小时以上使其杂化。之后，进行脱气，将所得试样之中170μL装入专用吸收池中，用Tm测定仪测定260nm的吸光度的温度变化。测定完成后，采用中线法由所得图表计算出50%熔解温度（Tm）。将结果示于图5和表2，其结果，BP、BuP、PuP和BtuP显示出与天然型几乎同等程度的热稳定性。
[表2]
（蛋白表达抑制效果的测定）
为了评价利用上述实施例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（9）而合成的siRNA（siRNA（BuP））、利用比较例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（18）而合成的siRNA链（以下称为“siRNA（BP）”）的蛋白表达抑制效果，以0.1nM、1.0nM、10nM的浓度进行双荧光素酶检测来评价敲减效果。合成的siRNA以海肾荧光素酶为靶，将表达该基因和控制基因（萤火虫荧光素酶）的载体与siRNA同时转染到宫颈癌细胞中，由此测定其敲减效果。
该方法是采用对属于发光蛋白的萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶进行表达的载体，由各自发光的比例计算出由siRNA产生的海肾荧光素酶的蛋白表达抑制来进行评价的方法（参照图6）。
即，将宫颈癌细胞调整为4000个细胞/ml，在96孔板的各孔中各加入100μl，培养24小时。将合成的siRNA各自的链溶解在TE缓冲液(100mM氯化钠)中，进行退火。将该siRNA各量、培养基(OPTI-MEM)各量、0.1μg/μL的psi-CHECK(具有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶各自的序列的载体)1μl、Transfast(转染试剂)1.5μl混合并使总量为175μl，在吸出了培养基的96孔板的各孔中各加入35μl，1小时后加入100μl培养基，培养24小时。24小时后，吸出培养基，冷冻保存。在测定时，解冻后，加入24μl的Dual Glo底物(萤火虫荧光素酶的底物)放置10分钟后，将23μl试样转移到发光测定用的96孔板中，测定萤火虫荧光素酶。之后，加入23μl的Stop and Glo底物并放置10分钟后，测定海肾荧光素酶。用萤火虫荧光素酶的值除以海肾荧光素酶的值，使用对照组的%进行比较。应予说明，在荧光素酶测定中使用Luminescenser JNR。
其结果，如图7所示，可知siRNA（BuP）具有与有苯-吡啶部位的siRNA（BP）同等程度的蛋白表达抑制能力。
（核酸酶耐受性的测定）
在按上述方式合成的siRNA（BuP）、siRNA（BP）及天然型的siRNA（TT）的5’末端修饰荧光性取代基，调查其3’核酸外切酶耐受性。荧光性取代基为荧光素，利用DNA/RNA自动合成仪采用亚磷酰胺法将荧光素的亚磷酰胺体导入到5’末端。
调查这样在5’末端修饰有荧光性取代基的siRNA的核酸酶耐受性。
即，加入300pmol用荧光素进行了荧光标记的低聚核苷酸siRNA（TT）、siRNA（BP）及siRNA（BuP）、100μL的SVP 5.0×10-3unit/mL，于37℃下孵育，每隔0min、1min、5min、10min、15min、30min、1h、3h在15μL预先分注到另外的Eppendorf管中的反应终止液(0.1%BPB，XC的7M尿素)中加入5μL反应液，使其成为各时间的反应溶液。应予说明，0min的试样不加入酶。
将它们用20%PAGE分离后，利用荧光扫描仪（Lumino ImageAnalyzer LAS-4000）测定荧光素的荧光强度，由此调查核酸酶耐受性的程度。
将结果示于图8图9。由图9可知，天然型siRNA（TT）在1分钟后核酸酶耐受性活性几乎消失，与此相对，具有苯-吡啶部位的siRNA（BuP）和siRNA（BP）即使经过30分钟左右，核酸酶耐受性活性仍然残留50%左右。由此可知，具有苯-吡啶部位的siRNA（BuP）和siRNA（BP）与天然型siRNA（TT）相比具有优异的3’核酸外切酶耐受性。
而且，由以上结果可以明白，即使在将利用实施例1的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体（9）而合成的siRNA（以下称为“siRNA（BuP）”）用于单链和双链DNA、单链和双链RNA、DNA／RNA嵌合体以及DNA/RNA杂化物等时，也具有同样的核酸酶耐受性。
如上所述，实施例的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体能够容易地合成在3’末端化学修饰有苯骨架和吡啶骨架之中2个骨架的低聚核苷酸衍生物。另外，吡啶环与苯环彼此通过脲键连接，利用脲键进行的芳香族环彼此的连接采用羰基二咪唑进行偶联，由此能够使其极其容易且定量地形成。因此，与利用亚磷酰胺试剂而使磷酸酯键合而得的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体相比，合成是容易的。
（实施例4）
＜氟甲基苯环彼此通过脲键连接的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成＞
在实施例4中，按照下面所示的合成路线合成了氟甲基苯环彼此通过脲键连接的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体。
5-羟甲基间苯二甲酸二甲酯(32)的合成
将1,3,5-苯三甲酸三甲酯（5.02g，19.9mmol）溶解在THF（15mL）中，脱气后，进行氩气置换，进一步加入NaBH4（901mg，23.8mmol）后，缓慢地滴加THF∶MeOH（12.5mL∶3.7mL）溶液，回流30分钟。通过TLC确认反应进行后，加入HCl（1N，20mL）终止反应。用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=4∶1→3∶1)分离精制残渣，从而获得为白色晶体的5-羟甲基间苯二甲酸二甲酯(32)(2.73g，61%)。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)
δ＝8.60(1H，s，Ar-H)，8.24(2H，s，Ar-H)，4.82(2H，d，J＝6.3Hz，CH2O)，3.95(6H，s，CH3CO2)，1.98(1H，t，J＝6.3Hz，OH)
13C-NMR(CDCl3，100MHz)
δ＝166.2，142.0，131.9，130.7，129.7，64.05，52.37
5-氟甲基间苯二甲酸二甲酯(33)的合成
在Ar气氛下将5-羟甲基间苯二甲酸二甲酯(32)(3.36g，15.0mmol)溶解在二氯甲烷(150mL，0.1M溶液)中，一边在冰冷却下缓慢地滴加三氟化二乙氨基硫(4.00mL，30.5mmol)，一边于室温下搅拌2小时。通过TLC确认反应进行后，加入甲醇(150mL)终止反应。减压蒸馏除去溶剂后，用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液(×3)萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=10∶1)分离精制残渣，从而获得为白色晶体的5-氟甲基间苯二甲酸二甲酯(33)(2.57g，78%)。
1H-NMR(CDCl3，400MHz)
δ＝8.67(1H，s，Ar-H)，8.24(2H，s，Ar-H)，5.48(2H，d，J＝48.1Hz，CH2F)，3.97(6H，s，CH3CO2)
13C-NMR(CDCl3，100MHz)
δ＝165.8，137.3(d，J ＝19.1Hz)，132.2(d，J ＝6.7Hz)，131.1，130.8，83.2(d，J ＝171.7Hz)，52.5
3-氟甲基-5-羟甲基苯甲酸甲酯(34)的合成
将5-氟甲基间苯二甲酸二甲酯(33)(3.16g，14.0mmol)溶解在THF（10.5mL）中，脱气后，进行氩气置换，进一步加入NaBH4（638mg，16.9mmol）后，缓慢地滴加THF∶MeOH（8.8mL∶2.6mL）溶液，回流1小时。通过TLC确认反应进行后，加入HCl（1N，14mL）终止反应。用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=5∶1→2∶1)分离精制残渣，从而获得为白色晶体的3-氟甲基-5-羟甲基苯甲酸甲酯(34)(2.21g，80%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.93(1H，s，Ar-H)，7.87(1H，s，Ar-H)，7.52(1H，s，Ar-H)，5.36(2H，d，J＝48.6Hz，CH2F)，4.67(2H，s，CH2O)，3.88(3H，s，CH3CO2)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝166.6，141.9，136.7(d，J＝18.1Hz)，130.3，129.8(d，J＝5.7Hz)，127.8(d，J＝1.9Hz)，127.1(d，J＝6.7Hz)，83.6(d，J＝169.8Hz)，63.8，52.1
3-叠氮甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(35)的合成
使3-氟甲基-5-羟甲基苯甲酸甲酯(34)(2.30g，11.6mmol)干燥24小时，使叠氮化钠(3.77g，58.1mmol)、四溴化碳(4.24g，12.1mmol)、三苯基膦(3.66g，13.9mmol)干燥48小时。Ar气氛下，加入三乙胺(3.6mL)后，溶解在DMF(88mL)中，于室温下搅拌93小时。通过TLC确认反应进行后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=10∶1)分离精制残渣，从而获得为淡黄色油的3-叠氮甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(35)(1.37g，53%)。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝8.02(1H，s，Ar-H)，8.00(1H，s，Ar-H)，7.55(1H，s，Ar-H)，5.45(2H，d，J＝48.1Hz，CH2F)，4.45(2H，s，CH2N3)，3.95(3H，s，CH3CO2)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝166.2，137.5(d，J＝18.1Hz)，136.5，131.2，130.9(d，J＝5.7Hz)，129.3，128.0(d，J＝6.7Hz)，84.0(d，J＝171.7Hz)，77.50，54.1，52.4
3-叠氮甲基-5-氟甲基苄醇(36)的合成
将3-叠氮甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(35)(468mg，2.10mmol)溶解在THF（1.5mL）中，脱气后，进行氩气置换，进一步加入NaBH4（97.5mg，2.58mmol）后，缓慢地滴加THF∶MeOH（1.3mL∶0.4mL）溶液，回流20分钟。通过TLC确认反应进行后，加入1N盐酸（2.5mL）终止反应。之后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=5∶1→EtOAc)分离精制残渣，从而获得为无色透明油的3-叠氮甲基-5-氟甲基苄醇(36)(149mg，36%)。另外，在萃取时的水层中加入饱和碳酸氢钠水溶液使其成碱性后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。于是获得为黄色透明油的3-氨甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(37)(33.1mg，8%)。
3-叠氮甲基-5-氟甲基苄醇(36)
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.36(1H，s，Ar-H)，7.33(1H，s，Ar-H)，7.26(1H，s，Ar-H)，5.40(2H，d，J＝48.6，CH2F)，4.75(2H，s，CH2O)，4.38(2H，s，CH2N3)
3-氨甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(37)
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.99(1H，s，Ar-H)，7.93(1H，s，Ar-H)，7.56(1H，s，Ar-H)，5.42(2H，d，J＝48.1，CH2F)，3.96(2H，s，CH2N)，3.93(3H，s，CH3CO2)
3-氨甲基-5-氟甲基苄醇(38)的合成
将3-叠氮甲基-5-氟甲基苯甲酸甲酯(35)(476mg，2.13mmol)溶解在THF（21.3mL）中，脱气后，进行氩气置换。另外，在另外的进行了氩气置换的茄形烧瓶中加入LiAlH4（408mg，10.7mmol），在冰冷却下悬浮在THF（21.3mL）中，一边缓慢地滴加先前的化合物（3）一边于0℃搅拌2小时。通过TLC确认原料消失后，加入甲醇（10mL）终止反应。通过硅藻土过滤除去金属后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=1∶1→EtOAc∶MeOH=2∶1)分离精制残渣，从而获得为黄色固体的3-氨甲基-5-氟甲基苄醇(38)（172mg，48%）。
1H-NMR(CD3OD，400 MHz)
δ＝7.43(2H，s，Ar-H)，7.39(1H，s，Ar-H)，5.40(2H，d，J＝49.0，CH2F)，4.66(2H，s，CH2O)，4.11(2H，s，CH2N)
13C-NMR(CD3OD，100 MHz)
δ＝144.5，139.0(d，J＝17.2Hz)，135.4，128.6，127.7(d，J＝6.7Hz)，127.3(d，J＝5.7Hz)，85.1(d，J＝168.8Hz)，64.4，44.0
3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基叠氮(39)的合成
将3-叠氮甲基-5-氟甲基苄醇(36)（142mg，0.73mmol）脱气后，进行氩气置换，加入DMTrCl（323mg，0.95mmol）。分别向其中加入DMF（2.0mL）和吡啶（2.0mL），于室温下搅拌22小时。通过TLC确认反应进行后，在真空中减压蒸馏除去溶剂。用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=20∶1→EtOAc∶MeOH=5∶1)分离精制残渣，从而获得为无色透明油的3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基叠氮(39)（346mg，95%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.51-7.21(12H，m，Ar-H)，6.84(4H，d，J＝9.2Hz，Ar-H)，5.39(2H，d，J＝48.6，CH2F)，4.37(2H，s，CH2N3)，4.21(2H，s，CH2O)，3.80(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.5，144.8，140.6，136.9(d，J＝18.1Hz)，136.0，135.9，130.0，128.1，127.9，126.8，125.7，125.7，113.2，86.6，84.2(d，J＝169.8Hz)，65.1，55.2，54.5
3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(40)的合成
将3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基叠氮（39）（247mg，0.50mmol）溶解在THF（5.00mL）中，依次加入水（0.20mL）、三苯基膦（264mg，1.01mmol），脱气后，进行氩气置换，于室温下搅拌15小时。通过TLC确认反应进行后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法（EtOAc→EtOAc∶CH3OH=2∶1）分离精制残渣，从而获得为白浊油的3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(40)（234mg，100%）。
1H-NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.51-7.20(12H，m，Ar-H)，6.84(4H，d，J＝8.7Hz，Ar-H)，5.38(2H，d，J＝49.0，CH2F)，4.18(2H，s，CH2O)，3.89(2H，s，CH2N)，3.79(6H，s，CH3O)
13C-NMR(CDCl3，100 MHz)
δ＝158.5，144.9，143.4，140.1，136.5(d，J＝17.2Hz)，136.1，130.0，128.1，127.8，126.8，126.1，125.0(d，J＝5.7Hz)，124.6(d，J＝6.7Hz)，113.1，86.5，84.6(d，J＝168.8Hz)，65.3，55.2，46.2
3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(41)的合成
使3-氨甲基-5-氟甲基苄醇(38)（520mg，3.07mmol）和咪唑（923mg，13.6mmol）溶解在DMF（15.5mL）中，脱气后，进行氩气置换。向其中加入TBDMSCl（1.03g，6.83mmol）使其溶解，脱气后，再一次进行氩气置换并于室温下搅拌18小时。通过TLC确认反应进行后，用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂。采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=1∶1)分离精制残渣，从而获得为无色油的3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(41)（661mg，76%）。
1H NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.21(1H，s，Ar-H)，7.19(1H，s，Ar-H)，7.11(1H，s，Ar-H)，5.35(2H，d，J＝49.0Hz，CH2F)，4.73(2H，s，CH2O)，4.48(2H，d，J＝6.0Hz，CH2N)，0.94(9H，s，t-C4H9Si)，0.10(6H，s，(CH3)2Si)
N-3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基-N’-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄基脲(42)的合成
将装有3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(40)（89.3mg，0.19mmol)的茄形烧瓶脱气后，进行氩气置换，加入THF（5.0mL）溶解。另外，将1,1’-羰基二咪唑（33.0mg，0.20mmol）溶解在THF（5.0mL）中，一边缓慢地滴加化合物（10）一边于室温下搅拌9.5小时。通过TLC确认反应进行。然后，将3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄胺(41)（54.8mg，0.19mmol）溶解在THF（1.6mL）中，缓慢地滴加到反应体系内。于室温下搅拌13小时，通过TLC确认反应进行。减压蒸馏除去溶剂，采用中性硅胶柱色谱法(hexane∶EtOAc=2∶3→EtOAc∶CH3OH=2∶1)分离精制残渣，从而获得为无色油的N-3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基-N’-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄基脲(42)（93.5mg，63%）。
1H NMR(CDCl3，400 MHz)
δ＝7.47-6.79(19H，m，Ar-H)，5.28(4H，d，J＝49.0Hz，CH2F)，4.34(2H，s，CH2)，4.15(2H，s，CH2)，3.75(8H，s，CH3O and CH2)，3.72(2H，s，CH2)，0.93(9H，s，t-C4H9Si)，0.09(6H，s，(CH3)2Si)
对这样获得的N-3-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)甲基-5-氟甲基苄基-N’-3-(叔丁基二甲基甲硅烷氧基)甲基-5-氟甲基苄基脲(42)，采用与实施例1、实施例2相同的方法，能够获得实施例3的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体。
本发明不受上述发明的实施方式和实施例的说明的任何限定。在不脱离权利要求的保护范围、本领域技术人员能够容易地想到的范围内各种变形方式均包含在本发明中。
附图说明
[图1]是表示siRNA的化学修饰的例子的图。
[图2]是表示在专利文献1中记载的、在CPG树脂上介由连接体化学修饰有通过磷酸二酯键连接的2个苯骨架的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成路线的图。
[图3]是表示在专利文献1中记载的、在CPG树脂上介由连接体化学修饰有通过磷酸二酯键连接的2个吡啶骨架的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体的合成路线的图。
[图4]是表示实施例和比较例中合成的低聚核苷酸的序列的图。
[图5]是表示实施例siRNA（BP、BuP、PuP、BtuP）和比较例siRNA（TT）的热稳定性的图表。
[图6]是表示测定由siRNA产生的海肾荧光素酶的蛋白表达抑制效果的方法的图。
[图7]是由各自的发光比例计算出由实施例siRNA（BuP）和比较例siRNA（BP）产生的海肾荧光素酶的蛋白表达抑制的图表。
[图8]是表示核酸酶耐受性活性度测定中的电泳结果的图。
[图9]是表示核酸酶耐受性活性度与时间的关系的图表。产业上的可利用性
本发明能够提供在期待对个别化医疗展开的RNA药物研发等利用核酸低聚物的医疗领域中有用的手段。
Claims (17)
1.一种芳香族化合物，其特征在于，以下述结构式（A）表示，
其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者卤代烷基；式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫；Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基。
2.根据权利要求1所述的芳香族化合物，其特征在于，以下述结构式（A1）表示，
其中，式中的R1和R2各自独立地为卤代烷基，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫；Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基。
3.根据权利要求1所述的芳香族化合物，其特征在于，以下述结构式（A2）表示，
其中，Pr1和Pr2各自独立地表示羟基的保护基。
4.一种低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a）表示的单元，
其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者卤代烷基；式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。
5.根据权利要求4所述的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a1）表示的单元，
其中，式中的R1和R2各自独立地为卤代烷基，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。
6.根据权利要求4所述的低聚核苷酸衍生物合成用修饰载体，其特征在于，在载体上直接或者介由连接体地化学修饰有下述结构式（a2）表示的单元，
7.一种低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式（a）表示的单元修饰，
其中，式中的R1～R6各自独立地表示氢或者卤代烷基；式中Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。
8.根据权利要求7所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式（a1）表示的单元修饰，
其中，式中的R1和R2各自独立地为卤代烷基，Z1和Z2各自独立地表示CH或者氮，X表示氧或者硫。
9.根据权利要求7所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，低聚核苷酸的3’末端被下述结构式（a2）表示的单元修饰，
10.根据权利要求7～9中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其中，所述低聚核苷酸具有规定的基因mRNA的部分序列或者其互补序列。
11.根据权利要求7～9中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其中，所述低聚核苷酸的链长为10～35。
12.根据权利要求7～9中任一项所述的低聚核苷酸衍生物，其特征在于，所述低聚核苷酸为寡核糖核苷酸。
13.一种构建物，是基因表达调节用低聚核苷酸构建物，具有权利要求7～12中任一项所述的低聚核苷酸衍生物。
14.根据权利要求13所述的构建物，是选自单链和双链DNA、单链和双链RNA、DNA/RNA嵌合体以及DNA/RNA杂化物中的基因表达调节用低聚核苷酸构建物。
15.根据权利要求13或14所述的构建物，其选自反基因、反义、适体、siRNA、miRNA、shRNA及核酶。
16.一种构建物，是基因诊断用低聚核苷酸构建物，具有权利要求13～15中任一项所述的低聚核苷酸衍生物。
17.根据权利要求16所述的构建物，其特征在于，是探针或者引物。
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| Yoshihito Ueno等."Synthesis of novel siRNAs having thymidine dimers consisting".《Biochemical and Biophysical Research Communication》.2005,第330卷(第4期),第1168-1175页. |
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