ES2628322T3

ES2628322T3 - Compuestos de tiol y su uso para la síntesis de oligonucleótidos modificados

Info

Publication number: ES2628322T3
Application number: ES13713922.6T
Authority: ES
Inventors: François MORVAN; Albert Meyer; Jean-Jacques Vasseur; Julie MAYEN; Carole Chaix; Carole FARRE; Chantal Fournier-Wirth; Jean-François CANTALOUBE; Myriam LEREAU
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Universite de Montpellier I; Francais du Sang Ets
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Universite de Montpellier I; Francais du Sang Ets
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2013-04-04
Publication date: 2017-08-02
Anticipated expiration: 2033-04-04
Also published as: WO2013150106A1; US20150158964A1; EP2834253A1; EP2834253B1; FR2989086A1; US9896473B2; US20180265538A1; CA2869429A1; US11078229B2; JP6152415B2; CA2869429C; JP2015515471A; FR2989086B1

Abstract

Compuesto que responde a la fórmula (I) siguiente:**Fórmula** en la que: T es un grupo elegido entre -O-P(OR1)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)JC(O)NH-, - R1 se elige entre los grupos 2-cianoetilo, R'1R'2R'3SiCH2CH2, y R'1, R'2, R'3 idénticos o diferentes representan un grupo elegido entre los alquilos lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 átomos de carbono y los arilos en C6-C12, - R2 se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 átomos de carbono, pirrolidina, - J se elige entre un enlace sencillo, un grupo -CH2-, -CH2CH2-, -CH2OCH2-, -CH2OPhOCH2- en el que Ph es un bencilo, - representa un soporte sólido, D es un grupo protector de alcoholes elegido entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo, fluorenilmetiloxicarbonilo y terc-butil-dimetilsililo, W se elige entre los grupos CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexanos tri-ilo, y bencenos triilo, Z se elige entre los grupos alcoxi en C1-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, NCOalquilos en C1-C12, CON-alquilos en C1-C12, Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, R se elige entre los grupos acilo en C1-C12, S-alquilos en C1-C12, S-arilos en C6-C12, S-2-piridina, Sheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C1-C12, S-cicloalquilos en C3-C12, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12.

Description

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DESCRIPCION

Compuestos detiol y su uso para la smtesis de oligonucleotidos modificados Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un compuesto de tiol apto para formar una cadena de oligomeros que se pueden injertar sobre un oligonucleotido. La invencion tambien se refiere a un oligonucleotido injertado con un compuesto de este tipo, que de ese modo posee uno o varios grupos funcionales tiol, aptos para su inmovilizacion sobre una superficie de oro o sobre una superficie injertada, en particular una superficie injertada con grupos maleimida o acrilamida. La invencion tambien se refiere a un kit de ensayo de deteccion de interaccion entre nucleotidos y otras moleculas usando como superficie la superficie de oro o la superficie injertada, en particular con grupos maleimida o acrilamida sobre la que se inmovilizan los oligonucleotidos de acuerdo con la invencion.

Estado de la tecnica

Los oligonucleotidos son moleculas que comprenden una cadena corta de nucleotidos, numero de nucleotidos que puede variar de 1 a aproximadamente 100. Se trata de fragmentos de ARN (acido ribonucleico) o de ADN (acido desoxirribonucleico). Los oligonucleotidos se sintetizan generalmente en forma de hebras sencillas.

Los oligonucleotidos se pueden sintetizar por via enzimatica o mediante procedimientos de smtesis qmmica. Cuando se elige un procedimiento qrnmico, habitualmente, los oligonucleotidos se sintetizan sobre soporte solido mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, realizando un procedimiento que usa fosforamiditas, H-fosfonatos, fosfodiesteres o fosfotriesteres, siendo los dos ultimos compuestos derivados del acido fosforico, mientras que las fosforamiditas son derivados del acido fosforoso.

Una propiedad importante de los oligonucleotidos es su capacidad para controlar los genes y la funcion de las protemas en una secuencia espedfica. Esta propiedad hace que los oligonucleotidos y sus derivados sean compuestos muy usados en investigacion en biologfa molecular y en numerosas aplicaciones farmaceuticas y de diagnostico. El campo de la investigacion necesita tener a disposicion grandes cantidades de oligonucleotidos. Por lo tanto, es necesario un procedimiento que permita producir grandes cantidades de oligonucleotidos que tengan una pureza muy elevada.

Los acidos nucleicos que tienen una secuencia dada de nucleotidos se usan en gran medida para la deteccion de ADN en muestras biologicas. El principio de este ensayo de deteccion se basa en la complementariedad de la secuencia de nucleotidos con la secuencia diana, formando de ese modo una hebra doble. Esta hebra doble se forma en el transcurso de un procedimiento denominado hibridacion.

Este fenomeno de hibridacion se puede detectar a continuacion con diversos procedimientos, en particular mediante etiquetado de la secuencia de nucleotidos destinada a unirse a la secuencia inicialmente presente. Los procedimientos de etiquetado, fluorescente o radiactivo, para la deteccion del fenomeno de hibridacion presentan ciertos inconvenientes. El etiquetado necesita una etapa complementaria durante la smtesis de la secuencia de nucleotidos, en ocasiones siendo esta etapa diffcil de realizar. El ensayo basado en este fenomeno de hibridacion detectado mediante etiquetado necesita, despues de la etapa de hibridacion, eliminar las secuencias de nucleotidos etiquetadas que no se han unido a la secuencia diana de la muestra.

A continuacion se realizaron otros procedimientos de deteccion, en particular procedimientos en los que las secuencias de nucleotidos se inmovilizan previamente sobre una superficie, siendo a continuacion la muestra a someter a ensayo puesta en contacto con esta superficie con el fin de crear el fenomeno de hibridacion mediante la formacion de hebras dobles.

Entre estos otros procedimientos, cada vez se usan mas los procedimientos electroqmmicos. Estos procedimientos se basan en la inmovilizacion de oligonucleotidos sobre un electrodo, por ejemplo un electrodo de oro. Durante el transcurso del ensayo, la hibridacion de los oligonucleotidos inmovilizados con hebras sencillas sobre el electrodo de oro se cuantifica gracias a la medicion de la corriente electrica, que depende del numero de hebras dobles formadas entre el oligonucleotido de una sola hebra inmovilizado y el oligonucleotido de la muestra.

Con el fin de realizar estos ensayos, el oligonucleotido se inmoviliza sobre la superficie metalica, y en particular sobre una superficie de oro. Esta inmovilizacion se puede obtener en particular gracias a un enlace entre un atomo de oro y un atomo de azufre. Sin embargo, el enlace Au-S es moderadamente fuerte. Por lo tanto, un solo enlace de oro-azufre no es suficiente para inmovilizar un oligonucleotido sobre la superficie de oro de manera muy estable. De hecho, los procedimientos de ensayo conllevan etapas, en particular de lavado, que ocasionan fuertes limitaciones mecanicas susceptibles de desestabilizar el enlace Au-S.

El documento EP 0 523 978 desvela compuestos de fosforamidita o fosfonato que se pueden usar para la produccion de oligonucleotidos modificados con tioles. No se pueden introducir mas que una sola vez y unicamente en el extremo la posicion 5' de un oligonucleotido.

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El documento US 7.601.848 desvela un compuesto polifuncional que comprende dos atomos de azufre destinado a su incorporacion en oligomeros con el fin de crear al menos dos enlaces de oro-azufre y de ese modo estabilizar el oligonucleotido sobre la superficie de oro. Algunos de estos compuestos comprenden un grupo funcional fosforamidita. Los compuestos usados en el presente documento se fabrican a partir de compuestos de alto coste y el acoplamiento del compuesto polifuncional sobre los oligonucleotidos no tiene un rendimiento satisfactorio debido al impedimento esterico de este compuesto. En el presente documento, es necesario un agente de enlace con el fin de unir los compuestos de tiol entre sf y de ese modo realizar una multiple introduccion de compuestos de tiol en un oligonucleotido.

U. K. Shigdel y C. He, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130 (52), 17634-5, describen un nucleotido modificado con un el grupo funcional fosforamidita destinado a su introduccion sobre un oligonucleotido mediante este grupo funcional fosforamidita. La smtesis del compuesto descrito se realiza en 12 etapas.

S. Jin y col., J. Org. Chem. 2005, 70, 4284-4299, describen un nucleosido modificado con un grupo funcional fosforamidita y un grupo funcional tiol. Los nucleosidos modificados se usan para introducir sondas bioffsicas en el seno del ARN. El nucleosido modificado se sintetiza en 9 etapas con un rendimiento global de un 12,5 %.

A. Hatano y col., Tetrahedron, 61, 2005, 1723-1730, describen la smtesis de ADN haciendo intervenir una base de nucleosido que comprende un grupo funcional fosforamidita y un grupo funcional tiofenol. El nucleosido modificado se sintetiza en 7 etapas con un rendimiento insuficiente, inferior a un 5 %.

En las tres publicaciones cientfficas mencionadas anteriormente, el compuesto de fosforamidita es un nucleosido modificado destinado a su incorporacion en un oligonucleotido mediante el compuesto intermedio de este grupo funcional de fosforamidita. Los reactivos de partida son caros, las smtesis son largas y complejas y los rendimientos de la smtesis de estos compuestos de fosforamidita son bajos. Ademas, el impedimento esterico de estos compuestos osfdicos no es adecuado para un injerto satisfactorio sobre una superficie.

A. A. Rowe y col., Anal. Chem. 2011, 83, 9462-9466 describen un compuesto nucleosfdico que se puede inmovilizar sobre la superficie de oro para la deteccion de ADN. El compuesto nucleosfdico se incorpora una sola vez, para una inmovilizacion sobre una superficie de oro mediante el compuesto intermedio de un unico grupo funcional tiol. El reactivo de partida es caro, y la fabricacion del compuesto de tiol es compleja.

El objeto de la presente invencion es proporcionar un compuesto de tiol que disminuya al menos parcialmente los inconvenientes mencionados anteriormente, es decir, un compuesto de tiol, facil de fabricar, que se pueda oligomerizar de manera sencilla y economica, y destinado a su incorporacion en un oligonucleotido e inmovilizacion sobre una superficie.

De forma mas particular, la invencion se dirige a proporcionar un procedimiento que permita introducir de manera facil y eficaz uno o varios grupos funcionales tiol en un oligonucleotido.

Sumario de la invencion

Un primer objeto de la invencion se refiere a un compuesto que responde a la formula (I) siguiente:

T

Y

x-w

/ \

D-0 Z (I)

/

s

R

en la que:

T es un grupo elegido entre -O-P(OR-,)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)JC(O)NH-^,

◦ R1 se elige entre los grupos 2-cianoetilo, R'1R'2R'3SiCH2CH2, y R'1, R'2, R'3 identicos o diferentes representan un grupo elegido entre los alquilos lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono y los arilos en C6-C12,

◦ R2 se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono, pirrolidina,

◦ J se elige entre un enlace sencillo, un grupo -CH2-, -CH2CH2-, -CH2OCH2-, -CH2OPhOCH2- en el que Ph es un bencilo,

◦ □ representa un soporte solido,

D es un grupo protector de alcoholes elegido entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo,

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fluorenilmetiloxicarbonilo y terc-butil-dimetilsililo,

W se elige entre los grupos CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexanos triilo, y bencenos triilo,

Z se elige entre los grupos alcoxi en C1-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, NCO- alquilos en C1-C12, CON-alquilos en C1-C12,

Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12,

X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12,

R se elige entre los grupos acilo en C1-C12, S-alquilos en C1-C12, S-arilos en C6-C12, S-2-piridina, S- heteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C1-C12, S-cicloalquilos en C3-C12, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto responde a una de las siguientes formulas (la), (Ib) e (Ic):

imagen1

De acuerdo con un modo de realizacion,

• D se elige entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo o Fluorenilmetiloxicarbonilo,

• W se elige entre un grupo CH, CCH3, CCH2CH3, un ciclohexano tri-ilo y benceno tri-ilo; y/o

• Z se elige entre los grupos alcoxi en C1-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6, NCO- alquilos en C1-C6, CON-alquilos en C1-C6 ; y/o

• Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C6, aminoalquilos en C1-C6, alcoxi en C1-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6 ; y/o

• X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C6, aminoalquilos en C1-C6, alcoxi en C1-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6 ; y/o

• R se elige entre los grupos acilo en Cl-C6, S-alquilos en C1-C6, S-arilos en C6-C6, S-heteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C1-C6, S-cicloalquilos en C3-C6, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6, preferentemente R es un acilo en C1-C6.

De acuerdo con un modo de realizacion, el grupo T es un grupo -O-P(ORi)N(R2)2 en el que R2 es un grupo isopropilo

y Ri se elige entre los grupos 2-cianoetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, 2-(trifenilsilil)etilo, 2-(difenilmetilsilil)etilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, el grupo T es el grupo -OC(O)JC(O)NH-^ en el que □ es un soporte solido

elegido entre resinas, en particular entre las resinas a base de poliestireno, poliacrilamida, polietilenglicol, celulosa,

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polietileno, poliester, latex, poliamida, polidimetilacrilamida, poKmeros hidrofilos sinteticos o naturales, perlas de vidrio, geles de s^lice.

Otro objeto de la invencion se refiere a un procedimiento de fabricacion de un compuesto de formula (I) de acuerdo con la invencion que comprende al menos una etapa elegida entre las etapas siguientes:

imagen2

o de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

imagen3

en la que Q y Q' representan, independientemente entre sf, un grupo benceno sustituido o no, preparacion del compuesto (Ic) a partir del compuesto (II) de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

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imagen4

o de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

imagen5

Otro objeto de la invencion se refiere a un oligomero susceptible de ser obtenido por oligomerizacion de un compuesto (I) de acuerdo con la invencion, que responde a la formula

{lc)-(A)t (XVI )t

en la que:

(Ic) tiene el mismo significado que se ha mencionado anteriormente, el grupo R del compuesto (Ic) ademas puede representar H.

k representa un numero entero comprendido entre 1 y 12,

A representa (I'a) o (I'b) en los que

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imagen6

en las que, X, Y, W, Z, R, Ri tienen la misma definicion que para el compuesto (I), R ademas puede representar H.

imagen7

en la que,

□ , D, X, Y, W, Z, R y Ri tienen la misma definicion que para el compuesto (I), R ademas puede representar H y D ademas puede representar H, k es un numero entero comprendido entre 1 y 11.

La invencion tambien se refiere a un procedimiento de preparacion de un oligonucleotido modificado que comprende al menos:

- una etapa de injerto de un compuesto (I) de acuerdo con la invencion sobre un oligonucleotido, o

- una etapa de injerto de un nucleotido sobre un oligomero de acuerdo con la invencion.

Otro objeto de la invencion se refiere a un oligonucleotido modificado susceptible de ser obtenido con el procedimiento de acuerdo con la invencion que responde a la formula (XIIa) siguiente:

J N, ■ Ny.IVr Nn- (, Mm.r M Jp - {r>y

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(I') representa un compuesto de formula (I'a) o (I'b) tal como se ha definido anteriormente, n es un numero entero comprendido entre 1 y 100,

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m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, p representa 0 o 1,

y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 e, y' es igual a 0 si p vale 0,

□ representa un soporte solido.

Otro objeto de la invencion se refiere a un oligonucleotido modificado susceptible de ser obtenido con el procedimiento de acuerdo con la invencion que responde a la formula (Xllla) siguiente:

{10 - {1^ ■ N, ■ Njr N„_r N„ -{rv -[M, ■ M2- ... ■ Mm_1 ■

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(I') representa un compuesto de formula (I'a) o (I'b) tal como se ha definido anteriormente, n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12, p vale 0 o 1 si y' es diferente de 0 y, si y' vale 0 entonces p vale 0,

y" es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 y, si p vale 0 entonces y" vale 0.

De acuerdo con un modo de realizacion, el oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion responde a la formula (Xllc):

imagen8

en la que,

n, y, N1, ... Nn-1 tienen la misma definicion que anteriormente, X, Y, Z, W tienen la misma definicion que anteriormente,

Bn representa la base del n-esimo nucleotido.

De acuerdo con un modo de realizacion, el oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion responde a la formula (Xlllc):

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en la que,

n, y, N tienen la misma definicion que anteriormente,

X, Y, Z, W tienen la misma definicion que anteriormente,

Bi representa la base del 1er nucleotido.

Otro objeto de la invencion se refiere a un dispositivo automatizado para la smtesis de nucleotidos que comprende al menos recipientes distintos que contienen:

- nucleotidos,

- activadores de acoplamiento y

- productos de lavado,

medios mecanicos de extraccion y distribucion de muestras de productos, asf como medios informaticos que permiten la realizacion controlada de estos medios mecanicos, asf como:

al menos un recipiente en el que se coloca un soporte solido injertado con un oligomero de acuerdo con la invencion, y/o al menos un recipiente que contiene un compuesto (la) o un compuesto (Ib) de acuerdo con la invencion.

Otro objeto de la invencion se refiere a un sustrato injertado con al menos un oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion, comprendiendo dicho sustrato al menos una zona de recepcion revestida con una pelfcula de oro o de platino o injertada con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida, siendo dicho sustrato de metal en el caso de la pelfcula de oro y de plastico en el caso del injerto con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida.

De acuerdo con un modo de realizacion de la invencion, los grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono se eligen entre los alquenos activados por un grupo funcional carbonilo en alfa, preferentemente los alquenos se eligen entre los grupos maleimida, acrilamida.

De acuerdo con un modo de realizacion, los grupos halogenoacetamida se eligen entre los grupos bromoacetamido e yodoacetamido .

De acuerdo con un modo de realizacion de la invencion, los grupos que comprenden al menos un triple enlace carbono-carbono se eligen entre los alquinos activados por un grupo funcional carbonilo en alfa, preferentemente los alquinos se eligen entre los grupos 2-propinamida.

De acuerdo con un modo de realizacion, el sustrato de metal es de cobre o de titanio y/o el sustrato de plastico es de poliestireno.

La invencion tambien propone un kit de ensayo que comprende:

- al menos un sustrato que comprende al menos una zona de recepcion revestida con una pelfcula metalica de oro o de platino o de un sustrato injertado con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono- carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida,

- al menos un oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion.

Otro objeto de la invencion se refiere a un uso de un sustrato de acuerdo con la invencion para realizar ensayos de

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afinidad entre un oligonucleotido y otra molecula.

Las ventajas de la presente invencion son las siguientes:

- el compuesto de tiol de la invencion es de bajo coste,

- el compuesto de tiol de la invencion se obtiene mediante un procedimiento de realizacion sencillo,

- el compuesto de tiol de la invencion se puede introducir una o varias veces en un oligonucleotido de manera simple y eficaz,

- el oligonucleotido injertado de la invencion se puede inmovilizar de manera estable sobre una superficie de oro, o sobre una superficie injertada, en particular con grupos maleimida o acrilamida,

- los oligonucleotidos de la invencion se pueden fabricar con un procedimiento totalmente automatizable.

Otras caractensticas y ventajas de la invencion apareceran con la lectura de la descripcion que sigue a continuacion de un modo de realizacion de la invencion, proporcionada a modo de ejemplo y por referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripcion de las figuras

La figura 1 representa un esquema que describe un procedimiento de smtesis de los compuestos (I).

Las figuras 2A y 2B representan respectivamente un esquema que describe un procedimiento de smtesis de un oligomero de los compuestos de la invencion a partir de compuestos (la) y a partir de compuestos (Ib).

La figura 3 representa un esquema que describe un procedimiento de smtesis de un compuesto (Xllc) oligonucleotido injertado con un oligomero de (I) en su extremo en la posicion 5'.

La figura 4 representa un esquema que expone un procedimiento de smtesis de un compuesto (Xlllc) oligonucleotido injertado con un oligomero de (I) en su extremo en la posicion 3'.

La figura 5 representa un histograma de la tasa de injerto de oligonucleotidos modificados sobre una superficie de oro.

La figura 6 representa un esquema que expone la estabilidad del injerto de oligonucleotidos modificados sobre una superficie de oro en funcion del tiempo a 60 °C.

La figura 7 representa un esquema que expone la estabilidad del injerto de oligonucleotidos modificados sobre una superficie de oro en funcion del tiempo a 80 °C.

La figura 8 representa un diagrama que esquematiza los resultados de un ensayo de ELOSA con deteccion mediante fluorescencia.

La figura 9 representa los resultados de un ensayo de hibridacion de sonda/diana con una sonda de monotiol.

La figura 10 representa los resultados de un ensayo de hibridacion de sonda/diana con una sonda de ditiol.

La figura 11 representa los resultados de un ensayo de hibridacion de sonda/diana con una sonda de tetratiol.

La figura 12 representa los resultados de un ensayo de hibridacion de sonda/diana con una sonda de tetratiol injertada sobre superficie de oro.

La figura 13a representa las reacciones entre el oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion y la superficie injertada con grupos alquenilos o alquinilos activados.

La figura 13b representa las reacciones entre el oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion y la superficie injertada con grupos alquenilos o alquinilos con activacion luminosa (A = 265 nm).

La figura 14 representa los resultados de un ensayo de hibridacion de sonda/diana con sondas que presentan respectivamente 1, 2, 4, 6 y 8 compuestos de tiol de acuerdo con la invencion.

Resumen de los modos de realizacion de la invencion

La presente invencion se refiere a la preparacion y el uso de compuestos de estructura de fosforamidita, H-fosfonato o de compuestos unidos a un soporte solido que presentan un grupo funcional tiol protegido. Estos compuestos de tiol estan destinados a su introduccion en oligonucleotidos. Los oligonucleotidos obtenidos de este modo pueden presentar varios grupos funcionales tiol.

Compuesto de tiol

Los compuestos de la presente invencion responden a la formula (I) siguiente:

T

Y

/-w (i)

D-0 z

/

S

\

R

en la que:

T es un grupo elegido entre -O-P(OR-i)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)JC(O)NH-^,

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◦ Ri se elige entre los grupos 2-cianoetilo, R'iR'2R'3SiCH2CH2, y R'i, R'2, R'3, identicos o diferentes, representan un grupo elegido entre los alquilos lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono y los arilos en C6-C12,

◦ R2 se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono, pirrolidina

◦ □ representa un soporte solido,

D es un grupo protector de alcoholes elegido entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo, fluorenilmetiloxicarbonilo y terc-butil-dimetilsililo,

En el sentido de la presente invencion, por « alcano tri-ilo » se hace referencia a los alcanos triilo, lineales, ramificados o dclicos, opcionalmente sustituidos con uno o varios grupos alquilo.

Entre los grupos arilos tri-ilos que pueden estar presentes en el compuesto de acuerdo con la invencion, se pueden mencionar benceno tri-ilo, naftaleno tri-ilo.

Entre los grupos aralcanos tri-ilos que pueden estar presentes en el compuesto de acuerdo con la invencion, se pueden mencionar 1,3,5-trimetilbenceno tri-ilo, trimetilnaftaleno tri-ilo.

El compuesto (I) se puede separar en tres subcompuestos (la), (Ib) e (Ic) que responden a las siguientes formulas (la), (Ib) y (Ic), en las que los parametros X, Y, Z, R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que se ha expuesto anteriormente para la formula (I):

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imagen11

Preferentemente, Ri se elige entre los grupos 2-cianoetilo y R'iR'2R'3SiCH2CH2, y R'i, R'2, R'3 identicos o diferentes representan un grupo elegido entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de 1 a 6 atomos de carbono, fenilo; preferentemente Ri se elige entre los grupos 2-cianoetilo y R'iR'2R'3SiCH2CH2, y R'i, R'2, R'3 identicos o diferentes representan un grupo elegido entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de i a 3 atomos de carbono, fenilo; incluso mas preferentemente Ri se elige entre los grupos 2-cianoetilo, 2- (trimetilsilil)etilo, 2-(trifenilsilil)etilo, 2-(difenilmetilsilil)etilo.

Preferentemente, R2 se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de i a 6 atomos de carbono. Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr).

Preferentemente, el soporte solido □ se elige entre las resinas, en particular entre las resinas a base de poliestireno, poliacrilamida, polietilenglicol, celulosa, polietileno, poliester, latex, poliamida, polidimetilacrilamida, polfmeros hidrofilos sinteticos o naturales, perlas de vidrio, geles de sflice.

Preferentemente, W se elige entre los grupos CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexanos triilo, y bencenos triilo.

Preferentemente, D se elige entre 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr), 9-fenilxanten-9-ilo (pixilo) o Fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). El grupo protector pixilo se describe en particular en el documento de Chattopadhyaya y Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., i978, 639-640. Otro grupo protector de alcoholes puede ser un grupo terc-butil-dimetilsililo, en este caso, sera particularmente preferente un soporte de poliestireno.

Preferentemente, Z se elige entre los grupos aminoalquilo en Ci-C6, alcoxi en Ci-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6, NCO-alquilos en Ci-C6, CON-alquilos en Ci-C6.

Preferentemente, Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en Ci-C6, aminoalquilos en Ci-C6, alcoxi en Ci-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6.

Preferentemente, X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en Ci-C6, aminoalquilos en Ci-C6, alcoxi en Ci-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6.

Preferentemente, R se elige entre los grupos acilo en Ci-Ci2, S-alquilos en Ci-C6, S-arilos en C6, S-heteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C6, S-cicloalquilos en C6, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C6.

De acuerdo con un modo de realizacion, los alquilos lineales o ramificados se eligen entre los grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, isopropilo, isobutilo, ferc-butilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, les aminoalquilos se eligen entre los grupos aminometilo, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo, aminopentilo, aminohexilo, aminoheptilo, aminooctilo, aminononilo, aminodecilo, aminoundecilo, aminododecilo, aminoisopropilo, aminoisobutilo, amino-terc-butilo que comprende uno o varios atomos de nitrogeno.

De acuerdo con un modo de realizacion, los alcoxi se eligen entre los grupos metoxi, etoxi, propiloxi, oxibutiloxi,

pentiloxi, hexiloxi, heptiloxi, octiloxi, noniloxi, deciloxi, undeciloxi, dodeciloxi, isopropiloxi, isobutiloxi, ferc-butiloxi que comprende uno o varios atomos de oxfgeno.

De acuerdo con un modo de realizacion, los cicloalquilos se eligen entre los ciclos, que comprenden opcionalmente una o varias insaturaciones, que comprenden entre 3 y 12 atomos de carbono, preferentemente 6 atomos de 5 carbono.

De acuerdo con un modo de realizacion, los cicloheteroalquilos se eligen entre les ciclos sustituidos con uno o varios atomos de nitrogeno y/o de oxfgeno, que comprenden opcionalmente una o varias insaturaciones y que comprenden entre 3 y 12 atomos de carbono, preferentemente 5 atomos de carbono y un atomo de nitrogeno o de oxfgeno.

De acuerdo con un modo de realizacion, los NCO-alquilos y CON-alquilos son grupos a los que los alquilos pueden 10 ser alquilos lineales o ramificados elegidos entre los grupos metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, isopropilo, isobutilo, ferc-butilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y/o R1 es un grupo cianoetilo.

De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el compuesto de tiol (la) es el compuesto (VI) que responde a la formula siguiente:

15

20

imagen12

en la que,

n es un numero entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente comprendido entre 1 y 6, R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que anteriormente para (la).

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

Preferentemente, R es un grupo acetilo.

Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.

De acuerdo con otro modo de realizacion, el compuesto de tiol (la) es el compuesto (VII) que responde a la formula siguiente:

imagen13

25 en la que,

n es un numero entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente comprendido entre 1 y 6,

R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que anteriormente para (la).

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

Preferentemente, R es un grupo acetilo.

30 Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto de tiol (Ic) es el compuesto (VIII) que responde a la formula

5

10

15

en la que,

n es un numero entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6.

R, D y □ tienen la misma definicion que anteriormente para (Ic).

Preferentemente, R es un grupo acetilo. Preferentemente, J es un grupo etilo. Preferentemente, D es 4,4'- dimetoxitritilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto de tiol (la) es el compuesto (IX) de formula:

imagen15

en la que,

n es un numero entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6,

R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que anteriormente para (la).

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

Preferentemente, R es un grupo acetilo.

Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto de tiol (la) es el compuesto (X) de formula:

imagen16

en la que,

10

15

20

n es un numero entero comprendido entre 1 y 12, preferentemente entre 1 y 6,

R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que anteriormente para (la).

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

Preferentemente, R es un grupo acetilo.

Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto de tiol (la) es el compuesto (XI) de formula:

imagen17

en la que,

R, R1, R2 y D tienen la misma definicion que anteriormente para (la).

Preferentemente, R2 es un grupo isopropilo (iPr) y R1 es un grupo cianoetilo.

Preferentemente, R es un grupo acetilo.

Preferentemente, D es 4,4'-dimetoxitritilo.

Procedimiento de fabricacion

El procedimiento de fabricacion de los compuestos (la), (lb) e (Ic) se representa en el esquema de la figura 1. Los compuestos (la), (lb) e (lc) se obtienen a partir del mismo compuesto (ll) que presenta la formula siguiente:

imagen18

en la que, D, X, W, Y, Z y R tienen la misma definicion que en el compuesto de tiol (l).

El compuesto de formula (la) se puede obtener de acuerdo con la reaccion representada en el esquema siguiente:

5

10

D-0

HO: /OR,)

\: Cl—P

Y /: N-R2
Y /

X 1 /S: R2 ^-w

Z: D-0

/
/

O-PlOFLjNtRO,

R

(II)

(la)

o de acuerdo con la reaccion representada en el esquema siguiente, preferentemente en presencia de la sal de tetrazolida de diisopropilamina:

imagen19

en la que, Q y Q' representan, independientemente entre s^ un grupo benceno sustituido o no.

La reaccion precedente de obtencion del compuesto (la) o (Ib) se realiza a partir del compuesto (II), preferentemente en presencia de una base, por ejemplo diisopropiletilamina (DIEA), en un disolvente anhidro, tal como diclorometano anhidro.

El compuesto de formula (Ic) tambien se obtiene a partir del compuesto (II) pero preferentemente de acuerdo con la etapa de reaccion representada en el esquema siguiente:

imagen20

La reaccion precedente de obtencion del compuesto (Ic) se realiza preferentemente en un disolvente anhidro, tal como piridina, en presencia de una base tal como trietilamina.

El compuesto (Ic) tambien se puede obtener de acuerdo con el esquema de reaccion siguiente:

5

imagen21

Un objeto de la presente invencion es el compuesto (II) de formula mencionada anteriormente en la que los grupos D, X, W, Z, Y y R tienen la misma definicion que en el compuesto (I).

El compuesto de formula (II) se puede obtener a partir del compuesto (III) de acuerdo con la etapa de reaccion que se describe a continuacion:

10

imagen22

en la que G es un halogeno, preferentemente bromo o yodo.

La creacion descrita anteriormente se realiza preferentemente en un disolvente anhidro, tal como tolueno anhidro y en presencia de un eter corona.

El compuesto (III) se puede obtener a partir del compuesto (IV) de acuerdo con la etapa de reaccion que se describe 15 a continuacion:

5

10

15

20

25

30

35

imagen23

en la que,

G y G' son atomos de halogeno identicos o diferentes, preferentemente G y G' son atomos de bromo o yodo,

Z' es un grupo aminoalquilo en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloheteroalquilo oxigenado o nitrogenado en C3- C12, NCO-alquilo en C1-C12, CON-alquilo en C1-C12,

Z" es un grupo alquilo lineal o ramificado en C1-C12, aminoalquilo en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilo en C3-C12, cicloheteroalquilo oxigenado o nitrogenado en C3-C12, NCO-alquilo en C1-C12, CON-alquilo en C1- C12,

estando el compuesto dihalogenado G-Z"-G' destinado a reaccionar con el grupo Z' del compuesto (IV) para llevar a la formacion del grupo Z-G del compuesto (III).

La etapa de obtencion del compuesto (III) se realiza preferentemente en presencia de un hidruro alcalino, tal como NaH.

El compuesto (IV) se puede obtener a partir del compuesto comercial (V) mediante proteccion del grupo funcional alcohol, de acuerdo con la etapa de reaccion siguiente:

imagen24

Esta etapa de proteccion del grupo funcional alcohol se realiza en condiciones bien conocidas por el experto en la materia, en funcion de la eleccion de D.

De acuerdo con un modo de realizacion, el compuesto (IV) se obtiene a partir del compuesto (V) por reaccion con 4,4'-cloruro de dimetoxitritilo (DMTr-Cl) preferentemente en un disolvente, tal como piridina con el fin de proteger el grupo funcional alcohol.

De acuerdo con otro modo de realizacion, el compuesto (IV) se obtiene a partir del compuesto (V) a partir de cloruro de 9-fenilxanten-9-ilo (pixilo-Cl) en las condiciones que se describen en el documento de Chattopadhyaya y Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978, 639-640.

De acuerdo con otro modo de realizacion, el compuesto (IV) se obtiene a partir del compuesto (V) por reaccion con cloruro de fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc-Cl) en condiciones bien conocidas por el experto en la materia.

En las formulas precedentes (II) a (V), X, Y, W, Z, D, R, Ri, R2 tienen las mismas definiciones que en la definicion del compuesto (I) indicado anteriormente.

Preferentemente, el compuesto (V) de partida es 1,1,1-tris(hidroximetil)etano o acido 2,2-bis(hidroximetil) propionico o 1,3,5-tris(hidroxietoxi) benceno o 1,3,5-tris(hidroximetil)ciclohexano o 2-amino-1,3-propanodiol.

Oligomero del compuesto de tiol

Un objeto de la presente invencion se refiere a un oligomero formado a partir de compuestos de tiol de formula (I) descritos anteriormente. El procedimiento de smtesis de tales oligomeros se describe en el esquema de la figura 2A para la oligomerizacion de compuestos de formula (Ia) y en el esquema de la figura 2B para la oligomerizacion de compuestos de formula (Ib).

En una primera etapa, el grupo funcional alcohol del compuesto (Ic) esta desprotegida para conducir al compuesto (Ic.1). Esta etapa de desproteccion se realiza con medios bien conocidos por el experto en la materia,

preferentemente en presencia del acido di o tricloroacetico para los grupos DMTr y Pixilo y piperidina para el grupo Fmoc.

imagen25

A continuacion, el compuesto (Ic.1) reacciona con el compuesto (la) o (Ib) para conducir respectivamente al compuesto de fosfitriester (XIV')1 o H-fosfonato diester (XV') 1

5

imagen26

A continuacion, el compuesto (XIV')1 se oxida preferentemente en presencia de diyodo, siendo a continuacion el diyodo desplazado por el agua que aporta el atomo de ox^geno del enlace triester de fosfato, para conducir al compuesto fosfotriester (XIV)1. Esta etapa de oxidacion se realiza despues de cada etapa de acoplamiento entre un 10 compuesto (XIV)i y un compuesto (la).

imagen27

A continuacion, de la misma manera, el compuesto (XIV)1 reacciona con (k-1) compuestos (la) para conducir, despues de (k-1) oxidaciones, al compuesto (XlV)k:

imagen28

5 y el compuesto (XV')1 se desprotege sobre su grupo funcional alcohol para dar (XV")1 que reacciona con (k-1) compuestos (Ib) para conducir al compuesto (XV')k:

imagen29

A continuacion, el compuesto (XV')k se oxida, preferentemente en presencia de diyodo y de agua para conducir al compuesto fosfodiester (XV)k.

5

10

15

20

25

imagen30

Por ultimo, una ultima etapa opcional consiste en desproteger los compuestos (XIV)k o (XV)k para conducir al mismo compuesto (I)k.

imagen31

Preferentemente, el oligomero resulta de la oligomerizacion de 2 a 12 compuestos (I), en particular entre 2 y 8 compuestos (I), es decir que el oligomero puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 compuestos (I). Preferentemente, el oligomero de tiol destinado a ser injertado sobre una superficie de oro comprende entre 3 y 8, de forma ventajosa entre 4 y 8 compuestos (I) y el oligomero de tiol destinado a la conjugacion con un sustrato injertado con un grupo que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o un grupo halogenoacetamida, en particular maleimida o acrilamida, comprende entre 2 y 6 compuestos (I).

De acuerdo con un modo de realizacion, el oligomero se fabrica unicamente a partir de compuestos de formula (Ia) o de compuestos de formula (Ib). La oligomerizacion se realiza por reaccion entre grupo funcional alcohol desprotegido de un primer compuesto (I) y el grupo funcional fosforamidita o H-fosfonato de un segundo compuesto (I).

Tambien es posible proporcionar la fabricacion de un oligomero a partir de una mezcla de compuestos (Ia) y de compuestos (Ib), modo de realizacion que presenta menos interes.

Preferentemente, el oligomero se fabrica usando la qmmica de las fosforamiditas, es decir, por oligomerizacion de compuestos de tipo (Ia).

La oligomerizacion se puede realizar sobre soporte solido o en solucion. Preferentemente, la oligomerizacion se realiza sobre soporte solido. De hecho, la oligomerizacion en solucion implica etapas de purificaciones mediante cromatograffa, etapas que no son economicamente viables, en particular para las pequenas cantidades necesarias en las aplicaciones de diagnostico.

Otro objeto de la invencion descrito anteriormente es un soporte solido injertado con un oligomero de un compuesto

(Ia) o de un compuesto (Ib) y que responde a la formula (XVI)k que sigue a continuacion:

en la que:

imagen32

k representa un numero entero comprendido entre 1 y 11

(Ic) tiene el mismo significado que se ha mencionado anteriormente,

(I') representa (I'a) o (I'b), con:

5

10

imagen33

El oligomero sobre soporte solido □ formado a partir de un compuesto (Ic) y de compuestos de formula (la) responde a la formula (XIV)k siguiente:

imagen34

en la que □, D, X, Y, W, Z, J, R y Ri tienen la misma definicion que anteriormente y R ademas puede representar H, k es un numero entero comprendido entre 1 y 11.

El oligomero sobre soporte solido □ formado a partir de un compuesto (Ic) y de compuestos de formula (lb) responde a la formula (XV)k siguiente:

imagen35

en la que □, D, X, Y, W, Z, J y R tienen la misma definicion que anteriormente y R ademas puede representar H, k es

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un numero entero comprendido entre 1 y 11.

En el caso en el que el oligomero se forma sobre soporte solido □ a partir de un compuesto (Ic) y de compuestos

(Ib), el compuesto obtenido (XV)k responde a la misma formula que el compuesto (XIV)k pero en la que R1 es un atomo de hidrogeno despues de oxidacion de los enlaces de H-fosfonato diesteres.

Al final de la reaccion de oligomerizacion, se puede proporcionar la desproteccion de los grupos funcionales tiol mediante procedimientos clasicos y entonces R representa H.

Oligonucleotidos modificados

Otro objeto de la presente invencion se refiere a un oligonucleotido modificado, que comprende al menos un nucleotido, preferentemente al menos dos nucleotidos y al menos un compuesto de tiol (I) descrito anteriormente.

En la presente solicitud, un oligonucleotido designa una cadena que comprende entre 2 y 100 nucleotidos.

El injerto del compuesto de tiol de acuerdo con la invencion se realiza en la posicion 3', en la cadena, o en la posicion 5' de un oligonucleotido.

El procedimiento de preparacion de un oligonucleotido modificado de este tipo comprende al menos:

- una etapa de injerto de un compuesto (I) sobre un oligonucleotido para dar un 5'-tiol oligonucleotido, o

- una etapa de injerto de un nucleotido sobre un oligomero de un compuesto (I) para dar un 3'-tiol oligonucleotido.

De acuerdo con un modo de realizacion de la invencion, el oligonucleotido injertado responde a la formula (XIIa) siguiente:

□- Mi ■ Ny ■ -■ N„_r Nn- Mm.r Mjp ■ <l')y (XIIa)

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ...Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(I') representa un compuesto de formula (I'a) o (I'b), n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, p representa 0 o 1,

□ representa un soporte solido.

El oligonucleotido modificado (XIIa) presenta uno o varios compuestos de tiol en la posicion 5' de un oligonucleotido N o bien en la cadena de nucleotidos. Este compuesto se obtiene mediante un injerto de un compuesto (I) seguido por una elongacion del oligomero obtenido en (I) en la posicion 5' de un oligonucleotido. A continuacion, en el caso en el que p = 1, la elongacion de la cadena de nucleotidos continua. A continuacion, de la misma manera, se puede considerar el injerto de uno o varios compuestos (I) complementarios en la posicion 5' del oligonucleotido M.

Un esquema de obtencion del compuesto (XIIa) se describe en la figura 3 en la que los compuestos de tiol son de tipo (Ia) y p es igual a 0. Las tres primeras etapas de fabricacion del compuesto (XIIa) permiten la smtesis de un oligonucleotido. La smtesis del oligonucleotido se realiza sobre soporte solido con un procedimiento clasico bien conocido por el experto en la materia. Durante la primera etapa, un primer nucleotido se injerta sobre un soporte solido, a continuacion los otros nucleotidos se injertan siguiendo procedimientos de smtesis bien conocidos por el experto en la materia. Se obtiene el siguiente compuesto:

□-N,-N2"-Nn.i (Xlla.1)

A continuacion, otros nucleotidos se injertan con un procedimiento identico para conducir al compuesto de formula (XIIa.2).

Durante la etapa siguiente, un compuesto de tiol de acuerdo con la invencion de tipo (Ia) se injerta en la posicion 5' del oligonucleotido (XIIa.2) para conducir al compuesto (XIIa.3):

□-Ni-Na-..-Nn.,-Nn(l1a) (XIIa. 3)

Durante esta etapa, el injerto se realiza de manera clasica por reaccion del grupo funcional fosforamidita del

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compuesto (la) con el grupo funcional alcohol en la posicion 5' del nucleotido terminal del compuesto (XIIa.2).

En el esquema de la figura 3, se describe un ejemplo de smtesis con la oligomerizacion del compuesto de tiol de tipo (la); un procedimiento de smtesis similar se usa para la smtesis de oligonucleotidos modificados con compuestos de tiol de tipo (lb).

A continuacion, la oligomerizacion tal como se estila anteriormente, en particular en las figuras 2A y 2B, continua a partir del compuesto (Xlla.3) mencionado anteriormente, por reaccion con uno o varios compuestos (la) o (lb) para conducir al compuesto (Xlla.4) de formula:

□ -N1-NI-...-Nn.r I^{r*v

o de formula desarrollada (en el caso en el que p = 0):

imagen36

en la que,

□ , D, R, X, Y, W, Z, Ri tienen la misma definicion que para el compuesto (l) y Ri ademas puede representar H, n, y, y Ni, N2, ...Nn-i tienen la misma definicion que para el compuesto (Xlla),

Bn representa una base usada clasicamente en una cadena de nucleotidos.

En el caso en el que la elongacion del oligomero se realiza con compuestos de tipo (lb), el oligonucleotido modificado presenta una estructura similar a la del oligonucleotido modificado (Xlla.4) pero en la que Ri representa H.

Un injerto posterior de compuestos nucleotidos Mi, M2, ...Mm es posible a continuacion para conducir al producto (Xlla) con p = i. En este caso, la elongacion tambien se realiza sobre soporte solido.

Esta etapa de injerto se realiza de manera clasica con procedimientos conocidos por el experto en la materia.

De acuerdo con otro modo de realizacion de la invencion, el oligonucleotido injertado responde a la formula (Xllla) siguiente:

(lc)-{IVi- N,-Nr -- Nn-r Nn -M2- ■ M^lty (Xllla)

en la que,

Ni, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

Mi, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(l') representa un compuesto de formula (l'a) o (l'b),

n es un numero entero comprendido entre i y i00,

m es un numero entero comprendido entre i y i00,

y es un numero entero comprendido entre i y i2,

y' es un numero entero comprendido entre 0 y i2,

p vale 0 o i si y' es diferente de 0 y, si y' vale 0 entonces p vale 0,

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Un esquema que representa un modo de smtesis del compuesto (XIIIc) se describe en la figura 4 usando un oligomero formado a partir de un compuesto de tipo (Ic) en el que J es un grupo etilo, y que compuestos de tipo (Ib).

La smtesis del compuesto de formula (XIIIc) comprende una primera etapa que consiste en la oligomerizacion del compuesto de tiol de acuerdo con la invencion de formula (I) cuyo procedimiento se ha descrito anteriormente para conducir al compuesto de formula (XIIIa.1):

(Xllla.11

en la que,

(Ic) tiene la misma definicion que anteriormente,

(I') representa un grupo de tipo (I'a) o (I"b), en el que

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o en formula desarrollada en el caso en el que (I') representa (I"b):

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En una segunda etapa, un primer nucleotido procedimiento se injerta sobre el oligomero de formula (XIIIa.1) para conducir al compuesto de formula (XIIIa.2) que sigue a continuacion:

(fcJ-fl'Vr Ni (XII la. 2)

Esta etapa de injerto se realiza por reaccion entre el grupo funcional alcohol desprotegido al final de la cadena de oligomero del compuesto (XIIIa.1) y el grupo funcional fosforamidita o H-fosfonato del primer nucleotido.

El oligonucleotido modificado se sintetiza a continuacion sin importar con que procedimiento conocido por el experto en la materia, en particular un procedimiento clasico bien conocido por el experto en la materia por reaccion entre el grupo funcional alcohol en la posicion 5' del primer nucleotido presente en el oligomero del compuesto de tiol y el grupo funcional fosforamidita o H-fosfonato en la posicion 3' de un segundo nucleotido. La smtesis continua mediante etapas sucesivas similares de elongacion de la cadena de nucleotidos bien conocidas por el experto en la materia para conducir al compuesto de formula (XIIIa).

Otro objeto de la presente invencion se refiere a los compuestos obtenidos a partir de los compuestos de formula (XIIa) y (XIIIa) mencionadas anteriormente despues de romper el enlace que une el oligonucleotido modificado al soporte solido. La rotura del enlace se realiza a nivel del grupo funcional ester.

Por lo tanto, de acuerdo con un modo de realizacion de la invencion, el oligonucleotido no soportado presenta la estructura (XIIb) siguiente:

N, ■ Nt Nn- <l,)y-(M1 (XIIb)

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en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 e, y' es igual a 0 si p vale 0.

La retirada del soporte se realiza en dos etapas en primer lugar con una base fuerte no nucleofila (piperidina o DBU) para eliminar los grupos cianoetilo, si estuvieran presentes (caso de las fosforamiditas), y en segundo lugar con un procedimiento clasico conocido por el experto en la materia, preferentemente con un tratamiento del compuesto (XIIa) con hidroxido de amonio (NH4OH). Es necesario eliminar los grupos cianoetilo antes de la desproteccion de los grupos tiol ya que forman acrilonitrilo durante su eliminacion que reacciona fuertemente con los grupos funcionales tiol.

De acuerdo con otro modo de realizacion de la invencion, el oligonucleotido no soportado presenta la estructura (XIIIb) siguiente:

> V-rN, -N3r . - I^rN„- <I‘V’ KM, - M2 - -Mm_r MJp^V (XIIIb)

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(Ic') representa el compuesto obtenido a partir de (Ic) mediante rotura del enlace ester con el soporte solido □,

(I') representa un compuesto de formula (i'a) o (I'b),

n es un numero entero comprendido entre 1 y 100,

m es un numero entero comprendido entre 1 y 100,

y es un numero entero comprendido entre 1 y 12,

y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12,

p vale 0 o 1 si y' es diferente de 0 y, si y' vale 0 entonces p vale 0,

La retirada del soporte se realiza con un procedimiento clasico conocido por el experto en la materia, preferentemente con un tratamiento del compuesto (XIIIa) con hidroxido de amonio (NH4OH).

Otro objeto de la presente invencion se refiere a los oligonucleotidos modificados (XIIc) y (XIIIc) obtenidos respectivamente a partir de los compuestos (XIIa) y (XIIIa) por desproteccion del grupo funcional tiol y rotura del enlace que une el compuesto al soporte solido (Figuras 3 y 4 respectivamente).

En el caso en el que el oligonucleotido esta modificado con uno o varios compuestos de tiol de tipo (Ia), despues de la desproteccion del grupo funcional tiol y del grupo funcional fosforamidita del compuesto (XIIa) con un tratamiento conocido por el experto en la materia, se obtiene el compuesto de formula (XIIc):

N, ■ N2- Nn- {I")y-(M1 Mm_r Mjp-(Dy (XIIc)

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ...Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

imagen39

n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, p representa 0 o 1,

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y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 e, y' es igual a 0 si p vale 0. o en la formula desarrollada en el caso en el que p = 0:

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en la que,

X, Y, W, Ztienen la misma definicion que para el compuesto (I),

Ni, ... Nn, n, y tienen la misma definicion que para el compuesto (Xlla),

Bn representa una base usada clasicamente en una cadena de nucleotidos.

En el caso en el que el oligonucleotido esta modificado con uno o varios compuestos de tiol de tipo (lb), despues de la desproteccion del grupo funcional tiol del compuesto (Xllla) con un tratamiento conocido por el experto en la materia, se obtiene el compuesto de formula (Xlllc):

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en la que,

Ni, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

Mi, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(lc') representa el compuesto obtenido a partir de (Ic) mediante rotura del enlace ester con el soporte solido □,

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n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12, p vale 0 o 1 si y' es diferente de 0 y, si y' vale 0 entonces p vale 0,

o en la formula desarrollada en el caso en el que y' = p = 0:

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en la que,

X, Y, W, Ztienen la misma definicion que para el compuesto (I),

N2, ... Nn, n e ytienen la misma definicion que para el compuesto (XIIa),

Bn corresponde una base usada clasicamente en una cadena de nucleotidos.

Durante la smtesis del oligonucleotido, el grupo funcional tiol esta preferentemente protegido. De hecho, el grupo funcional tiol puede reaccionar con el grupo funcional fosforamidita entrante.

De acuerdo con un modo de realizacion, la etapa de desproteccion de los grupos funcionales tiol y de eliminacion del soporte solido se realiza en una sola etapa de tratamiento del oligonucleotido modificado (XIIa) o (xilla).

De acuerdo con un modo de realizacion, la eliminacion del soporte solido se realiza en una primera etapa y a continuacion la desproteccion de los grupos funcionales tiol se realiza en una segunda etapa.

El oligonucleotido final (Xllc) (respectivamente el oligonucleotido final (Xlllc)) se obtiene independientemente del compuesto de tiol de partida, ya sea a partir del compuesto (la) o del compuesto (lb). De hecho, independientemente del monomero (la) o (lb) usado, la unidad de monomero de tiol que resulta de la reaccion de oligomerizacion corresponde al compuesto (l") descrito anteriormente.

Los soportes injertados de formulas (XVl)k de acuerdo con la invencion permiten comenzar la smtesis de oligonucleotidos. En particular se puede considerar la preparacion de soportes solidos injertados con secuencias de oligomeros de manera industrial o semiindustrial que se usaran como secuencia de politiol en la posicion 3' de un oligonucleotido.

Kit de smtesis

Un soporte solido de este tipo injertado con un primer oligomero (lc) - (l')k se puede usar de forma ventajosa en un kit de smtesis de oligonucleotidos modificados. En un kit de este tipo, se puede asociar con un soporte que comprende zonas de recepcion tales como los pocillos de una placa de multiples pocillos en los que las reacciones de smtesis se realizan con procedimientos tales como los que se conocen para la realizacion de reacciones de oligomerizacion de nucleotidos.

Dispositivo automatizado

Un kit de este tipo se puede usar en un dispositivo automatizado para la smtesis de oligonucleotidos. En este caso, un dispositivo de este tipo comprende al menos

• recipientes distintos que contienen:

- nucleotidos,

- activadores de acoplamiento y

- productos de lavado,

• medios mecanicos de extraccion y distribucion de muestras de productos, asf como medios informaticos que permiten la realizacion controlada de estos medios mecanicos, asf como:

• al menos un recipiente en el que se coloca un soporte solido injertado con un oligomero (XVl)k de los compuestos (l) tal como se ha descrito anteriormente, y/o al menos un recipiente que contiene un compuesto (la) o un compuesto (lb).

Un dispositivo automatizado de este tipo tambien comprende medios mecanicos de toma de muestras en los diferentes recipientes y medios de distribucion de estas muestras en el recipiente que comprende el soporte solido.

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Los medios de este tipo pueden consistir en un conjunto de tubos de circulacion de fluidos y valvulas, colocados opcionalmente en circuitos microfluidizados, o en brazos articulados equipados con pipetas de extraccion. El dispositivo tema de estado tamil comprende medios informaticos (programas) que permiten la realizacion controlada de estos medios mecanicos, permitiendo la realizacion de reacciones secuenciadas.

Funcionalizacion de superficie

Los oligonucleotidos modificados de acuerdo con la invencion se pueden depositar sobre un sustrato con el fin de funcionalizar la superficie de este sustrato. El sustrato puede ser metalico o bien de polfmero.

De acuerdo con un modo de realizacion, el sustrato es metalico, por ejemplo de cobre o de titanio, y esta revestido parcialmente o en toda su superficie con una pelfcula de oro o de platino, preferentemente de oro.

De acuerdo con otro modo de realizacion, el sustrato de polfmero, por ejemplo de poliestireno, esta injertado con grupos funcionales alquenilo o alquinilo o bromoacetamida o yodoacetamida.

De acuerdo con un modo de realizacion, el sustrato de polfmero es un polfmero conductor.

De acuerdo con un modo de realizacion, los grupos funcionales alquenilo o alquinilo se activan con un el grupo funcional carbonilo en alfa, preferentemente los grupos funcionales alquenilo o alquinilo se eligen entre los grupos maleimida, acrilamida, yodoacetamido o bromoacetamido, 2-propinamida o N-alquil-2-propinamida.

Por ejemplo, el sustrato puede comprender zonas de recepcion revestidas con una pelfcula de oro o de platino por revestidas con grupos funcionales alquenilo o alquinilo, tales como grupos funcionales maleimida o acrilamida sobre los que se deposita el oligonucleotido modificado.

Como se ilustra en la figura 13a, en la que el compuesto gpt - SH representa el oligonucleotido modificado (XIIc) o el oligonucleotido modificado (XIIIc) de acuerdo con la invencion, el grupo funcional tiol reacciona con el doble enlace carbono-carbono o el triple enlace carbono-carbono activada con un el grupo funcional carbonilo en alfa. Desde la parte alta hacia la parte baja de la figura 13a, la primera reaccion de funcionalizacion corresponde una superficie injertada con maleimida, la segunda reaccion corresponde a una superficie injertada con acrilamida, la tercera reaccion corresponde a una superficie injertada con yodoacetamido o bromoacetamido y la cuarta reaccion corresponde a una superficie injertada con 2-propinamida realizada en el caso de un oligonucleotido (XIIc) o (XIIIc) modificado con dos compuestos de tiol de acuerdo con la invencion.

En el caso de la figura 13b, la superficie esta injertada con grupos alquenilo (1a reaccion) y alquinilo (2a reaccion) no activados. La reaccion entre el grupo funcional tiol del oligonucleotido modificado (XIIc) o (XIIIc) se realiza con la ayuda de una activacion luminosa (A = 265 nm). La primera reaccion de funcionalizacion se realiza con la ayuda de un oligonucleotido modificado de monotiol que se representa esquematicamente mediante gpt - SH y la segunda reaccion se realiza con la ayuda de un oligonucleotido modificado de ditiol.

En el caso en el que soportes de injertado con grupos funcionales alquinilo, la funcionalizacion de la superficie con un oligonucleotido modificado de politiol es muy interesante ya que conduce a una estructura dclica gracias a los reacciones sucesivas entre un primer el grupo funcional tiol y el grupo funcional -ino en una primera etapa y a continuacion entre un segundo grupo funcional tiol y el grupo funcional -eno resultante en una segunda etapa (figuras 13a y 13b).

De acuerdo con un modo de realizacion preferente, el sustrato esta injertado con grupos maleimida o acrilamida.

Por lo tanto, la invencion permite por ejemplo con que analizar una superficie de oro mediante la creacion de un enlace o enlaces de oro-azufre entre la superficie del sustrato y el oligonucleotido modificado o bien funcionalizado una superficie injertada con grupos funcionales maleimida o acrilamida mediante la creacion de un enlace o enlaces tioeter.

La fijacion de los oligonucleotidos modificados a la superficie del sustrato se realiza por contacto de la superficie a tratar con una solucion que comprende el oligonucleotido modificado, tal como los representados con las formulas (XIIc) y (XIIIc). Por lo general tambien se considera una o varias etapas posteriores de lavado y de secado. En general, la solucion de oligonucleotidos modificados se encuentra en una concentracion comprendida entre 0,10 pM y 500 pM, preferentemente entre 0,50 pM y 100 pM para la superficie de oro y entre 50 y 200 nM, preferentemente entre 75 nM y 150 nM para la maleimida o la acrilamida seguido de un lavado para eliminar lo que no ha reaccionado.

La presencia de varios atomos de azufre en el oligonucleotido permite crear varios enlaces de oro-azufre, o varios enlaces de tioeter, lo que permite estabilizar el oligonucleotido sobre la superficie.

De acuerdo con un modo de realizacion, el sustrato no es plano, por ejemplo, se encuentra en forma de micropartfculas o nanopartfculas. Los oligonucleotidos modificados de acuerdo con la invencion se pueden insertar a continuacion sobre estas micropartfculas o nanopartfculas. Preferentemente, estas partfculas son magneticas. De hecho, estas partfculas magneticas se pueden llevar a continuacion facilmente a la superficie de un electrodo o al

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fondo de los pocillos de una microplaca, con fines de un ensayo de deteccion, mediante la aplicacion de un iman. Fiiacion a marcadores o ligandos

Los oligomeros de la presente invencion tambien se pueden usar con el fin de unir marcadores o ligandos a moleculas o polfmeros mediante uno o varios puntos de union. Los marcadores o ligandos pueden ser, por ejemplo, marcadores enzimaticos, agentes cromogenos, fluorogenos, radiactivos, o quimioluminiscentes, metales, iones metalicos, hormonas, protemas, peptidos, sacaridos, oligosacaridos, agentes nucleolfticos o proteolfticos, agentes de enlace, tales como una biotina, un antfgeno, un hapteno, un anticuerpo o un receptor. Los marcadores o ligandos pueden ser todos estos compuestos de interes biologico que pueden influir en el transporte de los oligonucleotidos a traves de las membranas biologicas y/o que pueden modificar la solubilidad de los oligonucleotidos.

Kits de ensayo

Otro objeto de la invencion consiste en un kit de ensayo y/o de diagnostico que comprende al menos un soporte que comprende al menos una zona de recepcion, sobre la que se coloca al menos un oligonucleotido modificado de acuerdo con la invencion.

Por lo tanto, el kit de ensayo se puede usar para el cribado de moleculas biologicamente activas o para ensayos de diagnostico o secuenciacion. Se puede considerar que el kit de diagnostico comprenda varias zonas de recepcion distintas, sobre las que se deposita un soporte solido injertado con oligonucleotidos identicos o distintos. Por ejemplo, los soportes solidos injertados con oligonucleotidos identicos o distintos se pueden colocar en zonas de recepcion distintas de un sustrato revestido con una pelfcula de oro o de un sustrato injertado con grupos funcionales que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos funcionales halogenoacetamida, preferentemente grupos funcionales maleimida o acrilamida con el fin de formar un soporte de ensayo y/o de diagnostico.

En particular, el soporte puede ser un electrodo de oro. El kit de ensayo puede comprender una celda electroqmmica que comprende un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia. El electrodo de trabajo puede ser de oro y el contraelectrodo de platino y el electrodo de referencia de plata. El estudio de la interaccion de un oligonucleotido modificado con una molecula a someter a ensayo puede comprender una etapa de voltamperometna dclica.

El injerto con grupos funcionales alquenilo, alquinilo o halogenoacetamida, tales como maleimida o acrilamida, se puede usar, por ejemplo, para aplicaciones en el campo del diagnostico en formato microplaca y/o para la realizacion de ensayos de tipo ELOSA (« Enzyme-Linked OligoSorbent Assay » en ingles o « dosage d'oligoadsorption par enzyme liee » en frances). En el transcurso de este tipo de ensayo, la superficie de los pocillos se injerta con grupos funcionales alquenilo, alquinilo o halogenoacetamida, tal como grupos funcionales maleimida o acrilamida. A continuacion, la superficie se pone en contacto con oligonucleotidos modificados de acuerdo con la invencion. Por lo tanto, se forman uno o varios enlaces tioeter gracias a la presencia de uno o varios compuestos de tiol de acuerdo con la invencion sobre los oligonucleotidos. A continuacion, el ensayo consiste en la puesta en contacto de una muestra a someter a ensayo con los pocillos funcionalizados de ese modo, para medir en particular la hibridacion de los oligonucleotidos. La medicion se puede realizar por ejemplo mediante fluorescencia gracias a un etiquetado de las cadenas de oligonucleotidos.

Ejemplos

En los ejemplos, por « sonda » se hace referencia a una cadena de oligonucleotidos que comprende al menos un compuesto de tiol de acuerdo con la invencion destinado a ser inmovilizado sobre una superficie.

Por « diana » se hace referencia a una cadena de oligonucleotidos destinada a su hibridacion con una sonda, por ejemplo, durante un ensayo de diagnostico.

Sintesis del compuesto 1-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metilpropano-1.3-diol 4

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El compuesto 3 se obtiene a partir del compuesto 1 siguiendo el protocolo que se describe en Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J., y Morvan, F., Journal of Organic Chemistry 74, 2009, 1218-1222.

A una solucion de 1-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2-(6-bromohexiloximetil)-2-metil-1,3-propanodiol 3, (556 mg, 0,95 mmol) y 5 tioacetato de potasio (162 mg, 1,42 mmol) en tolueno anhidro (10 ml) se anade el eter corona 18-6 (70 mg, 0,26 mmol). La mezcla se agita magneticamente 2 horas a 50 °C. Despues de dilucion con diclorometano (150 ml) la mezcla se filtra y la fase organica se lava con agua (2 x 50 ml) y a continuacion se seca sobre Na2SO4. Despues de evaporacion, el producto en bruto de reaccion se purifica mediante cromatograffa sobre silice (de un 0 a un 30 % de acetato de etilo en ciclohexano) para conducir al producto deseado en forma de un aceite incoloro (413 mg, 75 %).

10 Sintesis__________del__________1-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metil-3-O-(2-cianoetil-N,N'-

diisopropilfosforamidita)-propano-1,3-diol 5

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A una solucion de 1-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metilpropano-1,3-diol 4 (413 mg, 0,71 mmol) y diisopropiletilamina (186 pl, 1,06 mmol) en diclorometano anhidro (10 ml) se anade 2-cianoetil-N,N'- 15 diisopropilclorofosforamidita (190 pl, 0,85 mmol). La mezcla se agita magneticamente durante una hora a temperatura ambiente. El exceso de reactivo se neutraliza mediante adicion de 500 pl de agua y a continuacion la mezcla se diluye con diclorometano (150 ml). La fase organica se lava con una solucion acuosa saturada de NaHCO3 (100 ml), a continuacion se seca sobre Na2SO4. Despues de evaporacion, el producto en bruto se purifica mediante cromatograffa sobre sflice (de un 0 a un 30 % de acetato de etilo en ciclohexano que contiene un 4 % de 20 trietilamina) conduciendo al compuesto 5 deseado en forma de un aceite incoloro (400 mg, 72 %).

Sintesis del soporte solido de tiol 6

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En un tubo esmerilado, 1-0-(4,4'-dimetoxitritil)-2-(6-S-acetiltiohexiloximetil)-2-metil-1,3-propanodiol 4 (178 mg, 0,3 mmol) y dimetilaminopiridina (DMAP 36 mg, 0,3 mmol) se coevaporan con 3 ml de piridina anhidra. A continuacion se anade succinil-alquilamina de cadena larga -CPG (Vidrio de Poro Controlado) (1 g), piridina anhidra (5 ml), trietilamina anhidra (160 ml, 1,2 mmol) y etildimetilaminopropil carbodiimida (EDC, 280 mg, 2,0 mmol). A continuacion se aclara con 1 ml de piridina anhidra. La mezcla se agita durante una noche.

La mezcla se filtra y se lava con CH2O2 (10 ml) y a continuacion se seca en el desecador. El compuesto de tiol sobre soporte solido se trata con una solucion de antudrido acetico, N-metilimidazol, 2,6-lutidina en tHf durante 3 h con agitacion. La mezcla se filtra y se lava con CH2Cl2 (10 ml) y a continuacion se seca en el desecador para dar el soporte solido de tiol 6 (940 mg) con una funcionalizacion de 29 pmol/g.

Preparacion de oligonucleotidos modificados

Tres oligonucleotidos que comprenden un grupo ferroceno en la posicion 5' y un numero creciente de compuestos de tiol de tipo (la) de acuerdo con la invencion (1, 2 y 4 compuestos de tiol) se sintetizaron en un sintetizador de ADN. El grupo ferroceno se uso con el fin de visualizar la inmovilizacion del oligonucleotido sobre la superficie de oro mediante voltamperometna dclica. Uno, dos o cuatro grupos de tiol se introdujeron sobre un soporte solido de tipo propanodiol y la secuencia de ADN , SEQ ID NO: 3, se injerto. Por ultimo, una fosforamidita alfa-timidina portadora de un grupo ferroceno se introdujo en la posicion 5' del oligonucleotido modificado. La desproteccion que sigue a continuacion se realiza en dos etapas. En primer lugar, el medio se trata con un 10 % de piperidina en acetonitrilo durante 10 minutos con el fin de eliminar el grupo cianoetilo mediante una beta-eliminacion el acetonitrilo resultante se elimina del medio mediante un lavado en acetonitrilo. A continuacion, un tratamiento con hidroxido de amonio concentrado permite eliminar los grupos protectores de acilo sobre las nucleobases y sobre los grupos funcionales tiol y permite hidrolizar la rama de enlace succinilo (soporte solido). Este protocolo permite evitar la adicion de Michael entre los grupos funcionales tiol desprotegidos y el acrilonitrilo. Despues de la evaporacion, el oligonucleotido modificado no soportado se purifica mediante cromatograffa de HPLC en fase inversa sobre columna C18.

Tetratiol (oligonucleotido modificado con 4 compuestos de tiol)

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Ditiol (oligonucleotido modificado con 2 compuestos de tiol)

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Monotiol (oligonucleotido modificado con 1 compuesto de tiol)

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Injerto y estudio de estabilidad de los oligonucleotidos modificados (tetratiol, ditiol y monotiol)

Para este estudio se uso un potenciostato de multiples vfas VMP3 Biologic (Biologic Science Instruments, Pont de Claix). Los resultados se registraron con la ayuda del software informatico EC-Lab de Biologic Science Instruments.

La celda electroqmmica esta formada por un electrodo de oro de 0,28 cm2 de superficie, un contraelectrodo de

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platino y un electrodo de referencia de Ag/AgCl.

Etapa 1: Reduccion de los grupos tiol

4 nmoles de ODN-tiol (oligonucleotidos modificados con uno o varios compuestos de tiol) se reducen en una solucion de clorhidrato de Tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP, HCL, Sigma-Aldrich) (160 mM) es decir, una concentracion en la solucion de 20 mM de TCEP,HCl, a 20 °C, durante 2 h en atmosfera de argon.

El ODN se purifica mediante dos diluciones/centrifugaciones con una solucion de TCEP, HCl 20 mM desgasificado sobre filtros amicon YM3000 (Millipore) 15 min a 14000 rcf (rcf= Fuerza Centnfuga Relativa). Despues de dilucion en 450 pl de tampon fosfato 100 mM desgasificado, el medio se centrifuga de nuevo sobre filtros amicon YM3000, 30 min, 14000 rcf.

Se obtiene una solucion de injerto que contiene 4 nmoles de ODN, 90 mM en fosfato de sodio, 2 mM en TCEP, HCl. Etapa 2: Activacion del electrodo de oro

El electrodo de trabajo de oro se limpia mediante un primer lavado en acetona durante 10 minutos con ultrasonidos. Una vez secada la superficie se sumerge en una solucion « pirana » (0,7 ml de H2SO4, 0,3 ml de H2O2) durante 1 minuto con el fin de eliminar cualquier residuo organico de la superficie.

Por ultimo, la activacion basica del electrodo consiste en limpiar el oro de la superficie mediante la produccion de hidrogeno en el electrodo mediante hidrolisis de agua en sosa 0,5 M en los potenciales negativos (-1,4 V con respecto a Ag/AgCl) durante varios ciclos.

Etapa 3: Injerto de la sonda

Despues del aclarado, la solucion de injerto que contiene el oligonucleotido de tiol se pone en contacto con el electrodo de oro activado, durante tres dfas en atmosfera inerte.

Despues del aclarado, la celda electroqmmica se llena con el electrolito de analisis (fosfato de sodio dibasico 10 mM, fosfato de potasio monobasico 10 mM, perclorato de sodio 250 mM, pH 6,5).

La superficie se pasiva con una solucion de mercaptopropanol 1 mM durante 30 minutos, despues del aclarado la celda se pone en el electrolito de analisis durante 2 h con el fin de estabilizar la capa injertada.

Etapa 4: Analisis de la estabilidad de los compuestos injertados en la superficie

Los analisis se realizan mediante voltamperometrta dclica (CV) a 50 mV/s ; entre -0,1 V y 0,45 V. Los estudios de estabilidad de la capa injertada se realizan despues de la estabilizacion de la senal electroqmmica durante 2 h realizando ciclos cada 30 minutos.

La celda se llena con agua destilada desgasificada a 60 °C o 80 °C durante 1 o 5 minutos, despues del aclarado la celda se llena con 1,5 ml de electrolito de analisis de fosfato (20 mM) perclorato (250 mM). Despues de 30 minutos de estabilizacion, se realiza una CV.

La operacion se repite tantas veces como sea necesario.

Resultados

Se realizo una comparacion de la tasa de injerto de los 3 oligonucleotidos modificados con compuestos de tiol (tetratiol, ditiol y monotiol). La tasa de injerto se determino mediante integracion del pico de oxidacion del ferroceno. De hecho, la carga electronica transferida esta relacionada directamente con el numero de ferrocenos presentes en la superficie del electrodo, y por lo tanto con el numero de sondas injertadas sobre el oro.

Los resultados que se muestran a continuacion corresponden a la media de las tasas de injerto de 3 injertos diferentes para cada sonda.

: moleculas/cm2

monotiol: 5,21E+12

ditiol: 5,81E+12

tetratiol: 1,40E+12

Un histograma de los resultados se representa en la figura 5.

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Las tasas de injerto para monotiol y ditiol son bastante comparables, los inventores pueden observar un injerto menos importante del tetratiol debido probablemente al volumen mas importante de acuerdo con el numero de ramas de tiol. A pesar de esta diferencia, la tasa de injerto del tetratiol sigue siendo importante y es muy reproducible.

Un estudio de estabilidad de los 3 oligonucleotidos modificados con compuestos de tiol con respecto a la temperatura se realizo en agua destilada desgasificada. La evolucion de la respuesta electroqmmica se siguio mediante voltamperometna dclica. El porcentaje de disminucion de la intensidad de oxidacion del Ferroceno se calcula con respecto a la senal obtenida despues de estabilizacion.

Estas disminuciones en funcion del tiempo se indican en las figuras 6 y 7.

La molecula de tetratiol es muy estable con respecto a tratamientos sucesivos en agua a 60 °C (figura 6). De hecho, despues de 5 veces durante un minuto de este tratamiento, queda un 97 % de la senal de partida, a diferencia del monotiol (70 % de senal de partida) y ditiol (62 % de senal de partida).

A 80 °C, la perdida de senal es mas importante (figura 7). Despues de cinco tratamientos sucesivos de un minuto, todavfa se puede cuantificar un 83 % de la senal de partida para el tetratiol. Por lo tanto, la estabilidad del tetratiol es bastante superior a la del monotiol (45 % de senal residual) y la del ditiol (18 % de senal residual).

Este estudio muestra el aumento notable de estabilidad del injerto de tiol sobre oro mediante el uso de un oligonucleotido modificado con 4 compuestos de tiol (tetratiol), en comparacion con el injerto de un monotiol o de un ditiol. La falta de estabilidad de este ultimo ditiol se puede explicar mediante una posible competicion entre el injerto sobre oro y el cierre del ciclo para reformar el puente disulfuro intramolecular. Por lo tanto, parece preferente mantener un numero de cuatro tioles sobre la rama de injerto para asegurar una buena estabilidad con respecto a la temperatura.

Aplicacion: deteccion de la presencia del Virus de la Hepatitis C Muestras diana a someter a ensayo

1) Dianas naturales: amplicones de VHC (+)

Toma de muestras: las muestras de plasma obtenidas de donantes de sangre que dieron positivo para la presencia del Virus de la Hepatitis C (VHC) a escala nacional se analizan mediante secuenciacion.

Amplificacion del ARN viral: Se producen amplicones de VHC de 401 pb en la region viral NS5b mediante RT-PCR a partir de las muestras de plasma descritas anteriormente. El ARN se extrae a partir de 200 pl de plasma humano usando el kit de Acido Nucleico Viral de Alta Pureza (Roche) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El ARN se eluyo en 50 pl de agua esteril (sin DNasa/RNasa). Con el fin de realizar una etapa de retro-transcripcion (RT), se desnaturalizaron 11 pl de ARN a 72 °C durante 10 minutos y se retro-transcribieron en presencia de 4 pl de 5X de Tampon de Primera Hebra (Invitrogen), 2 pl de 10X de Mezcla de Hexanucleotidos (Roche), 2 pl de mezcla de dNTP 10 mM (Invitrogen) y 200 U de Transcriptasa Inversa Superscript® II (Invitrogen). Las condiciones de retro- transcripcion son las siguientes: 10 min a 23 °C, 45 min a 37 °C, y 10 min a 95 °C. a continuacion se amplificaron cinco microlitros de ADNc por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa) usando los cebadores « VHCsentido biotinilado » (SEQ ID NO: 1 [Btn] Tgg ggA TCC CgT Atg ATA CCC gCT gCT TTg A) y « VHCanti-sentido » (SEQ ID NO: 2 ggC ggA ATT CCT ggT CAT AgC CTC CgT gAA) (vease Catherine Tamalet, Philippe Colson, Herve Tissot- Dupont, Mireille Henry, Christian Tourres, Natacha Tivoli, Danielle Botta, Isabelle Ravaux, Isabelle Poizot-Martin y Nouara Yahi. 2003, Journal of Medical Virology 71: 391-398) en 50 pl de mezcla de reaccion: 1X Tampon para PCR sin MgCl2 (Invitrogen), 0,2 pM de cada cebador, MgCh 1,5 mM (Invitrogen), mezcla de dNTP 0,2 mM (Invitrogen) y 1,3 U Taq Polimerasa (Invitrogen). Las condiciones de PCR son las siguientes: 5 min a 95 °C, 40 ciclos (desnaturalizacion: 40 seg, 95 °C; hibridacion: 40 seg, 56 °C; elongacion: 50 seg, 72 °C), y una extension final de 10 min a 72 °C.

Los amplicones de VHC obtenidos se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa, se toman alfcuotas y se conservan a -20 °C antes de su uso.

2) Dianas sinteticas: oligonucleotidos biotinilados

Se sintetizaron oligonucleotidos de 15-meros biotinilados en el extremo en la posicion 5'. Estos oligonucleotidos son estrictamente complementarios con las sondas de VHC elegidas como sigue a continuacion.

Diseno de las sondas de oligonucleotidos para el reconocimiento de secuencias de VHC.

La region NS5b del VHC se tomo como diana para el diseno de las sondas de oligonucleotidos.

Las secuencias de los genomas de VHC amplificadas en la region NS5b (banco de 800 muestras) se analizaron con la ayuda de los programas informaticos de alineamiento clustalW2 y de filogenia Mega5 con el fin de identificar las zonas mas conservadas. Se selecciono una region muy conservada que permite la amplificacion espedfica de todos

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los genomas de genotipo viral 1a1b as^ como una segunda region que permite la amplificacion espedfica de los genomas de genotipo viral 3a. Se disenaron dos sondas de 15-meros complementarias de cada una de estas regiones. A continuacion, el diseno de las sondas 1a1b y 3a se usa para la smtesis de los oligonucleotidos de multi- tiol.

Evaluacion de las hibridaciones de sondas l dianas por ELOSA (Ensayo de OligoAbsorcion Ligado a Enzimas)

El injerto de cualquier tipo de sondas de tiol (oligonucleotidos con anomena alfa o beta, sondas lineales o estructuradas (por ejemplo tallo-lazo) se puede realizar de acuerdo con este protocolo optimizado despues del lavado de los pocillos de microplacas activadas con maleimida (Pierce) con el tampon WB1 (Na2HPO4 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05 % (p/v), pH 7,2). La funcionalizacion de los pocillos se realiza con 100 nM de sondas multi- tiol en tampon BB (Na2HPO4 0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 10 mM, pH 7,2) durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). A continuacion, los pocillos se lavan tres veces con WB1, se saturan con una solucion de 10 pg.ml'1 de Cistema-HCl en BB (Pierce) durante 1 hora a TA, y se lavan de nuevo tres veces con WB1.

Los ensayos de hibridacion se pueden realizar con las dianas sinteticas cortas de 15-meros o con amplicones reales de VHC largos (401 nucleotidos) descritos anteriormente. Las dianas sinteticas y los amplicones se diluyen en 150 pl de tampon de hibridacion (TH: NaCl 0,9 M, NaH2PO4 60 mM, EDTA 6 mM, pH 7,4, Denhardt 5X) antes de su deposicion en los pocillos. Una etapa complementaria de desnaturalizacion de 10 min a 95 °C se realiza en los amplicones antes de su transferencia en los micropocillos. La hibridacion se realiza durante la noche a 37 °C. Los pocillos se lavan con tampon WB2 (NaCl 0,75 M, NaH2PO4 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4, SDS al 0,1 %) tres veces durante 2 min a TA y una vez durante 30 min a 50 °C.

La etapa de deteccion se realiza despues de incubacion durante 30 min a TA de los pocillos en presencia de 100 pl/pocillo de Estreptavidina-Europio diluido en 100 pl de tampon de ensayo (« Tampon de Ensayo », Perkin Elmer). Por ultimo, los pocillos se lavan seis veces con tampon WB3 (WB1X, Perkin Elmer) y se anaden 200 pl de tampon de amplificacion (« Tampon de Amplificacion », Perkin Elmer) en cada pocillo durante 5 min a tA. La fluorescencia en tiempo resuelto se mide en un detector de multiples etiquetas Victor3TM 1420 (« contador de multiples etiquetas », Perkin Elmer) de acuerdo con el protocolo del fabricante (excitacion a 340 nm y emision a 615 nm).

El ensayo ELOSA se realizo con amplicones espedficos del genotipo VHC 3a (diluciones a 1/10, 1/100 y 1/1000) y amplicones espedficos del genotipo VHC 1a1b (y por lo tanto no espedficos del genotipo 3a). El control de la hibridacion se realiza con dianas sinteticas (15-meros) espedficas del genotipo 3a (complementaria de la sonda), sometidas a ensayo a 1000 pM y 5 pM y dianas sinteticas espedficas del genotipo 1a1b, sometidas a ensayo a 1000 pM.

El grafico de la figura 8, que corresponde al ensayo de fluorescencia, ilustra los resultados del ensayo ELOSA y cuantifica la hibridacion con la sonda de tetratiol que corresponde al genotipo VHC 3a. Los ensayos « control 1a1b » corresponden al ruido de fondo; por lo tanto los resultados « espedficos 3a » deben superar el ruido de fondo para que el ensayo permita cuantificar la hibridacion.

Estudio del efecto de la densidad de injerto

El mismo ensayo ELOSA se realizo modificando la concentracion de la solucion de sondas (monotiol, ditiol y tetratiol) para variarla de 1 nM a 100 nM. El ensayo ELOSA se realiza con las sondas 1a1b y 3a a de cadenas cortas (15- meros) y de cadenas medias (105-meros). Los ensayos realizados con las sondas espedficas del genotipo 1a1b muestran una especificidad de hibridacion muy buena con las dianas espedficas 1a1b y ninguna hibridacion con las dianas no complementarias del genotipo 3a.

La deteccion de la hibridacion de sonda/diana se realiza mediante fluorescencia como se ha mencionado anteriormente (figura 8).

Los resultados para cada tipo de sonda (monotiol, ditiol y tetratiol) se representan en los graficos de las figuras 9, 10 y 11. El control TH corresponde a un ensayo realizado en los pocillos pero sin la presencia de las sondas. Tambien se sometieron a ensayo otras sondas (que comprenden 6 y 8 tioles) y se representan en la figura 14.

La figura 9 ilustra los resultados obtenidos para la sonda de monotiol, es decir, que comprende un solo compuesto de tiol de acuerdo con la invencion. La sonda de monotiol no es eficaz para la deteccion de diana de 105-meros, siendo la senal para las dianas de 105-meros identica a la senal de control TH. Ademas, la figura 9 muestra tambien que la concentracion de sonda usada para el injerto entre 10 nMy 100 nM no tiene ningun efecto sobre la eficacia de la hibridacion, de hecho, no hay diferencia significativa entre el ensayo realizado con 10 nM de sondas y con el realizado con 100 nM de sondas. Por el contrario, el uso de una concentracion de 1 nM en la sonda conlleva una reduccion de la eficacia de la hibridacion.

La figura 10 ilustra los resultados obtenidos para la sonda de ditiol, es decir, que comprende dos compuestos de tiol de acuerdo con la invencion. Se desvela que la sonda de ditiol es poco eficaz para la deteccion de dianas de 105- meros, siendo observada una deteccion de la hibridacion para una concentracion de dianas 1a1b de 1000 pM.

10

15

20

25

30

35

40

45

Ademas, la figura 10 muestra que la densidad de injerto influye ligeramente en la deteccion de la hibridacion. De hecho, la senal de fluorescencia es mas importante cuando la concentracion de las sondas pasa de 1 nM a 100 nM con poca diferencia entre 25 nM y 100 nM.

La figura 11 ilustra los resultados obtenidos para la sonda de tetratiol, es decir, que comprende cuatro compuestos de tiol de acuerdo con la invencion. Se desvela que la sonda de ditiol es muy eficaz para la deteccion de dianas de 105-meros, la senal de fluorescencia es muy superior a la senal de fluorescencia del control TH, en particular para una concentracion de dianas de 100 pM y 1000 pM. Ademas, la figura 11 muestra que la densidad de injerto influye en la deteccion de la hibridacion para los 105-meros. De hecho, para una misma concentracion de dianas, por ejemplo 1000 pM, la senal de fluorescencia es mas importante cuando la concentracion de las sondas es de 100 nM, con respecto a una concentracion de las sondas de 1 nM. Este efecto, tambien denominado « dependencia de la dosis » es muy notable para la deteccion de dianas de 105-meros.

La figura 14 muestra que las sondas que comprenden 6 o 8 tioles proporcionan resultados de hibridacion satisfactorios. De hecho, la senal de fluorescencia para estas dos sondas es similar a la de la sonda de tetratiol.

La figura 12 ilustra los resultados de un ensayo de hibridacion realizado con la secuencia que permite la formacion de genotipos 1a/1b de VHC. El ensayo se realiza a tres concentraciones de diana, 100 pM, 10 pM y 1 pM, con dianas sinteticas de 105 bases de longitud. El control negativo se realiza con la diana 3a no complementarias. La sonda de tetratiol 1a/1b se injerta en el electrodo de trabajo en superficie o de la celda electroqmmica. La reaccion de reconocimiento va seguida por voltametna de pulsos diferenciales. Los valores indicados en la ordenada corresponden a los valores normalizados de variacion de corriente. Este ensayo mediante electroqmmica es sensible y espedfico a una concentracion de diana de 1 pM. La variacion de la senal parece ser mas fuerte que para el ensayo realizado a 100 pM. A mayor concentracion de diana, un efecto de adsorcion no espedfica de las dianas sobre la superficie del electrodo reduce la eficacia de la reaccion de reconocimiento. La variacion de la senal del ensayo realizado a 100 pM parece mas baja que la observada para el ensayo a 1 pM. Este procedimiento electroqmmico no permite un seguimiento cuantitativo de la reaccion de hibridacion. Sin embargo, proporciona una respuesta de si/no espedfica de una gran sensibilidad.

Listado de secuencias

<110> Centro Nacional de Investigacion Cientffica (CNRS) Establecimiento Frances de la Sangre (EFS) Universidad de Montpellier 1 Universidad Claude Bernard Lyon 1

<120> Compuestos detiol y su uso para la smtesis de oligonucleotidos modificados

<130> 33336 CNRS

<160>3

<170> BiSSAP 1.0

<210> 1 <211> 31 <212>ADN

<213> secuencias artificiales <220>

<221> fuente <222> 1..31

<223> /mol_tipo = "ADN" /nota = "Cebo de VHC sentido biotinilado" /organismo = "secuencias artificiales"

<400> 1

tggggatccc gtatgatacc cgctgctttg a 31

<210>2 <211> 30 <212>ADN

<213> secuencias artificiales <220>

<221> fuente <222> 1..30

<223> /mol_tipo = "ADN" /nota = "Cebo de VHC anti-sentido" /organismo = "secuencias artificiales"

<400>2

ggcggaattc ctggtcatag cctccgtgaa 30

<211> 13 <212> ADN

<213> secuencias artificiales <220>

5 <221>fuente

<222> 1..13

<223> /mol_tipo = "ADN" /nota = "Acido nucleico ensayo injerto" /organismo = "secuencias artificiales" <400>3

ccaagcacga tgt 13

10

Claims

5

10

15

20

25

REIVINDICACIONES

T

\

Y

/

x-w

t \

D-0 Z (I)

/

S

R

en la que:

T es un grupo elegido entre -O-P(OR-i)N(R2)2, -O-PH(O)O-, -OC(O)JC(O)NH-^,

◦ R1 se elige entre los grupos 2-cianoetilo, R'iR'2R'3SiCH2CH2, y R'i, R'2, R'3 identicos o diferentes representan un grupo elegido entre los alquilos lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono y los arilos en C6-C12,

◦ R2 se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados que comprenden de 1 a 12 atomos de carbono, pirrolidina,

◦ J se elige entre un enlace sencillo, un grupo -CH2-, -CH2CH2-, -CH2OCH2-, -CH2OPhOCH2- en el que Ph es un bencilo,

◦ □ representa un soporte solido,

D es un grupo protector de alcoholes elegido entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo, fluorenilmetiloxicarbonilo y terc-butil-dimetilsililo,

W se elige entre los grupos CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexanos tri-ilo, y bencenos triilo,

Z se elige entre los grupos alcoxi en C1-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, NCO- alquilos en C1-C12, CON-alquilos en C1-C12,

Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12,

X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C12, aminoalquilos en C1-C12, alcoxi en C1-C12, cicloalquilos en C3-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12,

R se elige entre los grupos acilo en C1-C12, S-alquilos en C1-C12, S-arilos en C6-C12, S-2-piridina, S- heteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C1-C12, S-cicloalquilos en C3-C12, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12.
2. Compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 que responde a una de las siguientes formulas (la), (Ib) y (Ic):

imagen1

5

10

15

20

25

imagen2
3. Compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que:

• D se elige entre 4,4'-dimetoxitritilo, 9-fenilxanten-9-ilo o Fluorenilmetiloxicarbonilo,

• W es un grupo elegido entre CH, CCH3, CCH2CH3, ciclohexano tri-ilo y benceno tri-ilo; y/o

• Z se elige entre los grupos alcoxi en C1-C12, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C12, NCO- alquilos en C1-C12, CON-alquilos en C1-C12 ; y/o

• Y se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C6, aminoalquilos en C1-C6, alcoxi en C1-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6 ; y/o

• X se elige entre los grupos alquilo lineales o ramificados en C1-C6, aminoalquilos en C1-C6, alcoxi en C1-C6, cicloalquilos en C3-C6, cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6 ; y/o

• R se elige entre los grupos acilo en C1-C6, S-alquilos en C1-C6, S-arilos en C6-C6, S-heteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C1-C6, S-cicloalquilos en C3-C6, S-cicloheteroalquilos oxigenados o nitrogenados en C3-C6, preferentemente R es un acilo en C1-C6.
4. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el grupo T es un grupo -O- P(OR-i)N(R2)2 en el que R2 es un grupo isopropilo y R1 se elige entre los grupos 2-cianoetilo, 2-(trimetilsilil)etilo, 2- (trifenilsilil)etilo, 2-(difenilmetilsilil)etilo.
5. Compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el grupo T es el grupo - OC(O)JC(O)NH-^ en el que □ es un soporte solido elegido entre resinas, en particular entre las resinas a base de poliestireno, poliacrilamida, polietilenglicol, celulosa, polietileno, poliester, latex, poliamida, polidimetilacrilamida, polfmeros hidrofilos sinteticos o naturales, perlas de vidrio, geles de sflice.
6. Procedimiento de fabricacion de de un compuesto de formula (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende al menos una etapa elegida entre las etapas siguientes:

- preparacion del compuesto (la) a partir del compuesto (II) de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

imagen3

/0-P(0R,)N(R2)2

Y

x-w

V \

D-Q z /

5

\

R

(la)

o de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

HO

D-0

x-w.

\

R

/OR,)

R2

^IM-P R2 VN_R2

R2

/ 0-R^0R1)N(R2)2 Y

x-w

t \

D-0 z

/

S

\

R

(II)

(la)

preparacion del compuesto (Ib) a partir del compuesto (II) de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

5

imagen4

en la que Q y Q' representan, independientemente entre sf, un grupo benceno sustituido o no,

- preparacion del compuesto (Ic) a partir del compuesto (II) de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

imagen5

o de acuerdo con el esquema de smtesis siguiente:

5

10

15

imagen6

D, X, Y, Z, W, R, □, Ri y R2teniendo la misma definicion en cada una de estas etapas que en las reivindicaciones 1 a 5.
7. Oligomero susceptible de ser obtenido por oligomerizacion de un compuesto (I) de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, que responde a la formula

(te>-Wk (XVDfc

en la que:

(Ic) tiene el mismo significado que en las reivindicaciones 2 a 5, el grupo R del compuesto (Ic) ademas puede representar H.

k representa un numero entero comprendido entre 1 y 12,

A representa (I'a) o (I'b) en los que

imagen7

en las que, X, Y, W, Z, R, R1 tienen la misma definicion que en las reivindicaciones 1a 5, R ademas puede

5

10

15

20

25

30

35

representar H.

imagen8

en la que,

□ , D, X, Y, W, Z, R y Ri tienen la misma definicion que en las reivindicaciones 1 a 4, R ademas puede representar H y D ademas puede representar H, k es un numero entero comprendido entre 1 y 11.
9. Procedimiento de preparacion de un oligonucleotido modificado que comprende al menos:

- una etapa de injerto de un compuesto (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 sobre un oligonucleotido,

o

- una etapa de injerto de un nucleotido sobre un oligomero de acuerdo con la reivindicacion 7 o la reivindicacion
8.
10. Oligonucleotido modificado susceptible de ser obtenido con el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9 que responde a la formula (XIIa) siguiente:

imagen9

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ...Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(I') representa un compuesto de formula (I'a) o (I'b) tal como se definen en la reivindicacion 7, n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, p representa 0 o 1,

y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 e, y' es igual a 0 si p vale 0,

□ representa un soporte solido.
11. Oligonucleotido modificado susceptible de ser obtenido con el procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 9

que responde a la formula (XIIIa) siguiente:

{lc) - {I V,- Nl ■ >V --■- NrH ■ Nn ■ (ny KM, - M2 - ... - MJp-Ciy

en la que,

N1, ... Nn representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

M1, ... Mm representan independientemente los unos de los otros un nucleotido,

(I') representa un compuesto de formula (I'a) o (I'b) tal como se definen en la reivindicacion 7, n es un numero entero comprendido entre 1 y 100, m es un numero entero comprendido entre 1 y 100, y es un numero entero comprendido entre 1 y 12, y' es un numero entero comprendido entre 0 y 12, p vale 0 o 1 si y' es diferente de 0 y, si y' vale 0 entonces p vale 0,

y" es un numero entero comprendido entre 0 y 12 si p vale 1 y, si p vale 0 entonces y" vale 0.

5

10

15

imagen10

en la que,

n, y, N1, ... Nn... Nn-1 tienen la misma definicion que en la reivindicacion 8, X, Y, Z, W tienen la misma definicion que en las reivindicaciones 1 a 4,

Bn representa la base del n-esimo nucleotido.
13. Oligonucleotido modificado de acuerdo con la reivindicacion 11 que responde a la formula (XIIIc):

en la que

imagen11

n, y, N tienen la misma definicion que en la reivindicacion 9,

X, Y, Z, W tienen la misma definicion que en las reivindicaciones 1 a 4, B1 representa la base del 1er nucleotido.
14. Dispositivo automatizado para la smtesis de nucleotidos que comprende al menos:

• recipientes distintos que contienen:

- nucleotidos,

- activadores de acoplamiento y

- productos de lavado,

• medios mecanicos de extraccion y distribucion de muestras de productos, asf como medios informaticos que permiten la realizacion controlada de estos medios mecanicos, asf como:

• al menos un recipiente en el que se coloca un soporte solido injertado con un oligomero de acuerdo con la reivindicacion 7 o 8, y/o al menos un recipiente que contiene un compuesto (la) o un compuesto (Ib) de acuerdo con la reivindicacion 2.

10

15
15. Sustrato injertado con al menos un oligonucleotido modificado de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 13, comprendiendo dicho sustrato al menos una zona de recepcion revestida con una pelfcula de oro o de platino o injertado con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono- carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida, siendo dicho sustrato de metal en el caso de la pelfcula de oro y de plastico en el caso del injerto con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida.
16. Sustrato de acuerdo con la reivindicacion precedente en el que el sustrato de metal es de cobre o de titanio y/o el sustrato de plastico es de poliestireno.
17. Kit de ensayo que comprende:

- al menos un sustrato que comprende al menos una zona de recepcion revestida con una pelfcula metalica de oro o de platino o de un sustrato injertado con grupos que comprenden al menos un doble enlace carbono- carbono o un triple enlace carbono-carbono o grupos halogenoacetamida, preferentemente grupos maleimida y/o acrilamida,

- al menos un oligonucleotido modificado de acuerdo con una de las reivindicaciones 10 a 13.
18. Uso de un sustrato de acuerdo con la reivindicacion 15 para realizar ensayos de afinidad entre un oligonucleotido y otra molecula.