JP2015515471A - チオール化合物および修飾オリゴヌクレオチド合成のためのこれらの使用 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、オリゴヌクレオチドにグラフト可能なオリゴマー鎖を形成するために適切なチオール化合物に関する。【解決手段】前記チオール化合物は、オリゴヌクレオチド内への導入が意図される。このようにして得られたオリゴヌクレオチドは、複数のチオール官能基を有し得る。本発明はさらに、このような化合物、つまり１以上のチオール官能基を有し、金表面またはグラフト化表面への固定に適切な化合物によりグラフト化されたオリゴヌクレオチドに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドにグラフト可能なオリゴマー鎖の形成に適切なチオール化合物に関する。本発明はさらに、このような化合物、つまり１以上のチオール官能基を有する化合物によりグラフト化されたオリゴヌクレオチドに関し、この化合物は、金表面への固定に、またはグラフト化表面、特に、マレイミドまたはアクリルアミド官能基によるグラフト化表面への固定に、適切に用いられる。本発明はさらに、検出試験のキットに関し、前記検出試験は、ヌクレオチドと、表面として使用する他の分子との間の相互作用を検出し、前記表面として使用する他の分子は、本発明に係るオリゴヌクレオチドが固定された金表面またはグラフト化表面、とりわけマレイミドまたはアクリルアミド官能基によるグラフト化表面として用いられる。

オリゴヌクレオチドは短鎖ヌクレオチドを含む分子であり、ヌクレオチドの数は、１から約１００の範囲である。オリゴヌクレオチドはＲＮＡ（リボ核酸）またはＤＮＡ（デオキシリボ核酸）の断片である。オリゴヌクレオチドは、一般に一本鎖として合成される。

オリゴヌクレオチドは、酵素的手段または化学合成方法により合成可能である。化学的方法を選択した場合、通常、オリゴヌクレオチドは、当業者に周知の技術、例えば、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネートまたはホスホジエステルやホスホトリエステルを使用する方法によって実施される技術により固体支持体上に合成され、後者の２つの化合物は、リン酸の誘導体であり、一方ホスホラミダイトは亜リン酸の誘導体である。

オリゴヌクレオチドの重要な特性は、特定の配列の遺伝子およびタンパク質機能を制御する、それらの能力である。この特性により、オリゴヌクレオチドおよびそれらの誘導体化合物は、分子生物学研究および多数の薬学的および診断的用途に広範囲に使用される。この研究は、利用可能な大量のオリゴヌクレオチドを有することが必要である。したがって、非常に純粋な大量のオリゴヌクレオチドを作製する方法が要求される。

特定のヌクレオチド配列を有する核酸は、生体試料中のＤＮＡの検出に広範囲に使用される。この検出試験の原理は、ヌクレオチド配列と標的配列との相補性、それによる二本鎖の形成を頼りにしている。この二本鎖は、ハイブリダイゼーションと呼ばれる過程の間に形成される。

このハイブリダイゼーション現象は、その後、さまざまな方法、特に当初存在した配列に結合することが意図されるヌクレオチド配列のマーキングにより検出可能である。ハイブリダイゼーション現象を検出するための、蛍光または放射性のマーキング法は、ある不利益を有する。マーキングは、ヌクレオチド配列の合成の間に付加ステップを必要とし、このステップは、時として実施が困難である。マーキングにより検出されるこのハイブリダイゼーション現象に基づく試験は、ハイブリダイゼーションステップの後で、試料の標的配列と結合しなかったマーキングされたヌクレオチド配列の除去を必要とする。

検出の他の方法、特に、ヌクレオチド配列をまず表面に固定し、次いで、試験試料をその表面と接触させて、二本鎖の形成によりハイブリダイゼーション現象を作り出す方法をその後実施している。

これらの他の方法の中で、電気化学的方法がますます使用されている。これらの方法は、電極、例えば金電極へのオリゴヌクレオチドの固定化に基づく。試験の間に、金電極に固定された一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、電流を測定することにより定量化し、この電流は、固定された一本鎖オリゴヌクレオチドと試料のオリゴヌクレオチドとの間に形成された二本鎖の数に依存する。

それらの試験を理解するために、オリゴヌクレオチドを金属表面、特に金表面に固定する。この固定化は、とりわけ、金原子とイオウ原子との間の結合を用いて得ることができる。しかし、Ａｕ−Ｓ結合は、中程度の強度の結合である。したがって、単一の金−イオウ結合は、オリゴヌクレオチドを金表面に非常に安定な様式で固定するためには十分ではない。実際に、試験方法は特に洗浄ステップを伴い、洗浄ステップは、Ａｕ−Ｓ結合を不安定化させ得る、強力な機械的ストレスを生じる。

文献EP 0 523 978は、チオール−修飾オリゴヌクレオチドを作製するために使用可能なホスホラミダイトまたはホスホネート化合物を開示している。それらは、１回だけ、オリゴヌクレオチドの５’末端にだけ導入可能である。

文献US 7,601,848は、少なくとも２つの金−イオウ結合を生じさせ、それ故、金表面のオリゴヌクレオチドを安定化させるために、オリゴマー中への組み込みが意図される２つのイオウ原子を含む、多官能性化合物を開示している。これらの化合物のいくつかは、ホスホラミダイト官能基を含む。この文献において使用される化合物は、非常に高価な化合物から製造され、多官能性化合物のオリゴヌクレオチドのカップリングは、この化合物の立体障害のため、満足の行く収率を有さない。この文献において、チオール化合物を互いに結合させるため、結合剤が必要であり、それによって、チオール化合物のオリゴヌクレオチド内への複数導入がもたらされる。

U. K. Shigdel and C. He, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130(52), 17634-5は、ホスホラミダイト官能基により修飾されたオリゴヌクレオチドを記載しており、該修飾オリゴヌクレオチドは、このホスホラミダイト官能基によるオリゴヌクレオチド内への導入が意図される。記載の化合物の合成は、１２ステップで実施される。

S. Jin et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 4284-4299は、ホスホラミダイト官能基およびチオール官能基により修飾されたヌクレオシドを記載している。修飾ヌクレオシドは、生物物理学的プローブをＲＮＡに導入するために使用される。修飾ヌクレオシドは、９ステップで合成され、全収率は１２．５％である。

A. Hatano et al. Tetrahedron, 61, 2005, 1723-1730は、ホスホラミダイト官能基およびチオフェノール官能基を含むヌクレオシド塩基を伴うＤＮＡの合成を記載している。修飾ヌクレオシドは、７ステップで合成され、収率はわずか５％未満である。

上記の３つの科学的刊行物のうち、ホスホラミダイト化合物は、このホスホラミダイト官能基によってオリゴヌクレオチドに組み込まれることが意図される修飾ヌクレオシドである。出発試薬は高価であり、合成は、長く複雑であり、これらのホスホラミダイト化合物の合成の収率は低い。加えて、これらのモノサッカライド化合物（osidic compounds）の立体障害は、表面への満足なグラフティングには適切ではない。

A. A. Rowe et al., Anal. Chem. 2011, 83, 9462-9466 は、ＤＮＡ検出のために金表面への固定が可能であるヌクレオシド化合物を記載している。ヌクレオシド化合物は、単一のチオール官能基による金表面への固定のために、わずか１回のみ含まれる。出発試薬は高価であり、チオール化合物は製造が複雑である。

EP 0 523 978 US 7,601,848

U. K. Shigdel and C. He, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130(52), 17634-5 S. Jin et al., J. Org. Chem. 2005, 70, 4284-4299 A. Hatano et al. Tetrahedron, 61, 2005, 1723-1730 A. A. Rowe et al., Anal. Chem. 2011, 83, 9462-9466

本発明の目的は、前述の欠点を少なくとも部分的に克服するチオール化合物、すなわち、製造が容易であり、単純かつ経済的な様式でオリゴマー化可能であり、オリゴヌクレオチド内に組み込まれ、表面に固定されることが意図されるチオール化合物を提供することである。

より詳細には、本発明は、１以上のチオール官能基をオリゴヌクレオチド内に導入する、容易かつ効率的な方法を提供することを目的とする。

本発明の第１の構成は、下記の式（Ｉ）に対応する化合物である。

（式中、
Ｔは、−Ｏ−Ｐ（ＯＲ_１）Ｎ（Ｒ_２）_２、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）Ｏ⁻、−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□から選択される基であり、
・Ｒ_１は、２−シアノエチル、およびＲ’_１Ｒ’_２Ｒ’_３ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２基から選択され、Ｒ’_１、Ｒ’_２、Ｒ’_３は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分枝鎖の１から１２の炭素原子を含むアルキルおよびＣ６−Ｃ１２アリールから選択される基を表し、
・Ｒ_２は、直鎖もしくは分枝鎖の１から１２の炭素原子を含むアルキル基、ピロリジンから選択され、
・Ｊは、単結合、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＯＣＨ_２−、Ｐｈがベンジルである−ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２−の基から選択され、
・□は固体支持体を表し、
Ｄは、アルコールの保護基であり、
Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、
Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＣＯＮ−アルキル基から選択され、
Ｙは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｘは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２ Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２ Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２ Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。）

一実施態様では、前記化合物は、下記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）のいずれか１つに対応する。

ある実施態様では、
・Ｄが４，４’−ジメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イルまたはフルオレニルメトキシカルボニルから選択され、
・Ｗが、Ｃ１−Ｃ６アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アリールトリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、より詳細には、ＣＨ、ＣＣＨ_３、ＣＣＨ_２ＣＨ_３、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイル基から選択され、および／または
・Ｚが、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６ ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ ＣＯＮ−アルキル基から選択され、および／または
・Ｙが、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択され、および／または
・Ｘが、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択され、および／または
・Ｒが、Ｃ１−Ｃ６アシル、Ｃ１−Ｃ６ Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ６ Ｓ−アリール、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ６ Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ６ Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６ Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択され、好ましくは、ＲはＣ１−Ｃ６アシル基である。

ある実施態様では、Ｔが基−Ｏ−Ｐ（ＯＲ_１）Ｎ（Ｒ_２）_２である。
（式中、Ｒ_２はイソプロピル基であり、Ｒ_１は、２−シアノエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチル、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル基から選択される。）

ある実施態様では、Ｔが基−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□
（式中、□は、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、合成または天然の親水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルから選択される固体支持体である）である。

本発明の別の構成は、本発明に係る式（Ｉ）の化合物を製造するための方法である。前記方法は、
下記のステップ：
−化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：

または下記の合成経路：

に従った化合物（Ｉａ）の調製工程、
−化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：

（式中、ＱおよびＱ’は、それぞれ独立して、置換または非置換のベンゼン基を表す）
に従った、化合物（Ｉｂ）の調製工程、
−化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：

または下記の合成経路：

に従った化合物（Ｉｃ）の調製工程、
（Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗ、Ｒ、□、Ｒ１およびＲ２は、化合物（Ｉ）におけるこれらの各ステップにおける同じ定義を有する）
から選択される少なくとも１つのステップを含む。

本発明の別の構成は、本発明にかかる化合物（Ｉ）のオリゴマー化により得ることができるオリゴマーであり、オリゴマーは、
式：
（Ｉｃ）−（Δ）_ｋ （ＸＶＩ）_ｋ
［式中、
（Ｉｃ）は、化合物（Ｉ）と同じ意味を有し、化合物（Ｉｃ）のＲ基はさらにＨを表してもよく、
ｋは、１から１２の間の整数を表し、
（△）は、（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）：

（式中、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＲおよびＲ_１は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表し得る）を表す］
を有する。

一実施態様では、本発明に係るオリゴマーは、
式（ＸＩＶ）_ｋ：

（式中、
□、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＲおよびＲ_１は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表すことができ、ＤはさらにＨを表すことができ、ｋは、１から１１の間に含まれる整数である）
を有する。

本発明は、また修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法に関し、前記方法は、
−本発明に係る化合物（Ｉ）をオリゴヌクレオチド上にグラフトするステップ、または
−ヌクレオチドを、本発明に係るオリゴマーにグラフトするステップ、
を少なくとも含む

本発明の別の構成は、本発明に係る製造方法により得ることができる修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
下記の式（ＸＩＩａ）：
□-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y-(M₁-…-M_m-1-M_m)_p-(I’)_y’
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、上記の式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
□は固体支持体を表す）
を有する。

本発明の別の構成は、本発明に係る製造方法により得ることができる修飾オリゴヌクレオチドであって、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
下記の式（ＸＩＩＩａ）：
(Ic)-(I’)_y-1-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y’-[M₁-M₂-…-M_m-1-M_m]_p-(I’)_y”
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、上記の式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｙ’は、０から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は０を有する）
を有する。

一実施態様において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
式（ＸＩＩｃ）：

（式中、
ｎ、ｙ、Ｎ_１、…Ｎ_ｎ−１は上記と同じ定義を有し
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは上記と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ｎ番目のヌクレオチドの塩基を表す）
を有する。

一実施態様において、前記修飾オリゴヌクレオチドは、
式（ＸＩＩＩｃ）：

（式中、
ｎ、ｙ、Ｎは上記と同じ定義を有し、
Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは上記と同じ定義を有し、
Ｂ１は、１番目のヌクレオチドの塩基に対応する）
を有する。

本発明の別の構成は、ヌクレオチドの合成のための自動装置に関し、前記自動装置は、
以下を含有する別個の容器、
−ヌクレオチド
−カップリング活性化因子、および
−洗浄剤、
生成物試料のサンプリングおよび分配のための機械的手段ならびにこれらの機械的手段実施の制御のためのコンピュータ手段、ならびに
本発明に係るオリゴマーによるグラフト化固体支持体、および／または本発明に係る化合物（Ｉａ）もしくは化合物（Ｉｂ）を含有する少なくとも１つの容器が配置された、少なくとも１つの容器、
を少なくとも含む。

本発明は、さらに本発明に係る少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドによりグラフト化された基材であって、
前記基材は、金またはプラチナの膜により被覆された、または少なくとも１つ炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基を含む基によりグラフト化された、少なくとも１つのレシービングゾーンを含み、
金の膜の場合、前記基材は金属製であり、
少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基によりグラフト化された場合、前記基材はプラスチック製である、グラフト化基材に関する。

本発明の一実施形態に従って、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を含む基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化されたアルケン、好ましくは、マレイミド、アクリルアミド基から選択されるアルケンから選択される。

一実施形態に従って、ハロアセトアミド基は、ブロモアセトアミドおよびヨードアセトアミド基から選択される。

本発明の一実施形態に従って、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化されたアルキンから選択され、このアルキンは、好ましくは２−プロピンアミド基から選択される。

一実施形態に従って、金属基材は銅製またはチタン製であり、および／またはプラスチック基材はポリスチレン製である。

本発明はまた、試験キットを提案し、前記試験キットは、
−少なくとも１つの基材であって、前記基材は、金またはプラチナの金属の膜により被覆された少なくとも１つのレシービングゾーンを含む基材か、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基によりグラフト化された基材と、
−本発明に係る、少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドと、
を含む。

本発明の別の構成は、オリゴヌクレオチドと別の分子との間の親和性試験を行うための、本発明に係る基材の使用に関する。

本発明の別の構成は、少なくとも２つのチオール基を含む化合物の、診断試験の確立のための使用に関し、
前記チオール基は、オリゴヌクレオチドを、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基により修飾された表面にグラフトする。

本発明の有利性は、下記：
−本発明のチオール化合物は安価である、
−本発明のチオール化合は、実施が単純な方法により得られる、
−本発明のチオール化合物は、単純かつ効率的な様式で、オリゴヌクレオチドに１回以上導入することができる、
−本発明のグラフト化オリゴヌクレオチドは、金表面に、または通常アクリルアミドもしくはマレイミド基によりグラフト化された表面に、安定に固定することができる、
−本発明のオリゴヌクレオチドは、完全に自動化された方法により製造可能である、
のとおりである。

本発明の他の特長および有利性は、下記の本発明の好ましい実施形態の説明、所与の実施例を読み、添付の図面を参照することにより明らかになると思われる。

図１は、化合物（Ｉ）の合成方法を説明する概略図を示す。 図２Ａは、化合物（Ｉａ）から出発する、本発明の化合物のオリゴマーの合成方法を説明する概略図を示す。 図２Ｂは、化合物（Ｉｂ）から出発する、本発明の化合物のオリゴマーの合成方法を説明する概略図を示す。 図３は、その５’末端において（Ｉ）のオリゴマーによりグラフト化されたオリゴヌクレオチド化合物（ＸＩＩｃ）の合成方法を説明する概略図を示す。 図４は、その３’末端において（Ｉ）のオリゴマーによりグラフト化されたオリゴヌクレオチド化合物（ＸＩＩＩｃ）の合成方法を表す概略図を示す。 図５は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面におけるグラフト率のヒストグラムを示す。 図６は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面へのグラフティングの安定性を、６０℃における時間の関数として表すグラフを示す。 図７は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面へのグラフティングの安定性を、８０℃における時間の関数として表すグラフを示す。 図８は、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。 図９は、モノチオールプローブによるプローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。 図１０は、ジチオールプローブによるプローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。 図１１は、テトラチオールプローブによるプローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。 図１２は、金表面にグラフトされたテトラチオールプローブによる、プローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。 図１３ａは、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドと、活性化アルケニルもしくはアルキニル基によりグラフト化された表面との間の反応式を示す。 図１３ｂは、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドと、光（λ＝２６５ｎｍ）により活性化されたアルケニルもしくはアルキニル基によりグラフト化された表面との間の反応式を示す。 図１４は、それぞれ、本発明に係る、１、２、４、６および８つのチオール基含有化合物を含むプローブによる、プローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。

本発明は、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート構造の化合物または保護されたチオール官能基を有する固体支持体に結合された化合物の調製および使用に関する。これらのチオール化合物は、オリゴヌクレオチド内への導入が意図される。このようにして得られたオリゴヌクレオチドは、複数のチオール官能基を有し得る。

［チオール化合物］
本発明の化合物は、下記の式（Ｉ）に対応する。

（式中、
Ｔは、−Ｏ−Ｐ（ＯＲ_１）Ｎ（Ｒ_２）_２、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）Ｏ⁻、−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□から選択される基であり、
・Ｒ_１は、２−シアノエチル、Ｒ’_１Ｒ’_２Ｒ’_３ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２基から選択され、ここで、Ｒ’_１、Ｒ’_２、Ｒ’_３は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分枝鎖の、１から１２の炭素原子を含むアルキルおよびＣ６−Ｃ１２アリールから選択される基を表し、
・Ｒ_２は、直鎖もしくは分枝鎖の１から１２の炭素原子を含むアルキル基、ピロリジンから選択され、
・Ｊは、単結合、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＯＣＨ_２−、Ｐｈがベンジルである−ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２−の基から選択され、
・□は固体支持体を表し、
Ｄは、アルコールの保護基であり、
Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、
Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＣＯＮ−アルキル基から選択され、
Ｙは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｘは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２ Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２ Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。）

本発明の意味の範囲内で、「アルカントリイル」は、１以上のアルキル基により場合により置換されている直鎖、分枝鎖または環状のアルカントリイルを意味する。

本発明に従った化合物中に存在できるアリールトリイル基としては、ベンゼントリイルおよびナフタレントリイルを挙げることができる。

アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）基としては、１，３，５−トリメチルベンゼントリイルおよびトリメチルナフタレントリイルを挙げることができる。

化合物（Ｉ）は、下記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）に対応する３種類の亜化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）に分けることができ、式中、パラメーターＸ、Ｙ、Ｚ、Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の式（Ｉ）に提示される同じ定義を有する：

好ましくは、Ｒ_１は、２−シアノエチルおよびＲ’_１Ｒ’_２Ｒ’_３ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２基から選択され、
Ｒ’_１、Ｒ’_２、Ｒ’_３は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分枝鎖の、１から６の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
好ましくはＲ_１は、２−シアノエチルおよびＲ’_１Ｒ’_２Ｒ’_３ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２基から選択され、
Ｒ’_１、Ｒ’_２、Ｒ’_３は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分枝鎖の、１から３の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
さらにより好ましくは、Ｒ_１は、２−シアノエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチル、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル基から選択される。

好ましくは、Ｒ_２は、直鎖または分枝鎖の、１から６の炭素原子を含むアルキル基から選択される。好ましくは、Ｒ_２は、イソプロピル基（ｉＰｒ）を表す。

好ましくは、固体支持体□は、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミドで構成される樹脂、合成または天然の親水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルから選択される。

好ましくは、Ｗは、Ｃ１−Ｃ６アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アリールトリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、より好ましくは、ＣＨ、ＣＣＨ_３、ＣＣＨ_２ＣＨ_３基、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイルから選択される。

好ましくは、Ｄは、化合物（Ｉ）の他の基に対して直交脱保護（orthogonal deprotection）が可能なアルコールの保護基から選択される。より詳細には、Ｄは、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、９−フェニルキサンテン−９−イル（ピキシル（ｐｉｘｙｌ））またはフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択される。ピキシル保護基は、特に、文献Chattopadhyaya and Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978年, 639-640頁に記載されている。アルコールの別の保護基候補は、ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基であり、およびこの場合ポリスチレン支持体が特に好ましいと思われる。

好ましくは、Ｚは、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ６ＣＯＮ−アルキル基から選択される。

好ましくは、Ｙは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択される。

好ましくは、Ｘは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択される。

好ましくは、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ６Ｓ−アルキル、Ｃ６Ｓ−アリール、酸素含有または窒素含有Ｃ６Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ６Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ６Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。

一実施形態に従って、直鎖または分枝鎖のアルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される。

一実施形態に従って、アミノアルキルは、１以上の窒素原子を含む、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチル、アミノペンチル、アミノヘキシル、アミノヘプチル、アミノオクチル、アミノノニル、アミノデシル、アミノウンデシル、アミノドデシル、アミノイソプロピル、アミノイソブチル、アミノ−ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される。

一実施形態に従って、アルコキシは、１以上の酸素原子を含む、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、オキシブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、イソプロピルオキシ、イソブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシの基から選択される。

一実施形態に従って、シクロアルキルは、場合により１以上の不飽和を含み、３から１２の間の炭素原子、好ましくは６の炭素原子を含む環から選択される。

一実施形態に従って、シクロヘテロアルキルは、１以上の窒素原子および／または酸素原子により置換され、場合により、１以上の不飽和を含み、３から１２の間の炭素原子、好ましくは５の炭素原子および１個の窒素原子または酸素原子を含む環から選択される。

一実施形態に従って、ＮＣＯ−アルキルおよびＣＯＮ−アルキルは、アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される直鎖または分枝鎖のアルキル基であってよい基である。

一実施形態に従って、Ｒ_２は、イソプロピル基（ｉＰｒ）である、および／またはＲ_１はシアノエチル基である。

好ましい実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、下記の式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の（Ｉａ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩ）である。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。

好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

別の実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、下記の式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩＩ）である。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。

好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉｃ）は、下記の式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｄおよび□は、上記の式（Ｉｃ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩＩＩ）である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。好ましくは、Ｊはエチル基である。好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（ＩＸ）である。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。

好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（Ｘ）である。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。

好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：

（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（ＸＩ）である。

好ましくは、Ｒ_２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ_１はシアノエチル基である。

好ましくは、Ｒはアセチル基である。

好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。

［製造方法］
化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）の製造方法を、図１の概略図に表す。

化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）は、下記の式：

（式中、Ｄ、Ｘ、Ｗ、Ｙ、ＺおよびＲは、チオール化合物（Ｉ）と同じ定義を有する）
を有する同じ化合物（ＩＩ）から得られる。

式（Ｉａ）の化合物は、下記の式：

に表された反応により、
または、好ましくはジイソプロピルアミンテトラゾリドの塩の存在下で、下記の式：

に表された反応によって得ることができる。

式（Ｉｂ）の化合物は、下記の式：

（式中、ＱおよびＱ’は互いに独立して、置換または非置換のベンゼン基を表す）
に表された反応によって得ることができる。

化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）を得るための前述の反応は、化合物（ＩＩ）から出発して、好ましくは塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で、無水溶媒、例えば無水ジクロロメタン中で実施される。

式（Ｉｃ）の化合物もまた、化合物（ＩＩ）から出発するが、好ましくは下記の式：

に表される反応ステップに従う。

化合物（Ｉｃ）を得るための前述の反応は、好ましくは無水溶媒、例えばピリジン中で、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で実施される。

化合物（Ｉｃ）を、下記の反応式：

に従って得ることもまた可能である。

本発明の目的は、上記の式の化合物（ＩＩ）（式中、Ｄ、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ＹおよびＲ基は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有する）である。

式（ＩＩ）の化合物は、化合物（ＩＩＩ）から下記の反応ステップ：

（式中、Ｇはハロゲン、好ましくは臭素またはヨウ素である）
に従って得ることができる。

上記の反応は、好ましくは、無水溶媒、例えば無水トルエン中で、クラウンエーテルの存在下で実施される。

化合物（ＩＩＩ）は、化合物（ＩＶ）から、下記の反応ステップ：

（式中、
ＧおよびＧ’はハロゲン原子であり、同一であっても、または異なっていてもよく、好ましくはＧおよびＧ’は臭素またはヨウ素原子であり、
Ｚ’は、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基であり、
Ｚ”は、Ｃ１−Ｃ１２の直鎖または分枝鎖アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基であり、
ジハロゲン化化合物Ｇ−Ｚ”−Ｇ’は、化合物（ＩＶ）のＺ’基と反応して、化合物（ＩＩＩ）のＺ−Ｇ基の形成をもたらすことが意図される）
に従って得ることができる。

化合物（ＩＩＩ）を得るステップは、好ましくはアルカリ金属水素化物、例えばＮａＨの存在下で実施される。

化合物（ＩＶ）は、市販の化合物（Ｖ）から、下記の反応ステップ：

に従ってアルコール官能基の保護によって得ることができる。

アルコール官能基の保護のこのステップは、当業者に周知の条件下で、Ｄの選択に依存して実施される。

一実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｖ）からアルコール官能基を保護するために好ましくは溶媒、例えばピリジン中で、４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）との反応により、得られる。

別の実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（ｖ）から、９−フェニルキサンテン−９−イル塩化物（ピキシル−Ｃｌ）から出発して、文献Chattopadhyaya and Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978年, 639-640頁に記載の条件下で得られる。

別の実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｖ）から、当業者に周知の条件下でフルオレニルメトキシカルボニル塩化物（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）との反応により得られる。

上記の式（ＩＩ）から（Ｖ）において、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｄ、Ｒ、Ｒ_１、Ｒ_２は、上記の化合物（Ｉ）の定義と同じ定義を有する。

好ましくは、出発化合物（Ｖ）は、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンまたは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸または１，３，５−トリス（ヒドロキシエトキシ）ベンゼンまたは１，３，５−トリス（ヒドロキシメチル）シクロヘキサンまたは２−アミノ−１，３−プロパンジオールである。

［チオール化合物のオリゴマー］
本発明の目的は、上記の式（Ｉ）のチオール化合物から形成されるオリゴマーに関する。これらのオリゴマーの合成方法は、式（Ｉａ）の化合物のオリゴマー化に関しては図２Ａの略図に、式（Ｉｂ）の化合物のオリゴマー化に関しては図２Ｂに記載する。

第１のステップにおいて、化合物（Ｉｃ）のアルコール官能基を、化合物（Ｉｃ．１）を得るために脱保護させる。この脱保護ステップは、当業者に周知の手段により、好ましくは、ＤＭＴｒおよびＰｉｘｙｌ基に関してはジ−またはトリクロロ酢酸の存在下で、およびＦｍｏｃ基に関してはピペリジンの存在下で実施される。

次いで、化合物（Ｉｃ．１）を化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）と反応させ、それぞれ、化合物亜リン酸トリエステル（ＸＩＶ’）１またはＨ−ホスホネートジエステル（ＸＶ’）１を得る。

次いで、化合物（ＸＩＶ’）１を、好ましくは２ヨウ素の存在下で酸化させ、この２ヨウ素をその後、亜リン酸トリエステル結合の酸素原子を供給する水により置き換え、リン酸トリエステル化合物（ＸＩＶ）１を得る。この酸化ステップは、化合物（ＸＩＶ）ｉと化合物（Ｉａ）との間の各カップリングステップ後に実施される。

次いで、同じ方法において、化合物（ＸＩＶ）１を（ｋ−１）の化合物（Ｉａ）と反応させ、（ｋ−１）の酸化後、化合物（ＸＩＶ）_ｋを得：

化合物（ＸＶ’）１を、そのアルコール官能基において脱保護し、（ＸＶ”）１を得、これを（ｋ−１）の化合物（Ｉｂ）と反応させ、化合物（ＸＶ’）_ｋを得る：

次いで、化合物（ＸＶ’）_ｋを、好ましくは２ヨウ素および水の存在下で酸化させ、リン酸ジエステル化合物（ＸＶ）_ｋを得る。

最終的に、任意選択の最終ステップは、化合物（ＸＩＶ）_ｋまたは（ＸＶ）_ｋの脱保護から成り、同じ化合物（Ｉ）_ｋを得る。

好ましくは、オリゴマーは、２から１２の化合物（Ｉ）、特に２から８の間の化合物（Ｉ）のオリゴマー化からもたらされる、すなわち、このオリゴマーは、２、３、４、５、６、７または８の化合物（Ｉ）を含み得る。好ましくは、金表面へのグラフトが意図されるチオールオリゴマーは、３から８、有利には４から８の化合物（Ｉ）を含み、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド基、特にマレイミドもしくはアクリルアミドを含む基によるグラフト化基材への連結が意図されるチオールオリゴマーは、２から６の化合物（Ｉ）を含む。

一実施形態に従って、オリゴマーは、式（Ｉａ）の化合物または式（Ｉｂ）化合物から単独で作製可能である。オリゴマー化は、第１の化合物（Ｉ）の脱保護されたアルコール官能基と、第２の化合物（Ｉ）のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応により実施される。

化合物（Ｉａ）および化合物（Ｉｂ）の混合物から出発するオリゴマーの作製を想定することも可能であるが、この実施形態はあまり興味深くない。

好ましくは、オリゴマーは、ホスホラミダイトの化学的性質を利用して、すなわち、タイプ（Ｉａ）の化合物のオリゴマー化により作製される。

オリゴマー化は、固体支持体上、または溶液中で実施可能である。好ましくは、オリゴマー化は、固体支持体上で実施される。実際に、溶液中のオリゴマー化は、特に、診断応用に必要な少量のために経済的には採算の合わないクロマトグラフィーによる精製ステップを伴う。

上記した本発明の別の目的は、化合物（Ｉａ）のオリゴマーまたは化合物（Ｉｂ）のオリゴマーによるグラフト化固体支持体であって、下記の式（ＸＶＩ）_ｋ：
(Ic)-(I’)_k （ＸＶＩ）_ｋ
（式中、
ｋは、１から１１の整数を表し、
（Ｉｃ）は、上記と同じ意味を有し、
（Ｉ’）は、（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）：

を表す）
に対応するものである。

化合物（Ｉｃ）および式（Ｉａ）の化合物から形成された固体支持体□上のオリゴマーは、下記の式（ＸＩＶ）_ｋ：

（式中、□、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｊ、ＲおよびＲ_１は、上記と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表してもよく、ｋは、１から１１の間の整数である）
に対応する。

化合物（Ｉｃ）および式（Ｉｂ）の化合物から形成された固体支持体上のオリゴマーは、下記の式（ＸＶ）_ｋ：

（式中、□、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＪおよびＲは、上記と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表してもよく、ｋは、１から１１の間の整数である）
に対応する。

オリゴマーが、化合物（Ｉｃ）および化合物（Ｉｂ）から出発して、固体支持体上に形成される場合、得られた化合物（ＸＶ）_ｋは、化合物（ＸＩＶ）_ｋと同じ式に対応するが、Ｈ−ホスホネートジエステル結合の酸化後、Ｒ_１は水素原子である。

オリゴマー化反応の終わりに、既存の方法によるチオール官能基の脱保護が想定され、その後ＲはＨを表す。

［修飾オリゴヌクレオチド］
本発明の別の主題は、少なくとも１つのヌクレオチド（好ましくは、少なくとも２つのヌクレオチド）および少なくとも１つの前記チオール化合物（Ｉ）で構成された修飾オリゴヌクレオチドに関する。

本出願において、オリゴヌクレオチドという用語は、２から１００のヌクレオチドを含む鎖を表す。

本発明に従ったチオール化合物は、鎖の３’位またはオリゴヌクレオチドの５’位にグラフトされる。

前記修飾オリゴヌクレオチドの調製方法は、少なくとも：
−化合物（Ｉ）をオリゴヌクレオチド上にグラフトして、５’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、または
−化合物（Ｉ）のオリゴマー上にヌクレオチドをグラフトして、３’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、
を含む。

本発明の一実施形態に従って、グラフト化オリゴヌクレオチドは、下記の式（ＸＩＩａ）：
□-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y-(M₁-…-M_m-1-M_m)_p-(I’)_y’ （ＸＩＩａ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
□は固体支持体をあらわす）
に対応する。

修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ）は、オリゴヌクレオチドＮの５’位またはヌクレオチド鎖に、１以上のチオール化合物を有する。前記化合物は、化合物（Ｉ）をグラフトし、その後、オリゴヌクレオチドの５’位における（Ｉ）から得られたオリゴマーを伸長することによって得られる。次いで、ｐ＝１の場合、ヌクレオチド鎖の伸長を継続する。次いで、同じ方法で、１以上の追加の化合物（Ｉ）を、オリゴヌクレオチドＭの５’位へのグラフティングを、想定することができる。

化合物（ＸＩＩａ）を得るための略図を、図３に記載するが、ここでチオール化合物はタイプ（Ｉａ）であり、ｐは０に等しい。化合物（ＸＩＩａ）の調製の最初の３ステップにより、オリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に、当業者に周知の方法により合成される。第１のステップにおいて、第１のヌクレオチドを固体支持体にグラフトし、次いで、他のヌクレオチドを、当業者に周知の合成方法によりグラフトさせる。下記の化合物が得られる：

その後、別のヌクレオチドを、同じ方法によりグラフトし、式（ＸＩＩａ．２）の化合物を得る。

次のステップにおいて、本発明に従うタイプ（Ｉａ）のチオール化合物を、オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ．２）の５’位にグラフトし、化合物（ＸＩＩａ．３）を得る：
□-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’a) （ＸＩＩａ．３）

このステップにおいて、グラフティングは、化合物（Ｉａ）のホスホラミダイト官能基と、化合物（ＸＩＩａ．２）の末端ヌクレオチドの５’位のアルコール官能基との反応により、従来通りに実施される。

図３の概略図において、合成例は、タイプ（Ｉａ）のチオール化合物のオリゴマー化により記載しているが、同様の合成方法は、タイプ（Ｉｂ）のチオール化合物により修飾されたオリゴヌクレオチドの合成にも使用される。

その後、前記のオリゴマー化、特に図２Ａおよび図２Ｂに記載のオリゴマー化を、上記の化合物（ＸＩＩａ．３）から出発して実施し、１以上の化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）との反応により、式：
□-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’a)_y
の化合物（ＸＩＩａ．４）
または構造式（ｐ＝０の場合）：

（式中、
□、Ｄ、Ｒ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｒ_１は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、Ｒ_１はさらにＨを表してもよく、
ｎ、ｙおよびＮ_１、Ｎ_２、…Ｎ_ｎ−１は、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖に従来通り使用される塩基を表す）
を得る。

オリゴマーの伸長がタイプ（Ｉｂ）の化合物により実施される場合、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ．４）と類似の構造を有するが、Ｒ_１はＨを表す。

その後、ヌクレオチド化合物Ｍ_１、Ｍ_２、…Ｍ_ｍを続けてグラフティングすることが可能であり、ｐ＝１の生成物（ＸＩＩａ）が得られる。これらの場合も、固体支持体上においてさらに伸長が起こる。

このグラフトステップは、当業者に周知の方法により、従来通り実施される。

本発明の別の実施形態に従って、グラフト化オリゴヌクレオチドは、下記の式（ＸＩＩＩａ）：
(Ic)-(I’)_y-1-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y’-[M₁-M₂-…-M_m-1-M_m]_p-(I’)_y”
（ＸＩＩＩａ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｙ’は、０から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は値０を有する）
に対応する。

Ｊがエチル基であるタイプ（Ｉｃ）の化合物およびタイプ（Ｉｂ）の化合物から形成されるオリゴマーを使用する、化合物（ＸＩＩＩｃ）の合成方法を表す略図を図４に記載する。

式（ＸＩＩＩｃ）の化合物の合成は、式（Ｉ）の本発明に従ったチオール化合物のオリゴマー化からなる第１のステップを含み、そのための方法は上に記載しており、式（ＸＩＩＩａ．１）：
(Ic)-(I’)_y-1 （ＸＩＩＩａ．１）
（式中、
（Ｉｃ）は、前述と同じ定義を有し、
（Ｉ’）は、タイプ（Ｉ’ａ）または（Ｉ”ｂ）の基を表し、

である）
または
（Ｉ’）が（Ｉ”ｂ）を表す場合の構造式として、

の化合物をもたらす。

第２のステップにおいて、第１のヌクレオチドＮ_１を式（ＸＩＩＩａ．１）のオリゴマーにグラフトし、下記の式（ＸＩＩＩａ．２）：
(Ic)-(I’)_y-1-N₁ （ＸＩＩＩａ．２）
の化合物を得る。

このグラフトステップは、化合物（ＸＩＩＩａ．１）のオリゴマー鎖の末端の脱保護されたアルコール官能基と、第１のヌクレオチドＮ_１のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応により実施される。

修飾オリゴヌクレオチドは、次いで、当業者に公知の任意の方法、特に、チオール化合物のオリゴマー上に存在する第１のヌクレオチドの５’のアルコール官能基と、第２のヌクレオチドの３’位のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応による、当業者に周知の従来どおりの方法により合成される。合成を、当業者に周知のヌクレオチド鎖の伸長の同様の連続ステップにより継続し、式（ＸＩＩＩａ）の化合物を得る。

本発明の別の主題は、修飾オリゴヌクレオチドを固体支持体に結び付ける結合の切断後の、上記の式（ＸＩＩａ）および（ＸＩＩＩａ）の化合物から得られる化合物に関する。結合の切断は、エステル官能基のレベルにおいて起こる。

したがって、本発明の一実施形態に従って、支持されていないオリゴヌクレオチドは、下記の構造（ＸＩＩｂ）：
N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y-(M₁-…-M_m-1-M_m)_p-(I’)_y’ （ＸＩＩｂ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しい）
を有する。

支持体の離脱は２ステップで実施される。まず、シアノエチル基が存在する場合（ホスホラミダイトの場合）その除去が非求核性強塩基（ピペリジンまたはＤＢＵ）により行われ、第２に、当業者に公知の従来の方法、好ましくは化合物（ＸＩＩａ）を水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）により処理することによって実施される。シアノエチル基はその除去の間にアクリロニトリルを形成し、アクリロニトリルはチオール官能基と強力に反応するので、チオール基の脱保護の前にシアノエチル基を除去することが必要である。

本発明の別の実施形態に従って、支持されていないオリゴヌクレオチドは、下記の構造（ＸＩＩＩｂ）：
(Ic’)-(I’)_y-1-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y’-[M₁-M₂-…-M_m-1-M_m]_p-(I’)_y”
（ＸＩＩＩｂ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉｃ’）は、（Ｉｃ）から、固体支持体とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｙ’は、０から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は０を有する）
を有する。

支持体の離脱は、当業者に公知の従来の方法、好ましくは化合物（ＸＩＩａ）を水酸化アンモニウム（ＮＨ_４ＯＨ）により処理することによって実施される。

本発明はさらに、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）および（ＸＩＩＩｃ）に関し、それぞれ、化合物（ＸＩＩａ）および（ＸＩＩＩａ）から出発して、チオール官能基の脱保護および化合物と支持体とを結ぶ結合の切断により得られる（それぞれ、図３および４）。

オリゴヌクレオチドが、１以上のタイプ（Ｉａ）のチオール化合物により修飾される場合、当業者に公知の処理による、チオール官能基および化合物（ＸＩＩａ）のホスホラミダイトの脱保護後、式（ＸＩＩｃ）：
N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I”)_y-(M₁-…-M_m-1-M_m)_p-(I”)_y’ （ＸＩＩｃ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、

であり、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しい）
の化合物、
またはｐ＝０の場合、構造式：

（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚは化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎ、ｎ、ｙは、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基を表す）
の化合物を得る。

オリゴヌクレオチドが、タイプ（Ｉｂ）の１以上のチオール含有化合物により修飾される場合、当業者に公知の処理による化合物（ＸＩＩＩａ）のチオール官能基の脱保護後、式（ＸＩＩＩｃ）：
(Ic’)-(I’)_y-1-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I”)_y’-[M₁-M₂-…-M_m-1-M_m]_p-(I”)_y”
（ＸＩＩＩｃ）
（式中、
Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉｃ’）は、（Ｉｃ）から、固体支持体□とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、

であり、
ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
ｍは、１から１００の間に含まれる数であり、
ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
ｙ’は、０から１２の間に含まれる整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は０を有する）
の化合物；
またはｙ’＝ｐ＝０の場合、構造式：

（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚは、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、
Ｎ_２、…Ｎ_ｎ、ｎおよびｙは、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基に対応する）
の化合物を得る。

オリゴヌクレオチドの合成の間に、チオール官能基は保護されることが好ましい。実際に、チオール官能基は、入ってくるホスホラミダイト官能基と反応可能である。

一実施形態に従って、チオール官能基の脱保護および固体支持体の除去のステップは、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ）または（ＸＩＩＩａ）の単一ステップ処理で実施される。

一実施形態に従って、固体支持体の除去は第１のステップにおいて実施され、チオール官能基の脱保護は第２のステップにおいて実施される。

最終オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）（それぞれ、最終オリゴヌクレオチド（ＸＩＩＩｃ））は、出発チオール化合物とは独立して、化合物（Ｉａ）から出発しても、または化合物（Ｉｂ）から出発しても得られる。実際、モノマー（Ｉａ）または（Ｉｂ）のいずれを使用するかに関わりなく、オリゴマー化反応から得られるチオールモノマー単位は、上記の化合物（Ｉ”）に対応する。

本発明に従った式（ＸＶＩ）_ｋのグラフト化支持体は、オリゴヌクレオチドの合成開始を可能にする。オリゴヌクレオチドの３’位において、ポリチオール配列として使用されるオリゴマーの配列によりグラフト化された固体支持体の工業的または半工業的調製が、特に想定可能である。

［合成キット］
第１のオリゴマー（Ｉｃ）−（Ｉ’）_ｋによりグラフト化されるこのような固体支持体は、修飾オリゴヌクレオチドの合成のためのキットに、有利に使用することができる。このようなキットにおいて、該固体支持体は、マルチウェルプレートのウェルなどのレシービングゾーンを有する担体に関連付けることができ、合成反応は、ヌクレオチドのオリゴマー化反応を実施するための当業者に公知の方法などの方法によって実施される。

［自動装置］
このようなキットは、オリゴヌクレオチド合成のための自動装置において使用することができる。この場合、このような装置は、少なくとも：
・以下をそれぞれ含有する別個の容器、
−ヌクレオチド
−カップリング活性化因子および
−洗浄剤、
・生成物試料のサンプリングおよび分配のための機械的手段およびこれらの機械的手段実施の制御のためのコンピュータ手段、ならびに
・上記の化合物（Ｉ）のオリゴマー（ＸＶＩ）_ｋによるグラフト化固体支持体を含有する少なくとも１つの容器、および／または化合物（Ｉａ）もしくは化合物（Ｉｂ）を含有する少なくとも１つの容器、
を含む。

このような自動化は、さまざまな容器に試料を採取するための機械的手段、およびこれらの試料を、固体支持体を含む容器に分配する手段をさらに含む。このような手段は、１セットの流体流動パイプおよびバルブ中に存在してもよく、必要に応じて、マイクロ流体チャネルに配置されて存在してもよもよい。または、このような手段は、ピペットサンプリングを装備した多関節アームに存在してもよい。自動装置は、これらの機械的手段の実施を制御可能なコンピュータ手段（ソフトウェア）や、連続反応(reactions sequencees)の実施が可能なコンピュータ手段（ソフトウェア）をさらに含む。

［表面の官能化］
本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、基材上に付着させることができる。それにより、この基材の表面を官能化することができる。基材は、金属製またはポリマー製であってよい。

一実施形態に従って、基材は金属、例えば銅もしくはチタン製であり、部分的もしくはその全表面にわたって金またはプラチナの膜、好ましくは金の膜で被覆される。

別の実施形態において、ポリマー基材、例えばポリスチレンは、アルケニルもしくはアルキニルまたはブロモアセトアミドもしくはヨードアセトアミドの官能基によりグラフト化される。

一実施形態に従って、ポリマー基材は導電性ポリマーである。

一実施形態に従って、アルケニルまたはアルキニル官能基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化され、好ましくは、アルケニルまたはアルキニル官能基は、マレイミド、アクリルアミド、ヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミド、２−プロピンアミドまたはＮ−アルキル−２−プロピンアミド基から選択される。

例えば、基材は、金もしくはプラチナの膜により被覆されたレシービングゾーンを含んでいてもよく、またはアルケニルもしくはアルキニル官能基、例えばアクリルアミドまたはマレイミド官能基により被覆された、レシービングゾーンを含んでよく、レシービングゾーンには修飾オリゴヌクレオチドが付着される。

化合物ｇｐｔ−ＳＨが本発明に従った修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）または修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩＩｃ）を表す図１３ａに例示するように、チオール官能基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化された炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合と反応する。図１３ａの上から下にかけて、第１の官能化反応はマレイミドによるグラフト化表面に対応し、第２の反応はアクリルアミドによるグラフト化表面に対応し、第３の反応はヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミドによるグラフト化表面に対応し、第４の反応は２−プロピンアミドによるグラフト化表面に対応し、これらは、オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）または（ＸＩＩＩｃ）が本発明に従った２つのチオール基含有化合物により修飾された場合に実施される。

図１３ｂの場合、表面は、活性化されていないアルケニル基（第１の反応）およびアルキニル基（第２の反応）によりグラフト化される。修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）または（ＸＩＩＩｃ）のチオール官能基の反応は、光（λ＝２６５ｎｍ）による活性化を使用して実施される。第１の官能化反応は、ｇｐｔ−ＳＨにより模式的に表されるモノチオール修飾オリゴヌクレオチドを使用して実施され、第２の反応は、ジチオール修飾オリゴヌクレオチドを使用して実施される。

支持体がアルキニル官能基によりグラフト化される場合、ポリチオール修飾オリゴヌクレオチドによる表面官能化は非常に興味深い（図１３ａおよび１３ｂ）。なぜなら第１ステップにおける第１のチオール官能基と、−イン官能基との間およびその後の第２ステップにおける第２のチオール官能基と得られた−エン官能基との間の、２つの連続反応により環状構造がもたらされるためである。

好ましい実施形態に従って、基材は、マレイミドまたはアクリルアミド基によりグラフト化される。

したがって、本発明は、例えば、基材の表面と修飾オリゴヌクレオチドとの間に金−イオウ結合を作製することによって金表面の官能化を可能にしてもよく、またはチオエーテル結合の作製によって、マレイミドまたはアクリルアミド官能基を有するグラフト化表面の官能化を可能にしてもよい。

修飾オリゴヌクレオチドの基材表面への固定化は、処理される表面を、修飾オリゴヌクレオチド、例えば式（ＸＩＩｃ）および（ＸＩＩＩｃ）により表される修飾オリゴヌクレオチドを含む溶液と接触させることによって実施される。一般的に、洗浄および乾燥の１以上のさらなるステップが提供される。概して、修飾オリゴヌクレオチドの溶液は、基材表面が金製である場合、０．１０μＭから５００μＭ、好ましくは０．５０μＭから１００μＭの間が含まれる濃度であり、マレイミドもしくはアクリルアミドの場合、５０ｎＭから２００ｎＭの間、好ましくは７５ｎＭから１５０ｎＭの間が含まれる濃度であり、次いで洗浄を行い、未反応生成物をすべて除去する。

オリゴヌクレオチド上の複数のイオウ原子の存在は、複数の金−イオウ結合、または複数のチオエーテル結合の作製を可能にし、これにより、オリゴヌクレオチドを表面に安定化させることができる。

一実施形態に従って、基材は非平面、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子の形態である。本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、これらのマイクロ粒子またはナノ粒子にグラフト可能である。好ましくは、これらの粒子は磁性である。実際、これらの磁性粒子は、検出試験の目的で、磁石を利用して、電極の表面またはマイクロプレートのウェルの底に容易にもたらすことができる。

［マーカーまたはリガンドへの固定］
本発明のオリゴマーは、１以上の結合点によりマーカーまたはリガンドを分子またはポリマーに結合させるために使用することもできる。このマーカーまたはリガンドは、例えば、酵素性、発色性、蛍光発生性、放射性、または化学発光性のマーカー、金属、金属イオン、ホルモン、タンパク質、ペプチド、糖類、オリゴ糖、核酸分解剤もしくはタンパク質分解剤、ビオチンなどの結合剤、抗原、ハプテン、抗体または受容体であってよい。このマーカーまたはリガンドは、生体膜を通したオリゴヌクレオチドの輸送に影響を与え得る、および／またはオリゴヌクレオチドの溶解度を改良し得る、生体対象のすべての化合物であってよい。

［試験キット］
本発明の別の主題は、試験キットおよび／または診断キットからなり、前記キットは、少なくとも１つの支持体を含み、前記支持体は、本発明に従った少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチが配置された少なくとも１つレシービングゾーンを含んでいる。

すなわち、試験キットは、生物学的活性分子のスクリーニングまたは診断もしくはシーケンシング試験のために使用することができる。診断キットが、複数の別個のレシービングゾーンを含み、その上に、同一もしくは異なるオリゴヌクレオチドによるグラフト化固体支持体が付着されることが想定可能である。例えば、試験および／または診断用支持体を形成するために、同一または異なるオリゴヌクレオチドによるグラフト化固体支持体は、一つの基材中の別個のレシービングゾーンに配置することができる。前記基材は、金膜により被覆された基材であってもよく、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を含む官能基またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基によるグラフト化基材であってもよい。

支持体は、特に金電極であってよい。試験キットは、作用電極、対電極および基準電極を含む、電気化学セルを含むことができる。作用電極は金製、対電極はプラチナ製および基準電極は銀製であってよい。修飾オリゴヌクレオチドと被験分子との間の相互作用の調査は、サイクリックボルタンメトリーのステップを含むことができる。

アルケニルまたはアルキニルまたはハロアセトアミド官能基、例えば、マレイミドもしくはアクリルアミド官能基によるグラフティングは、例えば、マイクロプレートフォーマットにおける診断分野への応用のため、および／またはＥＬＯＳＡタイプ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）の試験を実施するために使用することができる。このタイプの試験の過程において、ウェルの表面は、アルケニル、アルキニルまたはハロアセトアミド官能基、例えばマレイミドもしくはアクリルアミド官能基によりグラフト化される。その後、この表面を、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドと接触させる。したがって、オリゴヌクレオチド上の本発明に従った１以上のチオール官能基の存在のため、１以上のチオエーテル結合が形成される。次いで、試験は、特に、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定するために、試験試料と、このように官能化されたウェルとを接触させるステップからなる。測定は、例えば、オリゴヌクレオチド鎖を標識化することによる蛍光に基づくことができる。

本発明はさらに、少なくとも２つのチオール官能基を含む化合物の使用に関し、前記チオール官能基は、オリゴヌクレオチドを、官能化された表面、特に、マレイミドまたはアクリルアミドにより官能化された表面にグラフトするための化合物の使用に関する。一実施形態に従って、化合物は、３または４つのチオール官能基を含んでもよい。少なくとも２つのチオール官能基を含む化合物により、マレイミドまたはアクリルアミド表面に固定されたオリゴヌクレオチドは、診断試験（例えばＥＬＯＳＡタイプの試験）に使用する場合非常に優れた安定性を示すとともに、標的に関するより優れた利用可能性を示す。化合物中のチオール官能基の数が増加した場合、検出試験の間にグラフト化された全支持体のハイブリダイゼーションの数が増加する。したがって、４つのチオール官能基を有するオリゴマーは、標的のより効率的なハイブリダイゼーションを可能にする。実際に、オリゴヌクレオチドとの反応後、ＥＬＯＳＡタイプの検出試験において、非常に優れた結果を得ることが可能である。

実施例において、「プローブ」は、表面への固定が意図される、少なくとも１つの本発明に従ったチオール化合物を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。

「標的」は、例えば診断試験の間に、プローブとのハイブリダイズが意図されるオリゴヌクレオチド鎖を意味する。

［化合物１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオール４の合成］

化合物３を、Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J., and Morvan, F., Journal of Organic Chemistry 74, 2009, 1218-1222に記載のプロトコルに従って、化合物 １から得る。

クラウンエーテル１８−６（７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（１０ｍＬ）中１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−ブロモヘキシルオキシメチル）−２−メチル−１，３−プロパンジオール３（５５６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸カリウム（１６２ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。この混合物を、２時間、５０℃において磁気撹拌に供する。ジクロロメタン（１５０ｍＬ）による希釈後、混合物をろ過し、有機相を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥する。蒸発後、粗反応生成物をシリカクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０から３０％のエチルアセテート）により精製し、所望の生成物を、無色の油状物質の形態で得る（４１３ｍｇ、７５％）。

［１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホラミダイト）−プロパン−１，３−ジオール５の合成］

２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１９０μＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオール４（４１３ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１８６μＬ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を、１時間、周囲温度において磁気撹拌に供する。過剰な試薬を、５００μＬの水を加えることによって中和し、次いで混合物を、ジクロロメタン（１５０ ｍＬ）で希釈する。有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ_２ＳＯ_４で乾燥する。蒸発後、粗反応生成物を、シリカクロマトグラフィー（４％のトリエチルアミン含有シクロヘキサン中０から３０％の酢酸エチル）により精製し、所望の化合物５を、無色の油状物の形態で得る（４００ｍｇ、７２％）。

［チオール固体支持体６の合成］

すりガラス管において、１−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチル−１，３−プロパンジオール４（１７８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ ３６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水ピリジンと一緒に同時蒸発させる。次いで、スクシニル−長鎖アルキルアミン-ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）（１ｇ）、無水ピリジン（５ｍＬ）、無水トリエチルアミン（１６０ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ、２８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加える。次いで、１ｍＬの無水ピリジンによりすすぐ。混合物を一晩撹拌する。

混合物をろ過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）で洗浄し、その後デシケーター中で乾燥させる。支持体上のチオール化合物を、ＴＨＦ中無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、２，６−ルチジンの溶液により、３時間、撹拌しながら処理する。混合物をろ過し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍＬ）で洗浄し、その後デシケーター中で乾燥させ、２９μｍｏｌ／ｇで官能化されたチオール固体支持体６（９４０ｍｇ）を得る。

［修飾オリゴヌクレオチドの調製］
フェロセン基を５’位に含み、本発明に従ったタイプ（Ｉａ）の漸増数のチオール化合物（１、２および４チオールの化合物）を含む３種のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成装置で合成した。金表面へのオリゴヌクレオチドの固定化をサイクリックボルタンメトリーにより可視化するために、フェロセン基を使用した。１、２または４つのチオール基を、プロパンジオールタイプの固体支持体に導入し、配列番号３のＤＮＡ配列をグラフトした。最終的に、フェロセン基を保有するアルファ−チミジンホスホラミダイトを、修飾オリゴヌクレオチドの５’位に導入した。その後の脱保護は、２ステップで実施する。第１に、ベータ−除去によりシアノエチル基を除去するために、媒体を、アセトニトリル中１０％のピペリジンにより１０分間処理し、得られたアクリロニトリルを、アセトニトリルによる洗浄によって媒体から除去する。次いで、濃水酸化アンモニウムによる処理で、核酸塩基上およびチオール官能基上のアシル保護基の除去を可能にし、スクシニル連結（固体支持体）の加水分解を可能にする。このプロトコルは、脱保護されたチオール官能基とアクリロニトリルとの間のＭｉｃｈａｅｌ付加の回避を可能にする。蒸発後、支持されていない修飾オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムによる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製する。

［修飾オリゴヌクレオチド（テトラチオール、ジチオールおよびモノチオール）のグラフティングおよび安定性調査］
この研究のために、ＶＭＰ３ Ｂｉｏｌｏｇｉｃマルチチャンネル・ポテンショスタット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ）を使用した。結果を、ＥＣ−Ｌａｂソフトウェア、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製を使用して記録した。

電気化学セルは、表面積０．２８ｃｍ²の金電極、プラチナの対電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極からなる。

ステップ１：チオール基の還元
４ｎｍｏｌのＯＤＮ−チオール（１以上のチオール化合物により修飾されたオリゴヌクレオチド）を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１６０ｍＭ）、すなわち、溶液中、濃度２０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣＬで、２０℃において２時間アルゴン下で還元する。

ＯＤＮを、ＴＣＥＰ−ＨＣｌの２０ｍＭ溶液による２回連続の希釈／遠心分離により精製し、アミコンＹＭ３０００フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において１５分間１４０００ｒｃｆ（ｒｃｆ＝相対遠心力（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｏｒｃｅ））でガス抜きする。４５０μＬのガス抜きした１００ｍＭのリン酸バッファーで希釈後、媒体を、アミコンＹＭ３０００フィルターにおいて３０分、１４０００ｒｃｆで、再度遠心分離する。

４ｎｍｏｌのＯＤＮ、９０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌを含有するグラフティング溶液を得る。

ステップ２：金電極の活性化
金の作用電極を、アセトン中で１０分間、超音波による１回目の洗浄により、浄化する。一度乾燥させ、すべての有機残留物を表面から除去するために、表面を「ピラニア」溶液（０．７ｍＬのＨ_２ＳＯ_４、０．３ｍＬのＨ_２Ｏ_２）に１分間浸漬する。

電極の最終基本活性化は、０．５Ｍのソーダ中で負電位（−１．４Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌ）において数サイクル、水の加水分解により電極において水素を発生させることによる金の表面浄化からなる。

ステップ３：プローブのグラフティング
すすぎ後、チオールオリゴヌクレオチドを含有するグラフティング溶液を、活性化された金電極と、不活性雰囲気下で３日間接触させる。

すすぎ後、電気化学セルに分析電解質（１０ｍＭの二塩基性のリン酸ナトリウム、１０ｍＭの一塩基性のリン酸カリウム、２５０ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を満たす。

表面を、１ｍＭのメルカプトプロパノール溶液により３０分間不動態化し、すすぎ後、グラフト層を安定化させるために、セルを分析電解質に２時間入れる。

ステップ４：表面にグラフトされた化合物の安定性分析
分析は、５０ｍＶ／秒において−０．１Ｖから０．４５Ｖの間で、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）により実施される。グラフト層の安定性の研究は、３０分ごとのサイクルで２時間、電気化学シグナルの安定化後、実施される。

セルを、６０℃または８０℃で１または５分ガス抜きした蒸留水で満たし、すすぎ後、セルを、１．５ｍＬの分析電解質のリン酸塩（２０ｍＭ）過塩素酸塩（２５０ｍＭ）で満たす。３０分間安定化後、ＣＶを実施する。

操作を必要な回数繰り返す。

結果
チオール化合物（テトラチオール、ジチオールおよびモノチオール）により修飾された３種のオリゴヌクレオチドのグラフト率の比較を実施した。グラフト率は、フェロセンの酸化ピークの積分により決定した。実際、移動した電子電荷は、電極の表面に存在するフェロセンの数に直接関係し、したがって、金にグラフトされたプローブの数に直接関係する。

下記の得られた結果は、各プローブに関する３種の異なるグラフティングのグラフト率の平均値に対応する。

結果のヒストグラムを図５に示す。

モノチオールおよびジチオールに関するグラフト率は極めて同等であり、テトラチオールのグラフティングは、チオール連結の数との調和においておそらく障害の大きさのため、低レベルであることが観察されている。この差にもかかわらず、テトラチオールのグラフト率はそれでもかなりの量であり、非常に再現性がある。

チオール化合物により修飾された３種のオリゴヌクレオチドの、温度に対する安定性試験を、ガス抜きした蒸留水中で実施した。電気化学応答の進展を、サイクリックボルタンメトリーによりモニターした。フェロセンの酸化強度の百分率低下を、安定化後に得られたシグナルに関して計算する。

時間の関数としてのこれらの低下を、図６および７に提示する。

テトラチオール分子は、６０℃の水中における連続処理に対し非常に安定である（図６）。実際に、１分のこの処置を５回後、モノチオール（出発シグナルの７０％）およびジチオール（出発シグナルの６２％）とは対照的に、９７％の出発シグナルが残存する。

８０℃において、シグナルの喪失はより多い（図７）。１分間の５回連続処理後、８３％の出発シグナルがテトラチオールに関して再度定量可能である。したがって、テトラチオールの安定性は、モノチオール（残留シグナルの４５％）の安定性およびジチオール（残留シグナルの１８％）の安定性を超えて十分上である。

この研究は、４チオール化合物（テトラチオール）により修飾されたオリゴヌクレオチドの使用により、金へのチオールのグラフティングの安定性が、モノチオールまたはジチオールのグラフティングと比較して著しく増加することを示す。この最後に述べたジチオールの安定性の欠如は、金へのグラフティングと、分子内ジスルフィド結合の再形成のための閉環との間の競合による可能性があり得る。したがって、グラフティング連結における４つのチオールの数を維持し、温度に対する優れた安定性を確実にすることが好ましいと思われる。

［応用：Ｃ型肝炎ウイルスの存在の検出］
被験標的試料
１）天然標的：ＨＣＶ（＋）アンプリコン
サンプリング：国家規模のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在に関する検査で陽性と出た血液ドナー由来の血漿試料を、シーケンシングにより解析する。
ウイルスＲＮＡの増幅：４０１ｂｐのＨＣＶアンプリコンを、ＲＴ−ＰＣＲにより、上記の血漿試料から、ＮＳ５ｂウイルス領域に作製する。ＲＮＡを、２００μＬのヒト血漿からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造業者の推奨に従って抽出する。ＲＮＡを、５０μＬの滅菌水（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有）に溶出させる。逆転写（ＡＴ）ステップのために、１１μＬのＲＮＡを７２℃で１０分間変性させ、４μＬの５Ｘ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬの１０Ｘ Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）、２μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で逆転写する。逆転写条件は下記のとおりである：１０分２３℃、４５分３７℃、および１０分９５℃。

５マイクロリットルのｃＤＮＡをその後、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、プライマー「ビオチン化ＨＣＶセンス」（配列番号１［Ｂｔｎ］ Ｔｇｇ ｇｇＡ ＴＣＣ ＣｇＴ ＡＴＧ ＡＴＡ ＣＣＣ ｇＣＴ ｇＣＴ ＴＴｇ Ａ）および「ＨＣＶアンチセンス」（配列番号２ ｇｇＣ ｇｇＡ ＡＴＴ ＣＣＴ ｇｇＴ ＣＡＴ ＡｇＣ ＣＴＣ ＣｇＴ ｇＡＡ）（Catherine Tamalet, Philippe Colson, Herve Tissot-Dupont, Mireille Henry, Christian Tourres, Natacha Tivoli, Danielle Botta, Isabelle Ravaux, Isabelle Poizot-Martin and Nouara Yahi. 2003, Journal of Medical Virology 71: 391-398を参照されたい）を使用して、５０μＬの反応混合物：ＭｇＣｌ_２非含有１Ｘ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２μＭの各プライマー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．３ＵのＴａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む中で増幅させる。ＰＣＲ条件は下記のとおりである：５分９５℃、４０サイクル（変性：４０秒９５℃；ハイブリダイゼーション：４０秒５６℃；伸長：５０秒７２℃）および最終伸長が１０分７２℃。

得られたＨＣＶアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により解析し、アリコートを採取し、−２０℃において使用まで保存する。

２）合成標的：ビオチン化オリゴヌクレオチド
５’末端においてビオチン化された１５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、下記のように選択されたＨＣＶプローブに厳密に相補的である。

ＨＣＶ配列の認識のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計
ＨＣＶのＮＳ５ｂ領域を、オリゴヌクレオチドプローブの設計のための標的とした。

最も保存されたゾーンを同定するために、ＮＳ５ｂ領域において増幅されたＨＣＶゲノム配列（８００試料のバンク）を、クラスタルＷ２アライメントソフトウェアおよびＭｅｇａ５系統樹解析ソフトウェアを使用して解析した。ウイルスの遺伝子型１ａ１ｂのすべてのゲノムの特異的増幅を可能にする高度に保存された領域、およびウイルスの遺伝子型３ａのゲノムの特異的増幅を可能にする第２の領域を選択した。それらの各領域に相補的な、２種の１５−ｍｅｒのプローブを設計した。プローブ１ａ１ｂおよび３ａの設計を、マルチ−チオールオリゴヌクレオチドの合成のためにこのように使用する。

［ＥＬＯＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｏｌｉｇｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）によるプローブ／標的のハイブリダイゼーションの評価］
任意のタイプのチオールプローブ（アルファ−アノマーまたはベータ−アノマーのオリゴヌクレオチド、線形または構造化（例えばステムループ）のプローブ）のグラフティングは、この最適化されたプロトコルに従って、マレイミド活性化マイクロプレートウェル（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ＷＢ１バッファー（０．１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２）により洗浄後、実施することができる。ウェルの官能化を、ＢＢバッファー（０．１ＭのＮａ_２ＨＰＯ_４、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中１００ｎＭのマルチチオールプローブにより、２時間、周囲温度（ＡＴ）において実施する。次いでウェルをＷＢ１により３回洗浄し、ＢＢ中１０μｇ．ｍＬ^−１のシステイン−ＨＣｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で１時間ＡＴにおいて満たし、ＷＢ１により再度３回洗浄する。

ハイブリダイゼーション試験を、短鎖の１５−ｍｅｒの合成標的により、または実際のＨＣＶアンプリコン：上記の鎖長（４０１ヌクレオチド）により実施する。合成標的およびアンプリコンを、１５０μＬのハイブリダイゼーションバッファー（ＨＢ：０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、Ｄｅｎｈａｒｄｔ ５Ｘ）で希釈し、その後ウェルに付着させた。１０分、９５℃の追加の変性ステップをアンプリコンに実施し、その後マイクロウェルに移す。ハイブリダイゼーションを、一晩、３７℃において実施する。ウェルを、ＷＢ２バッファー（０．７５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、ＳＤＳ ０．１％）により、２分間ＡＴにおいて３回、および３０分間５０℃において１回洗浄する。

検出ステップを、３０分間ＡＴにおけるウェルのインキュベーション後に、１００μＬのアッセイバッファー（「Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で希釈された１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ユーロピウムの存在下で実施する。ウェルを最終的にＷＢ３バッファー（ＷＢ１Ｘ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により６回洗浄し、２００μＬの増幅バッファー（「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を、各ウェルに５分間ＡＴにおいて加える。時間分解蛍光(time-resolved fluorescence)を、Ｖｉｃｔｏｒ_３（商標）１４２０マルチ標識検出器（「マルチラベルカウンター（ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｎｔｅｒ）」、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）において、製造業者のプロトコル（３４０ｎｍにおいて励起および６１５ｎｍにおいて放射）に従って測定する。

ＥＬＯＳＡ試験を、ＨＣＶ３ａ遺伝子型に特異的なアンプリコン（１／１０、１／１００および１／１０００希釈）およびＨＣＶ１ａ１ｂ遺伝子型に特異的なアンプリコン（したがって３ａ遺伝子型に非特異的）より実施する。ハイブリダイゼーションの対照は、１０００ｐＭおよび５ｐＭで試験した、３ａ遺伝子型に特異的な合成標的（１５−ｍｅｒ）（プローブに相補的）、および１０００ｐＭで試験した遺伝子型１ａ１ｂに特異的な合成標により実施する。

蛍光試験に対応する図８のグラフは、ＥＬＯＳＡ試験の結果を示すとともに、ＨＣＶ遺伝子型３ａに対応するテトラチオールプローブによるハイブリダイゼーションの定量化の結果を説明する。「対照１ａ１ｂ」試験はバックグラウンドノイズに対応し、「３ａ特異的」の結果は、この試験がハイブリダイゼーションを定量化可能なように、バックグラウンドノイズを超えていなければならない。

［グラフト密度の効果の研究］
同じＥＬＯＳＡ試験を、プローブ溶液（モノチオール、ジチオールおよびテトラチオール）の濃度を、１ｎＭから１００ｎＭにさまざまに変化させることによって実施する。ＥＬＯＳＡ試験を、短鎖（１５−ｍｅｒ）および中程度の鎖（１０５−ｍｅｒ）の１ａ１ｂおよび３ａ標的により実施する。１ａ１ｂ遺伝子型に特異的なプローブにより実施された試験は、１ａ１ｂ特異的標的との非常に優れたハイブリダイゼーション特異性を示し、非相補的３ａ遺伝子型標的とはハイブリダイゼーションを示さない。

プローブ／標的のハイブリダイゼーションの検出を、上記のように、蛍光により実施する（図８）。

各タイプのプローブ（モノチオール、ジチオールおよびテトラチオール）の結果を、図９、１０および１１のグラフに示す。ＴＨ対照は、プローブが存在しないウェルにおいて実施した試験に対応する。他のプローブ（６および８つのチオールを含む）もまた試験し、図１４に示す。

図９は、モノチオールプローブ、すなわち、本発明に従った単一のチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示す。モノチオールプローブは、１０５−ｍｅｒの標的の検出には効率的ではなく、１０５−ｍｅｒの標的のシグナルは、ＴＨ対照のシグナルと同一である。加えて、図９はまた、１０ｎＭから１００ｎＭの間の、グラフティングに使用したプローブの濃度が、ハイブリダイゼーションの効率には効果がなく、要するに、１０ｎＭのプローブにより実施された試験と、１００ｎＭのプローブにより実施された試験との間に有意な差がないことを示している。しかし、１ｎＭの濃度のプローブの使用は、ハイブリダイゼーションの効率の低下を引き起こす。

図１０は、ジチオールプローブ、すなわち、本発明に従った２つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示す。ジチオールプローブは、１０５−ｍｅｒの標的の検出には殆ど効果がなく、ハイブリダイゼーションの検出は、１０００ｐＭの１ａ１ｂ標的濃度に対して見られる。さらに、図１０は、グラフティングの密度が、ハイブリダイゼーションの検出にほとんど影響を与えないことを示している。実際に、プローブの濃度が１ｎＭから１００ｎＭへ推移した場合、蛍光シグナルは大きくなり、２５ｎＭから１００ｎＭの間は殆ど差がない。

図１４は、テトラチオールプローブ、すなわち、本発明に従った４つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示す。テトラチオールプローブは、１０５−ｍｅｒの標的の検出に非常に効率的であり、蛍光シグナルは、特に１００ｐＭおよび１０００ｐＭの標的濃度に関して、ＴＨ対照の蛍光シグナルより高い。さらに、図１１は、グラフト密度が、１０５−ｍｅｒに対するハイブリダイゼーションの検出に影響を与えることを示している。実際に、同じ濃度の標的、例えば１０００ｐＭに対して、プローブの濃度が１００ｎＭである場合、蛍光シグナルは、１ｎＭのプローブ濃度と比較して高い。「用量依存性」とも称されるこの効果は、１０５−ｍｅｒの標的の検出に対して非常に明白である。

図１４は、６または８つのチオールを含むプローブが、満足の行くハイブリダイゼーション結果をもたらすことを示している。実際に、それらの２種のプローブに関する蛍光シグナルは、テトラチオールプローブの蛍光シグナルと同様であった。

図１２は、ＨＣＶの遺伝子型１ａ／１ｂに関する配列により実施されたハイブリダイゼーション試験の結果を示す。試験は、３種の標的濃度１００ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭにおいて、１０５塩基長の合成標的により実施する。陰性対照は、非相補的な標的３ａを用いて実施する。テトラチオールプローブ１ａ／１ｂを、電気化学セルの、金表面を有する作用電極にグラフトする。ハイブリダイゼーション反応を、差次的パルスボルタンメトリーによりモニターする。ｙ軸に示した値は、電流変化の正規化された値に対応する。電気化学によるこの試験は、１ｐＭの標的濃度において感度が高く、特異的である。シグナルの変動もまた、試験を１００ｐＭにおいて実施された試験よりも大きくなると思われる。より高い標的濃度において、電極表面における標的の非特異的吸着の効果は、認識反応の有効性を低下させる。１００ｐＭにおいて実施された試験のシグナルの変動は、１ｐＭにおける試験で観察されたシグナルの変動よりも低くなると思われる。この電気化学的方法では、ハイブリダイゼーション反応の定量的モニタリングは不可能である。にもかかわらず、電気化学的方法は、非常に高い感度で特異的応答の有無を供給する。

Claims (19)

1. 下記の式（Ｉ）に対応する化合物。
   

   

   （式中、
   Ｔは、−Ｏ−Ｐ（ＯＲ_１）Ｎ（Ｒ_２）_２、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）Ｏ⁻、−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□から選択される基であり、
   ・Ｒ_１は、２−シアノエチル、およびＲ’_１Ｒ’_２Ｒ’_３ＳｉＣＨ_２ＣＨ_２基から選択され、Ｒ’_１、Ｒ’_２、Ｒ’_３は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分枝鎖の１から１２の炭素原子を含むアルキルおよびＣ６−Ｃ１２アリールから選択される基を表し、
   ・Ｒ_２は、直鎖もしくは分枝鎖の１から１２の炭素原子を含むアルキル基、ピロリジンから選択され、
   ・Ｊは、単結合、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＯＣＨ_２−、Ｐｈがベンジルである−ＣＨ_２ＯＰｈＯＣＨ_２−の基から選択され、
   ・□は固体支持体を表し、
   Ｄは、アルコールの保護基であり、
   Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、
   Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ ＣＯＮ−アルキル基から選択され、
   Ｙは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
   Ｘは、直鎖または分枝鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
   Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２ Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２ Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２ Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２ Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。）
2. 下記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）：
   

   

   のいずれか１つに対応する、請求項１に記載の化合物。
3. ・Ｄが４，４’−ジメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イルまたはフルオレニルメトキシカルボニルから選択され、
   ・Ｗが、Ｃ１−Ｃ６アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アリールトリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、より詳細には、ＣＨ、ＣＣＨ_３、ＣＣＨ_２ＣＨ_３、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイル基から選択され、および／または
   ・Ｚが、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ６ ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ６ ＣＯＮ−アルキル基から選択され、および／または
   ・Ｙが、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択され、および／または
   ・Ｘが、直鎖または分枝鎖のＣ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択され、および／または
   ・Ｒが、Ｃ１−Ｃ６アシル、Ｃ１−Ｃ６ Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ６ Ｓ−アリール、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ６ Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ６ Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６ Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択され、好ましくは、ＲはＣ１−Ｃ６アシル基である、請求項１または２に記載の化合物。
4. Ｔが基−Ｏ−Ｐ（ＯＲ_１）Ｎ（Ｒ_２）_２である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
   （式中、Ｒ_２はイソプロピル基であり、Ｒ_１は、２−シアノエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチル、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル基から選択される。）
5. Ｔが基−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□（式中、□は、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミド、合成または天然の親水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルから選択される固体支持体である）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
6. 下記のステップ：
   −化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：
   

   

   または下記の合成経路：
   

   

   に従った化合物（Ｉａ）の調製工程、
   −化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：
   

   

   （式中、ＱおよびＱ’は、それぞれ独立して、置換または非置換のベンゼン基を表す）
   に従った、化合物（Ｉｂ）の調製工程、
   −化合物（ＩＩ）から出発する、下記の合成経路：
   

   

   または下記の合成経路：
   

   

   に従った化合物（Ｉｃ）の調製工程、
   （Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗ、Ｒ、□、Ｒ１およびＲ２は、請求項１から５のこれらの各ステップにおける同じ定義を有する）
   から選択される少なくとも１つのステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
7. 式：
   (Ic)-(Δ)_k （ＸＶＩ）_ｋ
   ［式中、
   （Ｉｃ）は、請求項２から５と同じ意味を有し、化合物（Ｉｃ）のＲ基はさらにＨを表してもよく、
   ｋは、１から１２の間の整数を表し、
   （△）は、（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）：
   

   

   （式中、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＲおよびＲ１は、請求項１から５と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表し得る）を表す］
   を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物（Ｉ）のオリゴマー化により得ることができるオリゴマー。
8. 式（ＸＩＶ）_ｋ：
   

   

   （式中、
   □、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＲおよびＲ_１は、請求項１から４と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表すことができ、ＤはさらにＨを表すことができ、ｋは、１から１１の間に含まれる整数である）
   を有する、請求項７に記載のオリゴマー。
9. −請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物（Ｉ）をオリゴヌクレオチド上にグラフトするステップ、または
   −ヌクレオチドを、請求項７または請求項８に記載のオリゴマーにグラフトするステップ、
   を少なくとも含む、修飾オリゴヌクレオチドを製造する方法。
10. 下記の式（ＸＩＩａ）：
    □-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y-(M₁-…-M_m-1-M_m)_p-(I’)_y’
    （式中、
    Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
    Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
    （Ｉ’）は、上記の式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
    ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
    ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
    ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
    ｐは、０または１を表し、
    ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
    □は固体支持体を表す）
    を有する、請求項９に記載の方法により得ることができる修飾オリゴヌクレオチド。
11. 下記の式（ＸＩＩＩａ）：
    (Ic)-(I’)_y-1-N₁-N₂-…-N_n-1-N_n-(I’)_y’-[M₁-M₂-…-M_m-1-M_m]_p-(I’)_y”
    （式中、
    Ｎ_１、…Ｎ_ｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
    Ｍ_１、…Ｍ_ｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
    （Ｉ’）は、上記の式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
    ｎは、１から１００の間に含まれる整数であり、
    ｍは、１から１００の間に含まれる整数であり、
    ｙは、１から１２の間に含まれる整数であり、
    ｙ’は、０から１２の間に含まれる整数であり、
    ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
    ｙ”は、ｐが値１を有する場合、０から１２の間に含まれる整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は０を有する）
    を有する、請求項９に記載の方法により得ることができる修飾オリゴヌクレオチド。
12. 式（ＸＩＩｃ）：
    

    

    （式中、
    ｎ、ｙ、Ｎ_１、…Ｎ_ｎ−１は上記と同じ定義を有し
    Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは上記と同じ定義を有し、
    Ｂｎは、ｎ番目のヌクレオチドの塩基を表す）
    を有する、請求項１０に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
13. 式（ＸＩＩＩｃ）：
    

    

    （式中、
    ｎ、ｙ、Ｎは上記と同じ定義を有し、
    Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｗは上記と同じ定義を有し、
    Ｂ１は、１番目のヌクレオチドの塩基に対応する）
    を有する、請求項１１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
14. 以下を含有する別個の容器、
    −ヌクレオチド
    −カップリング活性化因子、および
    −洗浄剤、
    生成物試料のサンプリングおよび分配のための機械的手段ならびにこれらの機械的手段実施の制御のためのコンピュータ手段、ならびに
    請求項７または８に記載のオリゴマーによるグラフト化固体支持体、および／または請求項２に記載の化合物（Ｉａ）もしくは化合物（Ｉｂ）を含有する少なくとも１つの容器が配置された、少なくとも１つの容器、
    を少なくとも含む、ヌクレオチドの合成のための自動装置。
15. 請求項１０から１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドによりグラフト化された基材であって、
    前記基材は、金またはプラチナの膜により被覆された、または少なくとも１つ炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基を含む基によりグラフト化された、少なくとも１つのレシービングゾーンを含み、
    金の膜の場合、前記基材は金属製であり、
    少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基によりグラフト化された場合、前記基材はプラスチック製である、グラフト化基材。
16. 金属製基材が銅製もしくはチタン製である、および／またはプラスチック製基材がポリスチレン製である、請求項１５に記載の基材。
17. 試験キットであって、前記試験キットは、
    −少なくとも１つの基材であって、前記基材は、金またはプラチナの金属の膜により被覆された少なくとも１つのレシービングゾーンを含む基材か、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基によりグラフト化された基材と、
    −請求項１０から１３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレオチドと、
    を含む試験キット。
18. オリゴヌクレオチドと別の分子との間の親和性試験を行うための、請求項１５に記載の基材の使用。
19. 少なくとも２つのチオール基を含む化合物の、診断試験の確立のための使用であって、
    前記チオール基は、オリゴヌクレオチドを、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合を含む基またはハロアセトアミド基、好ましくは、マレイミドもしくはアクリルアミド基により修飾された表面にグラフトする、チオール基を含む化合物の使用。

Images